PT98813B

PT98813B - Processo para a preparacao de peptidos por sintese em fase solida

Info

Publication number: PT98813B
Application number: PT98813A
Authority: PT
Inventors: Jochen Knolle; Wolfgang Konig; Gerhard Breipohl
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1991-08-29
Publication date: 1999-01-29
Also published as: TW295589B; ZA916848B; PT98813A; NO300216B1; AU646488B2; FI102380B1; PL167504B1; JPH04230697A; FI914064A0; HU208838B; IL99338A0; NO913396D0; IE913051A1; DK0475184T3; AU8340291A; EP0475184A1; FI914064A; FI102380B; SK280319B6; CZ282881B6

Description

DESCRIÇÃO

A invenção refere-se a um processo para a preparação de péptidos com amida de azaaminoãcido C-terminal por meio de síntese em fase sólida.

É objectivo da invenção desenvolver um processo pobre em racemização para a preparação de péptidos com amidas de azaaminoãcido C-terminais por meio de síntese em fase sólida.

Conseguiu-se atingir esse objectivo, de acordo com a invenção, através do processo para a preparação de péptidos de fórmula geral I (X)_n-A-NH₂ (I), na qual

X significa um aminoácido natural ou não natural, um azaaminoãcido ou um iminoãcido,

n significa um número inteiro de 1 a 50, de preferência de 1 a 30, e

A significa um azaaminoácido, bem como dos respectivos sais fisiologicamente assimiláveis, ca racterizado por se transformar um espaçador (spacer) numa for ma acilável, fazer reagir esta com um derivado de ácido fórmico apropriado e, em seguida, com uma hidrazida de aminoácido adequada, se transformar, conforme o caso o grupo protector num gru po protector lábil perante bases ou ácidos fracos, se acoplar o espaçador assim obtido a uma resina, se construir o péptido desejado passo a passo a partir do extremo C-terminal, se remover por fim o péptido da resina e se transformar, conforme o caso, nos respectivos sais fisiologicamente assimiláveis.

Os aminoácidos naturais ou não naturais podem, caso sejam quirais, existir na forma D ou L. Preferem-se os X-aminoácidos. Como exemplos, referem-se os seguintes:

Aad, Abu, yAbu, ABz, 2ABz, Aca, Ach, Acp, Adpd, Ahb, Aib,

Aib, Ala, Ala, Ala, Alg, All, Ama, Amt, Ape, Apm, Apr, Arg,

Asn, Asp, Asu, Aze, Azi, Bai, Bph, Can, Cit, Cys, (Cys)2/ Cyta, Daad, Dab, Dadd, Dap, Dapm, Dasu, Djen, Dpa, Dct, Fel, Gin, Glu, Gly, Guv, hAla, hArg, hCys, hGln, hGlu, His, Hlle, hlle, hLeu, hLys, hMet, hPhe, hPro, hSer, hThr, hTrp, hTyr, Hyl, Hyp, 3Hyp, Lie, Ise, Iva, Kyn, Lant, Lcn, Leu, Lsg, Lys, Lys, Lys, Met,

Mim, Min, nArg, Lie, Nva, Oly, Orn, Pan, Pec, Pen, Phe, Phg,

Pic, Pro, Pro, Pse, Pya, Pyr, Pza, Qin, Ros, Sar, Sec, Sem,

Ser, Thi, Thi, Thr, Thy, Thx, Tia, Tle, Tly, Trp, Trta, Tyr,

Val, Nal, Tbg, Npg, Cha, Chg, Thia(vidé p. ex. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band XV/1 e 2, Stuttgart, 1974).

Os azaaminoãcidos são derivados de aminoácidos naturais ou não naturais nos quais o elemento central - CMR - ou -CH₂ - estã substituido por -NR- ou -NH-. Referem-se como exem pio azaglicina, azavalina, azalencina, azaisoleucina e azafanil alanina.

