PL197783B1 - Glikozyd steroidowy, środek o czynności hamowania łaknienia, produkt żywnościowy lub napój, zastosowanie glikozydu steroidowego, nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia oraz ekstrakt roślinny - Google Patents

Glikozyd steroidowy, środek o czynności hamowania łaknienia, produkt żywnościowy lub napój, zastosowanie glikozydu steroidowego, nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia oraz ekstrakt roślinny

Info

Publication number
PL197783B1
PL197783B1 PL374521A PL37452198A PL197783B1 PL 197783 B1 PL197783 B1 PL 197783B1 PL 374521 A PL374521 A PL 374521A PL 37452198 A PL37452198 A PL 37452198A PL 197783 B1 PL197783 B1 PL 197783B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
compound
animal
sample
extract
group
Prior art date
Application number
PL374521A
Other languages
English (en)
Inventor
Heerden Fanie Retief Van
Robert Vleggaar
Roelof Marthinus Horak
Robin Alec Learmonth
Vinesh Maharaj
Rory Desmond Whittal
Original Assignee
Csir
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Csir filed Critical Csir
Publication of PL197783B1 publication Critical patent/PL197783B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/33—Cactaceae (Cactus family), e.g. pricklypear or Cereus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/765—Polymers containing oxygen
    • A61K31/78—Polymers containing oxygen of acrylic acid or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/27—Asclepiadaceae (Milkweed family), e.g. hoya
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C07H13/08—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals directly attached to carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/04—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
    • C07H5/08—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to sulfur, selenium or tellurium
    • C07H5/10—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to sulfur, selenium or tellurium to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J15/00—Stereochemically pure steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having a partially or totally inverted skeleton, e.g. retrosteroids, L-isomers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J17/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, having an oxygen-containing hetero ring not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J17/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, having an oxygen-containing hetero ring not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J17/005—Glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/002—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa not substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/0025—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/001—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group
    • C07J7/0015—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa
    • C07J7/0025—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa substituted in position 16
    • C07J7/0035—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by a keto group not substituted in position 17 alfa substituted in position 16 by a hydroxy group free esterified or etherified
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J7/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms
    • C07J7/0005—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21
    • C07J7/0065—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by an OH group free esterified or etherified
    • C07J7/007—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms not substituted in position 21 substituted in position 20 by an OH group free esterified or etherified not substituted in position 17 alfa
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

