RU2096455C1 - Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности - Google Patents
Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности Download PDFInfo
- Publication number
- RU2096455C1 RU2096455C1 RU9393047672A RU93047672A RU2096455C1 RU 2096455 C1 RU2096455 C1 RU 2096455C1 RU 9393047672 A RU9393047672 A RU 9393047672A RU 93047672 A RU93047672 A RU 93047672A RU 2096455 C1 RU2096455 C1 RU 2096455C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- met
- arg
- ddap
- dap
- asp
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 38
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 title claims description 16
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 title claims description 10
- PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N 0.000 title claims description 8
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 27
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 claims description 16
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 43
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 abstract 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102100039694 Death-associated protein 1 Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 6
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000309464 bull Species 0.000 description 6
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N (2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-n-(4-nitrophenyl)-3-phenylpropanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 241000049703 Dictyostelium discoideum AX3 Species 0.000 description 3
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 101000886298 Pseudoxanthomonas mexicana Dipeptidyl aminopeptidase 4 Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 108090000212 dipeptidyl peptidase II Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 3
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108050003188 Disks large-associated protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- NVLDXKCJZRQSDJ-UHFFFAOYSA-L cyclohexane-1,2-diamine;2-(1,2-dihydroxyethyl)-3-hydroxy-5-oxo-2h-furan-4-olate;platinum(2+) Chemical compound [Pt+2].NC1CCCCC1N.OCC(O)C1OC(=O)C([O-])=C1O.OCC(O)C1OC(=O)C([O-])=C1O NVLDXKCJZRQSDJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LKVCNGLNTAPMSZ-JYJNAYRXSA-N Gln-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LKVCNGLNTAPMSZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001874 anterior cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000013590 bulk material Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N cystamine Chemical compound CCSSCCN OOTFVKOQINZBBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940099500 cystamine Drugs 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-phenylalanine Chemical compound NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005019 pattern of movement Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11005—Prolyl aminopeptidase (3.4.11.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Escalators And Moving Walkways (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Polyamides (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Noodles (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: дипептидиламинопептидаза, выделенная из клеточного слизневого грибка Dictyostelium discoideum АТСС 28368 имеет молекулярный вес около 225000 Да и способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от соответствующей полипептидной последовательности; ферментативное отщепление указанного дипептида проводят при рН от 2,5 до 5,5, температуре от 15 до 45oC и в течение 1 мин - 24 ч в зависимости от природы используемого субстрата. 2 с. и 4 з. п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а более точно к дипептидиламинопептидазе, выделенной из слизневого грибка, Dictyostelium discoideum, которая может использоваться при получении рекомбинантных полипептидов.
Изобретение также касается способа ферментативного отщепления N-концевых дипептидов Met-Tyr. Met-Arg или Met-Asp от полипептидной последовательности, предусматривающего контактирование полипептидной последовательности с дипептидиламинопептидазой при условиях, достаточных для этой реакции.
Из патента США N 5126249 (C 12 P 21/06, 1992) известен способ энзиматического отщепления N-концевых дипептидов с использованием дипептидаминопептидазы DAP-1.
Дипептидиламинопептидазы (ДАП) являются ферментами, которые гидролизуют предпоследнюю пептидную связь у аминного конца, выделяя дипептиды из пептидов и белков, содержащих свободные концевые аминогруппы. В настоящее время известно четыре класса дипептидиламинопептидаз (их обозначают DAP-I, DAP-II, DAP-III и DAP-IV), которые различают по их физическим характеристикам и скоростям, с которыми они катализируют расщепление различных последовательностей аминоконцевых пептидов. DAP-I является относительно неспецифичной ДАП, которая способна катализировать высвобождение большого количества дипептидных комбинаций из пептидов и белков со свободными концевыми аминогруппами. DAP-I проявляет небольшую активность или не проявляет никакой активности в том случае, если образуется дипептид типа Х-Pro, Arg-X или Lys-X (где Х аминокислота). Использование DAP-II предпочтительно в случае таких дипептидных последовательностей с концевыми аминогруппами, которые начинаются с Arg-X или Lys-X, и в меньшей степени, Pro-X. По отношению к большинству других дипептидных комбинаций DAP-II демонстрирует значительно более низкие скорости расщепления. DAP-III проявляет склонность к дипептидным последовательностям с концевыми аминогруппами типа Arg-Arg и Lys-Lys. Наибольшая скорость гидролитической активности DAP-IV наблюдается по отношению к дипептидным последовательностям типа Pro-X. Было установлено, что ДАП ферменты, в частности DAP-I и DAP-IV могут быть использованы в производстве белков.
Настоящее изобретение касается новой ДАП из Dictyostelium discoideum, которая может быть использована при получении рекомбинантных белков с четным количеством N-концевых аминокислот.
Настоящее изобретение касается новой дипептидиламинопептидазы, выделенной из клеточного слизневого грибка Dictyostelium discoideum.
Dictyostelium discoideum является простейшим эукариотным микроорганизмом, обычно называемым слизневым грибком или, точнее, клеточным слизневым грибком. Его название возникло из двух крайних, с макроскопической точки зрения, состояний этого микроорганизма. Во время стадии активного роста Dictyostelium discoideum развивается как простая одноклеточная амеба. На этой стадии они не имеют клеточных стенок и поэтому напоминают тонкую пленку (или слизь). При отмирании на твердой поверхности независимые клетки агрегируют с образованием колонии. Колония проявляет черты, присущие многоклеточному организму, в частности, она может перемещаться в виде так называемого слизня, а также видоизменяется так, что задние клетки слизня образуют ножку, передние клетки стебель, а средние клетки способное к размножению тело. В природе этот микроорганизм встречается на поверхности почвы и навоза. Некультивированная амеба питается исключительно путем проглатывания (фагоцитоз) целиком всей бактерии; по этой причине их иногда относят к плотоядным. Были выделены мутанты Dictyostelium discoideum, которые способны расти в отсутствие культуры "пищевой" бактерии и поэтому могут быть выращены в жидкой среде.
ДАП-фермент по изобретению получен из штамма Dictyostelium discoideum АТСС 28368 и обладает следующими характеристиками:
молекулярный вес: около 225000 Да,
ферментативная активность: способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от Met-Tyr-человеческого проинсулина, Met-Arg-человеческого проинсулина или Met-Asp-человеческого проинсулина соответственно, при рН оптимуме около 3,5.
молекулярный вес: около 225000 Да,
ферментативная активность: способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от Met-Tyr-человеческого проинсулина, Met-Arg-человеческого проинсулина или Met-Asp-человеческого проинсулина соответственно, при рН оптимуме около 3,5.
Новый ДАП фермент, dDAP, проявляет активность, которая в некоторой степени напоминает как DAP-I, так и DAP-III, но значительно отличается от этих ферментов по своим физическим и другим ферментативным характеристикам. Изобретение касается также способов применения фермента dDAP для выделения дипептидов у N-конца рекомбинантно полученных исходных белков и пептидов. Фермент dDAP по настоящему изобретению может быть использован для выделения отдельных дипептидов у N-конца полипептидов, а также для последовательного выделения более чем одного дипептида у N-конца исходных полипептидов. И, наконец, изобретение касается способов выделения и очистки фермента dDAP из культуры Dictyostelium discoideum.
Для пояснения целей настоящего изобретения, приведенных выше, введены следующие термины и сокращения:
dDAP дипептидиламинопептидаза, выделенная из Dictyostelium discoideum, оптимальный рН для которой составляет приблизительно 3,5, при использовании в качестве субстрата GFpNA, и имеющая, по данным аналитического ультрацентрифугирования, природную мол. м. около 225000 Да и подблочную мол. м. по данным гельэлектрофореза на полиакриламиде SDS, около 66000 Да.
dDAP дипептидиламинопептидаза, выделенная из Dictyostelium discoideum, оптимальный рН для которой составляет приблизительно 3,5, при использовании в качестве субстрата GFpNA, и имеющая, по данным аналитического ультрацентрифугирования, природную мол. м. около 225000 Да и подблочную мол. м. по данным гельэлектрофореза на полиакриламиде SDS, около 66000 Да.