Por aminoácidos entendem-se em geral aminoãci2

dos naturais ou não naturais, cujo grupo amino se encontra monos substituído . Referem-se em especial neste contexto compostos substituídos por alquilo-C^-Cg, que por sua vez pode ser monoou di-insaturado e que pode estar substituído por até 3 grupos iguais ou diferentes de entre a série mercapto, hidroxilo, alcooxilo-C., -C_, carbamoilo, alcanoiloxi-C-, -C_o, carboxilo, alcoo1 / lo xi-C^-C^-carbonilo, F, Cl, Br, I, amino ou amidino que, conforme o caso, pode estar substituído por um, dois ou três grupos alquilo-C^-Cg; guanidino que pode estar substituído, conforme o caso, por um ou dois grupos benziloxicarbonilo ou por um, dois, três ou quatro grupos alquilo-C^-C_o; alquilamino-C., -C_; dialquilamino-C₁-C₇; alcoxi-C₁-Cg-carbonilamino; arilalcooxi-C₇-C₁₅-carbonilo; arilalcooxi-C^-C^^-carbonilamino, fenil-alcooxilo^-^ι^-0^; 9-fluorenilmetoxicarbonilamino; alquilsulfonilo-C^-Cg; alquilsulfinilo-C^-Cg; alquiltio-C^-Cg; hidroxiamino; hidroximi no; sulfamoilo.

Referem-se além disso heterociclos de entre o seguinte grupo:

ácido pirrolidina-2-carboxílico; ãcido piperidina-2-carboxílico; ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico; ãcido deca-hidroisoquinolina-3-carboxílico; ãcido octa-hidroindole-2-carboxílico; ácido deca-hidroquinolina-2-carboxílico; ácido octa-hidrociclopenta[b]pirrole-2-carboxílico; ácido-2-azabiciclo[2.2.2]octano-3-carboxílico; ãcido 2-azabiciclo[2.2.1]heptano-3-carboxílico; ãcido 2-azabiciclo[3.1.0]hexano-3-carboxilico; ãcido 2-azaespiro[4.4]nonano-3-carboxílico; ácido 2-azaespiro[4.5]decano-3-carboxílico; ãcido espiro(biciclo[2.2.1]heptano)-2,3-pirrolidina-5-carboxílico; ácido espiro(biciclo[2.2.2]octa no)-2,3-pirrolidina-5-carboxílico; ãcido 2-azatriciclo[4.3.0.

I⁶'⁹]decano-3-carboxílico; ãcido deca-hidrociclo-hepta[b]pirrole-2-carboxílico; ãcido octa-hidrociclo[c]pirrole-2-carboxílico; ácido octa-hidroisoindole-l-carboxílico; ãcido 2,3,3a,4,6a-hexa -hidrociclopenta[b]pirrole-2-carboxílico; ãcido 2,3,3a,4,5,7a-hexa-hidroindole-2-carboxílico; ãcido tetra-hidrotiazole-4-car boxílico; ãcido isoxizolidina-3-carboxílico; ãcido pirazolidina -3-carboxílico; ãcido hidroxiprolina-2-carboxílico; podendo todos eles, conforme o caso, estar substituídos:

Por sais de compostos de fórmula I entendem-se em especial sais farmacologicamente aceitáveis ou não tóxicos. Referem-se em particular sais alcalinos ou alcalinoterrosos, sais com aminas fisiològicamente assimiláveis e sais com ácidos inorgânicos ou orgânicos como p. ex. HCl, HBr, H^O^, H^PO^áci do maleico, ãcido fumárico, ãcido cítrico, ácido tartárico e ãci do acético.

processo de preparação efectua-se vantajosamente fazendo reagir um composto de fórmula II

(II)

na qual

2 3 4 5

Y , Y , Y , Y e Y significam hidrogénio, alquilo-C^-C^, alcoOXilo-C.-C. ou -0-(CH_o) -COOH, -(CH„) -COOH ou -NH-CO-(CH„) j-4 z η δ η z. n

-COOH, podendo os grupos ser iguais ou diferentes, e sendo pelo menos um dos grupos -0-(CH₂)_n“COOH, -(CH₂)_n~COOH ou -NH-CO-(CH₂)_n~C00H, n é um número inteiro de 1 a 6, de preferência de 1 a 3, e

