CZ286950B6 - Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase, process of its preparation and use - Google Patents
Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase, process of its preparation and use Download PDFInfo
- Publication number
- CZ286950B6 CZ286950B6 CZ19932033A CZ203393A CZ286950B6 CZ 286950 B6 CZ286950 B6 CZ 286950B6 CZ 19932033 A CZ19932033 A CZ 19932033A CZ 203393 A CZ203393 A CZ 203393A CZ 286950 B6 CZ286950 B6 CZ 286950B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- ddap
- met
- arg
- dap
- enzyme
- Prior art date
Links
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 5
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 4
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 title abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 claims abstract description 20
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 25
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 abstract description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 30
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 22
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 8
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 7
- UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N Met-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N UASDAHIAHBRZQV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 7
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000049703 Dictyostelium discoideum AX3 Species 0.000 description 3
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N Met-Asp Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O QTZXSYBVOSXBEJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 101000886298 Pseudoxanthomonas mexicana Dipeptidyl aminopeptidase 4 Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000212 dipeptidyl peptidase II Proteins 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 3
- UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L potassium tetrathionate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O UVTKHPSJNFFIDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- JNTASUHAFOHMQK-ZDUSSCGKSA-N (2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)-n-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)pentanamide Chemical compound C1=C(NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C JNTASUHAFOHMQK-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N (2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-n-(4-nitrophenyl)-3-phenylpropanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 KNDZCZRECXTRHP-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- NISFAIXCOKCVHV-ROUUACIJSA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(naphthalen-2-ylamino)-1-oxopentan-2-yl]pentanamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)=CC=C21 NISFAIXCOKCVHV-ROUUACIJSA-N 0.000 description 2
- 241000224489 Amoeba Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 2-naphthylamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC=C21 JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- -1 DAP-III Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000224421 Heterolobosea Species 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical group NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N Phe-Pro Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N1[C@@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 WEQJQNWXCSUVMA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003001 amoeba Anatomy 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000001874 anterior cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000003816 axenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L tetrathionate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HPQYKCJIWQFJMS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11005—Prolyl aminopeptidase (3.4.11.5)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Escalators And Moving Walkways (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Polyamides (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
- Noodles (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Dictyostelium dipeptidylaminopeptidáza, způsob její přípravy a její použití
Oblast techniky
Vynález se týká Dictyostelium dipeptidylaminopeptidázy, způsobu její přípravy a jejího použití. Dipeptidylaminopeptidáza, izolovaná ze slizovky Dictyostelium discoideum je užitečná při zpracování rekombinantně produkovaných biologických sloučenin.
Dosavadní stav techniky
Dictyostelium discoideum je primitivní eukaryotický mikroorganismus běžně nazývaný slizovka nebo lépe buněčná slizovka. Označení je odvozeno od dvou extrémních stavů mikroorganismu z makroskopické perspektivy. Při skutečném růstu roste Dictyostelium discoideum jako jednobuněčná amoeba. V tomto stupni nemá žádnou buněčnou stěnu a její vzhled proto připomíná tenký film (nebo sliz). Po vyhladovění na pevném médiu se nezávislé buňky agregují za vytvoření kolonie. Tato kolonie má charakter multibuněčného organismu tím, že migruje ve formě označované jako slimák, a pak se diferencuje s pozdějšími buňkami slizu tvořícího nohu, přičemž přední buňky vytvářejí nožku a střední buňky vytvářejí plodnici. Organismus se v přírodě vyskytuje na povrchu půdy a hnoje. Divoký typ amoeby získává živiny výlučně vstřebáváním (fagocytosou) celou baktérií; proto se někdy označuje jako masožravý. Byly isolovány axenické mutanty Dictyostelium discoideum, které jsou schopny růstu bez současné kultivace „potravinových“ baktérií, a které proto mohou růst na rozpustném prostředí. Vynález se především týká novédipeptidylaminopeptidázy, izolované z Dictyostelium discoideum.
Dipeptidylaminopeptidázy (DAP) jsou enzymy, které hydro lyžují předposlední aminokoncovou peptidovou vazbu za uvolňování dipeptidu z neblokovaného aminozakončení peptidů a bílkovin. V současně době jsou známy čtyři dipeptidylaminopeptidázy (označované jako DAP-I, DAP-I, DAP-II, DAP-III, DAP-IV), které se rozlišují na základě svých fyzikálních charakteristik a míry, kterou katalyzují štěpení s různými peptidovými sekvencemi a aminozakončenin,. Dipeptidylaminopeptidáza DAP-I je poměrně nespecifická DAP, která katalyzuje uvolňování mnohých dipeptidových kombinací z neblokovaného aminozakončení peptidů a bílkovin. Dipeptidylaminopeptidáza DAP-I vykazuje malou aktivitu nebo nevykazuje žádnou aktivitu, když je vznikajícím dipeptidem X-Pro, Arg-X nebo Lys-X (kde X znamená aminokyselinu). Dipeptidylaminopeptidáza DAP-II vykazuje preferenci pro aminozakončené dipeptidové sekvence, které začínají Arg-X nebo Lys-X a v menší míře X-Pro. DAP-II vykazuje výrazně nižší míru štěpení proti většině jiných dipeptidových kombinací. Zdá se, že dipeptidylaminopeptidáza DAP-III má sklon k aminokyselinovému zakončení dipeptidových sekvencí formy Arg-Arg a Lys-Lys. Dipeptidylaminopeptidáza DAP-IV vykazuje nejvyšší stupeň hydrolytické aktivity se zřetelem na dipeptidové sekvence formy X-Pro. Dipeptidylaminopeptidázové (DAP) enzymy, zejména DAP-I a DAP-IV jsou užitečné při zpracování bílkovin. Vynález se týká nových DAP z Dictyostelium discoideum, které jsou užitečné při zpracování rekombinantních bílkovin se stejně číslovaným aminokyselinovým Nkoncovým prodloužením.
Podstata vynálezu
Podstatou předloženého vynálezu je dipeptidylaminopeptidáza, enzym dDAP, o molekulové hmotnosti 225 000, s optimální hodnotou pH 3,5; izolovaná z Dictyostelium discoideum.
Předložený vynález se tedy týká nové dipeptidylaminopeptidázy izolované z buněčné slizovky Dictyostelium discoideum. Nový dipeptidylaminopeptidázový enzym dDAP vykazuje účinnost,
-1 CZ 286950 B6 která je poněkud podobná účinnost DAP-I a DAP-III, je však vysoce odlišná od těchto enzymů svými fyzikálními a jinými enzymatickými charakteristikami. Vynález se týká způsobu použití DAP enzymu k odstraňování dipeptidů zN-zakončení rekombinantně produkovaného prekurzoru bílkovin nebo peptidů. Enzym dDAP podle předloženého vynálezu se může používat pro odstraňování jednotlivých dipeptidů zN-zakončení polypeptidů a také se ho může používat k sekvenčnímu odstraňování více než jednoho dipeptidů z N-zakončení prekurzorových polypeptidů. Kromě toho se vynález týká způsobů izolace a čištění dDAP enzymu z kultury dictyostelium discoideum.
