CZ287066B6 - Způsob přípravy polypeptidového produktu - Google Patents
Způsob přípravy polypeptidového produktu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287066B6 CZ287066B6 CZ2000793A CZ2000793A CZ287066B6 CZ 287066 B6 CZ287066 B6 CZ 287066B6 CZ 2000793 A CZ2000793 A CZ 2000793A CZ 2000793 A CZ2000793 A CZ 2000793A CZ 287066 B6 CZ287066 B6 CZ 287066B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- precursor
- ddap
- met
- preparing
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 58
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 35
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 16
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 claims abstract description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 claims 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 5
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000049703 Dictyostelium discoideum AX3 Species 0.000 description 3
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 101000886298 Pseudoxanthomonas mexicana Dipeptidyl aminopeptidase 4 Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 108090000212 dipeptidyl peptidase II Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L potassium tetrathionate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N (2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-n-(4-nitrophenyl)-3-phenylpropanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- -1 DAP-III Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LKVCNGLNTAPMSZ-JYJNAYRXSA-N Gln-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LKVCNGLNTAPMSZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001874 anterior cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000003816 axenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-phenylalanine Chemical compound NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11005—Prolyl aminopeptidase (3.4.11.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Escalators And Moving Walkways (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Polyamides (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Noodles (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu přípravy polypeptidového produktu s dipeptidylaminopeptidázou, izolovanou z Dictyostelium discoideum. Způsob přípravy polypeptidového produktu odstraněním dipeptidů z aminového zakončení prekurzorového polypeptidu kdy, se uvede do styku prekurzorový polypeptid, mající sudý počet aminokyselin vázaných na peptidovou vazbu, která je po odstranění uvedených dipeptidů aminovým zakončením polypeptidového produktu, s dipeptidylaminopeptidázou o molekulové hmotnosti 225 000, izolovanou z Dictyostelium discoideum s optimální hodnotou pH 3,5 za specifických podmínek pro působení enzymu dDAP k sekvenčnímu odstranění aminokoncových dipeptidů ze zpracovávaného prekurzorového polypeptidu.ŕ
Description
Způsob přípravy polypeptidového produktu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy polypeptidového produktu s dipeptidylaminopeptidázou, izolovanou z Dictyostelium discoideum. Dipeptidylaminopeptidáza, izolovaná ze slizovky Dictyostelium discoideum (enzym, způsob jeho přípravy a jeho použití jsou předmětem základní zveřejněné PV 2033-93) je užitečná při zpracování rekombinantně produkovaných biologických sloučenin.
Dosavadní stav techniky
Dictyostelium discoideum je primitivní eukaryotický mikroorganismus běžně nazývaný slizovka nebo lépe buněčná slizovka. Označení je odvozeno od dvou extrémních stavů mikroorganismu z makroskopické perspektivy. Při skutečném růstu roste Dictyostelium discoideum jako jednobuněčná amoeba. V tomto stupni nemá žádnou buněčnou stěnu a její vzhled proto připomíná tenký film (nebo sliz). Po vyhladovění na pevném médiu se nezávislé buňky agregují za vytvoření kolonie. Tato kolonie má charakter multibuněčného organismu tím, že migruje ve formě označované jako slimák, a pak se diferencuje s pozdějšími buňkami slizu tvořícího nohu, přičemž přední buňky vytvářejí nožku a střední buňky vytvářejí plodnicí. Organismus se v přírodě vyskytuje na povrchu půdy a hnoje. Divoký typ amoeby získává živiny výlučně vstřebáváním (fagocytosou) celou baktérií; proto se někdy označuje jako masožravý. Byly isolovány axenické mutanty Dictyostelium discoideum, které jsou schopny růstu bez současné kultivace „potravinových“ bakterií a které proto mohou růst na rozpustném prostředí.
Dipeptidylaminopeptidázy (DAP) jsou enzymy, které hydrolyzují předposlední aminokoncovou peptidovou vazbu za uvolňování dipeptidu z neblokovaného aminového zakončení peptidů a bílkovin. V současné době jsou známy čtyři dipeptidylaminopeptidázy (označované jako DAP-I, DAP-II, DAP-III, DAP-IV), které se rozlišují na základě svých fyzikálních charakteristik a míry, kterou katalyzují štěpení s různými peptidovými sekvencemi a aminozakončením. Dipeptidylaminopeptidáza DAP-I je poměrně nespecifická DAP, která katalyzuje uvolňování mnohých dipeptidových kombinací z neblokovaného aminového zakončení peptidů a bílkovin. Dipeptidylaminopeptidáza DAP-I vykazuje malou aktivitu nebo nevykazuje žádnou aktivitu, když je vznikajícím dipeptidem X-Pro, Arg-X nebo Lys-X (kde X znamená aminokyselinu). Dipeptidylaminopeptidáza DAP-II vykazuje preferenci pro aminově zakončené dipeptidové sekvence, které začínají Arg-X nebo Lys-X a v menší míře X-Pro. DAP-II vykazuje výrazně nižší míru štěpení proti většině jiných dipeptidových kombinací. Zdá se, že dipeptidylaminopeptidáza DAP-III má sklon k aminokyselinovému zakončení dipeptidových sekvencí formy Arg-Arg aLys-Lys. Dipeptidylaminopeptidáza DAP-IV vykazuje nejvyšší stupeň hydrolytické aktivity se zřetelem na dipeptidové sekvence formy XPro. Dipeptidylaminopeptidasové (DAP) enzymy, zejména DAP-I a DAP-IV jsou užitečné při zpracování bílkovin. Předložený vynález se týká způsobu přípravy polypeptidového produktu s dipeptidylaminopeptidázou, izolovanou z Dictyostelium discoideum.
