JP3005335B2 - プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法 - Google Patents
プレプロインスリンのインスリンへの酵素的変換方法Info
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Description
わち21個のアミノ酸残基を含むA鎖と30個のアミノ
酸残基を含むB鎖から構成されている。AおよびB両鎖
は、2個のジスルフィド結合を介して連結されている。
すなわち、A7とB7およびA20とB19の位置のシ
ステイン残基が互いに結合している。第三のジスルフィ
ド結合がA6とA11の間にある。動物およびヒトイン
スリンは膵臓において、プレプロインスリンの形で産生
される。ヒトプレプロインスリンは、たとえば、24個
のアミノ酸残基を有するプレペプチドに86個のアミノ
酸残基を有するプロインスリンが結合してなり、以下の
コンフィギュレーション:プレペプチド−B−Arg−
Arg−C−Lys−Arg−A(式中、Cは31残基
からなるアミノ酸鎖である)を有する。ランゲルハンス
島からの分泌時にプレペプチドは切断除去されてプロイ
ンスリンを生じる。最後にC鎖が蛋白分解的に切断され
て活性ヒトインスリンが生成する。
を微生物内で発現させることが徐々に可能になってきて
いる(EP−A−347 781、EP−A−367 1
63)。プレプロ配列は通常、化学的におよび/または
酵素的に切断される(DE−P−3 440 988、E
P−A−0 264 250)。既知の酵素的変換法は、
トリプシンとカルボキシペプチダーゼBによる切断に基
づくものである(Kemmler, W. ら:J. Biol. Chem., 2
46:6786〜6791,1971;EP−A−19
5 691:EP−B−89007)。これらの方法の
欠点は、反応溶液からの除去がかなり困難な大量の副生
成物の形成である。とくにヒトプレプロインスリンのヒ
トインスリン(ヒトインスリン、HI)への変換の場
合、大量のde−Thr(B30)−ヒトインスリン
(de−Thr(B30)−HI)が形成する。この副
生成物はHIと、末端アミノ酸を欠く点でのみ相違し、
反応溶液からの除去がきわめて困難である。
混合物にある種の重金属、とくにニッケルを添加するこ
とができる(EP−A 0264 250)。この方法で
の反応の実施は、流出液に多量の重金属が負荷されるの
で、工業的観点から望ましいものではない。したがっ
て、最高の特異性と環境への適合性のあるプレプロイン
スリンの変換が求められている。
ーゼB;EC 3.4.22.8)は Clostridium hist
olyticum の培養濾液からの酵素で、分子量約30,00
0〜80,000、蛋白分解活性とアミダーゼ/エステ
ラーゼ活性の両者を有する(Mitchell, W.M., Harringt
on, W.F.J.;J. Biol. Chem., 243(18):468
3〜4692,1968)。これはArg−C結合に対
する高い特異性が特徴である。すなわち、インスリンの
単離されたB鎖においては、クロストリパインはArg
−Gly結合をLys−Ala結合の場合の500倍以
上の速度で切断し、またグルカゴンにおいてはそのAr
g−Arg、Arg−AlaおよびLys−Tyrのみ
が切断される。これらの3つの結合の加水分解の相対的
初期速度は1.1/7および1/300である(Laboues
se, B.:Bull. Soc. Chim. Biol., 42:1293,1
960)。驚くべきことに、クロストリパインはプレプ
ロインスリンにおけるアルギニンの後のC末端の特異的
切断をもたらし、B鎖に存在するアルギニン(B22)
の後のアミノ酸の切断は無視できる程度であることを発
見し、本発明は完成された。
数であり、R2は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または2〜30個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、R3はヒドロキシル基、アミノ
酸または2〜10個のアミノ酸を有するペプチドであ
り、XはL−アルギニンまたは2〜45個のアミノ酸を
有しC末端およびN末端にL−アルギニン残基をもつペ
プチドであり、Yは遺伝子でコードできるアミノ酸であ
り、Zは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、A1〜
A20またはB2〜B29は、天然のまたは1個もしく