Zde používané symboly a zkratky mají následující významy:
dDAP - dipeptidylaminopeptidáza, izolovaná z Dictyostelium discoideum, která vykazuje optimum hodnoty pH přibližně 3,5 s GFpNA jakožto substrátem a má nativní molekulovou hmotnost přibližně 225 000 měřeno analytickým ultraodstřeďováním a subjednotkovou molekulovou hmotnost přibližně 66 000 měřeno SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou.
GFpNA - Gly-Phe p-nitroanilid.
Prekurzorový polypeptid - rekombinantně produkovaný polypeptid, který obsahuje stejný počet aminokyselin za aminovým zakončením žádaného polypeptidů.
Zpracovaný polypeptid - polypeptid, přičemž N-koncový dipeptid nebo dipeptidy jsou odstraněny k získání žádaného polypeptidů.
TTBNA - Arg-Arg-(3-naftylamid.
Všechny používané zkratky aminokyselin jsou podle amerického úřadu pro patenty a obchodní známky, uvedené v 37 C.F.R- 1.822 (b) (2) (1990).
Vynález se týká dDAP, dipeptidylaminopeptidázy izolované z buněčné slizovky Dictyostelium discoideum. Enzym dDAP má sklon štěpit neblokované aminokoncové sekvence tradičně spojené jak s DAP-I, tak DAP-III, avšak pDAP je vysoce odlišný od těchto obou enzymů svými fyzikálními a jinými enzymatickými vlastnostmi. dDAP vykazuje optimum hodnoty pH přibližně 3,5 s GFpNA jakožto substrátem a má nativní molekulovou hmotnost přibližně 225000 a subjednotkovou molekulovou hmotnost přibližně 66000. Lecitinová afmitní chromatografie dokládá, že dDAP enzym je pravděpodobně glykoprotein. dDAp má schopnost odstraňovat dipeptidy ze syntetických substrátů, Gly-Phe paranitroanilidu (GFpNA) a Arg-Arg-βnaftylamidu (RRBNA) jakož také z Četných jiných syntetických a rekombinantně produkovaných dipeptidů.
Známé enzymy dipeptidylaminopeptidázy DAP-I byly izolovány z nejrůznějších živočišných a rostlinných tkání. Nový enzym dDAP se izoluje z kultivační půdy Dictyostelium discoideum. Enzymy DAP-I vyžadují pro svoji aktivitu halogenid a redukční činidla. Redukční činidla, například jodacetát, který modifikuje cysteinové sulfhydryly, inakativuje DAP-I enzymy. Enzym DAP-I má optimální účinnost při hodnotě pH 5 až 6. Na rozdíl od toho enzym dDAP má optimum hodnoty pH přibližně 3,5 s Gly-Phe-pNA nebo s Gly-Arg-pNA jakožto se substráty a vykazuje význačnou účinnost se zřetelem na peptidy a bílkoviny při hodnotě pH 3,5. Enzym dDAP je prost významné účinnosti při hodnotě pH nad 6. Enzym dDAP nevyžaduje žádné přidávání redukčních činidel a je plně aktivní v přítomnosti cysteinových modifikátorů, jako je jodacetát nebo tetrathionát. Enzym dDAP je podobný hovězímu DAP-I v tom, že je neschopen štěpit peptidy s blokovaným N-zakončením, avšak dDAP na rozdíl od hovězího DAP-I je účinný se zřetelem na substráty, které mají oxidovaný methionin na N-zakončení. Hovězí DAP-I je
-2CZ 286950 B6 neschopen štěpit substráty s oxidovanými methioniny na N-zakončení. Kromě toho na rozdíl od hovězího DAP-I je enzym, dDAP schopen snadno štěpit Arg-Arg-P-naftylamidový substrát. Tato schopnost štěpit aminem zakončený Arg-Arg-dipeptidyl obsahující substrát je mnohem podrobnější aktivitě DAP-III enzymů ze savčích a mikrobiálních zdrojů, jakkoliv DAP-III enzym má optimum hodnoty pH v alkalické oblasti, zatímco dDAP působí nejúčinněji v kyselých oblastech. Subjednotková molekulová hmotnost, stanovená SDS PAGE, je přibližně 66 000 zatímco subjednotková molekulová hmotnost savčího DAP-I je přibližně 22 000.
Enzym dDAP podle vynálezu je nej užitečnější pro převádění prekurzorových polypeptidů na zpracované peptidy. Například pokud je lidský růstový hormon žádaným polypeptidem, vytlačuje se pouze prekurzor lidského růstového hormonu (v jednom případě Met-Asp-lidský růstový hormon), pak se tento prekurzor podrobuje působení sDAP k uvolnění dipeptidu Met-Asp a žádaného zpracovaného polypeptidů, lidského růstového hormonu. Zpracovávaným peptidem nemusí být „přirozený“ polypeptid divokého typu, jak je často žádoucí pro produkci analogů nebo meziproduktů. Vynález se také týká způsobu zpracování prekurzorového polypeptidů. Jakožto jiné prekurzorové peptidy, které se mohou zpracovávat enzymem dDAP, se uvádějí Met-Arg-hGH, Met-Tyr-proinzulin, Met-Arg-proinzulin, Met-Arg-proinzulinový analog (B28 Lys, B29 Pro), Met-Tyr-proinzulinový analog (B28 Lys, B29 Pro), Met-Arg-proinzulinový analog (BIO Asp, des B28-30), Met—Tyr-proinzulinový analog (BIO Asp, des B28-30). Inzulínový analog (B28 Lys, B29 Pro) je popsán v evropské přihlášce vynálezu číslo 90301224.3, zatím co inzulínový analog (BIO Asp, des B28-30) je popsán v evropské přihlášce vynálezu číslo 92305678.2. Kromě toho se může enzym dDAP používat k sekvenciálnímu odstraňování více než jedné sady dipeptidů z N-zakončení prekurzorových polypeptidů. Zpracování Met-Arg-proinzulinu a Met-Arg-proinzulinových analogů popsali Becker a kol. v americkém patentovém spise číslo 5 126249 (30. 6. 1992).