R^x significa hidrogénio ou alcooxi-C^-Cg-arilo-Cg-C^₂, de preferência 4-metoxifenilo, com um agente de sililação, por exemplo cloreto de ter-butildimetilsililo, cloreto de ter-butilfenilsililo, trimetilclorosila no, em especial trimetilclorosilano, num solvente apropriado, como p. ex. THF, acetonitrilo, cloreto de metileno, dimetilformamida ou misturas destes, e transformando em seguida o composto sililado, com um derivado do ácido clorofórmico, em especial com os respectivos ésteres substituídos, em compostos de fórmula III r²ooc-

(III) na qual

112 3

R , Y , Y , Y , .2

5.

Y e Y se definem como anteriormente, e

R significa um grupo arilo-C^-C^r substituido por grupos electroatractores, de preferência nitro e halogéneo, por exemplo F ou Cl, fazendo reagir os compostos de fórmula III assim obtidos com uma hidrazida de aminoácido, de fórmula IV

R³-X-CO-NH-NH-R⁴ (IV) na qual

X significa um aminoácido natural ou não natural ou um iminoãcido, e se define como anteriormente, e um grupo protector lábil em relaçao a bases ou labil em re lação a ácidos fracos ou ã hidrogenação, como p. ex. um grupo protector uretano (vidé p. ex. Hubbuch, Kontakte (Merck) 1979, NQ 3, pág. 14-23), e significa alquilo-C^-Cg, cicloalquilo-Cg-Cg, arilo-Cg-C^, aril-Cg-C^-alquilo-C^-Cg, heteroarilo ou heteroaril-alquilo ^-<21^_<28 °^u hidrogénio, num solvente no qual sejam solúveis os compostos de fórmulas III e IV, como p. ex. DMF, obtendo-se um composto de fórmula V

(V) na qual

134 1234 5

R , R , R e Υ , Υ , Υ , Y eY se definem como anteriormente, ,

no caso de R ser um grupo protector labil em relaçao a hidroge nação, de preferência benziloxicarbonilo, removendo este grupo protector por hidrogenação sobre um catalisador de Pd, e se transformar este grupo protector antes da reacção seguinte num grupo protector uretano lábil em relação a bases, de preferência Fmoc, ou num grupo protector lábil em relação a ácidos fracos, de preferência Bpoc, e acoplando o composto de fórmula V,

4 1 2 3 4 5 em que R,R,Y,Y,Y,Y eY possuem os significados aci3 ma mencionados e R significa um grupo protector uretano labil em relação a bases ou a ácidos fracos, com os reagentes de acoplamento usuais em química peptídica, através dos grupos -O“(CH₉) -COOH, -(CH ) -COOH ou -NH-CO-(CH) -COOH, a uma resi2a ií 2a li 2a ϋ na, removendo o grupo protector R , acoplando passo a passo ami noácidos, iminoácidos ou azaaminoácidos naturais ou não naturais eventualmente na forma de derivados activados, temporariamente protegidos por grupos aminoprotectores lábeis em relação a bases ou a ácidos fracos e, após a construção, libertando da resina os péptidos de fórmula I por tratamento com um ácido médio, removendo simultaneamente ou por processos adequados os grupos protectores de cadeia lateral temporâriamente introduzidos.

Os compostos de fórmula IV preparam-se por reacção de aminoácidos naturais ou não naturais ou iminoácidos com hidrazidas adequadas de acordo com métodos de acoplamento usuais em química peptídica.

Os grupos alquilo podem ser de cadeia linear ou ramificados. 0 mesmo se aplica a grupos deles derivados, como p. ex. alcooxilo, alquiltio, alquilamino, dialquilamino e al canoilo. Em particular, alquilo é alquilo-C^-C^.

Por cicloalquilo entendem-se também anéis alquil-substituidos, como p. ex. 4-metilciclohexilo ou 2,3-dimetilciclopentilo.

