HU219771B - Dictyostelium dipeptidil-aminopeptidáz - Google Patents
Dictyostelium dipeptidil-aminopeptidáz Download PDFInfo
- Publication number
- HU219771B HU219771B HU9302773A HU9302773A HU219771B HU 219771 B HU219771 B HU 219771B HU 9302773 A HU9302773 A HU 9302773A HU 9302773 A HU9302773 A HU 9302773A HU 219771 B HU219771 B HU 219771B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ddap
- dap
- enzyme
- arg
- met
- Prior art date
Links
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 title abstract description 10
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 2
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 title abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 claims description 17
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 50
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 34
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 30
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 abstract description 28
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 18
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 19
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N (2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-n-(4-nitrophenyl)-3-phenylpropanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000049703 Dictyostelium discoideum AX3 Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 3
- 101000886298 Pseudoxanthomonas mexicana Dipeptidyl aminopeptidase 4 Proteins 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000212 dipeptidyl peptidase II Proteins 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L potassium tetrathionate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000237858 Gastropoda Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFGSTSNUMVXOHJ-UHFFFAOYSA-M [I+].CC([O-])=O Chemical compound [I+].CC([O-])=O MFGSTSNUMVXOHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- NISFAIXCOKCVHV-ROUUACIJSA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(naphthalen-2-ylamino)-1-oxopentan-2-yl]pentanamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)=CC=C21 NISFAIXCOKCVHV-ROUUACIJSA-N 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-phenylalanine Chemical compound NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11005—Prolyl aminopeptidase (3.4.11.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Escalators And Moving Walkways (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Polyamides (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Noodles (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya Dictyostelium discoideum tenyészetéből nyertdipeptidil-aminopeptidáz, illetve eljárás ezen enzimnek a tenyészetbőltörténő kinyerésére, amelynek során a tenyészetből először elkülönítika sejtmentes levet, majd azt különböző kromatográfiás eljárásoknakvetik alá. ŕ
Description
A találmány tárgya a Dictyostelium discoideum nyálkagombából nyert dipeptidil-aminopeptidáz-enzim, mely felhasználható a biológiai vegyületek rekombináns módszerekkel történő előállítási eljárásaikban.
A Dictyostelium discoideum a nyálkagombáknak, pontosabban sejtes nyálkagombáknak nevezett egyszerű eukariotikus mikroorganizmusoknak a csoportjába tartozik. A név a mikroorganizmus makroszkópos megjelenésének két, egymástól élesen elváló állapotából származik. Aktív növekedési szakaszában a D. discoideum egyetlen, amőbához hasonló sejtként növekszik. Ebben az életszakaszában nincs sejtfala, ezért a felületet bevonó vékony filmként (vagy nyálkaként) jelenik meg. Szilárd közegen való elégtelen táplálkozás következtében az egyes sejtek telepet alkotnak. A telep megjelenésében egy soksejtű szervezethez hasonló felépítettséget mutat, amennyiben egy csupasz csigához hasonló alakban mászik, majd a testtájai differenciálódnak; a hátsó sejtek alkotják a „csiga” talpát, az első sejtek egy nyelet és a kettő közöttiek a termőtestet. A szervezet természetes körülmények között a talaj és a trágya felszínén található. A vad típusú, amőbaszerű nyálkagomba táplálékát kizárólag teljes baktériumok bekebelezésével (fagocitózissal) szerzi meg, ezért néha „ragadozónak” nevezik. Elkülönítettük a D. discoideum olyan steril mutánsait, melyek képesek a velük együtt élő „tápbaktériumok” nélkül is növekedni, vagyis folyékony táptalajban. A találmány tárgya a D. discoideumból kinyert új dipeptidil-aminopeptidáz.
A dipeptidil-aminopeptidázok (DAP) olyan enzimek, melyek a peptidek és proteinek aminoterminális végén az utolsó előtti peptidkötést hidrolizálják, tehát egy dipeptidet lehasítva, amennyiben az aminoterminális vég nem védett. Jelenleg a dipeptidil-aminopeptidázok négy csoportját ismerjük (DAP-I, DAP-II, DAP-III és DAP-IV), melyek fizikai tulajdonságaikban és a különféle aminoterminális peptidszekvenciákat eltérően hidrolizáló képességében különböznek egymástól. A DAP-I egy viszonylag nemspecifikus DAP, minthogy sokféle dipeptidváltozatot képes lehasítani a peptidek és proteinek nem blokkolt aminoterminális végéről. A DAP-I nem, vagy csak gyenge aktivitást mutat, ha a lehasítandó dipeptid X-Pro, Arg-X vagy Lys-X (ahol az X bármilyen aminosav lehet) összetételű. A DAP-II különösen jól hasítja le az Arg-X vagy Lys-X dipeptidet, kevésbé az X-Pro dipeptidet. A DAP-II lényegesen gyengébb hasítóaktivitást mutat más összetételű aminoterminális dipeptidek esetében. A DAP-ΠΙ lehasítja az Arg-Arg és Lys-Lys aminoterminális dipeptideket. A DAP-IV legerősebb hasítóaktivitását az X-Pro dipeptidszekvenciánál mutatja. A DAP-enzimek, különösen a DAP-I és a DAP-IV felhasználhatók proteinek előállításánál. A jelen találmány olyan új, a Dictyostelium discoideumból származó DAP-enzimmel foglalkozik, mely alkalmas olyan rekombináns proteinek átalakítására, ahol a protein az aminoterminális végén páros számú aminosawal hosszabb a kívántnál.
A jelen találmány a Dictyostelium discoideumból, egy sejtes nyálkagombából nyert új dipeptidil-aminopeptidázzal foglalkozik. Az új DAP-enzim, vagyis a dDAP aktivitása valamennyire hasonlít a DAP-I és a DAP-III aktivitására, de fizikai és más enzimatikus tulajdonsága révén élesen megkülönböztethető azoktól. A dDAP-enzim felhasználásával dipeptideket lehet eltávolítani a proteinek és peptidek rekombinánsként előállított előanyagainak N-terminális végéről. A dDAPenzim segítségével eltávolíthatunk egyetlen dipeptidet a polipeptid N-terminális végéről, de egymást követően eltávolíthatunk az enzimmel egynél több dipeptidet is az előanyagról. A találmány módszert nyújt továbbá a dDAP-enzim D. discoideum-tenyészetből való kinyerésére és tisztítására is.