は2個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもし
くは動物インスリンのアミノ酸配列である)のプレプロ
インスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、
プレプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水
分解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼBにより
相当するインスリンに変換する方法に関する。
そのアミノ酸鎖のN末端から指示される。プロテアーゼ
はペプチドおよび蛋白質のアミノ酸の間のペプチド結合
を加水分解する。クロストリパインはL−アルギニン含
有ペプチドまたは蛋白質をアルギニンの後で特異的に加
水分解する。プレプロインスリンに対するこの加水分解
で形成される生成物はC末端アルギニン残基を有するイ
ンスリン誘導体もしくはポリペプチド、またはアミノ酸
である。
y、Ala、Ser、Thr、Val、Leu、Il
e、Asp、Asn、Glu、Gln、Cys、Me
t、Tyr、Phe、Pro、Hyp、Trp、Ar
g、Lys、Hyl、Orn、CitまたはHisであ
る。
れる例は、Gly、Ala、Ser、Thr、Val、
Leu、Ile、Asp、Asn、Glu、Gln、C
ys、Met、Arg、Lys、His、Tyr、Ph
e、Trp、Proまたはセレノシステインである。
中、R1はPheであり、R2は水素、天然アミノ酸また
は2〜30個の天然アミノ酸を有し末端にC末端L−ア
ルギニンをもつペプチドであり、R3はヒドロキシル
基、天然アミノ酸または2〜10個の天然アミノ酸をも
つペプチドであり、XはL−アルギニンまたはヒトもし
くは動物のプロインスリンのC鎖であり、YはThr、
AlaまたはSerからなる群よりのアミノ酸であり、
ZはAsn、Gln、Asp、Glu、Gly、Se
r、Thr、AlaまたはMetからなる群よりのアミ
ノ酸であり、A1〜A20またはB2〜B29はヒトま
たは動物のインスリンアミノ酸配列のプレプロインスリ
ンである。
は、式中、R1はPheであり、R2は水素または2〜3
0個の天然アミノ酸を有し末端にC末端L−アルギニン
をもつペプチドであり、R3はヒドロキシル基、天然ア
ミノ酸または2〜10個の天然アミノ酸をもつペプチド
であり、XはL−アルギニンまたはヒト、ブタもしくは
ウシのプロインスリンのC鎖であり、YはThrであ
り、ZはAsnであり、A1〜A20またはB2〜B2
9はヒト、ブタまたはウシのインスリンのアミノ酸配列
のプレプロインスリンである。
ツ特許出願P39 19 852およびP40 12 81
8.0に提案されているインスリンである。たとえば、
以下のアミノ酸配列: NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-COOH をもつInsuArgである。
8)はクロストリジウム属(Clostridium)からの細胞
外チオールプロテアーゼである。この酵素はヘテロダイ
マーで、他の既知のチオールプロテアーゼの何れともホ
モロジーを示さない。この酵素はArg−XXX結合、
特にArg−Proに対してきわめて高い特異性を有す
る。その特性は、分子量30,000〜80,000、等
電点pH4.8〜4.9である。アクティベーターの例に
はシステイン、メルカプトエタノール、ジチオスレイト
ールまたはカルシウムイオンがある。
L−リジン、クロロメチルケトン、過酸化水素、EDT
A、Co2+、Cu2+もしくはCd2+イオンまたはクエン
酸塩の存在下に阻害される。
よって製造される。この方法ではクロストリジウムを栄
養培地中にクロストリパインが蓄積するまで培養する。
適当な例としては、Clostridium histolyticum、とくに
Clostridium histolyticumDSM 627がある。この
微生物の突然変異株および変異株も、それらがクロスト
リパインを合成する限り適当である。
で、たとえば、酵素の不存在下にまたは必要に応じて窒
素、不活性気体または他の酵素以外の気体を導入しファ
ーメンター中で、非撹拌下の深部培養で行われる。発酵
は約10〜45℃、好ましくは約25〜40℃、とくに
30〜38℃の範囲の温度で行われる。発酵はpH5〜
8.5、好ましくは5.5〜8の範囲で起こる。これらの
条件下では、一般的に培養ブロスは1〜3日後に検知可
能な酵素の蓄積を示すようになる。クロストリパインの
合成は後対数期に始まり、成長の静止期にその最高に到
達する。酵素の産生は活性検定(Mitchell, W.:Meth.