1. Glikozyd steroidowy o wzorze (1): 14. Zastosowanie zwi azku zdefiniowanego w zastrz. 1 w ilo sci skutecznej do hamowania lak- nienia do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania iub zwalczania oty losci. 18. Ekstrakt ro slinny z ro sliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, znamienny tym, ze zawiera skuteczn a do hamowania laknienia ilo sc zwi azku o wzorze (1) zdefiniowanego w zastrz. PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są glikozyd steroidowy, środek o czynności hamowania łaknienia lub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii, produkt żywnościowy lub napój, zastosowanie glikozydu steroidowego, nieterapeutyczny sposób zmniejszania całkowitego spożycia kalorii lub hamowania łaknienia oraz ekstrakt roślinny z roślin wybranych z grupy obejmującej rodzaj Trichocaulon i rodzaj Hoodia.
Ekstrakt roślinny można wytworzyć z materiału roślinnego, takiego jak łodygi i korzenie takich roślin rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia. Rodzaj Trichocaulon i rodzaj Hoodia obejmuje sukulenty rosnące w jałowych regionach znajdujących się w Afryce Południowej. W Botanische Jahrbucher fur Systematik Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie, vol. 115, nr 2, str. 145-270 P. Bruynsa, będącej zasadniczo pracą przeglądową z dziedziny taksonomii, wspomniano o rodzajach Trichocaulon i Hoodia. Zgodnie z jednym z zastosowań tego wynalazku ekstrakt o czynności hamowania łaknienia uzyskuje się z gatunku Trichocaulon piliferum. W celu dostarczenia ekstraktu o czynności hamowania łaknienia można również użyć gatunku Trichocaulon officinale. Zgodnie z innym zastosowaniem tego wynalazku ekstrakt o czynności hamowania łaknienia można uzyskać z gatunku Hoodia currorii, Hoodia gordonii lub Hoodia lugardii. Próby biologiczne prowadzone przez zgłaszającego na szczurach wykazały, że pewne ekstrakty mają czynność hamowania łaknienia.
Materiał roślinny można homogenizować w obecności odpowiedniego rozpuszczalnika, np. mieszaniny rozpuszczalników metanol/chlorek metylenu, z użyciem urządzenia, takiego jak mieszarka Waringa. Roztwór ekstrakcyjny można następnie oddzielić od pozostałego materiału roślinnego z zastosowaniem odpowiedniego sposobu rozdzielania, takiego jak np. odsączenie lub odwirowanie. Rozpuszczalnik ten można usunąć z użyciem wyparki rotacyjnej, korzystnie w łaźni wodnej w temperaturze wynoszącej 60°C. Oddzielony surowy ekstrakt można następnie poddać ekstrakcji chlorkiem metylenu i wodą, po czym rozdzielić ekstrakty w chlorku metylenu i w wodzie. Ekstrakt w chlorku metylenu może zawierać rozpuszczalnik, który korzystnie usuwa się drogą odparowania w wyparce rotacyjnej i uzyskany ekstrakt można dodatkowo oczyszczać drogą ekstrakcji z użyciem mieszaniny metanol/heksan. Produkt z ekstrakcji mieszaniną metanol/heksan można następnie rozdzielić z uzyskaniem ekstraktu w metanolu i ekstraktu w heksanie. Ekstrakt w metanolu można następnie odparować w celu usunięcia rozpuszczalnika z uzyskaniem częściowo oczyszczonego czynnego ekstraktu.
Częściowo oczyszczony czynny ekstrakt można rozpuścić w metanolu i dodatkowo frakcjonować drogą chromatografii kolumnowej z zastosowaniem żelu krzemionkowego jako ośrodka adsorbującego i mieszaniny chloroform/30% metanol jako eluenta. Można otrzymać wiele różnych frakcji i każdą z nich można oceniać poprzez zastosowanie odpowiednich procedur prób biologicznych i określić ich czynność hamowania łaknienia.
Frakcję o czynności hamowania łaknienia można korzystnie dodatkowo frakcjonować np. drogą chromatografii kolumnowej z użyciem żelu krzemionkowego jako ośrodka adsorpcyjnego i mieszaniny chloroform:metanol w stosunku 9:1 jako rozpuszczalnika i uzyskane podfrakcje można poddawać próbom biologicznym odnośnie ich czynności hamowania łaknienia. Podfrakcję wykazującą czynność hamowania łaknienia, w razie potrzeby, można dodatkowo frakcjonować i oczyszczać, dogodnie z użyciem metody chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym jako ośrodku adsorpcyjnym i z użyciem mieszaniny octan etylu:heksan w stosunku 9:1 jako rozpuszczalnika. Uzyskane oczyszczone frakcje można ponownie oceniać drogą odpowiednich procedur prób biologicznych pod względem ich czynności hamowania łaknienia.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że co najmniej jedna taka oczyszczona frakcja wykazuje dobrą czynność hamowania łaknienia i czynną zasadę we frakcji zidentyfikowano zwykłymi metodami chemicznymi, w tym metodą nuklearnego rezonansu magnetycznego, i stwierdzono że jest nią związek o wzorze strukturalnym
PL 197 783 B1
Zgodnie z nomenklaturą S.I. czynną zasadą (1) jest związek 3-O-[-3-D-tewetopiranozylo(1—-4)-p-D-cymaropiranozylo-(1 >4)-p-D-cymaropiranozylo]-12p-O-tygloiloksy-14-hydroksy-14p-pregn-50-en-20-On (C47H74O-|5 M 878).
Związek (1) jest nowym związkiem.
Wynalazek dotyczy zatem glikozydu steroidowego o wzorze (1):
Związek ten stosuje się do hamowania łaknienia lub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia lub do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości u człowieka lub zwierzęcia.
Wynalazek dotyczy również środka o czynności hamowania łaknienia lub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia lub do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości u człowieka lub zwierzęcia, charakteryzującego się tym, że zawiera skuteczną do hamowania łaknienia ilość związku o wzorze (1) zdefiniowanego powyżej.
Środek ten stosuje się do hamowania łaknienia u człowieka lub zwierzęcia.
Środek ten stosuje się do zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia.
Środek ten stosuje się do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości u człowieka lub zwierzęcia.
Korzystnie środek jest zmieszany z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
Korzystnie środek jest sformułowany w jednostkową postać dawkowaną.
Korzystnie środek ten stanowi produkt żywnościowy lub napój.
Wynalazek dotyczy także produktu żywnościowego lub napoju, charakteryzującego się tym, że zawiera skuteczną do hamowania łaknienia ilość związku o wzorze (1) zdefiniowanego powyżej.
Wynalazek dotyczy też zastosowania związku zdefiniowanego powyżej w ilości skutecznej do hamowania łaknienia do wytwarzania leku do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.
Wynalazek dotyczy ponadto nieterapeutycznego sposobu hamowania łaknienia lub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia, polegającego na tym, że podaje się człowiekowi lub zwierzęciu skuteczną do hamowania łaknienia ilość związku o wzorze (1) zdefiniowanego powyżej.
PL 197 783 B1
Wynalazek dotyczy również nieterapeutycznego sposobu hamowania łaknienia lub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia, polegającego na tym, że podaje się człowiekowi lub zwierzęciu środek zawierający skuteczną do hamowania łaknienia ilość związku o wzorze (1) zdefiniowanego powyżej.
W tym nieterapeutycznym sposobie korzystnie środek ten stanowi produkt żywnościowy lub napój.
Wynalazek dotyczy także ekstraktu roślinnego z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, charakteryzującego się tym, że zawiera skuteczną do hamowania łaknienia ilość związku o wzorze (1) zdefiniowanego powyżej.
Korzystnie roślina rodzaju Trichocaulon jest wybrana z grupy obejmującej gatunek Trichocaulon piliferum i Trichocaulon officinale, a roślina rodzaju Hoodia jest wybrana z grupy obejmującej gatunek Hoodia currorii, Hoodia gordonii i Hoodia lugardii, w szczególności roślina jest wybrana z grupy obejmującej gatunek Hoodia currorii, Hoodia gordonii i Hoodia lugardii.
Korzystnie ekstrakt jest zasadniczo wolny od wszystkich nieaktywnych zanieczyszczeń.
Korzystnie ekstrakt jest w postaci sypkiego proszku.
Korzystnie ekstrakt stosuje się jako lek o czynności hamowania łaknienia.
Korzystnie ekstrakt stosuje się do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości.
Wynalazek dotyczy ponadto środka o czynności hamowania łaknienia, zawierającego ekstrakt zdefiniowany powyżej.
Korzystnie środek ten jest zmieszany z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
Korzystnie środek ten jest sformułowany w jednostkową postać dawkowaną.
Ekstrakt z roślin rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierający czynnik hamujący łaknienie, można wytwarzać sposobem obejmującym etapy prasowania zebranego materiału roślinnego dla oddzielenia soku od stałego materiału roślinnego, oraz odzyskiwania soku wolnego od stałego materiału roślinnego z wytworzeniem ekstraktu.
Ekstrakt z roślin rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia, zawierający czynnik hamujący łaknienie, wytwarza się sposobem polegającym na traktowaniu zebranego materiału roślinnego rozpuszczalnikiem dla wyekstrahowania frakcji o czynności hamowania łaknienia, oddzielaniu roztworu ekstrakcyjnego od pozostałego materiału roślinnego, usuwaniu rozpuszczalnika z roztworu ekstrakcyjnego i odzyskaniu ekstraktu. Uzyskany ekstrakt można dalej oczyszczać np. drogą odpowiednich procedur ekstrakcji rozpuszczalnikowej.
Ekstrakt można wysuszyć i usunąć wodę, np. drogą suszenia rozpyłowego, liofilizacji lub suszenia pod próżnią z wytworzeniem sypkiego proszku.
Związek o wzorze (1) można wytwarzać na drodze syntezy.
W sposobie wytwarzania tego związku można stosować jako związek wyjściowy (lub związek pośredni lub prekursor) steroid o wzorze chemicznym
Steroid (15) można wytworzyć z użyciem związku o wzorze (22) sposobem obejmującym następujące etapy:
PL 197 783 B1 (i) progesterono wworze
poddaje się działaniu mikrnnreaoizmu Calonectria decora z wytwnrzsoism 12-,15a-dihydrnksyprnesstsrnou o wznrzs
(ii) związzS (17) prnddje się ddiałaniu chlorkk tonslu i piryydyo z wytworzzsiem 122-l-hyronks-15a-(p-tnlusonsullOoyln)prnesstsrnou o wznrzs
(iii) związsk (18) pnddajs się działaoiu knlidyoy w tsmpsraturzs 150°C z wytwnrzsoism 12--hy14 drnksy-Δ 1 -prn-esstsrnou n wznrzs
PL 197 783 B1 (iv) związek (19) poddaje się działaniu chlorku acetylu i bezwodnika octowego w temperaturze 120°C z wytworzeniem 3,123-diacetoksypregna-3,5,14-trien-20-onu o wzorze
(v) związek (20) poddaje się działaniu glikolu etylenowego i katalitycznej ilości kwasu p-toluenosulfonowego z wytworzeniem 3,123-diacetoksy-20,20-etylenodioksypregna-3,5,14-trienu o wzorze
(vi) związek (21) poddaje się działaniu NaBH4 z wytworzeniem 33,123-dihydroksy-20,20-etylenodioksypregna-5,14-dieno-12-octanu o wzorze
W pierwszej alternatywnej procedurze sposób wytwarzania steroidu (15) obejmującym następujące etapy (a) związek (22) poddaje się działaniu środka redukującego, np. L1AIH4, z wytworzeniem 3β ,123-dihydroksy-20,20-etylenodioksypregna-5,14-dienu o wzorze
PL 197 783 B1
(b) związek (23) poddaje się działaniu N-bromoacetamidu (NBA) i zasady, np. pirydyny z wytworzeniem 3β ,123-dihydroksy-14,15-epoksy-20,20-etylenodioksypregn-5-enu o wzorze
(c) związek (24) poddaje się działaniu środka redukującego, np. LiAIH4, np. w trakcie ogrzewania w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, z wytworzeniem 3β,12β ,143-trihydroksy-20,20-etylenodioksypregn-5-enu o wzorze
i (d) związek (25) poddaje się działaniu kwasu, np. kwasu octowego, i wody z wytworzeniem steroidu, związku pośredniego, 3β,12β ,143-trihydroksypregn-5-enu (15).
Schemat reakcji A dotyczy procedury wytwarzania steroidu, związku pośredniego (15) z użyciem związku (22) zgodnie z „pierwszym alternatywnym sposobem" (obejmuje wytwarzanie związku (22) z użyciem związku (16) dla celu zilustrowania).
PL 197 783 B1
Schemat reakcji A
PL 197 783 B1
W drugiej alternatywnej procedurze sposób wytwarzania steroidu (15) obejmuje następujące etapy (a) związek (22), (3β, 12|3dihydroksy-20,20-etylenodioksypregna-5,14-dieno-12-octan), poddaje się działaniu chlorku kwasu p-toluenosulfonowego i zasady, np. pirydyny, z wytworzeniem 3β,12p-dihydroksy-20,20-etylenodioksypregna-5,14-dieno-3-tosylo-12-octanu o wzorze
(b) zwiąąek (26) ppddaae się; όζίθ^ηίυ ootanu ppfasu w roopuszczalniku, np. acj^ec^ni^, zwyyworzeniem 6β ,123-dihydroksy-20,20-etylenodioksy-3,5a-cyklopregnan-14-eno-12-octanu o wzorze
(c) związek (27) poddaje sśę dzżałaniu śr^c^-^^k^ redukującego, no. LiAIH4, i np. te^ahydrofrjranu, z wytworzeniem 6β ,12,-dihydroksy-20,20-etylenodioksy-3,5a-cyklo-pregnan-14-enu o wzorze
(d) związek (28) poddaje się działaniu N-bromoacetamidu, ewentualnie kwasu octowego, i zasady, np. pirydyny, z wytworzeniem 6 β ,123-dihydroksy-20,20-etyleno-dioksy-14,15-epoksy-3,5a-cyklopregnanu o wzorze
PL 197 783 B1
(e) związek (29) poddaje się działaniu środka redukującego, np. LiAlH4, i np. tetrahydrofuranu, z wytworzeniem 6β ,12β ,14e-trihydroksy-20,20-etylenodioksy-3,5a-cyklopregnanu o wzorze
i (f) związek (30) poddaje się działaniu kwasu, np. kwasu chlorowodorowego, i rozpuszczalnika np. acetonu, z wytworzeniem związku (15).
Na schemacie reakcji B podano procedurę wytwarzania steroidu, związku pośredniego (15), z użyciem związku (22) zgodnie z „drugim alternatywnym sposobem".
PL 197 783 Β1
Schemat reakcji B
(26)
HO (15) mieszanina epimerów (15a) C-17p-acetyl (15b) C-17a-acetyl
Związek (1) można zsyntezować z użyciem pierwszego węglowodanu, związku pośredniego w postaci zaaktywowanej reszty monosacharydu, cymarozy, którą można wytworzyć z użyciem związku o wzorze (36). Związek (36) można wytworzyć sposobem obejmującym następujące etapy
PL 197 783 B1 (i) metylo-α-D-glukozę o wzorze
poddaje się działaniu benzaldehydu i chlozOk cynku o wytwozoeniem metylOg4,6gOgbenoylidenog -a gDggluOopizanooydk o woozoe
(ii) związok 032) ppolddje się działaniu cłilcoZu OoosIu i pirzddny oz Oernepeaturzo 0°C, z wztwzzoeniem metylog4,6gOgbenoylidenog2gOgtosylogagDgglkOopizanooydk o woozoe
(iii) związok 032) ppOddje oię ddiajaniu NaOMe w 0emeptaturao 000°C o wztwzraokiem η^γίοg4,6gOgbenoylidenog2gOgmetylogagDgaltzopizanooydk o woozoe
(iv) związok 032) ppoddje oię 0^80111.1 N-grameoukocnymidu ONNS) z wztwzraokiem η^γίο--gbzomog4gOgbenooilo 2gOgmetylog6gdeoOsygagDgaltzopizanooydk o woozoe
i (v) owizoeO (25) poddaje się doiałanik aaBH4 i aiCl2, o wytwozoeniem metylog4gOgbenooilog2g gOgmetylog6gdeoOsygagDgaltzopizanooydk o woozoe
PL 197 783 B1
Sposób wytwarzania węglowodanu, związku pośredniego w postaci zaaktywowanej reszty monosacharydu, cymarozy, obejmuje następujące etapy (i) związek (36) poddaje się działaniu PhSSiMe3 i fluorometanosulfonianu trimetylosiiliu z wytworzeniem 4-O-benzoilo-3-O-metylo-6-deoksy-a3-D-fenylotioaltrozydu o wzorze
(ii) ewentualnie związek (37) poddaje się działaniu trifuorku dietyloaminosiarki (DAST), np. w temperaturze 0°C, z wytworzeniem 4-O-benzoilo-3-O-metylo-2-fenylotio-2,6-dideoksy-a3-D-fluorocymaropiranozydu o wzorze
lub (iii) ewentualnie związek (37) poddaje się działaniu chlorku t-butylodimetylosililu i imidazoiu w rozpuszczalniku, np. pirydynie, z wytworzeniem 4-O-benzoilo-3-O-metylo-2-O-t-butylodimetylosililo-αβ-D-fenylotioaltrozydu o wzorze
w którym Z = TBDMS = t-butylodimetylosilil i (iv) związek (39) poddaje się działaniu zasady, np. metanolanu sodu, z wytworzeniem 3-O-metylo-2-O-t-butylo-dimetylosililo-a3-D-fenylotioaltrozydu o wzorze
PL 197 783 B1
w którym Z = TBDMS = t-butylodimetylosilil.
Na schemacie reakcji C przedstawiono procedurę syntezy zaaktywowanej reszty monosacharydu, cymarozy (40) z użyciem związku (36) (obejmuje on wytwarzanie związku (36) z użyciem związku (31) dla celów ilustracji).
Schemat reakcji C
Z=t-butylodimetylosilil
PL 197 783 B1
W sposobie syntezy związku (1) można również użyć drugiego węglowodanu, związku pośredniego w postaci zaaktywowanej reszty monosacharydu, tewetozy, którą można wytworzyć z użyciem związku o wzorze (47). Związek (47) można wytworzyć sposobem obejmującym następujące etapy (i) α-D-glukozę o wzorze
poddaje się działaniu acetonu i kwasu siarkowego z wytworzeniem 1,2:5,6-di-O-izopropylideno-α-D-glukofuranozy o wzorze
(ii) związek (42) poddaje się działaniu NaH i Mel z wytworzeniem 1,2:5,6-di-O-izopropylideno-3-O-metylo-a-D-glukofuranozy o wzorze
(iii) związek (43) poddaje się działaniu kwasu octowego z wytworzeniem 3-O-metylo-ap-D-glukopiranozy o wzorze
PL 197 783 B1 (iv) związek (44) poddaje się działaniu metanolu i kwasu chlorowodorowego z wytworzeniem
(v) związek (45) poddaje się działaniu benzaldehydu i chlorku cynku z wytworzeniem metylo-4,6-O-benzylideno-3-O-metylo-ae-glukopiranozydu o wzorze
(vi) zwiąązk(44)ppoddjesięddiałaniuN-bromosskccnamidu,cClorkk niklu i bbrowoodrkk ssou z wytworzeniem metylo-4-O-benzoilo-3-O-metylo-6-deoksy-a3-glukopiranozydu o wzorze
Sposób wytwarzania zaaktywowanej reszty monosacharydu, tewetozy obejmuje następujące etapy (i) związzk(44) ppoddńjssid diałaniufekaloOorrinίlotylowiianni t riflukrowotanawskΌwiann trimotyn losililu z wytworzeniem 4-O-benzoilo-3-O-metylo-1-fenylotio-6-deoksy-a3-glukopiranozydu o wzorze
(ii) związzk(44)p poddjes ięddiałaniuchlorkc piwoloilui roozukzzczlnikc, nn. piryydna, ζ\Όό rzeniem 4-O-benzoilo-3-O-metylo-2-O-piwaloilo-1-fenylotio-6-deoksy-a3-glukopiranozydu o wzorze
PL 197 783 B1
i (iii) związek (49) poddaje się działaniu środka bromującego, np. N-bromosukcynimidu, i trifluorku dietyloamino-siarki z wytworzeniem 4-O-benzoilo-3-O-metylo-2-O-piwaloilo-1-fluoro-6-deoksy-3-glukopiranozydu występującego jako stereoizomery o wzorze
Na schemacie reakcji D pokazano procedurę syntezy zaaktywowanej reszty monosacharydu, tewetozy (50(A) i 50(B)) z użyciem związku (48) (obejmuje wytwarzanie związku (47) z użyciem związku (41) dla celów ilustracji).
PL 197 783 B1
PL 197 783 B1
Związek o wzorze (1) można wytwarzać drogą syntezy. Może ona obejmować syntezę jego analogów i pochodnych, w etapach której syntezuje się odpowiedni związek pośredni, steroid lub prekursor i sprzęga się żądaną liczbę odpowiednich monosacharydów z pośrednim steroidem.
Sposób sprzęgania monosacharydu, cymarozy ze związkiem pośrednim, steroidem, obejmuje następujące etapy (i) resztę cymarozy (38) poddaje się reakcji ze związkiem pośrednim, steroidem (15), np. w temperaturze -15°C, i w obecności chlorku cyny, w rozpuszczalniku, np. eterze, z wytworzeniem 3-O-[4-O-benzoilo-2-fenylotio-3-D-cymaropiranozylo]-12,14-3-dihydroksypregn-5-en-20-onu o wzorze
i (ii) związek (51) poddaje się działaniu chlorku kwasu tyglinowego w pirydynie, a następnie zasady, np. NaOMe, z wytworzeniem 3-O-[4-O-benzoilo-2-fenylotio-3-D-cymaropiranozylo]-12p-tygloiloksy-14-hydroksy-14p-pregn-5-en-20-onu o wzorze
Związek (1) można wytwarzać sposobem, zgodnie z którym sprzęga się resztę monosacharydu, cymarozy z resztą monosacharydu, tewetozy i sprzęga się uzyskany disacharyd z otrzymanym uprzednio produktem, steroidem (52) z wytworzeniem związku (1).
Sposób sprzęgania reszty monosacharydu, cymarozy z resztą monosacharydu, tewetozy i sprzęgania uzyskanego disacharydu z otrzymanym uprzednio produktem, steroidem (52) może obejmować następujące etapy (i) selektywnie zabezpieczoną resztę cymarozy (40) sprzęga się z selektywnie zabezpieczoną resztą tewetozy (50 A) z użyciem chlorku cyny (SnCh) i trifluorometanosulfonianu srebra, np. w temperaturze -15°C, z wytworzeniem związku o wzorze
PL 197 783 B1
w którym Z = TBDMS = t-butylodimetylosilil (ii) związek (53) poddaje się działaniu fluorku tetrabutyloamoniowego z wytworzeniem związku o wzorze
(iii) związze (55) ppOddje się ddiałaniu trifiuorkk dietyloominosiarki, np. w temppraturzz 0°C, z wytworzeniem związku o wzorze
(iv) związek(55)p poddja s is ę diałaain uwiązkk u55) z wytworzeninm pwiązkuo ozorze
PL 197 783 B1
i (v) związek (56) poddaje się reakcji z niklem Raneya, po czym działa się zasadą, np. NaOMe, z wytworzeniem powyżej opisanego związku (1).
Na schemacie reakcji E podano procedurę syntezy związków pośrednich (52) i (55) i sprzęgania ich z wytworzeniem związku (56).
PL 197 783 B1
O
ΟΡν
Z=t-butylodimetylosilil
Istnieje alternatywny sposób, zgodnie z którym sprzęga się reszty cymarozy i tewetozy z wytworzeniem trisacharydu i sprzęga się trisacharyd ze związkiem pośrednim, steroidem z wytworzeniem związku o wzorze (1).
PL 197 783 B1
Sposób wytwarzania trisacharydu i sprzęgania uzyskanego trisacharydu ze związkiem pośrednim, steroidem może obejmować następujące etapy (i) selektywnie zabezpieczoną resztę cymarozy (40) sprzęga się ze związkiem (45) z użyciem chlorku cyny(II), AgOTf, Cp2ZrCl2 z wytworzeniem związku o wzorze
w którym Z = TBDMS = t-butylodimetylosilil (ii) związek (57) poddaje się działaniu fluorku tetrabutyloamoniowego i trifluorku dietyloaminosiarki z wytworzeniem, trisacharydu, związku o wzorze
i (iii) trisacharyd (58) sprzęga się ze steroidem, związkiem pośrednim o wzorze
z użyciem chlorku cyny(II), AgOTf, Cp2ZrCh z wytworzeniem związku (1).
Pośredni steroid (59) można wytworzyć w wyniku podziałania na steroid (15) chlorkiem kwasu tyglinowego.
Na schemacie reakcji F pokazano procedurę syntezy trisacharydu (58) i syntezy związku (1) drogą sprzęgania trisacharydu (58) ze steroidem, związkiem pośrednim (59).
PL 197 783 B1
Schemat reakcji F
Z=t-butylodimetylosilil
Związki pośrednie (23), (24), (25), (27), (28), (29), (30), (37), (38), (39), (40), (48), (49), (50), (51), (53), (54), (55), (56), (57) i (58) opisane powyżej są nowymi związkami.
Stwierdzono, że związek (1), 3-O-[-p-D-tewetopiranozylo-(1—>4)-p-D-cymaropiranozylo-(1 >4)-p-D-cymaropiranozylo]-12p-O-tygloiloksy-14-hydroksy-14p-pregn-5-en-20-on, jego różne analogi i pochodne mają czynność hamowania łaknienia.
Zakresem wynalazku są objęte środek, kompozycja lub preparat mające czynność hamowania łaknienia, w których substancję czynną stanowi ekstrakt uzyskany z rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia zawierający związek o wzorze (1).
Substancją czynną może być związek o wzorze (1), wyekstrahowany z rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia lub jego pochodna. Roślina może być z gatunku Trichocaulon officinale lub Trichocaulon piliferum, albo gatunku Hoodia currorii, Hoodia gordonii lub Hoodia lugardii.
Zakresem wynalazku są objęte środki, kompozycje lub preparaty mające czynność hamowania łaknienia, w których substancje czynną stanowi syntetycznie wytworzony związek o wzorze (1).
PL 197 783 B1
Wynalazek umożliwia hamowanie łaknienia przez podawanie człowiekowi lub zwierzęciu odpowiedniej dawki środka hamującego łaknienie zawierającego ekstrakt z rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia. Ekstrakt można wprowadzać do kompozycji lub preparatu razem z innymi farmaceutycznie dopuszczalnymi składnikami.
Środkiem hamującym łaknienie może być np. dowolny wyodrębniony naturalny lub syntetyczny chemiczny związek o wzorze:
Kompozycja lub preparat hamujące łaknienie mogą składać się ze środka hamującego łaknienie zmieszanego z farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem. W razie potrzeby można dodać inne odpowiednie substancje pomocnicze, w tym stabilizator i inne składniki.
Związek (1) oraz jego pochodne lub analogi można stosować do wytwarzania leku o czynności hamowania łaknienia.
Możliwe jest więc hamowanie łaknienia przez podawanie człowiekowi albo zwierzęciu skutecznej dawki opisanej powyżej kompozycji.
Opisano tu sposób ekstrahowania glikozydu steroidowego o czynności hamowania łaknienia z materiału roślinnego uzyskanego z rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia. Wynalazek swoim zakresem obejmuje więc ekstrakt uzyskany lub możliwy do uzyskania z materiału roślinnego rodzaju Trichocaulon lub Noodia i zawierający zasadniczo czysty glikozyd steroidowy o wzorze (1).
Wynalazek swoim zakresem obejmuje także artykuły żywnościowe oraz napoje zawierające skuteczną ilość glikozydu steroidowego o wzorze (1), które po spożyciu mają działanie hamowania łaknienia.
Molekularne badania genetyczne są prowadzone w celu lepszego zrozumienia regulacji łaknienia, nasycenia i wagi ciała. Badania te ujawniły wiele centralnych szlaków regulatorowych, mediowanych przez wiele neuropeptydów. Normalną wagę ciała utrzymuje się w wyniku skomplikowanej równowagi pomiędzy dostarczaną energią, przyjmowaniem pokarmu i zużyciem energii. Na homeostazę energii działa wiele czynników, ostatecznie kontrolowanych przez mózg. Do takich różnych sygnałów należą zmysł węchu i smaku oraz sygnały układu żołądkowo-jelitowego, takie jak rozszerzenie przewodu żołądkowo-jelitowego, chemiczne sygnały do błony śluzowej żołądka i przenoszone przez krew metabolity, takie jak kwasy tłuszczowe i glukoza.
Dowiedziono, że w układzie ośrodkowym neuropeptyd „Y" (NPY) ujemnie regulowany przez leptynę, jest jednym z dodatnich regulatorów zachowania odżywiania się. Wykazano, że ekspresja endogenicznego antagonisty receptorów melanokortyny przyczynia się do otyłości w konkretnym modelu (myszy ob/ob). Rzeczywiście defekt receptora melanokortyny MC4 w pełni powtarza syndrom otyłości. Do innych mediatorów, w przypadku których wykazano, że odgrywają rolę w bilansie energii, należą bombesyna, galonina i glukagono-podobny peptyd-1.
Bez wiązania się z teorią sądzi się, że związek (1) i jego opisane powyżej analogi działają jak agonista receptora melanokortyny 4. Wynikiem takiego działania jest regulowanie NPY, lecz również zwiększenie poziomu cholecystokininy. W wyniku działania cholecystokininy między innymi następuje zahamowanie opróżniania żołądka.
Wynalazek oraz jego skuteczność opisano dodatkowo poprzez poniższe przykłady i rysunki, bez ograniczenia zakresu ochrony wynalazku.
PL 197 783 B1
Na rysunkach:
Figura 1 obrazuje diagram przebiegu ogólnego sposobu ekstrahowania pierwszego surowego ekstraktu hamującego łaknienie i oczyszczonego ekstraktu hamującego łaknienie z materiału rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia;
Figura 2 jest graficznym przedstawieniem prób biologicznych prowadzonych na szczurach z użyciem częściowo oczyszczonego ekstraktu Trichocaulon piliferum w metanolu;
Figury 3 i 4 łącznie są schematycznym przedstawieniem sposobu wytwarzania ekstraktu z materiału rośliny rodzaju Trichocaulon lub Hoodia; a
Figury 5 i 6 są graficznym przedstawieniem procentowej zmiany masy ciała szczurów dla różnych grup odpowiednio dla dni od -7 do 7 i dni 0-7, w badaniu z powtarzaniem dawki, z użyciem ekstraktu soku i suszonego rozpryskowo ekstraktu soku z Hoodia gordonii.
P r z y k ł a d 1
Ogólny sposób ekstrahowania pierwszego surowego ekstraktu hamującego łaknienie i oczyszczonego ekstraktu hamującego łaknienie z materiału rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia ilustruje diagram przebiegu na fig. 1.
P r z y k ł a d 2
Próby biologiczne prowadzone na szczurach z użyciem częściowo oczyszczonego ekstraktu w metanolu uzyskanego sposobem podanym w przykładzie 1, wykazały, że ekstrakt rzeczywiście wykazuje czynność hamowania łaknienia. Czynność hamowania łaknienia czynnego ekstraktu mogą ilustrować typowe przykłady działania ekstraktu Trichocaulon piliferum w metanolu na szczury, jak zilustrowano fig. 2.
Jest oczywiste z fig. 2, że grupa badana szczurów, którym podawano ekstrakt dnia 5, wykazywała zasadnicze zmniejszenie przyjmowania pokarmu w ciągu następnych dwóch dni, podczas gdy grupa kontrolna nie ujawniła porównywalnego zmniejszenia przyjmowania pokarmu. Przyjmowanie pokarmu przez grupę badaną powróciło do normy, a w istocie zwiększyło się od dnia 8.
P r z y k ł a d 3
Sposób wytwarzania ekstraktu mającego czynność hamowania łaknienia zilustrowano schematycznie przykładowo na fig. 3 i 4, które łącznie ilustrują ten szeroki sposób. Jednak można użyć różnych innych sposobów, co jest zrozumiałe dla fachowców.
Zgodnie z fig. 3 materiał rośliny rodzaju Trichocaulon lub rodzaju Hoodia umieszcza się w mieszarce 3, np. mieszarce Waringa, z użyciem linii zasilania 1, z rozpuszczalnikiem w postaci roztworu chlorek metylenu/metanol dostarczonym poprzez linię zasilania 2. Homogenizowany produkt dostarcza się poprzez linę 4 do etapu rozdzielania 5, np. w postaci filtru lub wirówki, i pozostały materiał roślinny usuwa się z użyciem linii 27.
Mieszaninę rozpuszczalnik/ekstrakt dostarcza się z użyciem linii 6 do etapu odparowania 7, gdzie rozpuszczalnik usuwa się, np. z użyciem wyparki rotacyjnej. Wysuszony surowy ekstrakt doprowadza się z użyciem linii 8 do dalszego etapu ekstrahowania 9 z dodaniem roztworu chlorek metylenu/woda wprowadzonego z użyciem linii zasilania 29 w celu przeprowadzenia dalszej ekstrakcji, po czym do etapu rozdzielania 13 z użyciem linii 11, gdzie frakcję wodną usuwa się z użyciem linii 31. Rozpuszczoną frakcję ekstraktu doprowadza się z użyciem linii 15 do etapu suszenia 17, gdzie rozpuszczalnik odparowuje się, np. z użyciem wyparki rotacyjnej.
Zgodnie z fig. 4 wysuszony ekstrakt dostarcza się z użyciem linii 10 do etapu ekstrahowania 12. Roztwór metanol/heksan także dostarcza się z użyciem linii 14 do etapu ekstrahowania 12 w celu przeprowadzenia dodatkowego oczyszczania i ekstrakcji wysuszonego ekstraktu. Mieszaninę ekstrakt/metanol/heksan doprowadza się z użyciem linii 16 do etapu rozdzielania 18, frakcję heksanową usuwa się z użyciem linii 20 i mieszaninę metanol/ekstrakt następnie doprowadza się z użyciem linii 22 do etapu suszenia 24. W etapie suszenia 24 usuwa się rozpuszczalnik, np. drogą odparowania z użyciem wyparki rotacyjnej.
Wysuszony, częściowo oczyszczony czynny ekstrakt doprowadza się z użyciem linii 26 i z dodaniem metanolu z użyciem linii 28 do etapu rozpuszczania 30, i rozpuszczoną frakcję doprowadza się z użyciem linii 36 do kolumny chromatograficznej 38.
