PT973534E - Composições farmacêuticas tendo actividade supressora do apetite - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS TENDO ACTIVIDADE SUPRESSORA DO APETITE"

Esta invenção relaciona-se com a utilização de um extracto de planta feito de plantas do grupo que compreende o género Trichocaulon e o género Hoodia e tendo actividade supressora do apetite. 0 extracto pode ser preparado de material vegetal, tal como os caules e as raizes das referidas plantas do género Trichocaulon ou do género Hoodia. 0 género Trichocaulon e o género Hoodia incluem plantas suculentas que se desenvolvem em regiões áridas, tais como as encontradas no Sul da África. Numa aplicação da invenção, o extracto activo supressor do apetite é obtido da espécie Trichocaulon piliferum. A espécie Trichocaulon officinale também pode ser utilizada para proporcionar um extracto activo supressor do apetite. Noutra aplicação da invenção, o extracto activo supressor do apetite pode ser obtido das espécies Hoodia currorii, Hoodia gordonii ou Hoodia lugardii. Bioensaios conduzidos em ratos pelo Requerente indicaram que alguns dos extractos possuem actividade supressora do apetite. 0 material vegetal pode ser homogeneizado na presença de um solvente adequado, por exemplo, um solvente de metanol/cloreto de metileno, por meio de um dispositivo tal como um misturador Waring. A solução da extracção pode, então, ser separada do material vegetal residual por meio de um procedimento de separação apropriado tal como, por exemplo, filtração ou centrifugação. 0 solvente pode ser 2 removido por meio do evaporador rotativo, de preferência num banho de água a uma temperatura de 60°C. O extracto em bruto separado pode, então, ser extraído adicionalmente, com cloreto de metileno e água antes de ser separado num extracto de cloreto de metileno e um extracto de água. O extracto de cloreto de metileno pode ter o solvente removido, de preferência, por meio de evaporação num evaporador rotativo e o extracto resultante pode ser purificado adicionalmente por meio de uma extracção com metanol/hexano. O produto da extracção com metanol/hexano pode, então, ser separado para dar um extracto de metanol e um extracto de hexano. O extracto de metanol pode ser evaporado para remover o solvente, a fim de dar um extracto activo parcialmente purificado. O extracto activo parcialmente purificado pode ser dissolvido em metanol e pode ser adicionalmente fraccionado por meio de cromatografia em coluna, utilizando sílica gel como um meio de adsorção e uma mistura de clorofórmio/metanol a 30% como eluente. Pode-se obter uma pluralidade de fracções diferentes e cada uma pode ser avaliada por meio de procedimentos de bioensaio adequados, para determinar a actividade supressora de apetite das mesmas.

Uma fracção com actividade supressora de apetite pode, de preferência, ser fraccionada adicionalmente, tal como por cromatografia em coluna, utilizando sílica gel como meio de adsorção e uma proporção de solvente 9:1 de clorofórmio:metanol e as sub-fracções resultantes podem ser submetidas a bioensaio para avaliar a sua actividade supressora de apetite. Uma sub-fracção que apresenta actividade supressora de apetite pode, se desejado, ser 3 adicionalmente fraccionada e purificada utilizando convenientemente um procedimento cromatográfico em coluna com sílica gel como meio de adsorção e um solvente numa proporção de 9:1 de acetato de etilo:hexano. As fracções purificadas resultantes podem ser novamente avaliadas por meio de procedimentos de bioensaio adequados para verificar a sua actividade supressora do apetite. O Requerente verificou que, pelo menos uma destas fracções purificadas tem boa actividade supressora do apetite e o principio activo na fracção foi identificado por meio de técnicas quimicas convencionais incluindo a ressonância magnética nuclear e verificou-se ser um composto da fórmula estrutural

(li

De acordo com a nomenclatura S.I. o princípio activo (1) é o composto 3-0-[β-D-tevetopirano-sil-(1—>4)-β-D-cimaropiranosil- (1—>4)-β-D-cimaropiranosil]-12β-0-^ρ1οί1οχί-14-1ι.ίάηοχί-14β-ρηθρη-5 0-θη-2 0-οη3 (C47H74O15 M+878) . O composto (1) é um composto novo e este trissacárido esteroidal tem propriedades supressoras do apetite.

Deste modo, a presente invenção proporciona, num primeiro aspecto, a utilização na preparação de um 4 medicamento tendo actividade supressora do apetite para tratar, prevenir ou combater a obesidade de um ser humano ou animal, de um extracto de uma planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia, cujo extracto contém uma quantidade eficaz de um glicósido esteroidal supressor do apetite da referida planta, em que o glicósido esteroidal tem a fórmula

A presente invenção proporciona, num segundo aspecto, um método não terapêutico para reduzir a ingestão calorífica total de um ser humano ou animal, o método compreendendo administrar ao referido ser humano ou animal um alimento ou bebida compreendendo um extracto de uma planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia, cujo extracto contém uma quantidade eficaz de um glicósido esteroidal supressor do apetite da referida planta, em que o glicósido esteroidal tem a fórmula (1), conforme indicado acima. 0 extracto pode ser obtido, por exemplo, por meio de um processo que inclui os passos de tratar o material vegetal com um solvente para extrair uma fracção com actividade supressora do apetite, separar a solução de extracção do resto do material vegetal, remover o solvente da solução de extracção e recuperar o extracto. 5 0 extracto pode ser obtido, por exemplo, por um meio de processo que inclui os passos de prensar o material vegetal para separar a seiva do material vegetal sólido e recuperar a seiva livre do material vegetal sólido para formar o extracto. A planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia pode, por exemplo, ser seleccionada das espécies Trichocaulon piliferum e Trichocaulon officinale e a planta do género Hoodia pode, por exemplo, ser seleccionada das espécies Hoodia currorii, Hoodia gordonii e Hoodia lugardii. A planta pode ser seleccionada, por exemplo, de

Hoodia currorii, Hoodia gordonii e Hoodia lugardii. Num exemplo, a planta é Hoodia gordonii. 0 extracto da referida planta pode ser, por exemplo, um extracto em que, substancialmente, todas as impurezas não activas tenham sido removidas. 0 processo pode incluir, por exemplo, o passo de concentrar o agente activo no material extraido por meio da extracção adicional com um solvente. 0 solvente, no passo ou passos do processo de extracção com solvente pode ser, por exemplo, um ou mais de cloreto de metileno, água, metanol, hexano, acetato de etilo ou misturas destes. 0 processo pode incluir, por exemplo, o passo de concentrar o agente activo no material extraido por meio de separação cromatográfica. A separação cromatográfica pode 6 utilizar como eluente, por exemplo, um ou mais de clorofórmio, metanol, acetato de etilo, hexano ou misturas destes. 0 processo pode incluir, por exemplo, levar a cabo a separação cromatográfica numa coluna, colher o eluido da coluna em fracções, avaliar as fracções para determinar a sua actividade supressora do apetite e seleccionar a pelo menos uma fracção contendo o agente supressor do apetite.

No processo para se obter o referido extracto, o extracto pode ser processado, por exemplo, para formar um pó de fluidez livre. Por exemplo, o extracto pode ser seco para remover a humidade, por exemplo, por meio de secagem por pulverização, liofilização ou secagem a vácuo para formar um pó de fluidez livre. 0 extracto pode, por exemplo, ser incorporado numa composição ou formulação incluindo também outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Deste modo, o medicamento pode ser preparado, por exemplo, misturando uma composição tendo actividade supressora do apetite, compreendendo o referido extracto, com um excipiente, diluente ou veiculo farmacêutico.

Opcionalmente, o medicamento é preparado em forma de dosagem unitária. 0 agente supressor do apetite de fórmula (1) pode ser obtido, por exemplo, como um composto isolado (químico natural) da referida planta, nomeadamente uma planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia, por exemplo uma planta da espécie Trichocaulon piliferum ou Trichocaulon officinale ou da espécie Hoodia currorii, Hoodia gordonii ou Hoodia lugardii. 0 composto isolado pode ser processado 7 para proporcionar uma composição tendo actividade supressora do apetite compreendendo o composto (1) misturando o composto com um excipiente, diluente ou veiculo farmacêutico. Tal composição pode ser preparada, por exemplo, em forma de dosagem unitária. 0 composto de fórmula (1) pode, por exemplo, ser isolado e/ou purificado a partir de uma planta da espécie Trichocaulon piliferum ou Trichocaulon officinale ou da espécie Hoodia currorii, Hoodia gordonii ou Hoodia lugardii. 0 composto isolado e/ou purificado pode ser processado para proporcionar uma composição tendo actividade supressora do apetite compreendendo o composto (1) misturando o composto com um excipiente, diluente ou veiculo farmacêutico. Tal composição pode ser preparada, por exemplo, em forma de dosagem unitária. 0 composto de fórmula (1) pode, por exemplo, ser isolado e/ou purificado a partir de um extracto derivado de uma planta da espécie Trichocaulon piliferum ou Trichocaulon officinale ou da espécie Hoodia currorii, Hoodia gordonii ou Hoodia lugardii. 0 composto isolado e/ou purificado pode ser processado para proporcionar uma composição tendo actividade supressora do apetite compreendendo o composto (1) misturando o composto com um excipiente, diluente ou veiculo farmacêutico. Tal composição pode ser preparada, por exemplo, em forma de dosagem unitária. 0 agente supressor do apetite pode, por exemplo, ser um quimico natural isolado de formula:

8 Η MtO

GMe ΟΜβ <ι>. A composição ou formulação supressora do apetite pode consistir no agente supressor do apetite misturado com um excipiente, diluente ou veiculo farmacêutico. Outros aditivos adequados, incluindo um estabilizador e outros componentes deste tipo podem ser adicionados, conforme desej ado.

Deste modo, é possibilitado um método para suprimir o apetite por meio da administração a um ser humano ou animal de uma dosagem eficaz de uma composição, conforme descrito acima.

Deste modo, a invenção possibilita a utilização de um extracto obtido a partir de um material vegetal do género Trichocaulon ou Hoodia e contendo um glicósido esteroidal substancialmente puro de fórmula (1). A invenção também possibilita a utilização de um alimento ou bebida contendo uma quantidade eficaz do glicósido esteroidal de fórmula (1) para ter um efeito supressor do apetite quando ingerido.

Estudos de genética molecular conduziram a um aumento considerável na compreensão da regulação do apetite, 9 saciedade e peso corporal. Estes estudos revelaram muitas vias reguladoras centrais, mediadas por vários neuropéptidos. A manutenção de um peso corporal normal é conseguida por meio de um equilíbrio intricado entre a ingestão de energia, consumo de alimento e gasto de energia. A homeostase energética é submetida a uma ampla gama de influências, controladas, em última instância, pelo cérebro. Os diferentes sinais incluem sinais tais como o sentido do olfacto e d o paladar e sinais gastrointestinais, tais como a distensão do tracto gastrointestinal, sinais químicos para a mucosa gástrica e metabolitos transportados pelo sangue, tais como ácidos gordos e glucose.

Centralmente, o neuropéptido "Y" (NPY) que é regulado negativamente pela leptina, foi determinado como um dos reguladores positivos do comportamento alimentar. A expressão do antagonista endógeno para os receptores de melanocortina também demonstraram ser a base para a obesidade num modelo em particular (o murganho ob/ob). De facto, a deficiência no receptor da melanocortina MC4 replica completamente a síndroma da obesidade. Outros mediadores que demonstraram desempenhar papéis no equilíbrio da energia incluem a bombesina, a galonina e o péptido-1 similar a glucagon. A invenção e a sua eficácia serão agora melhor descritas, sem limitação do âmbito da invenção, com referência aos seguintes exemplos e desenhos.