Použití enzymu dDAP k odstranění dipeptidů z prekurzorových bílkovin je výhodné v tom, že dDAP má optimum při hodnotě pH 3,5, která umožňuje provádění reakce v kyselé oblasti, kdy jsou četné prekurzorové polypeptidy rozpustné. Kromě toho konverze některých prekurzorových polypeptidů při neutrální hodnotě pH nebo větší může vést k vyšší míře meziřetězcových disulfidických dimerů nebo polymerů substrátu s doprovodnou ztrátou výtěžku produktu. Tento jev, známý jakožto disulfídické „scrambling“ je obzvláště nepříjemné, když se používá hovězího DAP-I, jelikož DAP-I vyžaduje přidávání redukčních činidel, například β-merkaptoethanolu nebo cysteinu, do reakční směsi. V kyselé oblasti hodnot pH dochází rovněž k oxidaci methioninových zbytků nižší měrou. Kromě toho je ekonomicky snadnější používat enzymu z fermentační kultury Dictyostelium discoideum, než se spoléhat na provozní produkci enzymů z živočišných zdrojů, jelikož fermentační technologie umožňuje větší konsistenci produktu a reprodukovatelnost enzymu. Vyloučení enzymů na živočišné bázi představuje konstantní zdroj vysoce čistého základního materiálu. Fermentace Dictyostelium discoideum Ax3 (ATCC 28368) následovaná odstředěním, ionexovou chromatografii, hydrofóbní interakční chromatografii a chromatografii „size exclusion chromatography“ vede k vysoce vyčištěnému roztoku dDAP enzymu, který se může ukládat nebo bezprostředně používat pro zpracování prekurzorových polypeptidů. Vynález se rovněž týká izolace a čištění dDAP z fermentační půdy.
Konverze prekurzorových polypeptidů na zpracované polypeptidy se může provádět v širokém rozmezí teplot, hodnot pH a v širokém rozmezí doby. Reakce se zpravidla provádí ve vodném prostředí vhodně pufrovaném k získání a k udržení hodnoty pH přibližně 2,5 až přibližně 5,5. S výhodou je hodnota pH prostředí přibližně 3,0 až přibližně 4,5 a především přibližně 3,0 až přibližně 3,5. Optimální hodnota pH se může mírně měnit podle substrátu. Například zpracování Gly-Phe-pNA a Gly-Arg-pNA probíhá nejrychleji při hodnotě pH přibližně 3,5, zatímco rychlost zpracování Met-Asp-hGH probíhá ochotněji při hodnotě pH přibližně 3,0 až přibližně 3,5. Zpracování Arg-Arg-βρΝΑ probíhá nejrychleji při hodnotě pH přibližně 4,5. Pracovník v oboru snadno stanoví optimální hodnotu pH pro každou specifickou reakci na základě
-3CZ 286950 B6 charakteristik, jako je stabilita a rozpustnost daného prekurzorového polypeptidu a enzymu. V některých případech se může použít solubilizačního činidla, jako je například močovina, dodecylsulfát sodný a guanidin.
Reakce zpracování se může nechat probíhat po jakoukoliv danou dobu od několika sekund po několik dnů. S výhodou se reakce nechává probíhat po dobu přibližně 1 minuty až přibližně 24 hodin a především po dobu přibližně 1 minuty až přibližně 8 hodin. Pracovníkovi v oboru je zřejmé, že se reakce snadno nastaví ke splnění všech potřebných parametrů pro jakýkoliv žádaný prekurzorový polypeptid nebo zpracovaný polypeptid.
Teplota při zpracování se může také nastavit podle jakéhokoliv substrátu. S výhodou se reakce nechá probíhat při teplotě přibližně 15 až přibližně 45 °C. Zvláště je teplota reakční směsi přibližně 20 až přibližně 37 °C a především je teplota reakční směsi přibližně 25 až přibližně 37 °V. Opět pracovník v oboru snadno určí reakční parametry, jako je doba, teplota a hodnota pH, které se mohou měnit podle potřeby v souhlase se žádaným prekurzorem nebo zpracovávaným polypeptidem.
Při reakcích se může použít nejrůznějších pufrů, přičemž je v tomto případě jediným požadavkem udržení hodnoty pH v žádaném rozmezí. Jakožto typické příklady pufrů se uvádějí příkladně fosfát sodný, acetát sodný, citrát sodný a glycin. Jakožto výhodné pufry se uvádějí acetát sodný, fosfát sodný a glycin.
Prekurzorové polypeptidy pro použití podle vynálezu se obecně připravují rekombinantní DNA technologií. Při jejich přípravě se připravuje nukleotidová sekvence kódující pro žádaný prekurzorový polypeptid o sobě známými způsoby pro takové syntézy. Tyto způsoby obecně zahrnují přípravu oligonukleotidů kódujících jak pro fragmenty žádané kódující sekvence, tak pro jejich komplementární sekvence. Oligonukleotidy jsou určeny pro překrytí fragmentu kódující sekvence se dvěma fragmenty komplementární sekvence a naopak. Oligonukleotidy se párují a spojují za konečného vytvoření žádané genové sekvence.
Sekvence se včlení do klonovacího vektoru v místě, které umožňuje produkt, pro který kóduje, aby došlo k expresi. Vhodný klonovací vektor obsahuje alespoň část expresní řídicí sekvence.
Následující příklady vynález objasňují, nijak jej však neomezují.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Fermentace Dictyostelium discoideum
Lyofilizované kultury Dictyostelium discoideum Ax3, dodávané společností Američan Type Culture Collection, Rockville, Maryland pod objednacím číslem ATCC 28368, se nanesou v různé hustotě na agarové destičky (1,2% Difco Bacto Agar) obsahující pufrované prostředí kvasničný extrakt - pepton o složení (uváděném v g/1): Difco Yest Extract (kvasničný extrakt Difco) (7,15), Difco Bacto Pepton (14,3), dinatriumhydrogenfosfát (0,51) a kaliumdihydrogenfosfát (0,49), do kterého se přidá asepticky glukosa (10 g/1) po oddělené sterilizaci a s nastavenou hodnotou pH na 6,5 (± 0,1) hydroxidem sodným nebo kyselinou sírovou. Téhož prostředí (bez agaru) se používá pro růst kapalné kultury v objemech menších než přibližně jeden litr. Agarové destičky se inkubují po dobu 3 až 5 dní při teplotě 21 až 24 °C. Z destiček se sklidí spory, které se opatrují k předcházení snímání „potravinového bakteria“
-4CZ 286950 B6 lyofilizovaného s Ax3 kulturou, pak se naočkují do 3 ml pufrované peptonové půdy s kvasničným extraktem a inkubují se za mírného protřepávání při teplotě 21 až 24 °C. Pak se násobí buňky Dictyostelium discoideum sériovým přenosem postupně větších objemů pufrované půdy pepton - kvasničný extrakt. Každý sériový stupeň přenosu je za přibližně 10 až 25 násobného zředění a probíhá, když hustota buněk překročí přibližně 2 x 106/ml. Půdy se vždy inkubují při teplotě 21 až 24 °C za mírného míchání.