W kolumnie 38 frakcję rozpuszczoną w metanolu dodatkowo frakcjonuje się, z użyciem żelu krzemionkowego i mieszaniny rozpuszczalników chloroform/30% metanol, z uzyskaniem różnych frakcji wskazanych na schemacie jako frakcje I - V. Zgodnie z aktualną procedurą frakcjonowania prowadzoną przez zgłaszającego, w wyniku procedury frakcjonowania uzyskuje się poniższe frakcje o wadze: I (3,9 g); II (2,6 g); III (2,1 g); IV (1,1 g) i V (2,0 g). Frakcje te oddzielnie oceniono zgodnie z odPL 197 783 B1 powiednią próbą biologiczną (w etapie, który nie pokazano) i te frakcje zidentyfikowano jako frakcje I i II, wykazujące wyraźną czynność hamowania łaknienia, i dostarczono z użyciem linii zasilania 40 i 42 do kolumn odpowiednio 44 i 46, gdzie poddano je dodatkowemu frakcjonowaniu i oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej, ponownie z użyciem żelu krzemionkowego i układu rozpuszczalników 9:1 chloroform:metanol.
Podfrakcje II(A) - (C) uzyskane z kolumny 44 nie wykazywały, podczas badania, godnej uwagi czynności hamowania łaknienia, i można je ponownie poddawać dodatkowej chromatografii.
Podfrakcje I(A) - (L) uzyskane z kolumny 46 również oceniano (w etapie prób, który nie pokazano), i stwierdzono, że podfrakcja I(C) ma wyraźną czynność hamowania łaknienia.
Podfrakcję I(C) dostarcza się z użyciem linii 48 do kolumny 50 w celu przeprowadzenia dodatkowego frakcjonowania i oczyszczania, z użyciem żelu krzemionkowego i mieszaniny rozpuszczalników 9:1 octan etylu:heksan. Stwierdzono, że spośród pozostałych oczyszczonych frakcji, frakcja I(C) (ii) po badaniu, posiada wyraźną czynność hamowania łaknienia.
Oczyszczony produkt zidentyfikowano z użyciem spektroskopii nuklearnego rezonansu magnetycznego (jak wskazano w poniższych tabelach 1 i 2, jako związek (1).
T a b e l a 1: 1H (300,13 MHz) n.m.r. dane dta zwązku (1) Związek (1)
Atom wodoru J(HH)/Hz δΗ/p.p.m.
1 2 3
Aglikon-3 - 3,522 m
6 - 5,381 m
12 11,5, 4,1 4,607 dd
17 9,3, 9,3 3,157dd
18 - 1,029 s
19 - 0,951 s
21 - 2,164 s
3* 7,1, 1,5 6,888 qq
4* 7,1, 1,2 1,806 dq
5* 1,6, 1,2 1,853 dq
Cym-1' 9,4, 2,1 4,816 dd
2' 13,8, 3,7, 2,1 2,055 ddd
2'aq 13,8 ,9,4, 2,6 1,552 ddd
3'ax 3,7, 2,9, 2,6 3,776 ddd
4' 9,4, 2,9 3,179 dd
5' 6,3, 9,4 3,821 dd
6' 6,3 1,279 da
3'-OMe - 3,408 sd
1" 9,4, 2,1 4,730 dd
2" 13,8, 3,7, 2,1 2,108 ddd
2«aq 13,8, 9,4, 2,6 1,601 ddd
PL 197 783 B1 cd. tabeli
1 2 3
3"px 3,7, 2,9, 2,6 3,755 ddd
4" 9,4, 2,9 3,239 dd
5" 6,3, 9,4 3,898 dd
6" 6,3 1,243 db
3"-OMe - 3,392 s®
Tew-1'" 7,7 4,273 d
2''' 7,7, 8,0 3,469 dd
3''' 8,0, 2,9 3,099 dd
4'" 9,3, 2,9 3,179 dd
5'" 6,3, 9,3 3,351 dd
6'" 6,3 1,183 d'c
3"'-OMe - 3,622 s
a, b, c w każdej kolumnie mogą być zamienne d, e w każdej kolumnie mogą być zamienne * odnosi się do atomów grupy tyglinianu
T a b e l a 2: Odpiowtodme dane 13C (75,25 MHz) (75,25 MHz) n.m.r. cNa związku (1) w CDCh grupa aglikonu grppaukkrowa
Węgiel 5c/p.p.m. Węgiel 5c/p.p.m.
1 2 3 4
1 37,04 T cym-1' 95,84 D
2 29,44 T 2' 35,57 T
3 77,24 D 3' 77,05 D
4 38,62 T 4' 82,57 D
5 138,95 S 5' 68,48 D
6 131,90 D 6' 18,14 Q
7 27,30 T 3'-OMe 57,93 Q
8 35,30 D 1" 99,54 D
9 43,04 D 2" 35,17 T
10 37,22 S 3'' 76,99 D
11 26,04 T 4'' 82,52 D
12 75,88 D 5" 68,30 D
13 53,71 S 6" 18,36 Q
14 85,69 S 3"-OMe 57,09 Q
15 34,36 T Tew-1'" 104,28 D
16 24,31 T 2'" 74,62 D
PL 197 783 B1 cd. tabeli
1 2 3 4
17 57,18 D 3''' 85,30 D
18 9,85 Q 4'" 74,62 D
19 19,27 Q 5'" 71,62 D
20 216,85 S 6'" 17,75 Q
21 33,01 Q 3'"-OMe 60,60 Q
1* 167,60 S
2* 128,69 D
3* 137,66 D
4* 14,41 Q
5* 12,08 Q
*odnosi się do atomów grupy tyglinianu
Związek (1)
Dane IR: 3440 cm'1 (OH), 2910 cm'1 (CH), 1700 cm'1 (C=0) [α D]20589 = 12,67° (C=3, CHCI3)
T.t.: 147°C - 152°C
P r z y k ł a d y 4-13 ilustrują procedury syntez, zgodnie z którymi związki pośrednie i steroid (15) można wytworzyć zgodnie z „pierwszym alternatywnym sposobem".
P r z y k ł a d 4
123,15a-Dihydroksyprogesteron (17)
Hodowle Calonectria decora (ATCC 14767) uzyskano drogą inokulacji pożywki hodowlanej zawierającej sacharozę (900 g), K2HPO4 (30 g), koncentrat Czapka (300 ml), syrop „corn steep llquor" z kukurydzy (300 ml) i wodę destylowaną (30 l) (150 kolb po 500 ml). Po 5 dniach wytrząsania w 26°C, do kolb dodano progesteronu (16) (150 g) w zawiesinie Tween 80 (0,1% roztwór, 1,5 l). Hodowle inkubowano przez następne 5 dni, po czym prowadzono obróbkę chemiczną drogą odwirowywania, dekantowania, ekstrakcji pożywki chloroformem, odparowano i otrzymano dihydroksyprogesteron (17) (75 g, 45%).
1H NMR (CDCis): 5,71 (1H, s, H-4); 4,12-4,22 (1H, m, H-15) 4,43 (1H, br, s, OH) ; 3,46-3,53 (1H, dd, J = 4,6Hz, H-12); 2,16 Hz (3H, s, H-21); 1,18 (3H, s, H-19); 0,74 (3H, s, H-18).
P r z y k ł a d 5
123-Hydroksy-15a-(p-toluenosulfonyło)progesteron (18)
Dihydroksyprogesteron (17) (75 g, 0,22 mola) rozpuszczono w suchej pirydynie (300 ml) i całość ochłodzono do 0°C. W temperaturze 0°C do mieszaniny reakcyjnej wkroplono chlorek p-tolueno-sulfonylu (46 g, 0,24 mola) w suchej pirydynie (200 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze 0°C, i reakcję przerwano poprzez dodanie H2O (500 ml). Warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (1 l) i ekstrakt organiczny przemyto kwasem solnym (6M, 3x11), nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (500 ml), nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (500 ml) i wodą (500 ml). Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego otrzymano p-toluenosulfonowany progesteron (18) (98 g, 92%) w postaci gęstego, ciemnożółtego oleju.
1H NMR (CDCla): 7,7 (2H, d, J = 14Hz, H-2,6); 7,34 (2H, d, J = 8,4Hz, H-3,5); 5,67 (1H, s, H-4); 4,86-4,93 (1H, m, H-15); 3,45-3,50 (1H, dd, J = 4,6Hz, H-12); 2,44 (3H, s, H-4Me); 2,15 (3H, s, H-21) 1,13 (3H, s, H-19); 0,74 (3H, s, H-18).
P r z y k ł a d 6
123-Hydroksy-A -progesteron (19)
Roztwór tosylowanego progesteronu (18) (98 g, 0,19 mola) w 2,4,6-trimetylokolidynie (500 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 150°C przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono i wlano do wody (500 ml). Warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (1 l), po czym warstwę organiczną przemyto kwasem solnym (6M, 3x1 l), nasyconym wodnym
PL 197 783 B1 roztworem wodorowęglanu sodu (500 ml), nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (500 ml) i wodą (500 mi). Po wysuszeniu (MgSO4) i przesączeniu warstwę w octanie etylu odparowano i surową mieszaninę oczyszczono drogą chromatografii na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną aceton:chloroform (1:10) i otrzymano A14-progesteron (19) (50 g, 78%) w postaci ciemoczerwonego oleju.
1H NMR (CDCla): 5,73 (1H, s, H-4), 5,28 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,41 (1H, br, s, OH), 3,49-3,52 (1H, dd, J = 4,3Hz, H-12), 2,80-2,84 (1H, dd, J = 9,2Hz, H-17), 2,14 (3H, s, H-21), 1,19 (3H, s, H-19), 0,89 (3H, s, H-18).
P r z y k ł a d 7
3,12B-Diacetoksypregna-3,5,14-trien-20-on (20)
Roztwór Δ -progesteronu (19) (50 g, 0,15 mola) w chlorku acetylu (1,5 l) i bezwodnik octowy (750 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną wlano do zimnego octanu etylu (1 l) i w trakcie mieszania dodano nasyconego wodnego roztworu wodorowęglanu sodu, aż do ustania wydzielania się gazu. Warstwę w octanie etylu oddzielono od warstwy w wodorowęglanie sodu i przemyto dodatkowymi ilościami wodnego roztworu wodorowęglanu sodu (3 x 700 ml), a następnie nasyconym wodnym roztworem chlorku sodu (700 ml) i na końcu wodą (700 ml). Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego otrzymano 3,12p-diacetoksypregna-3,5,14-trien-20-on (20) (60 g, 93%) w postaci pomarańczowego oleju.
1H NMR (CDCls): 5,68 (1H, s, H-4), 5,44 (1H, m, H-6), 5,31 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,82-4,86 (1H, dd, J = 4,5Hz, H-12), 3,10-3,18 (1H, t, J = 9,5Hz, H-17), 2,18 (3H, s, 3-Ac), 2,11 (3H, s, 12-Ac), 2,08 (3H, s, H-21), 1,02 (3H, s, H-19), 1,01 (3H, s, H-18)
P r z y k ł a d 8
3,12p-Diacetoksy-20,20-etylenodioksypregna-3,5,14-trien (21)
Diacetoksylowy związek (20) (60 g, 0,14 mola) rozpuszczono w benzenie (1 l) i dodano glikolu etylenowego (60 ml) i kwasu p-toluenosulfonowego (1 g). (Benzen wcześniej ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin z użyciem aparatu Deana-Starka). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 16 godzin w trakcie mieszania i wodę usunięto drogą destylacji azeotropowej. Do ochłodzonego roztworu dodano wodnego nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu (500 ml). Całość przemyto solanką (500 ml) i wodą (500 ml) i wysuszono (MgSO4). Rozpuszczalnik odparowano i surową mieszaninę oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną octan etylu:heksan (2:8), w wyniku czego otrzymano etylenodioksypregna-3,5,14-trien (21) (35 g, 53%).
1H NMR (CDCls): 5,68 (1H, s, H-4), 5,45 (1H, m, H-6), 5,31 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,73-4,85 (1H, dd, J = 4,4Hz, H-12), 3,78-3,98 (4H, m, etylenodioksyl), 2,16 (3H, s, 3-Ac), 2,04 (3H, s, 12-Ac), 1,29 (3H, s, H-21), 1,12 (3H, s, H-19), 1,02 (3H, s, H-18).
P r z y k ł a d 9
3p-12p-Dihydroksy-20,20-etylenodioksypregna-5,14-dien-12-octan (22)
Dienolooctan (21) (35 g, 0,077 mola) zawieszono w etanolu (500 ml) i w temperaturze 0°C dodano borowodorku sodu (2,8 g, 0,074 mola). Pozwolono mieszaninie ogrzać się do temperatury pokojowej i całość mieszano przez noc. Większość rozpuszczalnika usunięto pod próżnią i mieszaninę rozcieńczono wodą (500 ml) i wyekstrahowano octanem etylu (500 ml). W wyniku obróbki metodą chromatografii na żelu krzemionkowym z użyciem mieszaniny aceton/chloroform (1:10) uzyskano 33-alkohol (22) (25 g, 80%).
1H NMR (CDCl3): 5,41 (1H, m, H-6), 5,28 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 4,72-4,81 (1H, dd, J = 4,4Hz, H-12), 3,82-4,02 (4H, m, etylenodioksyl), 3,45-3,59 (1H, m, H-3), 2,03 (3H, s, 12-Ac), 1,28 (3H, s, H-21), 1,10 (3H, s, H-19), 1,01 (3H, s, H-18).
P r z y k ł a d 10
3β ,123-Dihydroksy-20,20-etylenodioksypregna-5,14-dien (23)
Do zawiesiny wodorku litowo-glinowego (2,7 g, 72,2 mmola) w suchym tetrahydrofuranie (500 ml) wkroplono 33-alkohol (22) (25 g, 60,2 mmola) w suchym tetrahydrofuranie (300 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie ostrożnie dodano wody (2,7 ml) i całość mieszano przez dalsze 10 min. Dodano następnie roztworu wodorotlenku sodu (15% roztwór, 2,7 ml) i zawiesinę mieszano. Po 10 minutach dodano wody (8,1 ml) i zawiesinę mieszano przez 10 minut, przesączono, wysuszono (MgSO4) i rozpuszczalnik odparowano, w wyniku czego otrzymano 3β ,2p-dihydroksy-pregnadien (23) (20 g, 90%).
PL 197 783 B1 1H NMR (CDCI3): 5,36 (1H, m, H-6), 5,23 (1H, dd, J = 2,2Hz, H-15), 3,94-4,06 (4H, m, etylenodioksyl), 3,41-3,52 (1H, m, H-3), 3,32-3,36 (1H, dd, J = 4,3Hz, H-12), 1,31 (3H, s, H) 1,01 (3H, s, H-19), 0,96 (3H, s, H-18).
"5C NMR (CDCla): 152,4 (c-14), 140,2 (c-5), 121,1 (c-15) 119,7 (c-6), 111,1 (C-20), 79,8 (C-12), 71,6 (C-3), 63,7 i 63,6 (etylenodioksyl), 58,8 (C-17), 19,0 (C-19), 11,9 (C-18).
3β ,12e-Dihydroksy-14,15-epoksy-20,20-etylenodioksypregn-5-en;
3β ,12e-Dihydroksy-5,6-epoksy-20,20-etylenodioksypregn-14-en.
W 0°C i w trakcie mieszania do roztworu 5,14-dienu (23) (500 mg, 1,34 mmola) w acetonie (100 ml), kwasie octowym (2,5 ml) i wodzie (5 ml) dodano N-bromoacetamidu (211 mg, 1,5 mmola). Po 15 min do mieszaniny reakcyjnej dodano siarczynu sodu (5% roztwór, 50 ml). Odparowano aceton i warstwę wodną wyekstrahowano dichlorometanem (3 x 50 ml). Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Do produktu dodano pirydyny (1 ml) i całość mieszano przez 0,5 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano następnie dichlorometanu (100 ml) i dichlorometan przemyto kwasem cytrynowym (5% roztwór, 3 x 100 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (50 ml) i wodą (50 ml). Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano mieszaninę 14,15- i 5,6-epoksydów (360 mg, 69%) w postaci białej piany. Mieszaniny epoksydów nie można było rozdzielić drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym.
P r z y k ł a d 11
3β ,123-Dihydroksy-14,15-epoksy-20,20-etylenodioksypregn-5-en (24)
Mieszaninę 14,15- i 5,6-epoksydów (14,4 g, 37,0 mmoli) w suchym tetrahydrofuranie (200 ml) dodano do zawiesiny wodorku litowo-glinowego (1,69 g, 44,4 mmola) w suchym tetrahydrofuranie (300 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym poddano obróbce chemicznej sposobem opisanym wcześniej poprzez dodanie wody (1,69 ml) i roztworu wodorotlenku sodu (15% roztwór, 1,69 ml). Po przesączeniu i odparowaniu rozpuszczalnika surowy produkt oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem mieszaniny metanol:chloroform (1:9) jako rozpuszczalnika, w wyniku czego otrzymano niereaktywny 14,15-epoksy-20,20-etylenodioksypregn-5-en (24) (300 mg, 2,1%).
1H NMR (CDCls): 5,31 (1H, m, H-6), 3,82-3,98 (4H, m, etyleno-dioksyl), 3,43-3,52 (1H, m, H-3), 3,41 (1H, s, H-15), 3,31-3,35 (1H, dd, J=4,3 Hz, H-12), 1,29 (3H, s, H-21), 1,17 (3H, s, H-19), 1,02 (3H, s, H-18).
"5C NMR (CDCl3): 139,8 (C-5), 120,8 (C-6), 112,1 (C-20), 77,2 (C-12), 75,4 (C-14), 61,0 (C-15),
22.3 (C-21), 19,2 (C-19), 9,5 (C-18).
P r z y k ł a d 12
3β ,12β ,143-Trihydroksy-20,20-etylenodioksypregn-5-en (25)
14,15-epoksyd (24) (300 mg, 0,77 mmola) w suchym tetrahydrofuranie (10 ml) dodano do zawiesiny wodorku litowo-glinowego (300 mg, 7,89 mmola) w tetrahydrofuranie i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 48 godzin. Po dodaniu wody (0,3 ml), roztworu wodorotlenku sodu (15% roztwór, 0,3 ml) i przesączeniu, jak wcześniej opisano, mieszaninę oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z użyciem mieszaniny metanol:chloroform (1:9) jako rozpuszczalnika, w wyniku czego otrzymano trihydroksypregnen (25) (250 mg, 83%).
1H NMR (CDCh): 5,38 (1H, m, H-6), 3,98 (4H, m, etylenodioksyl), 3,43-3,53 (1H, m, H-3), 3,25-3,32 (1H, dd, J = 4,1Hz, H-12), 1,32 (3H, s, H-21), 1,01 (3H, s, H-19), 0,98 (3H, s, H-18) "5C NMR (CDCI3): 139,1 (C-5), 122,1 (C-6), 112,2 (C-20), 85,1 (C-14), 75,1 (C-12), 71,6 (C-3),
23.4 (C-21), 19,4 (C-19), 8,9 (C-18)
P r z y k ł a d 13
3β,12β ,143-Trihydroksypregn-5-en (15)
Etylenodioksypregnen (25) (250 mg, 0,64 mmola) rozpuszczono w kwasie octowym (13,4 ml) i wodzie i po liofilizacji uzyskano trihydroksysteroid (15) (200 mg, 89%), t.t.: 228°-235°C (literaturowa 225°-235°C), M+ 348, [aD]20 +35° (literaturowa [aD]20 +29°).
1H NMR (CDCI3): 5,39 (1H, m, H-6), 3,56-3,62 (1H, t, J = 8,1 Hz, H-17), 3,42-3,51 (1H, m, H-3), 3,28-3,39 (1H, dd, J = 4,3 Hz, H-12), 2,23 (3H, s, H-21), 1,01 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, s, H-18) "5C NMR (CDCh): 217,7 (C-20), 138,9 (C-5), 122,2 (C-6), 85,5 (C-14), 73,6 (C-12), 71,6 (C-3), 57,0 (C-17), 55,1 (C-13), 43,6 (C-9), 42,1 (C-4), 37,3 (C-1), 36,8 (C-10), 35,9 (C-8), 34,5 (C-15), 32,9 (C-21), 31,5 (C-16), 30,1 (C-2), 27,4 (C-7), 24,4 (C-11), 19,4 (C-19), 8,3 (C-18).
PL 197 783 B1
P r z y k ł a d y 14 - 19 ilustrują procedury syntez, którymi można wytworzyć związki pośrednie i steroid (15) zgodnie z „drugim alternatywnym sposobem".
P r z y k ł a d 14
Octan 20,20-etylenodioksy-3e-tolueno-e-sulfonyloksypregn-5,14-dien-12e-olu (26)
Do mieszaniny 12-octanu 20,20-etylenodioksypregna-5,14-dieno-33,123-diolu (22) (1,3 g, 3,1 mmola) w pirydynie (15 ml) w temperaturze 0°C wkroplono roztwór chlorku kwasu p-toluenosulfonylowego (650 mg, 3,4 mmola) w pirydynie (10 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, po czym do mieszaniny reakcyjnej dodano wody. Roztwór wyekstrahowano octanem etylu (2 x 50 ml), warstwę w octanie etylu przemyto kwasem cytrynowymi (5 x 50 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (100 ml), nasyconym roztworem chlorku sodu (100 ml) i wodą (100 ml). Warstwę w octanie etylu wysuszono (MgSO4), przesączono, odparowano i oczyszczono drogą rzutowej chromatografii kolumnowej z użyciem mieszaniny heksan-octan etylu (8:2 v/v) jako eluenta, w wyniku czego uzyskano β-O-tosylosteroid (26), (1,5 g, 84%), w postaci żółtego oleju (Stwierdzono: M 570,271, C32H42O7S obliczono: M 570,273).
δκ1,021 (3H, s, 19-H), 1,131 (3H, s, 18-H), 1,282 (3H, s, 21-H), 2,021 (octan-OCH3), 2,431 (3H, s, Ar-CHs), 3,883 (4H, m, OCH2CH2O), 4,750 (1H, dd,3J 10,8 Hz, 5,2 Hz, 12-H), 4,890 (1H, m, 30H), 5,281 (1H, dd, 3 J 4,2 Hz, 2,1 Hz, 15-H), 5,388 (1H, m, 6-H), 7,341 (2H, d, 3 J 8,2 Hz, ArH), 7,746 (2H, d, 3 J 8,2 Hz, ArH).
5C 13,493Q (C-18), 19,002Q (C-19), 21,612Q (Ar-metyl)*, 21,671Q (C-21)*, 24,175Q (octan metylu), 63,401T (etyleno-dioksyl), 63,498T (etylenodioksyl), 71,5315 (C-13), 80,912D (C-12), 82,531D (C-3), 111,363S (C-20), 120,881D (C-15), 121,4610 (C-6), 123,715-133,917 (grupa aromatyczna), 139,903S (C-14), 151,722S (C-5), 170,8195 (ester karbonylu).
* może być zamiennie
P r z y k ł a d 15
20.20- Etylenodioksy-3a ,5-cyklo-5a-pregn-14-eno-6e ,123-diol-12-octan (27)
Roztwór 33-tolueno-p-sulfonylooksypregn-5,14-dienu (26) (1,2 g, 2,1 mmola) i węglanu potasu (2,2 g, 22,4 mmola) w wodzie (250 ml) i acetonie (500 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 60°C przez 16 godzin. Aceton odparowano i warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu (200 ml). Warstwę w octanie etylu wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. W wyniku rozdzielania mieszaniny drogą chromatografii rzutowej z użyciem mieszaniny chloroform-aceton (9:1 v/v) jako eluenta otrzymano 3a,5-cyklo-pochodną (27), (530 mg, 61%) w postaci żółtego oleju (stwierdzono M 416,262, C25H3gO5 obliczono: M 416,263).
δκ 0,288 (1H, dd, 3j 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-Ha), 0,477 (1H, dd, 3j 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-Hb), 1,025 (3H, s, 19-H^ 1,121 (3H s, 18-H^ 1,256 (3H s, 21-H^ 1,989 (3H s, odan-CHa), 3,302 (1H dd, 3 J 2,8 Hz 2,8 Hz, 6-H), 3,784-3,947 (4H, m, OCH2CH2O), 4,721 (1H, dd, 3 J 8,5 Hz, 5,6 Hz, 12-H), 5,232 (1H, dd, 3j 3,9 Hz, 1,9 Hz, 15-H).
5c 11,678T (C-4), 12,298Q (C-18), 19,971Q (C-19), 23,623Q (C-21), 24,153Q (octan metylu), 63,700T (etylenodioksyl), 63,788T (etylenodioksyl), 73,591D (C-6), 80,551D (C-12), 111,1265 (C-20), 118,778D (C-15), 152,959S (C-14), 170,991S (estrowy karbonyl).
P r z y k ł a d 16
20.20- Etylenodioksy-3a ,5-cyklo-5a-pregn-14-eno-6e ,123-diol (28)
Do zawiesiny wodorku litowo-glinowego (50 mg, 1,3 mmola) w tetrahydrofuranie (10 ml) wkroplono roztwór 3a ,5-cyklo-pochodnej (27), (500 mg, 1,2 mmola) w tetrahydrofuranie (20 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 4 godziny i reakcję przerwano poprzez dodanie wody (50 μ). Po 30 minutach dodano roztworu wodorotlenku sodu (15% roztwór, 50 μ) i mieszanie kontynuowano przez następne 30 minut. Dodano wody (150 μ) i mieszaninę reakcyjną przesączono. Tetrahydrofuran wysuszono (MgSO4) przesączono, odparowano i oczyszczono drogą chromatografii rzutowej z użyciem mieszaniny chloroform-aceton (8:2 v/v) jako eluenta, w wyniku czego uzyskano diol (28), (370 mg, 83%) w postaci oleju (stwierdzono: M 374,250, C23H34O4 obliczono: M 374,252).
δκ 0,288 (1H, dd, 3j 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-H2), 0,510 (1H, dd, 3j 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-Hb), 0,985 (3H, s, 19-H), 1,055 (3H, s, 18-H), 1,325 (3H, s, 21-H), 3,318 (1H, dd, 3j 3,0 Hz, 3,0 Hz, 6-H), 3,363 (1H, dd, 3j 11,4 Hz, 4,2 Hz, 12-H), 4,019 (4H, m, OCH2CH2O), 4,622 (1H, s, OH), 5,255 (1H, dd, 3 J 3,9 Hz, 1,9 Hz, 15-H).
5c 11,681T (C-4), 12,243Q (C-18), 19,844Q (C-19), 23,604Q (C-21), 63,620T (etylenodioksyl), 63,733T (etylenodioksyl), 73,569D (C-6), 77,478D (C-12), 111,125S (C-20), 118,702D (C-15), 152,912S (C-14).
PL 197 783 B1
P r z y k ł a d 17
20.20- Etylenodioksy-14,15e-epoksy-3a ,5-cyklo-5a ,14e-pregnano-6e ,12e-diol (29)
Do roztworu 20,20-etylenodioksy-3a,5-cyklo-5a-pregn-14-eno-63,123-diolu (28) (340 mg, 0,91 mmola) w acetonie (20 ml), wody (0,25 ml) i kwasu octowego (0,25 ml) w temperaturze 0°C dodano N-bromoacetamidu (150 mg, 1,1 mmola). Po 15 minutach do mieszaniny reakcyjnej dodano siarczynu sodu (5% roztwór, 20 ml). Aceton odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostały roztwór wyekstrahowano dichlorometanem (3 x 30 ml). Warstwę w dichlorometanie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano z otrzymaniem zatężonej objętości (50 ml). Pirydynę (0,5 ml) dodano do mieszaniny i całość mieszano przez dalszą 1 godzinę, po czym warstwę w dichlorometanie przemyto roztworem kwasu cytrynowego (5% roztwór, 3 x 30 ml), nasyconym roztworem wodorowęglanu sodu (30 ml) i wodą (30 ml). Warstwę w dichlorometanie wysuszono (MgSO4), przesączono, odparowano i oczyszczono drogą rzutowej chromatografii kolumnowej z użyciem mieszaniny chloroform-metanol (9,5:0,5 v/v) jako eluentu, w wyniku czego uzyskano epoksyd (29) (180 mg, 51%) w postaci piany (stwierdzono: M 390,245, C23H34O2 obliczono: M 390,247).
5η 0,287 (1H, dd, 3J 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-Ha), 0,501 (1H, dd, 3J 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-Hb), 0,978 (3H, s, 19-H^ 1,048 (3H s, 18-H^ 1,321 (3H s, 21-H\ 3,318 (1H, dd, 3 J 3,1 Hz, 3,1 Hz, 6-H), 3,355 (1H dd, 3J 11,2 Hz, 4,1 Hz, 12-H), 3,491 (1H, s, 15-H), 4,001 (4H, m, OCH2CH2O), 4,901 (1H, s, OH).
5C 11,668T (C-4), 11,973Q (C-18), 19,515Q (C-19), 23,519Q (C-21), 59,9100 (C-15), 63,601T (etylenodioksyl), 63,713T (etylenodioksyl), 72,501S (C-14), 73,571D (C-6), 77,471D (C-12), 111,085S (C-20).
P r z y k ł a d 18
20.20- Etylenodioksy-63,12β ,14-trihydroksy-3a ,5-cyklo-5a ,143-pregnan (30)
Do zawiesiny wodorku litowo-glinowego (20 mg, 0,53 mmola) w tetrahydrofuranie (5 ml) dodano roztworu epoksydu (29) (170 mg, 0,44 mmola) w tetrahydrofuranie (10 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 2 godziny, po czym dodano wody (20 μΙ) i mieszanie kontynuowano przez 0,5 godziny. Dodano roztwór wodorotlenku sodu (15%, 20 μΙ) i mieszanie kontynuowano przez dalsze 0,5 godziny. Dodano dalszą ilość wody (60 μβ i zawiesinę mieszano przez 1 godzinę. Po przesączeniu zawiesinę wysuszono (MgSO4), przesączono i tetrahydrofuran odparowano. W wyniku rozdzielania uzyskanej mieszaniny metodą chromatografii rzutowej z elucją mieszaniną chloroform-metanol (9:1 v/v) uzyskano żądany triol (30) (90 mg, 53%) w postaci klarownego oleju (stwierdzono: M 392,261, C23H38O5 obliczono: M 392,263).
5h 0,287 (1H, dd, 3j 8,1 Hz, 4,9 Hz, 4-H2), 0,510 (1H, dd, 3j 4,4 Hz, 4,4 Hz, 4-Hb), 0,971 (3H, s, 19-H), 1,042 (3H, s, 18-H), 1,319 (3H, s, 21-H), 3,321 (1H, dd, 3j 3,0 Hz, 3,0 Hz, 6-H), 3,321 (1H, dd, 3 J 11,1 Hz, 3,9 Hz, 12-H), 3,561 (1H, s, OH), 4,084 (4H, m, OCH2CH2O) 4,671 (1H, s, OH). 5c 11,668T (C-4), 11,971Q (C-18), 19,511Q (C-19), 23,520Q (C-21), 63,612T (etylenodioksyl), 63,711T (etylenodioksyl), 73,483D (C-6), 76,051D (C-12), 84,307S (C-14), 111,099S (C-20).
P r z y k ł a d 19
3P,123,14-Trihydroksy-143-pregn-5-en-20-on (15)
Mieszaninę triolu (30) (80 mg, 0,20 mmola) w acetonie (20 ml) i kwasu chlorowodorowego (1M, 10 ml) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 60°C przez 2 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono i dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu (20 ml). Aceton odparowano i warstwę wodną wyekstrahowano chloroformem (3 x 20 ml), warstwę w chloroformie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego otrzymano epimeryczne trihydroksysteroidy (15a, 15b) (42 mg, 61%). Mieszaninę epimeryczną (15a, 15b) (15 mg) rozdzielono metodą chromatografii rzutowej z użyciem mieszaniny chloroform:metanol (9:1 v/v) jako eluenta, w wyniku czego uzyskano czysty 173-epimer (15a), (10 mg), t.t.; 224-229°C (aceton), (literaturowa 226-223°), (stwierdzono M 348,234, C; 72,32, H 9,21% C21H32O4 obliczono: C, 72,38; H 9,26%, M 348,236) i 17a-epimer (15B) (3 mg), t.t.: 183-191°C (aceton), (literaturowa 184-196°).
3β ,12 β ,14-Trihydroksy-143-pregn-5-en-20-on (15a):
5h 0,963 (1H, s, 19-H), 1,192 (3H, s, 18-H), 2,236 (3H, s 21-H), 3,325 (1H, dd, 3j 11,2 Hz, 3,9 Hz, 12-H), 3,464 (1H, s, OH), 3,5140 (1H, m, 3-H), 3,598 (1H, dd, 3j 9,6 Hz, 9,6 Hz, 17-H), 4,255 (1H, s, OH), 5,383 (1H, m, 5-H).
5c 8,275Q (C-18), 19,414Q (C-19), 24,400T (C-11) 24,581T (C-16), 27,443T (C-7), 30,062T (C-2), 32,972Q (C-21), 34,543T (C-15), 35,864D (C-8), 36,975S (C-10), 37,337T (C-1), 42,144T (C-4), 43,565D (C-9), 55,101S (C-13), 57,038D (C-17), 71,597D (C-3), 73,558D (C-12), 85,566S (C-14), 122,223D (C-6), 138,932S (C-5), 217,011S (C-20).
PL 197 783 B1
3β ,12β ,14-Trihydroksy-14e-pregn-5-en-20-on (15b):
δκ 0,996 (1H, s, 19-H), 1,144 (3H, s, 18-H), 2,221 (3H, s 21-H), 3,339 (1H, dd, 3 J 9,4 Hz, 9,4 Hz, 17-H^ 3,492 (1H, m, 3-H^ 3,629 (1H, dd, 3 J 11,1 Hz, 3,9 Hz, 12-H^ 3,712 (1H s, OH), 4,325 (1H s, OH), 5,383 (1H, m, 5-H).
P r z y k ł a d y 20 - 28 ilustrują procedury zgodnie z którymi można wytworzyć związki pośrednie przeznaczone do wytworzenia pierwszego monosacharydu (40).
P r z y k ł a d 20
Metylo-4,6-O-benzylideno-a-D-glukopiranozyd (32)
Mieszaninę metylo-a-D-glukopiranozydu (30 g, 0,15 mola), benzaldehydu (70 ml) i chlorku cynku (20 g) mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Produkt reakcji wlano do lodowatej wody i mieszanie kontynuowano przez 15 minut. Biały osad odsączono i przemyto eterem dietylowym. Stały materiał zmieszano z roztworem pirosiarczynu sodu (10% roztwór), przez 15 minut, przesączono i przemyto wodą. Stały związek wykrystalizował z mieszaniny chloroform:eter i otrzymano produkt benzylidenowy (32) (31 g, 72%).
P r z y k ł a d 21
Metylo-4,6-O-benzylideno-2-O-tosylo-a-D-glukopiranozyd (33)
Chlorek p-toluenosulfonylu (25 g, 1,2 równ.) w pirydynie (100 ml) wkroplono do roztworu benzylidenoglukozy (32) (31 g, 0,12 mola) w pirydynie (100 ml) w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Do mieszaniny reakcyjnej dodano lodu. Uzyskaną białą substancję stałą przemyto wodą i rekrystalizowano z gorącego etanolu, w wyniku czego otrzymano tosylanowaną glukozę (33) (28 g, 60%).
P r z y k ł a d 22
Metylo-4,6-O-benzylideno-3-O-metylo-a-D-altropiranozyd (34)
Tosylan (33) (28 g, 64 mmole) w roztworze sodu (7 g) w metanolu (150 ml) ogrzewano w 110°C przez 48 godzin w autoklawie. Naczynie reakcyjne ochłodzono i stały ditlenek węgla dodano do mieszaniny reakcyjnej. Po przesączeniu metanol odparowano i substancję stałą następnie roztworzono w wodzie. Warstwę wodną wyekstrahowano chloroformem (x 3). Chloroform wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Surową mieszaninę oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną chloroform:aceton (9:1), w wyniku czego otrzymano altrozyd (34) (10 g, 52%).
P r z y k ł a d 23
Metylo-6-bromo-4-O-benzoilo-3-O-metylo-6-deoksy-a-D-altropiranozyd (35)
Benzylidenoaltrozyd (34) (10 g, 33 mmole) dodano do roztworu N-bromosukcynimidu (7,6 g) i węglanu baru (20 g) w tetrachlorku węgla i mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 75°C przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną przesączono i warstwę w tetrachlorku węgla przemyto wodą. Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano 6-bromoaltrozyd (35), (9 g, 69%).
P r z y k ł a d 24
Metylo-4-O-benzoilo-3-O-metylo-6-deoksy-a-D-altropiranozyd (36)
Borowodorek sodu (18 g) w wodzie (30 ml) wkroplono dc roztworu bromoaltrozydu (35) (9 g, 23 mmole) i chlorku niklu (18 g) w etanolu (300 ml) w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 75°C przez 1 godzinę, po czym ją przesączono. Etanol odparowano i uzyskaną warstwę wodną wyekstrahowano chloroformem (x 3). Warstwę w chloroformie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano 6-deoksyaltrozyd (36) (5 g, 72%).
P r z y k ł a d 25
4-O-Benzoilo-3-O-metylo-6-deoksy-a3-D-fenylotioaltro-piranozyd (37)
Do roztworu 6-deoksyaltrozydu (36) (5 g, 17 mmoli) w dichlorometanie (200 ml) w 0°C dodano fenylotiotrimetylosilanu (5 ml) i trifluorometanosulfonianu trimetylosililu (2 ml). Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Do mieszaniny reakcyjnej dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Warstwę w dichlorometanie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Surową mieszaninę oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną chloroform:aceton (9:1), w wyniku czego uzyskano αβ-fenylotioaltrozyd (37) (4 g, 63%).
PL 197 783 B1
P r z y k ł a d 26
4-O-Benzoilo-3-O-metylo-2-fenylotio-2,6-dideoksy-ae-D-fluorocymaropiranozyd (38)
Do roztworu αβ-fenylotioaltrozydu (37) (0,5 g, 1,33 mmola) w dichlorometanie w temperaturze 0°C szybko dodano trifluorku dietyloaminosiarki (0,65 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 0,5 godziny w temperaturze 0°C, po czym dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Dichlorometan oddzielono od warstwy wodnej, wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano αβ-fluorocymarozę (38) (450 mg, 90%).
P r z y k ł a d 27
4-O-Benzoilo-3-O-metylo-2-O-t-butylodimetylosililo-ae-D-fenylotioaltrozyd (39)
6-Deoksyaltrozyd (37) (5 g) sililowano z użyciem chlorku t-butylodimetylosililu (3 g) i imidazolu (3 g) w pirydynie (50 ml). Mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano octanem etylu, przemyto octanem etylu i kwasem solnym (6 N), po czym wodorowęglanem sodu i na końcu wodą. Warstwę w octanie etylu wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano sililowany benzoilofenylotioaltrozyd (39) (80%).
P r z y k ł a d 28
3-O-Metylo-2-O-t-butylodimetylosililo-ae-D-fenylotioaltrozyd (40)
Sililowany benzoilofenylotioaltrozyd (39) (6 g) poddano działaniu metanolanu sodu (100 ml) przez 4 godziny. Metanol odparowano i do mieszaniny reakcyjnej dodano wody. Warstwę wodną zakwaszono (pH 5, ACOH) i wyekstrahowano octanem etylu. Warstwę w octanie etylu przemyto wodą, wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano sililowany metylofenylotioaltrozyd (40) (75%).