Podstata vynálezu
Podstatou předloženého vynálezu je způsob přípravy polypeptidového produktu odstraňováním dipeptidů z aminového zakončení prekurzorového polypeptidu, kdy se uvede do styku prekurzorový polypeptid, mající sudý počet aminokyselin vázaných na peptidovou vazbu, která je po odstranění uvedených dipeptidů aminovým zakončením polypeptidového produktu, s dipeptidylaminopeptidázou o molekulové hmotnosti 225 000, izolovanou z Dictyostelium discoideum s optimální hodnotou pH 3,5 za specifických podmínek pro působení enzymu dDAP
-1 CZ 287066 B6 k sekvenčnímu odstranění aminokoncových dipeptidů ze zpracovávaného prekurzorového polypeptidu.
Nový dipeptidylaminopeptidasový enzym dDAP vykazuje účinnost, která je poněkud podobná účinnosti DAP-I aDAP-III, je však vysoce odlišná od těchto enzymů svými fyzikálními a jinými enzymatickými charakteristikami. Vynález se týká způsobu použití DAP enzymu k odstraňování dipeptidů z N-zakončení rekombinantně produkovaného prekurzoru bílkovin nebo peptidů. Enzymu dDAP podle předloženého vynálezu se může používat pro odstraňování jednotlivých dipeptidů z N-zakončení polypeptidů a také se ho může používat k sekvenčnímu odstraňování více než jednoho dipeptidů z N-zakončení prekurzorových polypeptidů.
Používané symboly a zkratky mají následující významy:
dDAP - dipeptidylaminopeptidáza, izolovaná z Dictyostelium discoideum, která vykazuje optimum hodnoty pH = 3,5 s GFpNA jakožto substrátem a má molekulovou hmotnost 225 000 měřeno analytickým ultraodstřeďováním a subjednotkovou molekulovou hmotnost 66 000 měřeno SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou.
GFpNA - Gly-Phe p-nitroanilid.
Prekurzorový polypeptid - rekombinantně produkovaný polypeptid, který obsahuje stejný počet aminokyselin za aminovým zakončením žádaného polypeptidu.
Zpracovávaný polypeptid - polypeptid získaný odstraněním N-koncového dipeptidů nebo dipeptidů k získání žádaného polypeptidu.
RRBNA - Arg-Arg-beta-naftylamid.
Všechny používané zkratky aminokyselin v popise vynálezu jsou schválené americkým Úřadem pro patenty a obchodní známky, uvedené v platnost 37 C.F.R.-1.822 (b) (2) (1990).
Enzym dDAP podle vynálezu je nejužitečnější pro převádění prekurzorových polypeptidů na zpracovávané polypeptidy.
Prekurzorové polypeptidy, které se mohou zpracovávat enzymem dDAP lze uvést Met-ArghGH, Met-Tyr-proinzulin, Met-Arg-proinzulin, Met-Arg-proinzulinový analog (B28 Lys, B29 Pro), Met-Tyr-proinzulinový analog (B28 Lys, B29 Pro), Met-Arg-proinzulinový analog (BIO Asp, des B28-30), Met-Tyr-proinzulinový analog (BIO Asp, des B28-30). Inzulínový analog (B28 Lys, B29 Pro) je popsán v evropské přihlášce vynálezu EP 90301224.3, zatímco inzulínový analog (BIO Asp, des B28-30) je popsán v evropské přihlášce vynálezu EP 92305678.2. Vyjma toho, lze používat enzymu dDAP k sekvenčnímu odstraňování více než jedné sady dipeptidů z N-zakončení prekurzorových polypeptidů. Zpracování Met-Arg-proinzulinu aMet-Argproinzulinových analogů pomocí hovězího DAP-I popsali Becker a kol. v US patentovém spise 5 126 249, zveřejněném 30.6.1992.