A találmányban használt kifejezéseket és rövidítéseket az alábbiak szerint értelmezzük:
dDAP - Dictyostelium discoideumból nyert dipeptidil-aminopeptidáz, melynek GFpNA-szubsztráttal mért pH-optimuma 3,5. Natív molekulasúlya analitikai ultracentrifúgálással mérve 225 000 D; az alegység molekulasúlya SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS=nátrium-dodecil-szulfát) mérve 66 000 D.
GFpNA - Gly-Phe-p-nitro-anilid.
Polipeptid előanyag - rekombinációval előállított polipeptid, mely az illető kívánt polipeptidnél az aminoterminális végen páros számú aminosawal hosszabb.
Kialakított polipeptid - az a kívánt polipeptid, melyet úgy nyerünk, hogy az N-terminális végről egy vagy több dipeptidet eltávolítunk.
RR-βΝΑ - Arg-Arg^-naftil-amid.
A találmány a dDAP-enzimmel, a Dictyostelium discoideumból, egy sejtes nyálkagombából nyert dipeptidil-aminopeptidázzal foglakozik. A dDAP-enzim képes lehasítani a nem védett aminoterminális szekvenciákat, hasonlóan a DAP-I-hez és a DAP-III-hoz, de ezektől az enzimektől mégis élesen megkülönböztethető fizikai és enzimatikus tulajdonságait illetően. A dDAP pH-optimuma GFpNA-szubsztráttal meghatározva: 3,5; a natív molekulasúlya: 225 000 D; az alegység molekulasúlya: 66 000 D. A lektinaffinitási kromatográfia arra vall, hogy a dDAP-enzim valószínűleg egy glikoprotein. A dDAP-enzim képes dipeptideket eltávolítani szintetikus szubsztrátokról, Gly-Phe-p-nitroanilidról (GFpNA), Arg-Arg^-naftil-amidról (RR$NA), valamint számos szintetikus vagy rekombináns polipeptidről.
Az ismert DAP-I-enzimeket különféle állatokból és állati szövetekből izolálták. Az új enzimet, a dDAP-t a Dictyostelium discoideum tenyészetéből izoláltuk. A DAP-I-enzimek aktivitásukhoz halogenidet és redukálószert igényelnek. A cisztein szulfhidrilcsoportjával reagáló vegyületek, például a jód-acetát inaktiválja a DAP-I-enzimeket. A DAP-I optimális aktivitása pH 5 és 6 között van. Ezzel szemben a dDAP-enzim pHoptimuma 3,5 értéknél van Gly-Phe-pNA- vagy GlyArg-pNA-szubsztrátokkal meghatározva, és jelentős aktivitást mutat pH 3,5 kémhatásnál peptidek és proteinek esetében. A dDAP-enzimnek pH 6 felett jelentős aktivitása nincs. A dDAP-enzim nem igényli a redukálószer jelenlétét, és teljesen aktív szulfhidrilreagensek, például jód-acetát vagy tetrationát jelenlétében is. A dDAP hasonló a borjú-DAP-I-hez, amennyiben nem képes hasí2
HU 219 771 Β tani az olyan peptideket, melynek N-terminális vége blokkolt, eltér viszont a boqú-DAP-I-enzimtől annyiban, hogy aktív az olyan szubsztrátokkal szemben, melynek N-terminális végén oxidált metionin van. A borjú-DAP-I képtelen hasítani az ilyen szubsztrátot. Ezen túlmenően eltér a boíjú-DAP-I-től abban is, hogy a dDAP-enzim könnyen hasítja az Arg-Arg-p-naftilamid-szubsztrátot. Abból a szempontból viszont, hogy hasítja az aminoterminális végen lévő Arg-Arg dipeptidet tartalmazó szubsztrátot, hasonlít az emlősökből és a mikroorganizmusokból származó DAP-III-enzimekre, noha a DAP-III-enzimról leírták, hogy a pH-optimuma az alkalikus tartományban van, míg a dDAP sokkal aktívabb a savas kémhatásnál. A dDAP alegységének SDSpoliakrilamid elektroforézissel meghatározott molekulatömege: 66 000 D, míg az emlős-DAP-I-alegység molekulatömege: 22 000 D.
A jelen találmány szerinti dDAP-enzim a legalkalmasabb arra, hogy a polipeptidek előanyagát átalakítsuk kialakított polipeptidekké. így például, ha a kívánt polipeptid a humán növekedési hormon, elkészítjük az előanyagát (egyik esetben ez a Met-Asp-humán növekedési hormon), majd az előanyagot a dDAP-enzimnek tesszük ki, ami lehasítja a Met-Asp dipeptidet és megkapjuk a kívánt polipeptidet, a humán növekedési hormont. A kialakított peptid nem szükségszerűen azonos a „természetes” polipeptiddel, gyakran annak analógját vagy köztitermékét kívántuk előállítani.
A dDAP-enzimmel feldolgozható más polipeptid előanyagok: Met-Arg-hGH, Met-Tyr-proinzulin, MetArg-proinzulin, Met-Arg-proinzulin analóg (B28 Lys, B29 Pro), Met-Tyr-proinzulin analóg (B10 Asp, des B28-30) és a Met-Tyr-proinzulin analóg (B10 Asp, des B28-20). Az inzulinanalóg (B28 Lys, B29 Pro) a 383 472 számú európai szabadalomban, az inzulinanalóg (B10 Asp, des B28-30) az 519 750 számú európai szabadalomban szerepel. A dDAP-enzim egymás után több dipeptidet is képes lehasítani a polipeptid előanyag N-terminális végéről. A Met-Arg-proinzulin és a Met-Arg-proinzulin analógok a DAP-I-enzimmel való feldolgozását Becker és munkatársai igák le az 5 126 249 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban (közreadva: 1992. június 30-án).