P r z y k ł a d y 29 - 37 ilustrują procedury syntez, zgodnie z którymi można wytworzyć związki pośrednie do wytwarzania drugiego monosacharydu (50).
P r z y k ł a d 29
1,2:5,6-Di-O-izopropylideno-a-D-glukofuranoza (42)
Kwas siarkowy (40 ml) wkroplono do roztworu α-D-glukozy (41) (50 g, 0,28 mola) w acetonie (1 l) w temperaturze 0°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 24 godziny, po czym zobojętniono z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (6 M). Aceton odparowano i warstwę wodną wyekstrahowano chloroformem (x 2). Warstwę w chloroformie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Po krystalizacji z cykloheksanu otrzymano diizopropylidenoglukozę (42) (41 g, 57%).
P r z y k ł a d 30
1,2:5,6-Di-O-izopropylideno-3-O-metylo-a-D-glukofuranoza (43)
Do zawiesiny wodorku sodu (5 g) w tetrahydrofuranie (200 ml) wkroplono α-D-glukofuranozę (42) (41 g, 0,16 mola) w tetrahydrofuranie (300 ml). Po 0,5 godzinie do mieszaniny reakcyjnej wkroplono jodek metylu (25 g) w tetrahydrofuranie (100 ml), czym całość mieszano przez 24 godziny. Do mieszaniny reakcyjnej dodano wody, po czym wyekstrahowano eterem (x 3). Warstwę w eterze wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano zabezpieczoną grupą metylową glukozę (43) (38 g, 83%)
P r z y k ł a d 31
3-O-Metylo-ae-D-glukopiranozyd (44)
Związek metylodiizopropylidenu (43) (38 g, 0,14 mola) rozpuszczono w kwasie octowym (50%, 700 ml) i roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez 18 godzin. Po ochłodzeniu kwas octowy odparowano. Surowy produkt oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej z elucją mieszaniną chloroform:metanol:aceton:woda (70:27:2:1), w wyniku czego uzyskano 3-O-metylo-ae-glukopiranozyd (44) (13 g, 50%).
P r z y k ł a d 32
Metylo-3-O-metylo-a,e-D-qlukopiranozyd (45)
Metylo-3-O-metylo-a,e-glukopiranozyd (44) (10 g) rozpuszczono w metanolu (50 ml) i HCl (stęż.) (1 ml) i całość ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez noc. Dodano stałego NaHCO3 i mieszaninę reakcyjną przesączono. Metanol odparowano, w wyniku czego uzyskano 1,3-di-O-metylo-a,e-3-D-glukopiranozyd (45), (95%).
P r z y k ł a d 33
Metylo-4,6-O-benzylideno-3-O-metylo-a,e-glukopiranozyd (46)
Glukopiranozyd (45) (8 g) mieszano w temperaturze pokojowej w roztworze benzaldehydu (20 ml) i chlorku cynku (5 g). Po 24 godzinach dodano lodu i warstwę wodną wyekstrahowano chloroformem. Warstwę w chloroformie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Benzaldehyd usu36
PL 197 783 B1 nięto drogą destylacji pod próżnią i produkt oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną aceton:chloroform (0,5:9,5), w wyniku czego uzyskano benzylideno-ae-glukopiranozyd (46) (60%).
P r z y k ł a d 34
4-O-benzoilo-O-metylo-6-deoksy-a3-glukopiranozyd (47)
Benzyliden (46) (5 g) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 80°C w mieszaninie N-bromosukcynimidu (3,7 g) i węglanu baru (4 g) w tetrachlorku węgla. Po 4 godzinach mieszaninę reakcyjną przesączono i warstwę w tetrachlorku węgla przemyto wodą, wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano bromo-związek (70%).
Bromo-związek (4,3 g) rozpuszczono w roztworze etanolu (300 ml) i chlorku niklu (8,6 g) w temperaturze 0°C. Do tego roztworu wkroplono borowodorek sodu (8,6 g) w wodzie (50 ml) w ciągu 15 minut. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w temperaturze 100°C przez 45 minut, ochłodzono, przesączono i odparowano. Dodano chloroform i warstwę w chloroformie przemyto wodą, wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano 6-deoksycukier (47) (70%).
P r z y k ł a d 35
4-O-Benzoilo-3-O-metylo-1-fenylotio-6-deoksy-a3-glukopiranozyd (48)
6-Deoksyglukopiranozyd (47) (3 g) rozpuszczono w dichlorometanie (50 ml). Do tego roztworu dodano fenylotiotrimetylosilanu (2 g) i trifluorometanosulfonianu trimetylosililu (0,2 ml). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, po czym dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Warstwę w dichlorometanie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Produkt oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną octan etylu:heksan (2:8), w wyniku czego uzyskano związek (48) (60%).
P r z y k ł a d 36
4-O-Benzoilo-3-O-metylo-2-O-piwaloilo-1-fenylotio-6-deoksy-a3-glukopiranozyd (49)
Do roztworu glukopiranozydu (48) (2 g) w pirydynie (20 ml) dodano chlorku piwaloilu (2 ml). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, po czym dodano wody. Warstwę wodną wyekstrahowano octanem etylu i warstwę organiczną przemyto HCl (6 N). Warstwę organiczną wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano, w wyniku czego uzyskano ester kwasu piwalinowego (49) (80%).
P r z y k ł a d 37
4-O-Benzoilo-3-O-metylo-2-O-piwaloilo-1-fluoro-6-deoksy-3-glukopiranozyd (50)
N-Bromosukcynimid (1,2 g) i trifluorek dietyloaminosiarki (1,2 g) dodano w temperaturze 0°C do roztworu estru kwasu piwalinowego (49) (2 g) w dichlorometanie (100 ml). Po 1 godzinie dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Warstwę w dichlorometanie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. β-Fluoropiranozyd (50) oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną octan etylu:heksan (2:8), (wydajność 45%).
Przykład 38 ilustruje sposób syntezy zgodnie z którym można wytworzyć związek 3-O-[4-O-benzoilo-2-fenylotio-e-D-cymaropiranozylo]-12,143-dihydroksypregnan-5-en-20-on (51).
P r z y k ł a d 38
3-O-[4-O-Benzoilo-2-fenylotio-e-D-cymaropiranozylo]-12,143-dihydroksypregn-5-en-20-on (51)
Chlorek cyny (190 mg, 1 mmol) dodano do roztworu 3,12,143-trihydroksypregnan-5-en-20-onu (15) (100 mg, 0,28 mmola) i fluorocymaropiranozydu (38) (210 mg, 0,56 mmola) w suchym eterze dietylowym i sitach molekularnych 4A w temperaturze -15°C. Mieszaninę reakcyjną utrzymywano w temperaturze -15°C przez 3 dni. Do mieszaniny reakcyjnej dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Warstwę w eterze wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Produkt oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną chloroform:metanol (9,5:0,5), w wyniku czego uzyskano glikozyd (51) (30 mg, 15%).
P r z y k ł a d y 39 - 41 ilustrują sposoby syntez zgodnie z którymi można sprzęgać reszty cymarozy i tewetozy.
P r z y k ł a d 39
Disacharyd tewetozo-cymarozy (53)
Roztwór tewetozy (50 A) (1,5 g), cymarozy (40) (1,3 g), i sit molekularnych 4A w dichlorometanie mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury -15°C i dodano chlorku cyny(II) (0,8 g) i trifluorometanosulfonianu srebra (1,1 g). Mieszaninę mieszano w temperaturze -15°C przez 16 godzin, po czym dodano trietyloaminę (0,5 ml). Produkt
PL 197 783 B1 reakcji przesączono i dichlorometan odparowano. Disacharyd (53) oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym z elucją mieszaniną octan etylu:heksan (2:8) wydajność 15%.
P r z y k ł a d 40
Disacharyd tewetozo-cymarozy (54)
Do roztworu disacharydu (53) (200 mg) w tetrahydrofuranie (20 ml) dodano fluorku tetrabutyloamoniowego (0,4 ml). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, po czym dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Mieszaninę reakcyjną wyekstrahowano octanem etylu i warstwę w octanie etylu wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. Disacharyd (54) oczyszczono drogą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina aceton:chloroform, 0,5:9,5), wydajność: 60%.
P r z y k ł a d 41
Disacharyd tewetozo-cymaroza (55)
Do roztworu disacharydu (54) (80 mg) w dichlorometanie (10 ml) dodano w temperaturze 0°C trifluorku dietyloamino-siarki (80 μΙ.). Po mieszaniu w temperaturze 0°C przez 0,5 godziny dodano nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i więcej dichlorometanu. Warstwę w dichlorometanie wysuszono (MgSO4), przesączono i odparowano. W wyniku oczyszczenia metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym (mieszanina: octan etylu:heksan 1:9) otrzymano disacharyd (55) z wydajnością 65%.
P r z y k ł a d 42
Poniżej podano wyniki poniższych trzech prób biologicznych odnośnie hamowania łaknienia.
a) Próba Irwina;
b) Próba ostrej toksyczności; i
c) Próba anorektyczna dawki doustnej
a) Próba Irwina
Celem tej próby była ocena hamowania łaknienia związków według wynalazku uzyskanych z ekstraktu roślinnego jak opisano wcześniej na podstawie działania uspokajającego w uproszczonej próbie Irwina dla zwierząt.
Procedura doświadczalna
Związek hamujący łaknienie wyekstrahowano z materiału roślinnego przez Zgłaszającego opisanym tu sposobem i podano dwóm z czterech grup, w każdej po 3 zwierzęta: jedna grupa nie otrzymała leku, druga grupa otrzymała rozpuszczalnik, dimetylosulfotlenek (DMSO), trzecia grupa otrzymała badaną próbkę w ilości 50 mg/kg, a czwarta grupa otrzymała badaną próbkę w ilości 300 mg/kg. Podawanie odbyło się drogą iniekcji wewnątrzotrzewnowe i dokonywano obserwacji w określonych odstępach czasu do 5 godzin po podaniu. W interpretacji wyników posłużono się tylko objawami innymi niż te zaobserwowane u zwierząt, którym podawano DMSO.
Wyniki
Było oczywiste, że rozpuszczalnik DMSO działał w określony sposób na zwierzęta, zwłaszcza na mechanizm regulujący pracę serca. Zauważono znaczący spadek temperatury ciała u wszystkich zwierząt, którym podawano rozpuszczalnik, sam lub razem z badaną próbką.
Zwierzęta w grupie z niską dawką wykazywały zmniejszone rozproszenie w klatce i osłabienie czynności lokomotorycznej w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami, łącznie z grupą kontrolną. Zaobserwowano apatię w takim samym stopniu jak w grupie, której podawano DMSO. Po 15-60 minutach po podaniu zauważono spowolnienie oddychania. Opadanie (zamykanie się powiek) również zaobserwowano w większym stopniu niż w grupie DMSO. Zauważono reakcję małżowiny usznej (ucho) jak również pozytywną reakcję palca, wskazującą na strachliwość. Po podaniu nastąpił spadek temperatury ciała do 32,7°C.
Zwierzęta w grupie z wysoką dawką wykazywały w porównaniu z innymi grupami na początku zmniejszenie rozproszenia w klatce i zmniejszenie czynności lokomotorycznej, lecz wykazywały zwiększone rozproszenie i czynność lokomotoryczną przed śmiercią, występującą po około 1 godzinie po podaniu. 30 minut po podaniu wystąpiły liczne symetryczne drgawki kloniczne. Początkowo miało miejsce spowolnienie oddychania, lecz nastąpiło przyspieszenie przed śmiercią. Wystąpiło opóźnienie reakcji małżowiny usznej (ucho) i zaobserwowano pozytywną odpowiedź palca, wskazującą na strachliwość, podobnie jak u zwierząt w grupie z niską dawką. Po podaniu nastąpił spadek temperatury ciała do 30,7°C. Zaobserwowano zwiększoną pasywność położenia, jak również zmniejszone napięcie ciała. Zaobserwowano nieprawidłowy obrót kończyny, zmniejszenie siły uścisku, brak reakcji na ból i brak odruchów postawy i ułożenia.
PL 197 783 B1
Omówienie
W porównaniu z kontrolną grupą zwierząt i zwierzętami poddanymi działaniu DMSO zwierzęta otrzymujące niską dawkę (50 mg/kg) wykazywały tylko spowolnienie oddychania i zwiększony stopień opadania powiek. Zwierzęta otrzymujące wysoką dawkę (300 mg/kg) badanej próbki reagowały bardzo silnie z nastąpieniem drgawek i śmierci. Wszystkie inne obserwacje dokonane u tych zwierząt można przypisać zwierzętom znajdującym się w drgawkach i umierającym. Nie zauważono żadnych oznak świadczących o działaniu trankwilizującym i uspokajającym, takie jak zauważalne zmniejszenie rozproszenia w klatkach, zmniejszenie czynności lokomotorycznej i apatia w grupach badanych, które można przypisać badanej próbce.
Zatem można wywnioskować, że badana próbka jest śmiertelna dla myszy w ilości 300 mg/kg i ma działanie hamowania czynności oddychania u myszy przy 50 mg/kg, przy podawaniu dootrzewnowym z DMSO jako rozpuszczalnikiem.
b) Próba ostrej toksyczności
Celem tej próby było uzyskanie informacji o toksyczności badanej próbki.
Procedura doświadczalna
Ekstrakt z roślin wytworzony zgodnie z opisanym tu sposobem według wynalazku i o czynności hamowania łaknienia, oczyszczono i myszom podawano doustnie jedną próbkę badaną ze zwiększeniem dawek. Użyto po dwa zwierzęta w grupie dawkowania, z wyjątkiem grupy o najwyższej dawce, gdzie tylko jedno zwierzę poddano próbie. Zwierzęta badano pod kątem dobrego zdrowia i ich masy ciała w dniu podawania.
Zakres dawek wynosił od 100 mg/kg do 3028,5 mg/kg. Dawkę obliczono i zmieszano z przygotowaną skrobią ziemniaczaną, tak, że każde zwierzę otrzymało całkowitą dawkę 0,2 ml. Trzynaste zwierzę, otrzymało 0,25 ml. Skrobię ziemniaczaną przygotowano poprzez zmieszanie 20 g skrobi w niewielkiej objętości zimnej wody, dodano ją do wrzącej wody i uzupełniono do objętości 1 litra. Pozwolono by zawiesiną ochłodziła się do temperatury pokojowej przed podaniem.
Zwierzęta w grupach 1 i 2 potraktowano dawką tego samego dnia. Obserwowano je przez 24 godziny i jeśli nie pojawiały się objawy toksyczności, traktowano dawką następną grupę. W ten sam sposób badano następne grupy. Zastosowano tę procedurę w celu zapewnienia, że nie nastąpiło niepotrzebne badanie tych zwierząt w przypadku, gdy osiągnięto dawkę wywołującą ostrą toksyczność w poprzedniej grupie.
U zwierząt poszukiwano objawów klinicznych toksyczności niezwłocznie po podaniu (1-2 godziny) i każdego następnego dnia. Masę ciała określano raz na tydzień i mierzono całkowite przyjmowanie pokarmu i wody przez każdego zwierzęcia.
Zwierzęta, które przeżyły, usypiano poprzez iniekcję dootrzewnowe pentobarbitonu sodu (dostępny w handlu jako produkt o znaku towarowym Euthanaze, Centaur®) czternastego dnia eksperymentu. Badanie po śmierci przeprowadzano na tych zwierzętach, jak również na zwierzętach, które zdechły w trakcie eksperymentu. Pobrano próbki w celu badania histopatologicznego.
Wyniki
Grupa 1 (grupa kontrolna)
Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych toksyczności podczas 14-dniowego okresu obserwacji. Przyjmowanie pokarmu i wody było w normie. Wahania masy ciała były także w normie. W próbkach wątroby nie odnotowano żadnych zmian histopatologicznych.
Grupa 2 (100 mg/kg)
Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych toksyczności podczas okresu obserwacji. Przyjmowanie pokarmu i wody było w normie. Nie zaobserwowano żadnej patologii makroskopowej oraz nie odnotowano w próbkach wątroby żadnych zmian histopatologicznych oraz morfologicznych.
Grupa 3 (200 mg/kg)
Zwierzęta w tej grupie nie wykazywały żadnych klinicznych objawów toksyczności podczas eksperymentu. Przyjmowanie pokarmu i wody było normalne jak również zmiany masy ciała. Nie zaobserwowano żadnej patologii makroskopowej, lecz wątroby wykazywały zmiany histopatologiczne podczas badania. U 6 zwierząt było słabe mętne obrzmienie hepatocytów, lecz średnie u 5 zwierząt. U pięciu zwierząt również zaszło umiarkowane zwyrodnienie wodniczkowe w hepatocytach.
Grupa 4 (400 mg/kg)
Nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych toksyczności podczas okresu obserwacji oraz żadnej patologii makroskopowej podczas badania po śmierci. Zaobserwowano umiarkowane mętne obrzmienie i łagodne zmiany obrzękowe po histologii.
PL 197 783 B1
Przyjmowanie pokarmu i wody oraz zwiększenie masy ciała u zwierzęcia 7 było w normie. Zwierzę 8 spożyło prawie dwukrotnie więcej od zwierzęcia 7 (odpowiednio 144,6 g i 73,9 g), lecz zwiększenie masy ciała było tylko 0,81 g w porównaniu do 2,7 g.
Grupa 5 (800 mg/kg)
Jedno zwierzę (zwierzę 10) zdechło po 3 godzinach po podaniu bez wykazywania żadnych specyficznych objawów. Drugie zwierzę (zwierzę 9) przeżyło początkowy okres obserwacji bez żadnych oznak toksyczności. Przyjmowanie wody u zwierzęcia, które przeżyło, było normalne (42,42 ml), podczas gdy przyjmowanie pokarmu było wysokie (134,2 g). Masa ciała wzrosła do 2,85 g i była największa w przypadku wszystkich zwierząt eksperymentu.
W badaniu pośmiertnym u zwierzęcia 10, które zdechło krótko po podaniu doustnym, płuca były przekrwione. Nie występowała reakcja na ciało obce, która wskazywałaby na inhalację badanego związku. U zwierzęcia 9 nie zaobserwowano żadnej patologii makroskopowej. U zwierzęcia 10 była obecna łagodna cytoplazmatyczna wakuolizacja (zwyrodnienie wodniczkowe), a średnia u zwierzęcia 9. Gruczołowy cytoplazmatyczny wygląd wątroby zaklasyfikowano jako umiarkowany u obu zwierząt.
Grupa 6 (1600 mg/kg)
Żadne ze zwierząt nie miało objawów klinicznych toksyczności podczas trwania eksperymentu. Nie zaobserwowano patologii makroskopowej podczas badania pośmiertnego, lecz podczas badania histopatologicznego zaobserwowano umiarkowane zmiany zwyrodnieniowe w wątrobie zwierzęcia 11. Zwierzę 12 wykazywało umiarkowane mętne obrzmienie i łagodne zmiany obrzękowe hepatocytów. Przyjmowanie pokarmu i wody było normalne, jak również zwiększenie masy ciała w czasie trwania eksperymentu.
Grupa 7 (3028,5 mg/kg)
Tylko jednemu zwierzęciu podano taką dawkę. Zwierzę to nie wykazywało oznak toksyczności podczas okresu obserwacji i nie zauważono żadnych zmian makroskopowych. Podczas badania histopatologicznego zaobserwowano umiarkowane mętne obrzmienie i zwyrodnienie wodniczkowe hepatocytów. Zwierzę wykazało ubytek masy ciała podczas okresu obserwacji (-0,82 g), lecz przyjmowanie pokarmu i wody było normalne.
Omówienie
Ponieważ bardzo niewielkie liczby zwierząt użyto w każdej z grupie dawek, trudno jest wyciągnąć jakiekolwiek wnioski. Fakt, że tylko jedno zwierzę zdechło po podaniu niskiej dawki bez wykazywania jakichkolwiek objawów, może wskazywać, że śmierć nie była związana z próbką badaną, lecz na skutek stresu podczas i/lub po podaniu. Żadne ze zwierząt w grupach o wyższych dawkach nie zdechło lub nie wykazywało żadnych objawów toksyczności, co dodatkowo potwierdziło to przypuszczenie.
Obserwowane zwiększenie przyjmowania pokarmu przez zwierzę 8 mogłoby ewentualnie być przypisane nadmiernemu rozsypywaniu się pokarmu, co miało wyraz w małym wzroście masy ciała. Należy pamiętać, że w tym eksperymencie zwierzętom podano raz dawkę i jest mało prawdopodobne, że środek hamujący łaknienie będzie miał znaczący wpływ na przyjmowanie pokarmu lub wody albo na masę ciała w ciągu czternastodniowego okresu, jak w przypadku tego eksperymentu.
Z badania histopatologicznego próbek z wątroby było oczywiste, że zmiany patologiczne były zależne od dawek, i zwierzęta otrzymujące wyższe dawki wykazywały rozległe zmiany. Obserwowana patologia nie miała charakteru metabolicznego, lecz była prawdopodobnie wywołana próbką badaną. Zmiany były tylko zwyrodnieniowe, a zatem odwracalne. Nie zaobserwowano żadnych objawów nieodwracalnych zmian komórek wątroby.
Zatem można wnioskować, że tylko jedno zwierzę zdechło przy niskiej dawce (800 mg/kg), lecz śmierć być może nie była związana z próbką badaną. Żadne z innych zwierząt w dowolnej grupie dawek nie wykazywało żadnych objawów toksyczności podczas czternastodniowej obserwacji po podaniu ani nie zdechło w wyniku podania. Pojedyncza dawka doustna próbki badanej wzbudziła odwracalne zależne od dawki zmiany komórek wątroby.
c) Próba anorektyczna dawki doustnej
Celem tej próby było określenie czynności ekstraktu z rośliny wytworzonego sposobem według wynalazku i minimalnej skutecznej dawki, a jednocześnie zbadanie możliwych działań ubocznych, takich jak hamowanie oddychania, jak stwierdzono w próbie Irwina (powyżej).
Procedura eksperymentalna
Zwierzęta rozdzielono do grup, którym podawano środek, z użyciem tabel doboru losowego. Każda grupa, której podawano środek, składała się z trzech zwierząt, a grupa kontrolna z sześciu.
PL 197 783 B1
Próbkę badaną podawano młodym samicom szczurów ważącym 100-150 g w czasie aklimatyzacji, przez trzy dni z rzędu. Zwierzęta oznaczono z użyciem metalowych znaczników na uszy i znakowania skóry KMnO4 w celu łatwiejszej identyfikacji. Zwierzęta trzymano oddzielnie w standardowych klatkach poliwęglanowych dla gryzoni ze swobodnym dostępem do wody i rozdrobnionych handlowych granulek dla gryzoni. Przyjmowanie wody i pokarmu mierzono i obliczano każdego dnia. W celu określenia minimalnej dawki skutecznej próbki badanej badano 5 dawek. Próbkę badaną w zawiesinie w skrobi ziemniaczanej podawano doustnie poprzez zgłębnik.
Badaną substancją był związek (1), biały, granulowany proszek wytworzony z ekstraktu z materiału roślinnego sposobem według wynalazku, i odmierzoną ilość badanej próbki zmieszano ze skrobią ziemniaczaną i podawano. Zmieszanie ze skrobią ziemniaczaną miało miejsce niezwłocznie przed podaniem każdego dnia. Przed pobraniem objętości dawkowanej dla każdego zwierzęcia zawiesiny mieszano dokładnie z użyciem urządzenia Vortex.
Badano 5 dawek, przy czym grupa kontrolna otrzymała tylko nośnik. Dawki dobierano na podstawie skutków zaobserwowanych we wcześniejszej próbie Irwina i wynosiły one:
Grupa 1: 0,00 mg/kg (grupa kontrolna)
Grupa 2: 6,25 mg/kg
Grupa 3: 12,50 mg/kg
Grupa 4: 25,00 mg/kg
Grupa 5: 37,50 mg/kg
Grupa 6: 50,00 mg/kg
Wyniki
Podawanie nie wpłynęło na zdrowie zwierząt w ciągu okresu badań. Zwierzęta, którym podawano próbkę badaną we wszystkich grupach dawek, wykazywały znaczące zmniejszenie przyrostu średniej masy ciała w ciągu całkowitego okresu badań i zwierzęta w trzech, z pięciu grup, którym podawano środek, rzeczywiście straciły na wadze.
Średnie przyjmowanie pokarmu dla wszystkich grup, którym podawano środek, zmniejszyło się w czasie trwania badań. Zwierzęta z grup o wyższych dawkach wykazywały zwiększone spożycie wody.
Nie zmieniła się znacząco częstość oddechów u żadnego ze zwierząt w żadnej z grup dawek.
Zwierzęta we wszystkich grupach dawek wykazywały kruchość wątroby podczas badania pośmiertnego, lecz nie zaobserwowano u nich żadnej patologii w skali makroskopowej.
Omówienie
Dane uzyskane w trakcie trwania okresu aklimatyzacji potwierdziły, że wszystkie zwierzęta objęte eksperymentem były zdrowe i przyrost masy ciał był porównywalny pomiędzy zwierzętami.
Zmniejszenie przyrostu, a u niektórych zwierząt ubytek masy ciała w połączeniu ze zmniejszonym przyjmowaniem pokarmu wyraźnie wskazuje na hamowanie ośrodka łaknienia.
Zmniejszenie przyjmowania pokarmu i zmniejszenie przyrostu masy ciała występowało nawet w przypadku grupy o najniższej dawce (6,25 mg/kg). Rzeczywisty ubytek masy ciała miał miejsce w grupie 12,50 mg/kg.
Istotne jest to, że w przypadku wszystkich grup, którym podawano środek, nastąpiło zwiększone spożycie wody, podczas gdy spożycie pokarmu zmalało (fig. 2). Może to być skutkiem działania moczopędnego próbki badanej lub stymulowania ośrodka pragnienia w mózgu.
Pozytywnym aspektem jest fakt, że nie wystąpiło spowolnienie oddychania, co zaobserwowano w próbie ostrej toksyczności, opisanej powyżej, przy podawaniu dootrzewnowym. Mogło to być wywołane zmniejszeniem absorpcji z przewodu pokarmowego, a w konsekwencji zmniejszeniem biodostępności. Biodostępność przy testowanych dawkach doustnych, była jednak wystarczająca dla zapewnienia skuteczności próbki badanej. Nieznaczne zmniejszenie częstości oddychania po 1 godzinie od podania w większości grup można przypisać napełnianiu żołądka objętością dawki i wynikłą pasywnością zwierząt.
Kruchość wątroby zaobserwowana w grupach, którym podawano środek, mogła być spowodowana zmianami w metabolizmie energii w wyniku zmniejszenia przyjmowania pokarmu, powodując zwiększenie metabolizmu tłuszczu i przeciążenie wątroby. Gdyby rzeczywiście miało to miejsce, zmiany takie można by ewentualnie uznać za zmiany przejściowe, które mogłyby ustępować z czasem po osiągnięciu stanu ustalonego lub po wycofaniu badanej próbki. Możliwy wpływ na wątrobę również wymaga dalszych badań.
Ponieważ z założenia badanie to stanowiło jedynie próbę przesiewową, użyto małych grup badanych zwierząt. W związku z tym trudno było o interpretację statystyczną, zwłaszcza gdy poszczePL 197 783 B1 gólne zwierzęta reagowały całkowicie różnie. Jednak dane wskazują, że próbka badana ma działanie hamowania łaknienia, nawet, przy podaniu najniższej dawki (6,25 mg/kg). W przypadku badanych dawek nie zaszły żadne kliniczne objawy zmniejszenia częstości oddychania.
P r z y k ł a d 43
Zebrane rośliny Hoodia uzyskane z naturalnego środowiska lub z hodowli najpierw przechowywano w 4°C przez maksymalnie 48 godzin. Rośliny przemyto wodą wodociągową, po czym pokrojono na fragmenty o rozmiarach ±1 cm. Pokrojone kawałki zebrano i sprasowano z użyciem prasy hydraulicznej pod ciśnieniem 30000 kPa przez minimum 0,5 godziny. Sok uzyskany z roślin zbierano oddzielnie. Sok przechowywano w temperaturze -18°C aż do przeprowadzenia dalszej obróbki.
Sok suszono rozpyłowo w odpowiednich warunkach z wytworzeniem sypkiego proszku. Zawartość wilgoci w proszku wyniosła korzystnie mniej niż 5%, po suszeniu rozpyłowym, a w razie konieczności proszek, dalej suszono w piecu próżniowym lub z użyciem suszarki ze złożem fluidalnym.
Wykazano w próbach biologicznych, że zarówno sok jak i wysuszony próżniowo materiał były skuteczne jako środki hamujące łaknienie u szczurów.
Doświadczenie kg roślin Hoodia gordonii przemyto wodą wodociągową, po czym pokrojono na kawałki o rozmiarach 1 cm. Pokrojone rośliny następnie sprasowano z użyciem prasy hydraulicznej pod ciśnieniem 30000 kPa przez minimum 0,5 godziny/partię. Sok zebrano i stwierdzono masę 10 kg w przypadku gdy użyto roślin Hoodia gordonii ze środowiska naturalnego, zaś 20 kg gdy użyto roślin Hoodia gordonii z hodowli. Sok (500 g) suszono rozpyłowo stosując poniższe warunki:
Szybkość przepływu: Temperatura na wlocie: Temperatura na wylocie Temperatura komory:
2,85 ml/min 110°C 70°C 78°C
Uzyskany w wyniku suszenia rozpyłowego proszek stanowił sypki proszek (22 g) o zawartości wilgoci 6,9%.
Wysuszony rozpyłowo proszek poddano analizie na stężenie składnika czynnego z użyciem technik HPLC. Określono stężenie substancji czynnej w wysuszonym rozpyłowo proszku na 13 g/kg.
Analiza metodą HPLC Eluent:
Kolumna:
Absorbancja UV: Szybkość przepływu: Objętość iniekcji:
Acetonitryl:woda (7:3), izokratycznie układ faz odwróconych C-18 225 nm ml/min.
μ|
Sposób
Wysuszony rozpyłowo proszek (10 mg) rozpuszczono w wodzie (0,5 m|) i w acetonitry|u (0,5 m|). 10 μ| tego roztworu wstrzyknięto do HPLC i okreś|ono stężenie związku czynnego (1) z użyciem standardowej krzywej uzyskanej d|a czystego związku (1).
P r z y k ł a d 44
Podano poniżej wyniki badań oszacowania moż|iwego działania anorektycznego związku (1) u szczura. Poniższe badane próbki stanowią czysty sok (próbka 1), wysuszony rozpyłowo sok (próbka 2) i związek czynny (próbka 3). Próbki 1 i 2 stanowią odpowiednio sok i wysuszony rozpyłowo sok, jak opisano w przykładzie 43 powyżej. Próbkę 3 stanowi wyekstrahowany rozpuszcza|nikiem związek (1) o czystości >95%.
Każdą z próbek 1-3 podawano w postaci pojedynczej dawki doustnej samcom szczurów Wistar. Dwie dodatkowe grupy kontro|ne otrzymały nośnik (woda desty|owana |ub DMSO). Doustnie podawaną fenf|uraminę (7,5 mg/kg) dołączono jako standardowy wzorzec.
W wyniku podania doustnie próbki 1 (czysty sok) uzyskano za|eżne od dawki zmniejszenie spożycia pokarmu, które było statystycznie znaczące przy dawkach 1600 mg/kg i wyższych, w porównaniu z grupami kontro|nymi, którym podawano nośnik. Odnotowano również towarzyszące zmniejszenie wagi ciała (|ub szybkości wzrostu). W dniu podawania odnotowano statystycznie znaczące zwiększenie spożycia wody w 3 godzinie od podania (6400 i 10000 mg/kg) i 6 godzinie od podania (10000 mg/kg). Pomiędzy 24 i 48 godzinami od podania odnotowano statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia wody przy dawkach 3200 mg/kg i wyższych.
PL 197 783 B1
W wyniku podania doustnie dawki 2 (suszony rozpyłowo sok) w ilości 76 mg/kg także uzyskano statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu i zmniejszenie wagi ciała w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano nośnik. Nie odnotowano żadnego znaczącego statystycznie wpływu na spożycie wody.
Próbka 3 (związek czynny) dała statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu przy dawce doustnej wynoszącej 5,0 mg/kg. Związek czynny nie wywołał żadnego statystycznie znaczącego wpływu na wagę ciała chociaż rozpatrywane dane z badań ujawniły nieznaczne opóźnienie we wzroście w porównaniu z grupami kontrolnymi zwierząt, którym podawano nośnik. Nie odnotowano żadnego znaczącego statystycznie wpływu na spożycie wody.
Wzorzec fenfluramina (7,5 mg/kg), dawała statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu w 6 i 24 godziny po podaniu w porównaniu ze stosowną grupą kontrolną, której podawano nośnik. Nie odnotowano żadnego statystycznie znaczącego wpływu na spożycie wody lub wagę ciała.
Nie odnotowano żadnego zależnego od podawania wpływu na wątrobę.
Badana substancja
Tożsamość Próbka 1 (czysty sok) Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) Próbka 3 (substancja czynna)
Wygląd Brązowa ciecz Proszek Biały proszek
Warunki przechowywania -20°C w ciemności Temperatura pokojowa w ciemności 4°C w ciemności
Czystość Czysty sok Czysty suszony rozpyłowo sok >95%
Nośnik Woda destylowana Woda destylowana Dimetylosulfotlenek (DMSO)
Procedura eksperymentalna W badaniu użyto 55 samców szczurów Wistar.
Codziennie w tym samym czasie, od momentu przybycia do zakończenia badań, zapisywano ciężar ciała, spożycie pokarmu (ciężar skrzyni z pokarmem) i spożycie wody (ciężar butelki).
Zgodnie z poniższą tabelą 1 dnia szczury otrzymały pojedynczą dawkę doustnie (przez zgłębnik):
Grupa n Podawanie doustnie Dawka (mg/kg)
