CN114181917B - 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种改造尿酸酶及其核苷酸序列，改造尿酸酶通过将球形节杆菌尿酸酶上肽段替换成鹅源尿酸酶肽段方式制得，还提供了改造尿酸酶在制备对应鹅高尿酸症药物或饲料中的用途。本发明选择球形节杆菌尿酸酶相比于其他物种的尿酸酶，具有水溶性好，单位酶活性高等优点，便于改造尿酸酶的生产。本发明即是通过同源肽段替换的方法对球形节杆菌尿酸酶进行改造，并进一步融合鹅源IgY Fc片段以获得本发明尿酸酶，与原始尿酸酶相比，对鹅的免疫原性显著降低，且在鹅体内的半衰期得到大大延长。此外，由于鹅属于经济动物，因此本发明相比现有技术具有更低的成本，低廉的价格适合市场推广使用。

Description

一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用
技术领域
本申请属于酶领域，更具体地说，是涉及一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用。
背景技术
鹅高尿酸症是由多种原因引起的尿酸在体内大量积聚，造成内脏、皮下***和关节等部位发生尿酸盐沉积而引起的一种代谢性疾病，以关节肿大、跛行、腹泻等为特征，不同品种鹅均可发生，但多见于雏鹅发病。
目前针对于高尿酸症的一个主要药物成分为尿酸氧化酶（Urate Oxidase，UOX），又称为尿酸酶（Uricase），但天然尿酸酶的含量有限，提取困难。而目前通过重组手段得到的两种重组尿酸酶产品——拉布立酶和培戈洛酶在实际应用过程中仍然有一系列问题需要解决：1、免疫原性问题。由于尿酸酶多来源于哺乳动物和微生物等，不是使用者的自身蛋白，使用时易造成机体过敏等安全性问题；2、体内半衰期短。重组尿酸酶在体内的半衰期为18小时左右，需多次注射使用，常因产生针对尿酸酶的抗体造成疗效下降甚至无效果。PEG化后的重组尿酸酶半衰期可延长至10～12天，同时对机体的免疫原性也得到降低，但是使用该方法生产重组尿酸酶的成本太高，无法用于经济动物鹅等的高尿酸症临床应用。因此，开发对鹅等经济动物免疫原性低、半衰期长、价格低廉的改造尿酸酶具有重要意义。
发明内容
为实现上述目的，本申请采用的技术方案是：提供一种改造尿酸酶，改造尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
一种改造尿酸酶的基因序列，改造尿酸酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
一种改造尿酸酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将球形节杆菌尿酸酶上肽段“158FVGYPKDKY167”替换成鹅源尿酸酶“FEGFYKNEH”肽段，得到初级改造尿酸酶；
S2、通过连接序列在初级改造尿酸酶的碳端连接鹅源免疫球蛋白分子IgY Fc片段，得到次级改造尿酸酶。
可选的，连接序列的氨基酸序列为GGGGSGGGGS。
可选的，在次级改造尿酸酶的碳端增加氨基酸标记序列。
可选的，氨基酸标记序列为6个组氨酸组成的序列。
可选的，将标记后的改造尿酸酶制成重组质粒并在毕赤酵母感受态细胞中转化表达，得到可代谢改造尿酸酶的重组毕赤酵母菌株；
对重组毕赤酵母菌株进行培养和发酵，得到包含有改造尿酸酶的发酵液；
对发酵液进行浓缩和纯化处理，得到改造尿酸酶成品。
一种改造尿酸酶的应用方法，改造尿酸酶在制备对应鹅高尿酸症药物或饲料中的用途。
本发明的益处在于：
本发明选择球形节杆菌尿酸酶相比于其他物种的尿酸酶，具有水溶性好，单位酶活性高等优点，便于改造尿酸酶的生产。本发明即是通过同源肽段替换的方法对球形节杆菌尿酸酶进行改造，并进一步融合鹅源IgY Fc片段以获得本发明尿酸酶，与原始尿酸酶相比，对鹅的免疫原性显著降低，且在鹅体内的半衰期得到大大延长。此外，由于鹅属于经济动物，因此本发明相比现有技术具有更低的成本，低廉的价格适合市场推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是球形节杆菌尿酸酶四聚体的三维结构模拟图。
图2是球形节杆菌尿酸酶四聚体的三维结构中158FVGYPKDKY167肽段位置的模拟图。
图3是粗制改造尿酸酶浓缩液的SDS-PAGE蛋白电泳图谱。
具体实施方式
为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
现对本申请实施例提供的改造尿酸酶进行说明。
实施例1 防治鹅高尿酸症的改造尿酸酶及其基因的获得
通过在线SWISS-MODEL生物软件对球形节杆菌尿酸酶（GenBank登录号：WP_111904949.1）进行同源建模，分析其空间结构，如图1所示，并利用TEPITOPEpan软件进行免疫原性分析得到对鹅具有较强的免疫原性的肽段“158FVGYPKDKY167”，如图1和图2所示。