Nos desenhos 10 a Figura 1 ilustra um fluxograma de um método geral de extrair um primeiro extracto supressor do apetite em bruto e um extracto supressor do apetite purificado de material vegetal do género Trichocaulon ou Hoodia; a Figura 2 ilustra uma representação gráfica de um bioensaio levado a cabo em ratos utilizando um extracto de metanol parcialmente purificado de Trichocaulon piliferum; as Figuras 3 e 4, em conjunto, ilustram uma representação esquemática de um processo para produzir um extracto de material vegetal do género Trichocaulon ou Hoodia; e as Figuras 5 e 6 ilustram uma representação gráfica da alteração percentual da massa corporal dos ratos para grupos diferentes para os dias -7 a 7 e dias 0 a 7, respectivamente, num estudo de dose repetida utilizando um extracto de seiva e um extracto de seiva seca por pulverização de material vegetal da espécie Hoodia gordonii. EXEMPLO 1 O método geral para extrair um primeiro extracto supressor do apetite em bruto e um extracto supressor do apetite purificado de material vegetal do género Trichocaulon ou Hoodia está ilustrado por meio do fluxograma da Figura 1. EXEMPLO 2 11

Bioensaios levados a cabo em ratos utilizando um extracto parcialmente purificado obtido da maneira ilustrada no Exemplo 1, indicaram que, de facto, o extracto exibe actividade supressora do apetite. A actividade supressora do apetite do extracto activo pode ser ilustrada por meio de um exemplo tipico do efeito do extracto de metanol de Trichocaulon piliferum em ratos, por meio da representação gráfica da Figura 2.

Ficará evidente pela Figura 2 que o grupo de teste de ratos doseados com o extracto no dia 5 apresentaram uma ingestão de alimento substancialmente diminuída pelos dois dias seguintes, ao passo que um grupo de controlo não apresentou uma ingestão de alimento reduzida comparável. A ingestão de alimento do grupo de teste retornou ao normal e, de facto, diminuiu, do dia 8 em diante. EXEMPLO 3

Um processo para produzir um extracto tendo actividade supressora do apetite está ilustrado, de forma esquemática, por meio de exemplo, nas Figuras 3 e 4, cujas duas Figuras, em conjunto, ilustram o processo total. No entanto, pode-se utilizar vários outros procedimentos, conforme será entendido por especialistas na técnica.

Com referência à Figura 3, o material vegetal do género Trichocaulon ou do género Hoodia é alimentado num misturador 3, por exemplo, um misturador Waring, por meio da linha de alimentação 1, com um solvente na forma de uma solução de cloreto de metileno/metanol introduzido por meio da linha de alimentação 2. 0 produto homogeneizado é alimentado por meio da linha 4 para um estágio de separação 12 5, por exemplo, na forma de um filtro ou centrífuga e o material vegetal residual é removido por meio da linha 27. A mistura de solvente/extracto é alimentada por meio da linha 6 para um estágio de evaporação 7 onde o solvente é removido, por exemplo, por meio de um evaporador rotativo. 0 extracto seco, em bruto, é alimentado por meio da linha 8 para um outro estágio de extracção 9 com a adição de uma solução de cloreto de metileno/metanol introduzida por meio da linha de alimentação 29 para extracção adicional e, depois, para um estágio de separação 13 por meio da linha 11, onde a fracção aguosa é removida por meio da linha 31. A fracção dissolvida do extracto é alimentada por meio da linha 15 para um estágio secador 17 onde o solvente é evaporado, por exemplo, por um evaporador rotativo.

Com referência à Figura 4, o extracto seco é alimentado por meio da linha 10 para um estágio de extracção 12. Uma solução de metanol/hexano é também alimentada por meio da linha 14 para o estágio de extracção 12 para purificação e extracção adicional do extracto seco. A mistura de extracto/metanol/hexano é alimentada por meio da linha 16 para um estágio de separação 18, a fracção de hexano é removida por meio da linha 20 e a mistura de metanol/extracto é, então, alimentada por meio da linha 22 para um estágio de secagem 24. No estágio de secagem 24, o solvente é removido, por exemplo, por evaporação num evaporador rotativo. O extracto activo seco, parcialmente purificado é alimentado por meio da linha 26 e com a adição de metanol por meio da linha 28 para um estágio de solução 30 e a 13 fracção dissolvida é alimentada por meio da linha 36 para uma coluna de cromatografia 38.

Na coluna 38 a fracção de solução solúvel de metanol é adicionalmente fraccionada utilizando silica gel e um solvente de clorofórmio/metanol a 30%, em fracções diferentes, indicadas de forma esquemática como as fracções I a V. De acordo com um procedimento real de fraccionamento levado a cabo pelo Requerente, o procedimento de fraccionamento produziu os seguintes pesos de fracção: I (3,9 g) ; II (2,6 g) / III (2,1 g) ; -IV (1,1 g) e V (2,0 g) . Estas fracções foram avaliadas individualmente por um procedimento de bioensaio adequado (num passo não ilustrado) e estas fracções identificadas como as fracções I e II, apresentando pronunciada actividade supressora do apetite, são alimentadas pelas linhas de alimentação 40 e 42 nas colunas 44 e 46, respectivamente, onde são fraccionadas adicionalmente e purificadas por cromatografia em coluna, uma vez mais utilizando silica gel e um sistema de 9:1 de clorofórmio:metanol.

As sub-fracções II(A) - (C) obtidas da coluna 44, ao serem testadas, não apresentam uma actividade supressora do apetite significativa e podem ser recicladas para cromatografia adicional.

As sub-fracções I (A) - (L) obtidas da coluna 46 são também avaliadas (por um passo de ensaio não ilustrado) e verificou-se que a sub-fracção I(C) tem acentuada actividade supressora do apetite. A sub-fracção I(C) é alimentada por meio da linha 48 na coluna 50 para um fraccionamento adicional e 14 purificação, utilizando silica gel e um eluente na proporção de 9:1 de acetato de etilo:hexano. Das fracções purificadas resultantes, verificou-se que a fracção I (C) (ii), depois de testada, possui acentuada actividade supressora do apetite. 0 produto purificado é identificado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (conforme indicado nas Tabelas 1 e 2 adiante) como sendo o composto (D .

Tabela 1: Dados de RMN de XH (300,13 MHz) para o Composto (1) CPCl3 Composto (1) Átomo de Hidrogénio J(HH)Hz δΗ/ρ .p .m. Aglicona-3 - 3,522 m 6 - 5,381 m 12 11,5, 4,1 4,607 dd 17 9,3, 9,3 3,157 dd 18 - 1,029 s 19 - 0,951 s 21 - 2,164 s 3* 7,1, 1,5 6,888 qq 4* 7,1, 1,2 1,806 dq 5* 1,6, 1,2 1,853 dq Cim-1' 9,4, 2,1 4,816 dd 2'aq 13,8, 3,7, 2,1 2,055 ddd 2*ax 13,8, 9,4, 2,6 1,552 ddd 3' 3,7, 2,9, 2,6 3,776 ddd 4' 9,4, 2,9 3,179 dd 5' 6,3, 9,4 3,821 dd 6' 6, 3 1,279 da 3'-OMe - 3,408 sd 1" 9,4, 2,1 4,730 dd 2" 13,8, 3,7, 2,1 2,108 ddd 2 "aq to C\1 co co \—1 1,601 ddd 3"ax 3,7, 2,9, 2,6 3,755 ddd 4" 9,4, 2,9 3,239 dd 5" 6,3, 9,4 3,898 dd 6" 6, 3 1,243 db 3 "OMe - 3,392 se Tev-1"' 7,7 4,273 d 2"r 7,7, 8,0 3,469 dd 3", 8,0, 2,9 3,099 dd 4 " r 9,3, 2,9 3,179 dd 5"' 6,3, 9,3 3,351 dd 6"' 6,3 1,183 d,c 3"'-OMe - 3,622 s ' ' em cada coluna podem ser intercambiáveis. d' e em cada coluna podem ser intercambiáveis. * Refere-se aos átomos do grupo tigloato.

Tabela 2: Dados relevantes de RMN de 13C (75,25 MHz) para

Composto (1) em CPCl3

Carbono Unidade de aglicona ôc/p .p.m Carbono Unidade de açúcar ôc/p . p . m. 1 37,04 T cim- 1' 95,84 D 2 29,44 T 2' 35,57 T 3 77,24 D 3' 77,05 D 4 38, 62 T 4' 82,57 D 5 138,95 S 5' 68,48 D 6 131,90 D 6' 18,14 Q 7 27,30 T 3'-OMe 57,93 Q 8 35,30 D 1" 99,54 D 9 43, 04 D 2" 35,17 T 10 37,22 S 3" 7 6, 99 D 11 26, 04 T 4" 82,52 D 12 75, 88 D 5" 68,30 D 13 53,71 S 6" 18,36 Q 14 85, 69 S 3"-OMe 57,09 Q 15 34,36 T Tev- 1", 104,28 D 16 24,31 T 2 " r 74,62 D 17 57,18 D 3", 85,30 D 18 9, 85 Q 4 " r 74,62 D 19 19,27 Q 5"' 71,62 D 20 216,85 S 6'" 17,75 Q 21 33, 01 Q 3"'-OMe 60,60 Q 1* 167,60 S 2* 128,69 D 3* 137,66 D 4* 14,41 Q 5* 12,08 Q * Refere-se aos átomos do grupo tigloato.

Composto (1)

Dados IV: 3440 cm-1 (OH), 2910 cm-1 (CH) , 1700 cm-1 (C=0) [ aD ]2 °5 8 9 = 12 , 67 ° (C=3, CHC13) p.f. 147°C -152°C. EXEMPLO 4

Os resultados dos seguintes três bioensaios sobre o supressor de apetite estão apresentados adiante, a saber: 16 a) Teste de Irwin; b) Teste de Toxicidade Aguda; e c) Teste Anoréctico de Dose Oral. a) Teste de Irwin A finalidade deste teste era avaliar o supressor de apetite da invenção produzido a partir do extracto de uma planta, conforme aqui descrito anteriormente, de acordo com o teste de Irwin de animal reduzido para acção tranquilizante e sedativa.

Procedimento Experimental 0 supressor de apetite foi extraído de material vegetal pelo Requerente por meio do método conforme aqui descrito anteriormente, e administrado a dois de quatro grupos de três animais cada; um grupo não recebe tratamento, um grupo recebe o solvente sulfóxido de dimetilo (DMSO), um grupo recebe a amostra de teste a 50 mg/kg e um grupo recebe a amostra de teste a 300 mg/kg. O tratamento foi efectuado por injecção intraperitoneal e foram realizadas observações a intervalos específicos até cinco horas depois do tratamento. Somente os sintomas diferentes daqueles observados nos animais tratados com DMSO foram utilizados na interpretação dos resultados.