Halogéneo é flúor, cloro, bromo ou iodo, em es-

Arilo-C2^_C^2 ® por exemplo fenilo ou naftilo, de preferência fenilo. Heteroarilo representa um anel aromático monocíclico de 5 a 7 membros ou bicíclico de 8 a 10 membros, que pode estar anelado a um anel benzénico, que pode conter como he teroelementos um, dois, três ou quatro átomos de N, O, S ou gru pos NO, SO, SO2, que pode estar substituido por 1 a 6 grupos hi droxilo, ou por um, dois ou três grupos iguais, ou diferentes de entre a série F, Cl, Br, I; hidroxilo, mono-, di- ou tri-hidroxialquilo-C^-C^; trifluorometilo; formilo; carboxamido; monoou di-alquil-C^-C^aminocarbonilo; nitro; alcooxilo-C₁~C₇, alquilo-C^-C^; alcooxi-C^-C^-carbonilo; amino; alquil-C^-C^-amino; di-alquil-C^-C^-amino; carboxilo; carboximetoxi; aminoalquilo^-C1^-C7' ^al^<3^u;*-i“^ci''^C7^-ami^noai^<I^uii^o_ci^-C7 7 dialquil-C^-C^-aminoal quilo-C^-C^; alcooxi-C^-C^-carbonilmetoxi; carbamoilo; sulfamoi lo; alcooxi-C^-C^-sulfonilo; alquil-C^-Cg-sulfonilo; sulfoalqui lo-C^-Cg; guanidinoalquilo-C^-Cg e alcooxi-C^-Cg-carbonilo e/ou mono-, di ou tri-substituido por oxo. Referem-se em especial: furilo, tienilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tetrazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, indolilo, isoindolilo, indazolilo, ftalazinilo, quinolilo, isoquinolilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolilo, P> -carbolini-tlo, ou um derivado benzanelado destes grupos.

Caso seja necessário para evitar reacções secundárias ou para a síntese de péptidos especiais, protegem-se adicionalmente os grupos funcionais na cadeia lateral dos amino ácidos, azaaminoácidos ou iminoácidos por meio de grupos protectores adequados (vide p. ex. T.W.Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, New York, John Xiley & Sons, 1981; Hubbuch, Kontakte (Meck) 1979, NQ 3, pág. 14-23; Bullesbach, Kontakte (Merck) 1980, NQ 1, pág. 23-25), utilizando-se em primeira linha Arg(Tos), Arg(Mts), Arg(Mtr), Arg(Pmc), Asp(OBzl), Asp(OtBu),

Cys(4-MeBzl), Cys((Acm), Cys(StBu), Glu(OBzl), Glu(OtBu), His(os), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser(tBu), Thr(Bzl), Thr(tBu). Os grupos funcionais na cadeia lateral podem ainda estar glicosilados, como p. ex. na EP-A 263 521 HOE 86/F253) se encontra descrito.

As resinas utilizadas como material de suporte encontram-se disponíveis comercialmente ou podem preparar-se, como p. ex. as resinas de álcool alcooxibenzílico, as resinas de aminometilo ou as resinas de benzidrilamino. Preferem-se as resinas de aminometilo, benzidrilamino (BHA) e metilbenzidrilamino (MBHA). A carga determina-se por análise de aminoácidos e/ou análise elementar.

Por espaçadores (Spacers) apropriados entendem -se por exemplo os espaçadores descritos por Atterton, Sheppard em Perspectives in Peptide Chemistry, pág. 101.117 (Karger, Ba sileia, 1981); EP-A 264 802 (HOE 86/F 259), EP-A 287 882 (HOE 87/F 101) e EP-A 322 348 (HOE 87/F 386k), bem como seus derivados, como por exemplo aqueles a que-se removeu o grupo protector. Preferem-se a 4-carboxilatopropoxi-4'-metoxibenzidrilamina e a 5-carboxilatoetil-2,4-dimetoxi-4'-metoxibenzidrilamina.