将鹅源尿酸酶（GenBank登录号：XP_013033287.1）的“FEGFYKNEH”肽段替换“158FVGYPKDKY167”肽段，降低球形节杆菌尿酸酶的免疫原性以提高改造尿酸酶对鹅的同源性。然后再将鹅源IgY Fc片段（GenBank登录号：XP_013057801.1）通过连接序列Lingker（GGGGSGGGGS）序列与尿酸酶的碳端（C端）进行连接，可提高球形节杆菌尿酸酶在鹅体内的半衰期。并且在其C端增加6个组氨酸标签，以便于后期的蛋白纯化。最终得到一种防治鹅高尿酸症的低免疫原性、长效改造尿酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
其中，球形节杆菌尿酸酶含302个氨基酸并可自发形成四聚体结构，可将尿酸分解为尿囊素，从而降低鹅体内尿酸含量，可用于防治鹅高尿酸症，因此适用于用作尿酸酶的改造基础。
根据获得的改造尿酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码改造尿酸酶的核苷酸序列SEQ ID NO:2。并且在核苷酸序列上引入便于整合到毕赤酵母载体上并表达的酶切位点，如在N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点。
实施例2改造尿酸酶表达载体的构建与工程菌的获得
S1、将含改造尿酸酶基因的质粒载体pUC57-UOX和酵母表达载体通过双酶切法进行连接，进行PCR鉴定、测序。如均采用XhoI和XbaI双酶切。酵母表达载体为质粒pPICZαA。
S2、阳性质粒在毕赤酵母感受态细胞悬液中转化，电转化后通过选择培养基筛选重组菌株，选择培养基可选择含100μg/mL Zeocin的YPDS选择培养基，待YPDS培养基上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含更高浓度Zeocin的YPDS选择培养基，以在高浓度Zeocin培养基上正常生长的菌落为高拷贝的重组菌株。
S3、将S2中筛选到的重组菌株接种于含100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基中制备一代种子液，并从一代种子液中按4%体积比转接于5 ml BMGY培养基中制备二代种子液。为了维持诱导表达，每隔24h补加浓度为100%的甲醇使甲醇在种子液的终浓度达1%。培养48h后离心收集上清，进行尿酸酶活性测定。产生酶活的重组酵母菌株即为产改造尿酸酶的阳性菌株，命名为mUox株。
实施例3改造尿酸酶的制备
1、发酵工艺
将筛选得到的mUox株活化后逐级放大培养，首先按体积分数1%～10%接种量接种于三角瓶中震荡培养，后以5%～20%接种量接入20L发酵罐（实装培养基12L）进行发酵，在培养结束前4小时内流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束。发酵结束后放料并离心，收集发酵上清，即为粗酶液。
2、改造尿酸酶纯化
s1超滤浓缩：先后按1μm、0.22μm的顺序将粗酶液进行粗过滤，再用5kD膜包浓缩20倍，制备粗酶浓缩液。将粗酶浓缩液及浓缩后的滤下液进行SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳，如图3所示，图中Marker组为标准蛋白Marker，组1为空白酵母菌发酵上清；组2为粗酶浓缩液，粗酶浓缩液的条带约为58KDa。
s2镍柱纯化：将粗酶浓缩液进行镍柱纯化，最终获得纯度80%以上、蛋白浓度不低于3mg/ml的改造尿酸酶蛋白。
s3酶活测定
将s2步骤得到的改造尿酸酶蛋白进行酶活测定，利用尿酸溶液对改造尿酸酶蛋白进行反应，通过吸光度差异测酶活。其中，尿酸溶液含0.001%尿酸，pH值7.5的50 mmol/L硼酸缓冲液，0.001% Triton X-100和1.0 mmol/L乙二胺四乙酸；改造尿酸酶蛋白稀释后以体积比1：4添加到尿酸溶液中。并通过加入KOH终止反应。酶活的测定吸光度为290 nm。
3、改造尿酸酶成品制备
向纯化后的改造尿酸酶蛋白中添加助剂或缓冲液稀释，经滤膜除菌后得到改造尿酸酶制剂。其中助剂或缓冲液可选用20mM Tris溶液（pH值8.0）和0.9% NaCl缓冲液，将改造尿酸酶蛋白稀释至5U/ml。滤膜除菌过程中则采用0.22μm滤膜过滤后无菌分装。
制得的改造尿酸酶制剂可作为主要成分应用于鹅高尿酸症预防和治疗的药物中。
实施例4 改造尿酸酶制剂对雏鹅尿酸含量的效果试验
1、高尿酸雏鹅模型的制备
高尿酸雏鹅模型包括空白对照组、阴性对照组、尿酸酶标准品组和改造尿酸酶组，15只1日龄的雁鹅/组。其中空白对照组雏鹅的基础饲粮粗蛋白质终含量为18%。阴性对照组、尿酸酶标准品组和改造尿酸酶组雏鹅提高基础饲粮中豆粕等的含量，使粗蛋白质终含量为28%。各组雏鹅连续饲喂至14日龄，静脉采血，采用全自动生化分析仪检测尿酸含量。
如表1所示，雏鹅14日龄时，喂食高蛋白饲料的阴性对照组、尿酸酶标准品组和改造尿酸酶组雏鹅血中尿酸水平显著高于空白对照组，高尿酸雏鹅模型建成。
表1 新型尿酸酶制剂的治疗效果
组别 空白对照组 阴性对照组 尿酸酶标准品组 改造尿酸酶组
