HU227127B1 - Purified urate oxidases, process for preparation thereof and uricase conjugates - Google Patents
Purified urate oxidases, process for preparation thereof and uricase conjugates Download PDFInfo
- Publication number
- HU227127B1 HU227127B1 HU0204544A HUP0204544A HU227127B1 HU 227127 B1 HU227127 B1 HU 227127B1 HU 0204544 A HU0204544 A HU 0204544A HU P0204544 A HUP0204544 A HU P0204544A HU 227127 B1 HU227127 B1 HU 227127B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- uricase
- peg
- conjugate
- polyethylene glycol
- kda
- Prior art date
Links
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 title claims description 272
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 108
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 20
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 19
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 16
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 claims description 15
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 229940005267 urate oxidase Drugs 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 5
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 claims description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 5
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims description 4
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 claims description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 4
- 241000186074 Arthrobacter globiformis Species 0.000 claims description 3
- 241000235646 Cyberlindnera jadinii Species 0.000 claims description 3
- 241000255313 Drosophila pseudoobscura Species 0.000 claims description 3
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 claims 2
- 229920006380 polyphenylene oxide Polymers 0.000 claims 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 108010068701 Pegloticase Proteins 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 230000001751 uricolytic effect Effects 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 11
- 239000011833 salt mixture Substances 0.000 description 11
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 7
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 6
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N bis(4-nitrophenyl) carbonate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 ACBQROXDOHKANW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) hydrogen carbonate Chemical compound OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZJIFDEVVTPEXDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 2
- 206010051364 Hyperuricosuria Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N allantoin Chemical compound NC(=O)NC1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) hydrogen carbonate Chemical class OC(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LOVPHSMOAVXQIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N Allantoin Natural products NC(=O)N[C@@H]1NC(=O)NC1=O POJWUDADGALRAB-PVQJCKRUSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000608029 Sus scrofa Uricase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 229960000458 allantoin Drugs 0.000 description 1
- OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N allopurinol Chemical compound OC1=NC=NC2=C1C=NN2 OFCNXPDARWKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003459 allopurinol Drugs 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- FZFAMSAMCHXGEF-UHFFFAOYSA-N chloro formate Chemical compound ClOC=O FZFAMSAMCHXGEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000005195 poor health Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- -1 salt salt Chemical class 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical class [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000007968 uric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány fehérjék tisztítására és kémiai módosítására vonatkozik, ahol a cél a fehérjék véráramban való tartózkodási idejének meghosszabbítása és immunválaszt okozó hatásának csökkentése. Közelebbről a találmány tárgya oktamernél nagyobb aggregátumok eltávolítása urát-oxidáz (urikáz) enzimekből polietilénglikolokkal vagy poli(etilén-oxid)-okkal való összekapcsolás előtt. Ezzel gyakorlatilag megszüntetjük az urikáz immunválaszt okozó hatását az urikolitikus aktivitásának veszélyeztetése nélkül.
Az urát-oxidázok (urikázok, E.C. 1.7.3.3) olyan enzimek, amelyek katalizálják a húgysav oxidációját egy jobban oldódó termékké, allantoinná, amely a szervezetből könnyebben kiürülő purin metabolit. Az emberi szervezet nem termel enzimatikusan aktív urikázt az urikázra vonatkozó gén magasabb főemlősök evolúciója során létrejött több mutációjának eredményeként [Wu, X. és munkatársai, J. Mól. Evők, 34, 78-84 (1992)]. Ennek következtében az arra érzékeny személyek esetén a vérben kialakuló túlzott húgysavkoncentráció (hiperurikémia) és a vizeletben kialakuló túlzott húgysavkoncentráció (hiperurikozuria) fájdalmas ízületi gyulladáshoz (köszvényhez), eltorzító urátlerakódásokhoz (köszvényes csomókhoz) és veseelégtelenséghez vezethet. Egyes betegeknél a rendelkezésre álló gyógyszerek, például az allopurinol (amely gátolja a húgysav szintézisét) a kezelést korlátozó kedvezőtlen hatásokat okoznak vagy nem javítják megfelelően a felsorolt állapotokat [Hande, K. R. és munkatársai, Am. J. Med., 76, 47-56 (1984); Fám, A. G., Bailliere’s Clin. Rheumatol., 4, 177-192 (1990)]. Urikázinjekciókkal - legalábbis átmenetileg - csökkenthetjük a hiperurikémiát és hiperurikozuriát. Tekintettel arra, hogy az urikáz idegen fehérje az ember számára, az Aspergillus flavus törzsből származó módosítatlan fehérje első befecskendezése is anafilaxiás reakciókat váltott ki a kezelt betegek bizonyos százalékánál [Púi, C. H. és munkatársai, Leukémia, 11, 1813-1816 (1997)], és a létrejövő immunválaszok korlátozzák a felhasználását krónikus vagy időszakos kezeléshez [Donadio, D. és munkatársai, Nouv. Presse Méd., 10, 711-712 (1981); Leaustic, M. és munkatársai, Rév. Rhum. Mai Osteoartic., 50, 553-554 (1983)].
A 09/370,084 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a PCT/US99/17514 sz. publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés olyan polietilénglikol-urát-oxidázt (PEG-urikázt) ismertet, amely az eredeti urikáz urikolitikus aktivitásának legalább 75%-át megőrzi, és lényegesen kisebb az immunválaszt okozó hatása. Az egyik ilyen tisztított urikáznál minden egyes alegység kovalens kötéssel kapcsolódik átlagosan 2-10 PEG-szálhoz, ahol a PEG minden egyes molekulájának molekulatömege körülbelül 5 kDa és 100 kDa között lehet.
Ismeretes, hogy a fehérjék aggregálódása növeli az immunválaszt okozó hatásukat. Ez az ismeret hozzájárult olyan módszerek kifejlesztéséhez, amelyek során szándékosan hoznak létre fehérjeaggregátumokat például termikus denaturálással vagy glutáraldehiddel történő térhálósítással vakcinakészítéshez vagy állatok antiszérumtermelését célzó immunizálásához való felhasználás előtt.
Azt is felismerték, hogy a fehérjék véletlen aggregálódása hozzájárul az immunizáláshoz vagy az érzékenyítéshez gyógyászati célú fehérjék, például humán gamma-globulin [Henney és munkatársai, N. Eng. J. Med., 218, 2244-2246 (1968)] és emberi növekedési hormon [J. Clin. Endocrinol. Metab., 51, 691-697 (1980)] klinikai alkalmazásánál. Azt, hogy a humán alfa-interferon által kiváltott immunválaszhoz hozzájárulnak aggregátumok, BALB/c egereken mutatták ki [Braun és munkatársai, Pharm. Rés., 14, 1472-1478 (1997)], és egy enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatot fejlesztettek ki a mérésükre [Braun és munkatársai, Pharm. Rés., 14, 1394-1400 (1997)].
Az aggregátumoknak a fehérjék által előidézett immunválaszra gyakorolt hatásával ellentétben nem találtunk olyan beszámolót, amely az aggregátumok polialkilénglikolokkal, például PEG-gel összekapcsolt fehérjék által előidézett immunválaszra gyakorolt hatásával foglalkozna. Szükség van olyan polialkilénglikol-urikáz konjugátumokra, amelyek lényegében kiküszöbölik az urikáz immunválaszt okozó hatását az urikolitikus aktivitásának veszélyeztetése nélkül. A jelen találmány rendelkezésre bocsájt ilyen készítményeket.
Fehérjék és polialkilénglikol, különösen PEG összekapcsolásával olyan konjugátumokat hozunk létre, amelyek csökkentett mértékben váltanak ki immunválaszt, és hosszabb ideig tartózkodnak a véráramban. Amikor megkíséreltünk lényegében immunválaszt ki nem váltó, a módosítatlan urikázkészítmény urikolitikus aktivitását gyakorlatilag teljes mértékben megőrző urikázkonjugátumot előállítani, azt tapasztaltuk, hogy a kiindulási anyagban lévő nagyméretű urikázaggregátumok nyomnyi mennyiségei is meglepően hatékonyan okoztak antitestképződést és gyors kiürülést a véráramból az ilyen aggregátumokat tartalmazó urikázból előállított PEG-konjugátumok ismételt befecskendezésekor. Megjegyzendő, hogy mind az antitestképződés, mind a véráramból való gyors kiürülés káros. Meglepő módon azt találtuk, hogy a nagyobb mértékű immunválasz és a gyorsabb kiürülés nem annak a következménye volt, hogy jól definiált, közepes méretű urikázalegység-aggregátumok voltak jelen, amelyek nagyobbak a természetes tetramernél, például nyolc alegységet tartalmazó aggregátumok (oktamerek). Az urikáz oktamer formája elég nagy koncentrációban van jelen a legtöbb urikázkészítményben ahhoz, hogy kimutatható legyen az abszorbanciája alapján ultraibolya fényben, például 214 nm vagy 276 nm hullámhosszúságon, vagy a törésmutatóhoz való hozzájárulása alapján, vagy a fehérjekoncentráció egyéb mérésével. Azt tapasztaltuk viszont, hogy maguk az oktamerek csekély mértékben járulnak hozzá az immunválaszhoz és a gyorsabb kiürüléshez a PEG-urikáz konjugátumok esetén, ellentétben a sokkal kisebb mennyiségben jelen levő, lényegesen nagyobb aggregátumokkal, amelyek nem mutathatók ki a vizsgált körülmények között az abszorbancia alapján ultraibolya fényben, könnyen kimutathatók azonban statikus (Raleigh) vagy dinamikus fényszórás2
HU 227 127 Β1 sál. Ezért azt találtuk, hogy ha a nyomokban jelen levő igen nagy aggregátumokat eltávolítjuk a PEG-gel való összekapcsolás előtt, akkor meglepő mértékben csökken a kapott PEG-urikáz konjugátumok immunválaszt okozó hatása és kiürülése.
A találmány tárgyát egyrészt olyan tisztított urátoxidáz (urikáz) képezi, amely lényegében mentes az oktamereknél nagyobb aggregátumoktól. A tisztított urát-oxidáz az urikáz tetramer és oktamer formáit tartalmazza, és 0-2% mennyiségben tartalmaz az oktamereknél nagyobb méretű aggregátumokat. Előnyösen az urikáz emlősöktől származik. Különösen előnyösen az urikáz sertésmáj-, szarvasmarhamáj- vagy juhmájeredetű. Előnyös, ha az urikáz rekombináns. Ez utóbbi esetben célszerű, ha az urikáz lényegében a sertés-, szarvasmarha-, juh- vagy babuinmáj-urikáz szekvenciáját tartalmazza. Előnyösen az urikáz kimer. Célszerűen az urikáz PKS urikáz.
A találmány szerinti előnyös urikáz egy másik változatánál az urikáz lényegében a babuinmáj-urikáz szekvenciáját tartalmazza, amelyben a 97-es tirozint hisztidin helyettesíti. Előnyösen az urikáz tartalmaz egy láncvégi aminocsoportot és egy láncvégi karboxilcsoportot, és meg van csonkítva az egyik vagy mindkét láncvégződésnél.
