JP3550409B2 - ジクチオステリウムのジペプチジルアミノペプチダーゼ - Google Patents
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳しくは、本発明は組換え法により製造される生物学的化合物のプロセシングにおいて有用な、粘菌ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Dictyostelium discoideum)から単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。
【0002】
【従来の技術】
Dictyostelium discoideumは一般に粘菌、より詳しくは細胞性粘菌と称される原始的な真核微生物である。この名称は、肉眼で見たときの微生物の2つの極限状態を由来としている。活発に成長しているときには、D.discoideumは単細胞アメーバとして成長する。この時期には、それらは細胞壁を持たず、ゆえにそれらの外観は薄いフィルム(または粘液)のようである。固体培地上での飢餓により、個々の細胞が集合してコロニーを形成する。このコロニーは多細胞生物の特徴を示し、スラグと称される形態で移動し、次いで分化してスラグの後方細胞が足を形成し、前方細胞が柄を形成し、そして中央部細胞が子実体を形成する。この生物は土および糞の表面に天然に見られる。野生型のアメーバはもっぱら細菌全体の摂食(食作用)により栄養分を得るが、この意味においてそれらは肉食性であると称されることもある。D.discoideumの純培養の突然変異体が単離されているが、この変異体は「食物」細菌の共培養なしで成長することができ、ゆえに可溶性培地で成長することができる。本発明はD.discoideumから単離される新規なジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。
【0003】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP)は、末端から2番目のアミノ末端ペプチド結合を加水分解して、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からジペプチドを遊離させる酵素である。現在4クラスのジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP−I、DAP−II、DAP−III、DAP−IVと称される)が存在し、それらの物理的性質および様々なアミノ末端ペプチド配列の切断を触媒する速度に基づいて分類されている。DAP Iは、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からの多種組合せのジペプチドの遊離を触媒する比較的非特異的なDAPである。DAP Iは、現れたジペプチドがX−Pro、Arg−XまたはLys−X(Xは任意のアミノ酸)であるならば、ほとんどまたは全く活性を示さない。DAP IIはArg−XまたはLys−Xで始まるアミノ末端ジペプチド配列に対する選択性を示し、X−Proには比較的低い選択性を示す。DAP−IIは他のほとんどのジペプチド組合せに対して有意に一層低い切断速度を示す。DAP IIIはArg−ArgおよびLys−Lys型のアミノ末端ジペプチド配列への性向を有しているようである。DAP IVはX−Pro型のジペプチド配列に対して最高の加水分解活性速度を示す。DAP酵素、特にDAP−IおよびDAP−IVは、タンパク質のプロセシングにおいて有用であることが示されている。本発明は、偶数のアミノ酸N末端伸張を有する組換えタンパク質のプロセシングにおいて有用な、Dictyostelium discoideumから得た新規なDAPに関する。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumから単離される新規なジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。この新規なDAP酵素であるdDAPは、DAP−IおよびDAP−IIIの両方にいくらか類似しているが、これらの酵素とは物理的および他の酵素的な性質において大きく区別される活性を示す。さらに本発明は、このdDAP酵素を用いて、組換え法により製造された前駆体タンパク質またはペプチドのN末端からジペプチドを除去するための方法に関する。本発明のdDAP酵素は1個のジペプチドをポリペプチドのN末端から除去するために用いることができ、さらに1を越えるジペプチドを前駆体ポリペプチドのN末端から連続的に除去するために用いることができる。さらに、本発明はdDAP酵素をD.discoideumの培養物から単離および精製するための方法に関する。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本明細書中に開示し特許請求の範囲に記載した本発明のために、次の用語および短縮形を以下の様に定義する。
dDAP:ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Dictyostelium discoideum)から単離されたジペプチジルアミノペプチダーゼであり、GFpNAを基質として用いたときにpH約3.5の至適pHを示し、分析用超遠心により測定したときに約225,000ダルトンの天然分子量を有し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したときに約66,000ダルトンのサブユニット分子量を有する。
GFpNA:Gly−Phe p−ニトロアニリド。
前駆体ポリペプチド:目的の所望のポリペプチドのアミノ末端から伸張された偶数のアミノ酸を含む、組換え法により製造されたポリペプチド。
プロセシングされたポリペプチド:目的の所望のポリペプチドを得るためにN末端のジペプチドまたは複数ジペプチドが除去されたポリペプチド。
RRBNA:Arg−Arg−β−ナフチルアミド。
本明細書中で用いるすべてのアミノ酸の短縮形は、37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)に記載されている米国特許商標局により承認された短縮形である。
【0006】
本発明は、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼ dDAPに関する。dDAP酵素はDAP−IおよびDAP−IIIの両方に通常関係している未ブロックのアミノ末端配列を切断する性向を示すが、dDAPはこれらの酵素とは物理的および他の酵素的な性質の両方において大きく区別される。dDAPは、GFpNAを基質として用いたときにpH約3.5の至適pHを示し、約225,000ダルトンの天然分子量、約66,000ダルトンのサブユニット分子量を有する。レクチン・アフィニティークロマトグラフィーにより、dDAP酵素は糖タンパク質らしいことが示されている。dDAP酵素は、ジペプチドを、合成基質であるGly−Pheパラニトロアニリド(GFpNA)およびArg−Arg−β−ナフチルアミド(RRBNA)から、さらに他の数多くの合成および組換えにより製造されたポリペプチドから除去する能力を有する。
【0007】
既知のDAP−I酵素は多種多様の動物および動物組織から単離されている。新規な酵素dDAPはDictyostelium discoideumの培養ブロスから単離される。DAP−I酵素は活性のためにハロゲン化物および還元剤を必要とする。システインのスルフヒドリルを修飾するヨード酢酸などの試薬はDAP−I酵素を不活性化する。DAP−IはpH5〜6で最高活性を有する。対照的に、dDAP酵素は、基質としてGly−Phe−pNAまたはGly−Arg−pNAを用いたときに約3.5の至適pHを有し、pH3.5でペプチドおよびタンパク質に対して有意な活性を示す。dDAP酵素は6を越えるpHで有意な活性を持たない。dDAP酵素は還元剤の添加を全く必要とせず、ヨード酢酸またはテトラチオネートなどのシステイン修飾剤の存在下で完全に活性である。ブロックされたN末端でペプチドを切断することができない点においてdDAPはウシDAP−Iに似ているが、N末端に酸化型メチオニンを有する基質に対して活性である点においてウシDAP−Iに似ていない。ウシDAP−IはN末端に酸化型メチオニンを有する基質を切断することができない。さらに、ウシDAP−Iとは異なり、dDAP酵素はArg−Arg−β−ナフチルアミド基質を容易に切断することができる。このアミノ末端Arg−Argジペプチジル含有基質を切断する能力は哺乳動物および微生物を供給源とするDAP−III酵素の活性により類似しているが、DAP−III酵素はアルカリ性の範囲に至適pHを有すると報告されており、一方、dDAPは酸性の範囲において最も有効に機能する。SDS PAGEで評価したときのdDAPのサブユニット分子量は約66,000ダルトンであり、一方、哺乳動物のDAP−Iのサブユニット分子量は約22,000ダルトンである。
【0008】