GFpNA Gly-Phe-p-нитроанилид.
Исходный полипептид рекомбинантно полученный полипептид, который состоит из четного количества аминокислот, выстроенных с аминного конца заданного целевого полипептида.
Превращенный полипептид полипептид, в котором удален N-концевой дипептид или дипептиды с целью получения заданного полипептида
RRBNA Arg-Arf-β-нафталамид.
RRBNA Arg-Arf-β-нафталамид.
Все сокращения для аминокислот, используемые в описании данного изобретения, приняты управлением США по патентам и товарным знакам в соответствии с 37 C.F.R. параграф 1.822(b) (2) (1190).
Настоящее изобретение относится к dDAP, дипептидиламинопептидазе, выделенной из клеточного слизневого грибка Dictyostelium discoideum. Фермент dDAP проявляет склонность к расщеплению последовательностей незаблокированных аминокислотных остатков, которую обычно связывают с как DAP-I, так и DAP-III, однако dDAP значительно отличается от указанных ферментов как по физическим, так и по другим ферментативным характеристикам, dDAP имеет оптимальный рН около 3,5 при использовании в качестве субстрата GFpNA и природную мол. м. около 225000 Да и подблочную мол. м. около 66000 Да. Афинная хроматография на лектинах показывает, что фермент dDAP, вероятно, является гликопротеином. dDAP обладает способностью выделять дипептиды из синтетических субстратов, Gly-Phe-p-нитроанилида (GFpNA) и Arg-Arg-b-нафтиламида (RRBNA), а также из других синтетических и полученных рекомбинантно полипептидов.
Известный фермент DAP-I был выделен из большого количества организмов животных и животных тканей. Новый фермент, dDAP, выделен из бульона с культурой Dictyostelium discoideum. Фермент DAP-I требует для проявления своей активности присутствия галогена и восстановительного агента. Такие реагенты, как иодоацетат, которые модифицируют SH группы цистеина, дезактивируют фермент DAP-I, DAP-I проявляет оптимальную активность при рН между 5 и 6. Напротив, для dDAP, оптимальное значение рН составляет приблизительно 3,5, при использовании в качестве субстратов Gly-Phe-p-NA или Gly-Arg-p-NA, и он проявляет значительную активность при рН 3,5 по отношению к пептидам и белкам. Фермент dDAP лишен какой бы то ни было активности при рН более 6. Фермент dDAP не требует дополнительного применения восстановительного агента и полностью активен в присутствии модификаторов цистеина, таких как иодоацетат или тетратионат. dDAP напоминает бычий DAP-I в том, что он не в состоянии расщепить пептиды с заблокированными N-концами, однако в отличие от бычьего DAP-I dDAP активен по отношению к окисленному метионину у N-конца. Бычий DAP-I не в состоянии расщепить субстраты с окисленными метионинами у N-конца. Далее в отличие от DAP-I фермент dDAP легко расщепляет субстрат Arg-Arg-b-нафтиламид. Это способность расщеплять субстраты, содержащие аминоконцевые дипептидилы Arg-Arg, скорее напоминает активность ферментов DAP-III, выделенных из млекопитающих или микробных источников, однако сообщалось, что фермент DAP-III имеет оптимальное значение рН в щелочной области, в то время как dDAP функционирует наиболее эффективно в кислой области. Субблочная мол. м. dDAP, установленная по SDS PAGE, приблизительно составляет 66000 Да, в то время как субблочная мол. м. DAP-I млекопитающих составляет около 22000 Да.
Фермент dDAP по изобретению наиболее пригоден для получения превращенных полипептидов из исходных полипептидов. Например, если заданным полипептидом является человеческий гормон роста, необходимо лишь выделить исходный для человеческого гормона роста полипептид (в частности, Met-Asp-человеческий гормон роста и подействовать на него активностью dDAP, чтобы разделить дипептид Met-Asp и желаемый превращенный полипептид, человеческий гормон роста. Превращенный полипептид не обязательно должен быть "природным" некультивированным полипептидом, поскольку часто требуется получить аналоги или промежуточные соединения. Метод превращения исходных полипептидов также является частью настоящего изобретения. Другими исходными полипептидами, которые могут быть подвергнуты превращению с использованием dDAP, являются Met-Arg-hGH, Met-Tyr-проинсулин, аналог Met-Arg-проинсулина (В28 Lys, B29 Pro), аналог Met-Tyr-проинсулина (B28 Lys, B29 Pro), аналог Met-Arg-проинсулина (B10, Asp, des B29-30) и аналог Met-Tyr-проинсулина (B10 Asp, des B28-30). Аналог инсулина (B28 Lys, B29 Pro) описан в Европейской заявке на патент с серийным номером 90301224.3, а аналог инсулина (B10 Asp, des B28-30) описан в Европейской заявке на патент с серийным номером 92305678.2. Далее, dDAP может быть использован для последовательного выделения более одного дипептида у N-конца исходных полипептидов. Превращение Met-Arg-проинсулина и аналогов Met-Arg-проинсулина с применением DAP-1 быка описано Becker et.al, в заявке на патент США с номером 5126249, опубликованной 30 июня 1992, полная методика которой приводится здесь в качестве ссылки.
Преимущество использования фермента dDAP для удаления дипептидов из исходных белков состоит в том, что dDAP имеет оптимальное значение рН около 3,5, что позволяет проводить реакцию в кислой среде, в которой смогут быть растворены многие исходные полипептиды. Далее, превращение некоторых исходных полипептидов в нейтральных или больших значениях рН может привести к более высоким уровням образования межцепочечных дисульфидных димеров или полимеров субстрата, что сопровождается уменьшением выхода продукта. Это явление, получившее название дисульфидного захвата, представляет особую проблему, когда используют бычий DAP-I, поскольку DAP-I требует добавления к реакционной смеси восстановительных агентов, таких как бета-меркаптоэтанол или цистеин. В кислотном интервале значений рН также наблюдается более медленное окисление остатков метионина. Далее экономически целесообразнее использовать фермент, полученный из культуры Dictyostelium discoideum, чем полагаться на коммерческое производство ферментов из животных источников, поскольку ферментационная технология обеспечивает большую однородность продукта и воспроизводимость фермента. Отказ от ферментов, полученных из животных источников, позволяет получить постоянный источник особо чистого объемного материала. Ферментация Dictyostelium discoideum Ax3 (АТСС 28368) с последующим центрифугированием, анионной обменной хроматографией, хроматографией гидрофобных взаимодействий и хроматографией по размеру молекул приводит к высоко чистому раствору фермента dDAP, который можно хранить или же немедленно использовать для превращения исходных полипептидов. Выделение и очистка dDAP из ферментационного бульона также является частью настоящего изобретения.
Изменение исходных полипептидов в превращенные может быть осуществлено в широком интервале значений температуры, рН и времени. Реакцию обычно проводят в водной среде, которая содержит подходящий буфер для поддержания заданного значения рН в интервале приблизительно от 2,5 до 5,5. Предпочтительно, рН среды составляет от 3,0 до приблизительно 4,5, а еще более предпочтительно от 3,0 до приблизительно 3,5. Оптимальное значение рН может слегка изменяться в зависимости от субстрата. Например, скорость превращения Gly-Phe-pNA и Gly-Arg-pNA наибольшая при рН приблизительно 3,5, в то время как скорость превращения Met-Asp-hGH наибольшая в интервале рН приблизительно от 3,0 до 3,5. Скорость превращения Arg-Arg-bNA наибольшая при рН около 4,5. Опытный экспериментатор согласится с тем, что оптимальное значение рН конкретной реакции определяется такими факторами как устойчивость и растворимость данного исходного полипептида и фермента. В некоторых случаях могут быть применены солюбилизаторы, такие как мочевина, додецилсульфат натрия, гуанидин и т.п.