药物名称 - - 尿酸酶标准品 改造尿酸酶
首次用药日龄 - - 14日龄 14日龄
首次用药剂量 - - 0.1U/只 0.1U/只
第二次用药日龄 - - 21日龄 21日龄
第二次用药剂量 - - 0.1U/只 0.1U/只
14日龄血清尿酸值（μmol/L） 200.64±18.84 829.61±64.17 822.05±55.37 811.86±69.10
15日龄血清尿酸值（μmol/L） 212.76±21.13 832.45±71.18 600.58±85.69 613.94±94.62
18日龄血清尿酸值（μmol/L） 206.95±40.67 871.71±101.48 827.12±86.81 656.44±104.01
21日龄血清尿酸值（μmol/L） 234.32±52.41 914.28±106.48 887.67±105.63 679.91±114.76
22日龄血清尿酸值（μmol/L） 251.69±56.04 936.54±101.38 746.33±78.06 428.26±66.24
28日龄血清尿酸值（μmol/L） 269.71±60.79 964.55±103.76 903.64±92.19 561.59±94.31
2、改造尿酸酶对雏鹅尿酸含量的影响效果
四组高尿酸雏鹅模型采用以下方式处理：在14日龄时，改造尿酸酶组雏鹅腿部肌肉注射改造尿酸酶制剂0.1U/只一次，在21日龄时以同样的剂量注射第二次。尿酸酶标准品组雏鹅以同样方式和剂量注射尿酸酶标准品。
阴性对照组与空白对照组不进行注射。各组雏鹅分别于14、15、18、21、22、28日龄静脉采血检测尿酸含量。
结果如表1所示，改造尿酸酶与尿酸酶标准品在注射后均可快速降低高尿酸症雏鹅体内的尿酸含量，其中尿酸酶标准品在首次用药后24h可显著降低体内尿酸含量，96h检测时恢复至正常水平。第二次尿酸酶标准品用药后24h仍可降低雏鹅体内尿酸的含量，但是降低效果不如第一次用药，168h后检测时恢复至正常水平。
而改造尿酸酶组在首次给药后24h可显著降低体内尿酸含量，168h时检测雏鹅体内尿酸含量仍显著低于阴性对照组与尿酸酶标准品对照组雏鹅，第二次给药之后改造尿酸酶仍可继续显著降低体内尿酸的含量，且至少维持168h。说明天然球形节杆菌尿酸酶通过在C端增加鹅源IgY Fc片段以及替换高免疫原性肽段“158FVGYPKDKY167”，可显著提高尿酸酶在雏鹅体内的半衰期、降低其对雏鹅的免疫原性，具备广阔的市场前景与产业化开发价值。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 潍坊华卓生物科技有限公司，潍坊华英生物科技有限公司，山东省饲料兽药质量检测中心，昌乐县畜牧业发展中心
<120> 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asn Lys Ile Val Leu Gly His Asn Gln Tyr Gly Lys Ala Glu
1 5 10 15
Val Arg Val Val Lys Ile Thr Arg Asp Thr Asp Arg His Glu Ile Glu
20 25 30
Asp Leu Asn Val Thr Ser Gln Leu Arg Gly Asp Phe Glu Ala Ala His
35 40 45
Leu Glu Gly Asp Asn Ala His Val Val Ala Thr Asp Thr Gln Lys Asn
50 55 60
Thr Ile Tyr Ala Phe Ala Arg Glu Gly Val Gly Ser Pro Glu Ala Phe
65 70 75 80
Leu Leu Arg Leu Gly Glu His Phe Thr Ser Ser Phe Asp Trp Val Thr
85 90 95
Gly Gly Arg Trp Glu Ala Glu Ser Tyr Ala Trp Glu Arg Ile Gln Ala
100 105 110
His Gly Ser Ala His Asp His Ser Phe Val Arg Lys Gly Gln Glu Val
115 120 125
Arg Thr Ala Val Leu Val Arg Asp Gly Ala Ala Thr His Leu Ile Ser
130 135 140
Gly Leu Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gln Ser Gly Phe Glu
145 150 155 160
Gly Phe Tyr Lys Asn Glu His Thr Thr Leu Pro Glu Thr Lys Asp Arg
165 170 175
Ile Leu Ala Thr Asp Val Ser Ala Arg Trp Arg Phe Lys Ala Gly Thr
180 185 190