Resultados

Ficou claro que o solvente, o DMSO, teve um efeito acentuado sobre os animais, especialmente sobre o mecanismo regulador de calor. As temperaturas corporais de todos os animais tratados com o solvente, só ou associado com a amostra de teste, apresentaram um queda acentuada. 17

Os animais no grupo de dosagem baixa apresentaram dispersão diminuída na jaula e actividade locomotora diminuída, como em todos os outros grupos, incluindo o grupo de controlo. A apatia foi observada no mesmo grau que no grupo tratado com DMSO. Observou-se respiração diminuída 15-60 minutos depois do tratamento. Observou-se também ptose (fechamento das pálpebras) num grau maior do que no grupo tratado com DMSO. Uma resposta do pavilhão auricular (ouvido) foi observada, bem como uma resposta positiva dos dedos, indicando amedrontamento. A temperatura corporal caiu para 32,7°C depois do tratamento.

Os animais no grupo de dosagem elevada demonstram, como nos outros grupos, uma dispersão inicial diminuída na jaula e actividade locomotora diminuída, mas demonstraram dispersão e actividade locomotora aumentadas antes da morte, que ocorreu aproximadamente 1 hora depois do tratamento. Convulsões simétricas clónicas, graves, ocorreram 30 minutos depois do tratamento. A respiração diminui inicialmente, mas aumentou antes da morte. Uma resposta do pavilhão auricular (ouvido) foi retardada e uma resposta positiva dos dedos, indicando amedrontamento, ambas como observadas nos animais no grupo de dosagem baixa. A temperatura corporal caiu para 30,7°C depois do tratamento. Observou-se passividade posicionai aumentada, bem como tono corporal diminuído. Observou-se rotação anormal de membro, a força de preensão diminuiu, não houve resposta à dor e ocorreu perda do reflexo de endireitamento.

Discussão

Quando comparados com os animais de controlo e os tratados com DMSO, os animais que recebem a dose baixa (50 18 mg/kg) apenas apresentaram respiração diminuída e um grau de ptose aumentado. Os animais que receberam a dose alta (300 mg/kg) da amostra de teste reagiram muito intensamente apresentando convulsões e morte. Todas as outras observações feitas nestes animais podem ser atribuídas aos animais a entrar em convulsão e a morrer. Não foram observados os sinais sugestivos de acções tranquilizantes e sedativas, tais como a dispersão diminuída acentuada nas jaulas, actividade locomotora diminuída e apatia nos grupos de teste que poderiam ser atribuídos à amostra de teste.

Deste modo, pode-se concluir que a amostra de teste é letal a murganhos a 300 mg/kg e tem efeitos supressores respiratórios em murganhos a 50 mg/kg, quando administrada por via intraperitoneal com DMSO como solvente. b) Teste de Toxicidade Aguda A finalidade deste teste era obter informações sobre a toxicidade da amostra de teste.

Procedimento Experimental

Um extracto de planta preparado de acordo com a invenção, conforme descrita aqui anteriormente, e tendo acção supressora do apetite foi purificado e uma amostra de teste foi testada em doses crescentes por meio de tratamento oral em murganhos. Dois animais foram utilizados por grupo de dose, excepto no grupo de dose mais alta em que apenas um animal foi tratado. Os animais foram examinados para atestar boa saúde e as suas massas corporais foram determinadas no dia do tratamento.

As doses variaram de 100 mg/kg até 3028,5 mg/kg. A dose foi calculada e misturada em amido de batata 19 preparado, de modo que cada animal recebeu uma dose total de 0,2 mL. O animal 13 recebeu 0,25 mL. O amido de batata foi preparado misturando 20 g de amido num pequeno volume de água fria e adicionando água em ebulição ao mesmo até perfazer um volume de 1 litro. Deixou-se a suspensão arrefecer até a temperatura ambiente antes do doseamento.

Os animais nos grupos 1 e 2 foram tratados no mesmo dia. Os mesmos foram observados durante 24 horas e se não desenvolvessem sinais de toxicidade, o grupo seguinte era tratado. A mesma abordagem foi seguida até que todos os animais fossem tratados. Este esquema foi seguido para assegurar que os animais não seriam tratados desnecessariamente quando uma dose tóxica aguda tivesse sido alcançada no grupo anterior.

Os animais foram observados para a verificação de sinais clínicos de toxicidade imediatamente (1-2 horas) depois do tratamento e diariamente a partir daí. A massa corporal foi determinada uma vez por semana e foi medida a ingestão total de alimento e água de cada animal.

Os animais sobreviventes foram submetidos à eutanásia por meio de injecção intraperitoneal de pentobarbitona sódica (disponível comercialmente sob o nome comercial de Euthanaze, CentaurR) no dia 14 da experiência. Uma autópsia foi realizada nestes animais, bem como no animal que morreu durante a experiência. Foram colhidas amostras para histopatologia.

Resultados

Grupo 1 (Grupo de Controlo) 20 Não foram observados sinais clínicos de toxicidade durante o período de observação de 14 dias. A ingestão de alimento e água estava dentro dos parâmetros normais. As alterações na massa corporal também estavam dentro de parâmetros normais. Não foram registadas alterações histopatológicas nas amostra do fígado.

Grupo 2 (100 mg/kg) Não foram observados sinais clínicos de toxicidade durante o período de observação. A ingestão de alimento e água foi normal e as alterações em massa corporal durante o período de observação também foram normais. Não se observou patologia macroscópica e não foram registadas alterações histopatológicas ou morfológicas nas amostra do fígado.

Grupo 3 (200 mg/kg)

Os animais deste grupo não apresentaram sintomas clínicos de toxicidade durante a experiência. A ingestão de alimento e água foi normal, bem como as alterações em massa corporal. O inchaço turvo dos hepatócitos foi suave no animal 6, mas moderado no animal 5. Ocorreu também uma degeneração hidrópica moderada nos hepatócitos no animal 5.

Grupo 4 (400 mg/kg) Não foram observados sinais clínicos de toxicidade durante o período de observação e não foi observada patologia macroscópica durante a autópsia. Foram observados na histologia moderado inchaço turvo e alterações hidrópicas suaves dos hepatócitos. A ingestão de água e alimento e o aumento em massa corporal no animal 7 foram normais. 0 animal 8 consumiu quase o dobro da ingestão total do animal 7 (144,6 g e 73,9 21 g, respectivamente), mas o aumento da massa corporal foi de apenas 0,81 g comparado com 2,7 g.

Grupo 5 (800 mg/kg)

Um animal (animal 10) morreu três horas depois do doseamento sem apresentar quaisquer sinais específicos. O outro animal (animal 9) sobreviveu por todo o período de observação sem quaisquer sinais de toxicidade. A ingestão de água do animal sobrevivente era normal (42,42 mL) enquanto a ingestão de alimento era alta (134,2 g). A massa corporal aumentou em 2,85 g que foi a mais elevada de todos os animais na experiência.

Na autópsia do animal 10, que morreu alguns momentos depois do doseamento oral, os pulmões estavam congestionados. Não estava presente qualquer corpo estranho que poderia indicar a inalação de material de teste. Não se observou patologia macroscópica no animal 9. Uma vacuolização citoplasmática suave (degeneração hidrópica) estava presente no animal 10, mas moderada no animal 9. A aparência citoplasmática glandular do fígado foi classificada como moderada em ambos os animais.

Grupo 6 (1600 mg/kg)

Nenhum dos animais apresentou quaisquer sinais clínicos de toxicidade durante o período da experiência. Não foi observada patologia macroscópica na autópsia, mas foram observadas alterações degenerativas moderadas e alterações hidrópicas suaves dos hepatócitos. A ingestão de alimento e água foi normal, assim como o aumento da massa corporal durante o período da experiência.

Grupo 7 (3028,5 mg/kg) 22

Apenas um animal foi tratado a esta dose. Este animal não apresentou sinais de toxicidade durante o período de observação e não se observou patologia macroscópica. No exame histopatológico observou-se moderado inchaço turvo e degeneração hidrópica dos hepatócitos. 0 animal apresentou uma perda de massa corporal durante o período de observação (-0,82 g) mas a ingestão de alimento e água foi normal.

Discussão

Uma vez que um número muito pequeno de animais foi utilizado em cada grupo de dose, é difícil alcançar quaisquer conclusões. 0 facto de que apenas um animal morreu a uma gama de baixa dosagem, , sem apresentar sintomas, pode indicar que a morte não foi relacionada à amostra de teste, mas devido à tensão durante e/ou depois do tratamento. Nenhum animal nos grupos de dosagens mais elevadas morreu ou apresentou quaisquer sinais de toxicidade, o que melhor suporta esta hipótese. O aumento na ingestão de alimento observado no animal 8 poderia, possivelmente, ser atribuído ao excessivo derrame de alimento como foi reflectido no pequeno aumento na massa corporal. Deve-se recordar que todos os animais desta experiência foram tratados apenas uma vez e que é improvável que um supressor do apetite tenha uma influência acentuada, seja na ingestão de alimento, seja de água, ou na massa corporal durante um período de 14 dias, como foi o caso desta experiência.

Pelo exame histopatológico das amostras do fígado, ficou claro que as alterações patológicas estavam relacionadas com a dose, com os animais que receberam doses mais altas apresentando as alterações maiores. A patologia 23 observada não foi de natureza metabólica, mas possivelmente induzida pela amostra de teste. As alterações foram apenas degenerativas e, portanto, reversíveis. Não se observou sinais de alterações hepatocelulares irreversíveis.

Deste modo, pode-se concluir que apenas um animal morreu a uma dose mais baixa (800 mg/kg) mas que, possivelmente, a morte não estava relacionada com a amostra de teste. Nenhum dos outros animais em qualquer dos grupos de dose apresentou quaisquer sinais de toxicidade durante os 14 dias do período de observação depois do tratamento ou morreu como resultado do tratamento. Uma única dose oral da amostra de teste induziu alterações hepatocelulares reversíveis relacionadas com a dose. c) Teste Anoréctico de Dose Oral A finalidade deste teste era determinar a actividade de um extracto de planta preparado de acordo com a invenção e a dose eficaz mínima e, ao mesmo tempo, investigar quaisquer efeitos secundários possíveis, tais como a supressão respiratória, conforme ocorreu no Testes de Irwin (acima referido).

Procedimento Experimental

Foram distribuídos animais para grupos de tratamento utilizando tabelas de aleatorização. Cada grupo de tratamento consistia em três animais, com 6 animais no grupo de controlo. A amostra de teste foi doseada a ratos jovens, fêmeas, com peso corporal de 100-150 g na aclimatização, durante três dias consecutivos. Os animais foram identificados por meio de etiquetas metálicas na orelha e marcações com KMn04 na pele para facilitar a identificação. Os animais foram acomodados individualmente 24 em jaulas padrão de policarbonato para roedores e água e ração comercial em pó para roedores estavam disponíveis ad libitum. A ingestão de água e de alimento foi medida e calculada para cada dia. A fim de encontrar a dose eficaz mínima da amostra de teste, foram testadas cinco doses. 0 tratamento foi realizado por meio de sonda oral com a amostra de teste suspensa em amido de batata. A substância do teste era o composto (1), um pó granular branco preparado do extracto de um material vegetal de acordo com a invenção e a quantidade medida da amostra de teste foi misturada com o amido de batata preparado e doseado. A mistura com o amido de batata teve lugar imediatamente antes do doseamento em cada dia. Antes da remoção do volume de doseamento para cada animal, as suspensões foram totalmente misturadas utilizando um Vortex.