Реакция может протекать в течение любого временного интервала, начиная от нескольких секунд до нескольких дней. Предпочтительное время проведения реакции составляет от 1 мин до 24 ч, а наиболее предпочтительно от приблизительно 1 ч до приблизительно 8 ч. Опытный экспериментатор согласится с тем, что время проведения реакции можно подобрать таким образом, чтобы перекрыть любое значение, требуемое для любого необходимого исходного полипептида или превращенного полипептида.
Температуру проведения реакции также можно подобрать для каждого определенного субстрата. Реакцию предпочтительно проводят при температуре приблизительно от 15oC до 45oC. Более предпочтительная температура реакции лежит в интервале приблизительно от 20oC до 37oC, а наиболее предпочтительная температура реакции лежит в интервале приблизительно от 25oC до 37oC. Вновь, опытный экспериментатор согласится с тем, что такие параметры реакции, как время, температура и рН могут меняться в зависимости от свойств требуемого исходного или превращенного полипептида.
Может быть использован большой круг буферных агентов, единственным требованием является их способность поддерживать рН в заданном интервале. Примерами типичных буферных агентов являются фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, глицин и т.п. Предпочтительными буферными агентами являются ацетат натрия, фосфат натрия и глицин.
Исходные полипептиды для использования по изобретению обычно получают по рекомбинантной технологии с использованием ДНК. В процессе их получения кодирующую последовательность нуклеотидов для требуемого исходного полипептида подготавливают по обычным для этого синтеза методикам. Эти методы, как правило, включают подготовку кода олигонуклеотидов как для фрагментов требуемой кодирующей последовательности, так и комплементарной ей последовательности, олигонуклеотиды подготовлены таким образом, чтобы обеспечить перекрывание одного фрагмента кодирующей последовательности с двумя фрагментами комплементарной последовательности, и наоборот. Олигонуклеотиды группируются парами и связываются, образуя в конце концов заданную последовательность гена.
Эту последовательность наносят на клонирующий вектор с тем, чтобы выделить продукт, который он кодирует. Подходящий клонирующий вектор содержит по меньшей мере часть контрольной последовательности.
Следующие примеры приведены для пояснения настоящего изобретения, но не для его ограничения.
Пример 1. Ферментация Dictyostelium discoideum
Лиофилизованные культуры Dictyostelium discoideum Ах3 были получены из American Type Culture Cjlltection (Роквиль, штат Мериленд) по номеру каталога АТСС 28388 и были нанесены с разной толщиной на пластины из агар-агара (1,2% Difco Bacto Agar), содержащие буферную среду дрожжевой экстракт пептон при следующем содержании компонентов, г/л: дрожжевой экстракт Difco (7,15), пептон Difco Bacto (14,3), Na2HPO4 (0,51) и KH2PO4 (0,49), к которому асептично после нескольких стерилизаций прибавляют глюкозу (окончательная концентрация 10 г/л) и рН которого доводят до конечного значения 6,5 (+/-0,1) с помощью едкого натра или серной кислоты. Ту же среду (без добавления агар-агара) используют для выращивания жидкой культуры в объемах не более 1 л. Пластины агар-агара помещают на 3 5 дней в термостат при температуре от 21oC до 24oC. Мешочки со спорами осторожно снимают с пластин, чтобы предотвратить попадание "пищевых бактерий", лиофилизованных с культурой Ах3, а затем вносят в 3 мл бульона буферный дрожжевой экстракт - пептон и выращивают при небольшом встряхивании при 21 24oC. Далее клетки Dictyostelium discoideum распространяют последовательным переносом в бульон буферный дрожжевой экстракт пептон с большим объемом. Каждую операцию последовательного переноса осуществляют разбавлением от 10 до 25 раз, которое проводят, когда плотность клеток превысит значение около 2 х 106 /мл. Бульоны выдерживают в одинаковых условиях при 21 24oC при небольшом перемешивании.
Лиофилизованные культуры Dictyostelium discoideum Ах3 были получены из American Type Culture Cjlltection (Роквиль, штат Мериленд) по номеру каталога АТСС 28388 и были нанесены с разной толщиной на пластины из агар-агара (1,2% Difco Bacto Agar), содержащие буферную среду дрожжевой экстракт пептон при следующем содержании компонентов, г/л: дрожжевой экстракт Difco (7,15), пептон Difco Bacto (14,3), Na2HPO4 (0,51) и KH2PO4 (0,49), к которому асептично после нескольких стерилизаций прибавляют глюкозу (окончательная концентрация 10 г/л) и рН которого доводят до конечного значения 6,5 (+/-0,1) с помощью едкого натра или серной кислоты. Ту же среду (без добавления агар-агара) используют для выращивания жидкой культуры в объемах не более 1 л. Пластины агар-агара помещают на 3 5 дней в термостат при температуре от 21oC до 24oC. Мешочки со спорами осторожно снимают с пластин, чтобы предотвратить попадание "пищевых бактерий", лиофилизованных с культурой Ах3, а затем вносят в 3 мл бульона буферный дрожжевой экстракт - пептон и выращивают при небольшом встряхивании при 21 24oC. Далее клетки Dictyostelium discoideum распространяют последовательным переносом в бульон буферный дрожжевой экстракт пептон с большим объемом. Каждую операцию последовательного переноса осуществляют разбавлением от 10 до 25 раз, которое проводят, когда плотность клеток превысит значение около 2 х 106 /мл. Бульоны выдерживают в одинаковых условиях при 21 24oC при небольшом перемешивании.
Ферментации при перемешивании обычно проводят в аналогичной среде, заменяя пептон Bacto в исходной среде "буферный дрожжевой экстракт пептон" на соевый пептон (например пептон Phytone или соевый пептон Marcor) с концентрацией от 2 до 14,3 г/л. Выделяют целевой продукт из ферментаторов с рабочим объемом от 10 до 5000 л, снабженных от 1 до 3 турбин типа Rushton, рабочие колеса которых вращаются со скоростью 40 150 об/мин. Температуру поддерживают на уровне 22 ±1oC, поток воздуха устанавливают на уровне от 0,1 до 0,5 объемов воздуха на объем жидкости в бульоне, а обратное давление поддерживают на уровне 3 5 р.s.i. Некоторые ферментации проводят, поддерживая рН на уровне 6,4 с помощью серной кислоты, а некоторые ферментации проводят, контролируя количество растворенного кислорода на уровне 40 60% с помощью изменения скорости перемешивания и скорости газового потока. Принимают меры для уменьшения количества срезов при переносе и ферментации клеток, поскольку в процессе роста они представляют собой амебу, не имеющую клеточных стенок.
В общем случае перемешиваемые культуры Dictyostelium discoideum Ах3 растут с временем удвоения от 12 до 36 ч. Количество растворенного кислорода быстро уменьшается (если его содержание не поддерживается на заданном уровне), а затем начинает возрастать через некоторое время после того, как плотность клеток прекращает увеличиваться. Заключительная плотность клеток составляет от 3 • 106/мл до 5 • 107/мл, при этом перенос кислорода, вероятно, лимитирован в тех ферментациях, при которых достигается нижний указанный предел плотности клеток.