Célszerűen az urikáz gomba- vagy mikrobaeredetű. Előnyösen a gomba- vagy mikrobaeredetű urikáz az Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. vagy Candida utilis törzsből elkülönített vagy rekombináns enzim, amely lényegében a felsorolt urikázok valamelyikének a szekvenciáját tartalmazza. Alternatív módon az urikáz gerinctelen állatból származó. Előnyösen a gerinctelen állatból származó urikáz Drosophila melanogesterből vagy Drosophila pseudoobscurából elkülönített vagy rekombináns enzim, amely lényegében a felsorolt urikázok valamelyikének a szekvenciáját tartalmazza.
A találmány szerinti előnyös urikáz egy további változatánál az urikáz növényi eredetű. Előnyösen a növényi eredetű urikáz a Glycine max gyökérgumóiból elkülönített vagy rekombináns enzim, amely lényegében az urikáz szekvenciáját tartalmazza.
A találmány szerinti előnyös kiviteli alaknál a fentebb leírt urikáz polietilénglikollal vagy poli(etilén-oxid)dal van összekapcsolva úgy, hogy a konjugátumban jelen levő urikáz lényegében mentes az oktamereknél nagyobb aggregátumoktól. Az urikáz célszerűen uretán- (karbamát-), szekunderamin- vagy amidkötésen keresztül kapcsolódik a polietilénglikolhoz vagy poli(etilén-oxid)-hoz. A polietilénglikol például monometoxipolietilénglikol. A polietilénglikol vagy poli(etilén-oxid) molekulatömege például körülbelül 5 kDa és 30 kDa közötti. Előnyösen a polietilénglikol vagy poli(etilénoxid) molekulatömege például körülbelül 10 kDa és 20 kDa közötti. Az egyes urikázalegységekre az említett polietilénglikolból vagy poli(etilén-oxid)-ból átlagosan körülbelül 2 és 12 közötti szál jut. Célszerűen átlagosan körülbelül 6 és 10 közötti szál jut az említett polietilénglikolból vagy poli(etilén-oxid)-ból az egyes urikázalegységekre. Különösen előnyösen átlagosan körülbelül 7 és 9 közötti szál jut az említett polietilénglikolból vagy poli(etilén-oxid)-ból az egyes urikázalegységekre. Előnyösen a polietilénglikol vagy poli(etilénoxid) lineáris. Alternatív módon a polietilénglikol vagy poli(etilén-oxid) elágazó láncú.
A találmány a húgysavszintet valamely testfolyadékban vagy testszövetben csökkentő gyógyászati készítményre is kiterjed, amely a fenti urikázkonjugátumot tartalmazza gyógyászatilag elfogadható vivőanyag mellett. Előnyösen a készítmény liofilizálással van stabilizálva. A liofilizált termék oldással parenterálisan beadható oldattá alakítható vissza.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy eljárás csökkentett immunválaszt kiváltó tisztított urikáz előállítására. Az eljárás szerint urikázfrakciókban különítjük el az oktamereknél nagyobb urikázaggregátumokat, és az ilyen aggregátumokat kizárjuk a tisztított urikázból. Előnyösen az oktamereknél nagyobb aggregátumokat legalább az urikázfrakciók egy részében kimutatjuk, majd az aggregátumokat tartalmazó frakciókat kizárjuk az urikázból. A kimutatás célszerűen a fényszórás mérésével történik.
A találmány a fenti eljárással előállított elkülönített urikázra is kiterjed.
Az 1. ábra egy Pharmacia Biotech Mono Q (1x10 cm) anioncserélő oszlopról távozó frakciók urikázaktivitását, valamint teljes fehérje- és sókoncentrációját mutatja be. Az urikázaktivitást szobahőmérsékleten mértük 100 μΜ húgysav 292 nm hullámhosszúságon fennálló abszorbanciacsökkenésének követésével 200 mM nátrium-borát jelenlétében pH=9,2 értéken. A teljes fehérjetartalmat a méretkizárásos HPLC analízisnél az urikáz abszorbanciamaximumát leíró görbe alatti területből határoztuk meg.
[Az 1. ábrán található szöveg jelentése:
UV Assay of Uricolytic Activity in Fractions from Mono Q Chromatography of PKS Uricase=PKS urikáz Mono Q kromatográfiájával kapott frakciókban az urikolitikus aktivitás meghatározása UV-analízissel.
Protein Based in Size-Exclusion HPLC=a fehérje mennyisége méretkizárásos nagy teljesítményű folyadékkromatográfia alapján. Mean Activity +/- s.d., lU/mL or Protein, mg/5 mL=átlagos aktivitás ±standard szórás, NE/ml (az értékeket fekete négyszögek jelzik) vagy fehérje, mg/5 ml (az értékeket körök jelzik).
Elution Volume, mL=elúciós térfogat, ml.
Fractions=frakciók. Low-Salt Pool=kis sótartalmú elegy.
High-Salt Pool=nagy sótartalmú elegy.
Activity, IU/mL=aktivitás, NE/ml.
Protein, mg/5 mL=fehérje, mg/5 ml.]
A 2. ábrán Pharmacia Superdex 200 (1 χ30 cm méretű) oszlopon végzett méretkizárásos HPLC analízis eredménye látható. Az analízisnek az R291K és T301S (PKS urikáz) mutációkat tartalmazó sertésurikázt vetettük alá, frakcionálatlanul, illetve preparatív Mono Q kromatografálással kapott kiválasztott frakciókat analizáltunk. Az ábrán lévő adatokat fényszórásmérő detektorral 90°-os szögben (felső görbék), illetve az abszorban3
HU 227 127 Β1 cia 276 nm-en végzett mérésével (alsó görbék) kaptuk. A frakcionálatlan mintában és a különféle frakciókban lévő urikáz tetramer, oktamer és még jobban aggregálódott alakjaihoz tartozó különböző jelerősségek nyilvánvalóak. A frakcionálatlan mintát 1/5 arányban hígítottuk Mono Q oszlop pufferoldattal, az 5. számú frakciót 1/3 arányban, a 6. számú frakciót 1/9 arányban hígítottuk. Az 5. és 6. számú frakció egyesítésével kaptuk a „kis sótartalmú elegyet”.
[A 2. ábrán található szöveg jelentése:
Size-Exclusion HPLC on Superdex 200 of Unfractionated PKS Uricase (Load) and Mono Q Column Fractions in the Low-Salt Pool=frakcionálatlan PKS urikáz és Mono Q oszlopról távozó, a kis sótartalmú elegyhez tartozó frakciók Superdex 200 oszlopon végzett méretkizárásos nagy teljesítményű folyadékkromatográfiája.
Light Scattering at 90°, Volts=fényszórás 90°-os szögben, V.
Large aggregates=nagy aggregátumok.
Octamer=oktamer. Fr. 6=6. számú frakció. Fr. 5=5. számú frakció. Load=frakcionálatlan urikáz.
Relatíve Absorbance at 276 nm=relatív abszorbancia 276 nm-en.
Elution Volume, mL (0,5 mL/min)=elúciós térfogat, ml (0,5 ml/perc elvezetési sebesség az oszlopról).]
A 3. ábrán a Mono Q oszlopról távozó, 1. ábra szerinti frakciók méretkizárásos analízisét mutatjuk be. Az adatokat fényszórásmérö detektorral 90°-os szögben, illetve az abszorbancia 276 nm-en végzett mérésével kaptuk a 2. ábrán feltüntetett adatokhoz hasonlóan. Az ábrán bemutatott frakciókból nagy sótartalmú elegyet készítettünk, amelyből PEG-konjugátumot állítottunk elő, és ezeket BALB/c egerekbe fecskendeztük be. A BALB/c egerek vérszérumában létrejövő aktivitást és az immunválaszt az 5. és 6. ábrán adjuk meg.
[A 3. ábrán található szöveg jelentése:
Size-Exclusion HPLC on Superdex 200 of Mono Q Column Fractions of PKS Uricase in the High-Salt Pool=Mono Q oszlopról távozó, a nagy sótartalmú elegyhez tartozó PKS urikáz frakciók Superdex 200 oszlopon végzett méretkizárásos nagy teljesítményű folyadékkromatográfiája.
Light Scattering at 90°, Volts=fényszórás 90°-os szögben, V. Large aggregates=nagy aggregátumok.
Octamer=oktamer. Fr. 7=7. számú frakció. Fr. 8=8. számú frakció. Fr. 9=9. számú frakció. Fr. 10=10. számú frakció.
Relatíve Absorbance at 276 nm=relatív abszorbancia 276 nm-en. Elution Volume, mL (0,5 mL/min)=elúciós térfogat, ml (0,5 ml/perc elvezetési sebesség az oszlopról).]
A 4. ábrán a frakcionálatlan PKS urikáz és ez utóbbi preparatív Mono Q oszlopon végzett kromatografálásával nyert kiválasztott frakciók (1. ábra) oktamertartalmát tüntettük fel. Az adatokat a 276 nm-en mért abszorbanciával és a 90°-os szögben mért fényszórással határoztuk meg, és a 2. és 3. ábra adataiból számítottuk ki.
[A 4. ábrán található szöveg jelentése:
Octamer Content of Mono Q Column Fractions of PKS Uricase=PKS urikáz Mono Q oszlopon végzett kromatografálásával nyert frakciók oktamertartalma.
By Absorbance at 276 nm=a meghatározás a 276 nm-en mért abszorbancia alapján történt.
By Light Scattering at 90 degrees=a meghatározás a 90°-os szögben mért fényszórás alapján történt.
Low-Salt Pool=kis sótartalmú elegy.
High-Salt Pool=nagy sótartalmú elegy.
Octamer Content of the Load=a frakcionálatlan urikáz oktamertartalma.]
Az 5. ábrán 37 °C-on 4 órán át inkubált vérszérumok urikázaktivitásának 1. ábra szerinti UV-analízise látható. A vérszérumokat mindig 24 órával a befecskendezés után vettük, miután hat héten át heti egy alkalommal fecskendeztünk be egerekbe 6 db 10 kDa molekulatömegű PEG-szálhoz kapcsolt PKS urikázt vagy Mono Q oszlopról kinyert urikázfrakciók elegyeit.
[Az 5. ábrán található szöveg jelentése:
UV Uricase Assays of Sera from Mice Injected with 6x10-kDa PEG Conjugates of PKS Uricase or of Pools from Mono Q Column Fractions. Mice Were Bled 24 Hours after Each Weekly lnjection=6 db 10 kDa molekulatömegű PEG-szálhoz kapcsolt PKS urikázzal vagy Mono Q oszlopról kinyert és szintén 6 db 10 kDa molekulasúlyú PEG-szálhoz kapcsolt urikázfrakciók elegyeivel hetenként befecskendezett egerekből kinyert vérszérumokban lévő urikáz UV-analízise. Az egerektől a hetenkénti befecskendezések után 24 órával vettünk vért.
Mean Values +/- s.d., mAU/min/pL=átlagértékek ±standard szórás, milli-abszorbancia-egység/perc/μΙ.
Injection Number=a befecskendezések száma.
High-Salt Pool=nagy sótartalmú elegy.
Low-Salt Pool=kis sótartalmú elegy.
Unfractionated PKS Uricase=frakcionálatlan PKS urikáz.