本発明のdDAP酵素は、前駆体ポリペプチドをプロセシングされたポリペプチドに変換するのに最も有用である。例えば、ヒト成長ホルモンが所望のポリペプチドであるなら、単にヒト成長ホルモンの前駆体(1つの場合において、Met−Asp−ヒト成長ホルモン)を発現させ、次いでこの前駆体をdDAP活性に供してジペプチドMet−Aspおよび所望のプロセシングされたポリペプチドであるヒト成長ホルモンを遊離させる。プロセシングされるペプチドは「天然の」野生型ポリペプチドである必要はなく、類似体または中間体を製造するのが好ましいことが多い。さらに、前駆体ポリペプチドのプロセシングの方法は本発明の一部である。dDAPによりプロセシングし得る他の前駆体ポリペプチドには、Met−Arg−hGH、Met−Tyr−プロインスリン、Met−Arg−プロインスリン、Met−Arg−プロインスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)、Met−Tyr−プロインスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)、Met−Arg−プロインスリン類似体(B10 Asp、B28〜30を欠失)、Met−Tyr−プロインスリン類似体(B10 Asp、B28〜30を欠失)が含まれる。インスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)は欧州特許出願番号90301224.3に開示されており、インスリン類似体(B10 Asp、B28〜30を欠失)は欧州特許出願番号92305678.2に開示されている。さらに、dDAPは前駆体ポリペプチドのN末端から1組以上のジペプチドを連続的に除去するのに用いてよい。ウシDAP−IによるMet−Arg−プロインスリンおよびMet−Arg−プロインスリン類似体のプロセシングは、Beckerら,米国特許出願番号5,126,249(1992年6月30日発行)に開示されており、そのすべての教示は本明細書の一部を構成するものとする。
【0009】
前駆体タンパク質からジペプチドを除去するためのdDAP酵素の使用は、dDAPが約3.5の至適pHを有する点で有利である(このpHは、多くの前駆体ポリペプチドが溶解する酸性pH範囲で反応を行うことを可能にする)。さらに、中性またはそれ以上のpHでのある種の前駆体ポリペプチドの変換により、基質の鎖間ジスルフィド二量体または多量体量の一層の増大が、生成物収量の損失と共に導かれることがある。ジスルフィド・スクランブリングとして知られるこの現象は、特にウシDAP−Iを用いるときに問題となるが、これはDAP−Iがβ−メルカプトエタノールまたはシステインなどの還元剤を反応混合物に添加することを必要とするからである。また、メチオニン残基の酸化は酸性pH範囲においては比較的低い割合で起こる。さらに、発酵法はより高い製品の一様性および酵素の再現性を可能にするので、動物供給源から得た酵素の市販品に依存するよりもD.discoideumの発酵培養物から得た酵素を用いる方が経済的に適切である。動物由来の酵素の回避により、高度に精製された大量の物質の一定した供給が可能になる。D.discoideum Ax3(ATCC 28368)の発酵に続いて遠心分離、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを行い、前駆体ポリペプチドのプロセシング用に保存もしくは即時に用いることのできるdDAP酵素の高度に精製された溶液を得る。発酵ブロスからのdDAPの単離および精製も本発明の一部である。
【0010】
前駆体ポリペプチドのプロセシングされたポリペプチドへの変換は広範な温度、pH領域および時間で行うことができる。反応は通常、約2.5〜約5.5のpHを達成してそれを維持するために適切に緩衝化された水性媒体中で行う。この媒体のpHは約3.0〜約4.5の範囲が好ましく、約3.0〜約3.5が最も好ましい。至適pHは基質により若干変化することがある。例えば、Gly−Phe−pNAおよびGly−Arg−pNAのプロセシング速度はpH約3.5で最も速く、一方、Met−Asp−hGHのプロセシング速度はpH約3.0〜約3.5で速い。Arg−Arg−βNAのプロセシング速度はpH約4.5で最も速い。任意の特異的な反応の至適pHが、与えられた前駆体ポリペプチドおよび酵素の安定性および溶解性などの因子により決定されるであろうことは当業者の理解するところであろう。いくつかの場合においては可溶化剤、例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、グアニジンなどを用いてよい。
【0011】
プロセシング反応は、ほんの数秒から数日までの範囲の任意の必要時間で行うことができる。約1分から約24時間の間で反応を行うのが好ましく、約1時間から約8時間で行うのが最も好ましい。反応時間を調節して、任意の所望の前駆体ポリペプチドまたはプロセシングされるポリペプチドに必要とされるあらゆるパラメーターを容易に満足させ得ることは当業者の理解するところであろう。
【0012】
またプロセシング反応の温度は、与えられた任意の基質に応じて調節することができる。反応は約15℃から約45℃の間の温度で続けられるのが好ましい。反応温度は約20℃から約37℃の間がより好ましく、約25℃から約37℃の間で反応を行うのが最も好ましい。時間、温度およびpHの反応パラメーターは任意の所望の前駆体またはプロセシングされるポリペプチドの要求に従い変化させ得ることも当業者の容易に理解するところであろう。
【0013】
任意の広範囲の緩衝剤を用いることができ、その唯一の必要条件は所望の範囲内にpHを維持する能力である。通常の緩衝剤の例として、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシンなどが挙げられる。好ましい緩衝剤は酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびグリシンである。
【0014】
本発明で使用するための前駆体ポリペプチドは通常、組換えDNA技術により製造する。その製造において、所望の前駆体ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はその合成のための通常の技術を使用して製造する。これらの方法は通常、所望の暗号配列のフラグメントおよびその相補性配列の両方をコードしているオリゴヌクレオチドの製造を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、暗号配列の1つのフラグメントと相補性配列の2つのフラグメントおよびその逆の重複をもたらすように設計する。これらオリゴヌクレオチドを対にして結合させ、最終的には所望の遺伝子配列を製造する。
【0015】
配列はクローニングベクター中、この配列がコードする生成物の発現を可能にする位置に挿入する。適当なクローニングベクターは少なくとも発現制御配列の部分を含む。
【0016】
【実施例】
以下に示す実施例は、本発明をさらに説明する手段として挙げるものである。これらは本発明に限定を課すものと解釈すべきではない。
【0017】
実施例1 Dictyostelium discoideumの発酵
Dictyostelium discoideum Ax3の凍結乾燥培養物をAmerican Type Culture Collection(Rockville, Maryland)から受託番号ATCC 28368のもとで入手し、Difco酵母抽出物(7.15g/l)、Difco Bactoペプトン(14.3g/l)、Na2HPO4(0.51g/l)およびKH2PO4(0.49g/l)からなる緩衝化酵母抽出物−ペプトン培地を含む寒天プレート(1.2%Difco Bacto Agar)上にいくつかの密度で平板培養し、これにグルコース(最終10g/l)を個別の滅菌の後に無菌的に加え、これをNaOHまたはH2SO4を用いて最終pH6.5(+/−0.1)に調整した。この同じ培地(寒天を含まない)を約1リットル以下の容量で液体培養物の成長のために用いた。寒天プレートを3〜5日間21℃〜24℃でインキュベートした。Ax3培養物と共に凍結乾燥された「食物細菌」を拾い上げるのを防止するよう注意してプレートから胞子嚢を採収し、次いで緩衝化酵母抽出物−ペプトンブロス(3ml)中に接種し、穏やかに震盪しながら21〜24℃でインキュベートした。次いで、D.discoideum細胞を次第に大きな容量の緩衝化酵母抽出物−ペプトンブロスへの連続的な移し替えにより増幅させた。各々の一連の移し替え工程は、約10倍から25倍の間の希釈により、細胞密度が約2×106/mlを越えたときに行った。ブロスは常に21〜24℃で緩やかに撹拌しながらインキュベートした。
【0018】
撹拌発酵は通常、最初の酵母抽出物−ペプトン培地中Bactoペプトンの代わりに大豆ペプトン(PhytoneペプトンまたはMarcor大豆ペプトンなど)を2〜14.3g/lの濃度で含む同様の培地中で行った。採収物は通常、40〜150rpmで回転している1〜3のRushtonタービン羽根を装着した10〜5000リットルの作業容量を有する発酵槽から得た。温度は22+/−1℃に制御し、空気流は液体ブロスの容量当たり0.1から0.5の間の空気容量に制御し、背圧は3〜5p.s.i.に維持した。一部の発酵は硫酸によりpHを6.4に制御して行い、また一部は撹拌および空気流を変化させることにより溶存酸素を40〜60%に制御して行った。この細胞は成長中は壁の少ないアメーバであるので、細胞の取扱いおよび発酵中の剪断を最少限にするために注意を払った。
【0019】
通常、D.discoideum Ax3の撹拌培養物は12〜36時間の倍増時間で成長した。溶存酸素は次第に減少し(制御しない場合)、次いで細胞密度の増加が停止してしばらく後に増加し始めた。最終の細胞密度は3×106/ml〜5×107/mlの範囲にあり、酸素の移動はより低い最大細胞密度を有する発酵においては明らかに制限されていた。
【0020】