Время от времени отбирают пробы, которые подвергают анализу на плотность клеток и активность по отношению к GF-pNA (см. ниже пример 3). Для оценки плотности клеток выше приблизительно 5 • 105/мл используют счетную камеру Петрова-Хаузера. В целом, активность по отношению к GFpNA возрастает в процессе ферментации. Максимальная активность dDAP наблюдается через 2 4 дня после того, как достигается максимальная плотность клеток. Весь бульон целиком хранят при 4oC или же замораживают при -20oC, а позднее размораживают и анализируют активность. Ферментации выделяют охлаждением до температуры менее 10oC с последующим центрифугированием в постоянном потоке.
Пример 2. Получение dDAP
А. Удаление клеток и концентрирование
Первичная очистка dDAP, полученной из Dictyostelium discoideum, включает в себя операции удаления клеток и концентрирования. Удаление клеток осуществляют центрифугированием в постоянном потоке на центрифуге Western States. Свободную от клеток среду концентрируют в 20 раз с помощью ультрафильтрации с тангенциальным потоком на мембране, отсекающей мол. м. 50000. Остаток сливают из узла ультрафильтрации, который дополнительно промывают буфером Tris, рН 7, с концентрацией 50 мМ для выделения дополнительного количества dDAP. Остаток и промывочный раствор объединяют, получая конечный концентрат, который хранят замороженным при -20oC в течение нескольких месяцев перед проведением дальнейших операций.
А. Удаление клеток и концентрирование
Первичная очистка dDAP, полученной из Dictyostelium discoideum, включает в себя операции удаления клеток и концентрирования. Удаление клеток осуществляют центрифугированием в постоянном потоке на центрифуге Western States. Свободную от клеток среду концентрируют в 20 раз с помощью ультрафильтрации с тангенциальным потоком на мембране, отсекающей мол. м. 50000. Остаток сливают из узла ультрафильтрации, который дополнительно промывают буфером Tris, рН 7, с концентрацией 50 мМ для выделения дополнительного количества dDAP. Остаток и промывочный раствор объединяют, получая конечный концентрат, который хранят замороженным при -20oC в течение нескольких месяцев перед проведением дальнейших операций.
Б. Осветление
Замороженный конечный концентрат оттаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. После оттаивания конечный концентрат осветляют перед первым этапом колоночной хроматографии. Осветление проводят с помощью центрифугирования с последующей фильтрацией через мембрану с размером пор 5 мкм. Доводят рН осветленного конечного концентрата до 7,0 и хранят его при температуре 4 10oC не более 12 ч перед операцией анионной обменной хроматографии.
Замороженный конечный концентрат оттаивают в течение 12 ч при комнатной температуре. После оттаивания конечный концентрат осветляют перед первым этапом колоночной хроматографии. Осветление проводят с помощью центрифугирования с последующей фильтрацией через мембрану с размером пор 5 мкм. Доводят рН осветленного конечного концентрата до 7,0 и хранят его при температуре 4 10oC не более 12 ч перед операцией анионной обменной хроматографии.
В. Анионная обменная хроматография
Первой хроматографической стадией процесса очистки dDAP является ионообменная хроматография с использованием смолы Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow (FFQ). Колонку уравновешивают 50 мМ буфера Tris, рН 7. Осветленный очищенный от клеток концентрат подают с линейной скоростью потока 50 см/ч при отношении 60 л неконцентрированной ферментативной среды на 1 л смолы. Это приводит к загрузке белка на уровне 60 г на 1 л смолы (количественную оценку белка проводят по методике Pierce BCA Protein Assay по отношению к стандартному образцу альбумина бычьей сыворотки). На 1 л смолы FFQ подают приблизительно 250 единиц активности dDAP. Проводимость освобожденного от клеток концентрата составляет около 5 mMHOS на 1 см. По окончании загрузки образца смолу FFQ промывают уравновешивающим буферным раствором в количестве, равном трем объемам колонки. Активность dDAP элюируют из смолы, используя линейный градиент NaCl от 0 до 1 М, 50 мМ буфер Tris, рН 7, в количестве, равном 10 объемам колонки, со скоростью 50 см/ч. Размер фракции составляет 0,1 от объема колонки. Далее колонку с FFQ элюируют 1,0 М раствором NaCl в 50 мМ буфера Tris, рН 7, в количестве трех объемов колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять колориметрический субстрат Gly-Phe-п-нитроанилид (GFpNA) при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около двух объемов колонки. Целевую фракцию подкисляют до рН 3,5 10%-ным раствором HCl. Подкисленную целевую фракцию после FFQ хранят при 4oC не более двух дней.
Первой хроматографической стадией процесса очистки dDAP является ионообменная хроматография с использованием смолы Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow (FFQ). Колонку уравновешивают 50 мМ буфера Tris, рН 7. Осветленный очищенный от клеток концентрат подают с линейной скоростью потока 50 см/ч при отношении 60 л неконцентрированной ферментативной среды на 1 л смолы. Это приводит к загрузке белка на уровне 60 г на 1 л смолы (количественную оценку белка проводят по методике Pierce BCA Protein Assay по отношению к стандартному образцу альбумина бычьей сыворотки). На 1 л смолы FFQ подают приблизительно 250 единиц активности dDAP. Проводимость освобожденного от клеток концентрата составляет около 5 mMHOS на 1 см. По окончании загрузки образца смолу FFQ промывают уравновешивающим буферным раствором в количестве, равном трем объемам колонки. Активность dDAP элюируют из смолы, используя линейный градиент NaCl от 0 до 1 М, 50 мМ буфер Tris, рН 7, в количестве, равном 10 объемам колонки, со скоростью 50 см/ч. Размер фракции составляет 0,1 от объема колонки. Далее колонку с FFQ элюируют 1,0 М раствором NaCl в 50 мМ буфера Tris, рН 7, в количестве трех объемов колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять колориметрический субстрат Gly-Phe-п-нитроанилид (GFpNA) при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около двух объемов колонки. Целевую фракцию подкисляют до рН 3,5 10%-ным раствором HCl. Подкисленную целевую фракцию после FFQ хранят при 4oC не более двух дней.
Г. Хроматография гидрофобных взаимодействий
Подкисленную целевую фракцию после FFQ далее очищают методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (HlC) на смоле Pharmacia Phenyl Sepharose Fast Flow. Объем колонки составляет одну треть от объема колонки для ионообменной хроматографии. Помещают около 650 единиц активности на 1 л смолы, а загрузка белка составляет 4 г на 1 л смолы (1 единица поглощения при 280 нм соответствует 1 мг/мл белка). Целевая фракция после FFQ была подготовлена для загрузки в колонку HlC прибавления сульфата аммония в количестве 140 г на 1 л, рН доводят до 3,5, при этом окончательная электропроводность составляет около 90 mMHOS на 1 см. Колонку HlC уравновешивают 50 мМ цитратным буфером, рН 3,5, содержащим сульфат аммония в количестве не менее 140 г на 1 л. Загрузку осуществляют с линейной скоростью потока 40 см/ч и промывают смолу уравновешивающим буфером в количестве не менее трех объемов колонки. Активность dDAP элюируют из смолы, используя линейный градиент сульфата аммония от 140 г на 1 л до 0 г на 1 л в 50 мМ цитратном буфере, рН 3,5, в количестве, равном 10 объемам колонки, со скоростью 40 см/ч. Далее колонку промывают 50 мМ раствором цитратного буфера, рН 3,5, в количестве, равном трем объемам колонки. Размер фракции составляет 0,1 объема колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять GFpNA при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около двух объемов колонки. Целевую фракцию подкисляют до рН 3,5 10%-ным раствором HCl или 10%-ным раствором NaOH. Целевую фракцию после HlC хранят при 4oC не более одного дня до начала проведения превращений.
Подкисленную целевую фракцию после FFQ далее очищают методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (HlC) на смоле Pharmacia Phenyl Sepharose Fast Flow. Объем колонки составляет одну треть от объема колонки для ионообменной хроматографии. Помещают около 650 единиц активности на 1 л смолы, а загрузка белка составляет 4 г на 1 л смолы (1 единица поглощения при 280 нм соответствует 1 мг/мл белка). Целевая фракция после FFQ была подготовлена для загрузки в колонку HlC прибавления сульфата аммония в количестве 140 г на 1 л, рН доводят до 3,5, при этом окончательная электропроводность составляет около 90 mMHOS на 1 см. Колонку HlC уравновешивают 50 мМ цитратным буфером, рН 3,5, содержащим сульфат аммония в количестве не менее 140 г на 1 л. Загрузку осуществляют с линейной скоростью потока 40 см/ч и промывают смолу уравновешивающим буфером в количестве не менее трех объемов колонки. Активность dDAP элюируют из смолы, используя линейный градиент сульфата аммония от 140 г на 1 л до 0 г на 1 л в 50 мМ цитратном буфере, рН 3,5, в количестве, равном 10 объемам колонки, со скоростью 40 см/ч. Далее колонку промывают 50 мМ раствором цитратного буфера, рН 3,5, в количестве, равном трем объемам колонки. Размер фракции составляет 0,1 объема колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять GFpNA при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около двух объемов колонки. Целевую фракцию подкисляют до рН 3,5 10%-ным раствором HCl или 10%-ным раствором NaOH. Целевую фракцию после HlC хранят при 4oC не более одного дня до начала проведения превращений.
Д. Хроматография по размеру молекул
Целевую фракцию после HlC подвергают далее хроматографиии по размеру молекул (SEC) на носителе S-200 Sepharose HR. Объем колонки вдвое превышает объем HlC колонки с высотой основания 78 см. Целевую фракцию после HlC готовят для SEC колонки концентрированием целевой фракции после HlC в ультрацентрифуге с использованием мембраны, отсекающей мол. м. 10000 Да. Целевую фракцию после HlC концентрируют до уровня 2,5% от объема SEC колонки и остаток выделяют из ультрацентрифуги. Узел ультрацентрифуги промывают 50 мМ раствором цитратного буфера, рН 3,5, в количестве 2,5% от объема SEC колонки. Остаток и промывочный раствор объединяют, получая конечный концентрат и доводят его рН до 3,5 с помощью 10%-ного раствора HCl или 10%-ного раствора NaOH. Электропроводность конечного концентрата составляет около 30 mMHOS на 1 см. SEC колонку уравновешивают раствором 50 мМ уксусной кислоты, 20 мМ хлористого натрия, рН 3,5, имеющего электропроводность около 2 mMHOS на 1 см. Загрузку конечного концентрата осуществляют с линейной скоростью потока 15 см/ч и активность dDAP элюируют из смолы, используя уравновешивающий буферный раствор в количестве, равном одному объему колонки. Размер фракции составляет 0,02 объема колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять GFpNA при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около 0,08 объема колонки. Целевую фракцию после SEC можно сохранять при 4oC в течение нескольких месяцев.
Целевую фракцию после HlC подвергают далее хроматографиии по размеру молекул (SEC) на носителе S-200 Sepharose HR. Объем колонки вдвое превышает объем HlC колонки с высотой основания 78 см. Целевую фракцию после HlC готовят для SEC колонки концентрированием целевой фракции после HlC в ультрацентрифуге с использованием мембраны, отсекающей мол. м. 10000 Да. Целевую фракцию после HlC концентрируют до уровня 2,5% от объема SEC колонки и остаток выделяют из ультрацентрифуги. Узел ультрацентрифуги промывают 50 мМ раствором цитратного буфера, рН 3,5, в количестве 2,5% от объема SEC колонки. Остаток и промывочный раствор объединяют, получая конечный концентрат и доводят его рН до 3,5 с помощью 10%-ного раствора HCl или 10%-ного раствора NaOH. Электропроводность конечного концентрата составляет около 30 mMHOS на 1 см. SEC колонку уравновешивают раствором 50 мМ уксусной кислоты, 20 мМ хлористого натрия, рН 3,5, имеющего электропроводность около 2 mMHOS на 1 см. Загрузку конечного концентрата осуществляют с линейной скоростью потока 15 см/ч и активность dDAP элюируют из смолы, используя уравновешивающий буферный раствор в количестве, равном одному объему колонки. Размер фракции составляет 0,02 объема колонки. Эффлюент контролируют по электропроводности и поглощению при 280 нм и фракции подвергают анализу на активность dDAP по их способности расщеплять GFpNA при рН 3,5. Целевую фракцию составляют, объединяя фракции, содержащие приблизительно 90% общей активности dDAP, подвергнутой элюированию. Активность dDAP элюируется в виде одиночного пика в количестве около 0,08 объема колонки. Целевую фракцию после SEC можно сохранять при 4oC в течение нескольких месяцев.
Очистка dDAP с использованием комбинации ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий и хроматографии по размерам молекул приводит к материалу, который перемещается в виде широкой полосы в SDS PAGE. Полоса перемещается к точке на геле, которой соответствует молекулярный эквивалент стандартного альбумина сыворотки быка (66 кДа). Этот белок подкрашивают красителем ISS Pro-blue. На картину перемещения в процессе приготовления образца не оказывает влияние присутствие или отсутствие 0,1 М DTT (плюс температура 100oC в течение 5 мин). Субблочная мол. м. DAP-I быка, определенная по методу SDS-PAGE, составляет 22000 Да.
Пример 3. Активность dDAP
А. Реакции конверсии
1. Расщепление GF-pNA
Активность dDAP обычно контролируют по следующей реакции расщепления хромогенного субстрата Gly-Phe-п+-нитроанилида (GF-pNA). Как правило, анализ проводят 11-кратным разбавлением фермента в 1,0 мл 4 мМ раствора GFpNA с рН 3,5. Скорость расщепления GF дипептида контролируют при 37oC, измеряя увеличение поглощения при 405 нм. В этих условиях одна единица активности приводит к изменению оптической плотности на 0,90 единиц за 1 мин. Оценку величины единица/мл можно провести, приняв коэффициент экстинкции свободной pNA равным 9,9 мМ-1см-1 при 405 нм.
А. Реакции конверсии
1. Расщепление GF-pNA
Активность dDAP обычно контролируют по следующей реакции расщепления хромогенного субстрата Gly-Phe-п+-нитроанилида (GF-pNA). Как правило, анализ проводят 11-кратным разбавлением фермента в 1,0 мл 4 мМ раствора GFpNA с рН 3,5. Скорость расщепления GF дипептида контролируют при 37oC, измеряя увеличение поглощения при 405 нм. В этих условиях одна единица активности приводит к изменению оптической плотности на 0,90 единиц за 1 мин. Оценку величины единица/мл можно провести, приняв коэффициент экстинкции свободной pNA равным 9,9 мМ-1см-1 при 405 нм.
Профиль ингибирования dDAP по отношению к субстрату GF-pNA сравнивали с соответствующей характеристикой DAP-I быка, используя иодоацетамид и тетратионат натрия, агенты, модифицирующие SH-группы, которые, как известно, ингибируют активность DAP-I. Образцы dDAP или DAP-I из селезенки быка выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре в растворах обоих ингибиторов с концентрациями 0; 0,5; 5,0 или 50 мМ при рН 7 в 100 мМ раствора буфера Tris. Затем проводят 21-кратное разбавление выдержанных растворов в 4 мМ растворе GF-pNA с рН 3,5. Скорость расщепления контролируют, измеряя увеличение поглощения при 405 нм при 37oC. В случае DAP-I скорость расщепления GF-pNA уменьшается более чем на 90% при обработке 5 мМ иодоацетамидом и на 95% ингибируется действием 5 мМ тетратионата натрия. Не наблюдается существенного ингибирования dDAP при действии любых использованных при испытании уровней концентрации иодоацетамида или тетратионата.