Data fór the Low-Salt and High-Salt Pools were shifted on the x-axis by 0,1 and 0,2 units, respectively=a kis sótartalmú, illetve nagy sótartalmú elegyre vonatkozó adatokat 0,1, illetve 0,2 egységgel toltuk el az x tengelyen.]
A 6. ábra az IgG antitest képződésének ELISA analízisét szemlélteti PEG-hez kapcsolt PKS urikáz és a Mono Q oszlopról kinyert, szintén PEG-hez kapcsolt, az 1. ábrán feltüntetett frakciók elegyei esetén. A meghatározásokat BALB/c nőstény egereknek hat héten át heti egy alkalommal beadott injekciók után mindig 24 óra elteltével vett vérszérummal végeztük. Az egyes kezelések során 0,2 mg urikázfehérjét fecskendeztünk be az állatokba, 20 g testtömegre számolva. Minden egyes egérnél az 1-6. befecskendezés után 24 órával vett vérmintákra vonatkozó adatok balról jobbra láthatók. A vizsgálati körülményeket a 6. példában ismertetjük. Mindegyik csoportban a nyolc egérre vonatkozó adatokat a növekvő immunválasz sorrendjében rendeztük el balról jobbra.
HU 227 127 Β1 [A 6. ábrán található szöveg jelentése:
ELISA Analyses with Pig Uricase on the Plate and 1:30 Sera írom Mice Injected with 6*10-kDa PEG conjugates of Unfractionated PKS Uricase or Low-Salt or High-Salt Pools=lemezen lévő sertésurikázzal és 1:30 arányban hígított egérvérszérumokkal végzett ELISA analízisek (enzimhez kapcsolt immunszorbens analízis). A vérszérumot 6 db 10 kDa molekulatömegű PEG-szálhoz kapcsolt frakcionálatlan PKS urikázzal vagy szintén 6 db 10 kDa molekulatömegű PEG-szálhoz kapcsolt kis sótartalmú vagy nagy sótartalmú frakcióeleggyel hat alkalommal kezelt egerekből nyertük ki.
IgG Peroxidase Values, mAU/min=lgG peroxidáz értékek, milli-abszorbancia-egység/perc.
Low-Salt Pool=kis sótartalmú elegy.
Unfractionated PKS Uricase=frakcionálatlan PKS urikáz.
High-Salt Pool=nagy sótartalmú elegy.
Week Number=a hét száma.
Mouse 1=1. számú egér. Mouse 2=2. számú egér stb.]
A korábbi vizsgálatok azt mutatják, hogy amikor PEG-gel való összekapcsolással sikerül jelentősen csökkenteni az urikáz immunválaszt okozó hatását és/vagy antigént kiváltó képességét, ez mindig az urikolitikus aktivitás jelentős csökkenésével jár együtt. A találmány magában foglalja azt a megfigyelést, hogy az urát-oxidázok oktamernél nagyobb méretű aggregátumainak nyomnyi mennyiségei jelentős mértékben hozzájárulnak a PEG-hez hozzákapcsolt urikáz immunválaszt kiváltó hatásához és a gyors kiürüléséhez. Igen valószínű, hogy ez a felismerés urikázoktól eltérő fehérjékre is alkalmazható, ideértve az interferonokat és a növekedési faktorokat.
A biológiai gyógyszerekkel kapcsolatos biztonságot, kényelmet és költséghatékonyságot mind kedvezőtlenül befolyásolja a hatékonyságuk csökkenése és az az ebből következő igény, hogy növeljük a beadott dózist. Igény van tehát arra, hogy rendelkezésre álljon egy biztonságos és hatékony alternatív módszer a magas húgysavszint csökkentésére testfolyadékokban, ideértve a vért és a vizeletet. A találmány eljárást biztosít olyan urikáz előállítására, amely nem tartalmaz az oktamernél nagyobb méretű aggregátumot, és az így nyert urikázt használjuk fel a PEG-urikáz konjugátum előállítására. Ez a PEG-urikáz megőrzi a módosítatlan enzim urikolitikus aktivitásának egészét vagy közel az egészét. A találmány tisztított urikázt is biztosít, amely lényegében mentes az oktamernél nagyobb méretű aggregátumoktól. A „lényegében mentes” kifejezés arra mutat, hogy a tisztított urikáz nem tartalmaz körülbelül 2%-nál több oktamernél nagyobb méretű aggregátumot, előnyösen pedig nem tartalmaz körülbelül 1%-nál több oktamernél nagyobb méretű aggregátumot.
A találmány eljárást biztosít urikáz tisztítására, ahol az oktamernél nagyobb méretű aggregátumokat kizárjuk a tisztított készítményből. Tekintettel arra, hogy ezek a nagyobb aggregátumok erősen immunválaszt okozóak, nemkívánatos a jelenlétük a tisztított urikázkészítményben. Az eljárás értelmében inkább fényszórással, mint 280 nm-en végzett ultraibolya-abszorbanciával - vagy ezzel is - ellenőrizzük a kromatografálóoszlopról elvezetett frakciókat, mivel az aggregátumok túlságosan nagy hígításban lehetnek jelen ahhoz, hogy az ultraibolya-abszorbancia alapján kimutathassuk őket. Ezután a tisztított urikázt vízben oldódó polimerekhez, előnyösen polietilénglikolokhoz vagy poli(etilén-oxid)-okhoz kapcsoljuk a 09/370,084 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírt módon.
Egy főképpen tetramer urikázból álló készítményből az aggregált urikázt bármilyen, a szakember számára ismert módon eltávolíthatjuk, ideértve a méretkizárásos kromatográfiát, az ioncserélő kromatográfiát, a mikropórusos membránon keresztül végzett ultraszűrést és a centrifugálást, így az ultracentrifugálást. Az elválasztóeljárás állhat a frakciók elkülönítéséből és analíziséből, majd azoknak a frakcióknak az elöntéséből vagy kizárásából, amelyek nagyobb mennyiségben tartalmaznak nagyméretű aggregátumokat. Az így nyert urikázkészítmény alkalmasabb az immunválaszt lényegében nem okozó urikázkonjugátumok szintéziséhez, mint a frakcionálatlan urikáz. Hosszabb időn át történő adagolás esetén fontos, hogy a PEG-hez hozzákapcsolt fehérjék, például a PEG-urikáz, kevéssé okozzanak immunválaszt és ne váltsanak ki egyre gyorsabb kiürülést a véráramból a dózisok ismételt beadásakor.
A találmány a polimer-urikáz konjugátumokat tartalmazó gyógyászati készítményeket is biztosít. Ezek a konjugátumok immunválaszt lényegében nem okoznak, és a módosítatlan enzim urikolitikus aktivitásának legalább a 75%-át, előnyösen 85%-át, és különösen előnyösen 95%-át vagy még nagyobb hányadát megőrzik. A vízben oldódó polimerekhez való kapcsolásra alkalmas urikázok közé tartoznak a baktériumokból, gombákból, valamint növények és - gerinces és gerinctelen - állatok szöveteiből elkülönített, a természetben előforduló urát-oxidázok, továbbá az urikáz rekombináns formái, beleértve a mutáns, hibrid és/vagy megcsonkított, enzimatikusan aktív urikázvariánsokat.
A találmányhoz felhasználható, vízben oldódó polimerek közé tartoznak az egyenes és elágazó láncú polietilénglikolok vagy poli(etilén-oxid)-ok, amelyek közös neve PEG. Az elágazó láncú PEG-re egyes példák az 5,643,575 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalom tárgyát képezik. Az egyenes láncú PEG egyik előnyös példája a monometoxi-PEG, amelynek általános képlete CH3O-(CH2CH2O)nH, ahol n értéke körülbelül 100 és körülbelül 2300 közötti.
A találmány egyik kiviteli alakja az urát-oxidáz (urikáz) egy olyan konjugátuma, amely a konjugálásán urikáz urikolitikus aktivitásának legalább körülbelül 75%-át megtartja, és jelentős mértékben lecsökkent az immunválaszt okozó hatása. Ez a találmány szerinti urikáz rekombináns is lehet. Akár rekombináns, akár nem, az urikáz emlőstől származó is lehet. E kiviteli alak egyik változatánál az urikáz sertésmáj-, szarvasmarhamájvagy juhmájurikáz lehet. E kiviteli alak másik változatánál az urikáz kimer lehet. A kimer urikáz tartalmazhatja a sertésmáj- és/vagy babuinmáj-urikáz egyes részeit.
HU 227 127 Β1
Például a kimer urikáz olyan sertésurikáz lehet, amely tartalmazza az R291K és T301S mutációkat (PKS urikáz). Az urikáz azonban olyan babuinmáj-urikáz is lehet, amelyben a 97-es tirozint hisztidin helyettesíti; ezáltal az urikáz fajlagos aktivitása legalább mintegy 60%-kal megnövelhető. A találmány szerinti urikáz, akármilyen eredetű is, megcsonkított alakban is lehet jelen, vagy a láncvégi aminocsoportnál, vagy a láncvégi karboxilcsoportnál vagy mindkettőnél.
Hasonló módon az urikáz gomba- vagy mikrobaeredetű urikáz is lehet. E kiviteli alak egyik változatánál a gomba- vagy mikrobaeredetű urikáz az Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. vagy Candida utilis törzsekből származó, a természetben előforduló vagy rekombináns urikáz lehet.
Alternatív módon az urikáz gerinctelen állattól származó is lehet, például Drosophila melanogaster vagy Drosophila pseudoobscura eredetű, a természetben előforduló vagy rekombináns urikáz. A találmány szerinti urikáz növényi urikáz is lehet, például a szójabab gyökérgumóiból (Glucine max) elkülönített, a természetben előforduló vagy rekombináns urikáz.
A PEG átlagos molekulatömege körülbelül 5 kDa és 100 kDa közötti. Előnyösen a PEG átlagos molekulatömege körülbelül 8 kDa és 60 kDa közötti. Különösen előnyösen a PEG átlagos molekulatömege körülbelül 10 kDa és körülbelül 40 kDa közötti, például 10-20 kDa. A kovalens kötésben lévő PEG-szálak átlagos száma, urikázalegységenként, 2-12. Előnyösen a kovalens kötésben lévő PEG-szálak átlagos száma, urikázalegységenként, 6-10. Különösen előnyösen a kovalens kötésben lévő PEG-szálak átlagos száma, urikázalegységenként, 7-9.
E kiviteli alak egyik változatánál az urikáz tetramer lehet. A PEG-szálak uretán- (karbamát-) kötéseken, szekunderamin-kötéseken és/vagy amidkötéseken keresztül kapcsolódhatnak kovalens módon az urikázhoz. Abban az esetben, ha az urikáz a fentebb említett urikázok bármelyikének rekombináns formája, a rekombináns forma lényegében ugyanolyan szekvenciájú lehet, mint a természetben előforduló forma.