サンプルを時々採取し、細胞密度およびGF−pNAse活性について分析した(下記の実施例3を参照)。Petroff−Hauser計算板を使用して約5×105/mlを越える細胞密度を概算した。通常、GFpNA加水分解活性は発酵中に上昇した。最大dDAP活性は最大細胞密度に達してから2〜4日後に見られた。全ブロスを4℃で保存するかまたは−20℃で凍結させ、後に解凍して活性を分析した。10℃以下に冷却し、細胞を連続−流出遠心機で除去することにより発酵の収穫を行った。
【0021】
実施例2 dDAPの製造
A.細胞の除去および濃縮
Dictyostelium discoideum発酵ブロスからのdDAPの最初の精製には、細胞の除去および濃縮の工程が含まれる。細胞の除去はWestern States遠心機での連続−流出遠心により行った。細胞を含まない培地を50,000分子量カットオフ膜を使用した接線流出超遠心により約20倍濃縮した。保留液を超遠心ユニットから排出させ、このユニットを50mMトリス緩衝液(pH7)で洗浄してdDAPをさらに回収した。保留液および洗浄液のサンプルを合わせて最終濃縮液を得、これをさらに処理を行うまで数カ月間、−20℃で凍結保存した。
【0022】
B.清浄化
凍結最終濃縮液を約12時間室温で解凍した。解凍したら、最初のカラムクロマトグラフィー工程の前に最終濃縮液の清浄化を行った。清浄化は、遠心分離、次いで5ミクロン膜による濾過の組み合わせにより行った。清浄化された最終濃縮液をpH7.0に調整し、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を待つ間、12時間以内4〜10℃で保持した。
【0023】
C.陰イオン交換クロマトグラフィー
dDAP精製工程の最初のクロマトグラフィー工程は、Pharmacia Q−Sepharose Fast Flow樹脂(FFQ)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーであった。カラムは50mMトリス緩衝液(pH7)で平衡化した。清浄化細胞を含まない濃縮液を、50cm/時の直線流出速度で樹脂1リットル当たり非濃縮発酵培地60リットルの比でカラムにかけた。この結果、樹脂1リットル当たりのタンパク質量は約60gであった(タンパク質の定量はPierce BCAタンパク質アッセイに基づきウシ血清アルブミン標準に対して行った)。FFQ樹脂1リットル当たりにdDAP活性約250単位を適用した。細胞を含まない濃縮液の伝導率は約5mMHOS/cmであった。サンプルの賦課を完了した後に、FFQ樹脂を平衡化緩衝液の3カラム容量で洗浄した。0〜1M NaCl、50mMトリス(pH7)の直線勾配を10カラム容量以上、流速50cm/時で用いてdDAP活性を樹脂から溶離した。分画サイズは0.1カラム容量であった。このFFQカラムをさらに3カラム容量の50mMトリス(pH7)中の1.0M NaClで溶離した。流出物を伝導率および280nmでの吸光度でモニターし、pH3.5で比色基質Gly−Pheパラ−ニトロアニリド(GFpNA)を切断する能力により各分画をdDAP活性について分析した。全溶出dDAP活性の約90%を含む画分を合わせることにより主プールを調製した。dDAP活性はサイズが約2カラム容量の単一ピークとして溶出した。この主プールを10%v/v HClを用いてpH3.5の酸性にした。FFQ酸性化した主プールは2日以内4℃で保持した。
【0024】
D.疎水性相互作用クロマトグラフィー
次に、FFQ酸性化主プールをPharmacia Phenyl Sepharose Fast Flow樹脂による疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)により精製した。カラムは陰イオン交換カラムの容量の1/3であった。樹脂1リットル当たり約650単位の活性を適用し、タンパク質賦課量は樹脂1リットル当たり4gとした(280nmでの1吸光度単位を1mg/mlタンパク質に等しいとした)。140g/Lの硫酸アンモニウムの添加により、HICカラムへの賦課用にFFQ主プールを調製した。この賦課物をpH3.5に調整し、最終伝導率を約90mMHOS/cmとした。HICカラムを、少なくとも140g/Lの硫酸アンモニウムを含む50mMクエン酸塩(pH3.5)中に平衡化した。この賦課物を直線流速40cm/時で適用し、樹脂を少なくとも3カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した。140g/Lから0g/Lまでの硫酸アンモニウム[50mMクエン酸塩(pH3.5)中]の直線勾配を40cm/時で10カラム容量以上用いて樹脂からdDAP活性を溶離した。さらにカラムを、少なくとも3カラム容量の50mMクエン酸塩(pH3.5)で溶離した。分画サイズは0.1カラム容量であった。流出物を伝導率および280nmでの吸光度でモニターし、pH3.5でGFpNAを切断する能力により各分画をdDAP活性について分析した。全溶出dDAP活性の約90%を含む分画を合わせることにより主プールを調製した。dDAP活性はサイズが約2カラム容量の単一ピークとして溶出した。この主プールを10%v/v HClまたは10%w/w NaOHを用いてpH3.5に調節した。HIC主プールは工程を続行する前に1日以内4℃で保持した。
【0025】
E.サイズ排除クロマトグラフィー
HIC主プールをさらにS−200 Sepharose HRのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により処理した。このカラムはHICカラムの2倍の容量であり、78cmのベッド高さを有していた。HIC主プールを、10,000ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用いて限外濾過ユニット中で濃縮することにより、HIC主プールをSECカラム用に調製した。HIC主プールをSECカラム容量の2.5%に濃縮し、保留液をユニットから排出した。限外濾過ユニットを、SECカラム容量の2.5%に等しい容量の50mMクエン酸塩緩衝液(pH3.5)で洗浄した。保留液および洗浄液を合わせて最終濃縮物を得、10%v/v HClまたは10%w/v NaOHを用いてpH3.5に調節した。最終濃縮物の伝導率は約30mMHO/cmであった。SECカラムを50mM酢酸、20mM塩化ナトリウム、pH3.5で平衡化し、これは約2mMHO/cmの伝導率を有していた。最終濃縮液を15cm/時の直線流出でSECカラムにかけ、1カラム容量の平衡化緩衝液を注ぐことによりdDAP活性を溶離した。分画サイズは0.02カラム容量であった。流出物を伝導率および280nmでの吸光度でモニターし、pH3.5でGFpNAを切断する能力により各分画をdDAP活性について分析した。全溶出dDAP活性の約90%を含む分画を合わせることにより主プールを調製した。dDAP活性はサイズが約0.08カラム容量の単一ピークとして溶出した。SEC主プールは4℃で数カ月間保持することができる。
【0026】
陰イオン交換、疎水性相互作用、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを用いたdDAPの精製の結果、SDS−PAGE上で主バンドとして移動する物質を得た。このバンドは分子量標準のウシ血清アルブミン(66キロダルトン)と等しいゲル上の位置に移動した。このタンパク質はISS Pro−ブルー染色により染色した。移動パターンはサンプル調製中の0.1M DTT(+100℃で5分間)の存在または不在による影響を受けなかった。DAP−I(ウシ供給源)のサブユニット分子量はSDS−PAGEにより約22,000ダルトンであると概算される。
【0027】
実施例3 dDAPの活性
A.変換反応
1.GF−pNAの切断
dDAP活性は通常、色素基質Gly−Pheパラ−ニトロアニリド(GF−pNA)の切断を追跡することによりモニターする。通常このアッセイは、酵素をpH3.5に調整された4mM GFpNA(1.0ml)中に11倍希釈することにより行う。GFジペプチドの切断速度は405nmでの吸光度の上昇を測定することにより37℃でモニターした。1単位の活性はこれらの条件下で1分間あたり0.90のOD変化を導く。単位/mlの概算は、遊離pNAに対する吸光度係数を405nmで9.9mM-1cm-1であると仮定して行うことができる。
【0028】
基質GFpNA指向性のdDAPの阻害特性を、ウシDAP−Iの活性を阻害することが知られているスルフヒドリル修飾剤であるヨードアセトアミドおよびカリウム・テトラチオネートを用いてウシDAP−Iのものと比較した。dDAPまたはウシ脾臓DAP−Iのサンプルを、100mMトリス緩衝液中、pH7でどちらかの阻害剤の最終濃度0、0.5、5.0、または50mM中にて室温で15分間インキュベートした。次いで、このインキュベートした溶液を4mM GFpNA(pH3.5)で21倍に希釈した。切断速度は、37℃で405nmでの吸光度の上昇を測定することによりモニターした。ウシDAP−IのGFpNA切断速度は5mMヨードアセトアミドに暴露することにより90%以上減少し、5mMカリウム・テトラチオネートにより95%阻害された。試験したヨードアセトアミドまたはカリウム・テトラチオネートのいずれの濃度によってもdDAPの有意な阻害の形跡はなかった。
【0029】
dDAPのGFpNA切断能力に対する至適pHを、0.5トリス、リン酸塩およびクエン酸塩からなる緩衝液を10%HClまたは10%NaOHで3〜8の範囲内の種々のpHに調節することにより測定した。dDAP酵素を、100mMシステアミンおよび10mM NaClを含む緩衝液中に20倍希釈した。ウシDAP−Iは同じ緩衝液中に200倍希釈した。GFpNA基質溶液(4mM)を2%DMF中に調製した。微量滴定プレート中で、種々のpHのトリス/リン酸塩/クエン酸塩緩衝液(0.025ml)を、希釈酵素(0.1ml)および基質溶液(0.1ml)と合わせた。410nmでの吸光度の上昇速度をプレートリーダーで30分間にわたって測定した。この結果により、GFpNA切断に対するdDAPの至適pHは3.5〜4.0の間であることが示された。