Foi testada uma gama de cinco doses com um grupo de controlo recebendo apenas a substância veículo. As doses foram escolhidas com base nos efeitos observados no Teste de Irwin acima descrito e foram:

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 4 Grupo 6 0,00 mg/kg (Grupo de Controlo) 6,25 mg/kg 12.50 mg/kg 25.00 mg/kg 37.50 mg/kg 50.00 mg/kg

Resultados O tratamento não afectou a saúde dos animais durante o período de estudo. Os animais tratados com a amostra de 25 teste em todos os grupos de dose apresentaram um ganho de massa corporal médio significativamente reduzido durante o período total do estudo e os animais em três dos cinco grupos de tratamento, de facto, perderam massa corporal. A ingestão média de alimento para todos os grupos de tratamento foi reduzida durante o período de estudo. Os animais nos grupos de doses mais elevadas apresentaram um consumo aumentado de água. A taxa respiratória não foi afectada, de forma significativa, em qualquer grupo de dose. Os animais em todos os grupos de doses apresentaram fígados friáveis na autópsia, mas não se observou patologia macroscópica.

Discussão

Os dados colhidos durante o período de aclimatização confirmaram que todos os animais incluídos na experiência estavam saudáveis e o ganho de massa corporal era comparável entre os animais. A redução e, em alguns animais mesmo uma perda, em ganho de massa corporal, em combinação com a ingestão reduzida de alimento é fortemente indicativa de supressão do centro de apetite. A redução da ingestão de alimento e ganho reduzido de massa corporal ocorreu mesmo com o grupo de dose mais baixa (6,25 mg/kg). A perda real em massa corporal ocorreu no grupo de 12,50 mg/kg. É importante observar que todos os grupos de tratamento tiveram um aumento no consumo de água quando o 26 consumo de alimentos diminuiu (Figura 2). Isto poderia ser devido a um efeito diurético da amostra de teste ou a uma estimulação do centro da sede no cérebro. 0 facto de não ter ocorrido supressão respiratória, como havia sido observado no teste de toxicidade aguda acima referido, com a via intraperitoneal, é visto como um aspecto positivo. Isto poderia ser devido à absorção reduzida do tracto gastrointestinal, com a consequente biodisponibilidade reduzida. No entanto, a biodisponibilidade nas doses orais testadas foi suficiente para que a amostra de teste fosse eficaz. A ligeira redução na taxa respiratória, 1 hora depois do tratamento na maioria dos grupos poderia ser atribuída ao enchimento do estômago com o volume da dose e a consequente passividade dos animais.

Os fígados friáveis observados nos grupos de tratamento poderiam ser devido a uma alteração no metabolismo energético secundário à ingestão reduzida de alimento, provocando o metabolismo aumentado de gordura e sobrecarga no fígado. Se, de facto, este tiver sido o caso, estas alterações poderiam possivelmente ser consideradas como transitórias, que podem recuperar com o tempo depois que um período de estado estável tenha sido atingido, ou depois da remoção da amostra de teste. 0 possível efeito sobre o fígado também necessita investigação adicional.

Uma vez que este estudo se destinava, principalmente, como um teste de selecção, foram utilizados pequenos grupos de animais. No entanto, os dados indicam que a amostra de teste tem acção supressora do apetite, mesmo na dose mais 27 baixa testada (6,25 mg/kg). Não ocorreram sinais clinicos de supressão respiratória nas doses testadas. EXEMPLO 5

As plantas Hoodia colhidas recebidas seja do ambiente natural, seja através de um programa de cultivo, são primeiro armazenadas a 4°C durante um período máximo de 48 horas. As plantas foram lavadas em água de torneira e depois cortadas em pedaços de ± 1 cm. As peças cortadas são todas combinadas e, depois, prensadas por uma prensa hidráulica a 300 bar de pressão durante um período mínimo de 0,5 hora por prensagem. Durante a prensagem a seiva da planta é colhida separadamente. A seiva é armazenada a -18°C até que seja necessário um processamento adicional. A seiva é seca por pulverização sob condições adequadas para obter-se um pó de fluidez livre. O teor de humidade no pó é, de preferência, inferior a 5% depois da secagem por pulverização e, se necessário, é adicionalmente seco num forno a vácuo ou utilizando um secador de leito fluido.

Tanto a seiva como o material seco por pulverização demonstraram ser eficazes como supressores do apetite em ensaios biológicos em ratos.

Parte Experimental 50 kg de plantas Hoodia gordonii foram lavados com água de torneira e, depois, cortados em pedaços de 1 cm. As plantas cortadas foram, então, prensadas por uma prensa hidráulica a 300 bar durante um mínimo de 0,5 hora por lote. A seiva foi colhida e verificou-se que a massa era de 10 kg quando foram utilizadas plantas Hoodia gordonii do 28 meio ambiente e 20 kg quando foram utilizadas plantas Hoodia gordonii do programa de cultivo. A seiva (500 g) foi seca por pulverização utilizando as seguintes condições:

2,85 mL/min 110°C 7 0 ° C 7 8 °C

Taxa de fluxo Temperatura de entrada Temperatura de saida Temperatura da câmara O pó seco por pulverização obtido era um pó de fluidez livre (22 g) com um teor de humidade de 6,9%. O pó seco por pulverização foi analisado para verificação da concentração de componente activo utilizando técnicas de HPLC. A concentração do componente activo foi determinada como sendo 13 g/kg de pó seco por pulverização.

Método de Análise por HPLC

Eluente Coluna Absorvância UV Taxa de fluxo Volume de injecção

Acetonitrilo:água (7:3), isocrático

Fase inversa C-18 225 nm 1 mL/min

10 pL Método O pó seco por pulverização (10 mg) foi dissolvido em água (0,5 mL) e acetonitrilo (0,5 mL) , 10 pL desta solução foi injectada na HPLC e a concentração do composto activo (1) foi determinada utilizando uma curva padrão que foi preparada a partir do composto puro (1). EXEMPLO 6

Os resultados de um estudo concebido para avaliar os possíveis efeitos anorécticos do composto (1) em rato estão 29 apresentados adiante. A seguir, as amostras testadas são de seiva pura (Amostra 1), seiva seca por pulverização (Amostra 2) e unidade activa (Amostra 3). As Amostras 1 e 2 são a seiva e a seiva seca por pulverização, respectivamente, conforme descrito no Exemplo 5 acima. A Amostra 3 é o composto (1) com o solvente extraido com >95% de pureza.

As Amostras 1 a 3 foram, cada uma, administradas como uma dose oral única a ratos Wister machos. Dois grupos de controlo adicionais receberam o veiculo (água destilada ou DMSO) . Fenfluramina administrada por via oral (7,5 mg/kg) foi incluida como padrão de referência. A Amostra 1 (seiva pura) administrada por via oral, produziu reduções dependentes da dose na ingestão de alimento, que foram doses estatisticamente significativas de 1600 mg/kg e acima, quando comparadas com os controlos tratados com veiculo. Foram também registadas reduções concomitantes em peso corporal (ou taxa de crescimento). No dia do doseamento, aumentos no consumo de água foram registados às 3 horas depois da dose (6400 e 10000 mg/kg) e 6 horas depois da dose (10000 mg/kg) . Entre 24 e 48 horas depois da dose, foram registadas reduções estatisticamente significativas no consumo de água em doses de 3200 mg/kg e acima. A Amostra 2 (seiva seca por pulverização) administrada por via oral a 76 mg/kg também produziu reduções estatisticamente significativas, dependentes da dose, na ingestão de alimento e peso corporal em comparação com os animais tratados com o veiculo. Não foram registados efeitos estatisticamente significativos no consumo de água. 30 A Amostra 3 (unidade activa) produziu reduções estatisticamente significativas na ingestão de alimento numa dose oral a 5,0 mg/kg. Não foram produzidos efeitos estatisticamente significativos nos pesos corporais pela unidade activa, embora a análise dos dados revelou um ligeiro atraso no crescimento em comparação com os animais tratados com o veiculo. Não foram registados efeitos estatisticamente significativos no consumo de água. O padrão de referência, a fenfluramina (7,5 mg/kg), produziu reduções estatisticamente significativas na ingestão de alimento às 6 e 24 horas depois da dose, em comparação com o grupo tratado com veiculo relevante. Não foram registados efeitos estatisticamente significativos no consumo de água. Não foram registados efeitos sobre os figados, relacionados ao tratamento.

SUBSTÂNCIA DE TESTE

Identidade Aparência Condições de armazenamento Pureza Veículo

Amostra 1 (Seiva pura) Líquido castanho -20° no escuro Seiva pura Água destilada

Amostra 2 (Seiva seca por pulverização) Pó Temperatura ambiente no escuro Seiva seca por pulverização Água destilada

Amostra 3 (Unidade activa) Pó branco 4°C no escuro >95% Sulfóxido de dimetilo (DMSO)

Procedimento Experimental

Para este estudo, foram utilizados cinquenta e cinco ratos Wister, machos.

Os pesos corporais, a ingestão de alimento (peso da coluna para alimento) e a ingestão de água (peso da 31 garrafa) foram registados diariamente no mesmo horário, todos os dia, desde o dia da chegada até o dia do término do estudo.

No Dia 1, os ratos receberam uma dose oral única (por sonda) de acordo com a seguinte tabela:

Grupo n Tratamento oral Dose (mg/kg) 1 5 Veículo - 2 4 Amostra 1 (seiva pura) 800 3 5 Amostra 1 (seiva pura) 1600 4 5 Amostra 1 (seiva pura) 3200 5 5 Amostra 1 (seiva pura) 6400 6 5 Amostra 1 (seiva pura) 10000 7 5 Amostra 2 (seiva seca por 58 8 5 pulverização) 76 9 5 Amostra 2 (seiva seca por 2,5 10 5 pulverização) 5, 0 11 3 Amostra 3 (unidade activa) 7,5 12 3 Amostra 3 (unidade activa) Fenfluramina Veículo (DMSO)

Os grupos 1-8 foram doseados utilizando um volume de dose constante de 10 mL/kg e os grupos 9-12 foram doseados utilizando um volume de dose de 1 mL/kg. A ingestão de alimento e água também foi medida às 1, 3 e 6 horas depois do doseamento no Dia 1.

Depois das medições do Dia 8, os animais foram mortos por asfixia com dióxido de carbono e os figados foram removidos e colocados em formalina tamponada a 10%, antes da histologia. 32

Foram tomadas secções de cera de parafina de cada fígado de 4 - 5 ym e coradas com hematoxilina e eosina.

Secções adicionais de 12 ym foram cortadas num criostato e coradas com Oil Red O (ORO).

Análise dos Dados

Os pesos corporais e as medições da ingestão de alimento e água pós-dosagem em cada ponto de tempo para os animais tratados com P57 foram comparados com os do grupo de controlo, relevantes, tratado de forma semelhante com veículo utilizando análise de variância seguida pelo teste de Williams para comparações com o controlo.

Os dados para os animais tratados com fenfluramina foram comparados com os do grupo de controlo tratado com veículo utilizando o teste t de Student.