of Enzym. 47巻,165〜170頁,1977)を用
いて追跡することができる。
溶液は0.2〜6%、好ましくは0.5〜3%の有機栄養
化合物、および無機塩を含有する。適当な有機栄養化合
物は、アミノ酸、ペプトン、同じく肉エキス、たとえば
トーモロコシ、小麦、インゲン豆、大豆もしくは綿の粉
砕種子、アルコール製造時の蒸留残留物、肉ミールまた
は酵母エキスである。栄養溶液に添加できる無機塩の例
には、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属、鉄、亜
鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン
酸塩、さらにアンモニウム塩および硝酸塩がある。
が、これらの条件は本技術分野の熟練者には既知である
かまたは予備試験によって容易に確立することができ
る。クロストリパインは古典的な方法、たとえば硫酸ア
ンモニウム沈殿、イオン交換またはゲル透過クロマトグ
ラフィーによって精製できる。この酵素は慣用方法によ
ってカップリングさせることができる(Colowick & Ka
plan:Meth. Enzymol., XLIV巻)。
全細胞、および同様に担体に結合させることもできる単
離酵素生成物の両者を使用することが可能である。
インによる切断は水性メジウム中で行われるが、これに
は水混和性の有機構成分たとえばアルコール、ケトン、
尿素またはジメチルホルムアミドを混合してもよい。と
くに、反応時のpHのコントロールを改善するため、反
応混合物に適当な無機または有機緩衝剤たとえばリン酸
塩、トリス、グリシンHEPES等を加えることもでき
る。切断時のプレプロインスリンの濃度は、たとえば
0.01mg/ml〜100mg/ml、好ましくは0.1mg/ml
〜10mg/mlとする。プレプロインスリンとクロストリ
パインの割合は〔mg対単位(U)〕1:0.01〜1:
1,000、好ましくは1:0.1〜1:50とする。
ることができる。好ましい温度範囲は0℃〜+80℃で
あり、+20℃〜+40℃の温度がとくに好ましい。
させることができ、pH6〜pH9の範囲がとくに好ま
しい。
換するのに要する時間は、反応条件によって広い限界内
を変動させることができる。たとえばそれは15分〜4
8時間であるが、1時間〜6時間の反応時間が好まし
い。
ンの存在下に活性化される。この目的に適当なメルカプ
タンは、原理的にはSH基を含むすべての化合物である
が、DTT、DTE、メルカプトエタノール、チオグリ
コール酸またはシステインの使用が好ましい。メルカプ
タンの濃度は広い範囲内で変動させることができるが、
0.1mM〜100mMの濃度が好ましい。活性化緩衝液に
はまた、Ca2+イオン、好ましくはCaCl2を含有さ
せる。活性化はpH4〜pH12、好ましくはpH6〜
pH8で行われ、pH7〜pH8の範囲がとくに好まし
い。適当な緩衝物質はたとえば、トリス、HEPES、
グリシン等であり、pHの維持のために添加することが
できる。活性化温度は0℃〜60℃とすることができ
る。0℃〜10℃の範囲が好ましく、0℃〜5℃がとく
に好ましい。この方法で活性化された酵素はそのまま使
用してもよく、また適宜、UltrogelR AcA 202上
クロマトグラフィーにより活性化緩衝剤を除去して使用
してもよい。
切断では、インスリンのC末端にアルギニン残基をもつ
インスリン誘導体と、切断された相当するアミノ酸およ
び/またはプレペプチドを生成する。このインスリン誘
導体は、所望により、カルボキシペプチダーゼBで相当
するインスリンに変換できる。これは、クロストリパイ
ンと同時に同一の反応混合物中で行うこともまた上述の
反応条件下に引き続いて行うこともできるが、この場
合、所望により、カルボキシペプチダーゼB処理の前
に、それ自体公知の方法で、たとえばクロマトグラフィ
ーもしくは結晶化を用いて、インスリン誘導体を単離す
ることもできる。カルボキシペプチダーゼBは溶解させ
た型または固定化した型で使用できる。カルボキシペプ
チダーゼBとインスリン誘導体の割合(重量対重量)
は、約1:10〜1:5,000、好ましくは約1:5
00〜1:3,500、とくに好ましくは約1:1,00
0〜1:3,000である。