Míchané fermentace se zpravidla provádějí v podobném prostředí se sójovým peptonem (například Phytone Peptone nebo Marcor Soy Peptone) o koncentraci 2 až 14, g/1 místo peptonu Bacto Peptone v počátečním prostředí pepton - kvasničný extrakt. Sklízí se zpravidla zfermentorů s pracovním objemem 10 až 5000 litrů, vybaveném 1 až 3 turbinovými míchadly Rushton o počtu otáček 40 až 150/min. Pracuje se při teplotě 22 ± 1 °C za řízeného průtoku vzduchu 0,1 až 0,5 objemů vzduchu na objem kapalné půdy a za tlaku 20,7 až 34,4 kPa. Některé fermentace se provádějí při hodnotě pH 6,4 nastavené kyselinou sírovou a některé s rozpuštěným kyslíkem řízeným na 40 až 60 % řízením míchání a průtoku vzduchu. Dbá se toho, aby docházelo k minimálnímu střihu při manipulaci a fermentaci buněk, aby amoebv byly prosty stěn v průběhu růstu.
Obecně rostou míchané kultury Dictyostelium discoideum Ax3 za zdvojnásobení průběhu 12 až 36 hodin. Postupně se snižuje obsah rozpuštěného kyslíku (když tento obsah není řízen) a pak začne stoupat když přestane vzrůstat hustota buněk. Konečné hustoty buněk 3 x 106ml až 5 x 107 ml zřejmě omezují přenos kyslíku v takových fermentacích s nižšími hustotami buněk.
Občas se odebírají vzorky a analyzují se se zřetelem na hustotu buněk a na aktivitu GF-pNAse (příklad 3 níže). Používá se čítači komůrky Petroff-Hauser ke stanovení hustoty buněk nad přibližně 5 x 105/ml. Obecně GFpNA hydrolyzační aktivita vzrůstá v průběhu fermentace. Maximální dDAP aktivita se pozoruje za 2 až 4 dny po dosažení maximální hustoty buněk. Veškerá půda se ukládá při teplotě 4° nebo se zmrazí na teplotu -20 °C a pak se nechá roztát a analyticky se zjišťuje aktivita. Fermentace se sklízí ochlazením na méně než 20° a oddělením buněk za použití odstředivky s kontinuálním průtokem.
Příklad 2
Příprava dDAP
A. Odstraňování a koncentrace buněk
Počáteční oddělování dDAP od živného prostředí obsahujícího Dictyostelium discoideum zahrnuje oddělení buněk a odstředění. Oddělení buněk se provádí za použití odstředivky Western States centrifuge s kontinuálním průtokem. Živné prostředí, prosté buněk se zkoncentruje přibližně 20 x ultrafiltrací s tangenciálním průtokem za použití membrány o molekulové hmotnosti 50 000. Zbytek se vylije z ultrafiltrační jednotky a jednotka se promyje 50 mM tris pufrem o hodnotě pH 7 k získání další dDAP. Zbytek a promývací kapaliny se spojí k získání konečného koncentrátu, který se skladuje ve zmrazeném stavu při teplotě -20 °C po dobu několika měsíců před dalším zpracováním.
B. Čeření
Zmrazený konečný koncentrát se nechá roztát v průběhu 12 hodin při teplotě místnosti. Jakmile dojde k roztáni, čeří se konečný koncentrát před prvním stupněm sloupcové chromatografie. Čeření se dosahuje kombinací odstřeďování následovaného filtrací přes 5 mikrometrovou
-5CZ 286950 B6 membránu. Vyčeřený konečný koncentrát se nastavuje na hodnotu pH 7,0 a udržuje se na teplotě 4 až 10 °C po dobu méně než 12 hodin před anexovou chromatografií.
C. Anexová chromatografie
Prvním chromatografíckým stupněm dDAP čisticího postupu je anexová chromatografie za použití pryskyřice Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow (FFQ). Sloupec se vyváží 50 mM tris pufrem o hodnotě pH 7. Čeřený koncentrát, prostý buněk, se nanáší lineární průtokovou rychlostí 50 cm/h při poměru 60 litrů nekoncentrovaného fermentačního prostředí na litr pryskyřice. To znamená 60 g bílkoviny na litr pryskyřice (kvantitativní hodnocení bílkovin je založeno na zkoušce Pierce BCA Protein Assay proti standardu hovězího sériového albuminu). Přibližně 250 jednotek dDAP aktivity se nanáší na litr FFQ piyskyřice. Vodivost koncentrátu prostého buněk je přibližně 5 mMHOS na cm. Po ukončeném dávkování vzorku se FFQ pryskyřice promyje třemi objemy sloupce vyvažovacího pufru. dDAP aktivita se eluuje z pryskyřice za použití lineárního gradientu 0 až 1 m chloridu sodného, 50 mM tris za hodnoty pH 7,0 nanesených na 10 sloupcových objemů za průtokové rychlosti 50 cm/h. Velikost frakce je 0,1 objemů sloupce. Sloupec FFQ se dále eluuje třemi objemy sloupce 1,0 M chloridu sodného v 50 mM tris o hodnotě pH 7. Výtok se monitoruje podle vodivosti a absorbance při 280 nm a frakce se zkoušejí na dDAP aktivitu podle jejich schopnosti štěpit kolorimetrický substrát Gly-Phe para-nitroanilid (GFpNA) při hodnotě pH 3,5. Soubor hlavního proudu („the mainstream pool“) se připraví spojením frakcí obsahujících přibližně 90 % veškeré eluované dDAP aktivity. dDAP aktivita se eluuje jakožto jediný pík o objemu přibližně dvou objemů sloupce. Soubor hlavního proudu se okyselí na hodnotu pH 3,5 za použití 10% (objem/objem) kyseliny chlorovodíkové. FFQ okyselený soubor hlavního proudu se udržuje na teplotě 4 °C po dobu kratší než dvou dnů.