Resultados

Os resultados estão resumidos nas tabelas. A Amostra 1 (seiva pura) administrada por via oral produziu reduções acentuadas relacionadas com a dose na ingestão diária de alimento. A duração e a amplitude destas reduções no consumo de alimento eram dependentes da dose. Às 24 horas após a dose, a Amostra 1 (seiva pura) produziu reduções estatisticamente significativas na ingestão de alimento em doses de 1600 mg/kg e acima em comparação com os controlos tratados com veículo. A dose mais alta da Amostra 1 (seiva) (10000 mg/kg) produziu reduções estatisticamente significativas na ingestão de alimento diariamente até 5 dias depois da dose. 33 A Amostra 2 (seiva seca por pulverização) e a Amostra 3 (unidade activa) produziram reduções acentuadas e estatisticamente significativas na ingestão de alimento em doses orais de 76 e 5,0 mg/kg, respectivamente. Em ambos os casos os efeitos duraram 48 horas depois da dose. O padrão de referência, a fenfluramina (7,5 mg/kg p.o.) produziu reduções estatisticamente significativas na ingestão de alimento às 6 e 24 horas após a dose, em comparação com o grupo de controlo tratado com o veiculo relevante (Grupo 12). A Amostra 2 (seiva seca por pulverização) e a Amostra 3 (unidade activa) não produziram efeitos acentuados sobre o consumo de água relacionados com a dose. No dia do doseamento, a seiva pura produziu aumentos estatisticamente significativos na ingestão de água às 3 horas depois da dose (6400 e 10000 mg/kg) e 6 horas depois da dose (10000 mg/kg) . No entanto, dois dias depois do doseamento, foram registadas diminuições estatisticamente significativas na ingestão de água nos animais que receberam a Amostra 1 (seiva) a 3200, 6400 e 10000 mg/kg. No entanto, estas reduções não estavam claramente relacionadas com a dose e só ocorreram entre 1 e 2 dias depois da dose. Deste modo, o significado biológico destes efeitos permanece incerto. A Amostra 1 (seiva pura) produziu efeitos estatisticamente significativos, relacionados com a dose, sobre os pesos corporais em comparação com o grupo de controlo tratado com o veiculo (Grupo 1). Quando administrada por via oral, em doses de 3200 mg/kg e acima, a Amostra 1 (seiva pura) produziu reduções estatisticamente significativas no peso corporal ou taxas de crescimento 34 diminuídas em comparação com os animais tratados com o veículo. Estes efeitos foram estatisticamente significativos desde 48 horas após a dose até o final do estudo. A Amostra 2 (seiva seca por pulverização) administrada por via oral a 7 6 mg/kg também produziu reduções estatisticamente significativas no crescimento dos animais quando em comparação com o grupo de controlo tratado com o veículo (Grupo 1). Estes efeitos foram estatisticamente significativos entre os Dias 3 (48 horas depois da dose) e 5, inclusive.

Embora a Amostra 3 (unidade activa) aparentemente atrasasse o crescimento dos animais na dose mais elevada (5,0 mg/kg) quando em comparação com o grupo de controlo tratado com o veículo (Grupo 12) , este efeito não era significativo do ponto de vista estatístico. A fenfluramina (7,5 mg/kg) não produziu efeitos acentuados ou estatisticamente significativos sobre o consumo de água ou pesos corporais quando em comparação com o grupo de controlo tratado com o veículo (Grupo 12). Não foram registados efeitos relacionados ao tratamento sobre os fígados. 35 TABELA la

Efeitos da administração oral sobre a ingestão de alimento em rato (dados pré- dose diários) Grupo Tratamento Dose Ingestão média de alimento do grupo (g + dp) oral (mg/kg) entre os Dias: -6- -5- -4- -3- -2- -5 -4 -3 -2 -1 1 Veículo - 27,8 ± 24,2 ± 27,6 ± 28,3 ± 29,4 ± (água) 1, 54 1, 83 3, 67 3, 50 2,66 2 Amostra 1 800 28,3 ± 24,9 + 27,7 ± 28,4 ± 30,1 ± seiva 1, 43 0, 82 0, 76 1, 51 0,27 3 Amostra 1 1600 29,0 ± 25,0 ± 27,4 ± 28,8 ± 29,5 ± seiva 1, 39 2, 16 1, 96 0, 61 1,55 4 Amostra 1 3200 27,2 ± 25,1 ± 26,0 ± 28,5 ± 27, 6 ± seiva 2, 33 2, 46 2, 52 2,29 1,15 5 Amostra 1 6400 28,7 ± 25,3 ± 27,3 ± 29,2 ± 30,3 ± seiva 1, 64 1, 73 1, 45 1, 09 0, 90 6 Amostra 1 10000 28,5 ± 233,7 ± 26,0 ± 27,0 ± 28, 7 ± seiva 2, 38 2, 73 2, 31 3, 50 2,26 7 Amostra 2 38 28,1 ± 23,9 ± 24,5 ± 27,6 ± 28,5 ± seca por 1,24 1, 79 2, 30 1, 61 1,87 pulverização 8 Amostra 2 76 28,7 ± 26,5 ± 27,1 ± 28,7 ± 28, 9 ± seca por 0, 91 1, 55 1, 01 1, 99 1,37 pulverização 9 Amostra 3 2,5 28,8 ± 2 6,4 ± 29,0 ± 29,4 ± 29,5 ± unidade 1, 49 3, 12 1, 99 1, 76 2,81 activa 10 Amostra 3 5, 0 28,3 ± 25,8 ± 28,1 ± 28,0 ± 28,5 ± unidade 2,1 1, 86 2, 65 2, 65 3,03 activa 11 Fenfluramina 7,5 29,1 ± 25,3 ± 27,0 ± 30,8 ± 29,7 + 0, 66 4, 03 1, 53 0, 54 2,84 12 Veículo - 27,9 + 26,7 ± 28,7 ± 28,1 ± 30, 5 ± (DMSO) 1,8 2,11 1, 99 4, 06 2,54 Dp: Desvio Padrão 36 TABELA lb

Efeitos da administração oral sobre a ingestão de alimento em rato (dados pós- dose diários) Grupo Tratamento Oral Dose (mg/kg) Ingestão média de alimento do grupo (g ± dp) entre os Dias: 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 1 Veículo (água) 29,5 + 3, 15 29, 6 ± 2, 84 30, 6 ± 3,49 31, 8 ± 3,21 30, 7 ± 2,24 31, 7 ± 3, 03 32, 9 ± 3, 18 2 Amostra 1 seiva 800 26,1 + 0, 98 29,3 ± 1,49 30, 7 ± 1, 15 30, 9 ± 0, 60 33,3 ± 1, 69 32, 7 ± 0, 80 40, 1 ± 13,40 3 Amostra 1 seiva 1600 22,6** ±3,17 26, 9 ± 2,06 30, 9 ± 2,54 30, 9 ± 1,22 34, 1 ± 1,36 33, 7 ± 1, 69 33, 8 ± 1, 61 4 Amostra 1 seiva 3200 20,1** ± 1,39 19,0** ±1,88 22,8 * * ±1,77 28, 0 ± 3, 14 31,4 ± 2, 82 32,3 ± 2, 91 33, 0 ± 3, 01 5 Amostra 1 seiva 64 0 0 18,2** ±4,18 14,8 * * ±1,75 18,4** ±0,97 22,4** ±3,01 26, 9 ± 2, 81 31, 0 ± 2,33 32, 0 ± 2,34 6 Amostra 1 seiva 10000 15,1** ±2,98 12,4** ±2,61 16, 0** ±3,15 19, 7** ±4,31 22, 6* ±5,70 30, 1 ± 4,79 32, 6 ± 5, 90 7 Amostra 2 seca por pulverização 38 25, 6 ± 2,85 27,3 + 0, 95 30,3 + 2,06 31, 0 ± 2, 13 31,8 + 1, 63 31, 1 + 1, 94 31,18 ± 2,45 8 Amostra 2 seca por pulverização 76 24,2* ±3,25 25,2* ±3,24 29,9 + 1, 85 30,2 ± 2,28 31,2 + 2,26 32,3 ± 1,44 33,1 + 0, 61 9 Amostra 3 unidade activa 2,5 26,8 + 3,33 29,1 + 3,43 31, 7 ± 3,08 34, 0 ± 2, 95 34,4 ± 4,32 33, 1 ± 4, 11 34, 8 ± 3, 71 10 Amostra 3 unidade activa 5, 0 2, 1±± ±2,19 21,0±± ±3,07 27,6 + 5,26 3 0,5 ± 3,33 33,0 + 3,16 32,4 ± 3,25 33,0 + 3, 84 11 Fenfluramina 7,5 22,4 + ± 3,19 31,9 + 0, 84 32, 7 ± 2,50 33, 0 ± 2,55 30,4 ± 0,26 32, 7 ± 1, 90 32,4 ± 1, 60 12 Veículo (DMSO) 29, 9 ± 3,36 30, 6 ± 4,43 30, 1 ± 4, 17 32,4 ± 5,26 31, 8 ± 3, 08 32, 8 ± 3, 98 33,3 ± 3,76 DP Desvio Padrão Grupos 2-8 foram comparados com veículo Grupo 1: *p<0,05, **p<0,01 Grupos 9-11 foram comparados com veículo Grupo 12: + p<0,05, ++p<0,01 37 TABELA 2a

Efeitos da administração oral sobre a ingestão de água em rato (dados pré-dose diários) Grupo Tratamento Dose Ingestão média de água dc grupo g + dP) oral (mg/kg) entre os Dias: -6- -5- -4- -3- -2- -5 -4 -3 -2 -1 1 Veículo - 40, 9 + 34,8 + 37,6 + 33, 5 + 32,2, + (água) 4, 61 4, 15 5, 63 7,42 6,32 2 Amostra 1 800 38, 6 + 37,1 + 63,4 ± 28,1 + 30, 4 + seiva 1, 96 9, 74 4, 81 1,83 4,75 3 Amostra 1 1600 43, 4 + 35,9 + 38,4 + 31, 1 + 36,5 + seiva 10,53 3, 84 4, 56 4,47 5,39 4 Amostra 1 3200 40, 1 + 33,3 + 37,3 + 31,3 + 31, 7 + seiva 5, 58 3, 01 4, 46 3,48 3,18 5 Amostra 1 6400 43,8 + 36,3 + 35,4 + 34,0 + 35,1 + seiva 8, 57 9, 02 8, 18 6, 62 5,72 6 Amostra 1 10000 37,4 + 32,7 + 33,2 + 29,0 + 32,2 + seiva 5, 34 3, 35 4, 86 5,11 3,27 7 Amostra 2 38 40, 0 + 35,8 + 34,7, + 30,2 + 31, 4 + seca por 4, 36 4, 92 3, 20 1,88 2,98 pulverização 8 Amostra 2 76 38, 6 + 37,0 + 48,8 + 31, 6 + 39,0 + seca por 1, 98 1, 96 21,6 4,56 17,27 pulverização 9 Amostra 3 2,5 42, 0 + 37,0 + 34,1 + 28,0 + 31, 6 + unidade 6, 70 5, 50 3.16 2,58 3,12 activa 10 Amostra 3 5,0 40, 9 + 34,2 + 32,7 + 28,2 + 33,1 + unidade 4, 48 3, 00 1,26 1,65 4,82 activa 11 Fenfluramina 7,5 47, 0 + 35,5 + 34,7 + 30, 9 + 31, 6 + 5, 3 7, 49 3, 73 2,12 2,80 12 Veículo - 43, 3 + 34,5 + 35,2 + 28,3 + 31, 4 + (DMSO) 5, 67 4, 97 4, 34 4,64 6,44 Dp: Desvio Padrão 38 TABELA 2b