Como reagentes de acoplamento para o espaçador de fórmula V e os restantes derivados de aminoácido podem utili zar-se todos os agentes activantes possíveis em síntese peptidi ca, vide p. ex. Houben-weyl, Methoden der Organischen Chemie, Vol XV/2, Stuttgart 1974, mas especialmente carbodiimidas, como p.ex. N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida, N,N-diisopropilcarbodiimida ou N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. O acopla mento pode fazer-se directamente à resina por adição do derivado de aminoácido ao reagente de activaçâo e eventualmente de um aditivo que evite a racemização, como p. ex. 4-dimetilaminopiri dina, 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) (W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970), 788-798) ou 3-hidroxi-4-oxo-3,4-di-hidrobenzotriazina (HOObt) W. Konig, R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1970), 2034-2040) , ou então efectuar-se separadamente a pré-activação do derivado de aminoácido na forma de anidrido simétrico ou éster de HOBt ou HOObt e adicionar-se a solução da espécie activa da num solvente apropriado â resina peptidica para acoplamento.

acoplamento ou activação do espaçador de fór mula V e dos derivados de aminoácido com um dos reagentes de ac tivação atrás mencionados pode efectuar-se em dimetilformamida ou em cloreto de metileno ou numa mistura destes dois solventes. 0 derivado de aminoácido activado utiliza-se habitualmente num excesso de 1,5 a 4 vezes. Nos casos em que ocorre um acoplamento incompleto, repete-se a reacção de acoplamento, sem efectuar primeiro o desbloqueamento do grupo Oó-amino da resina peptídica necessário ao acoplamento do aminoácido seguinte.

decurso da reacção de acoplamento pode testar-se por meio da reacção com ninidrina, como descrito p. ex. por E. Kaiser et al. (Anal. Biochem. 34(1970)595). A síntese po de também efectuar-se de forma automatizada, p. ex. com um sintetizador peptídico modelo 430A da firma Applied Biosystems, po dendo utilizar-se o programa de síntese sugerido pelo fornecedor ou um outro preparado pelo utilizador. Este último caso é o mais frequente quando se empregam derivados de aminoácidos protegidos pelo grupo Fmoc.

A remoção da amida peptídica da resina efectua -se por tratamento com ácidos médios usualmente utilizados em síntese peptídica (p. ex. ãcido trifluoroacético), adicionando-se como captores catiónicos substâncias como fenol, cresol, tio cresol, anisole, tioanisole, etanoditiol, sulfureto dimetílico, sulfureto etilmetílico ou outros captores aniónicos análogos usu ais em síntese em fase sólida, isoladamente ou em mistura de dois ou mais destes aditivos. O ácido trifluoroacético pode tam bém empregar-se diluido em solventes apropriados, como p. ex. cloreto de metileno.

Durante a remoção do espaçador da^ resina ocorre simultaneamente a remoção dos grupos ptotectores da cadeia lateral.

A purificação dos péptidos brutos assim obtidos efectua-se por meio de cromatografia em ^ephadex, resinas de permuta iónica ou por HPLC.

Prefere-se um processo de síntese em fase sóli da para a preparação de Ac-D-Nal(2)-p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (ít-L-Rha) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NH₂ e pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-(tBu)-Leu-Pro-Azagly-NH₂ (Zoladex).

Lista das abreviaturas utilizadas:

BSA Bistrimetilsililacetamida

Cha Ciclo-hexilalanina

Chg Ciclo-hexilglicina

DCC Diciclo-hexilcarbodiimida

DIC Diisopropilcarbodiimida

DMAP Dimetilaminopiridina

Fmoc 9-Fluorenilmetoxicarbonilo

HOBt 1-Hidroxibenzotriazole

HOObt 3-Hidroxi-4-oxo-3,4-di-hidro-l,2,3-benzotriazina Nal Naftilalanina

Npg Neopentilglicina

Pmc 2,2,5,7,8-Pentametilcromano-6-sulfonilo

Tbg Ter-butilglicina

THF Tetra-hidrofurano

Thia 2-Tienilalanina

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a presente invenção, sem contudo a limitarem.

Exemplo 1 la) 5-carboxilatoetil-2,4-dimetoxi-4'-metoxibenzidrilamina

Dissolveram-se 1,75 g de oxima de 5-carboxilatoetil-2,4-dimetoxi-4¹-metoxibenzofenona em 450 ml de uma mistu ra 1:1 de etanol e DMF e adicionou-se 2 ml de nH^ concentrado. Após adição do catalisador Pt/C procede-se â hidrogenação à pres são normal durante 5 dias. Terminada a reacção filtrou-se o catalisador, concentrou-se o filtrado e precipitou-se o produto com éter. Utilizou-se o produto nesta forma sem posterior purificação.

Ib) N-(p-nitrofeniloxicarbonil)-5-carboxilatoetil-2,4-dimetoxi-4¹-metoxibenzidrilamina

Colocaram-se 10 g do composto do ί titulo do exemplo la) em 100 ml de uma mistura de THF/DMF 4:1 e fez-se re agir, à temperatura ambiente com 2,1 equivalentes de bistrimetilsililacetamida (BSA). A suspensão clarificou completamente após pouco tempo e agitou-se a solução límpida durante mais 2 horas. Adicionaram-se então 3 g de éster nitrofenílico do ãcido clorofórmico e agitou-se durante mais uma hora. Terminada a reacção removeu-se o solvente em alto vácuo. Misturou-se o resíduo com 300 ml de água e extraiu-se o óleo resultante com aceta to de etilo. Lavou-se a fase de acetato de etilo com uma solu-.. ção IN de KHSO^ e com água. Secou-se a fase orgânica sobre MgSO^ e evaporou-se â secura. Caracterizou-se o resíduo (12 g) por NMR , IV e MS.

A N-(p-nitrofeniloxicarbonil)-5-carboxilatoetil-2,4-dimetoxi-4’-metoxibenzidrilamina transformou-se em seguida com hidrazidas de aminoácido nos derivados substituídos adequados.

Ic) Benziloxicarbonil-4-propilazoglicil-(5-carboxilatoetil-2,4-dimetoxi-4’-metoxibenzidril)amida

Dissolveram-se 3,27 g de cloridrato de benzilo xicarbonilpropil-hidrazida e 6,94 g do composto do título do exemplo lb) em 40 ml de dimetilformamida (DMF) e fez-se reagir com 3 equivalentes de N-etilmorfolina e uma quantidade catalíti ca de dimetilaminopiridina (DMAP). Deixou-se reagir durante 16 horas. Terminada a reacção evaporou-se à secura. Tomou-se o resíduo em acetato de etilo/butanol e lavou-se a fase orgânica com uma solução saturada de NaHCOg, com uma solução IN de KHSO^ e com água. Secou-se a fase orgânica sobre MgSO^ e, após filtra ção, evaporou-se à secura. Recristalizou-se o resíduo do acetato de etilo puro. Obtiveram-se 6,6 g do composto do título.

• FAB-MS: 641(M+Li⁺) . IV: CO 1695 cm¹

^H-NMR(DMSO): J =3,7 s (6H, OCH₃) ppm ld) 9-Fluorenilmetoxicarbonil-L-prolilazaglicil-(5-carboxilato etil-2,4-dimetoxi-4¹-metoxibenzidril)amida

Dissolveram-se 26,5 g do composto do título do exemplo lc) em 300 ml de metanol e fizeram-se reagir com 2 g de catalisador de Pd. Após uma hora a hidrogenação estava completa. Filtrou-se o catalisador e concentrou-se o filtrado até à secura. Sem mais purificação, tomou-se o resíduo (17,5 g) numa mistura de 80 ml de água de dioxano e fez-se reagir com 8 g de hidrogenocarbonato de sódio e 17 g de fluorenilmetoxicarbonil-N-hidroxi-succinimida (Fmoc-ONsu). Deixou-se reagir durante um dia. Terminada a reacção filtrou-se a mistura reaccional. Ajustou-se o pH do filtrado a 6 com H₂^°4 e evaporou-se em vácuo até um volume de 80 ml. Diluiu-se com 100 ml de água e extraiu-se com uma mistura de acetato de etilo/n-butanol (8,5:1,5). La vou-se a fase orgânica com uma solução de NaCl semiconcentrada e evaporou-se depois à secura. Filtrou-se o resíduo através de 500 g de sílica gel com acetato de etilo. Obtiveram-se 20 g do composto do título.