A dipeptidek protein-előanyagról dDAP-enzimmel történő eltávolításának előnye abból áll, hogy dDAP pH-optimuma 3,5 értéknél van, ami lehetővé teszi, hogy a reakciót savas körülmények között hajtsuk végre, ahol sok polipeptid előanyag oldódik. Továbbá semleges vagy magasabb pH-értékű tartományban néhány előanyag diszulfidhidakon keresztül dimereket vagy polimereket képez, ami a termékhozam jelentős csökkenését eredményezi. Ez a diszulfídhidak kialakulásával járó jelenség különösen zavaró, ha borjú-DAP-I-enzimet használunk, minthogy az működéséhez redukálószer, például β-merkapto-etanol vagy cisztein jelenlétét igényli a reakcióelegyben. A metionin oxidációja ugyancsak kisebb mértékű a savas tartományban. A D. discoideum fermentlevéból nyert enzim használata gazdaságosabb is, mint az állati fonásokból nyert enzimtermékek alkalmazása, minthogy a fermentációs technológia nagyobb termékhozamot és enzimreprodukálhatóságot biztosít. Az állati eredetű enzimek elkerülését lehetővé teszi egy magas tisztaságfokú enzim forrásának megteremtése. A D. discoideum Ax3 törzs (ATCC 28368) fermentálása, majd az ezt követő centrifúgálás, anioncserélő kromatografálás, hidrofób kromatográfia és méretkizárásos kromatográfia egy magas tisztaságfokú dDAP-enzimoidatot eredményez, ami tárolható vagy közvetlenül felhasználható a polipeptid előanyagok feldolgozásához. A dDAP-enzim fermentléből való elkülönítése és tisztítása ugyancsak részét képezi a jelen találmánynak.
A polipeptid előanyagok kialakított polipeptidekké való átalakítása széles hőmérsékleti, pH- és időtartományban történhet. A reakciót általában vizes közegben végezzük, mely megfelelően pufferolt ahhoz, hogy a kémhatása pH 2,5 és 5,5 értékek között maradjon. Előnyös kémhatású tartomány a pH 3,0-4,5, még előnyösebb a pH 3,0-3,5. A pH-optimum kissé változhat a szubsztráttól függően. így például a Gly-Phe-pNA és Gly-Arg-pNA feldolgozása pH 3,5 értéknél, a MetAsp-hGH feldolgozása pH 3,0-3,5 értékek között történik meg a leggyorsabban. A szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy bármelyik adott reakció pH-optimumát olyan tényezők határozzák meg, mint az adott polipeptid előanyag és az enzim stabilitása és oldhatósága. Bizonyos esetekben oldódást elősegítő anyagok, például karbamid, nátrium-dodecil-szulfát, guanidin stb., is alkalmazhatók.
A reakció különféle időtartamon át végezhető, néhány másodperctől néhány napig terjedően. Előnyös a reakciót 1 perc és 24 óra közötti időtartamban lejátszatni, még előnyösebb, ha a reakcióidő 1-8 óra. A szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy a reakcióidő könnyen beállítható bármelyik polipeptid előanyaghoz vagy kialakított polipeptidhez.
A feldolgozási reakció hőmérséklete ugyancsak beállítható bármelyik adott szubsztráthoz. Előnyös a reakciót 15 °C és 45 °C közötti hőmérsékleten végezni, még előnyösebb a 20-37 °C közötti, legelőnyösebb a 25-37 °C közötti hőmérséklet-tartomány. Összefoglalva, a szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy az olyan reakciótényezők, mint az idő, hőmérséklet és pH könynyen változtatható a kívánt előanyag vagy kidolgozott polipeptid tulajdonságainak figyelembevételével.
Bármelyik széles tartományú puffer alkalmazható, az egyetlen kívánalom, hogy képes legyen a kémhatást a kívánt pH-tartományon belül tartani. Tipikus puffervegyület például a nátrium-foszfát, nátrium-acetát, nátrium-citrát, glicin stb. Előnyös a nátrium-acetát, nátrium-foszfát és glicin alkalmazása.
A találmányban használt polipeptid elóanyagokat általában rekombináns DNS-technológiával állítjuk elő. A kívánt polipeptid előanyagot kódoló nukleotidszekvenciát a szokásos szintézises eljárásokkal állítjuk elő. Ezek a módszerek általában magukban foglalják mind a kívánt kódoló oligonukleotid, mind a komplementer szekvenciájának előállítását. Az oligonukleotidokat úgy tervezzük meg, hogy a kódolószekvencia egy fragmense átfedésben legyen a kiegészítőszekvencia két
HU 219 771 Β fragmensével és fordítva. Az oligonukleotidokat párosítjuk és összekapcsoljuk, kialakítva végűi a kívánt génszekvenciát.
A szekvenciát egy klónozóvektor olyan helyére építjük be, ami lehetővé teszi a kód kifejeződését. Az alkalmas klónozóvektor a kifejeződést szabályozó szekvenciának legalább egy részét tartalmazza.
Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi körét nem befolyásolják.
1. példa
A Dictyostelium discoideum fermentációja
Az ATCC 28368 nyilvántartási számon szereplő, az amerikai törzsgyűjteményből (American Type Culture Collection, Rockvilíe, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) származó, fagyasztva szárított Dictyostelium discoideum Ax3 törzset különféle hígításban ráoltjuk pufferolt élesztőkivonat/peptont tartalmazó agarlemezekre (1,2% Difco Bacto Agár). A pufferolt közeg összetétele: Difco élesztőkivonat 7,15 g/1, Difco Bacto Peptone 14,3 g/1, dinátrium-hidrogén-foszfát 0,51 g/1, kálium-hidrogén-foszfát 0,49 g/1, melyhez aszeptikus körülmények között, 10 g/1 végkoncentrációban a sterilizálás után glükózt adunk; a táptalaj kémhatását nátrium-hidroxid-oldattal vagy kénsavval végső pH=6,5 (±0,1) értékre állítjuk be. Ugyanezt a tápközeget (agar nélkül) használjuk a folyékony tenyészetekhez, melyeknek térfogata egy liternél kevesebb. Az agarlemezeket 21-24 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3-5 napon át. A spóratokokat óvatosan összegyűjtjük a lemezről, hogy ne kerüljenek bele az Ax3 törzzsel együtt liofilizált „tápbaktériumok”. A spórákkal beoltunk 3 ml pufferolt élesztőkivonat/pepton táptalajt és gyenge rázatás mellett 21-24 °C hőmérsékleten növesztjük. A D. discoideum-sejteket sorozatosan átvisszük fokozatosan növekvő térfogatú pufferolt élesztőkivonat/pepton tápközegbe. Mindegyik átviteli lépésnél 10-25-szörös hígítást végzünk, az átvitelt akkor végezzük, amikor a sejtsűrűség eléri a 2 χ 106/ml értéket. A tenyészeteket mindig 21 -24 °C hőmérsékleten inkubáljuk gyenge rázatás mellett.