1 5 Nośnik (woda destylowana) -
2 4 Próbka 1 (czysty sok) 800,0
3 5 Próbka 1 (czysty sok) 1600,0
4 5 Próbka 1 (czysty sok) 3200,0
5 5 Próbka 1 (czysty sok) 6400,0
6 5 Próbka 1 (czysty sok) 10000,0
7 5 Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) 38,0
8 5 Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) 76,0
9 5 Próbka 3 (substancja czynna) 2,5
10 5 Próbka 3 (substancja czynna) 5,0
11 3 Fenfluramina 7,5
12 3 Nośnik -
Grupom 1-8 podawano dawkę z użyciem stałej objętości dawki wynoszącej 10 ml/kg, a grupom 9-12 podawano dawkę w objętości 1 ml/kg.
Mierzono również spożycie pokarmu i wody w 1,3 i 6 godzinie po podaniu dnia 1.
Po przeprowadzeniu pomiaru w dniu 8 zwierzęta uśmiercono poprzez uduszenie z użyciem ditlenku węgla i wątroby wycięto i umieszczono w 10% buforowanej formalinie, przed histologią.
PL 197 783 B1
Wycinki 4 - 5 urn każdej wątroby w twardej parafinie zabarwiono z użyciem hematoksyliy i eozyny. Dodatkowe fragmenty pocięto na aparacie Cryostat na 12 um i zabarwiono Oil Red O (ORO) umożliwiającym wykrywanie tłuszczu.
Analiza danych
Pomiary spożycia pokarmu i wody oraz ciężaru ciała po podawaniu w każdym punkcie czasowym u zwierząt, którym podawano P57, porównano z wynikami dla odpowiedniej grupy kontrolnej, której podawano w podobny sposób nośnik, z użyciem analizy wariancji, testu Williamsa dla porównania z kontrolami.
Dane odnośnie zwierząt, którym podawano fenfluraminę porównano z danymi odnośnie grupy kontrolnej, której podawano nośnik, z użyciem testu t-Studenta.
Wyniki
Wyniki badań podano w tabelach.
Próbka 1 (czysty sok) podawana doustnie, dawała widoczne związane z dawką zmniejszenie spożycia pokarmu dziennie. Czas i amplituda tego zmniejszenia spożycia pokarmu były zależne od dawki. W 24 godziny po podaniu próbka 1 (czysty sok) dała znaczące statystycznie zmniejszenie spożycia pokarmu przy dawkach 1600 mg/kg i wyższych w porównaniu z grupami kontrolnymi, którym podawano nośnik. Najwyższa dawka próbki 1 (sok) (10000 mg/kg), dała statystycznie znaczące zmniejszenie dziennego spożycia pokarmu do 5 dni po podaniu.
Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) i próbka 3 (związek czynny) dały widoczne i statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu przy dawkach podawanych doustnie odpowiednio 76 i 5,0 mg/kg. W obu przypadkach działania te trwały 48 godzin po podaniu.
Wzorzec, fenfluramina (7,5 mg/kg, doustnie) dała statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia pokarmu w 6 i 24 godzinie po podaniu w porównaniu do odpowiedniej grupy kontrolnej, której podawano nośnik (Grupa 12).
Próbka 2 (suszony rozpyłowy sok) i próbka 3 (substancja czynna) nie wykazały widocznego związanego z dawką wpływu na spożycie wody. W dniu podawania czysty sok dawał statystycznie znaczące zwiększenie spożycia wody w 3 godzinie po podaniu (6400 i 10000 mg/kg) i 6 godzinie po podaniu (10000 mg/kg). W dwa dni po podaniu odnotowano jednak statystycznie znaczące zmniejszenie spożycia wody u zwierząt otrzymujących próbkę 1 (sok) w ilości 3200, 6400 i 10000 mg/kg. Te zmniejszenia jednak nie były ściśle zależne od dawki i występowały tylko pomiędzy 1 i 2 dniem po podaniu. Biologiczne znaczenie tych wpływów zatem pozostaje niejasne.
Próbka 1 (czysty sok) ma związane z dawką statystycznie znaczące działanie na ciężar ciała w porównaniu do grupy kontrolnej, której podawano nośnik (Grupa 1). W przypadku podawania doustnie dawek w ilości 3200 mg/kg i większych, próbka 1 (czysty sok) dawała znaczące statystycznie zmniejszenie wagi ciała lub zmniejszenie szybkości wzrostu w porównaniu ze zwierzętami, którym podawano nośnik. Te wpływy były statystycznie znaczące od 48 godzin po podaniu, aż do zakończenia badań.
Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) podawana doustnie w ilości 76 mg/kg także dawała statystycznie znaczące zmniejszenie wzrostu zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną, ktorej podawano nośnik (Grupa 1). Te wpływy były statystycznie znaczące pomiędzy dniami 3 i 5, włącznie (48 godzin po podaniu).
Aczkolwiek okazało się, że próbka 3 (związek czynny) opóźnia wzrost zwierząt przy najwyższej dawce (5,0 mg/kg) w porównaniu z odpowiednią grupą kontrolną, której podawano nośnik, Grupą 12, ten wpływ nie miał statystycznego znaczenia.
Fenfluramina (7,5 mg/kg) dawała żadnych widocznych lub statystycznie znaczących wpływów odnośnie spożycia wody lub ciężarów ciał w porównaniu z grupą kontrolną, której podano nośnik (Grupa 12).
Nie odnotowano żadnego zależnego od podawania wpływu na wątrobę.
PL 197 783 B1
T a b e l a 1a
Wpływ podawania doustnego na spożycie pokarmu u szczurów (dane przed podaniem dawki, codziennie)
Grupa Podawanie doustnie Dawka (mg/kg) Średnie spożycie pokarmu w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
-6-5 -5-4 -4-3 -3-2 -2-1
1 Nośnik (woda) - 27,8±1,54 24,2±1,83 27,6±3,67 28,3±3,50 29,4±2,66
2 Próbka 1 sok 800 28,3±1,43 24,9±0,82 27,7±0,76 28,4±1,51 30,1±0,27
3 Próbka 1 sok 1600 29,0±1,39 25,0±2,16 27,4±1,96 28,8±0,61 29,5±1,55
4 Próbka 1 sok 3200 27,2±2,33 25,1±2,46 26,0±2,52 28,5±2,29 27,6±1,15
5 Próbka 1 sok 6400 28,7±1,64 25,3±1,73 27,3±1,45 29,211,09 30,3±0,90
6 Próbka 1 sok 10000 28,5±2,38 23,7±2,73 26,0±2,31 27,0±3,50 28,7±2,26
7 Próbka 2 suszona rozpyłowo 38 28,1±1,24 23,9±1,79 24,5±2,30 27,6±1,61 28,5±1,87
8 Próbka 2 suszona rozpyłowo 76 28,7±0,91 26,5±1,55 27,1±1,01 28,7±1,99 28,9±1,37
9 Próbka 3 związek czynny 2,5 28,8±1,49 26,4±3,12 29,0±1,99 29,4±1,76 29,5±2,81
10 Próbka 3 związek czynny 5,0 28,3±2,1 25,8±1,86 28,1±2,65 28,0±2,65 28,5±3,03
11 Fenfluramina 7,5 29,1±0,66 25,3±4,03 27,0±1,53 30,8±0,54 29,7±2,84
12 Nośnik (DMSO) - 27,9±1,8 26,7±2,11 28,7±1,99 28,1±4,06 30,5±2,54
sd - odchylenie standardowe
T a b ela 1b
Wpływ podawania doustnego na spożycie pokarmu u szczurów (dane po podaniu dawki, codziennie]
Gru pa Podawanie doustnie Dawka (mg/kg) Średnie spożycie pokarmu w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 Nośnik (woda) - 29,5±3,15 29,6±2,84 30,6±3,49 31,8±3,21 30,7±2,24 31,7±3,03 32,9±3,18
2 Próbka 1 sok 800 26,1±0,98 29,3±1,49 30,7±1,15 30,9±0,60 33,3±1,69 32,7±0,80 40,1±13,4
3 Próbka 1 sok 1600 22,6**±3,17 26,9±2,06 30,9±2,54 30,9±1,22 34,1±1,36 33,7±1,69 33,8±1,61
4 Próbka 1 sok 3200 20,1**±1,39 19,0**±1,88 22,8**±1,77 28,0±3,14 31,4±2,82 32,3±2,91 33,0±3,01
5 Próbka 1 sok 6400 18,2**±4,18 14,8**±1,75 18,4**±0,97 22,4**±3,01 26,9±2,81 31,0±2,31 32,0±2,34
6 Próbka 1 sok 10000 15,1**±2,98 12,4**±2,61 16,0**±3,15 19,7**±4,31 22,6*±5,70 30,1±4,79 32,6±5,90
PL 197 783 B1 cd. tabeli 1 b
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
7 Próbka 2 suszona rozpyłowo 38 25,6±2,85 27,3±0,95 30,3±2,06 31,0±2,13 31,8±1,63 31,1±1,94 31,8±2,45
8 Próbka 2 suszona rozpyłowo 76 24,2*±3,25 25,2*±3,24 29,9±1,85 30,2±2,28 31,2±2,26 32,3±1,44 33,1±0,61
9 Próbka 3 związek czynny 2,5 26,8±3,33 29,1±3,43 31,7±3,08 34,0±2,95 34,4±4,32 33,1±4,11 34,8±3,71
10 Próbka 3 związek czynny 5,0 22,1tt±2,19 21,0tt±3,07 27,6±5,26 30,5±3,33 33,0±3,16 32,4±3,25 33,0±3,84
11 Fenfluramina 7,5 22,4t±3,19 31,9±0,84 32,7±2,50 33,0±2,55 30,4±0,23 32,7±1,90 32,4±1,60
12 Nośnik (DMSO) - 29,9±3,36 30,6±4,43 30,1±4,17 32,4±5,26 31,8±3,08 32,8±3,98 33,3±3,76
sd - odchylenie standardowe,
Grupy 2-8 porównano z grupą 1 z nośnikiem: *p<0,05, **p<0,01 Grupy 9-11 porównano z grupą 12 z nośnikiem: p<0,05, 1 0,01
T a b e l a 2a
Wpływ podawania doustnego na spożycie wody u szczurów (dane przed podaniem dawki, codziennie)
Grupa Podawanie doustne Dawka (mg/kg) Średnie spożycie wody w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
-6-5 -5-4 -4-3 -3-2 -2-1
1 Nośnik (woda) - 40,9±4,61 34,8±4,15 37,6±5,63 33,5±7,42 32,2±6,32
2 Próbka 1 sok 800 38,6±1,96 37,1±9,74 36,4±4,81 28,1±1,83 30,4±4,75
3 Próbka 1 sok 1600 43,4±10,53 35,9±3,84 38,4±4,56 31,1±4,47 36,5±5,39
4 Próbka 1 sok 3200 40,1±5,58 33,3±3,01 37,3±4,46 31,3±3,48 31,7±3,18
5 Próbka 1 sok 6400 43,8±8,57 36,3±9,02 35,4±8,18 34,0±6,62 35,1±5,72
6 Próbka 1 sok 10000 37,4±5,34 32,7±3,35 33,2±4,86 29,0±5,11 32,2±3,27
7 Próbka 2 suszona rozpyłowo 38 40,0±4,36 35,8±4,92 34,7±3,20 30,2±1,88 31,4±2,98
8 Próbka 2 suszona rozpyłowo 76 38,6±1,98 37,0±1,96 48,8±21,5 31,6±4,56 39,0±17,27
9 Próbka 3 związek czynny 2,5 42,0±6,70 37,0±5,05 34,1±3,16 28,0±2,58 31,6±3,12
10 Próbka 3 związek czynny 5,0 40,9±4,48 34,2±3,00 32,7±1,26 28,2±1,65 33,1±4,82
11 Fenfluramina 7,5 47,0±5,3 35,5±7,49 34,7±3,73 30,9±2,12 31,6±2,80
12 Nośnik (DMSO) - 43,3±5,67 34,5±4,97 35,2±4,34 28,3±4,64 31,4±6,44
sd - odchylenie standardowe
PL 197 783 B1
T a b e l a 2b
Wpływ podawania doustnego na spożycie wody u szczurów (dane po podaniu dawki, codziennie)
Grupa Podawanie doustne Dawka (mg/kg) Średnie spożycie wody w grupie (g±sd) pomiędzy dniami:
1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8
1 Nośnik (woda) - 34,9±5,45 36,9±6,06 38,0±7,59 37,2±6,18 37,7±5,54 35,3±2,86 36,5±5,85
2 Próbka 1 sok 800 30,9±3,77 34,4±8,12 38,2±13,71 35,9±13,51 39,5±11,20 28,8±1,22 31,8±5,58
3 Próbka 1 sok 1600 29,2±1,66 31,7±5,35 41,3±11,21 34,6±4,10 48,1±12,27 37,8±7,28 36,9±9,28
4 Próbka 1 sok 3200 35,9±5,88 26,2*±2,66 30,5±2,44 34,1±4,80 45,8±18,54 51,0±35,21 42,6±13,88
5 Próbka 1 sok 6400 33,4±12,04 27,4*±8,13 32,6±10,67 35,4±10,78 45,2±8,72 36,2±6,72 35,9±9,58
6 Próbka 1 sok 10000 31,7±12,74 28,5*±8,85 32,4±8,87 36,6±6,50 40,7±11,51 38,0±6,66 37,5±6,21
7 Próbka 2 suszona rozpyłowo 38 36,0±6,02 34,5±1,79 38,2±7,16 39,6±7,09 42,7±9,74 45,6±17,15 46,1±9,49
8 Próbka 2 suszona rozpyłowo 76 45,0±19,03 39,1±16,59 46,9±18,34 35,9±3,40 41,9±12,37 36,9±8,47 38,1±8,93
9 Próbka 3 związek czynny 2,5 32,2±4,01 36,1±12,42 38,3±11,71 41,5116,60 34,7±7,57 33,0±4,20 35,3±8,70
10 Próbka 3 związek czynny 5,0 33,9±2,40 31,5±8,12 35,1±3,82 37,7±5,99 39,5±7,78 37,4±11,07 37,8±6,42
11 Fenfluramina 7,5 34,1±3,60 37,2±1,48 36,7±3,92 33,8±2,89 33,7±5,43 32,1±1,93 33,6±2,50
12 Nośnik (DMSO) - 40,7±9,10 33,8±9,37 32,9±7,07 35,2±11,49 33,8±9,82 32,3±7,44 32,0±7,22
sd - odchylenie standardowe
Grupy 2-8 porównano z grupą 1 z nośnikiem: * p<0,05 Grupy 9-11 porównano z grupą 12 z nośnikiem (bez istotności)
T a b e l a 3a
Wpływ podawania doustnego na masę ciała u szczurów (dane przed podaniem dawki, codziennie)
Grupa Podawanie doustne Dawka (mg/kg) Średnia masa ciała w grupie (g±sd) w dniu:
-5 -4 -3 -2 -1
1 2 3 4 5 6 7 8
1 Nośnik (woda) - 130,9±5,56 150,7±5,37 157,3±5,29 168,±16,20 177,5±6,70
2 Próbka 1 sok 800 131,6±4,34 150,1±4,84 158,5±4,35 169,6±4,99 177,7±4,10
3 Próbka 1 sok 1600 130,1±4,3 148,6±6,59 156,7±6,38 167,5±6,04 176,6±6,37
4 Próbka 1 sok 3200 130,8±6,19 147,7±7,56 154,4±8,06 165,2±8,43 175,8±9,10
5 Próbka 1 sok 6400 132,6±7,01 151,3±7,23 158,4±8,50 169,0±8,79 178,1±7,75
PL 197 783 B1 cd. tabeli 3a
1 2 3 4 5 6 7 8
6 Próbka 1 sok 10000 132,3±6,75 151,8±9,08 157,3±9,37 167,1±10,41 175,4±10,90
7 Próbka 2 suszona rozpyłowo 38 131,7±8,28 149,0±5,85 156,2±5,81 166,7±5,54 175,6±8,42
8 Próbka 2 suszona rozpyłowo 76 130,0±6,99 146,116,00 155,9±6,59 166,0±6,87 175,1±6,55
9 Próbka 3 związek czynny 2,5 132,6±7,63 148,9±8,51 157,3±8,91 169,8±8,96 179,4±8,71
10 Próbka 3 związek czynny 5,0 133,5±6,46 150,5±9,55 158,8±8,48 171,0±7,72 179,0±9,20
11 Fenfluramina 7,5 133,2±9,21 152,7±9,09 160,0±9,82 170,0±9,15 182,81±0,21
12 Nośnik (DMSO) - 129,1±3,17 147,3±4,37 155,0±6,29 166,0±5,91 174,8±8,26
sd - odchylenie standardowe
PL 197 783 B1
Raport histopatologiczny
Badanie histologiczne ograniczono do wątroby. Nie wykryto żadnych związanych z podawaniem zmian dla grup otrzymujących próbkę 1 (ciecz), próbkę 2 (suszony rozpyłowo sok), próbkę 3 (substancja czynna), fenfluraminę lub grupy kontrolnej z DMSO.
Odnotowane protokoły były podobne w grupie kontrolnej i grupach, którym podawano próbki.
PL 197 783 B1
T a b e l a
Zestawienie przypadków patologii w skali mikroskopowej
Płeć: samce Liczba badanych samców Zwierzęta, które przeżyły próby Grupa 1 0 mg/kg 5 5 Grupa 2 800 mg/kg 4 4 Grupa 3 1600 mg/kg 5 5 Grupa 4 3200 mg/kg 5 5 Grupa 5 6400 mg/kg 5 5 Grupa 6 1000 mg/kg 5 5
Wątroba 5
Badano 5 4 5 5 5 0
Nie stwierdzono żadnych zmian 0 0 1 2 3 3
Miąższowe ogniska komórek zapaleniowych (ogólnie) 0 1 0 0 0 3
Minimalnie 0 1 0 0 0 1
Przerost hepatocytów - leżący w środkowej części zrazika (ogólnie) 0 0 0 0 0 1
Minimalnie 0 0 0 0 0 0
Hemopoeza pozaszpikowa (ogólnie) 2 0 0 0 0 0
Minimalnie 2 0 0 0 0 0
Martwica hepatocytów - ogniskowe (ogólnie) 1 0 0 0 0 0
Minimalnie 1 0 0 0 0 0
Wrotny limfoidalny naciek (ogólnie) 3 4 4 3 2 2
Minimalnie 3 4 4 3 2 2
Hepatocyty eozynochłonne - ogniskowe (ogólnie) 1 0 0 0 0 0
Minimalnie 1 0 0 0 0 0
Zwłóknienie wrotne (ogólnie) 0 0 1 0 0 0
Minimalnie 0 0 1 0 0 0
Wątroba (wybarwianie ORO)
Badane 5 4 5 5 5 5
Nie stwierdzono żadnych zmian 2 3 2 4 3 3
Tłuszcz w komórkach wątroby - leżący w środkowej części zrazika (ogólnie) 3 1 2 1 2 2
Minimalnie 3 1 2 1 2 2
Tłuszcz w komórkach wątroby - pozawrotne 0 0 1 0 0 0
Minimalnie 0 0 1 0 0 0
Płeć: samce Liczba badanych samców Zwierzęta, które przeżyły próby Grupa 7 0 mg/kg 5 5 Grupa 8 800 mg/kg 4 4 Grupa 9 1600 mg/kg 5 5 Grupa 10 3200 mg/kg 5 5 Grupa 11 6400 mg/kg 3 3 Grupa 12 1000 mg/kg 3 3
1 2 3 4 5 6 7
Wątroba
Badano 5 5 5 5 3 3
Nie stwierdzono żadnych zmian 2 2 0 1 0 2
PL 197 783 B1 cd. tabeli
1 2 3 4 5 6 7
Miąższowe ogniska komórek zapaleniowych (ogólnie) Minimalnie Martwica hepatocytów - ogniskowe (ogólnie) Minimalnie Wrotny limfoidalny naciek (ogólnie) Minimalnie Wrotne leukocyty (ogólnie) Minimalnie Wątroba (wybarwianie ORO) Badanie Nie stwierdzono żadnych zmian Tłuszcz w komórkach wątroby - leżący w środkowej części zrazika (ogólnie) Minimalnie 0 0 0 0 3 3 0 0 5 5 0 0 0 0 0 0 3 3 0 0 5 3 2 2 0 0 1 1 5 5 1 1 5 3 2 2 0 0 0 0 4 4 0 0 5 3 2 2 0 0 0 0 3 3 0 0 3 2 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 3 2 1 0
P r z y k ł a d 45
Poniżej opisano dalsze próby biologiczne, w których użyto tych samych próbek badanych jak opisano w przykładzie 44. Zwierzęta w tym badaniu poddano ograniczonej diecie, to znaczy zwierzęta otrzymywały pokarm tylko pomiędzy 12:00 a 15:00 każdego dnia. Odróżnia to tę próbę od innych prób biologicznych, w których szczury miały swobodny dostęp do pożywienia. Zwierzęta aklimatyzowano w ciągu okresu 7 dni (dni -7 do -1), dozowanie miało miejsce od dnia 0 do dnia 6 o godzinie 9:00 doustnie poprzez zgłębnik. Okres powrotu do zdrowia był od dnia 7 do dnia 13. Grupy dawek opisano w tabeli 1 poniżej. Należy zwrócić uwagę, że aktualną grupę kontrolną zaznaczono w tabeli jako grupę 09. Grupa 5 jest grupą kontrolną, która otrzymała dietę równoważną tej dla grupy 4. Celem w przypadku tej grupy było oszacowanie, jaki wpływ ma ograniczona dieta na wątroby zwierząt.
Wyniki
Uzyskane w trakcie badania wyniki pokazały, że okres aklimatyzacji był za krótki. Szczury żywiły się przede wszystkim w ciągu nocy i nagła zmiana w ograniczeniu dostępu pokarmu do 3 godzin w ciągu dnia spowodowała zmniejszenie przyjmowanej dziennie ilości. Przyjmowanie dzienne pokarmu wciąż się zwiększało w większości grup pod koniec okresu aklimatyzacji, gdy rozpoczęto podawanie badanych próbek. Z tego powodu działanie badanych związków nie miało znaczącego wpływu na przyjmowanie pokarmu przez szczury podczas okresu podawania.
W tabeli D1 i tabeli D2 podano średnie masy ciał dla różnych grup dla dni od -7 do -1 i dni 0-6. Działanie różnych dawek soku i suszonego rozpyłowo soku pokazano na dołączonym wykresie jako % zmianę w masie ciała dla dni 0-7 (fig. 5) i % zmiana w masie ciała dla dni od -7 do 7 (fig. 6). Spadek masy ciała jest wyraźnie związany z dawką, zwłaszcza z wyższymi dawkami.
Badanie histopatologiczne wątrób nie wykazało żadnej znaczącej patologii w grupach otrzymujących badane próbki.
Pokarm
Spożycie pokarmu mierzono codziennie podczas aklimatyzacji i w trakcie trwania badania. Pokarm był dostępny przez 3 godziny w ciągu dnia, od 12:00 do 15:00. Zwierzęta głodzono przez resztę czasu. Zwierzęta w 5 grupie otrzymały obliczoną ilość pokarmu pierwszego dnia 1, równoważną średniemu spożyciu pokarmu przez 4 grupę dnia 0. Ten model kontrolowanej ilości pokarmu dla 5 grupy, określony jako średnie spożycie pokarmu przez 4 grupę z poprzedniego dnia, stosowano przez dni 1-7.
PL 197 783 B1
Woda
Wodę dostarczono w standardowych pojemnikach. Woda była dostępna bez ograniczeń (Magalies Water Board Tap Water, odpowiednia do spożycia przez ludzi). Spożycie wody mierzono raz dziennie, o tej samej godzinie każdego dnia po określeniu spożycia pokarmu.
Aklimatyzacja
Zwierzęta aklimatyzowano przez 7 dni zanim rozpoczęto badania, jak opisano powyżej, z określeniem spożycia pokarmu i wody. Masy ciała określano w tym czasie codziennie.
Projekt badania i procedury
T a b e l a 1 Projekt badania
Grupa Próba Numery Dawka Badana próbka
01 6 samców 001 - 006 100 mg/kg Sok zamrożony
02 6 samców 007 - 012 400 mg/kg Sok zamrożony
03 6 samców 013 - 018 1600 mg/kg Sok zamrożony
04 6 samców 019 - 024 3200 mg/kg Sok zamrożony
05 6 samców 025 - 030 kontrola Elga Option 4 Woda destylowana
06 6 samców 031 - 036 2,2 mg/kg Suszony rozpyłowo sok
07 6 samców 037 - 042 8,8 mg/kg Suszony rozpyłowo sok
08 6 samców 043 - 048 35 mg/kg Suszony rozpyłowo sok
09 6 samców 049 - 054 kontrola Elga Option 4 Woda oczyszczona
Sposób podawania
Badane próbki podawano codziennie przez 7 dni z użyciem igły dożołądkowo. Zwierzęta głodzono przez 18 godzin zanim podano badane próbki (podawanie rozpoczęto o 09:00).
Czas podawania
Zwierzęta traktowano przez 7 kolejnych dni (od dnia 0 do dnia 6). Po trzy zwierzęta z każdej grupy uśmiercano po 24 godzinach od ostatniej dawki (dzień 7). Pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podania (dzień 13). Procedurę tę zastosowano dla wszystkich grup z wyjątkiem grupy 5, w której 3 zwierzęta uśmiercono 24 godziny po ostatnim kontrolowanym podawaniu pożywienia (dzień 8), pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podawania (dzień 13).
Masa ciała
Masy ciała określano codziennie, w przybliżeniu w tym samym czasie każdego dnia w trakcie badania, w tym w ciągu okresu aklimatyzacji.
Eutanazja zwierzęta z każdej grupy uśmiercono po 24 godzinach od podania ostatniej dawki (dzień 7).
Pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podania. Procedurę tę zastosowano dla wszystkich grup z wyjątkiem grupy 5, w której 3 zwierzęta uśmiercono 24 godziny po ostatnim kontrolowanym podawaniu pożywienia (dzień 8), pozostałe 3 zwierzęta uśmiercono po 7 dniach od ostatniego podawania (dzień 13). Zwierzęta uśmiercano pod koniec okresu badań z użyciem gazu, CO2.
Badania z użyciem oftalmoskopu
Badania oftalmoskopowe z użyciem oftalmoskopu przeprowadzono przed pierwszym podaniem badanej próbki i na koniec, u wszystkich zwierząt z każdej grupy.
Patologia makroskopowa
Całkowite badania po uśmierceniu wykonano na każdym zwierzęciu, które uśmiercono pod koniec okresu badania.
Histopatologia
Badania histopatologiczne wykonano na wątrobie każdego zwierzęcia.
PL 197 783 B1
Q _rc φ
_q ,rc •C
Φ
N σ
>» ¢-, φ-1
CL
-S3 "ra 'o ω
ω
CD
E
Średnia masa ciała (g) & odchylenie standardowe Dzień -1 ru» ci 60 Ή ud CM cM 00 UD CM © UD 4-1 C' cy oC © CM ry oo" -p 4-1 CM CD 196,77+74,56 190,15 +65,24 ; 185,97+ 58,76 - oo oo" © 4-! UD —y 0© CM CM oo oo" CD 4-1 © ©y oo" O ©Λ ©" UD 4© O"" •D-
CM 1 •c N Q Γ— -fy ri oo +i 00 -fy ci 00 O TT 0© UD 4-1 UD CM. oO © Os ccy OC Pp 44 r— ©. ©" CM P cy ud" r+1 m oc •tp" © Os CD. c—" © 4-1 (· oo ©" Os © OO oo' UD 4-1 UD UD TT 00 © OC ©" © 4-1 (·> O. o" CM CM © P-" CD 4-1 UD CM. r·" © CM P-" UD •H © CD. 6© •śf
CD •G U n Q o oo •pp 00 +1 ud Os Pp" 00 CM -fy Γ-7 UD 4-1 CM OO O P— © UD o" -t 44 o UD CD CM 0© P r-H UD CM OO OS 00 -p. t—" SD 4-1 © -fy ci © 60 © ©" UD +1 CM CM ©" oo © r-y 4-1 00 <y ©" CM CM © -fy © +1 O ©" © © P-" UD -H CD ©. ©~ p
* c N Q UD ργ © 00 +1 CM © OO 00 o oo" UD 4-1 o ci p- -p MO ©" *p 44 O· CD cm’ CD CM -P ud" ΓΗ CM OO O CM © -fy 00 © 44 00 Py CD © © co ©" © 4-1 UD CM, OO oo CD r— P7 4-1 CM ©, Cl" CD ΓΜ CD 0 pp 4-1 UD © ci P- 09 -fy ©" UD 4-1 09 cy UD
UD 1 •C u s Q Os -4 © 00 +1 UD P> ci Os C· cy © UD 4-1 UD CM OO p- pcm" UD 4-1 UD OO so" CD OO CD © t— 4-1 o Γ-’ o CM © c— P7 4-1 rUD oo" © 09 © 4-1 0O ci‘ © CD UD ci r4-1 t—· -y Γ-" CD CM © Pp 4-1 CD UD Γ— r» CD © © 41 UD ©. "D UD
so •fi υ 'R Q cd © O os +1 CD C-" Os © CM SD +1 CM Ογ c*-T 00 © OO UD +1 p00 CM yp UD CM Γ-" r4-1 UD xp CM -fy ci r— 4-1 UD 00 p © CM © -P cm" SO 4! P— CD ©" © r© ci P+1 CM © ©" -P CM © Γ-y ci pp +1 CD OO UD OO © ©. ci © Ή P©, cs" ©
Γ— •c o 'N O Os V? Os Ή 00 cd ci o CM o SD ud" © 4-1 CD DD cM © © oo„ tt UD 4-1 UD CM o" vr O Co" 00 4-1 UD PT CM CM © °y -p" r4-1 UD uy -*" CM -P c— UD © •H UD SO OO o CM ud UD r-" P·' 4Ί UD © ©" UD CM -P c— CD pr -H Γ— CD -r © oo ©" © -I-I CM UD Γ-
Dawka (mg/kg) © O © O Tp o © © © O CM CD 1 CM cm" oo. oo" UD CD •
Podawanie doustnie Próbka 1 (Sok) ^4 O CO JO X) ‘S A Z? •O oo π) 44 •O -O A O CO ca JD © £ Ό d f •0 fi 0 0 £ β o 2 < a d ?d 00 N Ξ 0 Próbka 2(suszony rozpyłowo sok) Próbka 2 (suszony rozpyłowo sok) próbka 2(suszony rozpyłowo sok) Elga Option woda oczyszczona (kontrola)
Grupa ___1 O CM O CD O Pp O UD O © © P© 00 o © o
PL 197 783 Β1
Średnia masa ciała (g) & odchylenie standardowe X -c 'R 00 SD cm" pΉ cn 00 P- © CM^ P-" c/S -H P^_ c- s© o od en +1 pcc" CM cn p^ vd SC +1 00 SC t/d OO Os P^ x" sn +1 1/Ί P- © en ΜΊ +1 oo s©' oC 00 V) cm" X +1 © CM CM 164,22+37,18 © rC< +1 ΜΊ oo^ P-" ΟΊ
tn SG N Q o\ Os cd r-H ΜΊ σ\ p>" r- p* τζ P-" +l cn Ch Os" X CM CM os en +1 © o~ oo CM 1/Ί rapd SD +1 1/Ί o SD OO m c oo un +1 ΜΊ 00 cm" P· X X sd 1/Ί +1 ΜΊ P*^ Os 00 OO m cm" X -H CM oo^ s· CM CM Os Χ^ P-" en +1 © m -’Τ X Cs cd n- 4-1 CM OO ud un
nj*G OJ 'n © CM x" P+l ΓΊ un ud p- © Γ-γ P-" +1 tCr vs x X 0s os" m +1 © P-; x" CM Cs cm SD SC +i pun SC oo 00 o X +1 ΡΊ Ργ raT p Os CM ΜΊ ΜΊ -H V» P; 1/Ί OO X ιζγ cd X +1 CM 00 cm" CM CM en °y x" cn -H CM tn cm" X pηγ ©" ΜΊ -H 00 ΜΊ' cm" ι/Ί
s 'R Q -śi· νγ r~-r r-> -H OO ^r td p- Os Sfi> P-" Vł +1 CM CM X X SC en "M" +1 © CM CM Os" SC +1 tn O Cs" 00 cn P raf +i cn ΜΊ P P so V? tn +1 CM X. 'sd 00 OO OO cd X +1 © oo CM CM X cn x" cn +1 un p-y CM X tn © cm ST) -H © Γ-γ Cs sT
cM § *N Q vn © cd r+l CM p^ ud p- C" en oo’' t/Ί -H 1/Ί TT kD O CM ed *T +1 m tn pd CM O ΓΜ O +1 O r-l. CM Os © ud s© +1 p Os OO Cs P*" »ZS +1 00 00 en X X X +J r© CM CM oo SC m -H O sn cm" X P"X^ CM ΟΊ -H © od
X 'O ’n Q CM 00 00 Ή CO oo m" P' CM ΟΊ CO ΜΊ +! oo tn Tp" X rr ps·" tfr +1 © oś CM SC © cd P-H 00 m x" σ· 00 "T •Χ X +1 cn © p" 00 Cs oo" ΜΊ +1 CM ι/γ 00 CM © oo X +1 ΜΊ V) CM CM cn ©, od cn -I-I CM *ςΓ M*" X ΓP^ en un -t-l un un x"
o ‘G tu 'R m cn_ m 00 -H [-" 00 en oo cn p© X +1 VI cn P- © X ra- Ή 00 en τΓ ΠΊ SC ud p+1 o X Os Os X 'T. p" X +1 P CS ra*" Cs ΜΊ ©" X Ή © CP 00 CM cn Cs" X +1 oo CM o" m CM © oo" m +1 © Os" X V) vd un +1 CM O V)
Dawka (mg/kg) O O O © -3- O © SD O o CS cn 1 cm" oo od VT cn
Podawanie doustnie 2? O Zł ra 24 X Ό u Pi o Zł ra X) Ό t-i P- 24^ O Z ra 24 X Ό LCu o Zł ra 24 X X ί dd "3 u C O ra = c c 2 B> Cl o ° £ ω £ o -2 fr 2 X G 8 O) 3 en CM ra 24 X Z-K •O 24 & s 0 Z _o & S >> G O N en 3 cn CM ra 24 X S' £ 8 o £ lid O. IM O >, G s [Λ 3 cn CM X 24 d- o Cu cn 'ra' 2 G O 24 ra G 8 2 © N ra ή _op o ω £
ca O. g 22 O CM O ΓΊ O raf* O ŁT) O X o Po oo © o
PL 197 783 Β1 co
Ω _ra φ
_Q ,rc
Średnia masa ciała/grupę/tydzień (ciąg dalszy) Średnia masa ciała (g) & odchylenie standardowe Dzień 13 Uh 6© σΓ un +1 rh TlCC Ch CS rΟγ uh +1 O CS* u© Ch CS Uh σΓ Tt +1 O oo* CS* Th rUh Uh +1 rh σγ r»* Oh Oh Tt 00* Uh +1 O OO* r>* k© 198,60+30,18 OO Uh rh CS -rl rh r-* O* cc 00 Uh rh CS +1 Uh* 00* IS 207,13± 18,22
Dzień 12 i 239,07+60,24 uh rh oo* +1 rh ©h Tt ΠΊ es .... O Uh +1 O rh rh oo o Uh +1 rh O* Tt- O> t·-. <s* Uh -HI O Tt rh* O Tt O* Oh* CS +1 Γ" O\ k© Oh 185,10+24,60 o rUh* CS +1 o Oh* uh k© OO* +1 rh Oh Tt O CS
Dzień 11 236,33+62,31 229,43 ±16,97 rh O* rh uh +1 o rh 00 rh 194,73+52,78 160,80±57,67 194,73±29,68 rh uh* CS -I-I rh O rl 00 171,67+24,42 199,83+20,21
Dzień 10 234,07+62,09 rh O Tt +1 O t--* CS <s 134,53+54,96 L uh uh* uh +1 o r-* 00* ©h 158,87+57,76 192,60+29,09 Tt O* uh' CS +1 ΓkD O* 00 168,43+22,66 198,07+21,02
Dzień 9 236,73+62,39 cc Tt +1 rh r** rCS 135,23+455,74 198,90+57,48 CS kO 00* Uh +1 ooo rUh 190,27±29,54 178,17+23,79 00 o* rh CS -HI rh k© UD* hO k© 00* CS -HI 00 UD* Oh
Dzień 8 234,73+62,44 225,63+13,05 Γ" uh* Uh +1 O 00 rh rh 199,63+61,07 172,98+52,06 OO Γ-γ Γ"* CS +1 ΓCS* o* Oh 177,27+24,48 164,90+22,54 193,73+22,37
Dzień 7 *?t kD es* f-H 00 rh* Uh 00 Tt CS* 00 uh +f rh OO* 0© I-' 0Φ o_ r-* rh -HI CS CS* CS* rh 188,57+66,14 .....J 173,97+54,29 196,00+53,09 Oh Ό -HI O th rh rs 167,48+36,75 165,50+49,27
Dawka (mg/kg) 100 400 i 1600 3200 • cS CS* oo* 00* Uh rh
Podawanie doustnie Próbka i (Sok) (GHA I 35A) Próbka 1 (Sok) (GHA I 3 5A) Próbka 1 (Sok) (GHAI35A) Próbka 1 (Sok) (GHA 9 3 5A) Elga Option 4 woda oczyszczona (kontrola) Próbka 2 (Suszony rozpyłowo sok) (GHA I 59) Próbka 2 (Suszony rozpyłowo sok) (GHA I 59) Suszony rozpyłowo sok (GHA I 59) Elga Option 4 woda oczyszczona (kontrola)
Grupa O 02 03 04 05 90 07 80 60
PL 197 783 B1
T a b e l a 1:
Histologiczna ocena sekcji wątroby szczurów (samce) Próbka 1
Grupa 1: 100 mg/kg Próbka 1 Grupa 2: 400 mg/kg Próbka 1
Zwierzę nr Zmiany w wątrobie Zwierzę nr Zmiany w wątrobie
Dzień 7 01 NPL 07 FHS1 +
02 NPL 08 NPLC1+
03 NPL C1 + 09 NPL
Dzień 13 04 NPL MLC Dzień 13 10 DHS1 +
05 FHS1 + 11 NPL
06 NPL 12 DHS1 +
Grupa 3: 1600 mg/kg Próbka 1 Grupa 4: 3200 mg/kg Próbka 1
Zwierzę nr Zmiany w wątrobie Zwierzę nr Zmiany w wątrobie
Dzień 7 13 NPL 19 NPL
14 NPL 20 NPL
15 NPL 21 NPL
Dzień 13 16 NPL Dzień 13 22 DHS1 +
17 DHS1 + 23 FHS1 +
18 NPL 24 NPL
Grupa 5: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona; ograniczone przyjmowanie pokarmu L e g e n d a :
Grupa 5: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona
Zwierzę nr Zmiany w wątrobie
Dzień 7 25 NPL MLC
26 NPL
27 NPL
Dzień 13 28 DHS1 +
29 DHS1 +
30 NPL
C = przekrwienie
DHS = rozsiane puchlinowe pęcznienie komórek FHS = ogniskowe puchlinowe pęcznienie komórek NPL = brak zmian miąższowych
MLC = min obrost limfocytowy
1+ = łagodne
2+ = łagodne
3+ = łagodne
T a b e l a 2:
Histologiczna ocena sekcji wątroby szczurów (samce) Próbka 2
Grupa 6: 2,2 mg/kg Próbka 2 Grupa 7: 8,8 mg/kg Próbka 2
Zwierzę nr Zmiany w wątrobie Zwierzę nr Zmiany w wątrobie
1 2 3 4 5 6
Dzień 7 31 NPL 37 NPL
32 NPL MLC 38 NPL
PL 197 783 B1 cd. tabeli 2
1 2 3 4 5 6
33 FHS1 + 39 NPL C1 +
Dzień 13 34 NPL Dzień 13 40 DHS1 +
35 DHS1 + 41 NPL
36 NPL 42 MLC DHS1 +
Grupa 8:35 mg/kg Próbka 2
Zwierzę nr Zmiany w wątrobie
Dzień 7 43 NPL
44 NPL
45 NPL
Dzień 13 46 NPL
47 NPL C1 +
48 MLC FHS1 +
Grupa 9: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona
L e g e n d a :
Grupa 9: Kontrola: Elga option 4, woda oczyszczona
Zwierzę nr Zmiany w wątrobie
Dzień 7 49 NPL
50 NPL
51 FHS1 +
Dzień 13 52 DHS1 +
53 NPL
54 FHS1 +
C = przekrwienie
DHS = rozsiane puchlinowe pęcznienie komórek
FHS = ogniskowe puchlinowe pęcznienie komórek
NPL = brak zmian miąższowych
MLC = min obrost limfocytowy
1+ = łagodne
2+ = średnie
3+ = ciężkie
Nie odnotowano żadnych konkretnych zmian we fragmentach wątrób u poddanych doświadczeniu szczurów, które otrzymały zamrożony sok jak również suszony rozpyłowo sok, które można byłoby przypisać podawaniu doustnemu wyżej wymienionych substancji chemicznych. Puchlinowe obrzmienie komórek zauważone zarówno w przypadku próby kontrolnej jak i u szczurów poddanych doświadczeniu może wskazywać na normalne metaboliczne obrzmienie komórek i zmiany na skutek niedotlenienia. Minimalne ogniska obrostu limfocytowego okołonaczyniowe wykryto u niektórych zwierząt i stanowią najprawdopodobniej przypadkowe spostrzeżenie. U kilku szczurów w zatokach wątrobowych nastąpiły przekrwienia o łagodnym stopniu i należy je traktować jako przypadkowe spostrzeżenie.
Istotną cechą tego wynalazku, którą obrazują wyniki tego badania jest to, że w czasie badania nie rozwinęła się żadna tolerancja na żadną z próbek. Może to stanowić znaczącą korzyść, zwłaszcza w związku z leczeniem otyłości.
PL 197 783 B1
Chociaż wcześniej opisano związki i środki według wynalazku w powiązaniu z ich właściwościami jako środków hamujących łaknienie, to należy zauważyć że określenie „środek hamujący łaknienie" - stosuje się w niniejszym opisie w celu wskazania czynności zmierzającej do ograniczenia łaknienia i/lub zwiększenia uczucia nasycenia, zatem w celu zmniejszenia całkowitej kaloryczności przyjmowanego pożywienia; co z kolei przeciwdziała otyłości. Zatem niniejszy wynalazek umożliwia leczenie, zapobieganie lub zwalczanie otyłości u człowieka lub zwierzęcia przez podawanie temu człowiekowi lub zwierzęciu leczącej, zapobiegającej lub zwalczającej otyłość ilości związku o wzorze (1) albo środka lub ekstraktu zawierającego związek o wzorze (1).
Stosowane w niniejszym opisie określenie „zwierzę" obejmuje, lecz nie ogranicza się do zwierząt towarzyszących, np. zwierząt domowych i zwierząt oswojonych; bez ograniczenia się do tych przykładów obejmuje bydło, owce, fretki, świnie, wielbłądy, konie, drób, ryby, króliki, kozy, psy i koty.
Środek anorektyczny lub do leczenia otyłości lub jej zapobiegania u człowieka, związek o wzorze (1), lub środek według wynalazku korzystnie podaje się takiemu człowiekowi w dawce w ilości od około 0,01 mg/kg/dzień do około 10 mg/kg/dzień. Korzystny zakres dawek wynosi 0,05 mg/kg/dzień do 0,5 mg/kg/dzień. W przypadku użycia ekstraktu w postaci suszonego rozpyłowo proszku korzystny zakres dawek wynosi od 0,1 mg/kg/dzień do 20 mg/kg/dzień; a zwłaszcza wynosi od 0,5 mg/kg/dzień do 5 mg/kg/dzień.