【0030】
2.Gly−Arg−pNAの切断
4mM Gly−Arg−pNA(GR−pNA)を50mM酢酸、50mMグリシン緩衝液、pH5中に調製した。HClまたはNaOHを用いて5.1から2.3の種々のpHにした。上記のpH緩衝化基質(180μl)にdDAP(5μl)(最終49ミリ単位/ml)を加えた。410nmでの吸光度の上昇速度をモニターし(プレートリーダーを使用)、上昇速度を反応溶液のpHと比較した。GF−pNAの場合と同様に、GR−pNA基質は約3.5の至適pHを有していた。この基質を用いた場合に、酵素はpH2.5以下またはpH5以上では活性はほとんどなかった。
【0031】
3.Arg−Arg−B−ナフチルアミド(RR−BNA)の切断
約0.25mMのRR−BNAまたは0.25mMのベンジルオキシカルボニル−RR−BNA(Z−RR−BNA)を100mM酢酸(pH3.5)または100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)のどちらかにおいて調製した。基質(2ml)にdDAPまたはウシDAP−I(約15ミリ単位/ml溶液)を加えた。切断速度(340nmでの励起と共に410nmでの蛍光の上昇をモニターする)をモニターした。ウシDAP−Iはどちらの基質も切断することができなかった。驚くべきことに、dDAPはRR−BNA基質を効率的に切断することができた。dDAPはブロックされたアミノ基Z−RR−BNA基質を切断することができなかったが、これはdDAPがDAP酵素であるという観察を支持している。RR−BNAの切断のための至適pHを、50mM酢酸および50mMクエン酸塩からなる緩衝系を用いてRR−BNA切断の速度をモニターすることにより調べた。HClまたはNaOHを用いて種々のpHとし、1.5mlの容量をRR−BNAの1mM保存溶液(最終濃度約0.25mM)0.5mlにより2.0にした。dDAPを加え(約15mU/mlに)、切断速度を測定した。RR−BNA切断のための至適pHは約4.5であることが観察され、調べた全範囲(pH3.5〜pH5.7)にわたって有意な活性が見られた。この驚くべき結果は、dDAPがDAPIIIの特性の一部を共有していることを示唆している。
【0032】
基質切断のための至適pHは、酵素だけでなく基質それ自体、すなわち除去されるジペプチドの構成ならびに指示基自体にも依存することを当業者は理解しているであろう。例えば、dDAPを使用した場合、Gly−Arg−pNAは約3.5の至適pHを有するが、Gly−Arg−7−アミド−4−メチルクマリン(GR−AMC)の切断のための至適pHは約pH5であり、このことはこのリポーティング基が切断特性に影響を与え得ることを示唆している。
【0033】
B.合成オクタペプチドおよびデカペプチドの変換
オクタペプチドMet−Asp−Phe−Pro−Ala−Met−Ser−Leuを50mM HOAc(pH3.5)で4mMの濃度に溶解した。この溶液をdDAP(10mU/ml)で1:1に希釈し、室温で6時間インキュベートした。この反応を、1%リン酸を含む7M尿素に20倍希釈することにより停止させた。反応停止サンプルを高速逆層(HPLC)クロマトグラフィーにより分析した。切断生成物をオクタペプチド標準、Met−Aspジペプチド、およびPhe−Pro−Ala−Met−Ser−Leuヘキサペプチドと比較した。dDAPは、オクタペプチドの未ブロックのアミノ末端からMet−Aspジペプチドを容易に除去したが、現れたPhe−Proジペプチドを容易に切断することはできなかった。
【0034】
合成されたデカペプチドMet−Arg−Met−Tyr−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leuを、100mMグリシン(pH3.5)中の1.7mM保存溶液として調製した。この溶液(0.5ml)にの6.4mU/ml dDAP[100mMグリシン(pH3.5)中に調製](8μl)を加えた。毎時間、この溶液(5μl)を逆層HPLCクロマトグラフィー系に直接注入して切断生成物をモニターした。Met−ArgおよびMet−TyrジペプチドならびにMet−Tyr−Phe−Val−Asn−Gln−His−LeuおよびPhe−Val−Asn−Gln−His−Leuペプチドを比較のために独立して注入した。dDAPは容易にMet−Argジペプチドをデカペプチドから除去し、さらに現れたMet−Tyrジペプチドを除去した。これにより、ジペプチドはdDAPによりアミノ末端から連続的に除去され得ることが示された。
【0035】
C.Met−Aspヒト成長ホルモンの変換
Met−Aspヒト成長ホルモン(Met−Asp−hGH)を、E.coli細胞質中の不溶性タンパク質として製造した。この不溶性タンパク質を可溶化し、折り畳んで適切なジスルフィド対が形成されたMet−Asp−hGHを製造し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。この調製物の溶媒を交換し、pH3.5に調整した。Met−Asp−hGHを37℃に暖め、280nmでの吸光度を測定した。Met−Asp−hGHの1mg当たり6ミリ単位のdDAPを加えた。この変換反応を、37℃で撹拌しながら約4〜約6時間進行させた。反応の進行は、より少ない酵素、より低い温度、またはより低いMet−Asp−hGH濃度を用いることにより損失を受けることなく遅くすることができる。反応速度は、より多くの酵素の添加、Met−Asp−hGHの濃度の上昇または反応温度の上昇により高めることができる。変換反応の進行は逆層クロマトグラフィーによりモニターした。撹拌しながらNaOHを急速に添加してpH8にし、さらに30%v/vアセトニトリルを加えることにより変換反応を停止させた。dDAP処理の後に生成したヒト成長ホルモンの反応産物を、ペプチドマッピング、N末端配列決定、質量分光分析、アミノ酸分析、および逆層クロマトグラフィー(HPLC)を含む多数の一連の分析操作に供した。すべてのデータが、真正なヒト成長ホルモンがdDAPにより製造されたことを示した。
【0036】
D.Met−Arg−ヒトプロインスリンの変換
Met−Arg−ヒトプロインスリン(Met−Arg−hPI)を、E.coli細胞質中の不溶性タンパク質として製造した。この不溶性タンパク質を7M尿素中で可溶化した。タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Met−Arg−hPIを亜硫酸分解し、溶媒を交換し、天然のジスルフィド結合対および天然の3次構造を形成させるために折り畳んだ。さらにこの物質を逆層クロマトグラフィーを用いて精製した。酸化型メチオニル[Met(O)]−Arg−hPIをMet−Arg−hPIから過酸化水素を用いて調製し、次いで逆層クロマトグラフィーで精製して凍結乾燥した。
【0037】
Met−Arg−hPIは約24mg/ml[約20mMグリシン緩衝液(pH3.5)中]であった。この物質(約2.4mg)をdDAP(0.19ミリ単位)とpH3.5でインキュベートした。この反応は室温で進行させた。定期的に、反応液の一部を取り10%リン酸で希釈した。この物質を中性の逆層HPLC系に注入し、Met−Arg−hPIまたはMet(O)−Arg−hPIの消失およびその後のhPIの生成についてモニターした。さらに、反応液の一部を適当な希釈液で希釈してMet−ArgまたはMet(O)−Argジペプチドのどちらかの出現をHPLCでモニターした。約60%のMet−Arg−hPIが8時間でhPIに変換された。予期せぬことにMet(O)−Arg−hPI変換実験について同様の結果が見られた;即ち、hPIが生成した。両基質の切断速度は類似していた。ウシDAP−IがhPIのMet(O)−X−誘導体(XはArg、PheおよびTyr)を切断することができないようであるので、この結果は意外であった。さらに逆層分析により、Met−Argジペプチドは基準のMet−Argジペプチドとの比較によりMet−Arg−hPIから放出され、またMet(O)−Argジペプチドとなり得るMet(O)−Arg−hPI基質を用いた実験についてピークはMet−Argジペプチドの領域に現れることが判明した。酸化型Met(O)−X基質を切断するdDAPの能力は、この切断を行うことができない酵素を凌ぐ明確なプロセシングの利点を有している。
【0038】
E.Met−Argヒトプロインスリン類似体の変換
さらにdDAP酵素を用いて、折り畳まれたMet−Argプロインスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)ならびに折り畳まれたMet−Argプロインスリン類似体(B10 Asp、B28〜B30を欠失)を効率よく変換した。これらの反応は、実質的にMet−Arg−hPIの変換の説明において示した方法に従って行った。
【産業上の利用分野】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳しくは、本発明は組換え法により製造される生物学的化合物のプロセシングにおいて有用な、粘菌ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Dictyostelium discoideum)から単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。
【0002】