D. Hydrofóbní interakční chromatografie
FFQ okyselený soubor hlavního proudu se nejdříve čistí hydrofóbní interakční chromatografií (HIC) na pryskyřici Pharmacia Phenyl Sepharose Fast flow. Sloupec má třetinu objemu anexového sloupce. Přibližně 650 jednotek aktivity se nanáší na litr pryskyřice a bílkovinovou dávkou je 4 g na litr pryskyřice (1 absorbační jednotka při 280 nm je rovna 1 mg/ml bílkoviny). FFQ okyselený soubor hlavního proudu se připravuje pro nanesení na HIC sloupce přidáním 140 g na litr síranu amonného. Hodnota pH dávky se nastaví na 3,5 a konečná vodivost je přibližně 90 mMHOS na cm. Sloupec HIC se vyváží 50 mM citrátu o hodnotě pH 3,5, obsahujícího alespoň 140 g na litr síranu amonného. Dávka se nanáší lineární rychlostí 40 cm/h a pryskyřice se promývá alespoň třemi objemy sloupce vyváženého pufru. Eluuje se dDAP aktivita z pryskyřice za použití lineárního gradientu 140 g na litr až 0 g na litr síranu amonného v 50 mM citrátu za hodnoty pH 3,5 při nanášení přes 10 objemů sloupce rychlostí 40 cm/h. Sloupec se dále eluuje alespoň třemi objemy sloupce 50 mM citrátu o hodnotě pH 3,5. Velikost frakce je 0,1 objemu sloupce. Výtok se monitoruje vodivostí a absorbancí při 280 nm a frakce se zkoušejí na dDAP aktivitu podle své schopnosti štěpit GFpNA při hodnotě pH 3,5. Soubor hlavního proudu se připravuje spojením frakcí obsahujících přibližně 90 % veškeré dDAP eluované aktivity. DDAP aktivita se eluuje jakožto jeden pík o objemu přibližně dvou sloupců. Hodnota pH hlavního proudu se nastaví na 3,5 za použití 10% (objem/objem) kyseliny chlorovodíkové nebo 10% (hmotnost/hmotnost) roztoku hydroxidu sodného. HIC soubor hlavního proudu se udržuje na teplotě 4 °C po dobu kratší než jeden den před dalším zpracováním.
E. Chromatografie, která vylučuje velikost („size exclusion chromatography“) (SEC)
Hlavní proud z HIC se dále zpracovává chromatografií SEC na s-200 Sepharose HR. Sloupec má dvojnásobek objemu sloupce HIC a má vrstvu o výšce 78 cm. Hlavní proud z HIC se připravuje pro SEC zkoncentrováním hlavního proudu z HIC na ultrafiltrační jednotce za použití membrány o molekulové hmotnosti řezu 10 000. HIC hlavní proud se koncentruje na 2,5 % objemu SEC sloupce a zadržený podíl se z jednotky vylije. Ultrafiltrační jednotka se promyje objemem
-6CZ 286950 B6 mM citrátového pufru o hodnotě pH 3,5 rovné 2,5 % objemu SEC slupce. Zadržený podíl a promývací vody se spojí, čímž se získá konečný koncentrát a jeho hodnota pH se nastaví na 3,5 za použití 10% (objem/objem) kyseliny chlorovodíkové nebo 10% (hmotnost/hmotnost) roztoku hydroxidu sodného. Vodivost konečného koncentrátu je přibližně 30 mMHO na cm. SEC sloupec se vyváží 50 mM kyseliny octové, 20 mM chloridu sodného za hodnoty pH 3,5, přičemž vodivost je přibližně 2 mMHO na cm. Konečný koncentrát se nanáší na SEC sloupec za lineárního průtoku 15 cm/h a dDAP aktivita se eluuje nanášením jednoho objemu sloupce vyváženého pufru. Velikost frakce je 0,02 objemy sloupce. Výtok se monitoruje vodivostí a absorbancí při 280 nm a frakce se zkouší na dDAP aktivitu podle jejich schopností štěpit GFpNA při hodnotě pH 3,5. Soubor hlavního proudu se připravuje spojením frakcí, obsahujících přibližně 90 % celkové eluované dDAP aktivity. DDAP aktivita se eluuje jako jeden pík o objemu přibližně 0,08 objemů sloupce. Soubor hlavního proudu SEC se může udržovat na teplotě 4 °C po dobu několika měsíců.
Čištěním dDAP za použití kombinace anexové chromatografie, hydrofóbní interakční chromatografie a chromatografie, která vylučuje velikost se získá materiál, který migruje jakožto hlavní pás na SDS-PAGE. Pás migruje k poloze na gelovém ekvivalentu ke standardu molekulové hmotnosti hovězího sérového albuminu (66 000). Bílkovina se zabarvuje za použití ISS Pro-blue skvrny. Obrazec migrace není ovlivněn přítomností nebo nepřítomností 0,1 M DTT (plus 100 °C po dobu pěti minut) v průběhu přípravy vzorku. Subjednotková molekulová hmotnost DAP-I (hovězí zdroj) se stanovuje SDS-PAGE jakožto 22 000.
Příklad 3
Aktivita dDAP
1. Štěpení GF-pNA
Enzym dDAP se normálně monitoruje podle štěpení chromogenního substrátu Gly-Phe paranitroanilid (GF-pNA). Zpravidla se zkouška provádí zředěním enzymu 11 krát na 1,0 ml 4 mM GFpNA nastaveného na hodnotu pH 3,5. Rychlost štěpení GF dipeptidu se monitoruje při teplotě 37 °C měřením vzrůstu absorbance při 405 nm. Jedna jednotka aktivity vede k 0,90 OD změně za minutu za těchto podmínek. Stanovení jednotky za minutu je možné za předpokladu extinkčního koeficientu pro volnou pNA 9,9 mM-Ι cm-1 při 405 nm.
Inhibiční profil enzymu dDAP se zřetelem na substrát GFpNA se porovnává s hovězím DAP-I za použití jodacetamidu a tetrathionátu draselného, sulfhydrylových modifíkačních činidel známých k inhibici aktivity DAP-I. Vzorky dDAP nebo hovězího slezinového DAP-I se inkubují po dobu 15 minut při teplotě místnosti v konečných koncentracích 0, 0,5, 5,0 nebo 50 mM každého inhibitoru při hodnotě pH 7 ve 100 mM pufru Tris. Inkubované roztoky se pak zředí 21 krát použitím 4 mM GFpNA za hodnoty pH 3,5. Rychlost štěpení se monitoruje měřením vzrůstu absorbance při 405 nm při teplotě 37 °C. Rychlost DAP-I štěpení GFpNA se snižuje více než o 90 % při vystavení 5 mM jodacetamidu a z 95 % se inhibuje 5 mM tetrathionátem draselným. Není žádných známek významné inhibice dDAP při žádné z testovaných koncentrací jodacetamidu nebo tetrathionátu draselného.