Efeitos da administração oral sobre a ingestão de água em rato (dados pós-dose diários) Grupo Tratamento Oral Dose (mg/kg) Ingestão média de água do grupo (g ± dp) entre os Dias: 1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 1 Veículo (água) 34, 9 + 5,45 36,9 + 6,06 38, 0 ± 7,59 37,2 ± 16,8 37,7 + 5,54 35,3 ± 2,86 36,5 ± 5, 85 2 Amostra 1 seiva 800 30, 9 ± 3, 77 34,4 + 8,12 38,2 + 13, 71 35,9 + 13,51 39,5 + 11,20 28,8 + 1,22 31,8 + 5,58 3 Amostra 1 seiva 1600 29,2 ± 1,66 31, 7 ± 5,35 41,3 + 11,21 34,6 ± 4, 10 48,1 + 12,27 37,8 + 7,22 36,9 + 9,28 4 Amostra 1 seiva 3200 35, 9 ± 5, 88 2 6,2* ± 2,66 30,5 + 2,44 34,1 + 4,80 45,8 + 18,54 51,0 + 35,21 4 2,6 ± 13,88 5 Amostra 1 seiva 64 0 0 33,4 + 12, 04 27,4* ±8,13 32,6 + 10, 67 35,4 + 10, 78 35,2 ± 8, 72 36,2 + 6, 72 35,9 + 9,58 6 Amostra 1 seiva 10000 31, 7 + 12, 74 28,5* ±8,85 32,4 + 8, 87 3 6,6 ± 6,50 40,7 + 11,51 38,0 + 6,66 37,5 + 6,21 7 Amostra 2 seca por pulverização 38 36,0 + 6, 02 34,5 + 1,79 38,2 + 7,16 39,6 + 7,09 42,7 + 9, 74 45,6 + 17, 15 46,1 + 9,49 8 Amostra 2 seca por pulverização 76 45, 0 + 19, 03 39, 1 ± 16,59 4 6,9 ± 18,34 35,9 + 3,40 41,9 + 12,37 36,9 + 8,47 38,1 + 8, 93 9 Amostra 3 unidade activa 2,5 32,2 + 4, 01 36,1 + 12,42 38,3 ± 11, 71 41,5 ± 16,60 34,7 + 7,57 43,0 + 4,20 35,3 + 8, 70 10 Amostra 3 unidade activa 5, 0 33, 9 + 2.40 31,5 + 8, 12 35,1 + 3, 82 37, 7 ± 5,99 39,5 + 7, 78 37,4 + 11, 07 37,8 + 6,42 11 Fenfluramina 7,5 34, 1 + 3, 60 37,2 + 1,48 36,7 + 3, 92 33,8 + 2,89 33,7 + 5,43 32,1 + 1, 93 33,6 + 2,50 12 Veículo (DMSO) 40, 7 + 9, 10 33,8 + 9,37 32,9 + 7, 07 35,2 + 11,49 33,8 + 9, 82 32,3 + 7,44 32,0 + 7,22 DP Desvio Padrão Grupos 2-8 foram comparados com veículo Grupo 1: *p<0,05 Grupos 9-11 foram comparados com veículo Grupo 12: (sem significados) 39 TABELA 3a

Efeitos da administração oral sobre o peso corporal em rato (dados pré-dose diários) Grupo Tratamento oral Dose (mg/kg) Peso corporal médio do grupo (g + dp) entre os Dias: -5 -4 -3 -2 -1 1 Veículo (água) 130,9 + 5,56 150,7 + 5, 37 157,3 + 5,29 168,1 + 6,20 177,5 + 6,70 2 Amostra 1 seiva 800 131,6 + 4,34 150,1 + 4, 84 158,5 + 4, 35 169,6 ± 4,99 177,7 + 4,10 3 Amostra 1 seiva 1600 130,1 + 4,3 148,6 + 6, 59 156,7 + 6, 38 167,5 + 6,04 176,6 + 6,37 4 Amostra 1 seiva 3200 130,8 + 6,19 147,7 + 7, 56 154,4 + 8, 06 165,2 + 8,43 175,8 + 9,10 5 Amostra 1 seiva 64 0 0 32, 6 + 7,01 151,3 + 7,23 158,4 + 8, 50 169,0 + 8,79 178,1 + 7,75 6 Amostra 1 seiva 10000 132,3 + 6,75 151,8 + 9, 08 157,3 + 9, 37 167,1 + 10, 41 175,4 + 10, 90 7 Amostra 2 seca por pulverização 38 31, 7 + 8,28 149,0 + 5, 85 156,2 + 5, 81 166,7 + 5,54 175,6 + 8,42 8 Amostra 2 seca por pulverização 76 130,0 + 6, 99 146,1 + 6, 00 155,9 + 6, 59 166,0 ± 6,87 175,1 + 6,55 9 Amostra 3 unidade activa 2,5 132,6 + 7,63 148,9 + 8, 51 157,3 + 8, 91 169,8 + 8, 96 179,4 + 81, 71 10 Amostra 3 unidade activa O LO 133,5 + 6,45 150,5 + 9, 55 158,8 + 8, 48 171,0 + 7,72 179,0 + 9,20 11 Fenfluramina LO 133,2 + 9,21 152,7 + 9, 09 160,0 + 9, 82 170,0 + 9,15 182,8 + 10,21 12 Veiculo (DMSO) 129,1 + 3,17 147,3 + 4, 37 155,0 + 6,29 166,0 ± 5, 91 174,8 + 8,26 Dp: Desvio Padrão TABELA 3Β

Efeitos da administração oral sobre o peso corporal em rato (dados pós-dose diários Grupo Tratamento oral Dose (mg/kg) Peso corporal médio do grupo (g i dp) no Dia: Pré-dose (D 2 3 4 6 6 7 8 1 Veículo (água) " 185,4 ± 7,77 192,6 í 7,16 202,0 í 10,17 211,2 ± 7,98 220,2 í 10,35 227,2 ± 10,26 235,8 ± 11,82 242, 8 í 11,97 2 Mostra 1 seiva 800 180,0 í 4,90 187,0 í 4,55 198,5 í 4,20 206,8 í 5,91 214,8 í 4,65 222,8 í 4,99 231,5 í 3,70 240, 0 í 3,65 3 Mostra 1 seiva 1000 185,0 í 0,07 186,0 í 8,28 193,2 í 6,42 204,0 í 6,40 212,4 í 5,81 223,0 í 6,33 232,6 í 7,70 240,4 í 6,66 4 Mostra 1 seiva 3200 181,8 í 9,18 184,6 í 8,88 186,2* í 8,67 189,8** í 9,99 199,2** í 9,34 210,6** í 10,21 219,0* ± 11,29 228,4* í 12,18 5 Mostra 1 seiva 0400 180,6 í 7,96 185,6 í 6,39 183,8** í 6,87 185,2** í 9,18 191,2** í 7,89 201,0 í 6,89 213,0** í 6,96 220, 0** í 7,94 6 Mostra 1 seiva 10000 182,8 í 12,22 181,4 í 14,06 179,8** í 15,85 180,6** í 13,85 185,6** í 11,28 192,2** í 10,99 203,4 i 11,68 212,4** í 11,35 7 Mostra 2 seca por pulverização 38 183,4 í 8,11 185,8 í 9,23 195,8 í 7,79 104,6 ± 9,79 214,4 í 9,61 222,6 ± 9,34 231,4 ± 10,62 239, 6 í 11,46 8 Mostra 2 seca por pulverização 76 100,6 í 6,47 103,4 í 7,57 188,6* í 6,73 198,2* í 8,50 206, 0* í 9,43 214,0 í 9,51 222,0 í 9,49 232,2 i 9,68 9 Mostra 3 unidade activa 2,5 188,2 í 9,42 191,2 í 11,15 200,0 í 11,25 209,6 í 12,28 219,6 í 12,95 229,4 í 13,69 238,4 í 14,50 247, 0 í 14,35 10 Mostra 3 unidade activa 5,0 186,4 í 10,2 192,0 i 9,93 192,4 í 9,84 201,0 i 11,27 209,4 í 12,70 219,8 í 11,86 228,2 í 12,28 236,0 í 13,95 11 Fenfluramina 7,5 190,3 1 9,11 190,3 í 10, 97 197,7 í 7,37 207,7 í 7,23 217,7 í 10,69 224,3 í 10,12 234,3 í 12,70 243,3 í 9,24 12 VEÍCULO (DMSO) “ 183,3 í 8,33 190,3 í 10,26 199,0 í 10,82 207,7 í 12,66 215,7 í 14,05 222,3 i 14,84 230,7 í 15,95 239,0 í 17,35 DP Desvio Padrão Grupos 2 - 8 foram comparados com veículo Grupo 1: *p<0,05, **p<0,01 Grupos 9 - 11 foram comparados com veículo Grupo 12: (sem significados) 4 Ο 41

Relatório de Histopatologia 0 exame histológico foi restrito ao fígado. Não foram detectadas alterações relacionadas ao tratamento para a Amostra 1 (líquido), a Amostra 2 (seiva seca por pulverização, Amostra 3 (unidade activa), fenfluramina ou o grupo de controlo com DMSO.

As verificações registadas eram de uma incidência semelhante nos grupos de controlo e nos grupos tratados. 42

TABELA

Sumário da incidência de patologia i microscópica Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo Grupo 1 2 3 4 5 6 0 800 1600 3200 6400 10000 Sexo: masculino mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg Machos em estudo 5 4 5 5 5 5 Animais completos 5 4 5 5 5 5 Figado 5 Examinado 5 4 5 5 5 0 Nenhuma anormalidade detectada 0 0 1 2 3 3 Focos de células inflamatórias parenquimatosas (Total) 0 1 0 0 0 3 Minima 0 1 0 0 0 1 Hipertrofia hepatócitos - centrolobular (Total) 0 0 0 0 0 1 Minima 0 0 0 0 0 0 Hemopoiese extramedular (Total Minima) 2 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 Necrose focal de hepatócitos (Total) Minima 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Infiltração Linfóide Portal (Total) Minima 3 4 4 3 2 2 3 4 4 3 2 2 Hepatócitos eosinofílicos focais (Total) 1 0 0 0 0 0 Minima 1 0 0 0 0 0 Fibrose portal (Total) 0 0 1 0 0 0 Minima 0 0 1 0 0 0 Figado (coloração ORO) Examinado 5 4 5 5 5 5 Nenhuma anormalidade detectada 2 3 2 4 3 3 Gordura no hepatócito - centrolobular (Total) 3 1 2 1 2 2 Minima 3 1 2 1 2 2 Gordura no hepatócito - periportal (Total) 0 0 1 0 0 0 Minima 0 0 1 0 0 0 Fígado Examinado 5 5 5 5 3 3 Nenhuma anormalidade detectada 2 2 0 1 0 2 Focos de células inflamatórias parenquimatosas 0 0 0 0 0 1 (Total) 0 0 0 0 0 1 Necrose focal de hepatócitos (Total) Minima 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Infiltração Linfóide Portal (Total) Minima 3 3 5 4 3 1 3 3 5 4 3 1 Leucócitos portal (Total) Minima 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 Figado (coloração ORO) Examinado 5 5 5 5 3 3 Nenhuma anormalidade detectada 5 3 3 3 2 2 Gordura no hepatócito - periportal (Total) 0 2 2 2 1 1 Minima 0 2 2 2 1 0 43 EXEMPLO 7

Um outro bioensaio, que utilizou as mesmas amostras de teste conforme descrito no Exemplo 6, está descrito no adiante. Os animais neste estudo receberam uma dieta restrita, isto é, os animais só receberam alimento entre 12:00 e 3:00 horas da tarde, diariamente. Os animais foram aclimatizados durante um período de sete dias (dias -7 a -1), o doseamento teve lugar do dia 0 até o dia 6 à 9:00 horas da manhã por meio de sonda oral. O período de recuperação foi dos dias 7 até o dia 13. Os grupos de dosagem estão descritos na Tabela 1 adiante. Deve-se observar que o grupo de controlo real é marcado como o Grupo 09. O Grupo 5 é um grupo controlado que recebeu uma dieta equivalente à do Grupo 4. A finalidade deste grupo era avaliar o efeito que uma dieta restrita tem sobre as vidas dos animais.