FAB-MS: 729(M+Li⁺)

IV: CO 1695 cm¹.

le) Acoplamento do composto do título do exemplo ld) a uma resina de poliestireno

Suspenderam-se 1,0 g de uma resina de aminometilpoliestireno (carga 1,07 mmol) e 1,2 g do composto do título do exemplo ld) em 10 ml de dimetilformamida e fizeram-se reagir com 216 mg de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) e 0,75 ml de diisopropilcarbodiimida (DIC). Deixou-se reagir durante a noite até o teste da ninidrina revelar uma reacção completa. Filtrou-se a resina e lavou-se com dimetilformamida e cloreto de metileno, e secou-se em vácuo. A carga da resina com prolina era de 0,51 mmol/g.

f) Ac-D-Nal (2) -p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (ôí-L-Rha) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NH₂

Removeu-se o grupo N- ^--aminoprotector 9-fluoroenilmetoxicarbonilo do composto do exemplo le) com uma solução a 20% de piperidina/dimetilformamida (2x3 min., 2x8 ml). Em seguida lavou-se a resina com N-metilpirrolidona (5x10 ml) e construiu-se o péptido na resina (785 mg da resina do exemplo lc)), efectuando ciclicamente os passos seguintes:

- Remoção do grupo protector Fmoc com piperidina a 20% em DMF

- Lavagem da resina com DMF/N-metilpirrolidona

- Acoplamento do Fmoc-aminoãcido por activação in situ na forma de éster de HOBt utilizando diisopropilcarbodiimida como reagente de activação (1,5 mmol de aminoácido; 2,25 mmol de HOBt; 1,6 mmol de diisopropilcarbodiimida).

Nos casos em que o acoplamento foi incompleto (teste de Kaiser) repetiu-se o passo de acoplamento. Como último aminoácido utilizou-se Fmoc-D-Na(2)-OH. O grupo acetilo N-terminal introduziu-se por reacção com anidrido acético.

Terminada a síntese em fase sólida lavou-se a resina (DMF, CH₂C1₂) e secou-se. Obtiveram-se 1,35 g de resina substituída.

Suspendeu-se a resina seca, à temperatura ambiente, em 0,75 ml de etanoditiol. Após 15 minutos adicionaram-se 7,5 ml de ácido trifluoroacético e agitou-se a suspensão du rante 1 hora e meia. Passado este tempo filtrou-se a resina e lavou-se com ácido trifluoroacético a 80%. Evaporou-se o filtra do em vácuo e tomou-se em 30 ml de água. Por adição de NaHCOg ajustou-se o pH a 6-7 e agitou-se o péptido com n-pentanol (4x 30 ml). Evaporou-se a fase de n-pentanol e tomou-se o resíduo em 10 ml de metanol/H₂0(9:1) e adicionou-se-lhe 0,5 g de i^CO^. Agitou-se durante 30 minutos, filtrou-se e concentrou-se o filtrado. Tomou-se o resíduo em 100 ml de n-pentanol e lavou-se a fase orgânica com água. Após secagem com HgSO^ e filtração, eva

porou-se a fase orgânica. Obtiveram-se 740 mg de produto bruto. Após cromatografia em Sephadex G25 (ácido acético 1M) e em sílica gel, obtiveram-se 185 mg do composto do título puro. FAB-MS:1531(M+H⁺).

Claims

REIVINDICAÇÕES

- 19 Processo para a preparação de péptidos de fórmula geral I (X)_n - A - NH₂ (I) , na qual

X significa um aminoácido natural ou nao natural, um azoaminoãcido ou um iminoãcido n significa um número inteiro de 1 a 50, de preferência de 1 a 30, e

A significa um azoaminoãcido, bem como dos respectivos ácidos fisiologicamente assimiláveis, caracterizado por se transformar um espaçador (Spacer) numa forma acilãvel, fazer reagir esta com um derivado de ácido fórmico apropriado e em seguida com uma hidrazina de aminoácido ade quada, se transformar conforme o caso, o grupo protector num gru po protector lábil perante bases ou ácidos fracos, se acoplar o espaçador assim obtido a uma resina, se construir o péptido desejado passo a passo a partir do extremo C-terminal, se remover por fim o péptido da resina e se transformar, conforme o caso, nos respectivos sais fisiologicamente assimiláveis.