Optima hodnoty pH pro GFpNA schopnost štěpení dDAP se stanovují nastavením pufru sestávajícího z 0,5 Tris, fosfátu a citrátu použitím 10% kyseliny chlorovodíkové nebo 10% roztoku hydroxidu sodného na hodnotu pH 3 až 8. Enzym dDAP se zředí 20 krát v pufru obsahujícím 100 mM cysteaminu a 10 mM chloridu sodného. Hovězí DAP-I se zředí 200 krát v témže pufru. Substrátový roztok GFpNA (4 mM) se připravuje v 2% dimethylformamidu. V mikrotitrové destičce se smíchá 0,025 ml pufru Tris/fosfát/citrát o různé hodnotě pH s 0,1 ml zředěného enzymu a s 0,1 ml substrátového roztoku. Míra vzrůstu absorbance při 410 nm se
-7CZ 286950 B6 stanovuje na deskovém čítači („plate reader“) v průběhu 30 minut. Výsledky naznačují, že optima hodnoty pH dDAP štěpení GFpNA jsou 3,5 až 4,0.
2. Štěpení Gly-Arg-pNA
Připraví se čtyři vzorky mM Gly-Arg-pNA (Gr-NA) v 50 mM kyseliny octové, v 50 mM glycinového pufru při hodnotě pH 5. K nastavení hodnot pH 5,1 až 2,3 se používá kyseliny chlorovodíkové nebo roztoku hydroxidu sodného. Do 180 μΐ shora uvedeného pufrovaného substrátu se přidá 5 μΐ dDAP (49 milijednotek/ml konečných). Míra vzrůstu absorbance při 410 nm se monitoruje (za použití deskového čítače) a míra vzrůstu se porovnává s hodnotou pH reakčního roztoku. Jako sGF-pNA má GR-pNA substrát optimum hodnoty pH přibližně 3,5. Enzym má malou aktivitu při hodnotě pH pod 2,5 nebo nad 5 za použití tohoto substrátu.
3. Štěpení Arg-Arg-B-naftylamidu (RR-BNA)
Připraví se přibližně 0,25 mM (RR-BNA) buď ve 100 mM kyseliny octové, hodnota pH 3,5, nebo ve 100 mM citrátového pufru při hodnotě pH 5. Do 2 ml substrátu se přidá dDAP nebo hovězí DAP-I (přibližně 15 milijednotek/ml roztoku). Míra štěpení (monitorovaná vzrůstem fluorescence při 410 nm za excitace při 340 nm) se monitoruje. Hovězí DAP-I není schopen štěpit žádný substrát. S překvapením dDAP je schopen účinně štěpit RR-BNA substrát. Enzym dDAP není schopen štěpit blokovanou aminoskupinu Z-RR-BNA substrátu, což potvrzuje pozorování, že dDAP je DAP enzym. Optimální hodnota pH pro štěpení RR-BNA se zkouší monitorováním rychlosti RR-BNA štěpení za použití systému pufru sestávajícího z 50 mM kyseliny octové a 50 mM citrátu. Různé hodnoty pH se nastavují použitím kyseliny chlorovodíkové nebo roztoku hydroxidu sodného a 1,5 ml objemy se upravují na 2,0 s 0,5 ml lmM zásobního roztoku RR-BNA (konečná koncentrace přibližně 0,25 mM). Enzym dDAP se přidává (do přibližně 15 mU/ml) a stanovuje se míra štěpení. Optimální hodnota pro štěpení RRBNA je přibližně 4,5 s výraznou aktivitou v celém zkoušeném oboru (hodnota pH 3,5 až 5,7). Tento překvapivý výsledek naznačuje, že enzym dDAp má některé vlastnosti DAP III.
Pracovníkovi v oboru je jasné, že optimální hodnota pH pro štěpení substrátu závisí nejen na enzymu avšak rovněž na samotném substrátu, to znamená, na konstituci odstraňovaného dipeptidu jakož také na samotné indikátorové skupině. Například za použití enzymu dDAP, má Gly-Arg-pNA optimální hodnotu pH přibližně 3,5 zatím co optimální hodnota pH pro štěpení Gly-Arg-7-amino-4-methylkumarinu (GR-AMC) je přibližně 5, což znamená, že příslušná skupina může ovlivňovat vlastnosti štěpení.
B. Konverze syntetických oktapeptidů a dekapeptidů
Oktapeptid Met-Asp-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu se rozpustí na koncentraci 4 mM s 50 mM octové kyseliny za hodnoty pH 3,5. Roztok se zředí na 1 : 1 dDAp (10 ml/ml) a inkubuje se při teplotě místnosti po dobu šesti hodin. Reakce se ukončí zředěním 20 násobek v 7 M močovině obsahující 1 % kyseliny fosforečné. Vzorek s ukončenou reakcí se analyzuje vysokovýkonnou reverzní fázovou chromatografií (HPLC). Štěpné produkty se porovnávají se standardním oktapeptidem, Met-Asp dipeptidem a se Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu hexapeptidem. DDAP ochotně odstraňuje Met-Asp dipeptid z neblokovaného aminozakončení oktapeptidů, není však schopen snadno štěpit objevený dipeptid Phe-Pro.
Syntetizovaný dekapeptid Met-Arg-Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu se připravuje jakožto 1,7 mM zásobní roztok ve 100 mM glycinu za hodnoty pH 3,5. Do 0,5 mililitrů tohoto roztoku se přidá 8 mikrolitrů 6,4 mU/ml dDAP (připraveno ve 100 mM glycinu, hodnota pH 3,5). Každou hodinu se 5 mikrolitrů tohoto roztoku přímo vstřikuje do reverzního fázového chromatografického systému HPCL k monitorování štěpných produktů. Pro srovnání se nezávisle
-8CZ 286950 B6 vstřikují Met-Arg a Met-Tyr dipeptidy jakož také Met-Tyr-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu a PheVal-Asn-Gin-His-Leu. Enzym dDAP ochotně štěpí Met-Arg dipeptid z dekapeptidu stejně jako vzniklý Met-Tyr dipeptid. To znamená, že dipeptidy se mohou sekvencionálně odstraňovat z aminozakončení použitím dDAP.
C. Konverze Met-Asp-lidského růstového hormonu
Met-Asp-lidský růstový hormon (Met-Asp-hGH) se produkuje jako nerozpustná bílkovina vcytoplazmě E. coli. Nerozpustná bílkovina se solubilizuje, ohýbá k vytvoření vhodně disulfídicky párovaných Met-Asp-hGH a čistí se ionexovou chromatografíí. Takový prostředek se rozpouštědlově vyměňuje a hodnota pH se nastaví na 3,5. Met-Asp-hGH se ohřeje na teplotu 37 °C a stanoví se absorbance při 280 nm. Přidá se dDAp v množství 6 milijednotek na mg MetAsp-hGH. Konverzní reakce se nechá probíhat při teplotě 37 °C za míchání přibližně 4 až přibližně 6 hodin. Reakce se může zpomalit bez nepříznivého ovlivnění použitím méně enzymu, nižší teploty nebo nižší koncentrace Met-Asp-hGH. Reakční rychlost se může zvýšit přidáním většího množství enzymu, zvýšením koncentrace Met-Asp-hGH nebo zvýšením reakční teploty. Postup konverzní reakce se monitoruje reverzní fázovou chromatografíí. Konverzní reakce se ukončí rychlým přidáním hydroxidu sodného za míchání při hodnotě pH 8 a přidáním 30% (objem/objem) acetonitrilu. Reakční produkt lidského růstového hormonu, produkovaný zpracováním enzymem dDAP, se podrobuje extenzivní baterii analytických procedur včetně mapování peptidu, N-koncového sekvencování, hmotové spektroskopie, aminokyselinové analýzy a reverzní fázové chromatografíi (HPLC). Všechny hodnoty potvrzují, že se použitím enzymu dDAp získá autentický lidský růstový hormon.