A kevertetett fermentációkat a kezdeti élesztőkivonat/pepton tápközeghez hasonló táptalajon végezzük, melyben a Bacto Peptont 2-14,3 g/1 koncentrációban szójapeptonnal (például Phytone Peptone vagy Marcor Soy Peptone) helyettesítjük. A fermentlé feldolgozása általában 10-5000 literes fermentorokból történik, melyek 1-3 Rushton-turbinakeverővel vannak ellátva; a kevertetés 40-150 percenkénti fordulatszámmal történik. Hőmérséklet: 22 °C (±1 °C); az átáramoltatott levegő mennyisége a tenyészet térfogatának 0,1-0,5-e; nyomása: 20,68-34,47-103 Pa (3-5 psi). Néhány fermentálást úgy végeztünk, hogy a kémhatást pH=6,4 értéken tartottuk kénsav hozzáadásával; másoknál az oldott oxigén koncentrációját 40-60% között tartottuk a kevertetés és a légáram változtatásával. A tenyészet kezelésénél és a fermentációnál kellő óvatossággal igyekszünk elérni, hogy minimálisra csökkentsük a nyíróerőhatást, minthogy a sejtek a tenyésztés alatt sejtfal nélküli amőbaszerű állapotban vannak.
A kevert D. discoideum Ax3 tenyészet sejtsűrűsége 12 és 36 óra között kétszeresére növekszik. Amennyiben nincs szabályozva, az oldott oxigén koncentrációja progresszíven csökken; majd a sejtsűrűség növekedésének megállása után egy idővel növekedni kezd. A végső sejtsűrűség 3x 106-5xl07/ml; az alacsonyabb sejtszámmaximumot elérő fermentációknál az oxigéntranszfer a valószínű korlátozó tényező.
Időnként mintát veszünk és meghatározzuk a sejtsűrűséget és a GF-pNAáz-aktivitást (lásd 3. példa). 5xl05/ml felett a sejtszám meghatározására, a Petroff-Hauser-számlálókamrát használjuk. A fermentáció alatt a GFpNA-t hidrolizáló aktivitás általában növekszik. A dDAP-aktivitás maximumát a legmagasabb sejtsűrűség utáni 2-4. napon érjük el. A teljes fermentlevet 4 °C hőmérsékleten vagy -20 °C hőmérsékleten lefagyasztva tároljuk, később felolvasztjuk és aktivitását meghatározzuk. A fermentléből a sejteket folyamatos centrifúgálással 10 °C hőmérséklet alatt gyűjtjük össze.
2. példa dDAP kinyerése
A) Sejtek eltávolítása és betöményítés
A Dictyostelium discoideum fermentlévéből nyert dDAP tisztítása a sejtek eltávolításával és a betöményítésével kezdődik. A sejtek eltávolítása folyamatos centrifúgálással történik, egy Western States centrifuga felhasználásával. A sejtmentes tápközeg körülbelül húszszoros betöményítése tangenciális átfolyású ultraszűréssel történik 50 000-es molekulatömegnél elválasztómembrán alkalmazásával. A visszamaradt anyagot elvezetjük az ultracentrifugából, és a centrifúgát 50 mM trisz-pufferrel (pH=7) mossuk ki, hogy a maradék dDAP-t is kinyerjük. A betöményített levet és a mosólevet egyesítjük és ezt a készítményt -20 °C hőmérsékleten tartottuk néhány hónapon át a további feldolgozásig.
B) Tisztítás
A lefagyasztott koncentrátumot 20 óra alatt felolvasztjuk és szobahőmérsékletre melegítjük. A levet centrifúgáljuk, majd 5 mikronos membránon szűrjük. A tisztított lé kémhatását pH=7,0 értékre állítjuk be és 0-10 °C hőmérsékleten tartjuk legalább 12 órán át az anioncserés kromatografálás előtt.
C) Anioncserés kromatográfia
A dDAP tisztítási eljárásának első kromatográfiás lépése anioncserés kromatografálással történik Pharmacia Q-Sepharose Fást Flow-gyantát (FFQ). Az oszlopot pH=7 kémhatású 50 mM trisz-pufferral egyenlítjük ki. 60 liter nem koncentrált fermentlé/liter gyanta aránynál a sejtmentes koncentrátum átfolyási sebessége 50 cm/óra. Egy liter gyantán körülbelül 60 g fehérje kötődik meg (a fehérjemeghatározáshoz Pierce BCA Protein Assay készítményt használunk, a viszonyítási fehérje : borjú-szérumalbumin). 250 egységnyi dDAP-aktivitást viszünk rá egy liter FFQ-gyantára. A sejtmentes koncentrátum vezetőképessége 5 mMHOS centiméterenként. Miután a megkötés megtörtént, az FFQ-gyantát háromszoros térfogatú - a kiegyenlítéshez használt 4
HU 219 771 Β pufferral mossuk. A dDAP-aktivitást a gyantáról lineáris gradienssel eluáljuk. A lineáris gradienselúcióhoz tízszeres oszloptérfogatú 50 mM trisz-puffert, pH=7 használunk, melyben a nátrium-klorid-koncentráció nulláról 1 M-ra növekszik. Az átfolyási sebesség 50 cm/óra. Az oszloptérfogat egytizedének megfelelő frakciókat gyűjtünk. Az FFQ-oszlopot ezután háromszoros oszloptérfogatú 50 mM trisz-pufferrel, pH=7, mossuk, melyben a nátrium-klorid-koncentráció: 1,0 M. Az eluátumot vezetőképesség-méréssel és 280 nm-en mért fényelnyeléssel vizsgáljuk, a frakciók dDAP-aktivitását meghatározzuk. Az aktivitásmeghatározás a Gly-Phe-p-nitro-anilid (GFpNA) kolorimetriás szubsztrát pH=3,5 kémhatásnál történő hasításán alapszik. Egyesítjük azokat a frakciókat, melyek az eluált összes dDAP aktivitásának körülbelül 90%-át tartalmazzák. A dDAP-aktivitás egy csúcsban jelenik meg körülbelül két oszloptérfogatnyi méretben. Az egyesített frakciók kémhatását 10%-os (térfogat) sósavval pH=3,5 értékre állítjuk be, és 4 °C hőmérsékleten tartjuk kevesebb, mint két napig.