【従来の技術】
Dictyostelium discoideumは一般に粘菌、より詳しくは細胞性粘菌と称される原始的な真核微生物である。この名称は、肉眼で見たときの微生物の2つの極限状態を由来としている。活発に成長しているときには、D.discoideumは単細胞アメーバとして成長する。この時期には、それらは細胞壁を持たず、ゆえにそれらの外観は薄いフィルム(または粘液)のようである。固体培地上での飢餓により、個々の細胞が集合してコロニーを形成する。このコロニーは多細胞生物の特徴を示し、スラグと称される形態で移動し、次いで分化してスラグの後方細胞が足を形成し、前方細胞が柄を形成し、そして中央部細胞が子実体を形成する。この生物は土および糞の表面に天然に見られる。野生型のアメーバはもっぱら細菌全体の摂食(食作用)により栄養分を得るが、この意味においてそれらは肉食性であると称されることもある。D.discoideumの純培養の突然変異体が単離されているが、この変異体は「食物」細菌の共培養なしで成長することができ、ゆえに可溶性培地で成長することができる。本発明はD.discoideumから単離される新規なジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。
【0003】
ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP)は、末端から2番目のアミノ末端ペプチド結合を加水分解して、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からジペプチドを遊離させる酵素である。現在4クラスのジペプチジルアミノペプチダーゼ(DAP−I、DAP−II、DAP−III、DAP−IVと称される)が存在し、それらの物理的性質および様々なアミノ末端ペプチド配列の切断を触媒する速度に基づいて分類されている。DAP Iは、ペプチドおよびタンパク質のブロックされていないアミノ末端からの多種組合せのジペプチドの遊離を触媒する比較的非特異的なDAPである。DAP Iは、現れたジペプチドがX−Pro、Arg−XまたはLys−X(Xは任意のアミノ酸)であるならば、ほとんどまたは全く活性を示さない。DAP IIはArg−XまたはLys−Xで始まるアミノ末端ジペプチド配列に対する選択性を示し、X−Proには比較的低い選択性を示す。DAP−IIは他のほとんどのジペプチド組合せに対して有意に一層低い切断速度を示す。DAP IIIはArg−ArgおよびLys−Lys型のアミノ末端ジペプチド配列への性向を有しているようである。DAP IVはX−Pro型のジペプチド配列に対して最高の加水分解活性速度を示す。DAP酵素、特にDAP−IおよびDAP−IVは、タンパク質のプロセシングにおいて有用であることが示されている。本発明は、偶数のアミノ酸N末端伸張を有する組換えタンパク質のプロセシングにおいて有用な、Dictyostelium discoideumから得た新規なDAPに関する。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumから単離される新規なジペプチジルアミノペプチダーゼに関する。この新規なDAP酵素であるdDAPは、DAP−IおよびDAP−IIIの両方にいくらか類似しているが、これらの酵素とは物理的および他の酵素的な性質において大きく区別される活性を示す。さらに本発明は、このdDAP酵素を用いて、組換え法により製造された前駆体タンパク質またはペプチドのN末端からジペプチドを除去するための方法に関する。本発明のdDAP酵素は1個のジペプチドをポリペプチドのN末端から除去するために用いることができ、さらに1を越えるジペプチドを前駆体ポリペプチドのN末端から連続的に除去するために用いることができる。さらに、本発明はdDAP酵素をD.discoideumの培養物から単離および精製するための方法に関する。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本明細書中に開示し特許請求の範囲に記載した本発明のために、次の用語および短縮形を以下の様に定義する。
dDAP:ジクチオステリウム・ジスコイデウム(Dictyostelium discoideum)から単離されたジペプチジルアミノペプチダーゼであり、GFpNAを基質として用いたときにpH約3.5の至適pHを示し、分析用超遠心により測定したときに約225,000ダルトンの天然分子量を有し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定したときに約66,000ダルトンのサブユニット分子量を有する。
GFpNA:Gly−Phe p−ニトロアニリド。
前駆体ポリペプチド:目的の所望のポリペプチドのアミノ末端から伸張された偶数のアミノ酸を含む、組換え法により製造されたポリペプチド。
プロセシングされたポリペプチド:目的の所望のポリペプチドを得るためにN末端のジペプチドまたは複数ジペプチドが除去されたポリペプチド。
RRBNA:Arg−Arg−β−ナフチルアミド。
本明細書中で用いるすべてのアミノ酸の短縮形は、37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)に記載されている米国特許商標局により承認された短縮形である。
【0006】
本発明は、細胞性粘菌Dictyostelium discoideumから単離されるジペプチジルアミノペプチダーゼ dDAPに関する。dDAP酵素はDAP−IおよびDAP−IIIの両方に通常関係している未ブロックのアミノ末端配列を切断する性向を示すが、dDAPはこれらの酵素とは物理的および他の酵素的な性質の両方において大きく区別される。dDAPは、GFpNAを基質として用いたときにpH約3.5の至適pHを示し、約225,000ダルトンの天然分子量、約66,000ダルトンのサブユニット分子量を有する。レクチン・アフィニティークロマトグラフィーにより、dDAP酵素は糖タンパク質らしいことが示されている。dDAP酵素は、ジペプチドを、合成基質であるGly−Pheパラニトロアニリド(GFpNA)およびArg−Arg−β−ナフチルアミド(RRBNA)から、さらに他の数多くの合成および組換えにより製造されたポリペプチドから除去する能力を有する。
【0007】
既知のDAP−I酵素は多種多様の動物および動物組織から単離されている。新規な酵素dDAPはDictyostelium discoideumの培養ブロスから単離される。DAP−I酵素は活性のためにハロゲン化物および還元剤を必要とする。システインのスルフヒドリルを修飾するヨード酢酸などの試薬はDAP−I酵素を不活性化する。DAP−IはpH5〜6で最高活性を有する。対照的に、dDAP酵素は、基質としてGly−Phe−pNAまたはGly−Arg−pNAを用いたときに約3.5の至適pHを有し、pH3.5でペプチドおよびタンパク質に対して有意な活性を示す。dDAP酵素は6を越えるpHで有意な活性を持たない。dDAP酵素は還元剤の添加を全く必要とせず、ヨード酢酸またはテトラチオネートなどのシステイン修飾剤の存在下で完全に活性である。ブロックされたN末端でペプチドを切断することができない点においてdDAPはウシDAP−Iに似ているが、N末端に酸化型メチオニンを有する基質に対して活性である点においてウシDAP−Iに似ていない。ウシDAP−IはN末端に酸化型メチオニンを有する基質を切断することができない。さらに、ウシDAP−Iとは異なり、dDAP酵素はArg−Arg−β−ナフチルアミド基質を容易に切断することができる。このアミノ末端Arg−Argジペプチジル含有基質を切断する能力は哺乳動物および微生物を供給源とするDAP−III酵素の活性により類似しているが、DAP−III酵素はアルカリ性の範囲に至適pHを有すると報告されており、一方、dDAPは酸性の範囲において最も有効に機能する。SDS PAGEで評価したときのdDAPのサブユニット分子量は約66,000ダルトンであり、一方、哺乳動物のDAP−Iのサブユニット分子量は約22,000ダルトンである。
【0008】
本発明のdDAP酵素は、前駆体ポリペプチドをプロセシングされたポリペプチドに変換するのに最も有用である。例えば、ヒト成長ホルモンが所望のポリペプチドであるなら、単にヒト成長ホルモンの前駆体(1つの場合において、Met−Asp−ヒト成長ホルモン)を発現させ、次いでこの前駆体をdDAP活性に供してジペプチドMet−Aspおよび所望のプロセシングされたポリペプチドであるヒト成長ホルモンを遊離させる。プロセシングされるペプチドは「天然の」野生型ポリペプチドである必要はなく、類似体または中間体を製造するのが好ましいことが多い。さらに、前駆体ポリペプチドのプロセシングの方法は本発明の一部である。dDAPによりプロセシングし得る他の前駆体ポリペプチドには、Met−Arg−hGH、Met−Tyr−プロインスリン、Met−Arg−プロインスリン、Met−Arg−プロインスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)、Met−Tyr−プロインスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)、Met−Arg−プロインスリン類似体(B10 Asp、B28〜30を欠失)、Met−Tyr−プロインスリン類似体(B10 Asp、B28〜30を欠失)が含まれる。インスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)は欧州特許出願番号90301224.3に開示されており、インスリン類似体(B10 Asp、B28〜30を欠失)は欧州特許出願番号92305678.2に開示されている。さらに、dDAPは前駆体ポリペプチドのN末端から1組以上のジペプチドを連続的に除去するのに用いてよい。ウシDAP−IによるMet−Arg−プロインスリンおよびMet−Arg−プロインスリン類似体のプロセシングは、Beckerら,米国特許出願番号5,126,249(1992年6月30日発行)に開示されており、そのすべての教示は本明細書の一部を構成するものとする。