Claims (27)

  1. Zastrzeżenia patentowe
  2. 2. Związek wedługzastrz. 1 do stosowaniado hamowania łaknienia I ub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia lub do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości u człowieka lub zwierzęcia.
  3. 3. Związek według zastrz. 2 do stosowania do hamowania łaknienia u człowieka lub zwierzęcia.
  4. 4. Związek według zastrz. 2 do stosowania do zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia.
  5. 5. Związek według zas^z. 2 do ssosowania do I eczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości u człowieka lub zwierzęcia.
  6. 6. Środek o czynności hamowania łaknienia lub zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia lub do leczenia, zapobiegania lub zwalczania otyłości u człowieka lub zwierzęcia, znamienny tym, że zawiera skuteczną do hamowania łaknienia ilość związku o wzorze (1) zdefiniowanego w zastrz. 1.
  7. 7. Środek według zastrz. 6 do stosowania do hamowania łaknienia u człowieka lub zwierzęcia.
  8. 8. Środek według zastrz. 6 do stosowania do zmniejszania całkowitego spożycia kalorii u człowieka lub zwierzęcia.
  9. 9. Środek według 6 do stosowania do leczenia, zapobiegania lub zwalczania Goy^ści u człowieka lub zwierzęcia.
  10. 10. Środekwedługzastrz. 6 albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, że 1 ess zmieszanyz farmaceutyczną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.
  11. 11. Środek według zas^z. 6 albo 7, albo 8, albo 9, albo 10, znamienny tym, że 1 ess sfoomułowany w jednostkową postać dawkowaną.
    PL 197 783 B1
  12. 12. Środekwedług zastrz.6 albo7, albo 8, albo 9, znamiennytym. że stanowi produktżywnościowy IkO onpój.
  13. 13. Prodektżeweoóśiowe luk) 8onPó znamienay tym, że zawieraskutekcaode hamowesiałaSt oikoin ilość awiąaUk o waorak (1) aUdfioiowsodgo w anstra. 1.
  14. 14. Zastodkwesie zwiąąau zaefiniowanodo w zantto. 1 w i loośi skuteccaoj do hamowesia łakoikoin Uo wytwsrasnis IdUk Uo lkcaknis, aspoOikosnis ikO awslcasnis otyłości.
  15. 15. NiejefonPktyycnoskPdkó 8amowesiałaSuiekia i uk zmoiejskasiaccłkuwiteko skP0eyia 8ulorii k całowikUn IkO awikraęcin, naaminaay tym, żk poUnjk kię całowikUowi IkO awidraęcik kUktdcaoą Uo asmownoin łsUoikois ilość awiąaUk o waorak (1) aUkfiniownnkoo w anktra. 1.
  16. 16. NiejefonPutyycnoskPdkó hamowesiałaSuienia l uk zmoiejskasiaccSłu>witeko ερηόζΐίθ 8ulorii k całowikUn IkO awikraęcin, naaminaay tym, żk poUnjk kię całowikUowi IkO awidraęcik śroUkU aawikrający kUktdcaoą Uo asmownoin łsUoikois iIość awiąaUk o waorak (1) aUk1ϊniownnkoo w anktra. 1.
  17. 17. Niejefapeuteccno sf^r^i^ć^t) wekUjk zasten. 16, znamienna tym, że śroclek skanowi produkt żywoościowy IkO onpój.
  18. 18. EUstrakt roślInny z roślIny rodzaju TricOiccaulon lub rodzaju zaamienny tym, żk anwikrn kUktdcaoą Uo asmownoin łsUoi6ois iIość awiąaUk o waorak (1) aUkfiniownnkoo w anktra. 1.
  19. 19. ΕΚ^πΜ wekług zasteo. 81, pnamienaa tym, żż ρηόΐίηθ poduaju Trichocaulon j esk wwyrnsa a grkpy oOkjmująckj ontkokU TrihOcauulcn piliferum i TriaOcauulcn cffiainule, n rośIion roUanjk Hccdiu jkkt wyOrnon a grkpy oOkjmkjąckj ontkakU Hccdiu aurrcrii, Hccdiu gcrdcnii i Hccdiu lugurdii.
  20. 20. EkuteoSt wekUjk zasteo. 11, znamienaa tym, że PC3^Hr^^ p webrosa z grripp oC^^jj^utć^cϊ^j gntkakU Hccdiu aurrcrii, Hccdiu gcrdcnii i Hccdiu lugurdii.
  21. 21. EkuteoSt wekług pasteo. 81 plbO 81, albO 82, pnamienaa tym, 8ż j jidk paskanicco Wilno Pd wkayktUica aikaUtywayca aaaikcaykacakń.
  22. 22. Ekuteakt wedłuk zaater. 18 albo 19, albO 20, albo 21, znamienny tym, że łest w ρο^8θϊ kypUikgo prokaUk.
  23. 23. EkutroStwekługzastrz.16albo 11, albO22, albO 21,albo22 dustodkweaiaj jSU I edo ccanoości aamdwaaia łaUaikaia.
  24. 24. EkuteoSt wekług zasteo. 11 albO 11, albO 22, albO 22, albO 22 do stedkwesia do 8 θ^ο!^, aapdOikgaaia IkO awalcaaaia otyłości.
  25. 25. ŚrodoSo ccanaadci hamowesiałaSuiesia,znamienaa tym, żż zawiera pSutroSt zaofiniowej oy w aaktra. 18 aIOo W, aIOo 20, aIOo 21, aIOo 22.
  26. 26. Środek w^f^łL^g zasteo. 25, zr^ć^r^i^r^r^^ tym, żż j cjsć zminskasa z 8i^rr^^c^^zaróóOą, rdacikńcaaIaiUikm IkO adśaiUikm.
  27. 27. Śrr^O^^^ wekług zasteo. 22 albO 22, znamiema tym, żż 8 sćo-mutowesa w 8 ekrιadte->wą poktać OawUdwaaą.
    PL 197 783 Β1
    Rysunki
    Materiał roślinny (Trichocaulon Spp łub Hoodia Spp) Ekstrakcja mieszaniną CH2Cl2/MeOH
    Rozdzielanie
    Oddzielony roślinny materiał Mieszanina rozpuszczalnik /ekstrakt
    Suszenie na powietrzu
    Wysuszony'materiał roślinny Usunięcie rozpuszczalnika
    Surowy ekstrakt i
    Ekstrakcja CH2CI2/H2O j Rozdzielanie
    Ekstrakt w CH2CI2 Ekstrakt w wodzie
    UsunięcieLozpuszczalnika Usunięcie rozpuszczalnika
    Pozostałość poekstrakcyjna
    Otrzymany suchy ekstrakt Ekstrakcja mieszaniną MeOH/heksan
    Rozdzielanie
    MejDH
    Usunięcie rozpuszczalnika
    Częściowo oczyszczony czynny ekstrakt
    Heksan
    Usunięcie rozpuszczalnika
    Pozostałość poekstrakcyjna
    FIG. I
    PL 197 783 Β1
    FIG 2
    PL 197 783 Β1
    PL 197 783 Β1
    PL 197 783 Β1
    Bfep Aseui eueiuiz %
    PL 197 783 B1 % zmiana masy ciała od dnia - 0 do dnia 7 ω
    ω
    Ll pjep Aselu eueiuiz %
    Departament Wydawnictw UP RP
    Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.
PL374521A 1997-04-15 1998-04-15 Glikozyd steroidowy, środek o czynności hamowania łaknienia, produkt żywnościowy lub napój, zastosowanie glikozydu steroidowego, nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia oraz ekstrakt roślinny PL197783B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ZA973201 1997-04-15
PCT/GB1998/001100 WO1998046243A2 (en) 1997-04-15 1998-04-15 Pharmaceutical compositions having appetite suppressant activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL197783B1 true PL197783B1 (pl) 2008-04-30