D) Hidrofób kromatográfia
Az FFQ savanyított egyesített frakcióját hidrofób interakciós kromatográfrával (HIC) tisztítjuk tovább, Pharmacia Phenyl Sepharose Fást Flow gyantát használva. Az oszlop térfogata egyharmada az anioncserélő oszlop térfogatának. Körülbelül 650 egység aktivitást viszünk 1 liter gyantára, és 4 g fehéije kötődik meg 1 liter gyantán. (280 nm-en mért 1 egységnyi abszorbancia megfelel 1 mg/ml fehérjének.) Az FFQ eluátumának egy literéhez hozzáadunk 140 g ammónium-szulfátot, a kémhatását pH=3,5 értékre beállítjuk; a végső vezetőképessége körülbelül 90 mMHOS centiméterenként. A HlC-oszlopot literenként legalább 140 g ammóniumszulfátot tartalmazó 50 mM citrátpufferral, pH=3,5, kiegyensúlyozzuk. A megkötés 40 cm/óra átfolyási sebességnél történik. Az oszlopot először háromszoros oszloptérfogatú kiegyenlitőpufferrel mossuk, majd a dDAP-aktivitást lineáris gradienselúcióval hozzuk le az oszlopról. A gradienselúcióhoz 50 mM citrátpuffert, pH=3,5, használunk, melyben az ammónium-szulfát koncentrációja 140 g/1 értékről nullára csökken. Körülbelül tízszeres oszloptérfogatnyi eluenst használunk, 40 cm/óra átfolyási sebességgel. Az oszlopot ezután három oszloptérfogatnyi 50 mM trisz-pufferral, pH=3,5, mossuk. Az oszloptérfogat egytizedének megfelelő térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elúciót vezetőképességméréssel és 280 nm-en mért fényelnyeléssel követjük nyomon, a frakciók dDAP-aktivitását pH=3,5 kémhatásnál mért GFpNA-hasítással határozzuk meg. Az eluált összes dDAP-aktivitás 90%-át tartalmazó frakciókat egyesítjük. A dDAP-aktivitás két oszloptérfogatnyi méretű csúcsban eluálódik a gyantáról. Az egyesített frakciók kémhatását 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (tömeg) nátrium-hidroxid-oldattal pH=3,5 értékre állítjuk be.
E) Méretkizárásos kromatográfia
A HlC-eluátum további feldolgozása méretkizárásos kromatográfrával (SEC) történik S-200 Sepharose HR-gyantán. Az oszlop térfogata kétszerese a HIC-oszlop térfogatának, magassága 78 cm. A HlC-eluátumot ultraszűréssel betöményítjük 10 000 D molekulaegység felett visszatartó membrán alkalmazásával. A betöményített frakció térfogata a SEC-oszlop térfogatának 2,5%-a. A koncentrátum eltávolítása után ugyanilyen térfogatú 50 mM citrátpufferrel, pH=3,5, kimossuk a készüléket. A koncentrátumot és a mosólevet egyesítjük és a kémhatást 10%-os (térfogat) sósavval vagy 10%-os (tömeg/térfogat) nátrium-hidroxid-oldattal pH=3,5 értékre állítjuk be. A készítmény vezetőképessége ekkor 30 mMHO centiméterenként. A SEC-oszlopot 20 mM ecetsav/20 mM nátrium-klorid, pH=3,5, oldattal - melynek vezetőképessége 2 mMHO centiméterenként - kiegyenlítjük. A koncentrátumot 15 cm/óra lineáris áramlási sebességgel rávisszük az oszlopra. A dDAP-aktivitást egy oszloptérfogatnyi kiegyenlítőpufferral eluáljuk le. Az oszloptérfogat 0,02 részének megfelelő térfogatú frakciókat gyűjtünk. Az elúciót a vezetőképesség mérésével és a fényelnyelés 280 nmnél történő meghatározásával követjük nyomon. A frakciók dDAP-aktivitását a GFpNA hasításával határozzuk meg pH=3,5 kémhatásnál. Az eluált összaktivitás 90%-át kitevő frakciókat egyesítjük. A dDAP-aktivitás egy csúcsban jön le körülbelül az oszloptérfogat 0,08ának megfelelő térfogatban. Az egyesített frakciót 4 °C hőmérsékleten tartjuk néhány hónapon keresztül.
Az elmondottak szerint tisztított dDAP egy fősávként jelenik meg az SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliamid-gélelektroforézis) vizsgálatoknál. A sáv a molekulasúly viszonyítóanyagként használt borjú-szérumalbuminnal (66 kD) együtt mozdul el a gélen. A fehéije megfestéséhez ISS Pro-Blue festéket használunk. A migrációs képet 0,1 M DTT (ditiotreitol) mintában lévő jelenléte (és ötperces 100 °C-os kezelés) nem befolyásolja. Az SDS-PAGE meghatározás szerint a borjúDAP-I alegységének molekulatömege 22 000 D.
3. példa dDAP aktivitása
A) átalakítási reakciók
1. GF-pNA hasítása
A dDAP aktivitását általában a Gly-Phe-p-nitroanilid (GFpNA) kromogén szubsztrát hasításával határozzuk meg. A meghatározáshoz általában az enzimet 11szeresre hígítjuk 1,0 ml 4 mM GFpNA-oldatban, melynek kémhatása pH=3,5. A GF dipeptid 37 °C hőmérsékleten történő lehasadásának mértékét a 405 nm-en mért fényelnyelés növekedésével méijük. E körülmények között percenként 0,90 OD változás felel meg egy egységnyi aktivitásnak. A milliliterenkénti egység meghatározható, tudva, hogy a szabad pNA extinkciós együtthatója 405 nm-en mM-ként és centiméterenként 0,99.