インの割合(重量対重量)は約1:1〜10:1、好ま
しくは2:1〜5:1である。
シペプチダーゼB切断の反応生成物は、たとえば、pH
の低下による沈殿析出および/または既知方法のカラム
クロマトグラフィーを用いる精製に付すことができる。
得られたインスリンは、慣用の表示に処方化して、糖尿
病治療用の医薬として使用できる。
記述する。特に指示のない限り、百分率のデータは重量
に関するものである。
の栄養溶液中で培養する。 カゼインペプトン 3% 肉エキス 3% 酵母エキス 0.5% システイン 0.05% KH2PO4 0.15% pH7.2
中嫌気的条件下、37℃で約2日間行う。微生物株は5
0%グリセロールを含有する上述の栄養溶液中に−20
℃で維持する。発酵槽を1%前培養で接種する。容量1
0lで栄養溶液8lを加えた発酵槽に接種を行う。培養
は、窒素を通じながら、33℃で一定のpH7.0にお
いて24時間実施する。培養濾液中の酵素活性を測定す
ると、20,000 U/lであった(Mitchell, W.:Me
th. of Enzym., 47巻,165〜170頁,197
7)。
よる細胞の除去、孔径0.22μmのフィルターを通し
た濾過による滅菌、ついで濾液への60%氷冷(−20
℃)メタノールの添加によって行った。次に溶液を−2
0℃に24時間保持し、ついで遠心分離した(8,00
0g)。ペレットを滅菌二重蒸留水に溶解し、遠心分離
した(12,000g)。ペレット中の酵素活性の測定
値は300 U/ml、200 U/mg蛋白質であった。収
率は発酵槽中の活性の測定値の75%であった。
地は次の通りとし、 プロテアーゼペプトン(Difco) 5% システイン 0.05% K2HPO4 0.15% pH7.2 2%前培養で接種した。培養濾液中のクロストリパイン
活性は45,000 U/mlであった。
m膜(Filtron,オメガ膜)接線流濾過、および溶解し
たクロストリパインを濃縮するための10KD膜(Filtro
n,オメガ膜)接線流濾過によって実施した。濃縮ファ
クターは20とした。濃縮液を次に脱塩し、DEAE−
セルロース上クロマトグラフィーに付した。クロストリ
パイン活性1,000 U/ml;収率85%。酵素プレパ
レーションは使用時まで−20℃に保存した。
U/mg,実施例1より) 活性化緩衝液1μl(250mM DTT,125mM Ca
Cl2) ─混合物中含量 DTT 5mM CaCl2 2.5mM ─氷上で2時間インキュベーション ─切断反応用には酵素を25mM トリス/HCl緩衝液
pH7.8で1:40に希釈する。
離させるためのクロストリパイン切断混合物 100μl InsuArg(1mg/ml) 20μl KCl(1M) 5μl トリス/HCl(1M,pH7.8) 55μl 水 20μl クロストリパイン(1:40希釈) ─混合物中含量 InsuArg 0.5mg/ml クロストリパイン 2.5 U/ml DTT 12.5μM トリス/HCl 25mM KCl 100mM CaCl2 6μM ─28℃で1〜2時間インキュベーション、反応はHP
LCによって容易にチェックできる。ついで反応はトシ
ル−L−リジンクロロメチルケトン(TLCK)で停止
させる。 ─1μlのTLCK(15mM)の添加により反応を停
止。 ─4℃で保存 ─結果:ヒトインスリン−Arg。HPLCで検出可能
なヒトインスリン(de B30)は形成しない。
キシペプチダーゼB切断混合物 クロストリパイン切断混合物200μl カルボキシペプチダーゼB(1:100希釈)10μl ─混合物中のカルボキシペプチダーゼ含量:2.5μg
/ml ─28℃で2〜4時間インキュベーション、反応はHP
LCで容易にチェックできる。 ─反応のためには、カルボキシペプチダーゼB(759
U/ml,150 U/mg,ブタ膵臓より)は25mM ト
リス/HCl緩衝液pH7.8で1:1,000に希釈す
る。 ─結果:ヒトインスリン。HPLCで検出可能なインス
リン(de B30)は形成しない。
H2SO4でpH4に調整、25〜50%アセトニトリル
勾配)またはC8カラム(0.1%TFA,20%〜5
0%アセトニトリル勾配)を用いてチェックした。
5.7mg 1Mメルカプトエタノール315μl 1Mアスコルビン酸105μl 20mMグリシン緩衝液pH10.7,100μl フォールディングは冷室中4℃で一夜行い、フォールデ