Processo de acordo com a reivindicação 1, racterizado por se fazer reagir um composto de fórmula II cana qual
2 3 4 5

Y , Y , Y e Y significam hidrogénio, alquilo-C^-C^, alcooxilo-C.-C. ou -O“(CH„) -COOH, -(CHJ -COOH ou -NH-CO- (CH_o) j.4 z n z n zn

-COOH, podendo estes grupos ser iguais ou diferentes, sendo contudo pelo menos um grupo -0-(C^)_n~COOH, -(CH2)_n-C00H ou -NH-CO-(CH₂)_n-COOH, n ê um número inteiro de 1 a 6, e significa hidrogénio ou alcooxilo-C^-Cg-arilo-Cg-C^2, comum reagente de sililação num solvente apropriado para esse fim e se transformar em seguida o composto sililado, com um derivado do ácido clorofórmico, em compostos de fórmula III

R 00C- (III) na qual r1, Υ”', Y^, γ\ γ⁴ _e Υ^ se definem como anteriormente, e 2

R significa um grupo arilo-C^-C^^r que se encontra substituído por substituintes electroatractores, de preferência nitro e halo, se fazer reagir os compostos de fórmula III assim obtidos com uma hidrazina de aminoácido, de fórmula IV

R³ - X - CO - NH - NH - R⁴ (IV) na qual

X significa um aminoácido natural ou não natural ou um iminoácido, definido como anteriormente,

3 . . .

R significa um grupo protector labil em presença de bases ou de ácidos fracos ou em relação â hidrogenação, e

R significa alquilo-C^-Cg, cicloalquilo-Cg-Cg, arilo-Cg-C₁₂, aril-Cg-C₁₂-alquilo-C₁-Cg, heteroarilo ou heteroaril-alquilo-C^-Cg ou hidrogénio, num solvente apropriado, obtendo-se compostos de fórmula V mencionados,

- 2§ - (II)
3 , no caso de R ser um grupo protector labil em relaçao a hidroge nação, se remover este grupo protector por hidrogenação sobre um catalizador de paládio e, antes da reacção seguinte, se transfor mar num grupo protector uretano lábil em relação a bases ou a áci dos fracos, e em seguida se acoplar o composto de fórmula V, em 1 4 1 2 3 4 5 que R , R , Y , Y , Y , Y eY possuem os significados acima 3 mencionados e R significa um grupo protector uretano labil em relação a bases ou a ácidos fracos, com os reagentes de acoplamento usuais na química dos péptidos, a uma resina, através dos grupos -O-(CH„) -COOH, -(CH„) -COOH ou -NH-CO-(CH„) -COOH, se η. 2 Tí Ώ remover o grupo protector . .R , se acoplarem passo a passo aminoácidos, iminoácidos ou azaminoácidos naturais ou não naturais, eventualmente na forma de derivados activados, temporariamente protegidos por grupos aminoprotectores lãbeis em relação a bases ou a ácidos fracos e, terminado o acoplamento, se libertarem da resina os péptidos de fórmula I por tratamento com um ácido médio, removendo-se também simultaneamente ou por meio de processos específicos os grupos protectores de cadeia lateral temporariamente introduzidos.

- 3ã Processo de acordo com qualquer das reivindica ções 1 ou 2, caracterizado por se preparar o péptido Ac-D-Nal(2) -p-Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Ser ( <0(-L-Rha) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NH₂.

- 4ã Processo de acordo com qualquer das reivindica ções 1 ou 2, caracterizado por se preparar o péptido pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-(tBu)-Leu-Arg-Pro-Azagly-NH^.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 30 de Agosto de 1990, sob o N° P 40 27 394.6.