【0009】
前駆体タンパク質からジペプチドを除去するためのdDAP酵素の使用は、dDAPが約3.5の至適pHを有する点で有利である(このpHは、多くの前駆体ポリペプチドが溶解する酸性pH範囲で反応を行うことを可能にする)。さらに、中性またはそれ以上のpHでのある種の前駆体ポリペプチドの変換により、基質の鎖間ジスルフィド二量体または多量体量の一層の増大が、生成物収量の損失と共に導かれることがある。ジスルフィド・スクランブリングとして知られるこの現象は、特にウシDAP−Iを用いるときに問題となるが、これはDAP−Iがβ−メルカプトエタノールまたはシステインなどの還元剤を反応混合物に添加することを必要とするからである。また、メチオニン残基の酸化は酸性pH範囲においては比較的低い割合で起こる。さらに、発酵法はより高い製品の一様性および酵素の再現性を可能にするので、動物供給源から得た酵素の市販品に依存するよりもD.discoideumの発酵培養物から得た酵素を用いる方が経済的に適切である。動物由来の酵素の回避により、高度に精製された大量の物質の一定した供給が可能になる。D.discoideum Ax3(ATCC 28368)の発酵に続いて遠心分離、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを行い、前駆体ポリペプチドのプロセシング用に保存もしくは即時に用いることのできるdDAP酵素の高度に精製された溶液を得る。発酵ブロスからのdDAPの単離および精製も本発明の一部である。
【0010】
前駆体ポリペプチドのプロセシングされたポリペプチドへの変換は広範な温度、pH領域および時間で行うことができる。反応は通常、約2.5〜約5.5のpHを達成してそれを維持するために適切に緩衝化された水性媒体中で行う。この媒体のpHは約3.0〜約4.5の範囲が好ましく、約3.0〜約3.5が最も好ましい。至適pHは基質により若干変化することがある。例えば、Gly−Phe−pNAおよびGly−Arg−pNAのプロセシング速度はpH約3.5で最も速く、一方、Met−Asp−hGHのプロセシング速度はpH約3.0〜約3.5で速い。Arg−Arg−βNAのプロセシング速度はpH約4.5で最も速い。任意の特異的な反応の至適pHが、与えられた前駆体ポリペプチドおよび酵素の安定性および溶解性などの因子により決定されるであろうことは当業者の理解するところであろう。いくつかの場合においては可溶化剤、例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、グアニジンなどを用いてよい。
【0011】
プロセシング反応は、ほんの数秒から数日までの範囲の任意の必要時間で行うことができる。約1分から約24時間の間で反応を行うのが好ましく、約1時間から約8時間で行うのが最も好ましい。反応時間を調節して、任意の所望の前駆体ポリペプチドまたはプロセシングされるポリペプチドに必要とされるあらゆるパラメーターを容易に満足させ得ることは当業者の理解するところであろう。
【0012】
またプロセシング反応の温度は、与えられた任意の基質に応じて調節することができる。反応は約15℃から約45℃の間の温度で続けられるのが好ましい。反応温度は約20℃から約37℃の間がより好ましく、約25℃から約37℃の間で反応を行うのが最も好ましい。時間、温度およびpHの反応パラメーターは任意の所望の前駆体またはプロセシングされるポリペプチドの要求に従い変化させ得ることも当業者の容易に理解するところであろう。
【0013】
任意の広範囲の緩衝剤を用いることができ、その唯一の必要条件は所望の範囲内にpHを維持する能力である。通常の緩衝剤の例として、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシンなどが挙げられる。好ましい緩衝剤は酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびグリシンである。
【0014】
本発明で使用するための前駆体ポリペプチドは通常、組換えDNA技術により製造する。その製造において、所望の前駆体ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列はその合成のための通常の技術を使用して製造する。これらの方法は通常、所望の暗号配列のフラグメントおよびその相補性配列の両方をコードしているオリゴヌクレオチドの製造を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、暗号配列の1つのフラグメントと相補性配列の2つのフラグメントおよびその逆の重複をもたらすように設計する。これらオリゴヌクレオチドを対にして結合させ、最終的には所望の遺伝子配列を製造する。
【0015】
配列はクローニングベクター中、この配列がコードする生成物の発現を可能にする位置に挿入する。適当なクローニングベクターは少なくとも発現制御配列の部分を含む。
【0016】
【実施例】
以下に示す実施例は、本発明をさらに説明する手段として挙げるものである。これらは本発明に限定を課すものと解釈すべきではない。
【0017】
実施例1 Dictyostelium discoideumの発酵
Dictyostelium discoideum Ax3の凍結乾燥培養物をAmerican Type Culture Collection(Rockville, Maryland)から受託番号ATCC 28368のもとで入手し、Difco酵母抽出物(7.15g/l)、Difco Bactoペプトン(14.3g/l)、Na2HPO4(0.51g/l)およびKH2PO4(0.49g/l)からなる緩衝化酵母抽出物−ペプトン培地を含む寒天プレート(1.2%Difco Bacto Agar)上にいくつかの密度で平板培養し、これにグルコース(最終10g/l)を個別の滅菌の後に無菌的に加え、これをNaOHまたはH2SO4を用いて最終pH6.5(+/−0.1)に調整した。この同じ培地(寒天を含まない)を約1リットル以下の容量で液体培養物の成長のために用いた。寒天プレートを3〜5日間21℃〜24℃でインキュベートした。Ax3培養物と共に凍結乾燥された「食物細菌」を拾い上げるのを防止するよう注意してプレートから胞子嚢を採収し、次いで緩衝化酵母抽出物−ペプトンブロス(3ml)中に接種し、穏やかに震盪しながら21〜24℃でインキュベートした。次いで、D.discoideum細胞を次第に大きな容量の緩衝化酵母抽出物−ペプトンブロスへの連続的な移し替えにより増幅させた。各々の一連の移し替え工程は、約10倍から25倍の間の希釈により、細胞密度が約2×106/mlを越えたときに行った。ブロスは常に21〜24℃で緩やかに撹拌しながらインキュベートした。
【0018】
撹拌発酵は通常、最初の酵母抽出物−ペプトン培地中Bactoペプトンの代わりに大豆ペプトン(PhytoneペプトンまたはMarcor大豆ペプトンなど)を2〜14.3g/lの濃度で含む同様の培地中で行った。採収物は通常、40〜150rpmで回転している1〜3のRushtonタービン羽根を装着した10〜5000リットルの作業容量を有する発酵槽から得た。温度は22+/−1℃に制御し、空気流は液体ブロスの容量当たり0.1から0.5の間の空気容量に制御し、背圧は3〜5p.s.i.に維持した。一部の発酵は硫酸によりpHを6.4に制御して行い、また一部は撹拌および空気流を変化させることにより溶存酸素を40〜60%に制御して行った。この細胞は成長中は壁の少ないアメーバであるので、細胞の取扱いおよび発酵中の剪断を最少限にするために注意を払った。
【0019】
通常、D.discoideum Ax3の撹拌培養物は12〜36時間の倍増時間で成長した。溶存酸素は次第に減少し(制御しない場合)、次いで細胞密度の増加が停止してしばらく後に増加し始めた。最終の細胞密度は3×106/ml〜5×107/mlの範囲にあり、酸素の移動はより低い最大細胞密度を有する発酵においては明らかに制限されていた。
【0020】
サンプルを時々採取し、細胞密度およびGF−pNAse活性について分析した(下記の実施例3を参照)。Petroff−Hauser計算板を使用して約5×105/mlを越える細胞密度を概算した。通常、GFpNA加水分解活性は発酵中に上昇した。最大dDAP活性は最大細胞密度に達してから2〜4日後に見られた。全ブロスを4℃で保存するかまたは−20℃で凍結させ、後に解凍して活性を分析した。10℃以下に冷却し、細胞を連続−流出遠心機で除去することにより発酵の収穫を行った。
【0021】
実施例2 dDAPの製造
A.細胞の除去および濃縮
Dictyostelium discoideum発酵ブロスからのdDAPの最初の精製には、細胞の除去および濃縮の工程が含まれる。細胞の除去はWestern States遠心機での連続−流出遠心により行った。細胞を含まない培地を50,000分子量カットオフ膜を使用した接線流出超遠心により約20倍濃縮した。保留液を超遠心ユニットから排出させ、このユニットを50mMトリス緩衝液(pH7)で洗浄してdDAPをさらに回収した。保留液および洗浄液のサンプルを合わせて最終濃縮液を得、これをさらに処理を行うまで数カ月間、−20℃で凍結保存した。
【0022】
B.清浄化