ィング収量は0.152mg/mlであった。pH5.0にお
けるpH沈殿によって不純物を除去したのち、トリスを
最終濃度50mMになるように添加し、pHをHClで
7.8に調整した。酵素溶液30μlを加えた。切断は
30℃で行い、HPLCで追跡した。 結果:上述のプレプロインスリンはヒトインスリン−A
rgに切断できる。インスリン(de B30)の形成
は微小である。
Claims (9)
- 【請求項1】 式I 【化1】 (式中、R1はn個のアミノ酸で、nは0または1の整
数であり、R2は水素、化学的もしくは酵素的に切断除
去できるアミノ酸、または2〜30個のアミノ酸残基を
有するペプチドであり、R3はヒドロキシル基、アミノ
酸または2〜10個のアミノ酸を有するペプチドであ
り、XはL−アルギニンまたは2〜45個のアミノ酸を
有しC末端およびN末端にL−アルギニン残基をもつペ
プチドであり、Yは遺伝子でコードできるアミノ酸であ
り、Zは遺伝子でコードできるアミノ酸であり、A1〜
A20またはB2〜B29は、天然のまたは1個もしく
は2個以上のアミノ酸残基を置換して修飾したヒトもし
くは動物インスリンのアミノ酸配列である)のプレプロ
インスリンのアミノ酸鎖を加水分解する方法において、
プレプロインスリンをクロストリパインの存在下に加水
分解し、必要に応じてカルボキシペプチダーゼBにより
相当するインスリンに変換する方法。 - 【請求項2】 式Iにおいて、R1はPheであり、R2
は水素、天然アミノ酸または2〜30個の天然アミノ酸
を有し末端にC末端L−アルギニンをもつペプチドであ
り、R3はヒドロキシル基、天然アミノ酸または2〜1
0個の天然アミノ酸をもつペプチドであり、XはL−ア
ルギニンまたはヒトもしくは動物のプロインスリンのC
鎖であり、YはThr、AlaまたはSerからなる群
よりのアミノ酸であり、ZはAsn、Gln、Asp、
Glu、Gly、Ser、Thr、AlaまたはMet
からなる群よりのアミノ酸であり、A1〜A20または
B2〜B29はヒトまたは動物のインスリンのアミノ酸
配列であるプレプロインスリンを使用する請求項1記載
の方法。 - 【請求項3】 式Iにおいて、R1はPheであり、R2
は水素または2〜3個の天然アミノ酸を有し末端にC末
端L−アルギニンをもつペプチドであり、R3はヒドロ
キシル基、天然アミノ酸または2〜10個の天然アミノ
酸をもつペプチドであり、XはL−アルギニンまたはヒ
ト、ブタもしくはウシプロインスリンのC鎖であり、Y
はThrであり、ZはAsnであり、A1〜A20また
はB2〜B29はヒト、ブタまたはウシインスリンのア
ミノ酸配列であるプレプロインスリンを使用する請求項
1または2記載の方法。 - 【請求項4】 pH4〜12、好ましくは6〜9で実施
する請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 式Iのプレプロインスリンの濃度は0.
01mg/ml〜100mg/ml、好ましくは0.1mg/ml〜
10mg/mlとする請求項1〜4のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項6】 プレプロインスリン/クロストリパイン
の比(mg対単位)は1:0.01〜1:1,000、好ま
しくは1:0.1〜1:50とする請求項1〜5のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項7】 反応温度は0℃〜+80℃、好ましくは
+20℃〜+40℃とする請求項1〜6のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項8】 カルボキシペプチダーゼBはクロストリ
パインと同時に存在させるかまたはクロストリパインに
よる切断後に使用する請求項1〜7のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項9】 クロストリパインおよび/またはカルボ
キシペプチダーゼBは固定化型として存在させる請求項
1〜8のいずれかに記載の方法。
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