Az egyik előnyös emlőseredetű urikáz a rekombináns sertés-bábuin kimer urikáz, amely a sertésmáj- és babuinmáj-urikáz szekvenciájának részeiből áll. Ezeket először Wu és munkatársai határozták meg (1989). Például egy ilyen kimer urikáz tartalmazza az első 288 aminosavat a sertésszekvenciából (SEQ ID NO:1) és az utolsó 16 aminosavat a babuinszekvenciából (SEQ ID NO:2). (Hershfield és munkatársai, WO 00/8196 számú, 2000. február 17-én publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés.) Mivel ez az utóbbi szekvencia csak két helyen különbözik a sertésszekvenciától, amennyiben a 291-es helyen arginin helyett lizint (K), és a 301-es helyen treonin helyett szerint (S) tartalmaz, ezt a mutánst sertés-K-S vagy PKS urikáznak (SEQ ID NO:3) nevezik. A PKS urikáz eggyel több lizincsoportot, és ennek következtében eggyel több lehetséges helyet tartalmaz a PEG-gel való összekapcsolódáshoz, mint akár a sertés-, akár a babuinszekvencia.
A különféle emlőseredetű urikázok, közöttük a PKS urikáz cDNS-eit alklónoztuk, és meghatároztuk az Escherichia coli törzsben való expresszióhoz szükséges optimális körülményeket a szokásos módszerek alkalmazásával. Lásd Erlich, H. A. (szerkesztő), PCR Technology. Principles and Applications fór DNA Amplification. New York, Stockton Press, 1989; Sambrook, J. és munkatársai, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, második kiadás, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. A rekombináns urikázokat extraháltuk, tisztítottuk, és kiértékeltük a stabilitásukat, valamint aktivitásukat a hagyományos vizsgálatok módosításával. Lásd Fridovich, I., J. Bioi. Chem., 240, 2491-2494 (1965); Nishimura és munkatársai (1979), továbbá az 1. és 5. példát.
A találmány egyik változatánál az urikázt biológiailag stabil, kovalens kötésen keresztül kapcsolhatjuk össze viszonylag kis számú PEG-szállal. Az ilyen kötés lehet uretán- (karbamát-) kötés, szekunderamin-kötés és amidkötés. Az összekapcsoláshoz felhasználható különféle aktivált PEG-ek a Shearwater Polymers, Huntsville, AL. cégtől szerezhetők be.
Urikázhoz kapcsolódó uretánkötéseket például úgy hozhatunk létre, hogy urikázt a PEG szukcinimidil-karbonát- (SC) vagy p-nitro-fenil-karbonát- (NPC) származékának jelenlétében inkubálunk. Az SC-PEG származékot az 5,612,460 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt eljárással szintetizálhatjuk. Az NPC-PEG származékot úgy állíthatjuk elő, hogy a PEG-et klór-hangyasav-(p-nitro-fenil)-észterrel reagáltatjuk a Veronese és munkatársai által leírt [Appl. Biochem. Biotechnoi., 11, 141-152 (1985)] vagy az 5,286,637 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomból ismert módszerekkel. Az 5,286,637 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomban leírt módszereket nagyobb molekulasúlyú PEG-ekhez igazítottuk a reakciókomponensek koncentrációjának beállításával hasonló sztöchiometria fenntartása érdekében. Az NPCPEG származék szintézisének egy alternatív módszerét ismertették Büttner, W. és munkatársai, a DD 279 486 sz. kelet-német szabadalmi leírásban.
Urikázhoz kapcsolódó amidkötéseket úgy alakíthatunk ki, hogy a PEG egy karbonsavszármazékának N-hidroxi-szukcinimid-észterét használjuk (Shearwater Polymers). Szekunderamin-kötések előállításához 2,2,2-trifluor-etánszulfonil-PEG-et (trezil-PEG, Shearwater Polymers) használunk vagy reduktív alkilezést végzünk PEG-aldehid (Shearwater Polymers) és nátrium-ciano-borohidrid alkalmazásával.
Olyan konjugátumoknál, amelyek 10 kDa molekulatömegű PEG-et tartalmaznak, és megőrzik a módosítatlan enzim urikolitikus aktivitásának legalább 75%-át, az egy alegységhez kapcsolódó PEG-szálak maximális száma körülbelül 12 volt emlősöktől származó urikázok (például PKS urikáz, a sertésurikáz egy muteinje) esetén (a vizsgálati körülményeket illetően lásd az 5. példát). Az összekapcsolás ilyen mértéke az összes aminocsoport mintegy 40%-ának felel meg. A találmány egyik kiviteli alakjánál az összekapcsolt PEG-szálak átlagos száma urikázalegységenként körülbelül 2 és
HU 227 127 Β1 között van. Egy előnyös kiviteli alaknál az összekapcsolt PEG-szálak átlagos száma urikázalegységenként körülbelül 6 és 10 közötti. Egy különösen előnyös kiviteli alaknál a kovalens kötésben lévő PEG-szálak átlagos száma urikázalegységenként körülbelül 7 és között van. Egy másik kiviteli alaknál az összekapcsolási reakcióhoz használt PEG molekulatömege körülbelül 5 kDa és 30 kDa közötti, előnyösen körülbelül kDa és 20 kDa közötti.
Több tényező is befolyásolhatja az egy adott urikázhoz hozzákapcsolandó PEG optimális molekulatömegét és szálszámát. Általában ahhoz, hogy csökkentsük vagy kiküszöböljük az immunválaszt okozó hatást az urikolitikus aktivitás lényeges csökkenése nélkül, inkább kisebb molekulatömegű PEG viszonylag több szálának az összekapcsolására lehet szükség, és nem nagyobb molekulatömegű PEG viszonylag kevesebb szálának az összekapcsolására. Hasonló módon, az urikázok különféle formáinál eltérő lehet az optimum a PEG-szálak méretét és számát illetően. A PEG-szálak optimális számát és a PEG optimális molekulatömegét könnyen meghatározhatjuk az itt leírt módszerek alkalmazásával.
Amikor emlősöktől származó PEG-konjugátumokat állítottunk elő az enzim tisztított tetramer és oktamer alakjaiból (ezek négy vagy nyolc 35 kDa molekulatömegű alegységet tartalmaztak), a konjugátumok immunválaszt okozó hatása erősen lecsökkent egéren, ellentétben a nagyméretű aggregátumokat tartalmazó PEG-urikáz konjugátum készítmények közepes mértékű immunválaszt kiváltó hatásával és a módosítatlan enzim igen erős immunválaszt kiváltó hatásával.
A természetben előforduló és rekombináns urikázok tisztított készítményei rendszerint az enzim nagyon nagy aggregátumainak a keverékét tartalmazzák a tetramer (140 kDa) és az oktamer (280 kDa) formák mellett. Az egyes, tetramer vagy oktamer alakú urikázkészítmények százalékos mennyisége általában körülbelül 20% és 95% közötti (lásd a 2-4. ábrát). A bizonyítékok ellenére, hogy több más fehérje PEG-hez nem kapcsolt aggregátumai erős immunválaszt váltanak ki [lásd például Moore, W. V. és munkatársai, J. Clin. Endocrinol. Metab., 51, 691-697 (1980)], a PEG-urikáz konjugátummal végzett korábbi vizsgálatok során nem fordítottak gondot az aggregátumtartalom korlátozására, ami arra mutat, hogy nem vették figyelembe a PEGgel módosított aggregátumok immunválaszt okozó lehetséges hatását. A jelen találmány feltalálóinak megfigyelései alapján valószínűnek látszik, hogy ilyen aggregátumok azokban az enzimkészítményekben is jelen voltak, amelyeket a PEG-urikáz konjugátumok korábbi szintéziseihez használtak. Jelenlétük megnehezíthette azt a feladatot, hogy immunválaszt nem okozó konjugátumokat készítsenek. Az is valószínű, hogy az urikáz PEG-hez kapcsolásának korábbi erőfeszítései során az urikolitikus aktivitás megfigyelt jelentős mértékű csökkenése azzal volt összefüggésben, hogy az összekapcsolás kis molekulatömegű PEG nagyszámú szálával történt. Másrészt az itt leírt urikáztisztítási és PEG-hez kapcsolási módszerek lehetővé teszik akár
PEG-szál kovalens kötéssel való hozzákapcsolását egy urikázalegységhez, miközben az urikolitikus aktivitás több mint 75%-a megmarad, legalábbis bizonyos urikázok esetén, mint amilyen a PKS urikáz (a sertésurikáz egy muteinje) és a termofil Bacillus sp. törzstől származó enzim.
Egy másik kiviteli alaknál az enzim lényegében valamennyi nagyméretű aggregátumát eltávolíthatjuk ioncserélő kromatográfiával (1-3. ábrák) vagy méretkizárásos kromatográfiával körülbelül 9 és 10,5 közötti pH-értéken, előnyösen pH=10,2 értéken, mielőtt a kapott, lényegében aggregátummentes urikázkészítményt hozzákapcsolnánk a PEG-hez. A preparatív oszlopról távozó egyes frakciókban ellenőrizhetjük az urikáz molekulatömegét bármilyen, méretfüggő analitikai módszerrel, beleértve például a következőket: HPLC, hagyományos méretkizárásos kromatográfia, centrifugálás, fényszórás, kapilláriselektroforézis vagy gélelektroforézis denaturálást nem okozó pufferben. A méretkizárásos kromatográfia alkalmazásával elkülönített, aggregátumtól mentes urikáz esetén csak az enzim 140 kDa és 280 kDa molekulatömegű formáit tartalmazó frakciókat elegyíthetjük és használhatjuk fel a PEG-hez kapcsoláshoz. Az ioncserélő kromatográfia alkalmazásával elkülönített tetramer és oktamer urikáz esetén az ioncserélő oszlopról távozó frakciókat a méret tekintetében analizálhatjuk annak meghatározására, hogy mely frakciók tartalmaznak jelentős mennyiségben tetramer és oktamer formát a fényszórással kimutatott nagyméretű aggregátumok nélkül. Ezért a tisztított termékben a nem kívánt nagyméretű aggregátumok mennyisége mindössze körülbelül 1%-át vagy még kisebb hányadát képezi az összes urikáznak.
Eredményeink azt mutatják, hogy a PKS urikáz oktamernél nagyobb méretű formái, még abban az esetben is, ha jelentős mértékben PEG-hez vannak kapcsolva, gyorsabb kiürülést eredményeznek (5. ábra), és bizonyos mértékű immunválaszt okoznak egéren (6. ábra). Ugyanakkor a fényszórás alapján kimutatható nagyméretű aggregátumoktól lényegében mentes urikázból előállított konjugátumok hetenként legalább hat alkalommal befecskendezhetők alig gyorsuló kiürülés mellett (5. ábra) és antitestek kimutatható képződése nélkül, amint azt egy érzékeny, enzimhez kapcsolt immunvizsgálattal mértük (6. ábra). A nagymértékben tisztított tetramer vagy oktamer urikáz használata szintén különbséget jelent a találmány szerinti javított konjugátumok és a korábban leírt PEG-urikáz készítmények között. A némelyik korábbi kutató által használt urikázkészítményeknél a jelentős mennyiségű nagyméretű aggregátum jelenléte viszont arra ösztönözhette a kutatókat, hogy az immunválaszt okozó hatás csökkentése érdekében az urikázt nagyszámú PEG-szállal kapcsolják össze. Ennek következtében lényegesen csökkent a kapott konjugátumok enzimaktivitása.