Asp Phe Ser Ser Leu Asp Phe Asn Lys Ser Tyr Asp Asp Val Lys Gly
195 200 205
Leu Leu Leu Glu Gly Phe Thr Glu Asn Tyr Ser His Ala Leu Gln Gln
210 215 220
Thr Leu Phe Asp Met Gly Ala Lys Val Leu Glu Ala His Ser Glu Ile
225 230 235 240
Glu Glu Ile Lys Phe Ser Met Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp
245 250 255
Leu Ser Pro Phe Gly Leu Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Phe Ala Ala
260 265 270
Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Val Leu Arg Asp Asp Ala
275 280 285
Glu Ala Ala Asp Ala Ala Trp Ser Gly Ile Ala Gly Phe Cys Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ile Gln Ile Phe Val Val Pro
305 310 315 320
Pro Ser Pro Gly Gly Leu Tyr Val Arg Gln Asp Ala Lys Ile His Cys
325 330 335
Val Val Val Asn Leu Pro Ser Asp Ala Ser Leu Ser Ile Ser Trp Thr
340 345 350
Arg Glu Lys Ser Gly Val Leu Arg Pro Asp Pro Met Val Leu Ser Glu
355 360 365
His Phe Asn Ser Thr Phe Thr Ala Ser Ser Ser Leu Ala Val Ser Thr
370 375 380
Gln Asp Trp Val Ala Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Gln His Glu
385 390 395 400
Asp Leu Pro Glu Pro Ile Ser Lys Ser Ile Ser Lys His Ala Gly Lys
405 410 415
Val Thr Pro Pro His Ile Phe Thr Phe Pro Pro His Ala Glu Glu Met
420 425 430
Ala Leu Ala Glu Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Arg Gly Phe Gln Pro
435 440 445
Glu Asn Val Glu Val Gln Trp Leu Arg Asn His Asn Ser Val Pro Ala
450 455 460
Thr Glu Phe Val Thr Thr Pro Pro Leu Lys Glu Ala Asn Gly Asp Gly
465 470 475 480
Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Met Thr Val Pro Lys Ala Ser Trp Gln
485 490 495
Gly Gly Val Ser Tyr Ala Cys Met Val Val His Glu Gly Leu Pro Met
500 505 510
Arg Phe Thr Gln Arg His His His His His His
515 520
<210> 2
<211> 1572
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgtctaaca aaatcgtttt aggtcacaac caatacggta aagcagaagt tcgtgttgtt 60
aaaatcactc gtgatactga tcgtcacgaa atcgaagatt taaacgttac ttctcaatta 120
cgtggtgatt tcgaagcagc acacttagaa ggtgataacg cacacgttgt tgcaactgat 180
actcaaaaaa acactatcta cgcattcgca cgtgaaggtg ttggttctcc agaagcattc 240
ttattacgtt taggtgaaca cttcacttct tctttcgatt gggttactgg tggtcgttgg 300
gaagcagaat cttacgcatg ggaacgtatc caagcacacg gttctgcaca cgatcactct 360