Family

ID=25586362

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL380957A PL201487B1 (pl) 1997-04-15 1998-04-15 Sposób wytwarzania ekstraktu roślinnego, ekstrakt roślinny, środek o czynności hamowania łaknienia i zastosowanie ekstraktu roślinnego
PL374521A PL197783B1 (pl) 1997-04-15 1998-04-15 Glikozyd steroidowy, środek o czynności hamowania łaknienia, produkt żywnościowy lub napój, zastosowanie glikozydu steroidowego, nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia oraz ekstrakt roślinny
PL98336498A PL196015B1 (pl) 1997-04-15 1998-04-15 Zastosowanie ekstraktu roślinnego i nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL380957A PL201487B1 (pl) 1997-04-15 1998-04-15 Sposób wytwarzania ekstraktu roślinnego, ekstrakt roślinny, środek o czynności hamowania łaknienia i zastosowanie ekstraktu roślinnego

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL98336498A PL196015B1 (pl) 1997-04-15 1998-04-15 Zastosowanie ekstraktu roślinnego i nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia

Country Status (40)

Country Link
US (6) US6376657B1 (pl)
EP (5) EP1598054B1 (pl)
JP (3) JP3553086B2 (pl)
KR (2) KR100510614B1 (pl)
CN (3) CN101239089A (pl)
AP (3) AP2003002730A0 (pl)
AT (3) ATE344046T1 (pl)
AU (1) AU746414B2 (pl)
BG (1) BG103795A (pl)
BR (1) BR9808593A (pl)
CA (2) CA2584411A1 (pl)
DE (3) DE69836321T2 (pl)
DK (1) DK0973534T3 (pl)
EA (2) EA200200392A1 (pl)
EE (1) EE9900497A (pl)
ES (3) ES2276460T3 (pl)
GB (3) GB2360519B (pl)
GE (2) GEP20022709B (pl)
GT (3) GT199800076A (pl)
HK (1) HK1026373A1 (pl)
HU (1) HUP0000838A3 (pl)
ID (1) ID22888A (pl)
IL (3) IL158466A0 (pl)
IS (1) IS5196A (pl)
MY (1) MY141674A (pl)
NO (1) NO994992L (pl)
NZ (5) NZ525022A (pl)
OA (1) OA11166A (pl)
PE (1) PE85699A1 (pl)
PL (3) PL201487B1 (pl)
PT (2) PT1213020E (pl)
SA (1) SA98190501B1 (pl)
SG (1) SG120054A1 (pl)
SK (1) SK141899A3 (pl)
TR (2) TR199902540T2 (pl)
TW (3) TW539551B (pl)
UA (1) UA72439C2 (pl)
WO (1) WO1998046243A2 (pl)
YU (1) YU52199A (pl)
ZA (1) ZA983170B (pl)