A találmány szerinti PEG-urikáz konjugátumok alkalmasak a húgysavszint csökkentésére emlősök, előnyösen emberek testfolyadékaiban és testszöveteiben, ezért felhasználhatók az olyan állapotokat kísérő magasabb húgysavszintek kezelésére, mint amilyen a
HU 227 127 Β1 köszvény, köszvényes csomók, veseelégtelenség, szervátültetés és rosszindulatú daganat. A PEG-urikáz konjugátumokat többféle módon is beadhatjuk a túlzott húgysavszinttel rendelkező emlősnek, ideértve az intravénás, szubkután, intradermális, intramuszkuláris és intraperitoneális beadási módot. A PEG-urikáz konjugátumokat aeroszollá is alakíthatjuk, amelyet a beteg belélegez. Lásd Patton, J. S., Adv. Drug Deliv. Rév., 19, 3-36 (1996) és 5,458,135 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás.
A találmány szerinti PEG-urikáz konjugátumból a hatékony dózis függ a húgysavszinttől és a kezelt egyed méretétől. A találmány egyik változatánál a PEG-urikáz konjugátumot gyógyászatilag elfogadható vivőanyagban vagy hígítószerben adjuk be körülbelül 10 pg és mintegy 1 g közötti mennyiségben. A beadott mennyiség előnyösen körülbelül 100 pg és 500 mg között van. Különösen előnyösen a PEG-hez kapcsolt urikázt körülbelül 1 mg és 100 mg közötti mennyiségben adjuk be, például 5 mg, 20 mg vagy 50 mg mennyiséget adunk be. A megadott tömeg a konjugátumban lévő fehérje mennyiségére vonatkozik.
A PEG-urikáz konjugátumot tartalmazó gyógyászati készítményeket hagyományos módszerekkel állíthatjuk elő, például amint azokat a következő kézikönyv ismerteti: Gennaro, A. R. (szerkesztő), Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. kiadás, Easton, PA, Mack Publishing Co. (1990). Alkalmas vivőanyagok a befecskendezhető oldatok készítéséhez például a következők: foszfátpuffert tartalmazó sóoldat, laktáttartalmú Ringer-oldat, víz, poliolok és glicerin. A parenterális befecskendezésre szolgáló gyógyászati készítmények lehetnek gyógyászatilag elfogadható, steril vizes vagy nemvizes folyadékok, diszperziók, szuszpenziók vagy emulziók, valamint steril porok, amelyekből közvetlenül a beadás előtt készítünk steril befecskendezhető oldatokat vagy diszperziókat. Ezek a gyógyászati készítmények további alkotórészeket is tartalmazhatnak, például tartósítószereket, szolubilizálószereket, stabilizátorokat, nedvesítőszereket, emulgeálószereket, pufferanyagokat, antioxidánsokat és hígítószereket.
A PEG-urikáz konjugátumból szabályozott hatóanyag-leadású készítményeket is előállíthatunk, amelyek beültethetök az egyénbe a testfolyadékok nagy húgysavszintjének folyamatos szabályozására. Például a politejsav, poliglikolsav, regenerált kollagén, poli-L-lizin, nátrium-alginát, kaucsuk, chitosan, agaróz és többlamellás liposzóma mellett sok egyéb hagyományos depókészítmény tartalmaz biológiailag erodálódó vagy biológiailag lebomló anyagokat, amelyek felhasználhatók biológiailag aktív készítmények előállításához. Ezek az anyagok a beültetés vagy befecskendezés után fokozatosan lebomlanak, és leadják a környező szöveteknek a hatóanyagot. A PEG-urikáz konjugátum szabályozott hatóanyag-leadását biztosító egyik hatóanyag-bezáró módszer például az 5,653,974 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalomból ismert eljárás. A találmány kiterjed a biológiailag erodálódó, biológiailag lebomló és más depókészítmények alkalmazására is. Infúziós pumpák és mátrixrendszerek használata a PEG-urikáz konjugátum leadására szintén a találmány körébe tartozik. Előnyösen micellákba vagy liposzómákba is bezárható a PEG-urikáz konjugátum. Hatóanyagok liposzómákba való bezárásának technológiája ismert a szakember számára. Lásd Lasic, D. és munkatársai (szerkesztők), Stealth Liposomes, Boca Raton, FL., CRC Press, 1995.
A találmány szerinti PEG-urikáz konjugátumot tartalmazó gyógyászati készítmények csökkentik a művesekezelés iránti igényt olyan betegek részéről, akiknél jelentős a húgysav által kiváltott veseelégtelenség veszélye, például akiken szervátültetést hajtottak végre [lásd Venkataseshan, V. S. és munkatársai, Nephron, 56, 317-321 (1990)] és bizonyos rosszindulatú betegségekben szenvedő betegeknél. Olyan betegek esetén, akikben nagy mennyiségben halmozódott fel kristályos húgysavsó (köszvényes csomók), a találmány szerinti gyógyászati készítmények gyorsabban javítják az életminőséget, mint a jelenleg rendelkezésre álló kezelések.
A találmány különféle változatait az alábbi példákkal részletesen ismertetjük az oltalmi kör korlátozása nélkül. Ezekben a példákban az aktivált PEG (például a p-nitro-fenil-karbonát-származék) és a sertésurikáz egy muteinjének összekapcsolásával előállított PEGurikázokat írunk le. A példák útmutatást adnak a szakembernek olyan, immunválaszt lényegében nem okozó urikázkonjugátumok előállításához, amelyek a módosítatlan enzim urikolitikus aktivitásának legalább 75%-át megtartják és alkalmasak hosszabb időn át történő kezeléshez.
1. példa
Urikáz preparatív ioncserélő kromatográfiája
A preparatív ioncserélő kromatográfiát FPLC (Fást Protein Liquid Chromatography) készüléken (Amersham Pharmacia, Piscataway, N. J.) viteleztük ki. A Mono Q oszlopot (1x10 cm, Amersham Pharmacia) gradienselúciónak vetettük alá, ahol a kiindulási eluálószer összetétele 50 mM nátrium-karbonát, pH=10,3, 0,1 M nátrium-klorid („A” pufferoldat) volt, és az eluálást a következő összetételű eluálószerrel fejeztük be: 50 mM nátrium-karbonát, pH=10,3, 0,6 M nátrium-klorid („B” pufferoldat). Az eluálószert 0,5 ml/perc sebességgel vezettük át az oszlopon, a mintát azonban ennél kisebb áramlási sebességgel adagoltuk az oszlopra. Ezt a módszert használtuk 25 ml térfogatú PKS urikáz oldat (pH=10,3) frakcionálásához. A PKS urikázt a Bio-Technology General Limited (Rehovot, Izrael) cégtől kaptuk. Ez rekombináns sertésurikáz, amelyben egy lizin- (K) és egy szerin- (S) maradékot egy arginin-, illetve egy treoninmaradék helyettesít az eredeti sertésurikáz-szekvenciában [Lee és munkatársai, Science, 239, 1288-1291 (1988); Wu és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9412-9416 (1989)]. Miután a mintát felvittük az oszlopra, az oszlopot 100 ml „A” pufferoldattal mostuk át. Az urikáz maximuma 31 ml eluálószer távozása végén kezdett kioldódni, miközben a „B” pufferoldat koncentrációját lineáris módon 0%-ról 26%-ra növeltük. Az urikáz legnagyobb részét azonos
HU 227 127 Β1 koncentrációjú eluálószerrel eluáltuk (7 ml 26%-os „B” pufferoldattal). A kinyert urikáz további hányadát 89 ml oldattal eluáltuk, miközben a „B” pufferoldat koncentrációját lineáris módon 26%-ról 100%-ra növeltük. 4 vagy ml térfogatú frakciókat gyűjtöttünk. A 4-11. frakciókból vett aliquot részek urikáz- és összfehérje-tartalmát meghatároztuk (1. ábra), és méretkizárásos nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) végeztünk a
2. példában leírtak szerint (2. és 3. ábra). Az 5-10. frakció fennmaradó részét PEG-hez kapcsoltuk a 3. példában leírt módon. A 2. példában ismertetett analízisek eredményei alapján egyesítettük az 5. és 6. frakcióból készült PEG-konjugátumokat (ez volt a „kis sótartalmú elegy”), valamint a 7-10. frakciókból készült PEG-konjugátumokat (ez volt a „nagy sótartalmú elegy”), amint azt az 1. ábrán jeleztük.
2. példa
Urikáz méretkizárásos kromatográfiája fényszóráson és ultraibolya-abszorbancián alapuló ellenőrzés mellett
A méretkizárásos HPLC-t szobahőmérsékleten végeztük Superdex 200 oszlopon (1*30 cm, Amersham Pharmacia Biotech) frakcionálatlan PKS urikáz, továbbá a PKS urikáz 1. példában leírt preparatív Mono Q kromatográfiájával nyert kiválasztott frakciók felhasználásával. A Thermo Separation HPLC készülék (Sunnyvale, CA) abszorbanciamonitorából (UV 2000) távozó eluátumot a beeső fénnyel 90°-os szöget bezáró szórt fény alapján analizáltuk MiniDawn detektor (Wyatt Technologies, Santa Barbara, CA) alkalmazásával.
A 2-4. ábrán feltüntetett eredmények mutatják a megoszlást az urikázalegység tetramerje, oktamerje és nagyobb aggregátumai között, valamint a különféle mintákban lévő fenti urikázformákra kapott jelek különféle arányait. Eltérően az abszorbanciajeltől, amely egyenesen arányos a koncentrációval, a fényszórásjel a koncentráció és a fényszóró egység méretének szorzatával arányos. A fényszórást mérő detektor az igen csekély mennyiségű, nagymértékben aggregált urikázra fennálló érzékenysége következtében kimutatta a legnagyobb aggregátumok jelenlétét. Ezek a hézagtérfogatnál vagy annak közelében eluálódtak (mintegy ml).
3. példa
PEG-urikáz konjugátumok szintézise
Frakcionálatlan PKS urikázt (a Bio-Technology General Limited cégtől szereztük be) és az 1. példában ismertetett Mono Q oszlopról elkülönített frakciókban lévő urikázt 10 kDa molekulatömegű PEG-hez kapcsoltunk a PEG p-nitro-fenil-karbonát-származékának (NPC-PEG, gyártó: Shearwater Polymers, Huntsville, AL) alkalmazásával. Az NPC-PEG előállítását PEG és klór-hangyasav-fenil-észter reakciójával több közleményben is leírták [például Veronese, F. M. és munkatársai, Appl. Biochem. Biotechnol., 11, 141-152 (1985); Kito, M. és munkatársai, J. Clin. Biochem. Nutr., 21, 101-111 (1996)], és az NPC-PEG vegyületet használtuk fel a PEG-fehérje konjugátumok korábbi kutatók (ideértve a jelen találmány feltalálóit is) által leírt szintézisét alkalmazva [például Veronese és munkatársai fenti közleménye; Sherman, M. R. és munkatársai előadása a Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications kiadványban, ÁCS Symposium Series 680 (pp. 155-176), szerkesztők: Harris, J. M. és munkatársai, Washington, DC, American Chemical Society]. A 10 kDa molekulatömegű PEG egyes urikázalegységekhez kapcsolódó szálainak száma hat volt a Kunitani M. és munkatársai által leírt módszerrel meghatározva [J. Chromatogr., 588, 125-137 (1991).]