Оптимальные рН для расщепления GF-pNA с использованием dDAP определяют, изменяя кислотность буферного раствора, содержащего Tris, фосфат и цитрат, с помощью 10%-ного раствора HCl или 10%-ного раствора NaOH в интервале от 3 до 8. Фермент dDAP подвергают 20-кратному разбавлению в 100 мМ растворе цистамина и 10мМ NaCl. DAP-I быка подвергнут 200-кратному разбавлению в том же буфере. Готовят раствор субстрата GF-pNA (4 мМ) в 2%-ном ДМФА. В микролитровой кювете объединяют 0,025 мл буфера Tris /фосфат/цитрат с различными значениями рН, 0,1 мл разбавленного фермента и 0,1 мл раствора субстрата. Скорость увеличения поглощения при 410 нм определяют в течение 30 мин. Результаты показывают, что оптимальный рН для dDAP при расщеплении GF-pNA находится в интервале от 3,5 до 4,0.
2. Расщепление Gly-Arg-pNA
4 Мм Gly-Arg-hNA (GR-pNA) готовят в 50 мМ уксусной кислоты и 50 мМ глицинового буфера, рН 5. Для получения разнообразных значений рН в интервале от 5,1 до 2,3 используют HCl или NaOH. К 180 ед/л полученного буферного раствора субстрата прибавляют 5 ед/л dDAP (конечная концентрация соответствует 49 миллиед. /мл). Контролируют скорость увеличения поглощения при 410 нм и сопоставляют ее с рН реакционной смеси. Как и в случае GF-pNA, оптимум рН для субстрата GF-pNA составляет около 3,5. При использовании данного субстрата фермент проявляет незначительную активность при рН менее 2,5 и рН более 5.
4 Мм Gly-Arg-hNA (GR-pNA) готовят в 50 мМ уксусной кислоты и 50 мМ глицинового буфера, рН 5. Для получения разнообразных значений рН в интервале от 5,1 до 2,3 используют HCl или NaOH. К 180 ед/л полученного буферного раствора субстрата прибавляют 5 ед/л dDAP (конечная концентрация соответствует 49 миллиед. /мл). Контролируют скорость увеличения поглощения при 410 нм и сопоставляют ее с рН реакционной смеси. Как и в случае GF-pNA, оптимум рН для субстрата GF-pNA составляет около 3,5. При использовании данного субстрата фермент проявляет незначительную активность при рН менее 2,5 и рН более 5.
3. Расщепление Arg-Arg-B-нафтиламида (RR-BNA)
Готовят раствор приблизительно 0,25 мМ RR-BNA или 0,25 мМ бензилоксикарбонил-RR-BNA либо в 100 мМ уксусной кислоты, рН 3,5, или 100 мМ цитратного буфера, рН 5,0. К 2 мл субстрата прибавляют dDAP или DAP-I быка (в виде раствора 15 миллиед./мл). Контролируют скорости расщепления (контроль проводят по усилению флюоресценции при 410 нм при возбуждении светом с длиной волны 340 нм). DAP-I быка не в состоянии расщепить ни один из этих субстратов. Неожиданно dDAP оказывается способным эффективно расщеплять субстрат RR-BNA, dDAP не в состоянии расщепить Z-RR-BNA субстрат с заблокированной аминогруппой, что подтверждает вывод о том, что dDAP является ферментом типа ДАП. Оптимальное значение рН устанавливают путем контроля скорости расщепления RR-BNA с использованием буферной системы, состоящей из 50 нМ уксусной кислоты и 50 мМ цитрата. Различные величины рН достигаются с помощью HCl или NaOH и к 1,5 мл полученных растворов прибавляют 0,5 мл 1 мМ раствора RR-BNA (конечная концентрация составляет 0,25 мМ). Прибавляют dDAP и определяют скорость расщепления. Оптимальное значение рН для расщепления RR-BNA составляет 4,5, при этом значительная активность наблюдается во всем изученном диапазоне (рН от 3,5 до 5,7). Этот удивительный результат говорит о том, что dDAP обладает некоторыми свойствами, присущими DAP-III.
Готовят раствор приблизительно 0,25 мМ RR-BNA или 0,25 мМ бензилоксикарбонил-RR-BNA либо в 100 мМ уксусной кислоты, рН 3,5, или 100 мМ цитратного буфера, рН 5,0. К 2 мл субстрата прибавляют dDAP или DAP-I быка (в виде раствора 15 миллиед./мл). Контролируют скорости расщепления (контроль проводят по усилению флюоресценции при 410 нм при возбуждении светом с длиной волны 340 нм). DAP-I быка не в состоянии расщепить ни один из этих субстратов. Неожиданно dDAP оказывается способным эффективно расщеплять субстрат RR-BNA, dDAP не в состоянии расщепить Z-RR-BNA субстрат с заблокированной аминогруппой, что подтверждает вывод о том, что dDAP является ферментом типа ДАП. Оптимальное значение рН устанавливают путем контроля скорости расщепления RR-BNA с использованием буферной системы, состоящей из 50 нМ уксусной кислоты и 50 мМ цитрата. Различные величины рН достигаются с помощью HCl или NaOH и к 1,5 мл полученных растворов прибавляют 0,5 мл 1 мМ раствора RR-BNA (конечная концентрация составляет 0,25 мМ). Прибавляют dDAP и определяют скорость расщепления. Оптимальное значение рН для расщепления RR-BNA составляет 4,5, при этом значительная активность наблюдается во всем изученном диапазоне (рН от 3,5 до 5,7). Этот удивительный результат говорит о том, что dDAP обладает некоторыми свойствами, присущими DAP-III.
Опытный экспериментатор должен признать, что оптимальное значение рН для расщепления субстрата зависит не только от фермента, но и самого субстрата, т. е. состава удаляемого дипептида, а также самой индикаторной группы. Например, при использовании dDAP Gly-Arg-pNA имеет оптимальное значение рН около 3,5, в то время как оптимальное значение рН для расщепления Gly-Arg-7-амидо-4-метилкумарина составляет около 5, что свидетельствует о том, что указанная группа может влиять на свойства при расщеплении.
Б. Превращения синтетических октапептидов и декапептидов
Октапептид Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu растворяют для получения раствора с концентрацией 4мМ в растворе 50 мМ уксусной кислоты, рН 3,5. Полученный раствор разбавляют 1:1 с помощью dDAP (10 миллиед./мл) и выдерживают при комнатной температуре в течение 6 ч. Прекращают реакцию 20-кратным разбавлением реакционной массы в 7 М растворе мочевины, содержащем 1% фосфорной кислоты. Взятые из полученной смеси пробы анализируют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) с обращенной фазой. Продукты расщепления сравнивают со стандартами, приготовленными из октапептида, дипептида Met-Asp и гексапептида Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu, dDAP легко выделяет дипептид Met-Asp у свободного аминного конца октапептида, но не может также легко расщепить образующийся дипептид Phe-Pro.
Октапептид Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu растворяют для получения раствора с концентрацией 4мМ в растворе 50 мМ уксусной кислоты, рН 3,5. Полученный раствор разбавляют 1:1 с помощью dDAP (10 миллиед./мл) и выдерживают при комнатной температуре в течение 6 ч. Прекращают реакцию 20-кратным разбавлением реакционной массы в 7 М растворе мочевины, содержащем 1% фосфорной кислоты. Взятые из полученной смеси пробы анализируют методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) с обращенной фазой. Продукты расщепления сравнивают со стандартами, приготовленными из октапептида, дипептида Met-Asp и гексапептида Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu, dDAP легко выделяет дипептид Met-Asp у свободного аминного конца октапептида, но не может также легко расщепить образующийся дипептид Phe-Pro.