Použití enzymu dDAP k odstranění dipeptidů prekurzorových bílkovin je výhodné v tom, že dDAP má optimum při hodnotě pH 3,5, která umožňuje provádění reakce v kyselé oblasti, kdy jsou četné prekurzorové polypeptidy rozpustné. Kromě toho konverze některých prekurzorových polypeptidů při neutrální nebo větší hodnotě pH může vést k vyšší míře meziřetězcových disulfidických dimerů nebo polymerů substrátu s doprovodnou ztrátou výtěžku produktu. Tento jev známý jakožto disulfídické „scrambling“ je obzvláště nepříjemný, když se používá hovězího DAP-I, jelikož DAP-I vyžaduje přidávání redukčních činidel, například beta-merkaptoethanolu nebo cysteinu do reakční směsi. V kyselé oblasti hodnot pH dochází rovněž k oxidaci methioninových zbytků nižší měrou. Kromě toho je ekonomicky snadnější používat enzymu z fermentační kultury Dictyostelium discoideum, než se spoléhat na provozní produkci enzymů z živočišných zdrojů, jelikož fermentační technologie umožňuje větší konzistenci produktu a reprodukovatelnost enzymu. Vyloučení enzymů na živočišné bázi představuje konstantní zdroj vysoce čistého základního materiálu. Fermentace Dictyostelium discoideum Ax3 (ATCC 28368) následovaná odstředěním, ionexovou chromatografií, hydrofobní interakční chromatografií
-2CZ 287066 B6 a vylučovací chromatografií vede k vysoce vyčištěnému roztoku dDAP enzymu, kteiý se může ukládat nebo bezprostředně používat pro zpracování prekurzorových polypeptidů.
Konverze prekurzorových polypeptidů na zpracovávané polypeptidy se může provádět v širokém rozmezí teplot, hodnot pH a v širokém časovém rozmezí. Reakce se zpravidla provádí ve vodném vhodně pufrovaném prostředí k získání a k udržení hodnoty pH 2, až 5,5. Pro výhodné provedení je hodnota pH 3,0 až 4,5 a zejména 3,0 až 3,5. Optimální hodnota pH se může mírně měnit podle substrátu. Například zpracování Gly-Phe-pNA a Gly-Arg-pNa probíhá nejrychleji při hodnotě pH 3,5, zatímco rychlost zpracování Met-Asp-hGH probíhá lépe při hodnotě pH 3, až 3,5.
Zpracování Arg-Arg-βΝΑ probíhá nejrychleji při hodnotě pH 4,5. Pracovník v oboru snadno stanoví optimální hodnotu pH pro každou specifickou reakci na základě charakteristik jako je stabilita a rozpustnost daného prekurzorového polypeptidů a enzymu. V některých případech se může použít solubilizačního činidla, jako je například močovina, dodecylsulfát sodný a guanidin. Reakci zpracování lze nechat proběhnout po libovolný časový úsek, od pouze několika sekund až po několik dní. Výhodně reakce probíhá od 1 minuty až po 24 hodin, výhodněji zejména od 1 hodiny do 8 hodin. Zručný pracovník v oboru pozná na jakou dobu lze reakci nastavit pro splnění jakéhokoliv parametru pro jakýkoliv žádaný prekurzorový polypeptid nebo zpracovávaný polypeptid.
Teplota zpracovávací reakce se může také nastavit podle daného substrátu. Výhodně se reakce nechá probíhat při teplotě od 15 do 45 °C. Výhodněji seje teplota zpracovávací reakce mezi 20 až 37 °C, zejména je teplota reakční směsi 25 až 37 °C. Opět zručný pracovník v oboru lehce určí reakční parametiy jako je doba, teplota a hodnota pH, které se mohou měnit podle potřeby dle žádaného prekurzoru nebo zpracovávaného polypeptidů.
Při popisovaném způsobu se může použít nejrůznějších pufrů, jediným požadavkem je udržení hodnoty pH v žádaném rozmezí. Příklady typických pufrů jsou fosforečnan sodný, octan sodný citran sodný, glycin a podobně. Výhodné pufry jsou octan sodný, fosforečnan sodný a glycin.
Prekurzorové polypeptidy pro provádění způsobu podle předloženého vynálezu se obecně připravují pomocí rekombinantní DNA technologie. Během jejich přípravy je získána nukleotidová sekvence kódující požadovaný prekurzorový polypeptid za použití rutinních technik pro tyto syntézy.
Tyto způsoby obvykle zahrnují přípravu oligonukleotidů kódujících jak fragmenty požadované kódující sekvence, tak jejich komplementární sekvence. Oligunukleotidy jsou určeny pro zajištění překrytí jednoho fragmentu kódující sekvence se dvěma fragmenty komplementární sekvence a naopak. Oligonukleotidy se párují a spojují, což nakonec vede k vytvoření požadované genové sekvence.
Sekvence se včlení do klonovacího vektoru v místě, které dovoluje, aby byl exprimován produkt, který je jí kódován. Vhodné klonovací vektory obsahují alespoň část řídící sekvence exprese.
Následující příklady jsou podány jako prostředek pro ilustraci předloženého vynálezu. Příklady neomezují žádným způsobem předmět předloženého vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Fermentace Dictyostelium discoideum
Lyofilizované kultury Dictyostelium discoideum Ax3, získané z Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod označením ATCC 28368 se nanesou v různé hustotě na agarové destičky (1,2 % Difco Bacto Agar) obsahující pufrované prostředí kvasničný extrakt
-3CZ 287066 B6 pepton o složení (uváděném v g/1): Difco Yeast Extract (kvasničný extrakt Difco) (7,15), Difco Bacto Peptone (14,3), Na2HPO4 (0,51) a KH2PO4 (0,49), do kterého se přidá asepticky glukosa (10 g/1) po oddělené sterilizaci a s hodnotou pH upravenou na 6,5 (± 0,1) hydroxidem sodným nebo kyselinou sírovou. Totéž prostředí (bez agaru) se používá pro růst kapalné kultuiy v objemech menších než přibližně jeden litr. Agarové destičky se inkubují po dobu 3 až 5 dní při teplotě 21 až 24 °C. Z destiček se sklidí spory, které se opatrují k předcházení snímání „potravinového bakteria“ lyofilizovaného s Ax3 kulturou, pak se naočkují do 3 ml pufrované půdy kvasničný extrakt-peptonový bujón a inkubují se za mírného protřepávání při teplotě 21 až 24 °C. Pak se násobí buňky Dictyostelium discoideum sériovým přenosem postupně větších objemů pufrované půdy pepton-kvasničný extrakt. Každý sériový stupeň přenosu je za přibližně 10 až 25 násobného zředění a probíhá, když hustota buněk překročí přibližně 2 x 10^ ml. Půdy se vždy inkubují při teplotě 21 až 24 °C za mírného míchání.