4. példa
Urikáz és PEG-urikáz in vivő állandósága és immunválaszt okozó hatása a vérszérumban Rekombináns emlősurikázoknak a 3. példa szerinti módszerrel előállított PEG-konjugátumait foszfátpuffert tartalmazó fiziológiás sóoldatban (PBS) 1 mg fehérjetartalomra állítottuk be milliliterenként (pH=7,4) befecskendezés céljára. A mintákat lefagyasztottuk, és az analízis elvégzéséig vagy befecskendezésig tároltuk. A mintákat nyolc BALB/c nőstény egérből álló csoportok egyedeibe való befecskendezés előtt legfeljebb 1 órával melegítettük fel 37 °C-ra. A vizsgálatok kezdetén az egércsoportok átlagsúlya 18-22 g volt.
Valamennyi egér súlyát ellenőriztük, és feljegyeztük az injekciókra adott kedvezőtlen reakciók esetleges bizonyítékait vagy a rossz egészségi állapotra utaló esetleges egyéb jeleket. A hathetenkénti injekció mindegyike után 24 órával az állatokat ketaminnal narkotizáltuk, és 100-200 μΙ vért vettünk a szemgödör mögötti részből, kivéve azokat az eseteket, amikor az állatokat leöltük (elvéreztettük), ekkor ugyanis nagyobb mennyiségű vért gyűjtöttünk össze. Vérszérumot készítettünk a 2-8 °C-on 4-32 óra alatt megalvadt vérből. A vérszérumokat -20 °C-on tároltuk. A vérszérumok urikolitikus aktivitását az 5. példában leírt módon vizsgáltuk, az urikázok ellen létrejövő antitesteket pedig a 6. példában ismertetett módon határoztuk meg.
5. példa
PEG-urikáz urikolitikus aktivitásának meghatározása PEG-urikázzal befecskendezett egerektől vett vérszérumban
Ultraibolyafény-abszorbancián alapuló aktivitásmeghatározást végeztünk 100 μΜ húgysavat használva szubsztrátumként 200 mM koncentrációjú és 9,2 pH-értékű nátrium-borát-oldatban, mikrolemezre adaptálva I. Fridovich módszerét [J. Bioi. Chem., 240, 2491-2494 (1965)]. 15 percig követtük az abszorbancia csökkenését szobahőmérsékleten egy 96 bemélyedést tartalmazó, az ultraibolya fény számára átlátszó fenékkel ellátott lemezen (Costar, Corning, N. Y.), SpectraMAX 250 mikrolemezleolvasó készüléket használva (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Az adatokat analízisnek vetettük alá, és megkerestük az azon mérések során kapott abszorbanciaértékek maximális meredekségét (milli-abszorbancia-egység per perc dimenzióban), amelyeket abban a tartományban végez9
HU 227 127 Β1 tünk, amikor a szubsztrátum 10-40%-a oxidálódott. Az ezzel a vizsgálattal kapott eredményeket az 1. és 5. ábra tartalmazza.
Urikázalegységenként hat szál 10 kDa molekulatömegű PEG-hez kapcsolt PKS urikázzal (6^10 kDa PEG PKS) az első alkalommal beoltott egerek vérszérumában az átlagos felezési idő 29±4 óra volt, a befecskendezés után 24 és 72 órával kapott vérszérumokból nyert adatok alapján.
Különálló kísérletek során megállapítottuk, hogy a PEG-urikázzal beoltott egerek vérszérumában a kimutatható urikolitikus aktivitás -20 °C-on történő tároláskor csökken, és az aktivitást úgy tudjuk a legjobban regenerálni, ha a meghatározás előtt 4 órás inkubálást végzünk 37 °C-on. Az 5. ábra azt mutatja, hogy a 6x10 kDa PEG PKS urikázzal végzett ismételt hetenkénti befecskendezés után az urikolitikus aktivitás regenerálódása akkor volt a legnagyobb mértékű, amikor az enzimet Mono Q oszlopon végzett kromatografálással tisztítottuk az 1. példában leírtak szerint a 3. példa módszerével végzett PEG-hez kapcsolást megelőzően. Az aktivitás regenerálódása az 1. példában leírt nagy sótartalmú eluátumelegyből készült konjugátumok befecskendezése után volt a legnagyobb mértékű (lásd az 1. ábrát). Ez tartalmazta a legkisebb mennyiséget az igen nagy méretű aggregátumokból (lásd a 7-10. számú frakció fényszórási profilját a 3. ábrán).
Az aktivitás közepes mértékű regenerálódását az 1. példában leírt Mono Q oszlopról kapott kis sótartalmú eluátumelegyből készített konjugátumokkal kaptuk, míg a legrosszabb mértékű regenerálódást frakcionálatlan PKS urikázból előállított konjugátumok esetén figyeltük meg. Ez utóbbiak tartalmazták a legnagyobb mennyiséget az igen nagy méretű aggregátumokból (lásd a 2. ábrát).
Ismételt befecskendezések után is a vérszérumokban a regenerált relatív aktivitások ugyanilyen sorrendjét (nagy sótartalmú elegy > kis sótartalmú elegy > frakcionálatlan urikáz) figyeltük meg, függetlenül attól, hogy a fentebb leírt ultraibolyafény-abszorbancia vizsgálatot vagy P. Fossati és munkatársai adaptált kolorimetriás meghatározását [J. Clin. Chem., 26, 227-231 (1980)] alkalmaztuk-e, és függetlenül attól, hogy inkubáltuk-e a vérszérumokat 37 °C-on a meghatározás előtt.
6. példa
PEG-urikázzal beoltott egerek vérszérumának enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálata (ELISA)
Nem kompetitív ELISA analíziseket végeztünk 96 bemélyedést tartalmazó Immulon 2 lemezekhez kötött sertésurikázzal (Dynex Technologies, VWR Scientific, San Francisco, CA). A primer antiszérumok urikázzal vagy a 3. példa módszere szerint készített 6x10 kDa molekulatömegű PEG-konjugátummal befecskendezett egerektől származtak. A szekunder antitest torma-peroxidázhoz kapcsolt kecske antiegér IgG volt (Calbiochem-Novabiochem #401 253, La Jolla, CA), szubsztrátumként pedig o-fenilén-diamin-dihidroklorid (Sigma P-9187, St. Louis, MO) szolgált, a B. Porstmann és munkatársai által leírtak szerint [J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-440 (1981)].
A 6. ábra a nem kompetitív ELISA analízisek eredményét szemlélteti. Az eredmények azt mutatják, hogy az 1. példa Mono Q oszlopáról elvezetett (és az 1. ábrán látható) nagy sótartalmú eluátumból a 3. példa módszere szerint szintetizált 6x10 kDa molekulatömegű PEG PKS urikáz a nyolc egér egyikén sem okozott kimutatható immunválaszt (a nyolc egér hat héten át kapott injekciót heti egy alkalommal). A frakcionálatlan PKS urikázból a 3. példa módszere szerint készült konjugátumokkal beoltott egerek közül néhány mutatott csekély mértékű, de kimutatható immunválaszt. Az immunválaszok legnagyobb mértékű előfordulását olyan egereknél tapasztaltuk, amelyekbe az 1. példa Mono Q oszlopáról elvezetett kis sótartalmú eluátumelegyből a
3. példa módszere szerint előállított konjugátumokat fecskendeztük be.
A méretkizárásos HPLC analízisekhez használt, a
2. példában leírt, fényszóráson alapuló detektor nélkül nem lett volna nyilvánvaló, hogy nem az urikáz oktamer alakjának, hanem a legnagyobb méretű aggregátumoknak jelenléte függ össze a PEG-urikáz konjugátumok progresszív módon csökkenő regenerálódásával ismételt befecskendezés után, amint azt az 5. példában megfigyeltük (5. ábra), és a BALB/c egéren tapasztalt immunválasz-növekedéssel, amint azt a 6. példában megfigyeltük (6. ábra). Ezeknek az eredményeknek nagy a jelentőségük a gyógyászatban alkalmazandó PEG-urikáz előállításához kiindulási anyagként felhasznált urikáz szempontjából.
Jóllehet a találmányt részletesen ismertettük, és a jobb megértés érdekében példákat is közöltünk, a szakember a találmány bemutatása alapján könnyen belátja, hogy bizonyos változtatások és módosítások anélkül végrehajthatók, hogy eltávolodnánk a találmányszellemétől és az oltalmi körtől.
Claims (31)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Tisztított urát-oxidáz (urikáz), amely az urikáz tetramer és oktamer formáit tartalmazza, és az oktamereknél nagyobb méretű aggregátumokból 0 tömeg% és 2 tömeg% közötti mennyiséget tartalmaz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy emlőseredetű.
- 3. A 2. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy sertésmáj-, szarvasmarhamáj- vagy juhmájurikáz.
- 4. Az 1. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy rekombináns urikáz.
- 5. A 4. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy a sertésmájurikáz, szarvasmarhamáj-urikáz, juhmájurikáz vagy babuinmáj-urikáz szekvenciáját tartalmazza.
- 6. A 4. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy kimer.
- 7. A 6. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy a kimer urikáz PKS urikáz.HU 227 127 Β1
- 8. A 4. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy a babuinmáj-urikáz szekvenciáját tartalmazza, azzal az eltéréssel, hogy a 97-es tirozint hisztidin helyettesíti.
- 9. A 4. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy egy láncvégi aminocsoportot és egy láncvégi karboxilcsoportot tartalmaz, és az urikáz meg van csonkítva az egyik vagy mindkét láncvégi csoportnál.
- 10. Az 1. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy gomba- vagy mikrobaeredetű.
- 11. A 10. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy a gomba- vagy mikrobaeredetű urikáz az Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis, Bacillus sp. vagy Candida utilis törzsből van elkülönítve vagy olyan rekombináns enzim, amely a felsorolt urikázok egyikének a szekvenciáját tartalmazza.
- 12. Az 1. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy gerinctelen állattól származik.
- 13. A 12. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy a Drosophila melanogasterből vagy Drosophila pseudoobscurából van elkülönítve, vagy olyan rekombináns enzim, amely a felsorolt urikázok egyikének a szekvenciáját tartalmazza.
- 14. Az 1. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy növényi eredetű.
- 15. A 14. igénypont szerinti urikáz, azzal jellemezve, hogy a Glycine max gyökérgümőiből van elkülönítve, vagy olyan rekombináns enzim, amely ennek a szekvenciáját tartalmazza.
- 16. Urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti urikázt tartalmazza kovalens kötéssel polietilénglikolhoz vagy poli(etilén-oxid)-hoz kapcsolva.
- 17. A 16. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol monometoxi-polietilénglikol.
- 18. A 16. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy benne az urikáz uretán- (karbamát-), szekunderamin- vagy amidkötésen keresztül kapcsolódik a polietilénglikolhoz vagy poli(etilén-oxid)hoz.
- 19. A 16. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol vagy polifetilénoxid) molekulatömege körülbelül 5 kDa és 30 kDa közötti.
- 20. A 19. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol vagy polifetilénoxid) molekulatömege körülbelül 10 kDa és 20 kDa közötti.
- 21. A 16. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol- vagy poli(etilénoxid)-szálak átlagos száma urikázalegységenként körülbelül 2 és 12 közötti.
- 22. A 21. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol- vagy poli(etilénoxid)-szálak átlagos száma urikázalegységenként körülbelül 6 és 10 közötti.
- 23. A 22. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol- vagy poli(etilénoxid)-szálak átlagos száma urikázalegységenként körülbelül 7 és 9 közötti.
- 24. A 16. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol vagy poli(etilénoxid) lineáris.
- 25. A 16. igénypont szerinti urikázkonjugátum, azzal jellemezve, hogy a polietilénglikol vagy poli(etilénoxid) elágazó.
- 26. Gyógyászati készítmény a húgysavszint csökkentésére valamely testfolyadékban vagy testszövetben, azzal jellemezve, hogy a 16. igénypont szerinti urikázkonjugátumot és egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyagot tartalmaz.
- 27. A 26. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy liofilizálással van stabilizálva, és oldáskor parenterális beadásra alkalmas oldattá alakul át.
- 28. Eljárás az 1. igénypont szerinti tisztított urikáz előállítására, azzal jellemezve, hogy az urikáz tetramer és oktamer formáit urikázfrakciókban különítjük el az oktamereknél nagyobb méretű urikázaggregátumoktól, és ezeket az aggregátumokat kizárjuk a tisztított urikázból.
- 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elkülönítést ioncserélő kromatográfiával, méretkizárásos kromatográfiával vagy ultraszűréssel végezzük.
- 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elkülönítést az oktamereknél nagyobb méretű aggregátumoknak az urikázfrakciókban való kimutatásával és az említett aggregátumokat tartalmazó frakciók kizárásával végezzük.
- 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kimutatást a fényszórás mérésével végezzük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/501,730 US6783965B1 (en) | 2000-02-10 | 2000-02-10 | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| PCT/US2001/040069 WO2001059078A2 (en) | 2000-02-10 | 2001-02-07 | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0204544A2 HUP0204544A2 (en) | 2003-05-28 |
| HUP0204544A3 HUP0204544A3 (en) | 2007-05-02 |
| HU227127B1 true HU227127B1 (en) | 2010-07-28 |
Family
ID=23994789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0204544A HU227127B1 (en) | 2000-02-10 | 2001-02-07 | Purified urate oxidases, process for preparation thereof and uricase conjugates |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6783965B1 (hu) |
| EP (3) | EP2196538B1 (hu) |
| JP (2) | JP5165826B2 (hu) |
| KR (3) | KR101054247B1 (hu) |
| CN (2) | CN100491532C (hu) |
| AT (1) | ATE463576T1 (hu) |
| AU (3) | AU4997501A (hu) |
| BE (1) | BE2013C045I2 (hu) |
| BR (1) | BRPI0108386B8 (hu) |
| CA (1) | CA2398679C (hu) |
| CY (3) | CY1110142T1 (hu) |
| CZ (1) | CZ304864B6 (hu) |
| DE (1) | DE60141742D1 (hu) |
| DK (3) | DK2196538T3 (hu) |
| ES (2) | ES2343105T3 (hu) |
| FR (1) | FR13C0036I2 (hu) |
| HK (4) | HK1056742A1 (hu) |
| HU (1) | HU227127B1 (hu) |
| IL (3) | IL151065A0 (hu) |
| LU (1) | LU92237I2 (hu) |
| MX (1) | MXPA02007545A (hu) |
| NZ (1) | NZ520434A (hu) |
| PL (1) | PL208064B1 (hu) |
| PT (2) | PT1254237E (hu) |
| RU (3) | RU2352354C2 (hu) |
| TW (2) | TW200914617A (hu) |
| WO (1) | WO2001059078A2 (hu) |
| ZA (1) | ZA200207206B (hu) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6057287A (en) | 1994-01-11 | 2000-05-02 | Dyax Corp. | Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof |
| JP5183836B2 (ja) * | 1998-08-06 | 2013-04-17 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用 |
| US20060188971A1 (en) * | 1998-08-06 | 2006-08-24 | Duke University | Urate oxidase |
| PT1100880E (pt) | 1998-08-06 | 2011-01-13 | Univ Duke | Urato-oxidase |
| US6783965B1 (en) | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| CA2338665C (en) | 1998-08-06 | 2011-01-18 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
| US7229810B2 (en) | 2001-06-28 | 2007-06-12 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates of proteinases |
| US6913915B2 (en) * | 2001-08-02 | 2005-07-05 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | PEG-modified uricase |
| US7153829B2 (en) | 2002-06-07 | 2006-12-26 | Dyax Corp. | Kallikrein-inhibitor therapies |
| EP2298278B1 (en) | 2002-06-07 | 2015-11-11 | Dyax Corp. | Prevention and reduction of blood loss and inflammatory response |
| US20040062748A1 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-01 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| US8129330B2 (en) * | 2002-09-30 | 2012-03-06 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof |
| RS20050502A (en) * | 2002-12-26 | 2007-08-03 | Mountain View Pharmaceuticals Inc., | Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency |
| WO2004101600A2 (en) * | 2003-05-12 | 2004-11-25 | Affymax, Inc. | Novel poly(ethylene glycol) modified compounds and uses thereof |
| ES2395413T3 (es) * | 2003-05-12 | 2013-02-12 | Affymax, Inc. | Péptidos que se unen al receptor de eritropoyetina |
| MXPA05012314A (es) * | 2003-05-12 | 2006-04-18 | Affymax Inc | Radical separador para peptido modificado con polietilenglicol. |
| CA3050564A1 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-10 | Dyax Corp. | Poly-pegylated protease inhibitors |
| US7235530B2 (en) | 2004-09-27 | 2007-06-26 | Dyax Corporation | Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof |
| JP2008519858A (ja) * | 2004-11-11 | 2008-06-12 | アフィーマックス・インコーポレイテッド | エリスロポエチンレセプターに結合する新規ペプチド |
| WO2006062685A2 (en) * | 2004-11-11 | 2006-06-15 | Affymax, Inc. | Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor |
| CA2602654A1 (en) * | 2005-04-05 | 2006-10-12 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Method for shielding functional sites or epitopes on proteins |
| US8148123B2 (en) * | 2005-04-11 | 2012-04-03 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| US20080159976A1 (en) * | 2005-04-11 | 2008-07-03 | Jacob Hartman | Methods for lowering elevated uric acid levels using intravenous injections of PEG-uricase |
| ES2856881T3 (es) | 2005-04-11 | 2021-09-28 | Horizon Pharma Rheumatology Llc | Formas variantes de urato oxidasa y su uso |
| EP1871877A2 (en) | 2005-04-11 | 2008-01-02 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | A variant form of urate oxidase and use thereof |
| EP1883425A1 (en) * | 2005-05-23 | 2008-02-06 | Universite De Geneve | Injectable superparamagnetic nanoparticles for treatment by hyperthermia and use for forming an hyperthermic implant |
| US7550433B2 (en) * | 2005-06-03 | 2009-06-23 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US7919461B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-04-05 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| US8324159B2 (en) * | 2005-06-03 | 2012-12-04 | Affymax, Inc. | Erythropoietin receptor peptide formulations and uses |
| ES2532804T3 (es) * | 2006-04-12 | 2015-03-31 | Crealta Pharmaceuticals Llc | Purificación de proteínas con tensioactivo catiónico |
| CA2696208A1 (en) * | 2007-08-21 | 2009-02-26 | Genzyme Corporation | Treatment with kallikrein inhibitors |
| AU2010203712A1 (en) | 2009-01-06 | 2010-07-15 | Dyax Corp. | Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors |
| AU2010265964B2 (en) | 2009-06-25 | 2014-09-18 | Horizon Therapeutics Usa, Inc. | Methods and kits for predicting infusion reaction risk and antibody-mediated loss of response by monitoring serum uric acid during PEGylated uricase therapy |
| LT2521568T (lt) | 2010-01-06 | 2018-12-10 | Dyax Corp. | Plazmos kalikreiną surišantys baltymai |
| US8940861B2 (en) | 2010-04-08 | 2015-01-27 | Georgia Tech Research Corporation | Variants of ancestral uricases and uses thereof |
| BR112013017080A8 (pt) | 2011-01-06 | 2023-05-09 | Dyax Corp | Anticorpo ou fragmento funcional do mesmo que se liga a forma ativa de calicreína do plasma humano, composiçao farmacêutica e método de detecçao de calicreína do plasma em um paciente |
| CN102827073A (zh) | 2011-06-17 | 2012-12-19 | 安吉奥斯医药品有限公司 | 治疗活性组合物和它们的使用方法 |
| US9474779B2 (en) | 2012-01-19 | 2016-10-25 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compositions and their methods of use |
| DK3003358T3 (da) | 2013-06-07 | 2021-06-21 | Allena Pharmaceuticals Inc | Sammensætninger og anordninger til dialyse |
| CA2917671A1 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-15 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | 2,4-or 4,6-diaminopyrimidine compounds as idh2 mutants inhibitors for the treatment of cancer |
| US9579324B2 (en) | 2013-07-11 | 2017-02-28 | Agios Pharmaceuticals, Inc | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| WO2015003360A2 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-15 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| WO2015003355A2 (en) | 2013-07-11 | 2015-01-15 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| US20150031627A1 (en) | 2013-07-25 | 2015-01-29 | Agios Pharmaceuticals, Inc | Therapeutically active compounds and their methods of use |
| US9968595B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-05-15 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions of therapeutically active compounds |
| US10428158B2 (en) | 2014-03-27 | 2019-10-01 | Dyax Corp. | Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema |
| EP3294322A4 (en) | 2015-05-15 | 2018-12-12 | Medimmune, LLC | Improved uricase sequences and methods of treatment |
| MX2018004587A (es) | 2015-10-15 | 2018-08-14 | Agios Pharmaceuticals Inc | Terapia de combinacion para tratar tumores malignos. |
| KR20180067658A (ko) | 2015-10-15 | 2018-06-20 | 아지오스 파마슈티컬스 아이엔씨. | 악성 종양의 치료를 위한 조합물 요법 |
| BR112018011622A2 (pt) | 2015-12-11 | 2018-11-27 | Dyax Corp | método para tratar ataque de angioedema hereditário (hae) ou reduzir a taxa de ataque de hae |
| US20230085022A1 (en) | 2016-11-11 | 2023-03-16 | Horizon Therapeutics Usa, Inc. | Combination therapies of prednisone and uricase molecules and uses thereof |
| JP2020530282A (ja) | 2017-07-07 | 2020-10-22 | アレナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 組換えウリカーゼ酵素 |
| US20190309269A1 (en) | 2018-03-20 | 2019-10-10 | Rubius Therapeutics, Inc. | Therapeutic cell systems and methods for treating hyperuricemia and gout |
| US10980788B2 (en) | 2018-06-08 | 2021-04-20 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Therapy for treating malignancies |
| CN109055260B (zh) * | 2018-08-08 | 2021-11-09 | 淮海工学院 | 弯曲芽孢杆菌alkaAU及产尿酸氧化酶方法、产品与应用 |
| CN114181917B (zh) * | 2022-02-14 | 2022-06-03 | 潍坊华卓生物科技有限公司 | 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用 |
Family Cites Families (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE279486C (hu) | ||||
| US3616231A (en) | 1968-11-14 | 1971-10-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the production of uricase |
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| JPS5599189A (en) | 1979-01-22 | 1980-07-28 | Mihama Hisaharu | Modified uricase free from antigenicity and its preparation |
| JPS55135590A (en) | 1979-04-05 | 1980-10-22 | Mihama Hisaharu | Modified asparaginase and uricase and their preparation |
| CH657141A5 (de) | 1980-07-01 | 1986-08-15 | Hoffmann La Roche | Dns-sequenzen, rekombinante expressionsvektoren zur mikrobiellen herstellung von human-leukozyten-interferonen und transformierte mikroorganismen. |
| JPS57192435A (en) | 1981-05-20 | 1982-11-26 | Toyobo Co Ltd | Modified polypeptide |
| DE3126759A1 (de) | 1981-07-07 | 1983-01-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Loesliche leber-uricase, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung |
| WO1987000056A1 (en) * | 1985-06-26 | 1987-01-15 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4917888A (en) | 1985-06-26 | 1990-04-17 | Cetus Corporation | Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4766106A (en) | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4847079A (en) * | 1985-07-29 | 1989-07-11 | Schering Corporation | Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal |
| DD279486A1 (de) | 1986-03-10 | 1990-06-06 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur aktivierung von hydroxylgruppenhaltigen polymeren verbindungen |
| JPS6255079A (ja) * | 1986-04-23 | 1987-03-10 | Mihama Hisaharu | 修飾ウリカ−ゼ |
| JPH085506B2 (ja) * | 1986-08-25 | 1996-01-24 | 日東製器株式会社 | 缶容器 |
| DD279489A1 (de) | 1986-12-11 | 1990-06-06 | Leuna Werke Veb | Verfahren zur herstellung optisch transparenter epoxidharzformmassen |
| US5080891A (en) * | 1987-08-03 | 1992-01-14 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
| US4847325A (en) | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
| US5955336A (en) * | 1988-08-17 | 1999-09-21 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | DNA sequence for uricase and manufacturing process of uricase |
| US5349052A (en) | 1988-10-20 | 1994-09-20 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US5122614A (en) * | 1989-04-19 | 1992-06-16 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
| US5324844A (en) | 1989-04-19 | 1994-06-28 | Enzon, Inc. | Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides |
| NZ234453A (en) * | 1989-07-13 | 1993-01-27 | Sanofi Sa | Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith |
| US5382518A (en) | 1989-07-13 | 1995-01-17 | Sanofi | Urate oxidase activity protein, recombinant gene coding therefor, expression vector, micro-organisms and transformed cells |
| US5286637A (en) | 1989-08-07 | 1994-02-15 | Debiopharm, S.A. | Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same |
| JPH03148298A (ja) | 1989-11-01 | 1991-06-25 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | 修飾ペプチドおよびその製造方法 |
| US5766897A (en) * | 1990-06-21 | 1998-06-16 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Cysteine-pegylated proteins |
| US5653974A (en) | 1990-10-18 | 1997-08-05 | Board Of Regents,The University Of Texas System | Preparation and characterization of liposomal formulations of tumor necrosis factor |
| WO1992016221A1 (en) * | 1991-03-15 | 1992-10-01 | Synergen, Inc. | Pegylation of polypeptides |
| DE69233690T2 (de) | 1991-07-02 | 2008-01-24 | Nektar Therapeutics, San Carlos | Abgabevorrichtung für nebelförmige Medikamente |
| AU6240494A (en) | 1993-02-16 | 1994-09-14 | Enzon, Inc. | Ribosome inactivating protein compositions having reduced antigenicity |
| AU6586394A (en) * | 1993-04-22 | 1994-11-08 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of growth factor and bone resorption inhibitor |
| WO1995000162A1 (en) | 1993-06-21 | 1995-01-05 | Enzon, Inc. | Site specific synthesis of conjugated peptides |
| IT1265101B1 (it) * | 1993-07-23 | 1996-10-30 | Erba Carlo Spa | Derivati dell'acido 2-ammino-4-fenil-4-osso butirrico |
| US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| US5919455A (en) | 1993-10-27 | 1999-07-06 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
| DK0730470T3 (da) * | 1993-11-10 | 2002-06-03 | Enzon Inc | Forbedrede interferonpolymerkonjugater |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| WO1996017929A1 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Novo Nordisk A/S | Polypeptide with reduced allergenicity |
| US5932462A (en) * | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| JP2758154B2 (ja) * | 1995-04-06 | 1998-05-28 | エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー | インターフェロンを含む液体製剤 |
| FR2733914B1 (fr) * | 1995-05-11 | 1997-08-01 | Sanofi Sa | Composition de liquide stable contenant de l'urate oxydase et composition lyophilisee pour sa preparation |
| US5853974A (en) | 1995-06-07 | 1998-12-29 | Chiron Corporation | Enhancement of alkaline phosphatase with SDS in chemiluminescent substrates |
| JPH09154581A (ja) | 1995-12-05 | 1997-06-17 | Asahi Chem Ind Co Ltd | ウリカーゼを生産する実質上純粋な微生物 |
| EP1007082B1 (en) | 1997-01-15 | 2006-10-18 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | Modified tumor necrosis factor |
| EP1500661A1 (en) * | 1998-06-01 | 2005-01-26 | Genetech, Inc. | Separation of protein monomers from aggregates by use of ion-exchange chromatography |
| PT1100880E (pt) | 1998-08-06 | 2011-01-13 | Univ Duke | Urato-oxidase |
| CA2338665C (en) * | 1998-08-06 | 2011-01-18 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
| JP5183836B2 (ja) | 1998-08-06 | 2013-04-17 | マウンテン ビュー ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用 |
| US6783965B1 (en) * | 2000-02-10 | 2004-08-31 | Mountain View Pharmaceuticals, Inc. | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates |
| US6425448B1 (en) | 2001-01-30 | 2002-07-30 | Cdx Gas, L.L.P. | Method and system for accessing subterranean zones from a limited surface area |
| US6913915B2 (en) * | 2001-08-02 | 2005-07-05 | Phoenix Pharmacologics, Inc. | PEG-modified uricase |
| WO2014187953A1 (en) | 2013-05-24 | 2014-11-27 | Zentrum Mikroelektronik Dresden Ag | Non pwm digital dc-dc converter |
-
2000
- 2000-02-10 US US09/501,730 patent/US6783965B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-02-06 TW TW097145974A patent/TW200914617A/zh unknown
- 2001-02-06 TW TW090102540A patent/TWI322184B/zh not_active IP Right Cessation
- 2001-02-07 EP EP10158016.5A patent/EP2196538B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 AU AU4997501A patent/AU4997501A/xx active Pending
- 2001-02-07 CA CA2398679A patent/CA2398679C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 PL PL358539A patent/PL208064B1/pl unknown
- 2001-02-07 ES ES01923265T patent/ES2343105T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 CN CNB018077501A patent/CN100491532C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 DK DK10158016.5T patent/DK2196538T3/en active
- 2001-02-07 DE DE60141742T patent/DE60141742D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 RU RU2006107110/13A patent/RU2352354C2/ru active
- 2001-02-07 CZ CZ2002-2982A patent/CZ304864B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-02-07 JP JP2001558218A patent/JP5165826B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 KR KR1020087024272A patent/KR101054247B1/ko active IP Right Grant
- 2001-02-07 PT PT01923265T patent/PT1254237E/pt unknown
- 2001-02-07 KR KR1020027010189A patent/KR100884724B1/ko active IP Right Grant
- 2001-02-07 WO PCT/US2001/040069 patent/WO2001059078A2/en active Application Filing
- 2001-02-07 IL IL15106501A patent/IL151065A0/xx unknown
- 2001-02-07 BR BRPI0108386A patent/BRPI0108386B8/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-02-07 RU RU2002120486/13A patent/RU2281954C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-02-07 AU AU2001249975A patent/AU2001249975B2/en not_active Revoked
- 2001-02-07 CN CN2009101278530A patent/CN101735991B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 DK DK10180428.4T patent/DK2305819T3/en active
- 2001-02-07 MX MXPA02007545A patent/MXPA02007545A/es active IP Right Grant
- 2001-02-07 DK DK01923265.1T patent/DK1254237T3/da active
- 2001-02-07 EP EP10180428.4A patent/EP2305819B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 AT AT01923265T patent/ATE463576T1/de active
- 2001-02-07 HU HU0204544A patent/HU227127B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-02-07 EP EP01923265A patent/EP1254237B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 PT PT101804284T patent/PT2305819E/pt unknown
- 2001-02-07 KR KR1020077018682A patent/KR20070092329A/ko active Search and Examination
- 2001-02-07 ES ES10180428.4T patent/ES2524153T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-07 NZ NZ520434A patent/NZ520434A/en not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-08-05 IL IL151065A patent/IL151065A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2002-09-09 ZA ZA200207206A patent/ZA200207206B/en unknown
-
2003
- 2003-12-11 HK HK03109064.9A patent/HK1056742A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-08-03 US US11/882,750 patent/US7927852B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-11 IL IL193365A patent/IL193365A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-02-06 RU RU2009104003/10A patent/RU2557318C9/ru active
- 2009-09-02 AU AU2009212900A patent/AU2009212900B2/en not_active Expired
-
2010
- 2010-06-29 CY CY20101100597T patent/CY1110142T1/el unknown
- 2010-10-27 HK HK10110105.9A patent/HK1143989A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-10-27 HK HK11109405.7A patent/HK1155203A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2010-12-08 HK HK10111402.7A patent/HK1144701A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-04-12 JP JP2011088663A patent/JP5341945B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2011-04-13 US US13/085,793 patent/US8921064B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-07-03 BE BE2013C045C patent/BE2013C045I2/fr unknown
- 2013-07-03 LU LU92237C patent/LU92237I2/fr unknown
- 2013-07-04 FR FR13C0036C patent/FR13C0036I2/fr active Active
- 2013-07-04 CY CY2013028C patent/CY2013028I1/el unknown
-
2015
- 2015-02-09 CY CY20151100129T patent/CY1117264T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU227127B1 (en) | Purified urate oxidases, process for preparation thereof and uricase conjugates | |
| US20180223263A1 (en) | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates | |
| JP5183836B2 (ja) | Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用 | |
| AU2001249975A1 (en) | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates | |
| AU2006203252B8 (en) | Aggregate-free urate oxidase for preparation of non-immunogenic polymer conjugates | |
| MXPA01001272A (en) | Peg-urate oxidase conjugates and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: DUKE UNIVERSITY, US Free format text: FORMER OWNER(S): MOUNTAIN VIEW PHARMACEUTICALS, INC., US Owner name: MOUNTAIN VIEW PHARMACEUTICALS, INC., US Free format text: FORMER OWNER(S): MOUNTAIN VIEW PHARMACEUTICALS, INC., US |
|
| AA1S | Information on application for a supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: PEGLOTICASE AND EVERY THEREPEUTICALLY EQUIVALENT FORM THEREOF AS PROTECTED BY THE BASIC PATENT; REG. NO/DATE: EU/1/12/810 20130108 Spc suppl protection certif: S1300029 Filing date: 20130704 Expiry date: 20210207 |