凍結最終濃縮液を約12時間室温で解凍した。解凍したら、最初のカラムクロマトグラフィー工程の前に最終濃縮液の清浄化を行った。清浄化は、遠心分離、次いで5ミクロン膜による濾過の組み合わせにより行った。清浄化された最終濃縮液をpH7.0に調整し、陰イオン交換クロマトグラフィー工程を待つ間、12時間以内4〜10℃で保持した。
【0023】
C.陰イオン交換クロマトグラフィー
dDAP精製工程の最初のクロマトグラフィー工程は、Pharmacia Q−Sepharose Fast Flow樹脂(FFQ)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーであった。カラムは50mMトリス緩衝液(pH7)で平衡化した。清浄化細胞を含まない濃縮液を、50cm/時の直線流出速度で樹脂1リットル当たり非濃縮発酵培地60リットルの比でカラムにかけた。この結果、樹脂1リットル当たりのタンパク質量は約60gであった(タンパク質の定量はPierce BCAタンパク質アッセイに基づきウシ血清アルブミン標準に対して行った)。FFQ樹脂1リットル当たりにdDAP活性約250単位を適用した。細胞を含まない濃縮液の伝導率は約5mMHOS/cmであった。サンプルの賦課を完了した後に、FFQ樹脂を平衡化緩衝液の3カラム容量で洗浄した。0〜1M NaCl、50mMトリス(pH7)の直線勾配を10カラム容量以上、流速50cm/時で用いてdDAP活性を樹脂から溶離した。分画サイズは0.1カラム容量であった。このFFQカラムをさらに3カラム容量の50mMトリス(pH7)中の1.0M NaClで溶離した。流出物を伝導率および280nmでの吸光度でモニターし、pH3.5で比色基質Gly−Pheパラ−ニトロアニリド(GFpNA)を切断する能力により各分画をdDAP活性について分析した。全溶出dDAP活性の約90%を含む画分を合わせることにより主プールを調製した。dDAP活性はサイズが約2カラム容量の単一ピークとして溶出した。この主プールを10%v/v HClを用いてpH3.5の酸性にした。FFQ酸性化した主プールは2日以内4℃で保持した。
【0024】
D.疎水性相互作用クロマトグラフィー
次に、FFQ酸性化主プールをPharmacia Phenyl Sepharose Fast Flow樹脂による疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)により精製した。カラムは陰イオン交換カラムの容量の1/3であった。樹脂1リットル当たり約650単位の活性を適用し、タンパク質賦課量は樹脂1リットル当たり4gとした(280nmでの1吸光度単位を1mg/mlタンパク質に等しいとした)。140g/Lの硫酸アンモニウムの添加により、HICカラムへの賦課用にFFQ主プールを調製した。この賦課物をpH3.5に調整し、最終伝導率を約90mMHOS/cmとした。HICカラムを、少なくとも140g/Lの硫酸アンモニウムを含む50mMクエン酸塩(pH3.5)中に平衡化した。この賦課物を直線流速40cm/時で適用し、樹脂を少なくとも3カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄した。140g/Lから0g/Lまでの硫酸アンモニウム[50mMクエン酸塩(pH3.5)中]の直線勾配を40cm/時で10カラム容量以上用いて樹脂からdDAP活性を溶離した。さらにカラムを、少なくとも3カラム容量の50mMクエン酸塩(pH3.5)で溶離した。分画サイズは0.1カラム容量であった。流出物を伝導率および280nmでの吸光度でモニターし、pH3.5でGFpNAを切断する能力により各分画をdDAP活性について分析した。全溶出dDAP活性の約90%を含む分画を合わせることにより主プールを調製した。dDAP活性はサイズが約2カラム容量の単一ピークとして溶出した。この主プールを10%v/v HClまたは10%w/w NaOHを用いてpH3.5に調節した。HIC主プールは工程を続行する前に1日以内4℃で保持した。
【0025】
E.サイズ排除クロマトグラフィー
HIC主プールをさらにS−200 Sepharose HRのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により処理した。このカラムはHICカラムの2倍の容量であり、78cmのベッド高さを有していた。HIC主プールを、10,000ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用いて限外濾過ユニット中で濃縮することにより、HIC主プールをSECカラム用に調製した。HIC主プールをSECカラム容量の2.5%に濃縮し、保留液をユニットから排出した。限外濾過ユニットを、SECカラム容量の2.5%に等しい容量の50mMクエン酸塩緩衝液(pH3.5)で洗浄した。保留液および洗浄液を合わせて最終濃縮物を得、10%v/v HClまたは10%w/v NaOHを用いてpH3.5に調節した。最終濃縮物の伝導率は約30mMHO/cmであった。SECカラムを50mM酢酸、20mM塩化ナトリウム、pH3.5で平衡化し、これは約2mMHO/cmの伝導率を有していた。最終濃縮液を15cm/時の直線流出でSECカラムにかけ、1カラム容量の平衡化緩衝液を注ぐことによりdDAP活性を溶離した。分画サイズは0.02カラム容量であった。流出物を伝導率および280nmでの吸光度でモニターし、pH3.5でGFpNAを切断する能力により各分画をdDAP活性について分析した。全溶出dDAP活性の約90%を含む分画を合わせることにより主プールを調製した。dDAP活性はサイズが約0.08カラム容量の単一ピークとして溶出した。SEC主プールは4℃で数カ月間保持することができる。
【0026】
陰イオン交換、疎水性相互作用、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを用いたdDAPの精製の結果、SDS−PAGE上で主バンドとして移動する物質を得た。このバンドは分子量標準のウシ血清アルブミン(66キロダルトン)と等しいゲル上の位置に移動した。このタンパク質はISS Pro−ブルー染色により染色した。移動パターンはサンプル調製中の0.1M DTT(+100℃で5分間)の存在または不在による影響を受けなかった。DAP−I(ウシ供給源)のサブユニット分子量はSDS−PAGEにより約22,000ダルトンであると概算される。
【0027】
実施例3 dDAPの活性
A.変換反応
1.GF−pNAの切断
dDAP活性は通常、色素基質Gly−Pheパラ−ニトロアニリド(GF−pNA)の切断を追跡することによりモニターする。通常このアッセイは、酵素をpH3.5に調整された4mM GFpNA(1.0ml)中に11倍希釈することにより行う。GFジペプチドの切断速度は405nmでの吸光度の上昇を測定することにより37℃でモニターした。1単位の活性はこれらの条件下で1分間あたり0.90のOD変化を導く。単位/mlの概算は、遊離pNAに対する吸光度係数を405nmで9.9mM-1cm-1であると仮定して行うことができる。
【0028】
基質GFpNA指向性のdDAPの阻害特性を、ウシDAP−Iの活性を阻害することが知られているスルフヒドリル修飾剤であるヨードアセトアミドおよびカリウム・テトラチオネートを用いてウシDAP−Iのものと比較した。dDAPまたはウシ脾臓DAP−Iのサンプルを、100mMトリス緩衝液中、pH7でどちらかの阻害剤の最終濃度0、0.5、5.0、または50mM中にて室温で15分間インキュベートした。次いで、このインキュベートした溶液を4mM GFpNA(pH3.5)で21倍に希釈した。切断速度は、37℃で405nmでの吸光度の上昇を測定することによりモニターした。ウシDAP−IのGFpNA切断速度は5mMヨードアセトアミドに暴露することにより90%以上減少し、5mMカリウム・テトラチオネートにより95%阻害された。試験したヨードアセトアミドまたはカリウム・テトラチオネートのいずれの濃度によってもdDAPの有意な阻害の形跡はなかった。
【0029】
dDAPのGFpNA切断能力に対する至適pHを、0.5トリス、リン酸塩およびクエン酸塩からなる緩衝液を10%HClまたは10%NaOHで3〜8の範囲内の種々のpHに調節することにより測定した。dDAP酵素を、100mMシステアミンおよび10mM NaClを含む緩衝液中に20倍希釈した。ウシDAP−Iは同じ緩衝液中に200倍希釈した。GFpNA基質溶液(4mM)を2%DMF中に調製した。微量滴定プレート中で、種々のpHのトリス/リン酸塩/クエン酸塩緩衝液(0.025ml)を、希釈酵素(0.1ml)および基質溶液(0.1ml)と合わせた。410nmでの吸光度の上昇速度をプレートリーダーで30分間にわたって測定した。この結果により、GFpNA切断に対するdDAPの至適pHは3.5〜4.0の間であることが示された。
【0030】
2.Gly−Arg−pNAの切断
4mM Gly−Arg−pNA(GR−pNA)を50mM酢酸、50mMグリシン緩衝液、pH5中に調製した。HClまたはNaOHを用いて5.1から2.3の種々のpHにした。上記のpH緩衝化基質(180μl)にdDAP(5μl)(最終49ミリ単位/ml)を加えた。410nmでの吸光度の上昇速度をモニターし(プレートリーダーを使用)、上昇速度を反応溶液のpHと比較した。GF−pNAの場合と同様に、GR−pNA基質は約3.5の至適pHを有していた。この基質を用いた場合に、酵素はpH2.5以下またはpH5以上では活性はほとんどなかった。
【0031】
3.Arg−Arg−B−ナフチルアミド(RR−BNA)の切断