Míchané fermentace se zpravidla provádějí v podobném prostředí se sójovým peptonem (například Phytone Peptone nebo Marcor Soy Peptone) o koncentraci 2 až 14,3 g/1 místo peptonu Bacto Peptone v počátečním prostředí pepton-kvasničný extrakt. Sklízí se zpravidla z fermentorů s pracovním objemem 10 až 5000 litrů, vybavených 1 až 3 turbinovými míchadly Rushton o počtu otáček 40 až 150 za minutu. Pracuje se při teplotě 22 ± 1 °C za řízeného průtoku vzduchu 0,1 až 0,5 objemů vzduchu na objem kapalné půdy a za tlaku 20,7 až 34,4 kPa. Některé fermentace se provádějí při hodnotě pH 6,4 nastavené kyselinou sírovou a některé rozpuštěným kyslíkem řízeným na 40 až 60 % řízením míchání a průtoku vzduchu. Dbá se o to, aby docházelo k minimálnímu střihu při manipulaci afermentaci buněk, aby stěny byly prosty amoeby v průběhu růstu.
Obecně se míchané kultury Dictyostelium discoideum Ax3 zdvojnásobí v průběhu 12 až 36 hodin. Postupně se snižuje obsah rozpuštěného kyslíku (i když tento obsah není řízen), začne stoupat když přestane vzrůstat hustota buněk. Konečné hustoty buněk 3 x 10^ ml až 5 x 10? ml zřejmě omezují přenos kyslíku v takových fermentacích s nižšími hustotami buněk.
Občas se odebírají a analyzují vzorky se zřetelem na hustotu buněk a na aktivitu GF-pNAse (viz příklad 3, infra). Používá se čítači komůrky Petroff-Hauser ke stanovení hustoty buněk nad přibližně 5 x 10^ ml. Obecně GFpNA hydrolyzační aktivita vzrůstá během průběhu fermentace. Maximální dDAP aktivita se pozoruje za 2 až 4 dny po dosažení maximální hustoty buněk. Veškerá půda se ukládá při teplotě 4 °C nebo se zmrazí na teplotu -20 °C a pak se nechá roztát a analyticky se zjišťuje aktivita. Fermentace se sklízí ochlazením na méně než 10 °C a oddělením buněk za použití odstředivky s kontinuálním průtokem.
Příklad 2
Aktivita dDAP
A. Konverzní reakce
1. Štěpení GF/pNA
Enzym dDAP se normálně monitoruje podle štěpení chromgenního substrátu Gly-Pha paranitroanilid (GF-pNA). Zkouška se zpravidla provádí zředěním enzymu 11 krát na 1,0 ml 4 mM GFpNA nastaveného na hodnotu pH 3,5. Rychlost štěpení GF dipeptidu se monitoruje při teplotě 37 °C měřením vzrůstu absorbance při 405 nm. Jedna jednotka aktivity vede k 0,90 OD změně za minutu za těchto podmínek. Stanovení jednotky za minutu je možné za předpokladu extinkčního koeficientu pro volnou pNA 9,9 mM'l cm'l při 405 nm. Inhibiční profil enzymu dDAP se zřetelem na substrát GFpNA se porovnává s hovězím DAP-I za použití jodacetamidu a tetrathionátu draselného, sulfhydrylových modifikačních činidel známých k inhibici aktivity DAP-I. Vzorky dDAP nebo hovězího slezinového DAP-I se inkubují po dobu 15 minut při teplotě místnosti v konečných koncentracích 0, 0,5, 5,0 nebo 50 mM každého inhibitoru při hodnotě pH 7 ve 100 mM pufru Tris. Inkubované roztoky se pak zředí 21 krát použitím 4 mM
-4CZ 287066 B6
GFpNA za hodnoty pH 3,5. Rychlost štěpení se monitoruje měřením vzrůstu absorbance při
405 nm při teplotě 37 °C. Rychlost hovězího DAP-I štěpení GFpNA se snižuje více než o 90 % při vystavení 5 mM jodacetamidu a z 95 % se inhibuje 5 mM tetrathionátem draselným. Není žádných známek významné inhibice dDAP při žádné z testovaných koncentrací jodacetamidu nebo tetrathionátu draselného.
Optima hodnoty pH pro GFpNA schopnost štěpení se stanovují nastavením pufru sestávajícího z 0,5 Tris, fosfátu a citrátu použitím 10% kyseliny chlorovodíkové nebo 10% roztoku hydroxidu sodného na hodnotu pH 3 až 8. Enzym dDAP se zředí 20 krát v pufru obsahujícím 100 mM cysteaminu a 10 mM chloridu sodného. Hovězí DAP-I se zředí 200 krát vtémže pufru. Substrátový roztok GFpNA (4 mM) se připravuje v 2% dimethylformamidu. V mikrotitrové destičce se smíchá 0,025 ml pufru Tris/fosfát/citrát o různé hodnotě pH s0,l ml zředěného enzymu a s 0,1 ml substrátového roztoku. Míra vzrůstu absorbance při 410 nm se stanovuje na deskovém čítači („plate reader“) v průběhu 30 minut. Výsledky indikují, že optima hodnoty pH dDAP štěpení GFpNA jsou 3,5 až 4,0.
2. Štěpení Gly-Arg-pNA
Připraví se čtyři vzorky mM Gly-Arg-pNA (GR-pNA) v 50 mM kyseliny octové, v 50 mM glycinového pufru při hodnotě pH 5. K nastavení hodnot pH 5,1 až 2,3 se používá kyseliny chlorovodíkové nebo roztoku hydroxidu sodného. Do 180 μΐ shora uvedeného pufrovaného substrátu se přidá 5μ1 dDAP (49 milijednotek/ml konečných). Míra vzrůstu absorbance při 410 nm se monitoruje (za použití deskového čítače) a míra vzrůstu se podporovnává s hodnotou pH reakčního roztoku. Jako s GF-pNA má GR-pNA substrát optimum hodnoty pH přibližně
3,5. Enzym má malou aktivitu při hodnotě pH pod 2,5 nebo nad 5 za použití tohoto substrátu.
3. Štěpení Arg-Arg-B-riaftylamidu (RR-BNA)
Připraví se přibližně 0,25 mM (RR-BNA) nebo 0,25 mM benzyloxykarbonyl-RR-BNA (Z-RRBNA) buď ve 100 mM kyseliny octové, hodnota pH 3,5, nebo ve 100 mM citrátového pufru, při hodnotě pH 5,0. Do 2 ml substrátu se přidá dDAP nebo hovězí DAP-I (přibližně 15 milijednotek/ml roztoku). Míra štěpení (monitorovaná vzrůstem fluorescence při 410 nm za excitace při 340 nm) se monitoruje. Hovězí DAP-I není schopen štěpit žádný substrát.
Překvapivě je dDAP schopen účinně štěpit RP-BNA substrát. Enzym dDAP není schopen štěpit blokovanou aminoskupinu Z-RR-BNA substrátu, což potvrzuje pozorování, že dDAP je DAP enzym. Optimální hodnota pH pro štěpení RR-BNA se zkouší monitorováním rychlosti RRBNA štěpení za použití systému pufru sestávajícího z 50 mM kyseliny octové a 50 mM citrátu. Různé hodnoty pH se nastavují použitím kyseliny chlorovodíkové nebo roztoku hydroxidu sodného a 1,5 ml objemů se upravuje na 2,0 s 0,5 ml- 1 mM zásobního roztoku RR-BNA (konečná koncentrace přibližně 0,25 mM). Enzym dDAP se přidává (do přibližně 15mU/ml) a stanovuje se míra štěpení. Optimální hodnota pro štěpení RR-BNA je přibližně 4,5 s výraznou aktivitou v celém zkoušeném rozmezí (hodnota pH 3,5 až pH 5,7). Tento překvapivý výsledek napovídá, že enzym dDAP má některé vlastnosti DAP-III.
Pracovníkovi v oboru je jasné, že optimální hodnota pH pro štěpení substrátu závisí nejen na enzymu, ale také na samotném substrátu, to znamená na konstituci odstraňovaného dipeptidu, jakož také na samotné indikátorové skupině. Například za použití enzymu dDAP, má Gly-ArgpNA optimální hodnotu pH přibližně 3,5, zatímco optimální hodnota pH pro štěpení Gly-Arg7-amido-4-methylkumarinu (GR-AMC) je přibližně 5, což znamená, že příslušná skupina může ovlivňovat vlastnosti štěpení.
B. Konverze syntetických oktapeptidů a dekapeptidů
Oktapeptid Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu se rozpustí na koncentraci 4 mM s 50 mM kyseliny octové za hodnoty pH 3,5. Roztok se zředí na 1 : 1 dDAp (lOmU/ml) a inkubuje se při teplotě místnosti po dobu šesti hodin. Reakce se ukončí zředěním 20 násobkem v 7 M močovině
-5CZ 287066 B6 obsahující 1 % kyseliny fosforečné. Vzorek s ukončenou reakcí se analyzuje vysokovýkonostní reverzní fázovou (HPCL) chromatogragií. Štěpné produkty se porovnávají se standardním oktapeptidem, Met-Asp dipeptidem a s Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu hexapeptidem. dDAP lehce odstraňuje Met-Asp dipeptid z neblokového aminozakončení oktapeptidu, není však schopen snadno Štěpit vzniklý dipeptid Phe-Pro.
Syntetizovaný dekapeptid Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu se připravuje jakožto 1,7 mM zásobní roztok ve 100 mM glycinu za hodnoty pH 3,5. Do 0,5 mililitrů tohoto roztoku se přidá 8 mikrolitrů 6,4 mU/ml dDAP (připraveno ve 100 mM glycinu, hodnota pH 3,5). Každou hodinu se 5 mikrolitrů tohoto roztoku přímo vstřikuje do reverzního fázového chromatografického systému HPCL k monitorování štěpných produktů. Pro srovnání se nezávisle vstřikují Met-Arg aMet-Tyr dipeptidy jakož také Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu a Phe-ValAsn-Gln-His-Leu peptidy. Enzym dDAP ochotně štěpí Met-Arg dipeptid z dekapeptidu stejně jako vzniklý Met-Tyr dipeptid. To znamená, že dipeptidy se mohou sekvenčně odstraňovat z aminozakončení dDAP.
C. Konverze Met-Asp lidského růstového hormonu
Met-Asp lidský růstový hormon (Met-Asp-hGH) se produkuje jako nerozpustná bílkovina v cytoplasmě E. coli. Nerozpustná bílkovina se stabilizuje, ohýbá k vytvoření vhodně disulfídicky párovaných Met-Asp-hGH a čistí se ionexovou chromatografii. Po výměně rozpouštědel je hodnota pH nastavena na 3,5. Met-Asp-hGH se ohřeje na teplotu 37 °C a stanoví se absorbance při 280 nm. dDAP se přidá v množství 6 milijednotek na mg Met-Asp-hGH.
Konverzní reakce se nechá probíhat při teplotě 37 °C za míchání přibližně 4 až 6 hodin. Reakce se může zpomalit bez nepříznivého ovlivnění použitím méně enzymu, nižší teploty nebo nižší koncentrace Met-Asp-hGH. Reakční rychlost se může zvýšit přidáním většího množství enzymu, zvýšením koncentrace Met-Asp-hGH nebo zvýšením reakční teploty. Postup konverzní reakce se monitoruje pomocí reverzní fázové chromatografie. Konverzní reakce se ukončí lychlým přidáním hydroxidu sodného za míchání při hodnotě pH 8 a přidáním 30% (objem/objem) acetonitrilu. Reakční produkt lidského růstového hormonu, produkovaný zpracováním enzymem dDAP se podrobí extenzivní sérii analytických procedur včetně mapování peptidu, N-koncového sekvencování, hmotové spektroskopie, aminokyselinové analýzy a reverzní fázové chromatografii (HPCL). Všechna data indikují, že se použitím enzymu dDAP získá autentický lidský růstový hormon.
D. Konverze Met-Arg-lidského proinzulinu
Met-Arg-lidský proinzulin (Met-Arg-hPI) se produkuje jako nerozpustná bílkovina v cytoplazmě Ε. coli. Nerozpustná bílkovina se solubilizuje v 7 M močovině. Bílkovina se čistí ionexovou chromatografii. Met-Arg-hPI se sulfitolyzuje, rozpouštědlo se zamění a ohýbá se k vytvoření nativních disulfidických vazebných párů a nativní terciální struktury. Materiál se dále čistí za použití reverzní fázové chromatografie. Vytvoří se oxidovaný methionyl (Met(O))-ArghPI z Met-Arg-hPI za použití peroxidu vodíku a následně se čistí za použití reverzní fázové chromatografie a lyofilizuje se.
Met-Arg-hPI je přibližně 24 mg/ml (v přibližně 20 mM glycinovém pufru, pH 3,5). Přibližně 2,4 mg tohoto materiálu se inkubuje s 0,19 milijednotkami enzymu dDAP při hodnotě pH 3,5. Reakce se nechá probíhat při teplotě místnosti. Periodicky se odebírají podíly a zředí se 10% kyselinou fosforečnou. Tento materiál se vstřikuje na neutrální reverzní fázi systému chromatografii HPLC k monitorování zániku Met-Arg-hPI nebo (Met(O))-Arg-hPI za následné produkce hPI. Kromě toho se podíly ředí vhodným ředidlem pro umožnění HPLC monitorování vzniku buď Met-Arg, nebo (Met(O))-Arg-dipeptidu. Přibližně 60 % Met-Arg-hPI se v průběhu 8 hodin převede na hPI. Podobný výsledek se neočekávatelně pozoruje pro konverzi (Met(O))Arg-hPI; to znamená, že se vytváří hPI. Míra štěpení obou substrátů je podobná. Tento výsledek je překvapivý jelikož hovězí DAP-I se jeví jako neschopný štěpit Met-(O)-X-deriváty hPI, kde
-6CZ 287066 B6
X znamená Arg, Phe a Tyr. Reverzní fázová analýza také dokládá, že Met-Arg dipeptid se uvolňuje z Met-Arg-hPI ve srovnání s dipeptidem Met-Arg a pík se jeví v oblasti Met-Arg dipeptidu pro zkoušku s (Met(O))-Arg-hPI substrátem, kterým může být dipeptid Met(O)-Arg.
Schopnost dDAP štěpit oxidovaný Met(O)-X substrát je výraznou zpracovatelskou předností před enzymy, které nejsou schopny provádět toto štěpení.
E. Konverze Met-Arg-lidských proinzulinových analogů
Enzymu dDAP se také používá k účinné konverzi ohýbaného Met-Arg-lidských proinzulinového analogu (B28 Lys, B29 Pro) a ohýbaného Met-Arg-proinzulinového analogu (BIO Asp, B28B30). Tyto reakce se provádějí v podstatě stejně, jak je vysvětleno při konverzi Met-Arg-hPI.
Průmyslová využitelnost
Způsobu přípravy polypeptidového produktu s dipeptidylaminopeptidázou, izolovanou z Dictyostelium discoideum se používá k odstraňování dipeptidů z rekombinantně produkovaných prekurzorových bílkovin nebo peptidů.
Claims (8)
1. Způsob přípravy polypeptidového produktu odstraněním dipeptidů z aminového zakončení prekurzorového polypeptidu, vyznačený tím, že se uvede do styku prekurzorový polypeptid, mající sudý počet aminokyselin vázaných na peptidovou vazbu, která je po odstranění uvedených dipeptidů aminovým zakončením polypeptidového produktu, s dipeptidylaminopeptidázou o molekulové hmotnosti 225 000, izolovanou z Dictyostelium discoideum s optimální hodnotou pH 3,5 za specifických podmínek pro působení enzymu dDAP k sekvenčnímu odstranění aminokoncových dipeptidů ze zpracovávaného prekurzorového polypeptidu.
2. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároku 1, vyznačený tím, že se uvede do styku prekurzorový polypeptid, obsahující dipeptid vázaný na peptidovou vazbu, která je po odstranění uvedeného dipeptidu aminovým zakončením polypeptidového produktu, s dipeptidylaminopeptidázou o molekulové hmotnosti 225 000, izolovanou z Dictyostelium discoideum s optimální hodnotou pH 3,5 za specifických podmínek pro působení enzymu dDAP k sekvenčnímu odstranění aminokoncového dipeptidu ze zpracovávaného prekurzorového polypeptidu.
3. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároku 2, vyznačený tím, že zpracovávaný prekurzorový polypeptid se volí ze souboru zahrnujícího prekurzor lidského proinzulinu, prekurzor lidského růstového hormonu a prekurzor analogu lidského proinzulinu.
4. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároku 3, vyznačený tím, že se prekurzorový polypeptid uvede do styku s enzymem dDAP po dobu jedné minuty až 24 hodin.
5. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároků 2až4, vyznačený tím, že se prekurzorový polypeptid uvede do styku s enzymem dDAP v roztoku o hodnotě pH 2,5 -
5,5.
6. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároku 5, vyznačený tím, že se prekurzorový polypeptid uvede do styku s enzymem dDAP v roztoku o hodnotě pH 3,5.
-7CZ 287066 B6
7. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároku 2, vyznačený tím, že se prekurzorový polypeptid uvede do styku s enzymem dDAP při teplotě 15 až 45 °C.
8. Způsob přípravy polypeptidového produktu podle nároku 2, vyznačený tím, že N-koncovou aminokyselinou dipeptidu je oxidovaný methionin.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US95553992A | 1992-10-01 | 1992-10-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ287066B6 true CZ287066B6 (cs) | 2000-08-16 |
Family
ID=25496954
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19932033A CZ286950B6 (en) | 1992-10-01 | 1993-09-29 | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase, process of its preparation and use |
| CZ2000793A CZ287066B6 (cs) | 1992-10-01 | 2000-03-03 | Způsob přípravy polypeptidového produktu |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19932033A CZ286950B6 (en) | 1992-10-01 | 1993-09-29 | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase, process of its preparation and use |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5565349A (cs) |
| EP (2) | EP1094118A1 (cs) |
| JP (1) | JP3550409B2 (cs) |
| KR (1) | KR100291528B1 (cs) |
| CN (1) | CN1060212C (cs) |
| AT (1) | ATE211169T1 (cs) |
| AU (1) | AU669735B2 (cs) |
| BR (1) | BR9303949A (cs) |
| CA (1) | CA2107279A1 (cs) |
| CZ (2) | CZ286950B6 (cs) |
| DE (1) | DE69331371T2 (cs) |
| DK (1) | DK0595476T3 (cs) |
| ES (1) | ES2169036T3 (cs) |
| FI (1) | FI934305A (cs) |
| HU (1) | HU219771B (cs) |
| IL (1) | IL107123A (cs) |
| MX (1) | MX9306021A (cs) |
| MY (1) | MY113378A (cs) |
| NO (1) | NO933503L (cs) |
| NZ (1) | NZ248810A (cs) |
| PL (1) | PL176930B1 (cs) |
| PT (1) | PT595476E (cs) |
| RU (1) | RU2096455C1 (cs) |
| TW (1) | TW257792B (cs) |
| UA (1) | UA27718C2 (cs) |
| ZA (1) | ZA937243B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573923A (en) * | 1993-12-22 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum |
| US5614379A (en) * | 1995-04-26 | 1997-03-25 | Eli Lilly And Company | Process for preparing anti-obesity protein |
| EP1141263A4 (en) * | 1998-09-21 | 2002-08-28 | Lilly Co Eli | PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT TRYPSIN ANALOGS |
| US6794159B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
| US6743600B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-06-01 | Monsanto Technologies Llc | Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase |
| US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
| EP2536749A1 (en) * | 2010-02-17 | 2012-12-26 | Elona Biotechnologies | Methods for preparing human growth hormone |
| US11427814B2 (en) | 2019-03-26 | 2022-08-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
| AU2020247918B2 (en) * | 2019-03-26 | 2022-06-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US5177003A (en) * | 1987-04-16 | 1993-01-05 | Phillips Petroleum Company | Flavored protein products derived from Candida utilis |
| US5075222A (en) * | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| JPH023698A (ja) * | 1988-06-20 | 1990-01-09 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬 |
| US5208218A (en) * | 1988-09-19 | 1993-05-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | T cell growth factor glycoproteins |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US5175251A (en) * | 1989-05-04 | 1992-12-29 | Sri International | Antimetastatic peptides with laminin activity |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US5173409A (en) * | 1989-12-08 | 1992-12-22 | Ecogen Inc. | Recovery of bt endotoxin protein from lysed cell mixtures |
-
1993
- 1993-07-28 TW TW082106050A patent/TW257792B/zh active
- 1993-09-27 IL IL10712393A patent/IL107123A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-09-28 KR KR1019930020229A patent/KR100291528B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 UA UA93002125A patent/UA27718C2/uk unknown
- 1993-09-29 AU AU48719/93A patent/AU669735B2/en not_active Ceased
- 1993-09-29 EP EP01200113A patent/EP1094118A1/en not_active Withdrawn
- 1993-09-29 DK DK93307746T patent/DK0595476T3/da active
- 1993-09-29 BR BR9303949A patent/BR9303949A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-09-29 MY MYPI93001975A patent/MY113378A/en unknown
- 1993-09-29 PT PT93307746T patent/PT595476E/pt unknown
- 1993-09-29 NZ NZ248810A patent/NZ248810A/en unknown
- 1993-09-29 ES ES93307746T patent/ES2169036T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 AT AT93307746T patent/ATE211169T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 ZA ZA937243A patent/ZA937243B/xx unknown
- 1993-09-29 PL PL93300537A patent/PL176930B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 DE DE69331371T patent/DE69331371T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-29 CZ CZ19932033A patent/CZ286950B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 EP EP93307746A patent/EP0595476B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 CA CA002107279A patent/CA2107279A1/en not_active Abandoned
- 1993-09-29 MX MX9306021A patent/MX9306021A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 CN CN93118452A patent/CN1060212C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 JP JP24479993A patent/JP3550409B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 RU RU9393047672A patent/RU2096455C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 NO NO933503A patent/NO933503L/no not_active Application Discontinuation
- 1993-09-30 FI FI934305A patent/FI934305A/fi unknown
- 1993-09-30 HU HU9302773A patent/HU219771B/hu not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-07 US US08/301,519 patent/US5565349A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-19 US US08/445,308 patent/US5565330A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-03 CZ CZ2000793A patent/CZ287066B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0746611B1 (en) | Method for increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by (saccharomyces cerevisiae) | |
| CN1871351B (zh) | 一种新的真菌蛋白及其编码核酸 | |
| US6333175B1 (en) | Yield when disulfide-bonded proteins are secreted | |
| CA2218880A1 (en) | Process for preparing anti-obesity protein | |
| JPH08512201A (ja) | プロテアーゼ活性を有する酵素 | |
| CZ292541B6 (cs) | Purifikovaná enzymaticky aktivní rekombinantní karboxypeptidáza B a způsob její přípravy | |
| CZ287066B6 (cs) | Způsob přípravy polypeptidového produktu | |
| KR20010083900A (ko) | 활성 β-ＮＧＦ의 제조방법 | |
| Noronha et al. | Heterologous production of Aspergillus fumigatus keratinase in Pichia pastoris | |
| AU637254B2 (en) | An enzymatic process for the conversion of preproinsulins into insulins | |
| US5369016A (en) | Peptide amidase and the use thereof | |
| Nomura et al. | Characterization and crystallization of recombinant human cathepsin L | |
| WO1997023605A1 (en) | Thermostable proteolytic enzyme from thermoactinomyces thalpophilus thm1 | |
| JP3518868B2 (ja) | バシラスリケニフォーミス菌株から由来したアミノペプチダーゼ及び天然蛋白質の製造方法 | |
| Takahashi et al. | VARIATIONS IN THE CONTENT AND ISOZYMIC COMPOSITION OF NEPENTHESIN IN THE PITCHER FLUIDS AMONG NEPENTHES SPECIES. | |
| KR0132003B1 (ko) | 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법 | |
| Hrušková-Heidingsfeldová et al. | Enzymological characterization of secreted proteinases from Candida parapsilosis and Candida lusitaniae | |
| JP3516318B2 (ja) | 新規エンドペプチダーゼ | |
| JPH02186988A (ja) | 抗ウイルス性タンパク質の製造方法 | |
| JP2000116377A (ja) | 新規なセリンプロテアーゼ及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020929 |