ttcgttcgta aaggtcaaga agttcgtact gcagttttag ttcgtgatgg tgcagcaact 420
cacttaatct ctggtttaaa agatttaact gttttaaaat ctactcaatc tggtttcgaa 480
ggtttctaca aaaacgaaca cactacttta ccagaaacta aagatcgtat cttagcaact 540
gatgtttctg cacgttggcg tttcaaagca ggtactgatt tctcttcttt agatttcaac 600
aaatcttacg atgatgttaa aggtttatta ttagaaggtt tcactgaaaa ctactctcac 660
gcattacaac aaactttatt cgatatgggt gcaaaagttt tagaagcaca ctctgaaatc 720
gaagaaatca aattctctat gccaaacaaa caccacttct tagttgattt atctccattc 780
ggtttagata acccaaacga agttttcttc gcagcagatc gtccatacgg tttaatcgaa 840
gcaactgttt tacgtgatga tgcagaagca gcagatgcag catggtctgg tatcgcaggt 900
ttctgtggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctccaa tccaaatctt cgttgttcca 960
ccatctccag gtggtttata cgttcgtcaa gatgcaaaaa tccactgtgt tgttgttaac 1020
ttaccatctg atgcatcttt atctatctct tggactcgtg aaaaatctgg tgttttacgt 1080
ccagatccaa tggttttatc tgaacacttc aactctactt tcactgcatc ttcttcttta 1140
gcagtttcta ctcaagattg ggttgcaggt gaacgtttca cttgtactgt tcaacacgaa 1200
gatttaccag aaccaatctc taaatctatc tctaaacacg caggtaaagt tactccacca 1260
cacatcttca ctttcccacc acacgcagaa gaaatggcat tagcagaagt tactttaact 1320
tgtttagttc gtggtttcca accagaaaac gttgaagttc aatggttacg taaccacaac 1380
tctgttccag caactgaatt cgttactact ccaccattaa aagaagcaaa cggtgatggt 1440
actttcttct tatactctaa aatgactgtt ccaaaagcat cttggcaagg tggtgtttct 1500
tacgcatgta tggttgttca cgaaggttta ccaatgcgtt tcactcaacg tcaccaccac 1560
caccaccact aa 1572

Claims (6)

1.一种改造尿酸酶，其特征在于：所述改造尿酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种编码如权利要求1所述的改造尿酸酶的基因序列，其特征在于：编码所述改造尿酸酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种如权利要求1所述的改造尿酸酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将球形节杆菌尿酸酶上肽段“158FVGYPKDKY167”替换成鹅源尿酸酶“FEGFYKNEH”肽段，得到初级改造尿酸酶；
S2、通过连接序列在初级改造尿酸酶的碳端连接鹅源免疫球蛋白分子IgY Fc片段，得到次级改造尿酸酶；
所述连接序列的氨基酸序列为GGGGSGGGGS。
4.如权利要求3所述的改造尿酸酶制备方法，其特征在于：在次级改造尿酸酶的碳端增加氨基酸标记序列；
所述氨基酸标记序列为6个组氨酸组成的序列。
5.如权利要求4所述的改造尿酸酶制备方法，其特征在于：将标记后的改造尿酸酶制成重组质粒并在毕赤酵母感受态细胞中转化表达，得到可表达改造尿酸酶的重组毕赤酵母菌株；
对重组毕赤酵母菌株进行培养和发酵，得到包含有改造尿酸酶的发酵液；
对发酵液进行浓缩和纯化处理，得到改造尿酸酶成品。
6.一种改造尿酸酶的应用方法，其特征在于：如权利要求1所述的改造尿酸酶在制备对应鹅高尿酸症药物或饲料中的用途。
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