Resultados

Os resultados gerados durante o estudo demonstraram que o período de aclimatização foi muito curto. Os ratos alimentam-se principalmente durante a noite e a mudança súbita para um acesso restrito para alimentação durante 3 horas durante o tempo diurno, resultou em baixa ingestão diária. A ingestão diária de alimento estava ainda a aumentar na maioria dos grupos no final do período de aclimatização quando teve início o doseamento com os itens de teste. Como resultado disto, o efeito dos materiais de teste não afectaram de forma significativa a ingestão de alimento dos ratos durante o período de doseamento.

As massas corporais médias para os diferentes grupos para o dia -7 a -1 e os dias 0 a 6 estão ilustradas na Tabela 44

Dl e Tabela D2. o efeito das diferentes dosagens da seiva e da seiva seca por pulverização está apresentado nos gráficos apensos como o percentual da alteração na massa corporal do dia 0 a 7 (Figura 5) e o percentual da alteração na massa corporal do dia -7 a 7 (Figura 6) . A perda em massa corporal está claramente relacionada com a dose, especialmente com as dosagens mais altas. 0 exame histopatológico dos fígados não apresentou qualquer patologia significativa nos grupos que recebem os itens de teste.

Alimento A ingestão de alimento foi medida diariamente, durante a aclimatização e durante o estudo. 0 alimento estava disponível durante um período diário de alimentação de 3 horas, tendo início às 12:00 horas finalizando às 15:00 horas. Os animais ficaram em jejum durante o restante do tempo. Os animais do Grupo 5 receberam uma quantidade medida de alimento no Dia 1, equivalente à ingestão média de alimento do Grupo 4 no Dia 0. Este padrão de alimentação controlada para o Grupo 5, conforme determinado pela ingestão média de alimento do Grupo 4 do dia anterior, foi seguido para os Dias 1-7. Água A água foi fornecida em recipientes padrão. A água (Água de Torneira de Magalies Water Board, adequada para consumo humano) estava disponível ad libitum. O consumo de água foi medido uma vez ao dia, no mesmo horário, todos os dias, depois do término da ingestão de alimento. 45

Aclimatização

Os animais foram aclimatizados durante sete dias antes do inicio do estudo, tempo em que a ingestão de alimento e água foi determinada, conforme descrito acima. As massas corporais foram determinadas diariamente durante este período.

Procedimentos e Projecto de Estudo TABELA 1 PROJECTO DE ESTUDO GRUPO TESTE NÚMEROS DOSE ITEM DE TESTE 01 6 001 - 006 100 mg/kg Seiva congelada 02 6 007 - 012 400 mg/kg Seiva congelada 03 6 013 - 018 1600 mg/kg Seiva congelada 04 6 019 - 024 3200 mg/kg Seiva congelada 05 6 025 - 030 CONTROLO Opção Elga 4 Água purificada 06 6 031 - 036 2,2 mg/kg Seiva seca por pulverização 07 6 037 - 042 8,8 mg/kg Seiva seca por pulverização 08 6 043 - 048 35 mg/kg Seiva seca por pulverização 09 6 049 - 054 CONTROLO Opção Elga 4 Água purificada

Via de Administração

Os itens de teste foram administrados diariamente, durante sete dias, utilizando uma agulha intra-gástrica. Os animais ficaram em jejum durante 18 horas antes da administração do item (a partir das 09:00 hs).

Duração do Tratamento

Os animais foram tratados durante sete dias consecutivos (do Dia 0 - Dia 6) . Três animais de cada grupo foram sacrificados 24 horas depois do último doseamento (Dia 7) . Os 46 três animais restantes foram sacrificados 7 dias depois do ultimo dia de tratamento (Dia 13). Este procedimento foi seguido para todos os grupos, excepto para o Grupo 5, em que três animais foram sacrificados 24 horas depois da última alimentação controlada (Dia 8), os três animais restantes foram sacrificados 7 dias depois do último tratamento (Dia 13).

Massas Corporais

As massas corporais foram determinadas diariamente, aproximadamente no mesmo horário todos os dias pela duração do estudo, incluindo durante o período de aclimatização.

Eutanásia

Três animais de cada grupo foram sacrificados 24 horas depois do último doseamento (Dia 7).

Os três animais restantes foram sacrificados 7 dias depois do último tratamento. Este procedimento foi seguido para todos os grupos, excepto para o Grupo 5, em que três animais foram sacrificados 24 horas depois da última alimentação controlada (Dia 8) , os três animais restantes foram sacrificados 7 dias depois do último tratamento (Dia 13) . Todos os animais foram submetidos à eutanásia no final do período de estudo com CO2 gasoso.

Exames Oftalmoscópicos

Foram realizados exames oftalmoscópicos utilizando um oftalmoscópio, antes da primeira administração do item de teste e no término, em todos os animais, em todos os grupos. 47 foi

Patologia Macroscópica Uma autópsia completa submetido à eutanásia no foi realizada em final do período cada animal de estudo. que

Histopatologia 0 exame histopatológico foi realizado no fígado de cada um dos animais. TABELA D.l MASSA CORPORAIS MÉDIAS / GRUPO / SEMANA Gru Dose Massas corporais médias (g) e Desvio padrão po Oral (mg/ kg) Dia -7 Dia -6 Dia -5 Dia -4 Dia -3 Dia -2 Dia -1 01 Amostra 1 (seiva) 100 203,38 ± 95,39 197,13 ± 90,63 192,75 ± 89,49 188,62 ± 86,75 184,95 ± 84, 80 182,48 ± 83,47 182,25 ± 82,57 02 Amostra 1 (seiva) 400 192,53 ± 65,60 183,92 ± 61,20 178,25 ± 59,37 173,17 ± 58, 10 170,82 ± 57,42 168,25 ± 58,40 169,37 ± 59,25 03 Amostra 1 (seiva) 1600 149,25 ± 54,80 142,87 ± 51,89 136,85 ± 52,17 132,37 ± 49, 64 131.50 ± 49.50 129,67 ± 48, 89 131,12 ± 48,22 04 Amostra 1 (seiva) 3200 224,15 ± 80,70 214,45 ± 77,25 207,10 ± 76,38 201,82 ± 75,42 198,25 ± 74, 82 194,83 ± 75,34 196,77 ± 74,56 05 Opção Elga 4 Água purificada (controlo) 214,55 ± 74,90 204,85 ± 72,41 198,57 ± 71,79 193,48 ± 68,49 192,40 ± 67,48 190,87 ± 67,39 190,15 ± 65,24 06 Amostra 2 (seiva seca por pulverização 2,2 208,65 ± 65,74 199,37 ± 62,49 193,18 ± 61,18 188,25 ± 60, 89 186,22 ± 59, 98 184,55 ± 58, 86 185,97 ± 58,76 07 Amostra 2 (seiva seca por pulverização co co 256,95 ± 77,55 246,02 ± 73,67 237,47 ± 73,53 232,62 ± 71,73 229,78 ± 71,76 228,07 ± 69, 88 228,45± 68, 81 08 Amostra 2 (seiva seca por pulverização 35 194,37 ± 43,74 185,83 ± 42,70 177,53 ± 41, 10 172,05 ± 40, 13 170,10 ± 39,49 167,25 ± 37, 61 168,00 ± 38,83 09 Opção Elga 4 Água purificada (controlo) 171,52 ± 69,81 162,67 ±62,68 154,95 ± 61, 83 151,38 ± 59,48 149,63 ± 57, 66 148,30 ± 57.12 149,07 ± 56, 01 48 TABELA D.2 MASSA CORPORAIS MÉDIAS / GRUPO / SEMANA (Continuação) Grup 0 Tratamento Oral Dose (mg/k g) Massas corporais médias (g) e Desvio padrão Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 01 Amostra 1 (seiva) 100 183,87 ± 83,33 175,83 ± 81,82 175,72 ± 79,05 175,48 ± 77,54 175,53 ± 76,20 177,95 ± 73, 99 178,43 ± 72, 68 02 Amostra 1 (seiva) 400 173,45 ± 60,73 164,58 ± 58,52 164,75 ± 58,37 166,22 ± 57, 69 166,55 ± 57,79 169,93 ± 57,47 171,77 ± 57,29 03 Amostra 1 (seiva) 1600 134,38 ± 46,01 129,20 ± 44,74 127,53 ± 43,20 127,20 ± 41,36 126,70 ± 39,19 128,00 ± 39,22 128,07 ± 38, 66 04 Amostra 1 (seiva) 3200 19 9, 60 ± 75,16 196,38 ± 73, 96 192.20 ± 71.20 189,05 ± 69, 11 186,57 ± 66,29 186,05 ± 67,45 185,68 ± 65,73 05 Opção Elga 4 Água purificada (controlo) 194,25 ± 67,46 187,93 ± 65,48 181,97 ± 65,01 177,53 ± 64,73 174,73 ± 61,08 172,85 ± 58, 63 171,45 ± 56,79 06 Amostra 2 (seiva seca por pulverização 2,2 189,07 ± 60,15 181,52 ± 58,99 181,48 ± 57,79 184,42 ± 55, 64 185,75 ± 55,29 189,35 ± 54, 66 189,68 ± 53,70 07 Amostra 2 (seiva seca por pulverização co co 230,28 ± 69,32 221,55 ± 68,02 220,17 ± 6 6,63 221,80 ± 63, 88 222,82 ± 63,56 224,82± 62,38 224,90 ± 62, 05 08 Amostra 2 (seiva seca por pulverização 35 169,10 ± 38,40 164,42 ± 38,03 162,50 ± 36,81 162,75 ± 36,36 162,52 ± 36, 93 164,30 ± 37,69 164,22 ± 37, 18 09 Opção Elga 4 Água purificada (controlo) 151,02 ± 55,45 146,55 ± 53,77 148,10 ± 52,63 149,70 ± 52, 05 152,58 ± 50,37 155,82 ± 49, 91 157,85 ± 49,70 49 TABELA D.3 MASSA CORPORAIS MÉDIAS / GRUPO / SEMANA (Continuação) Grupo Tratamento Dose Massas corporais médias (g) e Desvio padrão Oral (mg/ kg) Dia 7 Dia 8 Dia 9 Dia 10 Dia 11 Dia 12 Dia 13 01 Amostra 1 (seiva) 100 185,38 ± 72,64 234,73 ± 62,44 226,73 ± 62,39 234,07 ± 62, 09 236,33 ± 62,31 239, 07 ± 60,24 238,43 ± 59, 85 02 Amostra 1 (seiva) 400 178,83 ± 58,24 225,63 ± 13,05 277,13 ± 14,18 227,10 ± 14, 03 229,43 ± 16, 97 234,93 ± 18,35 236,20 ± 15, 97 03 Amostra 1 (seiva) 1600 132,22 ± 37,08 133,80 ± 55,17 135,23 ± 445,74 134,53 ± 54, 96 138,30 ± 53,03 139,30 ± 51,10 142,80 ± 49,51 04 Amostra 1 (seiva) 3200 188,57 ± 66,14 199,63 ± 61,07 198,90 ± 57,48 198,70 ± 54,55 194,73 ± 52,78 194,93 ± 50,78 197,93 ± 51,57 05 Opção Elga 4 Água purificada (controlo) 173,97 ± 54,29 172,98 ± 52,06 157,80 ± 58,62 158,87 ± 57,76 160,80 ± 57,67 163,40 ± 56,27 167,80 ± 58,49 06 Amostra 2 (seiva seca por pulverização 2,2 196,00 ± 53,09 190,27 ± 27,78 190,27 ± 29,54 192,60 ± 29, 09 194,73 ± 29,68 196,97 ± 29,04 198,60 ± 30, 18 07 Amostra 2 (seiva seca por pulverização co co 231,30 ± 61, 91 177,27 ± 24,48 178,17 ± 23,79 180,67 ± 25, 04 182,03 ± 25,31 185,10 ± 24,60 189,73 ± 23,58 08 Amostra 2 (seiva seca por pulverização 35 167,48 ± 36,75 164,90 ± 22,54 166,63 ± 23,08 168,43 ± 22, 66 171,67 ± 24,42 174,90 ± 25,70 178,57 ± 23,58 09 Opção Elga 4 Água purificada (controlo) 165,50 ± 49,27 193,73 ± 22,37 196,87 ± 21,86 198,07 ± 21, 02 199,83 ± 20,21 204,93 ± 18,65 207,13 ± 18,22 50