約0.25mMのRR−BNAまたは0.25mMのベンジルオキシカルボニル−RR−BNA(Z−RR−BNA)を100mM酢酸(pH3.5)または100mMクエン酸緩衝液(pH5.0)のどちらかにおいて調製した。基質(2ml)にdDAPまたはウシDAP−I(約15ミリ単位/ml溶液)を加えた。切断速度(340nmでの励起と共に410nmでの蛍光の上昇をモニターする)をモニターした。ウシDAP−Iはどちらの基質も切断することができなかった。驚くべきことに、dDAPはRR−BNA基質を効率的に切断することができた。dDAPはブロックされたアミノ基Z−RR−BNA基質を切断することができなかったが、これはdDAPがDAP酵素であるという観察を支持している。RR−BNAの切断のための至適pHを、50mM酢酸および50mMクエン酸塩からなる緩衝系を用いてRR−BNA切断の速度をモニターすることにより調べた。HClまたはNaOHを用いて種々のpHとし、1.5mlの容量をRR−BNAの1mM保存溶液(最終濃度約0.25mM)0.5mlにより2.0にした。dDAPを加え(約15mU/mlに)、切断速度を測定した。RR−BNA切断のための至適pHは約4.5であることが観察され、調べた全範囲(pH3.5〜pH5.7)にわたって有意な活性が見られた。この驚くべき結果は、dDAPがDAPIIIの特性の一部を共有していることを示唆している。
【0032】
基質切断のための至適pHは、酵素だけでなく基質それ自体、すなわち除去されるジペプチドの構成ならびに指示基自体にも依存することを当業者は理解しているであろう。例えば、dDAPを使用した場合、Gly−Arg−pNAは約3.5の至適pHを有するが、Gly−Arg−7−アミド−4−メチルクマリン(GR−AMC)の切断のための至適pHは約pH5であり、このことはこのリポーティング基が切断特性に影響を与え得ることを示唆している。
【0033】
B.合成オクタペプチドおよびデカペプチドの変換
オクタペプチドMet−Asp−Phe−Pro−Ala−Met−Ser−Leuを50mM HOAc(pH3.5)で4mMの濃度に溶解した。この溶液をdDAP(10mU/ml)で1:1に希釈し、室温で6時間インキュベートした。この反応を、1%リン酸を含む7M尿素に20倍希釈することにより停止させた。反応停止サンプルを高速逆層(HPLC)クロマトグラフィーにより分析した。切断生成物をオクタペプチド標準、Met−Aspジペプチド、およびPhe−Pro−Ala−Met−Ser−Leuヘキサペプチドと比較した。dDAPは、オクタペプチドの未ブロックのアミノ末端からMet−Aspジペプチドを容易に除去したが、現れたPhe−Proジペプチドを容易に切断することはできなかった。
【0034】
合成されたデカペプチドMet−Arg−Met−Tyr−Phe−Val−Asn−Gln−His−Leuを、100mMグリシン(pH3.5)中の1.7mM保存溶液として調製した。この溶液(0.5ml)にの6.4mU/ml dDAP[100mMグリシン(pH3.5)中に調製](8μl)を加えた。毎時間、この溶液(5μl)を逆層HPLCクロマトグラフィー系に直接注入して切断生成物をモニターした。Met−ArgおよびMet−TyrジペプチドならびにMet−Tyr−Phe−Val−Asn−Gln−His−LeuおよびPhe−Val−Asn−Gln−His−Leuペプチドを比較のために独立して注入した。dDAPは容易にMet−Argジペプチドをデカペプチドから除去し、さらに現れたMet−Tyrジペプチドを除去した。これにより、ジペプチドはdDAPによりアミノ末端から連続的に除去され得ることが示された。
【0035】
C.Met−Aspヒト成長ホルモンの変換
Met−Aspヒト成長ホルモン(Met−Asp−hGH)を、E.coli細胞質中の不溶性タンパク質として製造した。この不溶性タンパク質を可溶化し、折り畳んで適切なジスルフィド対が形成されたMet−Asp−hGHを製造し、イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。この調製物の溶媒を交換し、pH3.5に調整した。Met−Asp−hGHを37℃に暖め、280nmでの吸光度を測定した。Met−Asp−hGHの1mg当たり6ミリ単位のdDAPを加えた。この変換反応を、37℃で撹拌しながら約4〜約6時間進行させた。反応の進行は、より少ない酵素、より低い温度、またはより低いMet−Asp−hGH濃度を用いることにより損失を受けることなく遅くすることができる。反応速度は、より多くの酵素の添加、Met−Asp−hGHの濃度の上昇または反応温度の上昇により高めることができる。変換反応の進行は逆層クロマトグラフィーによりモニターした。撹拌しながらNaOHを急速に添加してpH8にし、さらに30%v/vアセトニトリルを加えることにより変換反応を停止させた。dDAP処理の後に生成したヒト成長ホルモンの反応産物を、ペプチドマッピング、N末端配列決定、質量分光分析、アミノ酸分析、および逆層クロマトグラフィー(HPLC)を含む多数の一連の分析操作に供した。すべてのデータが、真正なヒト成長ホルモンがdDAPにより製造されたことを示した。
【0036】
D.Met−Arg−ヒトプロインスリンの変換
Met−Arg−ヒトプロインスリン(Met−Arg−hPI)を、E.coli細胞質中の不溶性タンパク質として製造した。この不溶性タンパク質を7M尿素中で可溶化した。タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。Met−Arg−hPIを亜硫酸分解し、溶媒を交換し、天然のジスルフィド結合対および天然の3次構造を形成させるために折り畳んだ。さらにこの物質を逆層クロマトグラフィーを用いて精製した。酸化型メチオニル[Met(O)]−Arg−hPIをMet−Arg−hPIから過酸化水素を用いて調製し、次いで逆層クロマトグラフィーで精製して凍結乾燥した。
【0037】
Met−Arg−hPIは約24mg/ml[約20mMグリシン緩衝液(pH3.5)中]であった。この物質(約2.4mg)をdDAP(0.19ミリ単位)とpH3.5でインキュベートした。この反応は室温で進行させた。定期的に、反応液の一部を取り10%リン酸で希釈した。この物質を中性の逆層HPLC系に注入し、Met−Arg−hPIまたはMet(O)−Arg−hPIの消失およびその後のhPIの生成についてモニターした。さらに、反応液の一部を適当な希釈液で希釈してMet−ArgまたはMet(O)−Argジペプチドのどちらかの出現をHPLCでモニターした。約60%のMet−Arg−hPIが8時間でhPIに変換された。予期せぬことにMet(O)−Arg−hPI変換実験について同様の結果が見られた;即ち、hPIが生成した。両基質の切断速度は類似していた。ウシDAP−IがhPIのMet(O)−X−誘導体(XはArg、PheおよびTyr)を切断することができないようであるので、この結果は意外であった。さらに逆層分析により、Met−Argジペプチドは基準のMet−Argジペプチドとの比較によりMet−Arg−hPIから放出され、またMet(O)−Argジペプチドとなり得るMet(O)−Arg−hPI基質を用いた実験についてピークはMet−Argジペプチドの領域に現れることが判明した。酸化型Met(O)−X基質を切断するdDAPの能力は、この切断を行うことができない酵素を凌ぐ明確なプロセシングの利点を有している。
【0038】
E.Met−Argヒトプロインスリン類似体の変換
さらにdDAP酵素を用いて、折り畳まれたMet−Argプロインスリン類似体(B28 Lys、B29 Pro)ならびに折り畳まれたMet−Argプロインスリン類似体(B10 Asp、B28〜B30を欠失)を効率よく変換した。これらの反応は、実質的にMet−Arg−hPIの変換の説明において示した方法に従って行った。
Claims (7)
- ジクチオステリウム・ジスコイデウムから単離された至適pH約3.5を有する約225キロダルトンのジペプチジルアミノペプチダーゼ。
- ジクチオステリウム・ジスコイデウムの培養から請求項1に記載のジペプチジルアミノペプチダーゼを単離する方法であって、
a)培養液から細胞を含まない培地を得、
b)該培地をアニオン交換クロマトグラフィーにかけ、
c)工程b)からの溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけ、そして
d)工程c)からの溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーにかける
ことを含む方法。 - 前駆体ポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを除去する方法であって、前駆体ポリペプチドからアミノ末端ジペプチドを順次除去するジペプチジルアミノペプチダーゼの作用を可能にするに十分な条件下に前駆体ポリペプチドを請求項1に記載のジペプチジルアミノペプチダーゼと接触させることを含む方法。
- 前駆体ポリペプチドが、ヒトプロインスリンの前駆体、ヒト成長ホルモンの前駆体、およびヒトプロインスリンのアナログの前駆体から選択される請求項3に記載の方法。
- 前駆体ポリペプチドが、ヒトプロインスリンのアナログ前駆体である請求項3に記載の方法。
- ヒトプロインスリンのアナログ前駆体が[LysB28,ProB29]−Met−Arg−プロインスリンである請求項5に記載の方法。
- ヒトプロインスリンのアナログ前駆体が[LysB28,ProB29]−Met−Tyr−プロインスリンである請求項5に記載の方法。
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