D. Konverze Met-Arg-lidského proinzulinu
Met-Arg-lidský proinzulin (met-Arg-hPI) se produkuje jako nerozpustná bílkovina v cytoplazmě E. coli. Nerozpustná bílkovina se solubilizuje v 7 M močovině. Bílkovina se čistí ionexovou chromatografíí. Met-Arg-hPI se sulfítolyzuje, rozpouštědlo se zamění a ohýbá se k vytvoření nativních disulfídických vazebných párů a nativní terciární struktury. Materiál se dále čistí za použití reverzní fázové chromatografie. Vytvoří se oxidovaný methionyl (Met (O))— Arg-hPI z Met-Arg-hPI za použití peroxidu vodíku a následně se čistí za použití reverzní fázové chromatografie a lyofílizuje se.
Met-Arg-hPI je přibližně 24 mg/ml (v přibližně 20 mM glycinovém pufru, hodnota pH 3,5). Přibližně 2,4 mg tohoto materiálu se inkubuje s 0,19 milijednotkami enzymu dDAP při hodnotě pH 3,5. Reakce se nechá probíhat při teplotě místnosti. Periodicky se odebírají podíly a zředí se 10% kyselinou fosforečnou. Tento materiál se vstřikuje na neutrální reverzní fázový chromatografícký HPLC systém k monitorování zániku Met-Arg-hPI nebo (Met (O))-Arg-hPI za produkce hPI. Kromě toho se podíly ředí vhodným ředidlem k umožnění HPLC monitorovat objevení buď Met-Arg, nebo (Met (O)-Arg dipeptid. Přibližně 60 % Met-Arg hPI se v průběhu 8 hodin převede na hPI. Podobné výsledky se neočekávatelně pozorují pro konverzi (Met (O))— Arg-hPI; to znamená, že se vytváří hPI. Míra štěpení obou substrátů je podobná. Tento výsledek je překvapivý, jelikož hovězí DAP-I se jeví jako neschopný štěpit Met-(O)-X-deriváty hPI, kde znamená X Arg, Phe a Tyr. Reverzní fázová analýza také dokládá, že Met-Arg dipeptid se uvolňuje z Met-Arg-hPI ve srovnání s dipeptidem Met-Arg a pík se jeví v oblasti Met-Arg dipeptidu pro zkoušku s (Met (O)-Arg-hPI substrátem, kterým může být dipeptid Met(O)-Arg. Schopnost dDAP štěpit oxidovaný Met(O)-X substrát je výraznou zpracovatelskou předností před enzymy, které nejsou schopny převádět tuto vazbu.
-9CZ 286950 B6
E. D. Konverze Met-Arg-iidský proinzulinových analogů
Enzymu dDAP se také používá k účinné konverzi ohýbaného Met-Arg-proinzulinového analogu (B28 Lys, B29 Pro) a ohýbaného Met-Arg-proinzulinového analogu (BIO Asp, des B28-B30).
Tyto reakce se provádějí v podstatě stejně jako je vysvětleno pro konverzi Met-Arg-hPI.
Průmyslová využitelnost
Nová dipeptidylaminopeptidáza se získá izolací a čištěním z buněčné slizovky Dictyostelium discoideum. Nový DAP enzym, dDAP, má aktivitu poněkud podobnou jako DAP-I a DAP-III, avšak vysoce se od nich liší svými fyzikálními a jinými enzymatickými charakteristikami. DDAP se může používat k odstraňování dipeptidů z N-zakončení rekombinantně produkovaných prekurzorových bílkovin nebo peptidů.
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Dipeptidylaminopeptidáza, enzym dDAP, o molekulové hmotnosti 225 000, s optimální hodnotou pH 3,5, izolovaná z Dictyostelium discoideum.
- 2. Způsob přípravy enzymu dDAP podle nároku 1, izolací z kultury Dictyostelium discoideum, 25 vyznačující se tím, žea) se připraví prostředí prosté buněk z kultivační kapaliny,b) toto prostředí se zpracuje ionexovou chromatografií,c) eluát ze stupně podle odstavce b) se podrobí hydrofóbní interakční chromatografíi,d) eluát ze stupně podle odstavce c) se podrobí vylučovací chromatografíi podle velikosti.