TABELA 1: AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE SECÇÃO DE FÍGADO DE RATOS MACHOS - Amostra 1 GRUPO 1: 100 mg/kg Amostra 1 GRUPO 2: 400 mg/kg Amostra 1 Animal N° Lesões hepáticas Animal N° Lesões hepáticas Dia 7 01 NPL 07 FS1 + 02 NPL 08 NPL C1+ 03 NPL C1+ 09 NPL Dia 13 04 NPL MLC Dia 13 10 DHS1 + 05 FHS1 + 11 NPL 06 NPL 12 DHS1 +

GRUPO 3: 1600 mg/kg Amostra 1 GRUPO 4: 3200 mg/kg Amostra 1 Animal N° Lesões hepáticas Animal N° Lesões hepáticas Dia 7 13 NPL 19 NPL 14 NPL 20 NPL 15 NPL 21 NPL Dia 13 16 NPL Dia 13 22 DHS1 + 17 DHS1 + 23 FHS1 + 18 NPL 24 NPL

GRUPO 5: CONTROLO: OPÇÃO ELGA 4 AGUA PURIFICADA: INGESTÃO

RESTRITA DE ALIMENTO GRUPO 5: 100 mg/kg Amostra 1 Animal N° Lesões hepáticas Dia 7 25 NPL MLC 26 NPL 27 NPL Dia 13 28 DHS1 + 29 DHS1 + 30 NPL 3+ = Grave LEGENDA: C = Congestão DHS = Inchaço celular hidrófico difuso FHS = Inchaço celular hidrófico focal NPL = Nenhuma lesão parenquimatosa MLC = Acumulação linfocitica minima 1+ = Suave; 2+ = Moderada 51

TABELA 2: AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA DE SECÇÃO DE FÍGADO DE RATOS MACHOS - Amostra 2 GRUPO 6: 2,2 mg/kg Amostra 2 GRUPO 7: 8,8 mg/kg Amostra 2 Animal N° Lesões hepáticas Animal N° Lesões hepáticas Dia 7 31 NPL 37 NPL 32 NPL MLC 38 NPL 33 FHS1 + 39 NPL C1+ Dia 13 34 NPL Dia 13 40 DHS1 + 35 DHS1 + 41 NPL 36 NPL 42 MLC FHS1+ GRUPO 8: 35 mg/kg Amostra 2 Animal N° Lesões hepáticas Dia 7 43 NPL 44 NPL 45 NPL Dia 13 46 NPL 47 NPL C1+ 48 MLC FHS1+

GRUPO 9: CONTROLO: OPÇÃO ELGA 4 ÁGUA PURIFICADA GRUPO 9: controlo: opção Elga 4 água purificada Animal N° Lesões hepáticas Dia 7 49 NPL MLC 50 NPL 51 NPL Dia 13 52 DHS1 + 53 DHS1 + 54 NPL 3+ = Grave LEGENDA i C = Congestão DHS = Inchaço celular hidrófico difuso FHS = Inchaço celular hidrófico focal NPL = Nenhuma lesão parenquimatosa MLC = Acumulação linfocitica minima 1+ = Suave; 2+ = Moderada 52 Não foram registadas lesões especificas nas secções do figado dos ratos experimentais que receberam a seiva congelada, bem como a seiva seca por pulverização que pudessem ser atribuídas à administração oral dos químicos acima mencionados. 0 inchaço celular hidrópico registado tanto nos ratos de controlo como nos experimentais podem indicar inchaço celular metabólico normal e alterações anóxicas. Foram encontrados focos mínimos de acumulação perivascular linfocítica em alguns animais e, muito provavelmente, isto é uma observação incidental. Em alguns ratos está presente a congestão de grau suave nos sinusoides hepáticos e isto deve ser considerado como uma observação incidental.

Uma característica importante da invenção demonstrada pelos resultados deste estudo é que não foi desenvolvida tolerância a qualquer das amostras, durante o período de teste. Isto pode proporcionar um benefício considerável, particularmente em relação ao tratamento da obesidade.

Embora os compostos e as composições tenham sido descritos principalmente em relação à suas propriedades como supressores do apetite, deve-se observar que esta expressão -"supressor do apetite" - é utilizada neste contexto para indicar a actividade que tende a limitar o apetite e/ou aumentar a sensação de saciedade e, deste modo, tende a reduzir a ingestão calorífica total; isto, por sua vez, tende a contrabalançar a obesidade. Em concordância, esta invenção disponibiliza o método para tratar, prevenir ou combater a obesidade num ser humano ou animal não humano que compreende 53 administrar ao referido ser humano ou animal não humano uma quantidade para tratar, prevenir ou combater a obesidade de uma composição ou extracto contendo um composto de fórmula (D - 0 termo "animal", conforme utilizado neste contexto, estende-se, mas não se limita a animais de companhia, por exemplo, os animais domésticos e os animais domesticados; exemplos não limitativos de tais animais incluem gado, ovelhas, furões, suínos, camelos, cavalos, aves, peixes, coelhos, caprinos, cães e gatos.

Como agente anoréctico ou no tratamento ou prevenção da obesidade num ser humano, um composto de fórmula (1) ou a composição definida em qualquer das reivindicações a seguir, é administrado, de forma vantajosa, a um ser humano numa quantidade de dosagem de cerca de 0,01 mg/kg/dia a cerca de 10 mg/kg/dia. Uma gama de dosagem preferida é de 0,05 mg/kg/dia a 0,5 mg/kg/dia. Quando se utiliza a forma em pó seco por pulverização, uma gama de dosagem preferida é de 0,1 mg/kg/dia a 20 mg/kg/dia; especialmente preferida é a dose de 0,5 mg/kg/dia a 5 mg/kg/dia.

Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização, na preparação de um medicamento tendo actividade supressora do apetite para tratar, prevenir ou combater a obesidade de um ser humano ou animal, de um extracto de uma planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia, cujo extracto contém uma quantidade eficaz de um glocósido esteroidal supressor do apetite da referida planta, em que o glocósido esteroidal tem a fórmula

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o extracto pode ser obtido por meio de um processo que inclui os passos de tratar o material vegetal com um solvente para extrair uma fracção tendo actividade supressora do apetite, separar a solução do extracto do resto do material vegetal, remover o solvente da solução do extracto e recuperar o extracto.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o extracto pode ser obtido por meio de um processo que inclui os passos de prensar o material vegetal para separar a seiva do material sólido da planta e recuperar 2 a seiva livre do material sólido da planta para formar o extracto.

4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia é seleccionada da espécie Trichocaulon piliferum e Trichocaulon officinale e a planta do género Hoodia é seleccionada da espécie Hoodia currorii, Hoodia gordonii e Hoodia lugardii.

5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 4, em que o processo inclui o passo de concentrar o agente activo no material extraído por meio de extracção adicional com um solvente.

6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 2, 4 ou 5, em que o solvente no passo ou passos de extracção do solvente do processo é um ou mais de cloreto de metileno, metanol, hexano, acetato de etilo ou misturas destes.

7. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 6, em que o processo inclui o passo de concentrar o agente activo no material extraído por meio de separação cromatográfica.

8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a separação cromatográfica utiliza um ou mais de clorofórmio, metanol, acetato de etilo, hexano ou misturas destes como eluente. 3

9. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o processo inclui levar a cabo a separação cromatográfica numa coluna, colher o eluido em fracções da coluna, avaliar as fracções para determinar a sua actividade supressora do apetite e seleccionar a pelo menos uma fracção contendo o agente supressor do apetite.

10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 9, em que, no processo, o extracto é processado para formar um pó de fluidez livre.

11. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que um medicamento é preparado na forma de dose unitária.

12. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a planta é seleccionada de Hoodia currorii, Hoodia gordonii e Hoodia lugardii.

13. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a planta é Hoodia gordonii.

14. Método não terapêutico para reduzir a ingestão calorífica total de um ser humano ou animal, o método compreendendo administrar ao referido ser humano ou animal um alimento ou bebida compreendendo um extracto de uma planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia, cujo extracto contém uma quantidade eficaz de um 4 glicósido esteroidal supressor do apetite da referida planta, em que o glicósido esteroidal tem a fórmula

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o extracto pode ser obtido por meio de um processo que inclui os passos de tratar o material vegetal com um solvente para extrair uma fracção tendo actividade supressora do apetite, separar a solução do extracto do resto do material vegetal, remover o solvente da solução do extracto e recuperar o extracto.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o extracto pode ser obtido por meio de um processo incluindo os passos de prensar o material vegetal para separar a seiva do material sólido da planta e recuperar a seiva livre do material sólido da planta para formar o extracto.

17. Método de acordo com qualquer das reivindicações 14 a 16, em que a planta do género Trichocaulon ou do género Hoodia é seleccionada da espécie Trichocaulon piliferum e Trichocaulon officinale e a planta do género Hoodia é 5 seleccionada da espécie Hoodia currorii, Hoodia gordonii e Hoodia lugardii.

18. Método de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 17, em que o processo inclui o passo de concentrar o agente activo no material extraído por meio de extracção adicional com um solvente.

19. Método de acordo com qualquer das reivindicações 15, 17 ou 18, em que o solvente no passo ou passos de extracção do solvente do processo é um ou mais de cloreto de metileno, metanol, hexano, acetato de etilo ou misturas destes.

20. Método de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 18, em que o processo inclui o passo de concentrar o agente activo no material extraído por meio de separação cromatográfica.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a separação cromatográfica utiliza um ou mais de clorofórmio, metanol, acetato de etilo, hexano ou misturas destes como eluente.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que o processo inclui levar a cabo a separação cromatográfica numa coluna, colher o eluído em fracções da coluna, avaliar as fracções para determinar a sua actividade supressora do apetite e seleccionar a pelo menos uma fracção contendo o agente supressor do apetite. 6

23. Método de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 22, em que, no processo, o extracto é processado para formar um pó de fluidez livre.

24. Método de acordo com qualquer das reivindicações 14 a 23, em que a planta é seleccionada de Hoodia currorii, Hoodia gordonii e Hoodia lugardii.

25. Método de acordo com qualquer das reivindicações 14 a 24, em que a planta é Hoodia gordonii. Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007