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998046243A2 (en) * 1997-04-15 1998-10-22 Csir Pharmaceutical compositions having appetite suppressant activity
BR0012984A (pt) * 1999-08-04 2002-07-16 Millennium Pharm Inc Método para tratar um estado associado com o mc4-r em um mamìfero, composto de ligação ao mc4-r, e, composição farmacêutica
GB2355657B (en) * 1999-10-27 2004-07-28 Phytopharm Plc Inhibitors Of Gastric Acid Secretion
GB2363985B (en) * 2000-06-30 2004-09-29 Phytopharm Plc Extracts,compounds & pharmaceutical compositions having anti-diabetic activity and their use
KR20040015670A (ko) * 2001-01-24 2004-02-19 트리콘 호울딩즈 리미티드 탄탈륨 필름 침착방법
US7008648B2 (en) 2001-11-16 2006-03-07 Novartis Nutrition Ag Plant derived or derivable material with appetite suppressing activity
US20040265398A1 (en) * 2002-04-25 2004-12-30 Fleischner Albert M. Herbal composition for weight control
TW200505461A (en) * 2003-02-14 2005-02-16 Phytopharm Plc Moldulation of ATP production or content in the hypothalamus
US7060308B2 (en) * 2003-06-04 2006-06-13 Ramaswamy Rajendran Caralluma extract products and processes for making the same
US7976880B2 (en) * 2003-06-04 2011-07-12 Ramaswamy Rajendran Pregnane glycoside compositions and Caralluma extract products and uses thereof
US7265101B2 (en) * 2004-04-07 2007-09-04 Rutgers, The State University Of New Jersey Appetite-suppressing compositions and methods
GB0411703D0 (en) * 2004-05-25 2004-06-30 Phytopharm Plc Selective separation or extraction of steroidal glycosides
US20050276839A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-15 Rifkin Calman H Appetite satiation and hydration beverage
US20050276869A1 (en) * 2004-06-14 2005-12-15 Century Systems Appetite-suppressing, lipase-inhibiting herbal composition
US7500679B2 (en) * 2004-10-08 2009-03-10 Wade James T Board for supporting front of snow vehicle
US20060083795A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-20 Lima Shatkina Meal replacement products having appetite suppressing qualities
GB0425172D0 (en) * 2004-11-15 2004-12-15 Phyto Res Ltd Plant cells and uses thereof
CA2596311A1 (en) * 2005-01-20 2006-07-27 Stephen Holt Herbal compositions containing hoodia
AU2006279602B2 (en) * 2005-08-17 2009-06-04 Elc Management Llc Delivery system for appetite suppressant
US20070082085A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Catani Steven J Compositions and methods for reducing food intake and controlling weight
US20070082029A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William R Fiber satiety compositions
US20070082108A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William R Jr Methods for reducing calorie intake
US20070082115A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William Ronald Jr Methods for inducing satiety, reducing food intake and reducing weight
US20070082025A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Catani Steven J Methods for achieving and maintaining weight loss
US20070082028A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William R Jr Compositions and methods for inducing satiety and reducing caloric intake
US20070082114A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Catani Steven J Methods for reducing weight
US20070082026A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William R Jr Compositions and methods for reducing food intake and controlling weight
US20070082084A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Catani Steven J Methods for weight management
US20070082030A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Aimutis William R Fiber satiety compositions
US20070104805A1 (en) * 2005-11-01 2007-05-10 Udell Ronald G Compositions of Hoodia Gordonii and Pinolenic Acid Derivatives
US8945652B2 (en) * 2005-11-23 2015-02-03 The Coca-Cola Company High-potency sweetener for weight management and compositions sweetened therewith
US20070207227A1 (en) * 2006-02-23 2007-09-06 Conopco, Inc., D/B/A Unilever, A Corporation Of New York Appetite suppressant compositions
US20070196436A1 (en) * 2006-02-23 2007-08-23 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Process for preparing an edible composition comprising steroidal glycosides
RU2009100892A (ru) * 2006-06-13 2010-07-20 Юнилевер Н.В. (Nl) Порционные композиции для подавления аппетита со стероидными гликозидами
JP5281234B2 (ja) * 2006-06-27 2013-09-04 ポーラ化成工業株式会社 毛様体過緊張による疲れ目の改善・予防のための経口投与組成物
MX2009001571A (es) 2006-08-17 2009-02-19 Unilever Nv Proceso para la produccion de la planta de hoodia que contiene glucosidos esteroides.
CA2661593A1 (en) * 2006-08-24 2008-02-28 Unilever Plc Process for preparing a composition comprising steroidal glycosides
US20080085354A1 (en) * 2006-10-06 2008-04-10 Teresa Marie Paeschke Controlled hydration of hydrocolloids
US20080138447A1 (en) * 2006-12-06 2008-06-12 Erin John Riggins Method for administering appetite suppressant and composition thereof
WO2008074656A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Unilever N.V. Process for harvesting plants of the apocynaceae family
US20080188447A1 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Svyatoslav Komarnytsky Glucocorticoid-lowering composition
US8580236B2 (en) * 2007-03-19 2013-11-12 Richard P. De Maria Hair sustaining formulation
EP2052727A3 (en) * 2007-10-02 2010-06-02 Unilever N.V. Hoodia extract oil compositions comprising unsaturated monoacylglycerides
US20100316736A1 (en) * 2007-10-24 2010-12-16 Desert Labs Agriculture Cooperative Association Ltd. Appetite suppressant
US20090110774A1 (en) * 2007-10-26 2009-04-30 The Hershey Company High antioxidant levels in cocoa-based beverages
ATE502620T1 (de) 2007-11-17 2011-04-15 Cognis Ip Man Gmbh Verfahren zur herstellung von wirkstoffkonzentraten
EP2080517A1 (en) * 2008-01-18 2009-07-22 Unilever N.V. Process for obtaining dried plant material
US20090324757A1 (en) * 2008-03-31 2009-12-31 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and Methods for Modulating Visceral Sensation and/or Gastrointestinal Reflex Activity
JP5276885B2 (ja) * 2008-04-11 2013-08-28 株式会社耐熱性酵素研究所 キチン又はキトサンを含む分解性複合材料
US20090263510A1 (en) 2008-04-21 2009-10-22 Conopco, Inc., D/B/A Unilever Process of making Hoodia plant extract with improved flavor
US7923435B2 (en) * 2008-04-21 2011-04-12 Phytopharm Plc Hoodia plant extract with improved flavor
AU2009325842A1 (en) 2008-12-08 2011-07-14 Bio-Mass Ltd. Method of treatment of diseases using Hoodia extracts
US20110003021A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Jason Christian Grovenor Halford Composition and method for reducing food intake
EP2329836A1 (en) 2009-12-03 2011-06-08 I.R.B. Istituto Di Ricerche Biotecnologiche S.r.l. Extracts obtained from hoodia gordonii cells lines, their preparation and use
CA2827050A1 (en) * 2010-02-18 2011-08-25 The Hershey Company Cocoa-based exercise recovery beverages
WO2012022880A2 (fr) 2010-07-29 2012-02-23 Universite De Strasbourg Procede de synthese de steroïdes
CN102462690B (zh) * 2010-11-11 2013-04-17 中国科学院上海药物研究所 3，8，12，14，17，20位氧取***甾烯糖苷类化合物在制备抑制食欲的药物中的用途
CA2923351C (en) 2010-12-20 2019-01-22 Hill's Pet Nutrition, Inc. Pet food compositions for inducing a satiety response
HUE051738T2 (hu) 2011-01-07 2021-03-29 Anji Pharma Us Llc Kemoszenzoros receptorligandum-alapú terápiák
WO2013103384A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Elcelyx Therapeutics, Inc. Biguanide compositions and methods of treating metabolic disorders
US9795792B2 (en) 2011-02-25 2017-10-24 Medtronic, Inc. Emergency mode switching for non-pacing modes
BR112014016810A8 (pt) 2012-01-06 2017-07-04 Elcelyx Therapeutics Inc composições e métodos para tratamento de distúrbios metabólicos
US9456916B2 (en) 2013-03-12 2016-10-04 Medibotics Llc Device for selectively reducing absorption of unhealthy food
AR091739A1 (es) 2012-07-11 2015-02-25 Elcelyx Therapeutics Inc Composiciones y metodos para reducir el riesgo cardiometabolico
US20140193498A1 (en) 2013-01-05 2014-07-10 Elcelyx Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for Treating Metabolic Disorders
US9067070B2 (en) 2013-03-12 2015-06-30 Medibotics Llc Dysgeusia-inducing neurostimulation for modifying consumption of a selected nutrient type
US9011365B2 (en) 2013-03-12 2015-04-21 Medibotics Llc Adjustable gastrointestinal bifurcation (AGB) for reduced absorption of unhealthy food
US20160176914A1 (en) * 2013-05-29 2016-06-23 Northeastern University Glycosylated cardiotonic steroids
CN103755762B (zh) * 2014-01-30 2016-06-01 中国科学院上海有机化学研究所 果同尼皂苷f及其衍生物的中间体、制备方法和用途及果同尼皂苷f衍生物
GB2544416B (en) * 2015-11-13 2017-11-01 Lykke Res Ltd A method for producing a medium containing steroidal glycosides from plant cells of the genus Hoodia

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4062950A (en) * 1973-09-22 1977-12-13 Bayer Aktiengesellschaft Amino sugar derivatives
FR2348655A1 (fr) 1976-04-20 1977-11-18 Sopharga Lab Nouvelle substance alimentaire ou dietetique ayant une structure alveolaire et son procede de preparation
US4185116A (en) 1976-09-28 1980-01-22 Pfizer Inc. L- and DL- Phenylglycines to treat diseases or conditions attributable to reduced carbohydrate metabolism
USPP4199P (en) 1977-01-18 1978-01-24 B. L. Cobia, Inc. Milkweed plant family
DE2719912C3 (de) * 1977-05-04 1979-12-06 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur Isolierung von 0- |4,6-Dideoxy-4- [JJl S-O,4,6/5)-4,5,6-trihydroxy-3-hydroxymethyl-2cyclohexen-1-yl] -amino] - a -D-glucopyranosyl} -(I Pfeil nach rechts 4)-0- a D-glucopyranosyl-(l Pfeil nach rechts 4)-D-glucopyranose aus Kulturbrühen
US4130714A (en) * 1977-05-23 1978-12-19 Pfizer Inc. Hydantoin therapeutic agents
NO154918C (no) * 1977-08-27 1987-01-14 Bayer Ag Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk aktive derivater av 3,4,5-trihydroksypiperidin.
JPS5953920B2 (ja) * 1977-12-28 1984-12-27 東洋醸造株式会社 新規なアミノ糖化合物およびその製法
IE47592B1 (en) * 1977-12-29 1984-05-02 Ici Ltd Enzyme inhibitory phthalazin-4-ylacetic acid derivatives, pharmaceutical compositions thereof,and process for their manufacture
US4273763A (en) 1978-01-23 1981-06-16 Efamol Limited Pharmaceutical and dietary compositions
JPS5745185A (en) * 1980-07-21 1982-03-13 Eisai Co Ltd Hydantoin derivative and its preparation
JPS5740478A (en) * 1980-08-22 1982-03-06 Ono Pharmaceut Co Ltd Rhodanine derivative, its preparation and aldose reductase inhibitor containing rhodanine derivative
US4791126A (en) * 1980-08-22 1988-12-13 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Rhodanine derivatives, process for their preparation, and aldose reductase inhibitor containing the rhodanine derivatives as active ingredients
EP0056194B1 (en) * 1981-01-05 1984-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. N-substituted pseudo-aminosugars, their production and use
CA1176269A (en) * 1981-03-02 1984-10-16 Kazimir Sestanj N-naphthoylglycine derivatives
US4377500A (en) 1981-07-08 1983-03-22 The Standard Oil Co. Catalysts
US4436745A (en) * 1982-04-15 1984-03-13 Alcon Laboratories, Inc. Method of inhibiting aldose reductase activity
US4438272A (en) * 1982-04-15 1984-03-20 Alcon Laboratories, Inc. Spiro-(fluoren-9,4'-imidazolidine)-2',5'-diones
JPS58194818A (ja) 1982-05-10 1983-11-12 Iwasaki Shuzo サボテン中の水溶性多糖及び繊維の取得方法
ES524614A0 (es) 1982-08-12 1984-05-01 Nativelle Sa Ets Procedimiento de preparacion de nuevos amino-14 esteroides.
AU570439B2 (en) 1983-03-28 1988-03-17 Compression Labs, Inc. A combined intraframe and interframe transform coding system
HU201675B (en) 1983-08-26 1990-12-28 Ivan Balkanyi Process for producing oral pharmaceutical compositions with unappetizing effect
US5066659A (en) * 1984-10-30 1991-11-19 Pfizer Inc. Spiro-heteroazalones for treatment of diabetic complications
US4634765A (en) * 1984-12-18 1987-01-06 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Homodisaccharide hypoglycemic agents
US5246960A (en) 1984-12-21 1993-09-21 Hoffmann-La Roche Inc. Oxetanones
CA1270837A (en) 1984-12-21 1990-06-26 Hoffmann-La Roche Limited Oxetanones
IT1207504B (it) 1985-09-26 1989-05-25 Crinos Industria Farmaco Composizione moderatrice dell'appetito ed antigastrica.
IT1190400B (it) 1985-10-04 1988-02-16 Istituto Biochimico Italiano Derivati dell'acido 19,20-bis,nor-prostanoico ad attivita' antiulcera e anoressivca,procedimento per la loro preparazione e composizioni farmaceutiche
GB8524663D0 (en) * 1985-10-07 1985-11-13 Fujisawa Pharmaceutical Co Quinazoline derivatives
US4939140A (en) * 1985-11-07 1990-07-03 Pfizer Inc. Heterocyclic oxophthalazinyl acetic acids
US4757151A (en) 1985-11-14 1988-07-12 Warner-Lambert Company 2-substituted-[2-substituted-amino]-N-arylalkyl-3-[indol-3-yl]
US4652553A (en) * 1985-11-25 1987-03-24 Merck & Co., Inc. Steroidal glycolipids as host resistance stimulators
GB8600489D0 (en) 1986-01-09 1986-02-12 Erba Farmitalia Aminoglycoside steroids
AU602641B2 (en) * 1986-04-17 1990-10-18 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Thiolactam-N-acetic acid derivatives, their production and use
EP0264586B1 (en) 1986-08-28 1991-04-03 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Hydantoin derivatives for treating complications of diabetes
ZA883929B (en) 1987-06-22 1990-02-28 Hoffmann La Roche Cholecystokinin analogs for controlling appetite
US5175154A (en) * 1987-11-25 1992-12-29 Research Corporation Technologies, Inc. 5 α-pregnan-20-ones and 5-pregnen-20-ones and related compounds
US5192772A (en) * 1987-12-09 1993-03-09 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Therapeutic agents
GB8801037D0 (en) * 1988-01-18 1988-02-17 Plessey Co Ltd Improvements relating to fuel supply systems
US5252572A (en) * 1988-02-03 1993-10-12 Chinoin Gyogyszer- Es Vegyeszeti Termekek Gyara Rt. Pyridopyrimidine derivatives, pharmaceutical compositions containing them and process for preparing same
EP0344383A1 (en) * 1988-06-02 1989-12-06 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Novel alpha-Glucosidase inhibitors
DE3836675A1 (de) * 1988-10-28 1990-05-03 Hoechst Ag Glykosidase-inhibitor salbostatin, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung
US4978669A (en) 1989-06-08 1990-12-18 Neurex Corporation Method of suppressing appetite by administration of tetrahydro-beta-carboline derivatives
JPH03120227A (ja) 1989-10-02 1991-05-22 Shigeo Ochi 飲食物消化分解産物吸収抑制剤
US4980357A (en) * 1990-03-01 1990-12-25 Pfizer Inc. Azolidinedione derivatives
US5037831A (en) * 1990-05-21 1991-08-06 American Home Products Corporation Spiro-isoquinoline-pyrrolidines and analogs thereof useful as aldose reductase inhibitors
US5504078A (en) * 1990-06-08 1996-04-02 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. α-glucosidase inhibitors
GB9016978D0 (en) * 1990-08-02 1990-09-19 Ici Plc Acetamide derivatives
US5217877A (en) * 1990-09-28 1993-06-08 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of α-glucosidase inhibitor, pradimicin Q
US5091418A (en) * 1990-09-28 1992-02-25 Bristol-Myers Squibb Company Novel alpha-glucosidase inhibitor, pradimicin Q
US6100048A (en) 1992-04-10 2000-08-08 Oregon Health Sciences University Methods and reagents for discovering and using mammalian melanocortin receptor agonists and antagonists to modulate feeding behavior in animals
AU683620B2 (en) * 1992-09-28 1997-11-20 Pfizer Inc. Substituted pyrimidines for control of diabetic complications
RU2115255C1 (ru) 1992-09-30 1998-07-10 Моторола, Инк. Способ доставки сообщений, система связи и портативный приемник селективного вызова для осуществления способа
GB9307833D0 (en) 1993-04-15 1993-06-02 Glaxo Inc Modulators of cholecystokinin and gastrin
FR2706255B1 (fr) 1993-06-17 1995-10-27 Univ Rennes Composition à usage alimentaire et/ou pharmaceutique pauvre en polyamines et applications thérapeutiques.
CA2165200A1 (en) 1993-06-18 1995-01-05 Ambikaipakan Balasubramaniam Neuropeptide y antagonists and agonists
US5516516A (en) 1993-10-19 1996-05-14 Cherksey; Bruce D. Method of preparing muira puama extract and its use for decreasing body fat percentage and increasing lean muscle mass
JPH07184548A (ja) 1993-12-28 1995-07-25 Meiji Seito Kk 口腔用組成物
US6309853B1 (en) * 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
US5698199A (en) 1995-03-10 1997-12-16 Kao Corporation Lipolysis acceleration method
ATE205477T1 (de) 1995-06-06 2001-09-15 Pfizer Substituierte n-(indol-2-carbonyl)-amide und derivate als glycogen phosphorylase inhibitoren
MX9709875A (es) 1995-06-06 1998-03-31 Pfizer N-(indol-2-carbonil)-glicinamidas substituidas y derivados como inhibidores de glicogeno fosforilasa, composiciones que las contienen y uso de las mismas.
JPH08332028A (ja) 1995-06-12 1996-12-17 Takashi Mizuno サボテン成分入り冷菓とその製法
US5693327A (en) 1995-07-12 1997-12-02 Shah; Eladevi Herbal compositions
EP0862631A1 (en) 1995-10-26 1998-09-09 The Board Of Regents, The University Of Texas System Luminal cholecystokinin-releasing factor
US5824668A (en) 1996-11-07 1998-10-20 Supergen, Inc. Formulation for administration of steroid compounds
TW432073B (en) 1995-12-28 2001-05-01 Pfizer Pyrazolopyridine compounds
US5932779A (en) * 1996-06-10 1999-08-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Screening methods for compounds useful in the regulation of body weight
US5908609A (en) 1996-06-10 1999-06-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Screening methods for compounds useful in the regulation of body weight
AU5243798A (en) 1996-11-06 1998-05-29 Children's Medical Center Corporation Transgenic animal expressing a syndecan in the regions of hypothalamus
WO1998027113A2 (en) * 1996-12-17 1998-06-25 Quadrant Holdings Cambridge Limited Melanocortin derivatives for specific binding of melanocortin receptor 3, 4 or 5
CA2217698A1 (en) 1996-12-20 1998-06-20 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5798101A (en) 1997-01-22 1998-08-25 Hpf, L.L.C. Herbal appetite suppressant and weight loss composition
EP0971957A1 (en) 1997-03-26 2000-01-19 Novo Nordisk A/S Polypeptide with appetite regulating activity
WO1998046243A2 (en) * 1997-04-15 1998-10-22 Csir Pharmaceutical compositions having appetite suppressant activity
FR2771105A1 (fr) 1997-11-20 1999-05-21 Vitasterol Utilisation du fusarium monoliforme pour la preparation des derives 7alpha-hydroxyles de la dehydroepiandrosterone et de la pregnenolone
GB2355657B (en) 1999-10-27 2004-07-28 Phytopharm Plc Inhibitors Of Gastric Acid Secretion
GB2363985B (en) * 2000-06-30 2004-09-29 Phytopharm Plc Extracts,compounds & pharmaceutical compositions having anti-diabetic activity and their use

Also Published As

Publication number Publication date
GT199800076A (es) 1999-12-01
PL196015B1 (pl) 2007-11-30
AU7061398A (en) 1998-11-11
EP1213020A2 (en) 2002-06-12
BG103795A (en) 2000-05-31
NZ525021A (en) 2004-05-28
EP1222927A2 (en) 2002-07-17
KR20010006424A (ko) 2001-01-26
US20020168427A1 (en) 2002-11-14
IS5196A (is) 1999-09-24
PL336498A1 (en) 2000-07-03
BR9808593A (pt) 2000-05-23
MY141674A (en) 2010-05-31
JP2002205997A (ja) 2002-07-23
JP2000510482A (ja) 2000-08-15
OA11166A (en) 2003-04-28
GB2360519A (en) 2001-09-26
KR100891756B1 (ko) 2009-04-07
EA199900932A1 (ru) 2000-04-24
ES2363230T3 (es) 2011-07-27
EA200200392A1 (ru) 2002-08-29
GB0117039D0 (en) 2001-09-05
EP1213020B1 (en) 2009-02-11
CA2283564A1 (en) 1998-10-22
CN1252000A (zh) 2000-05-03
HK1026373A1 (en) 2000-12-15
JP3553086B2 (ja) 2004-08-11
UA72439C2 (en) 2005-03-15
CN101239089A (zh) 2008-08-13
HUP0000838A2 (hu) 2000-10-28
NZ337422A (en) 2002-05-31
EP1222927B1 (en) 2013-11-20
ES2321162T3 (es) 2009-06-03
EP1222927A3 (en) 2002-10-30
ATE502041T1 (de) 2011-04-15
YU52199A (sh) 2003-02-28
PT973534E (pt) 2007-02-28
PT1213020E (pt) 2009-04-24
SA98190501B1 (ar) 2006-07-30
TW200300094A (en) 2003-05-16
GEP20022788B (en) 2002-09-25
EP0973534A1 (en) 2000-01-26
GB2338235A (en) 1999-12-15
GEP20022709B (en) 2002-06-25
US20060205931A1 (en) 2006-09-14
ATE422359T1 (de) 2009-02-15
GB2338235B (en) 2001-11-14
CA2283564C (en) 2007-07-10
DE69836321T2 (de) 2007-06-28
PL201487B1 (pl) 2009-04-30
US20040228935A1 (en) 2004-11-18
ATE344046T1 (de) 2006-11-15
DE69840552D1 (de) 2009-03-26
GB2360520A (en) 2001-09-26
AP2003002730A0 (en) 2003-06-30
DE69836321D1 (de) 2006-12-14
SK141899A3 (en) 2000-09-12
US7166611B2 (en) 2007-01-23
NO994992L (no) 1999-12-14
DE69842189D1 (de) 2011-04-28
TW589187B (en) 2004-06-01
TW539551B (en) 2003-07-01
DK0973534T3 (da) 2007-03-12
AP1291A (en) 2004-08-02
EP1598054B1 (en) 2011-03-16
AP2003002729A0 (en) 2003-06-30
JP2003026591A (ja) 2003-01-29
GB9919797D0 (en) 1999-10-27
HUP0000838A3 (en) 2001-04-28
EP1598054A3 (en) 2009-06-10
ZA983170B (en) 1999-10-15
IL131659A0 (en) 2001-01-28
KR20040004407A (ko) 2004-01-13
NZ525022A (en) 2004-05-28
IL158465A0 (en) 2004-05-12
CN101239090A (zh) 2008-08-13
EP1213020A3 (en) 2005-03-09
CA2584411A1 (en) 1998-10-22
WO1998046243A2 (en) 1998-10-22
GB2360520B (en) 2001-11-07
TW200300093A (en) 2003-05-16
ID22888A (id) 1999-12-16
NZ516696A (en) 2003-08-29
EE9900497A (et) 2000-06-15
EP1598054A2 (en) 2005-11-23
GB0117041D0 (en) 2001-09-05
NZ516695A (en) 2003-08-29
AP9901673A0 (en) 1999-12-31
IL158466A0 (en) 2004-05-12
US20040234634A1 (en) 2004-11-25
TWI253932B (en) 2006-05-01
GB2360519B (en) 2001-11-28
TR199902540T2 (xx) 2000-01-21
CN100378118C (zh) 2008-04-02
NO994992D0 (no) 1999-10-14
US6376657B1 (en) 2002-04-23
TR200001846T2 (tr) 2000-11-21
IL131659A (en) 2005-07-25
US20030086984A1 (en) 2003-05-08
EA002885B1 (ru) 2002-10-31
EP1213020A8 (en) 2003-12-17
AU746414B2 (en) 2002-05-02
ES2276460T3 (es) 2007-06-16
GT199800076BA (es) 1999-12-01
PE85699A1 (es) 1999-09-15
GT199800076AA (es) 1999-12-01
SG120054A1 (en) 2006-03-28
WO1998046243A3 (en) 1999-02-25
EP1438965A1 (en) 2004-07-21
EP0973534B1 (en) 2006-11-02
KR100510614B1 (ko) 2005-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL197783B1 (pl) Glikozyd steroidowy, środek o czynności hamowania łaknienia, produkt żywnościowy lub napój, zastosowanie glikozydu steroidowego, nieterapeutyczny sposób hamowania łaknienia oraz ekstrakt roślinny
AU780886B2 (en) Appetite suppresant steroidal glycosides
CZ359999A3 (cs) Farmaceutická kompozice snižující chuť k jídlu
HRP980456A2 (en) Pharmaceutical compositions having appetite suppressant activity
MXPA99009443A (en) Pharmaceutical compositions having appetite suppressant activity

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20110415