- 3. Použití dipeptidylaminopeptidázy podle nároku 1 pro přípravu polypeptidového produktu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US95553992A | 1992-10-01 | 1992-10-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ203393A3 CZ203393A3 (en) | 1994-04-13 |
| CZ286950B6 true CZ286950B6 (en) | 2000-08-16 |
Family
ID=25496954
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19932033A CZ286950B6 (en) | 1992-10-01 | 1993-09-29 | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase, process of its preparation and use |
| CZ2000793A CZ287066B6 (cs) | 1992-10-01 | 2000-03-03 | Způsob přípravy polypeptidového produktu |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000793A CZ287066B6 (cs) | 1992-10-01 | 2000-03-03 | Způsob přípravy polypeptidového produktu |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5565349A (cs) |
| EP (2) | EP1094118A1 (cs) |
| JP (1) | JP3550409B2 (cs) |
| KR (1) | KR100291528B1 (cs) |
| CN (1) | CN1060212C (cs) |
| AT (1) | ATE211169T1 (cs) |
| AU (1) | AU669735B2 (cs) |
| BR (1) | BR9303949A (cs) |
| CA (1) | CA2107279A1 (cs) |
| CZ (2) | CZ286950B6 (cs) |
| DE (1) | DE69331371T2 (cs) |
| DK (1) | DK0595476T3 (cs) |
| ES (1) | ES2169036T3 (cs) |
| FI (1) | FI934305A (cs) |
| HU (1) | HU219771B (cs) |
| IL (1) | IL107123A (cs) |
| MX (1) | MX9306021A (cs) |
| MY (1) | MY113378A (cs) |
| NO (1) | NO933503L (cs) |
| NZ (1) | NZ248810A (cs) |
| PL (1) | PL176930B1 (cs) |
| PT (1) | PT595476E (cs) |
| RU (1) | RU2096455C1 (cs) |
| TW (1) | TW257792B (cs) |
| UA (1) | UA27718C2 (cs) |
| ZA (1) | ZA937243B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5573923A (en) * | 1993-12-22 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum |
| US5614379A (en) * | 1995-04-26 | 1997-03-25 | Eli Lilly And Company | Process for preparing anti-obesity protein |
| EP1141263A4 (en) * | 1998-09-21 | 2002-08-28 | Lilly Co Eli | PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT TRYPSIN ANALOGS |
| US6794159B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
| US6743600B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-06-01 | Monsanto Technologies Llc | Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase |
| US8129139B2 (en) | 2009-07-13 | 2012-03-06 | Allergan, Inc. | Process for obtaining botulinum neurotoxin |
| EP2536749A1 (en) * | 2010-02-17 | 2012-12-26 | Elona Biotechnologies | Methods for preparing human growth hormone |
| US11427814B2 (en) | 2019-03-26 | 2022-08-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
| AU2020247918B2 (en) * | 2019-03-26 | 2022-06-30 | Encodia, Inc. | Modified cleavases, uses thereof and related kits |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK55685A (da) * | 1985-02-07 | 1986-08-08 | Nordisk Gentofte | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| DE3519218A1 (de) * | 1985-05-29 | 1986-12-04 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung |
| US4894439A (en) * | 1986-05-22 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| US5177003A (en) * | 1987-04-16 | 1993-01-05 | Phillips Petroleum Company | Flavored protein products derived from Candida utilis |
| US5075222A (en) * | 1988-05-27 | 1991-12-24 | Synergen, Inc. | Interleukin-1 inhibitors |
| JPH023698A (ja) * | 1988-06-20 | 1990-01-09 | Denki Kagaku Kogyo Kk | ヒトリンホトキシンに対するモノクローナル抗体及びそれら抗体を産生するハイブリドーマ、並びにそれら抗体を用いたヒトリンホトキシンの精製方法、測定方法及び測定試薬 |
| US5208218A (en) * | 1988-09-19 | 1993-05-04 | Ludwig Institute For Cancer Research | T cell growth factor glycoproteins |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US5175251A (en) * | 1989-05-04 | 1992-12-29 | Sri International | Antimetastatic peptides with laminin activity |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| US5173409A (en) * | 1989-12-08 | 1992-12-22 | Ecogen Inc. | Recovery of bt endotoxin protein from lysed cell mixtures |
-
1993
- 1993-07-28 TW TW082106050A patent/TW257792B/zh active
- 1993-09-27 IL IL10712393A patent/IL107123A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-09-28 KR KR1019930020229A patent/KR100291528B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 UA UA93002125A patent/UA27718C2/uk unknown
- 1993-09-29 AU AU48719/93A patent/AU669735B2/en not_active Ceased
- 1993-09-29 EP EP01200113A patent/EP1094118A1/en not_active Withdrawn
- 1993-09-29 DK DK93307746T patent/DK0595476T3/da active
- 1993-09-29 BR BR9303949A patent/BR9303949A/pt not_active Application Discontinuation
- 1993-09-29 MY MYPI93001975A patent/MY113378A/en unknown
- 1993-09-29 PT PT93307746T patent/PT595476E/pt unknown
- 1993-09-29 NZ NZ248810A patent/NZ248810A/en unknown
- 1993-09-29 ES ES93307746T patent/ES2169036T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 AT AT93307746T patent/ATE211169T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 ZA ZA937243A patent/ZA937243B/xx unknown
- 1993-09-29 PL PL93300537A patent/PL176930B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 DE DE69331371T patent/DE69331371T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-29 CZ CZ19932033A patent/CZ286950B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1993-09-29 EP EP93307746A patent/EP0595476B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-09-29 CA CA002107279A patent/CA2107279A1/en not_active Abandoned
- 1993-09-29 MX MX9306021A patent/MX9306021A/es not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 CN CN93118452A patent/CN1060212C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 JP JP24479993A patent/JP3550409B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1993-09-30 RU RU9393047672A patent/RU2096455C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1993-09-30 NO NO933503A patent/NO933503L/no not_active Application Discontinuation
- 1993-09-30 FI FI934305A patent/FI934305A/fi unknown
- 1993-09-30 HU HU9302773A patent/HU219771B/hu not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-07 US US08/301,519 patent/US5565349A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-19 US US08/445,308 patent/US5565330A/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-03 CZ CZ2000793A patent/CZ287066B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5614379A (en) | Process for preparing anti-obesity protein | |
| EP0746611B1 (en) | Method for increasing production of disulfide bonded recombinant proteins by (saccharomyces cerevisiae) | |
| CA2153254C (en) | Cloning of enterokinase and method of use | |
| US6333175B1 (en) | Yield when disulfide-bonded proteins are secreted | |
| US4987070A (en) | Use of a 97 amino acid leader sequence from the E. coli B-galactosidase gene for the production of hanp and hptc as fusion proteins | |
| CZ286950B6 (en) | Dictyostelium dipeptidylaminopeptidase, process of its preparation and use | |
| KR20010083900A (ko) | 활성 β-ＮＧＦ의 제조방법 | |
| IE56372B1 (en) | Microbially produced rennet methods for its production and plasmids used for its production | |
| Bourbonnais et al. | Cleavage of prosomatostatins by the yeast Yap3 and Kex2 endoprotease | |
| Ledgerwood et al. | Endoproteolytic processing of recombinant proalbumin variants by the yeast Kex2 protease | |
| Nomura et al. | Characterization and crystallization of recombinant human cathepsin L | |
| Gabrijelcic-Geiger et al. | Human-calpain: simple isolation from erythrocytes and characterization of autolysis fragments | |
| EP0267692B1 (en) | Production of recombinant human PSTI. | |
| KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조 | |
| NZ272121A (en) | Recombinant preparation of aprotinin and variants | |
| JP3518868B2 (ja) | バシラスリケニフォーミス菌株から由来したアミノペプチダーゼ及び天然蛋白質の製造方法 | |
| Inoue et al. | Heterologous expression and site‐directed mutagenesis studies on the activation mechanism and the roles of the basic residues in the prosegment of aspergillopepsinogen I | |
| KR0132003B1 (ko) | 스트렙토마이세스 써모니트리피컨스 아미노펩티다제를 이용한 천연형 재조합 단백질의 제조방법 | |
| MXPA01009979A (en) | Production of pancreatic procarboxy-peptidase b, isoforms and muteins thereof, and their use | |
| EP1334183A2 (en) | NOVEL SOLUBLE ENDOPROTEASES FOR THE i IN VITRO /i PROCESSING OF RECOMBINANT PROTEINS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20020929 |