Синтезированный декапептид Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu получают в виде исходного 1,7 мМ раствора в растворе 100 мМ глицина, рН 3,5. К 0,5 мл этого раствора прибавляют 8 мкл раствора, содержащего 6,4 миллиед./мл dDAP (готовят в растворе 100 мМ глицина, рН 3,5). Каждый час 5 мкл образовавшегося раствора непосредственно инжектируют в HPLC хроматографическую систему с обращенной фазой для контроля продуктов расщепления. Для сравнения независимо инжектируют дипептиды Met-Arg и Met-Tyr, а также пептиды Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu и Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu. dDAP легко выделяет дипептид Met-Arg из декапептида, а также образующийся дипептид Met-Tyr. Это свидетельствует о том, что с помощью dDAP дипептиды у аминного конца могут быть удалены последовательно.
В. Превращения гормона роста человека Met-Asp
Гормон роста человека Met-Asp (Met-Asp-hGH) получают в виде нерастворимого белка в цитоплазме E. coli. Нерастворимый белок солюбилизируют, свертывают с целью получения Met-Asp-hGH с нужными дисульфидными связями и очищают ионообменной хроматографией. Заменяют растворитель и доводят рН среды до 3,5. Met-Asp-hGH нагревают до 37oC и определяют поглощение при 280 нм. Прибавляют dDAP в количестве 6 миллиединиц на каждый грамм Met-Asp-hGH. Позволяют реакции превращения протекать при 37oC при перемешивании в течение от 4 до 6 ч. Протекание реакции может быть без ущерба замедленно путем использования меньшего количества фермента, более низкой температуры или меньшей концентрации Met-Asp-hGH. Скорость реакции можно увеличить, добавляя большее количество фермента, увеличивая концентрацию Met-Asp-hGH или температуру реакции. Ход реакции превращения контролируют хроматографией с обращенной фазой, реакцию превращения прерывают быстрым прибавлением NaOH при перемешивании до уровня рН 8 и прибавлением 30%-ного раствора ацетонитрила. Продукт реакции, гормон роста человека, полученный после действия dDAP, подвергают широкой серии аналитических процедур, включающих пептидное картографирование, определение последовательности аминокислот у N-конца, масс-спектрометрию, анализ на аминокислоты и хроматографию с обращенной фазой (HPLC). Все полученные данные указывают на то, что с помощью dDAP был получен продукт, аутентичный гормону роста человека.
Гормон роста человека Met-Asp (Met-Asp-hGH) получают в виде нерастворимого белка в цитоплазме E. coli. Нерастворимый белок солюбилизируют, свертывают с целью получения Met-Asp-hGH с нужными дисульфидными связями и очищают ионообменной хроматографией. Заменяют растворитель и доводят рН среды до 3,5. Met-Asp-hGH нагревают до 37oC и определяют поглощение при 280 нм. Прибавляют dDAP в количестве 6 миллиединиц на каждый грамм Met-Asp-hGH. Позволяют реакции превращения протекать при 37oC при перемешивании в течение от 4 до 6 ч. Протекание реакции может быть без ущерба замедленно путем использования меньшего количества фермента, более низкой температуры или меньшей концентрации Met-Asp-hGH. Скорость реакции можно увеличить, добавляя большее количество фермента, увеличивая концентрацию Met-Asp-hGH или температуру реакции. Ход реакции превращения контролируют хроматографией с обращенной фазой, реакцию превращения прерывают быстрым прибавлением NaOH при перемешивании до уровня рН 8 и прибавлением 30%-ного раствора ацетонитрила. Продукт реакции, гормон роста человека, полученный после действия dDAP, подвергают широкой серии аналитических процедур, включающих пептидное картографирование, определение последовательности аминокислот у N-конца, масс-спектрометрию, анализ на аминокислоты и хроматографию с обращенной фазой (HPLC). Все полученные данные указывают на то, что с помощью dDAP был получен продукт, аутентичный гормону роста человека.
Г. Превращения проинсулина человека Met-Arg
Проинсулин человека Met-Arg (Met-Arg-hPl) получают в виде нерастворимого белка в цитоплазме E.coli. Нерастворимый белок солюбилизируют в 7 М растворе мочевины. Белок очищают ионообменной хроматографией. Met-Arg-hPl сульфируют, заменяют растворитель и свертывают с целью образования нативных пар дисульфидных связей и нативной третичной структуры. Полученный образец очищают далее методом хроматографии с обращенной фазой. С помощью перекиси водорода из Met-Arg-hPl получают окисленный метионил (Met(0))-Arg-hPl, который далее подвергают очистке хроматографией с обращенной фазой и лиофилизации.
Проинсулин человека Met-Arg (Met-Arg-hPl) получают в виде нерастворимого белка в цитоплазме E.coli. Нерастворимый белок солюбилизируют в 7 М растворе мочевины. Белок очищают ионообменной хроматографией. Met-Arg-hPl сульфируют, заменяют растворитель и свертывают с целью образования нативных пар дисульфидных связей и нативной третичной структуры. Полученный образец очищают далее методом хроматографии с обращенной фазой. С помощью перекиси водорода из Met-Arg-hPl получают окисленный метионил (Met(0))-Arg-hPl, который далее подвергают очистке хроматографией с обращенной фазой и лиофилизации.
Концентрация полученного Met-Arg-hPl составляет приблизительно 24 мг/л (в растворе глицинового буфера с концентрацией около 20 мМ, рН 3,5). Приблизительно 2,4 мг этого материала выдерживают с 0,19 миллиединицами dDAP при рН 3,5. Реакция протекает при комнатной температуре. Время от времени отбирают аликвоты и разбавляют их 10%-ным раствором фосфорной кислоты. Полученные образцы инжектируют в HPLC систему с нейтральной обращенной фазой с целью контроля исчезновения Met-Arg-hPl или Met(0)-Arg-hPl и соответствующего получения hPl. Далее, аликвоты разбавляют подходящим разбавителем с целью контроля методом HPLC за появлением дипептидов Met-Arg или Met(0)-Arg. Приблизительно 60% Met-Arg-hPl в течение 8 ч было превращено в hPl. Неожиданно похожий результат был получен и в случае превращения Met(0)-Arg-hPl, т.е. был выделен hPl. Скорости расщепления обоих субстратов одинаковы. Это результат удивителен, так как DAP-I быка не может расщеплять Met(0)-X производные hPl, где Х Arg, Phe или Tyr. Анализ методом обращенной фазы с дипептидом Met-Arg в качестве свидетеля также подтверждает, что дипептид Met-Arg выделен из Met-Arg-hP, а в случае эксперимента с субстратом Met(0)-Arg-hPl в области пика дипептида Met-Arg появляется пик, который может быть отнесен к дипептиду Met(0)-Arg. Способность dDAP расщеплять окисленный субстрат Met(0)-X предоставляет ему значительные преимущества над ферментами, которые не могут проводить подобных расщеплений.
Д. Превращения аналога проинсулина человека Met-Arg
Фермент dDAP был также использован для эффективного превращения аналога проинсулина Met-Arg (B28 Lys, B29 Pro), а также аналога проинсулина - Met-Arg (B10 ASp, des B28-B30). Эти реакции проводят в полном соответствии с методиками, приведенными при описании превращений Met-Arg-hPl.
Фермент dDAP был также использован для эффективного превращения аналога проинсулина Met-Arg (B28 Lys, B29 Pro), а также аналога проинсулина - Met-Arg (B10 ASp, des B28-B30). Эти реакции проводят в полном соответствии с методиками, приведенными при описании превращений Met-Arg-hPl.
Claims (6)
1. Дипептидиламинопептидаза, выделенная из Dictyostelium discoideum АТСС 28368 и обладающая следующими характеристиками: мол. м. около 225000Д, ферментативная активность: способна отщеплять аминоконцевой дипептид Met-Tyr, Met-Arg, или Met-Asp от Met-Tyr-человеческого проинсулина, Met-Arg-человеческого проинсулина, или Met-Asp-человеческого проинсулина соответственно, при pH оптимуме около 3,5.
2. Способ ферментативного отщепления N-концевых дипептидов Met-Tyr, Met-Arg или Met-Asp от полипептидной последовательности, предусматривающий контактирование полипептидной последовательности с дипептидиламинопептидазой при условиях, достаточных для этой реакции, отличающийся тем, что дипептидиламинопептидаза выделена из Distyostelium discoideum АТСС 28368, а реакцию проводят при pH 2,5 5,5 и при температуре 15 45oС в течение от 1 мин до 24 ч.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является Met-Tyr-человеческим проинсулином.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является Met-Arg-человеческим проинсулином.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является аналогом Met-Arg-человеческого проинсулина.
6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанная полипептидная последовательность является Met-Asp-человеческим гормоном роста.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US95553992A | 1992-10-01 | 1992-10-01 | |
| US07/955,539 | 1992-10-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU93047672A RU93047672A (ru) | 1996-04-20 |
| RU2096455C1 true RU2096455C1 (ru) | 1997-11-20 |
Family
ID=25496954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU9393047672A RU2096455C1 (ru) | 1992-10-01 | 1993-09-30 | Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5565349A (ru) |
| EP (2) | EP1094118A1 (ru) |
| JP (1) | JP3550409B2 (ru) |
| KR (1) | KR100291528B1 (ru) |
| CN (1) | CN1060212C (ru) |
| AT (1) | ATE211169T1 (ru) |
| AU (1) | AU669735B2 (ru) |
| BR (1) | BR9303949A (ru) |
| CA (1) | CA2107279A1 (ru) |
| CZ (2) | CZ286950B6 (ru) |
| DE (1) | DE69331371T2 (ru) |
| DK (1) | DK0595476T3 (ru) |
| ES (1) | ES2169036T3 (ru) |
| FI (1) | FI934305A (ru) |
| HU (1) | HU219771B (ru) |
| IL (1) | IL107123A (ru) |
| MX (1) | MX9306021A (ru) |
| MY (1) | MY113378A (ru) |
| NO (1) | NO933503L (ru) |
| NZ (1) | NZ248810A (ru) |
| PL (1) | PL176930B1 (ru) |
| PT (1) | PT595476E (ru) |
| RU (1) | RU2096455C1 (ru) |
| TW (1) | TW257792B (ru) |
| UA (1) | UA27718C2 (ru) |
| ZA (1) | ZA937243B (ru) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573923A (en) * | 1993-12-22 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum |
| US5614379A (en) * | 1995-04-26 | 1997-03-25 | Eli Lilly And Company | Process for preparing anti-obesity protein |
| EP1141263A4 (en) * | 1998-09-21 | 2002-08-28 | Lilly Co Eli | PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT TRYPSIN ANALOGS |
| US6794159B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
| US6743600B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-06-01 | Monsanto Technologies Llc | Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase |
| US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
| EP2536749A1 (en) * | 2010-02-17 | 2012-12-26 | Elona Biotechnologies | Methods for preparing human growth hormone |
| US11427814B2 (en) | 2019-03-26 | 2022-08-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
| AU2020247918B2 (en) * | 2019-03-26 | 2022-06-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US5177003A (en) * | 1987-04-16 | 1993-01-05 | Phillips Petroleum Company | Flavored protein products derived from Candida utilis |
| US5075222A (en) * | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| JPH023698A (ja) * | 1988-06-20 | 1990-01-09 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬 |
| US5208218A (en) * | 1988-09-19 | 1993-05-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | T cell growth factor glycoproteins |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US5175251A (en) * | 1989-05-04 | 1992-12-29 | Sri International | Antimetastatic peptides with laminin activity |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US5173409A (en) * | 1989-12-08 | 1992-12-22 | Ecogen Inc. | Recovery of bt endotoxin protein from lysed cell mixtures |
-
1993
- 1993-07-28 TW TW082106050A patent/TW257792B/zh active
- 1993-09-27 IL IL10712393A patent/IL107123A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-09-28 KR KR1019930020229A patent/KR100291528B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 UA UA93002125A patent/UA27718C2/uk unknown
- 1993-09-29 AU AU48719/93A patent/AU669735B2/en not_active Ceased
- 1993-09-29 EP EP01200113A patent/EP1094118A1/en not_active Withdrawn
- 1993-09-29 DK DK93307746T patent/DK0595476T3/da active
- 1993-09-29 BR BR9303949A patent/BR9303949A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-09-29 MY MYPI93001975A patent/MY113378A/en unknown
- 1993-09-29 PT PT93307746T patent/PT595476E/pt unknown
- 1993-09-29 NZ NZ248810A patent/NZ248810A/en unknown
- 1993-09-29 ES ES93307746T patent/ES2169036T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 AT AT93307746T patent/ATE211169T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 ZA ZA937243A patent/ZA937243B/xx unknown
- 1993-09-29 PL PL93300537A patent/PL176930B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 DE DE69331371T patent/DE69331371T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-29 CZ CZ19932033A patent/CZ286950B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 EP EP93307746A patent/EP0595476B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 CA CA002107279A patent/CA2107279A1/en not_active Abandoned
- 1993-09-29 MX MX9306021A patent/MX9306021A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 CN CN93118452A patent/CN1060212C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 JP JP24479993A patent/JP3550409B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 RU RU9393047672A patent/RU2096455C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 NO NO933503A patent/NO933503L/no not_active Application Discontinuation
- 1993-09-30 FI FI934305A patent/FI934305A/fi unknown
- 1993-09-30 HU HU9302773A patent/HU219771B/hu not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-07 US US08/301,519 patent/US5565349A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-19 US US08/445,308 patent/US5565330A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-03 CZ CZ2000793A patent/CZ287066B6/cs not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| US, патент, 5126249, кл. C 12 P 21/06, 1992. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6333175B1 (en) | Yield when disulfide-bonded proteins are secreted | |
| US4987070A (en) | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins | |
| RU2096455C1 (ru) | Дипептидиламинопептидаза и способ ферментативного отщепления n-концевых дипептидов met-tyr, met-arg или met-asp от полипептидной последовательности | |
| EP1313848B1 (en) | Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone | |
| Ichishima | Unique catalytic and molecular properties of hydrolases from Aspergillus used in Japanese bioindustries | |
| Yuan et al. | The role of thioredoxin and disulfide isomerase in the expression of the snake venom thrombin-like enzyme calobin in Escherichia coli BL21 (DE3) | |
| US6461834B1 (en) | Clostripain catalyzed amidation of peptides | |
| JP3005335B2 (ja) | プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法 | |
| Nomura et al. | Characterization and crystallization of recombinant human cathepsin L | |
| EP0659886B1 (en) | Enzymatic conversion of proteins using immobilized dictyostelium dipeptidylaminopeptidase | |
| US5369016A (en) | Peptide amidase and the use thereof | |
| EP0629695B1 (en) | Novel Aminopeptidase from Streptomyces | |
| AU629929B2 (en) | Acetylated heterologous polypeptides | |
| JPH08298987A (ja) | 新規エンドペプチダーゼ | |
| US20070298457A1 (en) | Soluble endoproteases for the in vitro processing of recombinant proteins | |
| ZA200102694B (en) | Enzymatic amidation of peptides. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041001 |