A dDAP-aktivitás GFpNA-szubsztrátnál meghatározott gátlását összehasonlítjuk a DAP-I gátolhatóságával. A vizsgálathoz DAP-I-enzimet gátló szulfhidrilreagenseket használunk: jód-acetamidot és kálium-tetrationátot. A dDAP- vagy borjú-DAP-I-mintákat az egyes gátlókkal 100 mM trisz-pufferben, pH=7, szobahőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át. A gátlóreagens végkoncentrációja: 0, 0,5, 5,0 vagy 50 mM. Az inku5
HU 219 771 Β bált oldatot 4 mM GFpNA-oldattal, pH=3,5, 21-szeresre hígítjuk. A hasítás sebességét 37 °C hőmérsékleten 405 nm hullámhosszú fény abszorpciójának növekedésével méijük. A DAP-I GFpNA-szubsztráttal szembeni aktivitása 90%-kal csökken 5 mM jód-acetamid és 95%-kal csökken 5 mM kálium-tetrationát esetében. Nem tapasztalunk jelentős dDAP-aktivitáscsökkenést sem a jód-acetamid, sem a kálium-tetrationát egyik vizsgált koncentrációjánál sem.
A dDAP GFpNA-szubsztráthasítás pH-optimumát 0,5 M trisz-, foszfát- és citrátpufferben határozzuk meg, melynek kémhatását 10%-os sósavval vagy 10%os nátrium-hidroxid-oldattal különféle értékre állítjuk be pH=3 és 8 között. A dDAP-enzimet 20-szorosra hígítjuk 100 mM ciszteamint és 10 mM nátrium-kloridot tartalmazó pufferrel. A borjú-DAP-I-enzimet ugyanezzel a pufferrel 200-szorosra hígítjuk. 2%-os dimetilformamidban 4 mM koncentrációjú GFpNA-oldatot készítünk. A mikrotiterlemezen a különböző pH-jú egyes pufferek 0,025 ml-ét 0,1 ml hígított enzimmel és 0,1 ml szubsztrátoldattal keveijük össze. 30 percen át meghatározzuk a 410 nm-en mért abszorbancianövekedés mértékét. Az eredmények azt mutatják, hogy a dDAP pHoptimuma GFpNA-szubsztrát esetében: 3,5-4,0.
2. Gly-Arg-pNA hasítása mM Gly-Arg-pNA- (GR-pNA-) oldatot készítünk 50 mM ecetsav, 50 mM glicinpufferben, pH=5. Sósavval és nátrium-hidroxid-oldattal különféle pH-értékeket állítunk be 5,1 és 2,3 érték között. 180 pl pufferolt szubsztrátoldathoz hozzáadunk 5 pl dDAP-oldatot (végkoncentráció 49 milliegység/ml). 410 nm-en mérjük (titerlemez leolvasásával) az abszorbancianövekedés sebességét. Mint a GFpNA esetében, a GR-pNAszubsztrátnál is az optimum pH=3,5 körül van. Az enzim aktivitása az adott szubsztrátnál: alacsony pH=2,5 alatt és pH=5 felett.
3. Arg-Arg-P-naftil-amid (RR-βΝΑ) hasítása
0,25 mM RR-βΝΑ- vagy 0,25 mM benzil-oxikarbonil-RR-βΝΑ- (Z-RR-βΝΑ-) oldatot készítünk 100 mM ecetsavban, pH=3,5 vagy 100 mM citromsavpufferben, pH=5,0. 2 ml szubsztráthoz adjuk hozzá a dDAP- vagy boíjú-DAP-I-enzimet (15 milliegység milliliterenként). Méijük a hasítás sebességét (340 nmes excitációnál 410 nm-en mért fluoreszcenciát). A DAP-I-enzim egyik szubsztrátot sem hasítja. Meglepő módon a dDAP viszont hatékonyan hidrolizálja az RR^-BNA-szubsztrátot, míg a védett aminocsoportú ZRR^NA-szubsztrátot nem hasítja, megerősítve azt a feltételezést, hogy a dDAP- egy DAP-enzim. Az RR-βΝΑ hasításának pH-optimumát 50 mM ecetsav és 50 mM citrátpufferekkel határozzuk meg, melyeknek a különféle kémhatását sósavval és nátrium-hidroxid-oldattal állítjuk be. 1,5 ml pufferhez adunk 0,5 ml RR^NA-oldatot (végkoncentráció 0,25 mM). 15 mM/ml dDAP-enzimet adunk az oldathoz és meghatározzuk a hasítás sebességét. RR-βΝΑ esetében a pH-optimum 4,5 értéknek adódik és lényeges aktivitás mutatható ki az egész vizsgált pH-tartományban (pH=3,5-5,7). Ez a meglepő eredmény feltételezi, hogy a dDAP bizonyos tulajdonságokban hasonlít a DAP-III-enzimhez.
A szakemberek előtt nyilvánvaló, hogy a szubsztráthasítás pH-optimuma nemcsak az enzimtől, hanem magától a szubsztráttól is függ, azaz a lehasított dipeptid összetételétől, valamint az indikátorcsoporttól. így például a dDAP pH-optimuma Gly-Arg-pNA-szubsztrát esetében 3,5 körül van, míg Gly-Arg-7-amido4-metil-kumarin- (GR-AMC-) szubsztrát hasításánál pH=5 értéknél jelentkezik, ami alapján feltételezhetjük, hogy az indikátorcsoport befolyásolhatja a hasítási tulajdonságokat.
B) Szintetikus oktapeptidek és dekapeptidek átalakítása
A Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Ler oktapeptid 4 mM-os oldatát 50 mM ecetsavoldatban, pH=3,5 készítjük el. Az oldathoz azonos térfogatban hozzáadunk milliliterenként 10 milliegységet tartalmazó dDAP-oldatot és szobahőmérsékleten inkubáljuk 6 órán át. A reakciót 1% foszforsavat tartalmazó 7 M karbamidoldattal való 20szoros hígítással leállítjuk. A mintát fordított fázisú HPLC-vel analizáljuk. Viszonyító vegyületekként az oktapeptidet, Met-Asp dipeptid és Phe-Pro-Ala-MetSer-Leu hexapeptidet használunk. A dDAP könnyen lehasítja a Met-Asp dipeptidet az oktapeptid nem védett aminocsoportot hordozó végéről, de nem képes eltávolítani a soron következő Phe-Pro dipeptidet.
A Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu dekapeptidből 1,7 mM koncentrációjú oldatot készítünk 100 mM glicinoldatban, pH=3,5. 0,5 ml oldathoz hozzáadunk 8 μΐ 6,4 mU/ml koncentrációjú dDAP-oldatot, amit szintén 100 mM glicinoldatban készítünk el, pH=3,5. Óránként 5 μΐ mintát közvetlenül vizsgálunk fordított fázisú HPLC-vel, hogy nyomon kövessük a reakciót. Viszonyító vegyületként Met-Arg és Met-Tyr dipeptidet, valamint Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Glu-HisLeu és Phe-Val-Asn-Glu-His-Leu peptideket használunk. A dDAP könnyen lehasítja a Met-Arg dipeptidet a dekapeptidről, valamint a következő Met-Tyr dipeptidet. Ez azt mutatja, hogy a dDAP-enzimmel az egymást követő dipeptidek eltávolíthatók az aminoterminális végen.
C) Met-Asp-(humán növekedési hormon) átalakítása
A Met-Asp-(humán növekedési hormon) (MetAsp-hGH) oldhatatlan fehérjeként keletkezik az E. coli citoplazmájában. Az oldhatatlan proteint oldhatóvá tesszük, diszulfidhíddal összekapcsolt Met-Asp-hGHpárokat képezünk, amit ioncserélő kromatográfiával tisztítunk. A készítményben oldószercserét végzünk, a kémhatást beállítjuk pH=3,5 értékre. A Met-Asp-hGHkészítményt 37 °C hőmérsékletre melegítjük és 280 nm hullámhosszon megméijük a fényelnyelést. Hozzáadjuk a dDAP-enzimet 1 mg Met-Asp-hGH-ra 6 milliegység enzimet számolva. A reakciót 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 4-6 órás kevertetés mellett. A reakciófolyamat hátrány nélkül lelassítható kevesebb enzimet használva, alacsonyabb hőmérsékleten vagy alacsonyabb Met-Asp-hGH-koncentráció mellett. A reakciósebesség növelhető több enzim hozzáadásával, a MetArg-hGH-koncentráció emelésével vagy a reakció-hőmérséklet emelésével. A reakció előrehaladtát fordított fázisú kromatográfiával követjük nyomon. A reakció le6
HU 219 771 Β állítására kevertetés mellett nátrium-hidroxid gyors hozzáadásával a kémhatást pH=8 értékre állítjuk be és 30% (térfogat) acetonitrilt adunk a reakcióelegyhez. A dDAP-kezelés után kapott terméket alapos vizsgálatnak vetjük alá, ami kiterjed a peptidösszetétel vizsgálatára, az N-terminális vég aminosavsorrendjének megállapítására, magában foglal tömegspektroszkópiát, aminosavanalízist, fordított fázisú HPLC-analízist. Valamennyi vizsgálat azt bizonyítja, hogy a dDAP-kezelés hatására autentikus humán növekedési hormonhoz jutunk.
D) Met-Arg-(humán proinzulin) átalakítása
A Met-Arg-(humán proinzulin) (Met-Arg-hPI) oldhatatlan fehérjeként keletkezik az E. coli citoplazmájában. Az oldhatatlan fehéijét 7 M karbamidoldatban oldjuk és ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk. A MetArg-hPI-t szulfitkezeljük, az oldószert kicseréljük és kialakítjuk a natív diszulfidhíddal kötött párokat és a natív harmadlagos szerkezetet. Az anyagot tovább tisztítjuk fordított fázisú kromatografálással.
Az oxidált metionin Met(O)-Arg-hPI-terméket Met-Arg-hPI-ből állítjuk elő hidrogén-peroxiddal történő oxidálással.
mg/ml koncentrációjú Met-Arg-hPI-oldatot készítünk 20 mM glicinpufferben, pH=3,5. 2,4 mg szubsztrátot inkubálunk 0,19 milliegység dDAP-enzimmel pH=3,5 kémhatásnál. A reakciót szobahőmérsékleten hajtjuk végre. Időnként mintát veszünk és 10%-os foszforsavval meghígítjuk. Ezt a hígított mintát közvetlenül semleges, fordított fázisú HPLC-oszlopra visszük és vizsgáljuk a Met-Arg-hPI vagy Met(O)-Arg-hPI eltűnését és a hPI megjelenését. Emellett olyan hígításokat is végzünk a kivett mintákkal, ami lehetővé teszi a MetArg vagy Met(O)-Arg dipeptidek megjelenésének nyomon követését. 8 óra alatt a Met-Arg-hPI-fehérjének körülbelül 60%-a alakult át hPI-vé. A hasítás mértéke mindkét szubsztrátnál hasonló. Ez az eredmény meglepő, mert a borjú-dAP-I-enzim nem képes hasítani a hPI Met(O)-X származékát, ahol az X jelentése Arg, Phe vagy Tyr. A fordított fázisú analízis azt mutatja, hogy a Met-Arg-hPI-szubsztrátról Met-Arg dipeptid hasad le, a Met(O)-Arg-hPI-szubsztrát esetében egy csúcs jelenik meg a Met-Arg dipeptid megjelenési helyén, ami a Met(O)-Arg dipeptiddel lehet azonos. A dDAP-oxidált, Met(O)-X-szubsztrát hasítóképessége előnyt jelent más enzimekkel szemben, melyek képtelenek ezt a reakciót elvégezni.
E) Met-Arg-(humán proinzulin) analógok átalakítása
A dDAP-enzim ugyancsak hatékonyan felhasználható a hajtogatott Met-Arg-proinzuIin analógok (B28 Lys, B29 Pro), valamint a hajtogatott Met-Arg-proinzulin analógok (BIO Asp, des B28-B30) átalakítására is. Ezeket a reakciókat lényegében a Met-Arg-hPI átalakításánál ismertetett körülmények között hajtjuk végre.
Claims (2)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Dictyostelium discoideumból kinyert dDAPenzim.
- 2. Eljárás az 1. igénypont szerinti dDAP Dictyostelium discoideum tenyészetéből való kinyerésére, azzal jellemezve, hogya) a tenyészetből elkülönítjük a sejtmentes levet,b) a sejtmentes levet anioncserélő kromatografálásnak vetjük alá,c) a b) lépés eluátumát hidrofób interakciós kromatografálásnak vetjük alá, ésd) a c) lépés eluátumát méretkizárásos kromatografálásnak vetjük alá.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US95553992A | 1992-10-01 | 1992-10-01 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9302773D0 HU9302773D0 (en) | 1994-01-28 |
| HUT70299A HUT70299A (en) | 1995-09-28 |
| HU219771B true HU219771B (hu) | 2001-07-30 |
Family
ID=25496954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9302773A HU219771B (hu) | 1992-10-01 | 1993-09-30 | Dictyostelium dipeptidil-aminopeptidáz |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5565349A (hu) |
| EP (2) | EP1094118A1 (hu) |
| JP (1) | JP3550409B2 (hu) |
| KR (1) | KR100291528B1 (hu) |
| CN (1) | CN1060212C (hu) |
| AT (1) | ATE211169T1 (hu) |
| AU (1) | AU669735B2 (hu) |
| BR (1) | BR9303949A (hu) |
| CA (1) | CA2107279A1 (hu) |
| CZ (2) | CZ286950B6 (hu) |
| DE (1) | DE69331371T2 (hu) |
| DK (1) | DK0595476T3 (hu) |
| ES (1) | ES2169036T3 (hu) |
| FI (1) | FI934305A (hu) |
| HU (1) | HU219771B (hu) |
| IL (1) | IL107123A (hu) |
| MX (1) | MX9306021A (hu) |
| MY (1) | MY113378A (hu) |
| NO (1) | NO933503L (hu) |
| NZ (1) | NZ248810A (hu) |
| PL (1) | PL176930B1 (hu) |
| PT (1) | PT595476E (hu) |
| RU (1) | RU2096455C1 (hu) |
| TW (1) | TW257792B (hu) |
| UA (1) | UA27718C2 (hu) |
| ZA (1) | ZA937243B (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573923A (en) * | 1993-12-22 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum |
| US5614379A (en) * | 1995-04-26 | 1997-03-25 | Eli Lilly And Company | Process for preparing anti-obesity protein |
| EP1141263A4 (en) * | 1998-09-21 | 2002-08-28 | Lilly Co Eli | PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT TRYPSIN ANALOGS |
| US6794159B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
| US6743600B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-06-01 | Monsanto Technologies Llc | Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase |
| US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
| EP2536749A1 (en) * | 2010-02-17 | 2012-12-26 | Elona Biotechnologies | Methods for preparing human growth hormone |
| US11427814B2 (en) | 2019-03-26 | 2022-08-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
| AU2020247918B2 (en) * | 2019-03-26 | 2022-06-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US5177003A (en) * | 1987-04-16 | 1993-01-05 | Phillips Petroleum Company | Flavored protein products derived from Candida utilis |
| US5075222A (en) * | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| JPH023698A (ja) * | 1988-06-20 | 1990-01-09 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬 |
| US5208218A (en) * | 1988-09-19 | 1993-05-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | T cell growth factor glycoproteins |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US5175251A (en) * | 1989-05-04 | 1992-12-29 | Sri International | Antimetastatic peptides with laminin activity |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US5173409A (en) * | 1989-12-08 | 1992-12-22 | Ecogen Inc. | Recovery of bt endotoxin protein from lysed cell mixtures |
-
1993
- 1993-07-28 TW TW082106050A patent/TW257792B/zh active
- 1993-09-27 IL IL10712393A patent/IL107123A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-09-28 KR KR1019930020229A patent/KR100291528B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 UA UA93002125A patent/UA27718C2/uk unknown
- 1993-09-29 AU AU48719/93A patent/AU669735B2/en not_active Ceased
- 1993-09-29 EP EP01200113A patent/EP1094118A1/en not_active Withdrawn
- 1993-09-29 DK DK93307746T patent/DK0595476T3/da active
- 1993-09-29 BR BR9303949A patent/BR9303949A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-09-29 MY MYPI93001975A patent/MY113378A/en unknown
- 1993-09-29 PT PT93307746T patent/PT595476E/pt unknown
- 1993-09-29 NZ NZ248810A patent/NZ248810A/en unknown
- 1993-09-29 ES ES93307746T patent/ES2169036T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 AT AT93307746T patent/ATE211169T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 ZA ZA937243A patent/ZA937243B/xx unknown
- 1993-09-29 PL PL93300537A patent/PL176930B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 DE DE69331371T patent/DE69331371T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-29 CZ CZ19932033A patent/CZ286950B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 EP EP93307746A patent/EP0595476B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 CA CA002107279A patent/CA2107279A1/en not_active Abandoned
- 1993-09-29 MX MX9306021A patent/MX9306021A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 CN CN93118452A patent/CN1060212C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 JP JP24479993A patent/JP3550409B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 RU RU9393047672A patent/RU2096455C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 NO NO933503A patent/NO933503L/no not_active Application Discontinuation
- 1993-09-30 FI FI934305A patent/FI934305A/fi unknown
- 1993-09-30 HU HU9302773A patent/HU219771B/hu not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-07 US US08/301,519 patent/US5565349A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-19 US US08/445,308 patent/US5565330A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-03 CZ CZ2000793A patent/CZ287066B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5614379A (en) | Process for preparing anti-obesity protein | |
| JP2551551B2 (ja) | デスルファトヒルジン、その製造及びそれを含む製薬組成物 | |
| US8501439B2 (en) | Method for obtaining active pro-NGF and beta-NGF | |
| US4355104A (en) | Bacteriolytic proteins | |
| US4520016A (en) | Bacteriolytic proteins | |
| AU643822B2 (en) | Process for the enzymatic preparation of basic fibroblast growth factor | |
| IE66054B1 (en) | Thermally stable cytosine deaminase | |
| HU219771B (hu) | Dictyostelium dipeptidil-aminopeptidáz | |
| US6015685A (en) | Ancrod proteins, their preparation and use | |
| US7279309B2 (en) | Process for manufacture of Nematode-extracted Anticoagulant Protein (NAP) | |
| JP3518868B2 (ja) | バシラスリケニフォーミス菌株から由来したアミノペプチダーゼ及び天然蛋白質の製造方法 | |
| Tsai et al. | The primary structure of fulvocin C from Myxococcus fulvus | |
| Hasegawa et al. | Characterization of elastolytic proteinase from Aspergillus flavus: Comparison of biochemical properties to the elastolytic proteinase from Aspergillus fumigatus | |
| EP0391407B1 (en) | Polypeptide and antibacterial preparations containing the same | |
| KR0132003B1 (ko) | 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |