KR20210042936A - 단백질 제제를 위한 트립토판 유도체 및 l-메티오닌의 용도 - Google Patents

단백질 제제를 위한 트립토판 유도체 및 l-메티오닌의 용도 Download PDF

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KR20210042936A
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nat
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클레오 살리스버리
비카스 샤르마
스리드하라 알라바탐
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본원 발명은 산화에 취약한 용매 접근가능 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 방법 및 제제를 제공하는데, 여기서 N-아세틸-DL-트립토판 (NAT) 및/또는 L-메티오닌이 상기 폴리펩티드의 산화를 예방하는 데 이용된다.

Description

단백질 제제를 위한 트립토판 유도체 및 L-메티오닌의 용도
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2018년 8월 8일 자 제출된 U.S. 가출원 번호 62/716,239에 우선권을 주장하고, 이것은 각각 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본원 발명은 폴리펩티드, N-아세틸-DL-트립토판 및 L-메티오닌을 포함하는 액체 제제, 그리고 이들의 생산과 이용을 위한 방법에 관계한다.
배경
단일클론 항체 (mAbs)를 비롯한 치료 단백질의 생물활성은 입체형태적 및 생화학적 안정성에 의존한다. 산화는 치료 단백질 개발에서 저하를 유발할 것으로 많이 우려되는 것들 중에서 한 가지인데, 그 이유는 특히 산화가 생리학적 표적에 결합하는 데 관련된 단백질의 영역에서, 또는 작동체 기능에 결정적인 영역에서 일어나면, 산화가 약물동력학 또는 생물학적 활성에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문이다. 추가적으로, 산화는 응집에 대한 치료 단백질의 민감성을 변경하고, 결과적으로 면역원성 프로필에 영향을 줄 수 있다.
생물치료제에서 산화 위험의 관리를 위한 통상적인 해법은 동결 건조이다. 하지만, 이러한 접근법이 항상 바람직한 것은 아닌데, 그 이유는 이것이 생산 비용을 증가시키고, 그리고 약물의 제조와 임상적 이용을 더욱 복잡하게 만들 수 있기 때문이다. 산화하기 쉬운 아미노산 잔기의 돌연변이를 통한 단백질 재공학 또한 산화 위험을 경감하기 위한 가능한 접근법이다. 하지만, 표적화된 돌연변이가 항상 실행가능한 해법인 것은 아닌데, 그 이유는 비록 이들이 산화의 가능성을 감소시킬 수 있긴 하지만, 이들은 표적에 대한 단백질의 결합 친화성 및 결과적으로, 단백질의 효능 또한 감소시킬 수 있기 때문이다. 따라서, 제조, 저장 및 이용 동안 치료 단백질 산화를 제어하기 위한 대안적 또는 상보성 전략이 요구된다.
폴리펩티드 제제의 실례는 WO 2010/030670, WO 2014/160495, WO 2014/160497 및 WO 2017/117304에서 개시된다.
특허 출원, 특허 공보, 비-특허 문헌, 그리고 UniProtKB/Swiss-Prot/GenBank 수탁 번호를 비롯한, 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 마치 각 개별 참고문헌이 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 전체적으로 본원에서 참조로서 편입된다.
짧은 요약
이런 저런 요구에 부합하기 위해, 폴리펩티드 (예를 들면, 치료적 폴리펩티드, 예컨대 항체), N-아세틸-DL-트립토판 (NAT), 그리고 L-메티오닌을 포함하는 액체 제제가 본원에서 개시되는데, 여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 (예를 들면, 트립토판 잔기, 메티오닌 잔기 등)의 산화를 감소시키거나 또는 예방하는 데 충분한 양으로 제공된다. 본원 발명은 NAT의 첨가가 산화 스트레스 동안 2가지 예시적인 항체의 가변 영역 트립토판 잔기를 보호하는 데 효과적이긴 하지만, NAT의 포함이 Fc 메티오닌 잔기를 산화에 민감하게 만든다는 조사 결과에 적어도 부분적으로 기초된다. 하지만, NAT를 포함하는 제제에 L-메티오닌의 첨가는 예시적인 항체 둘 모두에 대해 트립토판과 메티오닌 잔기 둘 모두를 산화로부터 효과적으로 보호하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 1 참조). 본원 발명은 또한, 양쪽 부형제가 생체내에서 충분히 내약성이라는 조사 결과에 적어도 부분적으로 근거되는데 (실시예 1 참조), 이것은 NAT와 L-메티오닌이 생물치료 제제에서 항산화성 부형제로서 안전하고 효과적일 수 있다는 것을 지시한다.
따라서, 한 양상에서, 폴리펩티드, N-아세틸-DL-트립토판 (NAT), 그리고 L-메티오닌을 포함하는 액체 제제가 본원에서 제공되는데, 여기서 상기 NAT는 상기 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되고, 그리고 여기서 상기 L-메티오닌은 상기 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공된다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.01 내지 약 25 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.05 내지 약 1.0 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.05 내지 약 0.3 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.3 mM, 그리고 약 1.0 mM로 구성된 군에서 선택되는 농도이다. 일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 1 내지 약 125 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 5 내지 약 25 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 5 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.3 mM이고, 그리고 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 5.0 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 1.0 mM이고, 그리고 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 5.0 mM이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 가변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W103을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR-H1 및/또는 HVR-H3 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W33, W36, W52a, W99, W100a 및/또는 W100b를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 가변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M34 및/또는 M82를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 불변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M252 및/또는 M428을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화는 NAT를 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기의 산화에 비하여 감소된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화는 L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비하여 감소된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화는 NAT 및 L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기 및 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비하여 감소된다. 일부 구체예에서, 산화는 약 40%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 제제에서 폴리펩티드 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구체예에서, 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 부형제는 안정제, 완충액, 계면활성제, 그리고 긴장성 작용제로 구성된 군에서 선택된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 제제는 개체에게 투여에 적합한 제약학적 제제이다. 일부 구체예에서, 제약학적 제제는 피하, 정맥내, 또는 유리체내 투여에 적합하다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다.
일부 양상에서, 본원 발명은 본원에서 설명된 바와 같은 액체 제제를 포함하는 제조 물품 또는 키트를 제공한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 수성 제제에서 폴리펩티드의 산화를 감소시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 NAT 및 L-메티오닌을 상기 제제에 첨가하되, 상기 NAT가 상기 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되고, 그리고 상기 L-메티오닌이 상기 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, NAT는 약 0.01 내지 약 25 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, NAT는 약 0.05 내지 약 1 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, NAT는 약 0.05 내지 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, NAT는 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.3 mM, 그리고 약 1.0 mM로 구성된 군에서 선택되는 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, L-메티오닌은 약 1 내지 약 125 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, L-메티오닌은 약 5 내지 약 25 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, L-메티오닌은 약 5 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, NAT는 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가되고, 그리고 L-메티오닌은 약 5.0 mM의 농도로 제제에 첨가된다. 일부 구체예에서, NAT는 약 1.0 mM의 농도로 제제에 첨가되고, 그리고 L-메티오닌은 약 5.0 mM의 농도로 제제에 첨가된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 가변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W103을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR-H1 및/또는 HVR-H3 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W33, W36, W52a, W99, W100a 및/또는 W100b를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 가변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M34 및/또는 M82를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 불변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M252 및/또는 M428을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따른다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화는 NAT를 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기의 산화에 비하여 감소된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화는 L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비하여 감소된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화는 NAT 및 L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기 및 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비하여 감소된다. 일부 구체예에서, 산화는 약 40%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소된다.
본원 발명의 일부 구체예에서, 제제에서 폴리펩티드 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구체예에서, 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 한 가지 또는 그 이상의 부형제는 안정제, 완충액, 계면활성제, 그리고 긴장성 작용제로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 제제는 개체에게 투여에 적합한 제약학적 제제이다. 일부 구체예에서, 제약학적 제제는 피하, 정맥내, 또는 유리체내 투여에 적합하다. 일부 구체예에서, 개체는 인간이다.
상기 및 본원에서 설명된 다양한 구체예의 성질 중에서 한 가지, 일부 또는 전부는 본원 발명의 다른 구체예를 형성하기 위해 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원 발명의 이런 저런 양상은 당업자에게 명백해질 것이다. 본원 발명의 이런 저런 구체예는 다음의 상세한 설명에 의해 더욱 설명된다.
도면의 간단한 설명
도 1A-1B는 2,2'-아조-비스(2-아미디노프로판) 중염산염 (AAPH) 스트레스 시에 2가지 예시적인 IgG1 항체 (mAb1 및 mAb2)의 산화 수준에 대한 N-아세틸-DL-트립토판 (NAT) 농도의 영향을 보여준다. 도 1A는 Fv 트립토판 산화 수준에 대한 NAT 농도의 영향을 보여준다. 도 1B는 Fc 메티오닌 산화 수준에 대한 NAT 농도의 영향을 보여준다.
도 2A-2B는 메티오닌 또는 NAT 없음, 5 mM 메티오닌, 0.3 mM NAT, 또는 5 mM 메티오닌 및 0.3 mM NAT의 조합으로 조제된 2가지 예시적인 IgG1 항체 (mAb1 및 mAb2)의 AAPH 스트레스 후 산화 수준을 보여준다. 도 2A는 산화-민감성 Fv 트립토판의 산화 수준을 보여준다. 도 2B는 Fc 메티오닌의 산화 수준을 보여준다.
도 3A-3B는 높은-UV 광 스트레스 후 2가지 예시적인 IgG1 항체 (mAb1 및 mAb2)의 산화 수준에 대한 NAT 농도의 영향을 보여준다. 도 3A는 HVR 트립토판 산화 수준에 대한 NAT 농도의 영향을 보여준다. 도 3B는 Fc 메티오닌 산화 수준에 대한 NAT 농도의 영향을 보여준다.
도 4A-4B는 메티오닌 또는 NAT 없음, 5 mM 메티오닌, 0.3 mM NAT, 또는 5 mM 메티오닌 및 0.3 mM NAT의 조합으로 조제된 2가지 예시적인 IgG1 항체 (mAb1 및 mAb2)의 높은-UV 광 스트레스 후 산화 수준을 보여준다. 도 4A는 HVR 트립토판의 산화 수준을 보여준다. 도 4B는 Fc 메티오닌의 산화 수준을 보여준다.
도 5는 항산화제가 화학적 산화 위험을 경감한다는 것을 보여준다.
도 6은 I mM NAT 및 5 mM 메티오닌으로 W52의 산화로부터 보호를 보여준다.
상세한 설명
I. 정의.
본원 발명을 상세하게 설명하기에 앞서, 본원 발명은 특정 조성물 또는 생물학적 시스템에 한정되지 않으며, 이들은 당연히, 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정한 구체예를 설명하기 위한 것이고, 그리고 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 별도로 지시되지 않으면, 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "분자"에 대한 언급은 2개 또는 그 이상의 이런 분자의 조합 등을 임의적으로 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 당업자에게 쉽게 공지된 개별 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 값 또는 파라미터에서 "약"에 대한 언급은 그 자체로 상기 값 또는 파라미터에 관계하는 구체예를 포함한다 (및 설명한다).
본원에서 설명된 발명의 양상과 구체예는 "포함하는," "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는" 양상과 구체예를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 관용구, 예컨대 "A 및/또는 B"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 A와 B 둘 모두; A 또는 B; A (단독); 그리고 B (단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 본원에서 관용구, 예컨대 "A, B 및/또는 C"에서 이용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 다음의 구체예 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B와 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A (단독); B (단독); 그리고 C (단독).
용어 "제약학적 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 제제가 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다. 이런 제제는 무균이다.
"무균" 제제는 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 없거나 또는 본질적으로 없다.
"안정된" 제제는 그 안에 폴리펩티드가 보관 시에 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다. 바람직하게는, 제제는 보관 시에 물리적 및 화학적 안정성뿐만 아니라 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로, 제제의 의도된 보관 수명에 근거하여 선택된다. 폴리펩티드 안정성을 계측하기 위한 다양한 분석 기법이 당해 분야에서 가용하고, 그리고 예를 들면, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 리뷰된다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 양의 광 노출 및/또는 온도에서 계측될 수 있다. 안정성은 응집체 형성의 평가 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여, 혼탁도를 계측함으로써 및/또는 시각적 검사에 의해); ROS 형성의 평가 (예를 들면, 광 스트레스 검정 또는 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 중염산염 (AAPH) 스트레스 검정을 이용함으로써); 단백질의 특이적 아미노산 잔기 (예를 들면, 단일클론 항체의 Trp 잔기 및/또는 Met 잔기)의 산화; 양이온 교환 크로마토그래피, 영상화 모세관 등전위 초점 (icIEF) 또는 모세관 구역 전기이동을 이용하여 전하 이질성을 사정함으로써; 아미노 말단 또는 카르복시 말단 서열 분석; 질량 분광계 분석; 환원된 항체 및 무손상 항체를 비교하는 SDS-PAGE 분석; 펩티드 지도 (예를 들면, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 단백질의 생물학적 활성 또는 표적 결합 기능 (예를 들면, 항체의 항원 결합 기능) 평가; 등을 비롯한, 다양한 상이한 방식에서 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정은 하기 중에서 한 가지 또는 그 이상을 수반할 수 있다: 응집, 탈아미드화 (예를 들면, Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들면, Met 산화 및/또는 Trp 산화), 이성화 (예를 들면, Asp 이성화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들면, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 대합되지 않은 시스테인(들), N 말단 연장, C 말단 처리, 글리코실화 차이, 기타 등등.
폴리펩티드는 만약 이것이 컬러 및/또는 선명도의 시각 검사 시에, 또는 예를 들면, UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 계측될 때, 응집, 침전, 단편화 및/또는 변성의 징후를 전혀 또는 거의 보여주지 않으면, 제약학적 제제에서 "물리적 안정성을 유지한다".
폴리펩티드는 만약 소정의 시점에서 화학적 안정성이 상기 폴리펩티드가 아래에 규정된 바와 같이 생물학적 활성을 여전히 유지하는 것으로 고려되는 정도이면, 제약학적 제제에서 "화학적 안정성을 유지한다". 화학적 안정성은 폴리펩티드의 화학적으로 변경된 형태를 검출하고 정량함으로써 사정될 수 있다. 화학적 변경은 예를 들면, 트립신분해 펩티드 지도화, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분광분석법 (LC/MS)을 이용하여 평가될 수 있는 폴리펩티드 산화를 수반할 수 있다. 화학적 변경의 다른 유형은 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피 또는 icIEF에 의해 평가될 수 있는 폴리펩티드의 전하 변경을 포함한다.
폴리펩티드는 만약 소정의 시점에서 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성이 예를 들면, 단일클론 항체에 대한 항원 결합 검정에서 결정된 대로, 제약학적 제제가 제조된 시점에 전시된 생물학적 활성의 약 20% 이내에 (예컨대, 약 10% 이내에) 있으면 (검정의 오차 내에서), 제약학적 제제에서 "생물학적 활성을 유지한다".
본원에서 이용된 바와 같이, 폴리펩티드의 "생물학적 활성"은 표적에 결합하는 폴리펩티드의 능력, 예를 들면, 항원에 결합하는 단일클론 항체의 능력을 지칭한다. 이것은 시험관내에서 또는 생체내에서 계측될 수 있는 생물학적 반응을 더욱 포함할 수 있다. 이런 활성은 길항성 또는 효현성일 수 있다.
"산화에 민감성"인 폴리펩티드는 산화되기 쉬운 것으로 밝혀진 한 가지 또는 그 이상의 잔기(들), 예컨대 하지만 제한 없이, 메티오닌 (Met), 시스테인 (Cys), 히스티딘 (His), 트립토판 (Trp) 및 티로신 (Tyr)을 포함하는 것이다. 예를 들면, 단일클론 항체의 Fab 부분에서 트립토판 아미노산 또는 단일클론 항체의 Fc 부분에서 메티오닌 아미노산은 산화에 민감성일 수 있다.
폴리펩티드의 "산화 불안정" 잔기는 산화 검정에서 35% 이상의 산화 (예를 들면, AAPH-유도된 또는 열-유도된 산화)를 갖는 잔기이다. 폴리펩티드에서 잔기의 산화 퍼센트는 당해 분야에서 공지된 임의의 방법, 예컨대 예를 들면, 트립신 소화, 그 이후에 부위 특이적 Trp 산화에 대한 LC-MS/MS에 의해 결정될 수 있다.
용매에서 생체분자의 "용매-접근가능한 표면 부위" 또는 "SASA"는 용매에게 접근이 허용되는 생체분자의 표면 부위이다. SASA는 용매에게 접근이 허용되는 표면 부위의 계측 단위 (예를 들면, 입방 옹스트롬)로 또는 백분율로서 표현될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에서 아미노산 잔기의 SASA는 80 Å2, 또는 30%일 수 있다. SASA는 예를 들면, Shrake-Rupley 알고리즘, LCPO 방법, 파워 다이어그램 방법, 또는 분자 동역학 시뮬레이션을 이용하는 것을 비롯하여, 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
관심되는 제제에 관하여 용어 "등장성"은 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 제제를 지칭한다. 등장성 제제는 일반적으로, 약 250 내지 350 mOsm의 삼투압을 가질 것이다. 등장성은 예를 들면, 증기압 또는 결빙 유형 삼투압계를 이용하여 계측될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "완충액"은 이의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH에서 변화에 저항하는 완충된 용액을 지칭한다. 예를 들면, 본원 발명의 완충액은 약 4.5 내지 약 8.0의 범위 안에 pH를 가질 수 있다. 히스티딘 아세트산염은 pH를 이러한 범위 내에서 제어할 완충액의 실례이다.
"보존제"는 예를 들면, 그 안에 세균 작용을 본질적으로 감소시키고, 따라서 복수 이용 제제의 생산을 용이하게 하는, 제제 내에 임의적으로 포함될 수 있는 화합물이다. 잠재적 보존제의 실례는 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄, 헥사메토늄 염화물, 벤잘코늄 염화물 (알킬벤질디메틸암모늄 염화물의 혼합물, 여기서 알킬 기는 긴 사슬 화합물이다) 및 벤제토늄 염화물을 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알코올, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 그리고 m-크레졸을 포함한다. 한 구체예에서, 본원에서 보존제는 벤질 알코올이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "계면활성제"는 표면-활성제, 바람직하게는 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 본원에서 계면활성제의 실례는 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80); 폴록사머 (예를 들면, 폴록사머 188); 트리톤; 황산도데실나트륨 (SDS); 라우릴황산나트륨; 나트륨 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코크아미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-베타인 (예를 들면, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 나트륨 메틸 코코일- 또는 이나트륨 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUATTM 계열 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 그리고 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들면, 플루로닉, PF68 등); 기타 등등을 포함한다. 한 구체예에서, 본원에서 계면활성제는 폴리소르베이트 20이다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 계면활성제는 폴록사머 188이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "제약학적으로 허용되는" 부형제 또는 운반체는 당해 분야에서 널리 알려져 있는, 제약학적으로 허용되는 운반체, 안정제, 완충액, 산, 염기, 당, 보존제, 계면활성제, 긴장성 작용제, 기타 등등을 포함한다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, 2012). 제약학적으로 허용되는 부형제의 실례는 완충액, 예컨대 인산염, 구연산염, 아세트산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산, L-트립토판 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 잔기 이하) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류, 그리고 다른 탄수화물; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 복합체; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트, 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 그리고 PLURONICS™을 포함한다. "제약학적으로 허용되는" 부형제 또는 운반체는 이용된 활성 성분의 유효 용량을 제공하기 위해 개체에게 합리적으로 투여될 수 있고, 그리고 이용된 용량과 농도에서 거기에 노출되는 개체에게 비독성인 것들이다.
조제되는 폴리펩티드는 바람직하게는 본질적으로 순수하고, 그리고 바람직하게는 본질적으로 균질하다 (예를 들면, 오염 단백질 등이 없다). "본질적으로 순수한" 폴리펩티드는 조성물의 총 중량에 근거하여, 중량으로 적어도 약 90%, 바람직하게는 중량으로 적어도 약 95%의 폴리펩티드 (예를 들면, 단일클론 항체)를 포함하는 조성물을 의미한다. "본질적으로 균질한" 폴리펩티드는 조성물의 총 중량에 근거하여, 중량으로 적어도 약 99%의 폴리펩티드 (예를 들면, 단일클론 항체)를 포함하는 조성물을 의미한다.
용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 중합체는 선형이거나 또는 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산이 끼어들 수 있다. 이들 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는 예를 들면, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예를 들면, 비자연적인 아미노산 등 포함)뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 다른 변형을 내포하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에서 상기 정의 내에 포괄되는 폴리펩티드의 실례는 포유류 폴리펩티드, 예컨대 예를 들면, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 렙틴; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 그리고 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파와 -베타; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; TNF-관련된 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL); B-세포 성숙 항원 (BCMA); B-림프구 자극기 (BLyS); 증식-유도 리간드 (APRIL); 엔케팔리나아제; RANTES (활성화 시에 조절된 정상적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮤에레리안-저해 물질; 렐락신 A-사슬; 렐락신 B-사슬; 프로렐락신; 생쥐 성선자극호르몬-연관된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타 락타마아제; DNA분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 연관된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈소판-유래된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF); 혈관 내피 성장 인자 패밀리 단백질 (예를 들면, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 그리고 P1GF); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 패밀리 단백질 (예를 들면, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, 그리고 이들의 이합체); 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리, 예컨대 aFGF, bFGF, FGF4 및 FGF9; 표피 성장 인자 (EGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 예컨대 VEGF 수용체(들) (예를 들면, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3), 표피 성장 인자 (EGF) 수용체(들) (예를 들면, ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4 수용체), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체(들) (예를 들면, PDGFR-α 및 PDGFR-β), 그리고 섬유모세포 성장 인자 수용체(들); TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2); 안지오포이에틴 수용체, 예컨대 TIE1 및 TIE2; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 예컨대 뼈-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I과 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBPs); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 케모킨, 예컨대 CXCL12 및 CXCR4; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 사이토킨, 예컨대 인터류킨 (ILs), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 미드킨; 초과산화물 디스무타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들면, AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 에프린; Bv8; 델타-유사 리간드 4 (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; 폴리스타틴; 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF); Alk1; Robo4; ESM1; 퍼레칸; EGF-유사 도메인, 복수 7 (EGFL7); CTGF 및 이의 패밀리의 구성원; 트롬보스폰딘, 예컨대 트롬보스폰딘1 및 트롬보스폰딘2; 콜라겐, 예컨대 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII; 뉴로필린, 예컨대 NRP1 및 NRP2; 플레이오트로핀 (PTN); 프로그래눌린; 프로리페린; Notch 단백질, 예컨대 Notch1 및 Notch4; 세마포린, 예컨대 Sema3A, Sema3C 및 Sema3F; 종양 연관된 항원, 예컨대 CA125 (난소암 항원); 면역부착소; 그리고 상기-열거된 폴리펩티드 중에서 어느 것의 단편 및/또는 변이체뿐만 아니라 예를 들면, 임의의 상기-열거된 단백질을 비롯한 한 가지 또는 그 이상의 단백질에 결합하는 항체 및 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함), 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적, 삼중특이적 등), 그리고 항체 단편을 특정적으로 커버한다.
"단리된" 폴리펩티드 (예를 들면, 단리된 항체)는 자연 환경의 성분으로부터 확인되고, 분리되고 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염체 성분은 상기 폴리펩티드에 대한 연구적, 진단적 또는 치료적 이용을 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬, 그리고 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에서 원지에서 폴리펩티드를 포함하는데, 그 이유는 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 통상적으로, 하지만, 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"선천적 항체"는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 반면 이황화 연쇄의 숫자는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에서 서로 다르다. 각 중쇄와 경쇄는 또한, 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화 다리를 갖는다. 각 중쇄는 한쪽 단부에서 가변 도메인 (VH), 그 이후에 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한쪽 단부에서 가변 도메인 (VL) 및 다른 단부에서 불변 도메인을 갖는다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인과 함께 정렬되고, 그리고 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이에 인터페이스를 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 내포하는 면역글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비하여 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 내포한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노 말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로, 항체의 최대 가변 부분이고 항원 결합 부위를 내포한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 일정한 부분이 항체 사이에서 서열에서 광범위하게 상이하고, 그리고 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합과 특이성에 이용된다는 사실을 지칭한다. 하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인의 전역에서 균등하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄와 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 초가변 영역 (HVR)으로 불리는 3개의 분절에서 농축된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 불린다. 선천적 중쇄와 경쇄의 가변 도메인은 각각, 3개의 HVR에 의해 연결된, 베타-시트 형상을 주로 채택하는 4개의 FR 영역을 포함하고, 이들은 루프 연결을 형성하고, 그리고 일부 경우에, 베타-시트 구조의 일부를 형성한다. 각 사슬에서 HVR은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 묶여지고, 그리고 다른 사슬로부터 HVR과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)을 참조한다). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접적으로 관련되지 않지만, 다양한 작동체 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 독성에서 항체의 참여를 전시한다.
임의의 포유류 종으로부터 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파("κ")와 람다("λ")로 불리는 2가지 명확하게 상이한 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 IgG "아이소타입" 또는 "하위부류"는 그들의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징에 의해 규정되는 면역글로불린의 임의의 하위부류인 것으로 의미된다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 항체 (면역글로불린)는 상이한 부류에 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, γ, ε, γ 및 μ로 불린다. 면역글로불린의 상이한 부류의 이들 아단위 구조 및 3차원 형상은 널리 알려져 있고, 그리고 예를 들면, Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed., W.B. Saunders, Co., 2000에서 전반적으로 설명된다. 항체는 항체 및 하나 또는 그 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 연관에 의해 형성되는, 더욱 큰 융합 분자의 부분일 수 있다.
용어 "전장 항체," "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 아래에 규정된 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실제적으로 무손상 형태에서 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 이들 용어는 특히, Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 포함한다, 바람직하게는 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 실례는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산하고, 이들은 각각 단일 항원 결합 부위를 갖고, 그리고 쉽게 결정화하는 능력을 반영하는 명칭인 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편을 산출하는데, 이것은 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원을 여전히 교차연결할 수 있다. Fab 단편은 중쇄와 경쇄 가변 도메인을 내포하고, 그리고 또한, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)을 내포한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 소수 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 Fab' 단편의 쌍으로서 최초 생산되었는데, 이들은 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다. 항체 단편의 다른 화학적 연계 역시 알려져 있다.
"Fv"는 완전 항원-결합 부위를 내포하는 최소 항체 단편이다. 한 구체예에서, 2-사슬 Fv 종류는 단단한, 비공유 연관에서 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인의 이합체로 구성된다. 단일 사슬 Fv (scFv) 종류에서, 하나의 중쇄와 하나의 경쇄 가변 도메인은 이러한 경쇄와 중쇄가 2-사슬 Fv 종류에서와 유사한 "이합체성" 구조로 연관할 수 있도록 유연한 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이러한 형상에서 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이합체의 표면상에서 항원 결합 부위를 규정한다. 집합적으로, 6개 HVR은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 하지만, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)도 비록 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH와 VL 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에서 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 더욱 포함하는데, 이것은 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv에 관한 리뷰를 위해, 예를 들면, Pluckth
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n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994를 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭하는데, 이들 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 너무 짧아 동일한 사슬 상에서 두 도메인 사이에 대합을 허용하지 않는 링커를 이용함으로써, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 대합을 이루고 2개의 항원 결합 부위를 창출하도록 강제된다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 그리고 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)에서 더욱 충분히 설명된다. 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 예를 들면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들면, 자연발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 구별된 항체의 혼합물이 아니라는, 항체의 특징을 지시한다. 일부 구체예에서, 이런 단일클론 항체는 전형적으로, 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하는데, 여기서 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 획득되었다. 예를 들면, 선별 과정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 고유한 클론의 선별일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들면, 표적에 대한 친화성을 향상시키고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양 동안 이의 생산을 향상시키고, 생체내에서 이의 면역원을 감소시키고, 다중특이적 항체를 창출하고, 기타 등등을 위해 더욱 변경될 수 있고, 그리고 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 역시 본원 발명의 단일클론 항체인 것으로 이해되어야 한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 단일클론 항체 제조물은 그들의 특이성에 더하여, 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 지시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 예를 들면, 하이브리도마 방법 (예를 들면, Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), 재조합 DNA 방법 (예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567을 참조한다), 파지 전시 기술 (예를 들면, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)를 참조한다), 그리고 인간 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 좌위 또는 유전자 중에서 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들면, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)를 참조한다)를 비롯한 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
본원에서 단일클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열에 상동하고, 반면 사슬(들)의 나머지 부분이 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 이들 서열에 상동한 "키메라" 항체뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 전시하기만 하면, 이런 항체의 단편을 특정적으로 포함한다 (예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)를 참조한다). 키메라 항체는 PRIMATTZFD® 항체를 포함하는데, 여기서 상기 항체의 항원 결합 영역은 예를 들면, 마카크 원숭이를 관심되는 항원으로 면역화함으로써 생산된 항체로부터 유래된다.
비인간 (예를 들면, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 내포하는 키메라 항체이다. 한 구체예에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 수용력을 갖는, 비인간 종 (공여자 항체), 예컨대 생쥐, 쥐, 토끼 또는 비인간 영장류의 HVR로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 FR 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더욱 정밀화하기 위해 만들어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 초가변 루프의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 임의적으로 또한, 전형적으로 인간 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가 상세를 위해, 예를 들면, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참조한다. 또한, 예를 들면 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 그리고 U.S. 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 소유하고 및/또는 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 만들기 위한 임의의 기술을 이용하여 만들어진 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다. 인간 항체는 파지 전시 라이브러리를 비롯한, 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에서 설명된 방법이 또한 가용하다. 또한, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)를 참조한다. 인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 이런 항체를 생산하도록 변형되지만, 내인성 좌위에 장애가 있는 유전자도입 동물, 예컨대 면역화된 제노마우스에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다 (예를 들면, XENOMOUSETM 기술에 관하여 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584를 참조한다). 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체에 관하여, 예를 들면, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)를 참조한다.
본원에서 이용될 때, 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변성이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 선천적 항체에서, H3 및 L3은 6개 HVR 중에서 최대 다양성을 전시하고, 그리고 H3은 특히, 항체에 뛰어난 특이성을 부여하는 데 고유한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 예를 들면, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)을 참조한다. 실제로, 중쇄 단독으로 구성되는 자연 발생 낙타과 항체는 경쇄의 부재에서도 기능적이고 안정적이다. 예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참조한다. 일부 구체예에서, 이들 HVR은 상보성 결정 영역 (CDR)이다.
다수의 HVR 묘사가 본원에서 이용되고 포괄된다. Kabat 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성에 근거되고, 그리고 가장 흔히 이용되는 것이다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia는 그 대신에, 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR은 Kabat HVR 및 Chothia 구조적 루프 사이에 타협을 나타내고, 그리고 Oxford Molecular의 AbM 항체 모형화 소프트웨어에 의해 이용된다. "접촉" HVR은 가용한 복합 결정 구조의 분석에 근거된다. 이들 HVR 각각으로부터 잔기는 아래에서 제시된다.
루프 Kabat AbM Chothia 접촉
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat 넘버링)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia 넘버링)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
HVR은 아래와 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 그리고 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 이들 정의 각각에 대해 Kabat et al., 위와 같음에 따라 넘버링된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정된 바와 같은 HVR 잔기 이외에 가변 도메인 잔기이다.
용어 "Kabat의 경우에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링", "Kabat의 경우에서와 같은 아미노산 위치 넘버링", "잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른다", 그리고 이들의 변이는 Kabat et al., 위와 같음에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 이용되는 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축, 또는 이것 내로 삽입에 상응하는 더욱 적은 또는 추가 아미노산을 내포할 수 있다. 예를 들면, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입물 (Kabat에 따라 잔기 52a), 그리고 중쇄 FR 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기 (예를 들면, Kabat에 따라 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체의 서열과 "표준" Kabat 넘버링된 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 소정의 항체에 대해 결정될 수 있다.
가변 도메인 내에 잔기 (대략, 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때, Kabat 넘버링 시스템이 일반적으로 이용된다 (예를 들면, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 용어 "EU 넘버링 시스템", "EU 색인", "잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따른다", 그리고 이들의 변이는 일반적으로, 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서 잔기를 지칭할 때 이용된다 (예를 들면, Kabat et al., 위와 같음에서 보고된 EU 색인). "Kabat의 경우에서와 같은 EU 색인"은 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다.
용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 폴리에피토프 특이성을 갖는 (다시 말하면, 하나의 생물학적 분자 상에서 2개 또는 그 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 2개 또는 그 이상의 상이한 생물학적 분자 상에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 특정적으로 커버한다. 일부 구체예에서, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체)의 항원 결합 도메인은 2개의 VH/VL 단위를 포함하는데, 여기서 첫 번째 VH/VL 단위는 첫 번째 에피토프에 특이적으로 결합하고 두 번째 VH/VL 단위는 두 번째 에피토프에 특이적으로 결합하고, 여기서 각 VH/VL 단위는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 이런 다중특이적 항체는 전장 항체, 2개 또는 그 이상의 VL과 VH 도메인을 갖는 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디와 트리아바디, 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 항체 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 중쇄 불변 영역의 적어도 일부 및/또는 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 더욱 포함하는 VH/VL 단위는 "헤미머" 또는 "절반 항체"로서 또한 지칭될 수 있다. 일부 구체예에서, 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역의 적어도 일부 및 단일 경쇄 가변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 이런 구체예에서, 2개의 절반 항체를 포함하고 2개의 항원에 결합하는 이중특이적 항체는 첫 번째 항원 또는 첫 번째 에피토프에 결합하지만 두 번째 항원 또는 두 번째 에피토프에는 결합하지 않는 첫 번째 절반 항체 및 두 번째 항원 또는 두 번째 에피토프에 결합하지만 첫 번째 항원 또는 첫 번째 에피토프에는 결합하지 않는 두 번째 절반 항체를 포함한다. 일부 구체예에 따라서, 다중특이적 항체는 각 항원 또는 에피토프에 5 M 내지 0.001 pM, 3 M 내지 0.001 pM, 1 M 내지 0.001 pM, 0.5 M 내지 0.001 pM, 또는 0.1 M 내지 0.001 pM의 친화성으로 결합하는 IgG 항체이다. 일부 구체예에서, 헤미머는 분자내 이황화 결합이 두 번째 헤미머와 형성되도록 허용하는 중쇄 가변 영역의 충분한 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 헤미머는 예를 들면, 상보성 홀 돌연변이 또는 노브 돌연변이를 포함하는 두 번째 헤미머 또는 절반 항체와의 이종이합체화를 허용하는 노브 돌연변이 또는 홀 돌연변이를 포함한다. 노브 돌연변이 및 홀 돌연변이는 아래에 더욱 논의된다.
"이중특이적 항체"는 하나의 생물학적 분자 상에서 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 2개의 상이한 생물학적 분자 상에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 또한, 본원에서 "이중 특이성"을 갖거나 또는 "이중 특이적"인 것으로서 지칭될 수 있다. 별도로 지시되지 않으면, 이중특이적 항체에 의해 결합된 항원이 이중특이적 항체 명칭에서 열거되는 순서는 임의적이다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하는데, 여기서 각 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 임의적으로 중쇄 불변 영역의 적어도 일부, 그리고 단일 경쇄 가변 영역 및 임의적으로 경쇄 불변 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하는데, 여기서 각 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 단일 경쇄 가변 영역을 포함하고, 하나 이상의 단일 중쇄 가변 영역을 포함하지 않고, 그리고 하나 이상의 단일 경쇄 가변 영역을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 절반 항체를 포함하는데, 여기서 각 절반 항체는 단일 중쇄 가변 영역 및 단일 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그리고 여기서 첫 번째 절반 항체는 첫 번째 항원에 결합하지만 두 번째 항원에는 결합하지 않고 두 번째 절반 항체는 두 번째 항원에 결합하지만 첫 번째 항원에는 결합하지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "노브-인투-홀" 또는 "KnH" 기술은 2개의 폴리펩티드가 상호작용하는 인터페이스에서 융기 (노브)를 한쪽 폴리펩티드 내로, 그리고 공동 (홀)을 다른 폴리펩티드 내로 도입함으로써, 시험관내에서 또는 생체내에서 함께 이들의 대합을 주동하는 기술을 지칭한다. 예를 들면, KnH는 항체의 Fc:Fc 결합 인터페이스, CL:CH1 인터페이스 또는 VH/VL 인터페이스에서 도입되었다 (예를 들면, US 2011/0287009, US2007/0178552, WO 96/027011, WO 98/050431, 그리고 Zhu et al., 1997, Protein Science 6:781-788을 참조한다). 일부 구체예에서, KnH는 다중특이적 항체의 제조 동안 함께 2개의 상이한 중쇄의 대합을 주동한다. 예를 들면, 그들의 Fc 영역 내에 KnH를 갖는 다중특이적 항체는 각 Fc 영역에 연결된 단일 가변 도메인을 더욱 포함할 수 있거나, 또는 유사한 또는 상이한 경쇄 가변 도메인과 대합을 이루는 상이한 중쇄 가변 도메인을 더욱 포함할 수 있다. KnH 기술은 또한, 함께 2개의 상이한 수용체 세포외 도메인의 대합 또는 상이한 표적 인식 서열을 포함하는 임의의 다른 폴리펩티드 서열 (예를 들면, 어피바디, 펩티바디 및 다른 Fc 융합 포함)의 대합을 이루는 데 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "노브 돌연변이"는 한 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 상호작용하는 인터페이스에서, 융기 (노브)를 전자 폴리펩티드 내로 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구체예에서, 다른 폴리펩티드는 홀 돌연변이를 갖는다 (예를 들면, 각각 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805를 참조한다).
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "홀 돌연변이"는 한 폴리펩티드가 다른 폴리펩티드와 상호작용하는 인터페이스에서, 공동 (홀)을 전자 폴리펩티드 내로 도입하는 돌연변이를 지칭한다. 일부 구체예에서, 다른 폴리펩티드는 노브 돌연변이를 갖는다 (예를 들면, 각각 본원에서 전체적으로 참조로서 편입되는 US 5,731,168, US 5,807,706, US 5,821,333, US 7,695,936, US 8,216,805를 참조한다).
표현 "선형 항체"는 Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)에서 설명된 항체를 지칭한다. 간단히 말하면, 이들 항체는 한 쌍의 탠덤 Fd 분절 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는데, 이들은 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
II. 폴리펩티드 제제 및 제조
본원 발명의 일정한 양상은 폴리펩티드, N-아세틸-DL-트립토판 (NAT), 그리고 L-메티오닌을 포함하는 제제에 관계하는데, 여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판 및/또는 티로신 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 및 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 제제는 본원에서 설명된 폴리펩티드 중에서 어느 것에 따른 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 구체예에서, 제제는 수성 제제이다. 일부 구체예에서, 제제는 제약학적 제제 (예를 들면, 인간 개체에게 투여에 적합)이다.
일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.01 mM 내지 약 25 mM (예컨대, 약 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21.0, 22.0, 23.0, 24.0, 또는 25.0 mM 중에서 어느 것, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 포함), 또는 NAT가 제제에서 가용성인 가장 높은 농도까지이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.05 내지 약 1 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.05 내지 약 0.3 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.05 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.1 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 0.3 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 1.0 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 NAT의 농도는 약 1 mM이다.
일부 구체예에서, NAT는 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 반응성 산소 종은 일중항산소, 초과산화물 (O2-), 알콕실 라디칼, 페록실 라디칼, 과산화수소 (H2O2), 양수소 삼산화물 (H2O3), 히드로트리옥시 라디칼 (HO3ㆍ), 오존 (O3), 히드록실 라디칼 및/또는 알킬 과산화물에서 선택된다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이고, 그리고 NAT는 항체 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 경쇄 가변 영역 (예를 들면, HVR-L1, HVR-L2 및/또는 HVR-L3) 및/또는 중쇄 가변 영역 (예를 들면, HVR-H1, HVR-H2 및/또는 HVR-H3) 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 중쇄 가변 영역에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W103 (Kabat 넘버링에 따름)을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR-H1, HVR-H2 및/또는 HVR-H3 (예를 들면, HVR-H1 및/또는 HVR-H3)에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W33, W36, W52, W52a, W99, W100a, W100b 및/또는 W103 (Kabat 넘버링에 따름)을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W33 및/또는 W36, W99 및/또는 W100a를 포함한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 제제에서 NAT의 포함은 잔기 W33, W36, W52a, WW99, W100a, W110b 및/또는 W103에서 항체의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다 (예를 들면, NAT를 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기(들)와 비교하여). 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR-L1, HVR-L2 및/또는 HVR-L3에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 W94, W31 및/또는 W91을 포함한다.
일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 1.0 mM 내지 약 125.0 mM (예컨대, 약 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 100.0, 105.0, 110.0, 115.0, 120.0, 또는 125.0 mM 중에서 어느 것, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 포함), 또는 L-메티오닌이 제제에서 가용성인 가장 높은 농도까지이다. 일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 5.0 내지 약 25.0 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 농도는 약 5.0 mM이다.
일부 구체예에서, L-메티오닌은 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, L-메티오닌은 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 반응성 산소 종은 일중항산소, 초과산화물 (O2-), 알콕실 라디칼, 페록실 라디칼, 과산화수소 (H2O2), 양수소 삼산화물 (H2O3), 히드로트리옥시 라디칼 (HO3ㆍ), 오존 (O3), 히드록실 라디칼 및/또는 알킬 과산화물에서 선택된다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이고, 그리고 L-메티오닌은 항체 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 경쇄 가변 영역 (예를 들면, HVR-L1, HVR-L2 및/또는 HVR-L3) 및/또는 중쇄 가변 영역 (예를 들면, HVR-H1, HVR-H2 및/또는 및 HVR-H3) 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 중쇄 가변 영역에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 중쇄 가변 영역의 프레임워크 영역에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M82 (Kabat 넘버링에 따름)를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기는 항체의 HVR-H1, HVR-H2 및/또는 HVR-H3 (예를 들면, HVR-H1)에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M34 (Kabat 넘버링에 따름)를 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 HVR-L1, HVR-L2 및/또는 HVR-L3 (예를 들면, HVR-L1)에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 경쇄에서; 예를 들면, M30, M33, M92 부위에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 중쇄에서; 예를 들면, M82, M99, M57, M58, M62, M64 부위, 그리고 95-102 사이에 다른 부위에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체의 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역 내에 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 항체 (예를 들면, IgG1 항체)의 중쇄 불변 영역에서 위치된다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기는 M252, M35 및/또는 M428 (EU 넘버링에 따름)을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 제제에서 L-메티오닌의 포함은 잔기 M34, M82, M252 및/또는 M428에서 항체의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다 (예를 들면, L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기(들)와 비교하여).
일부 구체예에서, 본원 발명의 제제에서 NAT의 포함은 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기 (예를 들면, 전술된 임의의 메티오닌 잔기, 예컨대 위치 M252 및/또는 M428에서 Fc 영역 메티오닌)에서 항체의 산화를 증가시킨다. 일부 구체예에서, 제제에서 L-메티오닌의 포함은 항체 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기 (예를 들면, 전술된 임의의 메티오닌 잔기, 예컨대 위치 M252, M358 및/또는 M428에서 Fc 영역 메티오닌)의 NAT-유도된 및/또는 증폭된 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 액체 제제는 본원에서 설명된 농도 중에서 어느 것에서 NAT 및 본원에서 설명된 농도 중에서 어느 것에서 L-메티오닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 액체 제제는 약 0.3 mM의 농도에서 Nat 및 약 5.0 mM의 농도에서 L-메티오닌을 포함한다. 일부 구체예에서, 액체 제제는 약 1.0 mM의 농도에서 NAT 및 약 5.0 mM의 농도에서 L-메티오닌을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원 발명에 의해 제공된 액체 제제는 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌 (여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드의 산화 (예를 들면, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및/또는 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화)가 약 40% 내지 약 100% 감소된다 (예를 들면, NAT 및/또는 L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기 및/또는 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기와 비교하여). 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 산화 (예를 들면, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및/또는 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화)는 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위까지 감소된다 (예를 들면, NAT 및/또는 L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기 및/또는 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기와 비교하여). 예를 들면, 아래의 실시예 1 (및 그 안에 인용된 참고문헌)에서 기술된 방법을 비롯하여, 당해 분야에서 공지된 폴리펩티드 산화를 계측하는 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다.
폴리펩티드에서 산화의 양은 예를 들면, RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신분해 펩티드 지도화 중에서 한 가지 또는 그 이상을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신분해 펩티드 지도화 중에서 한 가지 또는 그 이상 및 하기 공식을 이용하여 백분율로서 결정된다:
Figure pct00002
일부 구체예에서, 본원 발명에 의해 제공된 액체 제제는 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌 (여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드 중에서 약 40% 내지 약 0% 이내가 산화된다 (예를 들면, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및/또는 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기에서 산화된다). 일부 구체예에서, 폴리펩티드 중에서 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내가 산화된다 (예를 들면, 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및/또는 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기에서 산화된다).
일부 구체예에서, 본원 발명에 의해 제공된 액체 제제는 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌 (여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드에서 적어도 하나의 산화 불안정 트립토판 잔기 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체의 트립토판 잔기 중에서 하나 또는 그 이상)의 산화가 약 40% 내지 약 100% 감소된다 (예를 들면, NAT를 결여하는 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기(들)와 비교하여). 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 트립토판 잔기(들)의 산화는 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위까지 감소된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 트립토판 잔기 각각의 산화는 약 40% 내지 약 100% (예컨대, 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중에서 어느 것, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 포함) 감소된다.
일부 구체예에서, 본원 발명에 의해 제공된 액체 제제는 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌 (여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드에서 적어도 하나의 산화 불안정 트립토판 잔기 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체의 트립토판 잔기 중에서 하나 또는 그 이상) 중에서 약 40% 내지 약 0% 이내가 산화된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 트립토판 잔기(들) 중에서 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내가 산화된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 트립토판 잔기 각각의 약 40% 내지 약 0% 이내 (예컨대, 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내)가 산화된다.
일부 구체예에서, 본원 발명에 의해 제공된 액체 제제는 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌 (여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드에서 적어도 하나의 산화 불안정 메티오닌 잔기 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체의 메티오닌 잔기 중에서 하나 또는 그 이상)의 산화가 약 40% 내지 약 100% 감소된다 (예를 들면, L-메티오닌을 결여하는 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기(들)과 비교하여). 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 메티오닌 잔기(들)의 산화는 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위까지 감소된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 메티오닌 잔기 각각의 산화는 약 40% 내지 약 100% (예컨대, 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중에서 어느 것, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 포함) 감소된다.
일부 구체예에서, 본원 발명에 의해 제공된 액체 제제는 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌 (여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 상기 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다)을 포함하고, 여기서 폴리펩티드에서 적어도 하나의 산화 불안정 메티오닌 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체의 메티오닌 잔기 중에서 하나 또는 그 이상) 중에서 약 40% 내지 약 0% 이내가 산화된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 메티오닌 잔기 중에서 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내가 산화된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드에서 산화 불안정 메티오닌 잔기 각각의 약 40% 내지 약 0% 이내 (예컨대, 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내)가 산화된다.
일부 구체예에서, 제제에서 폴리펩티드 (예를 들면, 항체) 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 (예를 들면, 항체)는 치료적 폴리펩티드이다. 제제에서 예시적인 폴리펩티드 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 이상, 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL를 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적, 삼중특이적 등), 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 제제는 수성이다. 일부 구체예에서, 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제를 더욱 포함한다. 예를 들면, 안정제, 완충액, 계면활성제, 긴장성 작용제, 그리고 이들의 임의의 조합을 비롯하여, 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 부형제가 본원에서 설명된 제제에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원 발명의 제제는 단일클론 항체, 폴리펩티드 (예를 들면, 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기에서)의 산화를 예방하는 본원에서 제시된 바와 같은 NAT, 폴리펩티드 (예를 들면, 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기에서)의 산화를 예방하는 본원에서 제시된 바와 같은 L-메티오닌, 그리고 제제의 pH를 바람직한 수준으로 유지하는 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 제제는 약 4.5 내지 약 9.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서 pH는 pH 4.0 내지 8.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 8.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 7.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 7.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 6.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 6.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 5.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 5.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 4.5의 범위 안에, pH 4.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 5.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 5.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 6.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 6.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 7.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 7.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 8.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 8.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 5.7 내지 6.8의 범위 안에, pH 5.8 내지 6.5의 범위 안에, pH 5.9 내지 6.5의 범위 안에, pH 6.0 내지 6.5의 범위 안에, 또는 pH 6.2 내지 6.5의 범위 안에 있다. 일부 구체예에서, 제제는 6.2 또는 약 6.2의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 제제는 6.0 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 제제는 본원에서 설명된 폴리펩티드 중에서 어느 것에 따른 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 더욱 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 제제는 개체에게 투여에 적합한 제약학적 제제이다. 본원에서 이용된 바와 같이 "개체", "환자", 또는 "피험자"는 인간 또는 비인간 동물을 지칭할 수 있다. "비인간 동물"은 인간으로서 분류되지 않는 임의의 동물, 예컨대 사육, 농장, 또는 동물원 동물, 스포츠, 애완 동물 (예컨대 개, 말, 고양이, 소 등)뿐만 아니라 연구에서 이용되는 동물을 지칭할 수 있다. 연구 동물은 제한 없이 선충, 절지동물, 척추동물, 포유동물, 개구리, 설치류 (예를 들면, 생쥐 또는 쥐), 어류 (예를 들면, 제브라피시 또는 복어), 조류 (예를 들면, 닭), 개, 고양이, 그리고 비인간 영장류 (예를 들면, 붉은 털 원숭이, 시노몰구스 원숭이, 침팬지 등)를 지칭할 수 있다. 일부 구체예에서, 개체, 환자, 또는 피험자는 인간이다.
제제에서 폴리펩티드 및 항체는 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 제제에서 항체 (예를 들면, 전장 항체, 항체 단편 및 다중특이적 항체)는 당해 분야에서 가용한 기술을 이용하여 제조될 수 있는데, 이들의 무제한의 예시적인 방법은 하기 섹션에서 더욱 상세하게 설명된다. 본원에서 방법은 다른 폴리펩티드, 예컨대 펩티드-기초된 저해제를 포함하는 제제의 제조를 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다. 치료 단백질의 생산을 위한 일반적으로 충분히 이해되고 통상적으로 이용되는 기술과 절차에 대해 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswill et al., 2006); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010)를 참조하는데, 이들 모두 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 제제 (예를 들면, 액체 제제) 중에서 어느 것에 따라서, 상기 제제는 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함한다 (예를 들면, 형성물은 2가지 또는 그 이상 폴리펩티드의 공동제제이다). 예를 들면, 일부 구체예에서, 제제는 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드, NAT, 그리고 L-메티오닌을 포함하는 공동제제인데, 여기서 상기 NAT와 L-메티오닌은 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드 중에서 적어도 한 가지의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, NAT 및 L-메티오닌은 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드 중 다수의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, NAT 및 L-메티오닌은 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드 각각의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드 중에서 적어도 한 가지는 항체, 예컨대 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드 중 다수는 항체, 예컨대 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편 사이에서 독립적으로 선택되는 항체이다. 일부 구체예에서, 2가지 또는 그 이상의 폴리펩티드 각각은 항체, 예컨대 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편 사이에서 독립적으로 선택되는 항체이다. 일부 구체예에서, 제제의 하나 또는 그 이상의 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 제제는 액체 제제이다. 일부 구체예에서, 제제는 수성 제제이다. 일부 구체예에서, 제제는 제약학적 제제 (예를 들면, 인간 개체에게 투여에 적합)이다. 일부 구체예에서, 제약학적 제제는 임의의 경장 루트 또는 비경구 루트를 통한 투여에 적합하다. 용어 투여의 "경장 루트"는 위장관의 임의의 부분을 통한 투여를 지칭한다. 경장 루트의 실례는 경구, 점막, 협측 및 직장 루트, 또는 위내 루트를 포함한다. 투여의 "비경구 루트"는 경장 루트 이외의 투여 루트를 지칭한다. 비경구 투여 루트의 실례는 정맥내, 근육내, 피내, 복막내, 종양내, 방광내, 동맥내, 척수강내, 낭내, 안와내, 유리체내, 심장내, 경기관, 관절내, 피막하, 거미막하, 척주내, 경막외 및 흉골내, 피하, 또는 국소 투여를 포함한다. 일부 구체예에서, 제약학적 제제는 피하, 정맥내, 또는 유리체내 투여에 적합하다. 일부 구체예에서, 제약학적 제제는 피하 또는 유리체내 투여에 적합하다.
A. 항체 제조
본원에서 제공된 액체 제제에서 항체는 관심되는 항원을 향해 지향된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이고, 그리고 장애를 앓는 포유동물에게 항체의 투여는 상기 포유동물에서 치료적 유익성을 유발할 수 있다. 하지만, 비폴리펩티드 항원을 향해 지향된 항체 또한 예기된다.
항원이 폴리펩티드인 경우에, 이것은 막경유 분자 (예를 들면, 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원은 분자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); CD20; ox-LDL; ox-ApoB100; 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 그리고 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; 종양 괴사 인자-알파와 -베타; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화 시에 조절된 정상적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮤에레리안-저해 물질; 렐락신 A-사슬; 렐락신 B-사슬; 프로렐락신; 생쥐 성선자극호르몬-연관된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타 락타마아제; DNA분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 연관된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 예컨대 뼈-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I과 -II (IGF-I 및 IGF-II); des (1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (ILs), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 초과산화물 디스무타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들면, AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 연관된 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 그리고 상기-열거된 폴리펩티드 중에서 어느 것의 단편을 포함한다.
(i) 항원 제조
다른 분자에 임의적으로 접합된 가용성 항원 또는 이들의 단편이 항체를 산출하기 위한 면역원으로서 이용될 수 있다. 막경유 분자, 예컨대 수용체의 경우에, 이들의 단편 (예를 들면, 수용체의 세포외 도메인)이 면역원으로서 이용될 수 있다. 대안으로, 막경유 분자를 발현하는 세포가 면역원으로서 이용될 수 있다. 이런 세포는 자연 공급원 (예를 들면, 암 세포주)로부터 유래될 수 있거나, 또는 막경유 분자를 발현하기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체를 제조하는 데 유용한 다른 항원 및 이들의 형태는 당업자에게 명백할 것이다.
(ii) 일정한 항체-기초된 방법
다중클론 항체는 바람직하게는, 유관한 항원 및 어쥬번트의 복수 피하 (sc) 또는 복막내 (ip) 주사에 의해 동물에서 조성된다. 이것은 이중기능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (여기서 R과 R1은 상이한 알킬 기이다)를 이용하여, 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들면, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 콩 트립신 저해제에 유관한 항원을 접합하는 데 유용할 수 있다.
동물은 예를 들면, 100 μg 또는 5 μg의 단백질 또는 접합체 (각각, 토끼 또는 생쥐의 경우)를 3 용적의 프로인드 완전 어쥬번트와 조합하고 용액을 복수 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대항하여 면역화된다. 1 개월 후, 이들 동물은 복수 부위에서 피하 주사에 의해 프로인드 완전 어쥬번트에서 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 추가접종된다. 7 내지 14 일 후, 이들 동물은 채혈되고, 그리고 혈청이 항체 역가에 대해 검정된다. 동물은 역가가 안정 상태를 유지할 때까지 추가접종된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 접합체로 추가접종되지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 교차연결 시약을 통해 접합된다. 접합체는 또한, 재조합 세포 배양 동안 단백질 융합체로서 만들어질 수 있다. 또한, 응집 작용제, 예컨대 백반이 면역 반응을 증강하는 데 적절하게 이용된다.
관심되는 단일클론 항체는 인간-인간 하이브리도마에 관하여 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 설명되고, 그리고 예를 들면, Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), 그리고 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)에서 더욱 설명되는 하이브리도마 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 추가 방법은 예를 들면, 하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 자연 IgM 항체의 생산에 관하여 U.S. 특허 번호 7,189,826에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술)은 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
다양한 다른 하이브리도마 기술에 대해, 예를 들면, US 2006/258841; US 2006/183887 (완전 인간 항체), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; 그리고 U.S. 특허 번호 7,078,492 및 7,153,507을 참조한다. 하이브리도마 방법을 이용하여 단일클론 항체를 생산하기 위한 예시적인 프로토콜은 하기와 같이 설명된다. 한 구체예에서, 생쥐 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 이용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 이끌어 내기 위해 면역화된다. 항체는 관심되는 폴리펩티드 또는 이의 단편, 그리고 어쥬번트, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로스 디크리노미콜레이트 (TDM)의 복수의 피하 (sc) 또는 복막내 (ip) 주사에 의해 동물에서 조성된다 (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). 관심되는 폴리펩티드 (예를 들면, 항원) 또는 이의 단편은 당해 분야에서 널리 공지된 방법, 예컨대 재조합 방법을 이용하여 제조될 수 있는데, 이들 중에서 일부는 본원에서 더욱 설명된다. 면역화된 동물로부터 혈청은 항-항원 항체에 대해 검정되고, 그리고 부스터 면역화가 임의적으로 투여된다. 항-항원 항체를 생산하는 동물로부터 림프구가 단리된다. 대안으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.
림프구는 이후, 하이브리도마 세포를 형성하기 위해, 적합한 융합 작용제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포주와 융합된다. 참조: 예를 들면, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). 효율적으로 융합하고, 선별된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은-수준 생산을 뒷받침하고, 그리고 배지, 예컨대 HAT 배지에 민감한 골수종 세포가 이용될 수 있다. 예시적인 골수종 세포는 뮤린 골수종 라인, 예컨대 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA로부터 가용한 MOPC-21과 MPC-11 생쥐 종양으로부터 유래된 것들, 그리고 American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA로부터 가용한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주 또한 설명되었다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 적합한 배양 배지, 예를 들면, 융합되지 않은, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 한 가지 또는 그 이상의 물질을 내포하는 배지에서 파종되고 성장된다. 예를 들면, 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT-결함성 세포의 성장을 예방한다. 바람직하게는, 혈청 없는 하이브리도마 세포 배양 방법이 예를 들면, Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)에서 설명된 바와 같이, 동물-유래된 혈청, 예컨대 소 태아 혈청의 이용을 감소시키는 데 이용된다.
하이브리도마 세포 배양액의 생산성을 향상시키기 위한 도구로서 올리고펩티드는 Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)에서 설명된다. 구체적으로, 표준 배양 배지는 일정한 아미노산 (알라닌, 세린, 아스파라긴, 프롤린)으로, 또는 단백질 가수분해 분획물로 농축되고, 그리고 아폽토시스가 3 내지 6개의 아미노산 잔기로 구성되는 합성 올리고펩티드에 의해 유의미하게 억제될 수 있다. 이들 펩티드는 밀리몰 또는 그 이상의 농도로 존재한다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 본원에서 설명된 항체에 결합하는 단일클론 항체의 생산에 대해 검정될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사면역검정 (RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 단일클론 항체의 결합 친화성은 예를 들면, 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다. 참조: 예를 들면, Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 참조: 예를 들면, Goding, 위와 같음. 이런 목적으로 적합한 배양 배지는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 이에 더하여, 하이브리도마 세포는 동물 내에 복수 종양으로서 생체내에서 성장될 수 있다. 하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 전통적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들면, 단백질 A-세파로오스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다. 하이브리도마 세포로부터 단백질의 단리를 위한 한 가지 절차는 US 2005/176122 및 U.S. 특허 번호 6,919,436에서 설명된다. 상기 방법은 결합 과정에서 최소의 염, 예컨대 친액 염을 이용하고, 그리고 바람직하게는 또한, 용리 과정에서 소량의 유기 용매를 이용하는 것을 포함한다.
(iii) 일정한 라이브러리 선별검사 방법
본원에서 설명된 제제와 조성물에서 항체는 조합 라이브러리를 이용하여, 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 선별검사함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들면, 파지 전시 라이브러리를 산출하고, 그리고 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지된다. 이런 방법은 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)에서 전반적으로 설명된다. 예를 들면, 관심되는 항체를 산출하는 한 가지 방법은 Lee et al., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93에서 설명된 바와 같은 파지 항체 라이브러리의 이용을 통하는 것이다.
원칙적으로, 합성 항체 클론은 파지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 전시하는 파지를 내포하는 파지 라이브러리를 선별검사함으로써 선별된다. 이런 파지 라이브러리는 원하는 항원에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 패닝된다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현하는 클론은 항원에 흡착되고, 그리고 따라서, 라이브러리 내에 비결합 클론으로부터 분리된다. 결합 클론은 이후, 항원으로부터 용리되고, 그리고 항원 흡착/용리의 추가 주기에 의해 더욱 농축될 수 있다. 관심되는 파지 클론을 선별하기 위한 적합한 항원 선별검사 절차, 그 이후에 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), vols. 1-3에서 설명된, 관심되는 파지 클론으로부터 Fv 서열 및 적합한 불변 영역 (Fc) 서열을 이용한 전장 항체 클론의 작제를 설계함으로써 임의의 항체가 획득될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체의 항원 결합 도메인은 경쇄 (VL)와 중쇄 (VH)로부터 각각 하나씩, 약 110개 아미노산의 2개의 가변 (V) 영역으로부터 형성되고, 이들 둘 모두 3개의 초가변 루프 (HVR) 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다. 가변 도메인은 Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이, VH와 VL이 짧은, 유연한 펩티드를 통해 공유 연결되는 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서, 또는 이들이 불변 도메인에 각각 융합되고 비공유적으로 상호작용하는 Fab 단편으로서 파지 상에서 기능적으로 전시될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, scFv 인코딩 파지 클론 및 Fab 인코딩 파지 클론은 "Fv 파지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 총칭된다.
VH와 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들 라이브러리는 이후, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이 항원 결합 클론에 대해 탐구될 수 있다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 구축하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 인간 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 그리고 고도로 가변적 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, 실모양 파지가 소수 외피 단백질 pIII에 융합에 의해 항체 단편을 전시하는 데 이용된다. 항체 단편은 단일 사슬 Fv 단편으로서 전시될 수 있는데, 여기서 VH와 VL 도메인은 예를 들면, Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)에 의해 설명된 바와 같이 유연한 폴리펩티드 스페이서에 의해, 또는 예를 들면, Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)에서 설명된 바와 같이 한쪽 사슬이 pIII에 융합되고 다른 사슬이 세균 숙주 세포 주변세포질 내로 분비되며, 여기서 Fab-외피 단백질 구조의 어셈블리가 야생형 외피 단백질 중에서 일부를 치환함에 의해 파지 표면상에서 전시되는 Fab 단편으로서 동일한 폴리펩티드 사슬 상에서 연결된다.
일반적으로, 항체 유전자 단편을 인코딩하는 핵산은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 획득된다. 만약 항-항원 클론에 우호적으로 편향된 라이브러리가 요망되면, 개체는 항체 반응을 산출하기 위해 항원으로 면역화되고, 그리고 비장세포 및/또는 순환 B 세포 다른 말초혈 림프구 (PBLs)가 라이브러리 작제를 위해 회수된다. 한 구체예에서, 항-항원 클론에 우호적으로 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 항원 면역화가 항원에 대한 인간 항체를 생산하는 B 세포를 발생시키도록, 기능적 인간 면역글로불린 유전자 어레이를 보유하는 (그리고 기능적 내인성 항체 생산 시스템을 결여하는) 유전자도입 생쥐에서 항-항원 항체 반응을 산출함으로써 획득된다. 인간 항체-생산 유전자도입 생쥐의 산출은 아래에 설명된다.
항-항원 반응 세포 개체군에 대한 추가 농축은 항원 특이적 막 결합된 항체를 발현하는 B 세포를 단리하기 위한 적합한 선별검사 절차를 이용함으로써, 예를 들면, 항원 친화성 크로마토그래피 또는 플루오로크롬-표지된 항원에 세포의 흡착을 이용한 세포 분리, 그 이후에 유동-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 획득될 수 있다.
대안으로, 비면역성 공여자로부터 비장세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBL의 이용은 가능한 항체 레퍼토리의 더욱 우수한 표현을 제공하고, 그리고 또한, 항원이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비인간) 종을 이용한 항체 라이브러리의 작제를 허용한다. 시험관내 항체 유전자 구성을 통합하는 라이브러리의 경우, 재배열되지 않은 항체 유전자 분절을 인코딩하는 핵산을 제공하기 위해 개체로부터 줄기 세포가 수확된다. 관심되는 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 생쥐, 쥐, 토끼목, 루프린, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 조류 종 등으로부터 획득될 수 있다.
항체 가변 유전자 분절 (VH와 VL 분절 포함)을 인코딩하는 핵산은 관심되는 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재배열된 VH와 VL 유전자 라이브러리의 경우에, 원하는 DNA는 림프구로부터 유전체 DNA 또는 mRNA를 단리하고, 그 이후에 Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)에서 설명된 바와 같이 재배열된 VH와 VL 유전자의 5'와 3' 단부에 정합하는 프라이머로 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하고, 따라서 발현을 위한 다양한 V 유전자 레퍼토리를 만듦으로써 획득될 수 있다. V 유전자는 cDNA 및 유전체 DNA로부터, Orlandi et al. (1989)에서 및 Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)에서 설명된 바와 같이 성숙 V-도메인을 인코딩하는 엑손의 5' 단부에서 역방향 프라이머 및 J-분절 내에 기초된 정방향 프라이머로 증폭될 수 있다. 하지만, cDNA로부터 증폭하기 위해, 역방향 프라이머는 또한, Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991)에서 설명된 바와 같이 리더 엑손에 기초될 수 있고, 그리고 정방향 프라이머는 Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)에서 설명된 바와 같이 불변 영역 내에 기초될 수 있다. 상보성을 최대화하기 위해, Orlandi et al. (1989) 또는 Sastry et al. (1989)에서 설명된 바와 같이 축중성이 프라이머에 통합될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들면, Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)의 방법에서 설명된 바와 같이 또는 Orum et al., Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)의 방법에서 설명된 바와 같이 면역 세포 핵산 표본 내에 존재하는 모든 가용한 VH와 VL 배열을 증폭하기 위해, 라이브러리 다양성이 각 V-유전자 패밀리에 표적화된 PCR 프라이머를 이용함으로써 최대화된다. 증폭된 DNA를 발현 벡터 내로 클로닝하기 위해, 희귀한 제한 부위가 Orlandi et al. (1989)에서 설명된 바와 같이 한쪽 단부에서 태그로서 PCR 프라이머 내에 도입되거나, 또는 Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)에서 설명된 바와 같이 태깅된 프라이머로 추가 PCR 증폭에 의해 도입될 수 있다.
합성적으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 시험관내에서 V 유전자 분절로부터 유래될 수 있다. 인간 VH-유전자 분절 중에서 대부분이 클로닝되고 염기서열분석되며 (Tomlinson et al., J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)에서 보고됨), 지도화되었다 (Matsuda et al., Nature Genet., 3: 88-94 (1993)에서 보고됨; 이들 클로닝된 분절 (H1과 H2 루프의 모든 주요 입체형태 포함)은 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에서 설명된 바와 같이 다양한 서열과 길이의 H3 루프를 인코딩하는 PCR 프라이머로 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 산출하는 데 이용될 수 있다. VH 레퍼토리는 또한, Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)에서 설명된 바와 같이, 모든 서열 다양성이 단일 길이의 긴 H3 루프에서 집중되도록 만들어질 수 있다. 인간 Vκ와 Vλ 분절은 클로닝되고 염기서열분석되며 (Williams and Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)에서 보고됨), 합성 경쇄 레퍼토리를 제조하는 데 이용될 수 있다. 합성 V 유전자 레퍼토리는 다양한 VH와 VL 접힘 및 L3과 H3 길이에 근거하여, 상당한 구조적 다양성의 항체를 인코딩할 것이다. V-유전자 인코딩 DNA의 증폭 이후에, 생식계열 V-유전자 분절이 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)의 방법에 따라서 시험관내에서 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 VH와 VL 유전자 레퍼토리를 여러 방식으로 함께 조합함으로써 구축될 수 있다. 각 레퍼토리는 상이한 벡터에서 창출될 수 있고, 그리고 이들 벡터는 예를 들면, Hogrefe et al., Gene, 128: 119-126 (1993)에서 설명된 바와 같이 시험관내에서, 또는 조합 감염, 예를 들면, Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)에서 설명된 loxP 시스템에 의해 생체내에서 재조합될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 대장균 (E. coli) 형질전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기에서 한계를 극복하기 위해 Fab 단편의 2-사슬 성질을 활용한다. 미경험 VH와 VL 레퍼토리는 별개로 클로닝되는데, 하나는 파지미드 내로, 그리고 다른 하나는 파지 벡터 내로 클로닝된다. 이들 2개의 라이브러리는 이후, 각 세포가 상이한 조합을 내포하고 라이브러리 크기가 존재하는 세포의 숫자 (약 1012개 클론)에 의해서만 한정되도록, 파지미드-내포 세균의 파지 감염에 의해 조합된다. 양쪽 벡터는 VH와 VL 유전자가 단일 레플리콘 위에 재조합되고 파지 비리온 내로 공동 포장되도록, 생체내 재조합 신호를 내포한다. 이들 대량의 라이브러리는 우수한 친화성 (약 10-8 M의 Kd -1)의 다수의 다양한 항체를 제공한다.
대안으로, 이들 레퍼토리는 예를 들면, Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)에서 설명된 바와 같이 동일한 벡터 내로 순차적으로 클로닝되거나, 또는 예를 들면, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)에서 설명된 바와 같이 PCR에 의해 함께 조립되고, 그리고 이후 클로닝될 수도 있다. PCR 어셈블리는 또한, VH와 VL DNA를 유연한 펩티드 스페이서를 인코딩하는 DNA와 연결하여 단일 사슬 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하는 데 이용될 수 있다. 또 다른 기술에서, "세포내 PCR 어셈블리"가 Embleton et al., Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)에서 설명된 바와 같이 림프구 내에서 VH와 VL 유전자를 PCR에 의해 조합하고, 그리고 이후, 연결된 유전자의 레퍼토리를 클로닝하는 데 이용된다.
미경험 라이브러리에 의해 생산된 항체 (자연 또는 합성 중에서 어느 한 가지)는 중간 친화성 (약 106 내지 107 M-1의 Kd -1)일 수 있지만, 친화성 성숙 또한, Winter et al. (1994), 위와 같음에서 설명된 바와 같이 이차 라이브러리를 작제하고 이들로부터 재선별함으로써 시험관내에서 모의될 수 있다. 예를 들면, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)의 방법에서 또는 Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)의 방법에서 오류가 발생하기 쉬운 중합효소를 이용함으로써 돌연변이가 시험관내에서 무작위로 도입될 수 있다 (Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)에서 보고됨). 추가적으로, 예를 들면, 선별된 개별 Fv 클론에서, 관심되는 CDR에 걸쳐 있는 무작위 서열을 보유하는 프라이머로 PCR을 이용하여 하나 또는 그 이상의 CDR을 무작위로 돌연변이시키고, 그리고 더욱 높은 친화성 클론에 대해 선별검사함으로써 친화성 성숙이 수행될 수 있다. WO 9607754 (1996년 3월 14일 자 공개됨)는 경쇄 유전자의 라이브러리를 창출하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하기 위한 방법을 설명하였다. 다른 효과적인 접근법은 파지 전시에 의해 선별된 VH 또는 VL 도메인을 비면역성 공여자로부터 획득된 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 재결합시키고, 그리고 Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)에서 설명된 바와 같이 여러 라운드의 사슬 리셔플링에서 더욱 높은 친화성에 대해 선별검사하는 것이다. 이러한 기술은 약 10-9 M 또는 그 이하의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 허용한다.
라이브러리의 선별검사는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 항원이 흡착 평판의 웰을 코팅하는 데 이용되거나, 흡착 평판에 부착되거나 또는 세포 분류에서 이용된 숙주 세포 상에서 발현되거나, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드로 포획을 위해 비오틴에 접합되거나, 또는 파지 전시 라이브러리를 패닝하기 위한 임의의 다른 방법에서 이용될 수 있다.
파지 라이브러리 표본은 파지 입자의 적어도 일부를 흡착제와 결합시키는 데 적합한 조건 하에, 고정된 항원과 접촉된다. 통상적으로, pH, 이온 강도, 온도 등을 비롯한 조건은 생리학적 상태를 모의하도록 선별된다. 고체상에 결합된 파지는 세척되고, 그리고 이후, 예를 들면, Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)에서 설명된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들면, Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)에서 설명된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들면, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차에서 항원 경쟁에 의해 용리된다. 파지는 단일 라운드의 선별에서 20-1,000-배 농축될 수 있다. 게다가, 농축된 파지는 세균 배양 동안 성장되고 추가 라운드의 선별에 종속될 수 있다.
선별의 효율은 세척 동안 해리의 동역학, 그리고 단일 파지 상에서 복수의 항체 단편이 항원과 동시에 맞물릴 수 있는 지의 여부를 비롯한 많은 인자에 의존한다. 빠른 해리 동역학 (및 약한 결합 친화성)을 갖는 항체는 짧은 세척, 다가 파지 전시 및 고체상에서 항원의 높은 코팅 밀도의 이용에 의해 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파지를 안정시킬 뿐만 아니라 해리된 파지의 재결합에 우호적이다. 느린 해리 동역학 (및 우수한 결합 친화성)을 갖는 항체의 선별은 Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)에서 및 WO 92/09690에서 설명된 바와 같이 긴 세척 및 일가 파지 전시, 그리고 Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)에서 설명된 바와 같이 항원의 낮은 코팅 밀도의 이용에 의해 증진될 수 있다.
항원에 대한 상이한 친화성, 심지어 약간 다른 친화성을 갖는 파지 항체 사이에서 선별하는 것이 가능하다. 하지만, 선별된 항체의 무작위 돌연변이 (예를 들면, 일부 친화성 성숙 기술에서 수행된 바와 같이)는 많은 돌연변이체를 발생시킬 가능성이 높은데, 대부분은 항원에 결합하고 소수는 더욱 높은 친화성으로 결합한다. 항원을 제한하면, 희귀한 높은 친화성 파지가 경쟁에서 탈락될 수 있었다. 모든 더욱 높은 친화성 돌연변이체를 유지하기 위해, 파지는 과잉의 비오틴화된 항원과 함께 배양될 수 있지만, 상기 비오틴화된 항원은 항원에 대한 목표 몰 친화성 상수보다 더욱 낮은 몰 농도의 농도에서 존재한다. 높은 친화성-결합 파지는 이후, 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포획될 수 있다. 이런 "평형 포획"은 더욱 낮은 친화성을 갖는 엄청난 과잉의 파지로부터 적게는 2 배 높은 친화성을 갖는 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 민감도로, 항체가 그들의 결합 친화성에 따라서 선별될 수 있도록 한다. 고체상에 결합된 파지를 세척하는 데 이용되는 조건 또한, 해리 동역학의 기초에서 구별하기 위해 조정될 수 있다.
항-항원 클론은 활성에 근거하여 선별될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원 발명은 항원을 자연적으로 발현하는 생존 세포에 결합하거나, 또는 자유 유동하는 항원 또는 다른 세포 구조에 부착된 항원에 결합하는 항-항원 항체를 제공한다. 이런 항-항원 항체에 상응하는 Fv 클론은 (1) 전술된 바와 같이 파지 라이브러리로부터 항-항원 클론을 단리하고, 그리고 적합한 세균 숙주에서 개체군을 성장시킴으로써 파지 클론의 단리된 개체군을 임의적으로 증폭하며; (2) 차단과 비-차단 활성이 각각 요망되는 항원 및 두 번째 단백질을 선별하고; (3) 항-항원 파지 클론을 고정된 항원에 흡착하고; (4) 과잉의 두 번째 단백질을 이용하여, 두 번째 단백질의 결합 결정인자와 중첩되거나 또는 공유되는 항원 결합 결정인자를 인식하는 임의의 바람직하지 않은 클론을 용리하고; 그리고 (5) 단계 (4) 이후에 흡착된 상태로 남아있는 클론을 용리함으로써 선별될 수 있다. 임의적으로, 원하는 차단/비-차단 성질을 갖는 클론은 본원에서 설명된 선별 절차를 1회 또는 그 이상 반복함으로써 더욱 농축될 수 있다.
하이브리도마-유래된 단일클론 항체 또는 파지 전시 Fv 클론을 인코딩하는 DNA는 전통적인 절차를 이용하여 (예를 들면, 하이브리도마 또는 파지 DNA 주형으로부터 관심되는 중쇄와 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열분석된다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있으며, 이들 벡터는 이후, 재조합 숙주 세포에서 원하는 단일클론 항체의 합성을 획득하기 위해 숙주 세포, 예컨대 대장균 (E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 만약 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 항체-인코딩 DNA의 세균에서 재조합 발현에 관한 리뷰 논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) 및 Pluckthun, Immunol. Revs, 130: 151 (1992)을 포함한다.
Fv 클론을 인코딩하는 DNA는 완전한 또는 부분적인 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 클론을 형성하기 위해, 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 공지된 DNA 서열 (예를 들면, 적합한 DNA 서열은 Kabat et al., 위와 같음으로부터 획득될 수 있다)과 조합될 수 있다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 비롯하여, 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적에 이용될 수 있고, 그리고 이런 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 획득될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 한 가지 동물 (예컨대, 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유래되고, 그리고 이후, 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합되어 "하이브리드," 전장 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성하는 Fv 클론은 본원에서 이용된 바와 같이 "키메라" 및 "하이브리드" 항체의 정의 내에 포함된다. 일부 구체예에서, 인간 가변 DNA로부터 유래된 Fv 클론은 인간 불변 영역 DNA에 융합되어 완전한- 또는 부분적인-길이 인간 중쇄 및/또는 경쇄에 대한 코딩 서열(들)을 형성한다.
하이브리도마로부터 유래된 항-항원 항체를 인코딩하는 DNA는 또한, 예를 들면, 하이브리도마 클론으로부터 유래된 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄와 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환함으로써 변형될 수 있다 (예를 들면, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)의 방법의 경우에서와 같이). 하이브리도마- 또는 Fv 클론-유래된 항체 또는 단편을 인코딩하는 DNA는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 중에서 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결함으로써 더욱 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유래된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
(iv) 인간화 항체 및 인간 항체
비인간 항체를 인간화하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지된다. 예를 들면, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 이것 내로 도입된다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 "이입" 잔기로서 종종 지칭되는데, 이들은 전형적으로, "이입" 가변 도메인으로부터 획득된다. 인간화는 본질적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDRs 또는 CDR 서열로 치환함으로써 Winter 및 동료 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))의 방법에 따라서 수행될 수 있다. 따라서, 이런 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인의 훨씬 적은 부분이 비인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (U.S. 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로, 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.
인간화 항체를 만드는 데 이용되는 인간 가변 도메인 (경쇄와 중쇄 둘 모두)의 선택은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 이른바 "최고 적합" 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별검사된다. 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열은 이후, 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 (FR)로서 인정된다 (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 여러 상이한 인간화 항체에 이용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 우호적인 생물학적 성질을 유지하면서 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 상기 방법의 한 구체예에 따라서, 인간화 항체는 부모 서열, 그리고 부모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모형을 이용한 다양한 개념적 인간화 산물의 분석의 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모형은 통상적으로 가용하고 당업자에게 익숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 개연적인 3차원 입체형태 구조를 예시하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 가용하다. 이들 전시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상 역할의 분석, 다시 말하면, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성되도록 수용자 및 이입 서열로부터 선별되고 조합될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 주는데 직접적으로 및 가장 실제적으로 관련된다.
본원에서 설명된 제제와 조성물에서 인간 항체는 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 전술된 바와 같은 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 작제될 수 있다. 대안으로, 인간 단일클론 항체는 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주는 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)에 의해 설명되었다.
면역화 시에, 내인성 면역글로불린 생산의 부재에서 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자도입 동물 (예를 들면, 생쥐)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 생쥐에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생산의 완전한 저해를 유발하는 것으로 설명되었다. 이런 생식계열 돌연변이체 생쥐 내에 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격 시에 인간 항체의 생산을 유발할 것이다. 참조: 예를 들면, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 및 Duchosal et al. Nature 355:258 (1992).
유전자 셔플링이 또한, 비인간, 예를 들면, 설치류 항체로부터 인간 항체를 도출하는 데 이용될 수 있는데, 여기서 인간 항체는 시작 비인간 항체와 유사한 친화성과 특이성을 갖는다. "에피토프 각인"으로 또한 불리는 이러한 방법에 따라서, 본원에서 설명된 바와 같은 파지 전시 기술에 의해 획득된 비인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 중에서 어느 한 가지가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 비인간 사슬/인간 사슬 scFv 또는 Fab 키메라의 개체군이 창출된다. 항원으로 선별은 비인간 사슬/인간 사슬 키메라 scFv 또는 Fab의 단리를 유발하는데, 여기서 인간 사슬은 일차 파지 전시 클론에서 상응하는 비인간 사슬의 제거 시에, 파괴된 항원 결합 부위를 복원한다, 다시 말하면, 에피토프가 인간 사슬 파트너의 선택을 지배한다 (각인시킨다). 나머지 비인간 사슬을 대체하기 위해 상기 과정이 반복될 때, 인간 항체가 획득된다 (참조: 1993년 4월 1일 자 공개된 PCT WO 93/06213). CDR 합체에 의한 비인간 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이러한 기술은 비인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기를 갖지 않는 완전 인간 항체를 제공한다.
(v) 항체 단편
항체 단편은 전통적인 수단, 예컨대 효소적 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 산출될 수 있다. 일정한 환경에서는 전체 항체보다 항체 단편을 이용하는 것이 이점이 있다. 단편의 더욱 작은 크기는 신속한 청소를 허용하고, 그리고 고형 종양에 대한 향상된 접근을 야기할 수 있다. 일정한 항체 단편에 관한 리뷰를 위해, Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134를 참조한다.
항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 도출되었다 (예를 들면, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)을 참조한다). 하지만, 이들 단편은 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 대장균 (E. coli)에서 발현되고 이들로부터 분비될 수 있고, 따라서 이들 단편의 손쉬운 대량 생산을 허용한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안으로, Fab'-SH 단편은 대장균 (E. coli)으로부터 직접적으로 회수되고 화학적으로 연계되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따라서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는, 생체내에서 증가된 반감기를 갖는 Fab와 F(ab')2 단편은 U.S. 특허 번호 5,869,046 에서 설명된다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 일부 구체예에서, 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. 참조: WO 93/16185; U.S. 특허 번호 5,571,894; 및 5,587,458. Fv 및 scFv는 불변 영역을 결여하는 무손상 조합 부위를 갖는 유일한 종류들이다; 따라서, 이들은 생체내 이용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합할 수 있다. scFv 융합 단백질은 scFv의 아미노 또는 카르복시 말단 중 어느 한 가지에서 작동체 단백질의 융합을 산출하기 위해 작제될 수 있다. 참조: Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 위와 같음. 항체 단편은 또한, 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,641,870에서 설명된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 이런 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
(vi) 다중특이적 항체
다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는데, 여기서 이들 에피토프는 통상적으로 상이한 항원으로부터 유래된다. 이런 분자는 정상적으로는 2개의 상이한 에피토프 (다시 말하면, 이중특이적 항체, BsAbs)에만 결합할 것이지만, 본원에서 이용될 때 이러한 표현은 추가 특이성을 갖는 항체, 예컨대 삼중특이적 항체를 포괄한다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체를 만들기 위한 방법은 당해 분야에서 공지된다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초되는데, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 조합 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하는데, 이들 중에서 단지 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 행위되는 정확한 분자의 정제는 상당히 번거롭고, 그리고 산물 수율이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829에서 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)에서 개시된다.
상이한 접근법에 따라서, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 이들 융합 중에서 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 내포하는 첫 번째 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 전형적이다. 면역글로불린 중쇄 융합 및 원하는 경우에, 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 그리고 적합한 숙주 생명체 내로 동시형질감염된다. 이것은 작제에서 이용된 3개 폴리펩티드 사슬의 부동 비율이 최적 수율을 제공하는 구체예에서 이들 3개 폴리펩티드 단편의 상호간의 비율을 조정하는 데 상당한 유연성을 제공한다. 하지만, 동등한 비율에서 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 유발하거나 또는 이들 비율이 특별한 의미가 없을 때, 2개 폴리펩티드 사슬 또는 3개 폴리펩티드 사슬 전부에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근법의 한 구체예에서, 이중특이적 항체는 한쪽 팔에서 첫 번째 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 그리고 다른 팔에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (두 번째 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 이중특이적 분자의 단지 한쪽 절반에서만 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 손쉬운 방식을 제공하기 때문이다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에서 개시된다. 이중특이적 항체를 산출하는 것에 관한 추가 상세를 위해, 예를 들면 Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)을 참조한다.
WO96/27011에서 설명된 다른 접근법에 따라서, 한 쌍의 항체 분자 사이에 인터페이스는 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 이종이합체의 백분율을 최대화하도록 가공될 수 있다. 한 가지 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 첫 번째 항체 분자의 인터페이스로부터 하나 또는 그 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더욱 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 "공동" 은 큰 아미노산 측쇄를 더욱 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 두 번째 항체 분자의 인터페이스에서 창출된다. 이것은 다른 원치 않는 최종 산물, 예컨대 동종이합체에 비하여 이종이합체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이적 항체는 교차연결된 또는 "헤테로접합체" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로접합체 내에 항체 중에서 한 가지는 아비딘에 연계될 수 있고, 다른 것은 비오틴에 연계될 수 있다. 이런 항체는 예를 들면, 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화 (U.S. 특허 번호 4,676,980)하고, 그리고 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089)를 위한 것으로 제안되었다. 헤테로접합체 항체는 임의의 편의한 교차연결 방법을 이용하여 만들어질 수 있다. 적합한 교차연결 작용제는 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 다수의 교차연결 기술과 함께, U.S. 특허 번호 4,676,980에서 개시된다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 산출하기 위한 기술 또한 기존 문헌에서 설명되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조될 수 있다. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)은 무손상 항체가 단백질분해적으로 개열되어 F(ab')2 단편이 산출되는 절차를 설명한다. 이들 단편은 인접 디티올을 안정시키고 분자간 이황화물 형성을 예방하기 위한 디티올 복합화 작용제 아비산나트륨의 존재에서 환원된다. 산출된 Fab' 단편은 이후, 티오니트로벤조산염 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중에서 한 가지는 이후, 메르캅토에틸아민으로 환원에 의해 Fab'-티올로 다시 전환되고, 그리고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 이용될 수 있다.
최근의 진전은 대장균 (E. coli)으로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 가능하게 하였는데, 이들 단편은 화학적으로 연계되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)는 완전 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 설명한다. 각 Fab' 단편은 대장균 (E. coli)으로부터 별개로 분비되고, 그리고 시험관내에서 지향된 화학적 연계에 종속되어 이중특이적 항체가 형성되었다.
재조합 세포 배양액으로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 만들고 단리하기 위한 다양한 기술 역시 설명되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생산되었다. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Fos와 Jun 단백질로부터 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동종이합체는 힌지 영역에서 환원되어 단량체가 형성되고, 그리고 이후, 재산화되어 항체 이종이합체가 형성되었다. 이러한 방법은 항체 동종이합체의 생산에도 활용될 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 의해 설명된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만들기 위한 대안 기전을 제공하였다. 이들 단편은 동일한 사슬 상에서 2개의 도메인 사이의 대합을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한쪽 단편의 VH와 VL 도메인은 다른 단편의 상보성 VL과 VH 도메인과 대합을 이루도록 강제되고, 따라서 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체의 이용에 의해 이중특이적 항체 단편을 만들기 위한 다른 전략 역시 보고되었다. 참조: Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).
2 이상의 결합가를 갖는 항체가 예기된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) 단일 도메인 항체
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체는 단일 도메인 항체이다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 일부 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,248,516 B1을 참조한다). 한 구체예에서, 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부로 구성된다.
(viii) 항체 변이체
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 예기된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변화를 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 만들어지는 시점에 요지 항체 아미노산 서열에서 도입될 수 있다.
(ix) 항체 유도체
본원 발명의 제제와 조성물에서 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체 중에서 어느 한 가지), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
(x) 벡터, 숙주 세포, 그리고 재조합 방법
항체는 또한 재조합 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 항-항원 항체의 재조합 생산을 위해, 상기 항체를 인코딩하는 핵산은 단리되고, 그리고 추가 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입된다. 항체를 인코딩하는 DNA는 전통적인 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 가용하다. 벡터 성분은 일반적으로, 다음 중에서 한 가지 또는 그 이상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 또는 그 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 그리고 전사 종결 서열.
(a) 신호 서열 성분
본원에서 설명된 제제와 조성물에서 항체는 직접적으로뿐만 아니라 이종성 폴리펩티드, 바람직하게는, 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N 말단에서 특이적 개열 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 선별된 이종성 신호 서열은 바람직하게는, 숙주 세포에 의해 인식되고 처리되는 (예를 들면, 신호 펩티드분해효소에 의해 개열되는) 것이다. 선천적 항체 신호 서열을 인식하고 처리하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우에, 신호 서열은 예를 들면, 알칼리 인산분해효소, 페니실린분해효소, Ipp, 또는 열저항 장독소 II 리더의 군에서 선택되는 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비의 경우에 선천적 신호 서열은 예를 들면, 효모 전화효소 리더, 인자 리더 (사카로미세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더 포함), 또는 산성 인산분해효소 리더, 칸디다 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라아제 리더, 또는 WO 90/13646에서 설명된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들면, 단순 포진 gD 신호가 가용하다.
(b) 복제 기점
발현과 클로닝 벡터 둘 모두 벡터가 하나 또는 그 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제하는 것을 가능하게 하는 핵산 서열을 내포한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 관계없이 복제할 수 있게 하고, 그리고 복제 기점 또는 자율적으로 복제하는 서열을 포함하는 것이다. 이런 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터 복제 기점은 대부분의 그람 음성균에 적합하고, 2μ 플라스미드로부터 복제 기점은 효모에 적합하고, 그리고 다양한 바이러스 복제 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유류 발현 벡터의 경우에 필요하지 않다 (SV40 복제 기점은 단지 이것이 초기 프로모터를 내포하기 때문에, 전형적으로 이용될 수 있다).
(c) 선별 유전자 성분
발현과 클로닝 벡터는 선별가능 마커로 또한 명명되는 선별 유전자를 내포할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉사트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결함을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 가용하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다 (예를 들면, 바실루스의 경우에 D-알라닌 라세미화효소를 인코딩하는 유전자).
선별 계획의 한 가지 실례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 활용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환되는 세포는 약제 내성을 부여하는 단백질을 생산하고, 그리고 따라서, 선별 섭생에서 생존한다. 이런 우성 선별의 실례는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 히그로마이신을 이용한다.
포유류 세포에 대한 적합한 선별가능 마커의 다른 실례는 항체-인코딩 핵산을 흡수하는 데 적격인 세포의 확인을 가능하게 하는 것들, 예컨대 DHFR, 글루타민 합성효소 (GS), 티미딘 키나아제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 탈아미노효소, 오르니틴 탈카르복실화효소 등이다.
예를 들면, DHFR 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉사트 (Mtx)를 내포하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에, DHFR 유전자는 임의의 다른 공동형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. 내인성 DHFR 활성에서 결함되는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들면, ATCC CRL-9096)가 이용될 수 있다.
대안으로, GS 유전자로 형질전환된 세포는 GS의 저해제인 L-메티오닌 술폭시민 (Msx)을 내포하는 배양 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 확인된다. 이들 조건 하에, GS 유전자는 임의의 다른 공동형질전환된 핵산과 함께 증폭된다. GS 선별/증폭 시스템은 전술된 DHFR 선별/증폭 시스템과 병용될 수 있다.
대안으로, 관심되는 항체, 야생형 DHFR 유전자, 그리고 다른 선별가능 마커, 예컨대 아미노글리코시드 3'-인산전달효소 (APH)를 인코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 공동형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 내포하는 야생형 숙주)는 선별가능 마커, 예컨대 아미노글리코시딕 항균제, 예를 들면 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대한 선별 작용제를 내포하는 배지에서 세포 성장에 의해 선별될 수 있다. 참조: U.S. 특허 번호 4,965,199.
효모에서 이용을 위한 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7 내에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력을 결여하는 효모의 돌연변이 균주에 대한 선별 마커, 예를 들면, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1을 제공한다. Jones, Genetics, 85:12 (1977). 효모 숙주 세포 유전체에서 trp1 병변의 존재는 이후, 트립토판의 부재에서 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결함성 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.
이에 더하여, 1.6 μm 환상 플라스미드 pKD1로부터 유래된 벡터가 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 효모의 형질전환에 이용될 수 있다. 대안으로, 재조합 송아지 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템이 클루이베로미세스 락티스 (K. lactis)에 대해 보고되었다. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). 클루이베로미세스 (Kluyveromyces)의 산업용 균주에 의한 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정된 멀티-사본 발현 벡터 또한 개시되었다. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).
(d) 프로모터 성분
발현과 클로닝 벡터는 일반적으로, 숙주 생명체에 의해 인식되고 항체를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 내포한다. 원핵 숙주에서 이용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 인산분해효소 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 그리고 하이브리드 프로모터, 예컨대 tac 프로모터를 포함한다. 하지만, 다른 공지된 세균 프로모터가 적합하다. 세균 시스템에서 이용을 위한 프로모터는 또한, 항체를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인 달가노 (S.D.) 서열을 내포할 것이다.
진핵생물에 대한 프로모터 서열은 알려져 있다. 사실상 모든 진핵 유전자가 전사가 시작되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치된 AT-풍부한 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사의 시작으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CNCAAT 영역인데, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 단부에는 AATAAA 서열이 있는데, 이것은 코딩 서열의 3' 단부에 폴리 A 꼬리의 부가를 위한 신호일 수 있다. 이들 모든 서열은 진핵 발현 벡터 내로 적절하게 삽입된다.
효모 숙주에서 이용하기 적합한 프로모터 서열의 실례는 3-포스포글리세린산 키나아제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 에놀라아제, 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소, 헥소키나아제, 피루브산염 탈카르복실화효소, 포스포프룩토키나아제, 글루코오스-6-인산염 이성화효소, 3-포스포글리세린산 무타아제, 피루브산 키나아제, 삼탄당인산염 이성화효소, 포스포글루코오스 이성화효소 및 글루코키나아제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산성 인산분해효소, 질소 물질대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소, 그리고 말토오스와 갈락토오스 활용을 책임지는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 이용을 위한 적합한 벡터와 프로모터는 EP 73,657에서 더욱 설명된다. 효모 인핸서 또한, 효모 프로모터와 함께 유리하게 이용된다.
포유류 숙주 세포에서 벡터로부터 항체 전사는 예를 들면, 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두바이러스, 아데노바이러스 (예컨대, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 유인원 바이러스 40 (SV40)의 유전체로부터, 또는 이종성 포유류 프로모터, 예를 들면 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 획득된 프로모터에 의해 제어될 수 있는데, 단서로써 이런 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립해야 한다.
SV40 바이러스의 초기와 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 내포하는 SV40 제한 단편으로서 편의하게 획득된다. 인간 시토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편의하게 획득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 이용하여 포유류 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 U.S. 특허 번호 4,419,446에서 개시된다. 이러한 시스템의 변형은 U.S. 특허 번호 4,601,978에서 설명된다. 단순 헤르페스 바이러스로부터 티미딘 키나아제 프로모터의 제어 하에 생쥐 세포에서 인간 β-인터페론 cDNA의 발현에 관해 Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)을 또한 참조한다. 대안으로, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복이 프로모터로서 이용될 수 있다.
(e) 인핸서 요소 성분
고등 진핵생물에 의한 항체를 인코딩하는 DNA의 전사는 종종, 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 많은 인핸서 서열이 현재 알려져 있다. 하지만, 전형적으로, 진핵 세포 바이러스로부터 인핸서가 이용될 것이다. 실례는 복제 기점의 후기 측면에서 SV40 인핸서 (bp 100-270), 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측면에서 폴리오마 인핸서, 그리고 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵 프로모터의 활성화를 위한 증강 요소에 대해, Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)을 또한 참조한다. 인핸서는 항체-인코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에서 위치된다.
(f) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 생물체로부터 유핵 세포)에서 이용되는 발현 벡터는 또한, 전사의 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 내포할 것이다. 이런 서열은 통상적으로, 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 가용하다. 이들 영역은 항체를 인코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 분절을 내포한다. 한 가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(g) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
본원에서 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 또는 발현하기 위한 적합한 숙주 세포는 전술된 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이런 목적으로 적합한 원핵생물은 진정세균, 예컨대 그람 음성 또는 그람 양성 생물체, 예를 들면, 장내세균 (Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아 (Escherichia), 예를 들면 대장균 (E. coli), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들면 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들면 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella)뿐만 아니라 바실루스 (Bacilli), 예컨대 바실루스 서브틸리스 (B. subtilis) 및 바실루스 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들면, 1989년 4월 12일 자 공개된 DD 266,710에서 개시된 바실루스 리체니포르미스 (B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예컨대 녹농균 (P. aeruginosa) 및 스트렙토미세스 (Streptomyces)를 포함한다. 비록 다른 균주, 예컨대 대장균 (E. coli) B, 대장균 (E. coli) X1776 (ATCC 31,537) 및 대장균 (E. coli) W3110 (ATCC 27,325)이 적합하긴 하지만, 한 가지 바람직한 대장균 (E. coli) 클로닝 숙주는 대장균 (E. coli) 294 (ATCC 31,446)이다. 이들 실례는 제한하기 보다는 예시이다.
전장 항체, 항체 융합 단백질, 그리고 항체 단편은 특히 글리코실화 및 Fc 작동체 기능이 필요하지 않을 때, 예컨대 종양 세포 파괴에서 그 자체로 유용성을 보여주는 세포독성 작용제 (예를 들면, 독소)에 치료 항체가 접합될 때, 세균에서 생산될 수 있다. 전장 항체는 순환 동안 더욱 큰 반감기를 갖는다. 대장균 (E. coli)에서 생산은 더욱 빠르고 더욱 비용 효과적이다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,648,237 (Carter et. al.), U.S. 특허 번호 5,789,199 (Joly et al.), U.S. 특허 번호 5,840,523 (Simmons et al.)을 참조하는데, 이들은 발현과 분비를 최적화하기 위한 번역 개시 영역 (TIR) 및 신호 서열을 설명한다. 대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254를 또한 참조한다. 발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 대장균 (E. coli) 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 그리고 예를 들면, 아이소타입에 따라서 단백질 A 또는 G 칼럼을 통해 정제될 수 있다. 최종 정제는 예를 들면, CHO 세포에서 발현된 항체를 정제하기 위한 과정과 유사하게 실행될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 실모양 균류 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 사이에서 가장 흔히 이용되는 것이다. 하지만, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 통상적으로 가용하고 본원에서 유용하다, 예컨대 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로미세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 예를 들면 클루이베로미세스 락티스 (K. lactis), 클루이베로미세스 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로미세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로미세스 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로미세스 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로미세스 드라소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 클루이베로미세스 써모톨레란스 (K. Thermotolerans) 및 클루이베로미세스 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코더마 레시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬반니오미세스 (Schwanniomyces), 예컨대 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 그리고 실모양 균류, 예컨대 예를 들면 네우로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예컨대 아스페르길루스 니둘란스 (A. nidulans) 및 아스페르길루스 니게르 (A. niger)를 포함한다. 치료 단백질의 생산을 위한 효모 및 실모양 균류의 이용을 논의하는 리뷰를 위해, 예를 들면, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)를 참조한다.
글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 유발하는 일정한 균류 및 효모 균주가 선별될 수 있다. 참조: 예를 들면, Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) (피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서 글리코실화 경로의 인간화를 설명); 그리고 Gerngross et al., 위와 같음.
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 숙주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (애벌레), 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 노랑초파리 (Drosophila melanogaster) (초파리), 그리고 누에나방 (Bombyx mori)으로부터 다양한 바쿨로바이러스 계열과 변이체 및 상응하는 허용적 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 계열, 예를 들면, 아우토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 누에나방 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 계열은 공개적으로 가용하고, 그리고 이런 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위한, 본원에서 본원 발명에 따른 바이러스로서 이용될 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 부평초 (렘나세아에 (Leninaceae)), 알팔파 (메디카고 트룬카툴라 (M. truncatula)), 그리고 담배의 식물 세포 배양액 또한 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명).
척추동물 세포가 숙주로서 이용될 수 있고, 그리고 배양 (조직 배양) 중인 척추동물 세포의 증식은 일과적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양에서 성장을 위해 하위클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 생쥐 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 라인 (Hep G2)이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 리뷰를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268을 참조한다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 그리고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭하는 데 타당하면 변형된 전통적인 영양 배지에서 배양된다.
(h) 숙주 세포 배양
항체를 생산하는 데 이용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 가용한 배지, 예컨대 Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 ((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 이에 더하여, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 U.S. 특허 공보 30,985에서 설명된 배지 중에서 한 가지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 이용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도에서 존재하는 무기 화합물로서 규정됨), 그리고 글루코오스 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물 또한, 당업자에게 공지될 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선별된 숙주 세포에서 기존에 이용된 것들이고, 그리고 당업자에게 명백할 것이다.
(xi) 항체의 정제
재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포내에서 생산되거나, 원형질막주위 공간에서 생산되거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되면, 첫 번째 단계로서, 미립자 조직파편 (숙주 세포 또는 용해된 단편)이 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)은 대장균 (E. coli)의 원형질막주위 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차를 설명한다. 간단히 말하면, 세포 페이스트는 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐 플루오르화물 (PMSF)의 존재에서 약 30 분에 걸쳐 해동된다. 세포 조직파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우에, 이런 발현 시스템으로부터 상층액은 일반적으로 먼저, 상업적으로 가용한 단백질 농축 필터, 예를 들면 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 농축된다. 단백질분해효소 저해제, 예컨대 PMSF가 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 전술한 단계에 포함될 수 있고, 그리고 항생제가 우발적인 오염체의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들면, 수산화인회석 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석, 그리고 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는데, 친화성 크로마토그래피가 전형적으로 바람직한 정제 단계 중에서 한 가지이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 근거되는 항체를 정제하는 데 이용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 생쥐 아이소타입 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). 단백질 L은 카파 경쇄에 근거된 항체를 정제하는 데 이용될 수 있다 (Nilson et al., J. Immunol. Meth. 164(1):33-40, 1993). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 주로 아가로오스이지만, 다른 매트릭스도 가용하다. 기계적으로 안정된 매트릭스, 예컨대 제어된 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로오스로 달성될 수 있는 것보다 더욱 빠른 유속 및 더욱 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우에, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)이 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온 교환 칼럼에서 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카에서 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM에서 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼)에서 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전 역시 회수되는 항체에 따라서 가용하다.
일반적으로, 전술된 방법론과 일치하는 및/또는 관심되는 특정 항체에 대해 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는, 연구, 검사 및 클리닉에서 이용을 위한 항체를 제조하기 위한 다양한 방법론은 당해 분야에서 충분히 확립된다.
B. 생물학적으로 활성 항체 선별
전술된 바와 같이 생산된 항체는 치료적 관점으로부터 유익한 성질을 갖는 항체를 선별하기 위해 한 가지 또는 그 이상의 "생물학적 활성" 검정에 종속될 수 있다. 항체는 자신이 조성된 항원에 결합하는 능력에 대해 선별검사될 수 있다. 예를 들면, 항-DR5 항체 (예를 들면, 드로지투맙)의 경우에, 상기 항체의 항원 결합 성질은 사멸 수용체 5 (DR5)에 결합하는 능력을 검출하는 검정에서 평가될 수 있다.
다른 구체예에서, 항체의 친화성은 예를 들면, 포화 결합; ELISA; 및/또는 경쟁 검정 (예를 들면, RIA의)에 의해 결정될 수 있다.
또한, 항체는 예를 들면, 치료제로서 이의 유용성을 평가하기 위해, 다른 생물학적 활성 검정에 종속될 수도 있다. 이런 검정은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 상기 항체에 대한 표적 항원 및 의도된 용도에 의존한다.
관심되는 항원 상에서 특정 에피토프에 결합하는 항체를 선별검사하기 위해, 일과적인 교차 차단 검정, 예컨대 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에서 설명된 것이 수행될 수 있다. 대안으로, 항체가 관심되는 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위해, 예를 들면, Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)에서 설명된 바와 같은 에피토프 지도화가 수행될 수 있다.
III. 제제를 제조하는 방법
본원 발명의 일정한 양상은 본원에서 설명된 임의의 액체 제제를 제조하는 방법에 관계한다. 액체 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 폴리펩티드를 NAT 및 L-메티오닌과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 조제되는 폴리펩티드는 사전 동결 건조에 종속되지 않았고, 그리고 본원에서 관심되는 제제는 수성 제제이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 치료 단백질이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 추가 구체예에서, 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항체는 전장 항체이다. 일부 구체예에서, 제제에서 항체는 항체 단편, 예컨대 F(ab')2이고, 이러한 사례에서 전장 항체에 대해 발생할 수 없는 문제 (예컨대, Fab에 대한 상기 항체의 클리핑)가 다뤄질 필요가 있을 수 있다. 제제 내에 존재하는 폴리펩티드의 치료 효과량은 예를 들면, 투여의 원하는 용량 용적 및 양식(들)을 고려함으로써 결정된다. 제제에서 예시적인 폴리펩티드 농도는 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL 이상, 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 250 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 약 225 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 약 200 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 175 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 150 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 또는 약 45 mg/mL 내지 약 55 mg/mL을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 폴리펩티드는 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 단백질 내에 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판 및/또는 티로신에서 선택되는 아미노산 중에서 한 가지 또는 그 이상이 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판이 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌이 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 및 하나 또는 그 이상의 메티오닌이 산화에 민감성이다.
일부 구체예에서, 액체 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제, 예컨대 안정제, 완충액, 계면활성제 및/또는 긴장성 작용제를 더욱 포함한다. 본원 발명의 액체 제제는 pH-완충된 용액에서 제조된다. 본원 발명의 완충액은 약 4.0 내지 약 9.0의 범위에서 pH를 갖는다. 일부 구체예에서 pH는 pH 4.0 내지 8.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 8.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 7.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 7.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 6.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 6.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 5.5의 범위 안에, pH 4.0 내지 5.0의 범위 안에, pH 4.0 내지 4.5의 범위 안에, pH 4.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 5.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 5.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 6.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 6.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 7.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 7.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 8.0 내지 9.0의 범위 안에, pH 8.5 내지 9.0의 범위 안에, pH 5.7 내지 6.8의 범위 안에, pH 5.8 내지 6.5의 범위 안에, pH 5.9 내지 6.5의 범위 안에, pH 6.0 내지 6.5의 범위 안에, 또는 pH 6.2 내지 6.5의 범위 안에 있다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 액체 제제는 6.2 또는 약 6.2의 pH를 갖는다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 액체 제제는 6.0 또는 약 6.0의 pH를 갖는다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 액체 제제는 5.8 또는 약 5.8의 pH를 갖는다. 본원 발명의 일부 구체예에서, 액체 제제는 5.5 또는 약 5.5의 pH를 갖는다. pH를 이러한 범위 내에서 제어할 완충액의 실례는 유기와 무기 산 및 이들의 염을 포함한다. 예를 들면, 아세트산염 (예를 들면, 히스티딘 아세트산염, 아르기닌 아세트산염, 아세트산나트륨), 숙신산염 (예를 들면, 히스티딘 숙신산염, 아르기닌 숙신산염, 숙신산나트륨), 글루콘산염, 인산염, 푸마르산염, 옥살산염, 유산염, 구연산염, 그리고 이들의 조합. 완충액 농도는 예를 들면, 완충액 및 제제의 원하는 등장성에 따라서, 약 1 mM 내지 약 600 mM일 수 있다. 일부 구체예에서, 제제는 히스티딘 완충액 (예를 들면, 약 5 mM 내지 100 mM의 농도에서)을 포함한다. 히스티딘 완충액의 실례는 히스티딘 염화물, 히스티딘 아세트산염, 히스티딘 인산염, 히스티딘 황산염, 히스티딘 숙신산염 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 제제 내에 히스티딘은 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 35 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM 또는 약 20 mM 내지 약 25 mM이다. 추가 구체예에서, 제제 내에 아르기닌은 약 50 mM 내지 약 500 mM (예를 들면, 약 100 mM, 약 150 mM, 또는 약 200 mM)이다.
본원 발명의 액체 제제는 당류, 예컨대 이당류 (예를 들면, 트레할로스 또는 수크로오스)를 더욱 포함할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이 "당류"는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당 알코올, 환원당, 비환원 당 등을 비롯한, 일반적인 조성물 (CH2O)n 및 이의 유도체를 포함한다. 본원에서 당류의 실례는 글루코오스, 수크로오스, 트레할로스, 락토오스, 프룩토오스, 말토오스, 덱스트란, 글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 사일리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토오스, 라피노오스, 만노트리오스, 스타키오스, 말토오스, 락툴로오스, 말툴로오스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소말툴로오스 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 수크로오스를 포함한다.
계면활성제가 액체 제제에 임의적으로 첨가될 수 있다. 예시적인 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트 (예를 들면, 폴리소르베이트 20, 80 등) 또는 폴록사머 (예를 들면, 폴록사머 188 등)를 포함한다. 첨가되는 계면활성제의 양은 이것이 조제된 항체의 응집을 감소시키고 및/또는 제제에서 미립자의 형성을 최소화하고 및/또는 흡착을 감소시키도록 하는 정도이다. 예를 들면, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 1.0% 이상, 중량/용적의 양으로 제제 내에 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 1.0%, 약 0.001% 내지 약 0.5%, 약 0.005% 내지 약 0.2%, 약 0.01% 내지 약 0.1%, 약 0.02% 내지 약 0.06%, 또는 약 0.03% 내지 약 0.05%, 중량/용적의 양으로 제제 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 0.04% 또는 약 0.04%, 중량/용적의 양으로 제제 내에 존재한다. 일부 구체예에서, 계면활성제는 0.02% 또는 약 0.02%, 중량/용적의 양으로 제제 내에 존재한다. 한 구체예에서, 제제는 계면활성제를 포함하지 않는다.
한 구체예에서, 제제는 상기의 작용제 (예를 들면, 항체, 완충액, 당류 및/또는 계면활성제)를 내포하고, 그리고 한 가지 또는 그 이상의 보존제, 예컨대 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 클로로부탄올 및 벤제토늄 Cl가 본질적으로 없다. 다른 구체예에서, 보존제가 제제 내에 포함될 수 있는데, 특히 상기 제제가 다중용량 제제인 경우에 그러하다. 보존제의 농도는 약 0.1% 내지 약 2%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 약 1% 범위 안에 있을 수 있다. 제제의 원하는 특징에 부정적으로 영향을 주지 않는다면, 한 가지 또는 그 이상의 다른 제약학적으로 허용되는 운반체, 부형제 또는 안정제, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 설명된 것들이 제제 내에 포함될 수 있다. 본원에서 예시적인 제약학적으로 허용되는 부형제는 세포간 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 더욱 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 한 양상에서, sHASEGP는 한 가지 또는 그 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
제제는 금속 이온 킬레이터를 더욱 포함할 수 있다. 금속 이온 킬레이터는 당업자에 의해 널리 알려져 있고, 그리고 아미노폴리카르복실산염, EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), EGTA (에틸렌 글리콜-비스(베타-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산), NTA (니트릴로트리아세트산), EDDS (에틸렌 디아민 디숙신산염), PDTA (1,3-프로필렌디아민테트라아세트산), DTPA (디에틸렌트리아민펜타아세트산), ADA (베타-알라닌디아세트산), MGCA (메틸글리신디아세트산) 등을 포함하지만 이들에 반드시 한정되지는 않는다. 추가적으로, 본원에서 일부 구체예는 포스포네이트/포스폰산 킬레이터를 포함한다.
조성물에서 액체의 긴장성을 조정하거나 또는 유지하기 위해 긴장성 작용제가 존재한다. 큰, 하전된 생체분자, 예컨대 단백질 및 항체와 함께 이용될 때, 이들은 또한 "안정제"로서 역할을 할 수 있는데, 그 이유는 이들이 아미노산 측쇄의 하전된 기와 상호작용하고, 따라서 분자간 및 분자내 상호작용에 대한 가능성을 줄일 수 있기 때문이다. 긴장성 작용제는 다른 성분의 상대적 양을 고려하여, 중량으로 0.1% 내지 25% 사이에, 또는 더욱 바람직하게는 중량으로 1% 내지 5% 사이에 임의의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 긴장성 작용제는 다가 당 알코올, 바람직하게는 삼가 또는 그 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다.
본원에서 설명된 제제는 또한, 필요에 따라 치료되는 특정 징후에 대한 하나 이상의 폴리펩티드 또는 소형 분자 약물, 바람직하게는 다른 폴리펩티드에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 예를 들면, 항체가 항-DR5 (예를 들면, 드로지투맙)인 경우에, 이것은 다른 작용제 (예를 들면, 화학요법제 및 항신생물 작용제)와 병용될 수 있다.
일부 구체예에서, 제제는 생체내 투여를 위한 것이다. 일부 구체예에서, 제제는 무균이다. 제제는 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 무균이 되도록 만들어질 수 있다. 본원에서 치료 제제는 일반적으로 무균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내로 배치된다. 투여 루트는 공지되고 용인된 방법에 따른다, 예컨대 장기간에 걸쳐 적합한 방식으로 단일 또는 복수의 일시 주사 또는 주입, 예를 들면, 피하, 정맥내, 복막내, 근육내, 동맥내, 병소내, 관절내 또는 유리체내 루트, 국소 투여, 흡입에 의한, 또는 지속된 방출 또는 연장된 방출 수단에 의한 주사 또는 주입에 의한다.
본원 발명의 액체 제제는 보관 시에 안정될 수 있다. 일부 구체예에서, 액체 제제 내에 폴리펩티드는 약 0 내지 약 5℃ (예컨대, 약 1, 2, 3, 또는 4℃)에서 적어도 약 12 개월 (예컨대, 적어도 약 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36 개월, 또는 그 이상) 동안 보관 시에 안정된다. 일부 구체예에서, 액체 제제 내에 폴리펩티드의 물리적 안정성, 화학적 안정성, 또는 생물학적 활성이 평가되거나 또는 계측된다. 당해 분야에서 공지된 임의의 방법이 안정성 및 생물학적 활성을 평가하는 데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 안정성은 보관 후 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화에 의해 계측된다. 안정성은 조제의 전후에서뿐만 아니라 보관 이후에 제제에서 항체의 물리적 안정성, 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 평가함으로써 검사될 수 있다. 물리적 활성 및/또는 안정성은 응집체 형성의 평가 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여, 혼탁도를 계측함으로써 및/또는 시각적 검사에 의해); 양이온 교환 크로마토그래피 또는 모세관 구역 전기이동을 이용하여 전하 이질성을 사정함으로써; 아미노 말단 또는 카르복시 말단 서열 분석; 질량 분광계 분석; 환원된 항체 및 무손상 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 지도 (예를 들면, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 항체의 생물학적 활성 또는 항원 결합 기능을 평가하는 것 등을 비롯한, 다양한 상이한 방식으로 정성적으로 및/또는 정량적으로 평가될 수 있다. 불안정은 응집, 탈아미드화 (예를 들면, Asn 탈아미드화), 산화 (예를 들면, Trp 산화), 이성화 (예를 들면, Asp 이성화), 클리핑/가수분해/단편화 (예를 들면, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 대합되지 않은 시스테인(들), N 말단 연장, C 말단 처리, 글리코실화 차이 등을 유발할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질에서 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신분해 펩티드 지도화 중에서 한 가지 또는 그 이상을 이용하여 결정된다. 일부 구체예에서, 항체에서 산화는 RP-HPLC, LC/MS, 또는 트립신분해 펩티드 지도화 중에서 한 가지 또는 그 이상 및 하기 공식을 이용하여 백분율로서 결정된다:
Figure pct00003
Figure pct00004
액체 제제를 만들거나, 또는 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 예방하는 방법 역시 본원에서 제공되는데, 이들 방법은 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방하는 NAT 및 L-메티오닌의 양을 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 액체 제제는 항체를 포함한다. 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방하는 NAT 및 L-메티오닌의 양은 본원에서 개시된 임의의 양일 수 있다.
IV. 산화를 감소시키는 방법
본원 발명의 일정한 양상은 액체 제제 내에 폴리펩티드 (예를 들면, 본원에서 설명된 임의의 폴리펩티드)의 산화를 감소시키는 방법에 관계하는데, 이들 방법은 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나 또는 예방하는 NAT의 양 및 L-메티오닌의 양을 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, Nat 및 L-메티오닌을 포함하는 액체 제제는 본원에서 설명된 임의의 액체 제제이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌, 시스테인, 히스티딘, 트립토판 및/또는 티로신 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 및 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기가 산화에 민감성이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 제제는 본원에서 설명된 폴리펩티드 중에서 어느 것에 따른 적어도 하나의 추가 폴리펩티드를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 제제는 수성 제제이다. 일부 구체예에서, 제제는 제약학적 제제 (예를 들면, 인간 개체에게 투여에 적합)이다.
예를 들면, 본원 발명의 제제는 단일클론 항체, 단일클론 항체 (예를 들면, 항체 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 및 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기에서)의 산화를 예방하는 본원에서 제시된 바와 같은 NAT 및 L-메티오닌, 그리고 제제의 pH를 바람직한 수준으로 유지하는 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제제는 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.
일부 구체예에서, 제제에 첨가되는 NAT의 양은 본원에서 제공된 NAT의 농도 중에서 어느 것이다. 일부 구체예에서, 제제에 첨가되는 NAT의 양은 약 0.3 mM이다. 일부 구체예에서, 제제에 첨가되는 NAT의 양은 약 1.0 mM이다. 일부 구체예에서, NAT는 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체의 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기 중에서 어느 것)의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 산화 (예를 들면, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기의 산화)는 약 40% 내지 약 100%, 예컨대 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위까지 감소된다 (예를 들면, NAT를 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 트립토판 잔기와 비교하여). 일부 구체예에서, 폴리펩티드 중에서 약 40% 내지 약 0% 이내, 예컨대 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내가 산화된다 (예를 들면, 상기 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 트립토판 잔기에서 산화된다). 일부 구체예에서, NAT는 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 폴리펩티드의 산화를 예방한다.
일부 구체예에서, 제제에 첨가되는 L-메티오닌의 양은 본원에서 제공된 L-메티오닌의 농도 중에서 어느 것이다. 일부 구체예에서, 제제에 첨가되는 L-메티오닌의 양은 약 5.0 mM이다. 일부 구체예에서, L-메티오닌은 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 항체의 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기 중에서 어느 것)의 산화를 감소시키거나 또는 예방한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 산화 (예를 들면, 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기의 산화)는 약 40% 내지 약 100%, 예컨대 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위까지 감소된다 (예를 들면, L-메티오닌을 결여하는 액체 제제 내에 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 상응하는 메티오닌 잔기와 비교하여). 일부 구체예에서, 폴리펩티드 중에서 약 40% 내지 약 0% 이내, 예컨대 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0%, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위 이내가 산화된다 (예를 들면, 상기 폴리펩티드 내에 하나 또는 그 이상의 메티오닌 잔기에서 산화된다). 일부 구체예에서, L-메티오닌은 반응성 산소 종 (ROS)에 의한 폴리펩티드의 산화를 예방한다.
일부 구체예에서, 제제에서 폴리펩티드 (예를 들면, 항체) 농도는 본원에서 설명된 폴리펩티드 농도 중에서 어느 것 (예를 들면, 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL)이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적, 삼중특이적 등), 또는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 항체는 IgG1 항체 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 제제는 한 가지 또는 그 이상의 부형제를 더욱 포함한다. 예를 들면, 안정제, 완충액, 계면활성제, 긴장성 작용제, 그리고 이들의 임의의 조합을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 부형제가 본원에서 설명된 제제에서 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 제제는 대략, 본원에서 설명된 pH 중에서 어느 것 (예를 들면, 약 4.5 내지 약 7.0)의 pH를 갖는다.
V. 제제의 투여
본원 발명의 일정한 양상은 본원에서 설명된 임의의 제제를 개체에게 투여하는 것에 관계한다. 일부 구체예에서, 본원 발명의 액체 제제는 개체에게 투여에 적합한 약제 (예를 들면, 개체에서 암을 치료하거나 예방하기 위한)의 제조에서 이용될 수 있다. 액체 제제는 공지된 방법에 따라서, 예컨대 일시 주사로서 정맥내 투여에 의해, 또는 일정한 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해, 근육내, 복막내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소, 흡입, 또는 유리체내 루트에 의해, 폴리펩티드 (예를 들면, 항체)로 치료가 필요한 개체 (예를 들면, 인간)에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 액체 제제는 정맥내, 유리체내, 또는 피하 투여에 의해 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 액체 제제는 유리체내 투여에 의해 개체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 액체 제제는 피하 투여에 의해 개체에게 투여된다.
폴리펩티드의 적합한 용량 ("치료 효과량")은 예를 들면, 치료되는 질환, 질환의 심각도와 코스, 폴리펩티드가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는 지의 여부, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 폴리펩티드에 대한 반응, 이용되는 폴리펩티드의 유형, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 폴리펩티드는 적절하게는 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여되고, 그리고 진단으로부터 계속하여 임의의 시점에서 환자에게 투여될 수 있다. 폴리펩티드는 유일 치료제로서, 또는 문제되는 질환을 치료하는 데 유용한 다른 약물 또는 요법과 함께 투여될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 개체는 장애를 이미 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 개체를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이 "장애"는 개체를 문제되는 장애에 취약하게 만드는 병리학적 상태를 비롯한 만성과 급성 장애 또는 질환을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 치료로부터 이익을 얻을 임의의 상태이다.
약리학적 의미에서, 본원 발명의 맥락에서, 폴리펩티드 (예를 들면, 항체)의 "치료 효과량"은 항체 치료가 효과적인 장애의 예방 또는 치료에 효과적인 양을 지칭한다. 일부 구체예에서, 투여되는 폴리펩티드의 치료 효과량은 1회 또는 그 이상의 투여에 의하는 지에 상관없이, 환자 체중의 약 0.1 내지 약 50 mg/kg (예컨대, 약 0.3 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 0.3 내지 약 15 mg/kg)의 범위 안에 있을 것이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 치료 효과량은 일일량으로서, 또는 복수의 일일량으로서 투여된다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드의 치료 효과량은 매일보다 덜 빈번하게, 예컨대 주 1회 또는 월 1회 투여된다. 예를 들면, 폴리펩티드는 1 주 또는 그 이상마다 (예컨대 1, 2, 3 또는 4 주 또는 그 이상마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개월 또는 그 이상마다) 약 100 내지 약 400 mg (예컨대, 약 100, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 400 mg, 그리고 이들 값 사이에 임의의 범위)의 용량으로 투여될 수 있거나, 또는 1 주 또는 그 이상마다 (예컨대 1, 2, 3 또는 4 주 또는 그 이상마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개월 또는 그 이상마다) 약 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 15.0, 또는 20.0 mg/kg의 용량으로 투여된다. 용량은 단회 용량으로서, 또는 복수 용량 (예를 들면, 2, 3, 4회, 또는 그 이상의 용량), 예컨대 주입으로서 투여될 수 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술에 의해 쉽게 모니터링된다.
VI. 제조 물품 및 키트
본원 발명의 일정한 양상은 본원 발명의 임의의 액체 제제를 유지하는 용기를 포함하는 제조 물품 또는 키트에 관계한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알 및 주사기를 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 예시적인 용기는 2-20 cc 단일 이용 유리 바이알이다. 대안으로, 다중용량 제제의 경우에, 용기는 2-100 cc 유리 바이알일 수 있다. 용기는 제제를 유지하고, 그리고 용기 상에 또는 이와 결부된 라벨은 이용 방향을 지시할 수 있다. 제조 물품은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 그리고 사용설명서를 포함하는 포장 삽입물을 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, 제조 물품 또는 키트는 액체 제제의 이용을 위한 사용설명서를 포함하는 포장 삽입물을 더욱 포함한다. 포장 삽입물은 이런 치료적 산물의 이용과 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포하는, 치료적 산물의 상업적인 포장에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭할 수 있다.
다양한 목적, 예를 들면, 액체 제제 내에 폴리펩티드의 산화를 감소시키거나, 또는 폴리펩티드의 감소된 산화에 대해 액체 제제를 선별검사하는 데 유용한 키트 역시 제공된다. 본원 발명의 키트에서 공급된 사용설명서는 전형적으로, 라벨 또는 포장 삽입물 상에서 서면 사용설명서 (예를 들면, 키트 내에 포함된 페이퍼 시트)이지만, 기계-판독가능 사용설명서 (예를 들면, 자성 또는 광학적 저장 디스크에서 제공된 사용설명서) 또한 허용된다.
본 명세서는 당업자가 본원 발명을 실시할 수 있게 하는 데 충분한 것으로 고려된다. 본 명세서에서 도시되고 설명된 것들 이외에, 본원 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이고, 그리고 첨부된 청구항의 범위에 들어간다.
실시예
본원 발명은 하기 실시예를 참조하면 더욱 충분히 이해될 것이다. 하지만, 이들은 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 설명된 실시예와 구체예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그리고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화는 당업자에게 제시되고 본원의 기술적 사상과 이해범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예 1: 산화로부터 NAT 보호의 사정.
생물치료제 약물에 대한 제제 성분으로서 N-아세틸-DL-트립토판 (NAT) 및/또는 L-메티오닌의 항산화제 효능과 안전성을 사정하기 위해 하기의 연구가 수행되었다. 메티오닌과 트립토판 잔기 둘 모두를 산화할 수 있는 반응성 산소 종을 산출하는 아조 화합물인 2,2'-아조-비스(2-아미디노프로판) 중염산염 (AAPH) (Ji et al. (2009) J. Pharm. Sci. 98(12):4485-4500)뿐만 아니라 광 노출이 하기의 연구를 위한 산화 모형으로서 선별되었는데, 그 이유는 이들이 항체가 제조 및/또는 장기간 보관 동안 노출될 수 있는 통상적인 산화 경로를 대표하였기 때문이다 (Grewal et al. (2014) Mol. Pharm. 11(4):1259-1272).
재료와 방법
재료
MAb1 및 mAb2는 산화 민감성인 트립토판과 메티오닌 잔기를 포함하는 IgG1 단일클론 항체이다 (Dion et al., 원고 준비 중). 이들 mAb는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 일련의 크로마토그래피 단계에 의해 정제되고, 그리고 별도로 명시되지 않으면, 계면활성제 또는 다른 부형제 없이 pH 5.5에서 낮은 이온 강도 아세트산나트륨 완충액에서 조제되었다.
L-메티오닌 및 N-아세틸-DL-트립토판 (NAT)은 Ajinomoto North America (Raleigh, NC)로부터 구입되었다. 2,2'-아조-비스(2-아미디노프로판) 중염산염 (AAPH)는 Calbiochem (La Jolla, CA)으로부터 구입되었다. 트립신 (질량 분광분석법 등급)은 Promega (Madison, WI)로부터 구입되었다. 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)-등급 아세토니트릴 및 물은 Fisher Scientific (Fairlawn, NJ)로부터 구입되었다. 완충액-제조에 이용된 물은 Milli-Q 정제 시스템 (Millipore, Bedford, MA)으로부터 획득되었다.
NAT 항산화제 효능의 평가
산화-민감성 잔기의 확인과 모니터링
항체는 산화에 민감한 CDR과 Fc 잔기를 확인하기 위해, AAPH 스트레스, 그 이후에 펩티드 지도화에 종속되었다 (Dion et al., 원고 준비 중). Kabat 넘버링은 가변 단편 (Fv) 잔기를 확인하는 데 이용되었고, 반면 EU 명명법 (Edelman et al. (1969) Proc Natl Acad Sci USA 63(1):78-85)은 Fc 잔기를 확인하는 데 이용되었다. 만약 잔기가 대조에 비하여 >5% 산화되면, 이것은 민감한 것으로 간주되고 실험의 코스 내내 모니터링되었다. 펩티드 지도화 및 분석 정보는 Dion et al. (원고 준비 중)에서 보고된 바와 같았다. 간단히 말하면, 표본은 변성되고, 환원되고, 카르복실메틸화되고, 트립신 소화에 종속되었다. 펩티드는 Thermo Q Exactive Plus 고해상 질량분광계에 연계된 Waters Acquity H-Class UHPLC 상에서 물/아세토니트릴/포름산 구배를 이용하여 Acquity UPLC 펩티드 CSH C18 칼럼에서 분리되었다. 데이터는 Thermo Scientific PepFinder™ 및 Xcalibur™ 소프트웨어를 이용하여 처리되었다. 통합은 선천적 및 산화된 펩티드에 대한 가장 풍부한 전하 상태(들)를 이용한 단일동위원소 m/z의 이온 추출 크로마토그램에서 수행되었다. 산화 퍼센트는 산화된 펩티드의 피크 면적을 선천적 및 산화된 펩티드의 합계된 피크 면적으로 나눔으로써 계산되었다. 주요 트립토판 분해 산물 (고도로 산화된 부위에 대한 +4, +20 및 +48에 더하여 +16 및 +32)은 합계되고 트립토판 산화를 계산하는 데 이용되었다. 메티오닌 술폭시드 (M+16)만 메티오닌 산화를 계산하는 데 이용되었는데, 그 이유는 메티오닌 술폰 (M+32)이 이들 조건 하에 관찰되지 않았기 때문이다. 이들 2가지 소프트웨어 패키지가 상이한 해답을 제공하는 경우에, 데이터의 수동 검사 후 Xcalibur™ 데이터가 보고되었다.
AAPH 화학적 산화 스트레스 모형
항체는 2cc 유리 바이알에서 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5에서 1 mg/mL의 최종 농도로 제조되었다. NAT는 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5에서 3 mM NAT의 원액으로부터 0.05 mM 및 0.3 mM의 최종 농도로 첨가되었다. L-메티오닌은 특정된 표본에 대해, 20 mM 아세트산나트륨, pH 5.5에서 50 mM 원액으로부터 5 mM의 최종 농도로 첨가되었다. 11 mM의 원액으로부터 AAPH는 1 mM의 최종 농도로 첨가되었다. 대조 표본의 경우에 AAPH 대신에 동등 용적의 물이 단백질 분취량에 첨가되었다. AAPH 또는 물의 첨가 이후에, 표본은 40℃에서 16 시간 동안 배양되었다. 대조 표본은 또한, -70℃에서 즉시 동결되었다. 유리 라디칼-산출 반응물은 20:1 L-메티오닌 대 AAPH의 비율에서 L-메티오닌으로 퀀칭되었고, 그리고 각 표본은 이후, PD-10 칼럼 (GE Healthcare)을 이용하여 조제 완충액 (20 mM 아세트산나트륨, 100 mM 수크로오스, pH 5.5)으로 완충액 교체되고, 그리고 LC-MS 펩티드 지도화를 통한 분석에 대비하여 Amicon Ultra 원심 필터 (EMD Millipore)를 이용하여 10 mg/mL의 최종 농도로 농축되었다.
광 노출 스트레스 모형
유리 바이알에서 10 mg/mL에서 표본을, 300 킬로럭스-시간 가시광선 및 50 Wㆍh/m2의 근거리 UV (320-400 nm) 광의 총 선량으로 Atlas SunTest CPS+ Xenon 라이트 상자 (Chicago, IL)에서 광에 노출시킴으로써 광안정성 연구가 수행되었다. NAT는 전술된 원액으로부터 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 또는 1.0 mM의 최종 농도로 첨가되었다. 대조 표본은 알루미늄 포일에 감싸지고 실험 바이알과 나란히 배치되었다. 노출 이후에, 표본은 LC-MS 펩티드 지도화를 통한 분석에 대비하여 -70℃에서 보관되었다.
NAT 및 L-메티오닌의 안전성 사정
인실리코 돌연변이유발성과 발암성 예측
Derek Nexus (프로그램 버전 2.0.2.201111291322; Lhasa Limited, Leeds, UK) 및 Leadscope® (Model Applier 버전 1.5.0; Leadscope Inc., Columbus, OH) 인실리코 모형화 도구를 이용하여 NAT의 돌연변이유발성과 발암성 잠재력이 사정되었다.
시험관내 수용체 결합 및 기능 사정
NAT의 활성이 결합, 세포와 핵 수용체 기능과 조직 생물학적 검정에서 사정되었다. 뉴로키닌-1 (NK-1) 수용체에 결합이 상기 수용체를 내생적으로 발현하는 U373MG 인간 성상세포종 세포에서 사정되고 (Eistetter et al. (1992) Functional characterization of Neurokinin-1 receptors on human U373MG astrocytoma cells. Glia 6(2):89-95; Heuillet et al. (1993) J. Neurochem 60(3):868-876), 그리고 참조 효현제 [Sar9, Met(O2)11]-SP 또는 참조 길항제 L 733,060와 비교되었다. NAT 또는 참조 화합물은 실온에서 U373MG 세포와 함께 배양되었다; 모든 농도는 이중으로 검정되었다.
NK-1 수용체를 통해 작용하는 물질 P는 인간 및 비임상 종 둘 모두에서 혈관 긴장도를 조절하는 것으로 밝혀졌다 (Coge and Regoli, (1994) Neuropeptides 26(6);385-390; Shirahase et al. (2000) Br. J. Pharmacol 129(5);937-942). NK-1 수용체에서 NAT의 특이적 활성에 대한 잠재력을 사정하기 위해, 산소화되고 (95% O2/5% CO2) 미리 가온된 (37℃) 생리식염수 (mM 단위에서): NaCl 118.0, KCl 4.7, MgSO4 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25 및 글루코오스 11.0 (pH 7.4)으로 채워진 20 mL 기관조에서, 무손상 내피를 갖는 토끼 폐동맥의 고리가 현탁되었다. β-아드레날린, 히스타민 H1, 무스카린 및 5-HT2 수용체 각각을 차단하기 위해 프로프라놀롤 (1 μM), 피릴아민 (1 μM), 아트로핀 (1 μM) 및 메틸세르지드 (1 μM)가 실험 내내 존재하였다. 조직은 등척성 장력 기록을 위해 힘 변환기에 연결되고, 2 g의 휴지기 장력까지 신장되고, 이후 60 분 동안 평형화되도록 허용되었고, 이 시간 동안 이들은 반복해서 세척되고 장력이 재조정되었다. 이들 실험은 멀티채널 데이터 획득으로, 8개 기관조를 소유하는 반자동화된 고립된 장기 시스템을 이용하여 실행되었다. 계측된 파라미터는 각 화합물 농도에 의해 유도된 장력에서 최대 변화이었다.
효현제 활성을 평가하기 위해, 조직은 노르에피네프린 (0.1 μM)으로 수축되고, 반응성을 실증하고 통제 이완을 획득하기 위해 준최대 농도의 참조 효현제 [Sar9, Met(O2)11]-SP (0.001 μM)에 노출되고, 이후 세척되었다. 그 후에, 조직은 45 분마다 노르에피네프린으로 수축되고, 증가하는 농도의 NAT 또는 참조 효현제에 노출되고, 이후 세척되었다. 각 화합물 농도는 안정된 반응이 획득될 때까지 또는 최대 15 분 동안 조직과 접촉된 상태로 남겨졌다. 만약 효현제-유사 반응 (이완)이 획득되면, 이러한 반응에서 NK1 수용체의 관여를 확증하기 위해, 30 분 전에 첨가된 참조 길항제 스판티드 II (1 μM)의 존재에서 화합물의 가장 높은 농도가 다시 한 번 검사되었다.
길항제 활성을 평가하기 위해, 조직은 노르에피네프린 (0.1 μM)으로 수축되고, 통제 이완을 획득하기 위해 준최대 농도의 참조 효현제 [Sar9,Met(O2)11]-SP (0.001 μM)에 노출되고, 이후 세척되었다. 이러한 순서는 [Sar9,Met(O2)11]-SP에 노출되기 30 분 전에 각각 첨가된 증가하는 농도의 NAT 또는 참조 길항제 스판티드 II의 존재에서 45 분마다 반복되었다.
NAT/L-메티오닌 제제의 생체내 내약성
동물에서 수행된 모든 절차는 동물 복지법, 실험 동물의 관리 및 사용 지침, 그리고 실험동물복지국 규정을 준수하였다. 프로토콜은 해당 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다.
단회 용량 토끼 유리체내 내약성 연구
망막 장애의 치료용으로 의도된 산물을 뒷받침하는 급성 내약성을 사정하기 위해, 수컷 뉴질랜드 화이트 (NZW) 토끼는 양측성 유리체내 주사 (50 uL/눈)에 의해, 등장성 운반제 제제 (n=2) 또는 5 mM NAT 및 25 mM L-메티오닌을 내포하는 운반제 제제 (n=3) 중에서 어느 한 가지의 단회 용량이 투여되었다.
동물은 연구 1일 자에 이들 운반제 용액이 투약되었다. 독성의 사정은 임상적 관찰, 안압 (IOP) 계측, 그리고 안과 검사에 근거되었다. 8일 자에 부검에서, 눈 및 시신경이 수집되고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 위해 처리되고, 그리고 American College of Veterinary Pathologists (ACVP-인증된 수의병리학자에 의해 현미경적으로 분석되었다.
반복 용량 토끼 유리체내 독성학 연구
망막 장애의 치료용으로 의도된 산물을 뒷받침하는 비임상시험관리기준 (GLP) 독성학 연구가 수컷과 암컷 NZW 토끼에서 수행되었다. 동물 (n=5/성별)은 2 주마다 1회 (1일 자, 15일 자, 29일 자, 그리고 43일 자) 양측성 유리체내 주사 (50 uL/눈)를 통해 운반제 제제 (pH 5.5에서 1 mM NAT, 5 mM L-메티오닌을 내포하는 등장성 용액)가 투여되었다. 독성의 사정은 임상적 관찰, 체중 계측, 안과 검사, IOP 계측, 안구 사진술, 그리고 임상 병리학에 근거되었다. 45일 자에 부검에서, 조직의 포괄적인 세트가 수집되고, H&E 염색을 위해 처리되고, 그리고 ACVP-인증된 수의병리학자에 의해 현미경적으로 분석되었다.
반복 용량 시노몰구스 원숭이 독성학 연구 - 유리체내 투여
망막 장애의 치료용으로 의도된 산물을 뒷받침하는 GLP 독성학 연구가 수컷과 암컷 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))에서 수행되었다. 동물 (n=5/성별)은 10 주 기간에 걸쳐 2 주마다 1회 (1일 자, 15일 자, 29일 자, 43일 자, 57일 자, 그리고 71일 자) 양측성 유리체내 주사 (50 uL/눈)를 통해 운반제 제제 (pH 5.5에서 1 mM NAT, 5 mM L-메티오닌을 내포하는 등장성 용액)가 투여되었다. 독성의 사정은 임상적 관찰, 신체 검사, 심전도, 안과 검사, 스펙트럼 도메인 광학적 전산화 단층촬영술 (OCT), 안구 사진술, 플루오레세인 혈관조영술, 망막전위도검사, 그리고 임상 병리학에 근거되었다. 72일 자 또는 99일 자에 부검에서, 조직의 포괄적인 세트가 수집되고, H&E 염색을 위해 처리되고, 그리고 ACVP-인증된 수의병리학자에 의해 현미경적으로 분석되었다.
반복 용량 시노몰구스 원숭이 연구 - 피하 투여
대사 질환의 치료용으로 의도된 산물을 뒷받침하는 GLP 독성학 연구가 수컷과 암컷 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))에서 수행되었다. 동물 (n=8/성별)은 4 주에 걸쳐 주 1회 (1일 자, 8일 자, 15일 자, 22일 자 및 29일 자) 운반제 제제 (pH 5.8에서 0.3 mM NAT, 5 mM L-메티오닌을 내포하는 등장성 용액) (0.1 mL/kg)가 피하 투여되었다. 독성의 사정은 임상적 관찰, 신체 검사, 신경학적 및 안과 검사, 임상 병리학, 그리고 소변 분석에 근거되었다. 32일 자 또는 99일 자에 부검에서, 조직의 포괄적인 세트가 수집되고, H&E 염색을 위해 처리되고, 그리고 ACVP-인증된 수의병리학자에 의해 현미경적으로 분석되었다.
결과
AAPH 유리 라디칼 화학적 산화 스트레스
용해 상태에서 유리 라디칼에 노출 시에 민감성 트립토판과 메티오닌 잔기에 대한 NAT의 항산화 성질을 결정하기 위해 AAPH 스트레스 검사가 수행되었다. 이전에 보고된 바와 같이 (Dion et al., 원고 준비 중), mAb1의 펩티드 지도화는 2개의 민감한 CDR 트립토판 잔기, W52a 및 W100b뿐만 아니라 Fv 메티오닌 HC M82를 지시하였다. mAb2의 경우에, 복수의 민감한 잔기를 각각 내포하는 2개의 펩티드가 확인되었다 (CDR H1 W33/M34/W36과 CDR H3 W99/W100a 및 Fv W103). 복수의 민감한 잔기를 갖는 이들 2개의 펩티드의 경우에, 각 펩티드에 대한 합계된 산화 값이 본원에서 도시된다. FcRn 수용체와 상호작용하는 Fc 메티오닌 잔기 252와 428 또한, 과거 문헌 (Bertolotti-Ciarlet et al., 2009)과 일관하게, 양쪽 분자에서 산화 스트레스에 민감한 것으로 밝혀졌다. 항산화제 효능에 대한 NAT 농도의 효과를 결정하기 위해, 제제에서 NAT의 농도가 0 mM 및 0.3 mM 사이에서 변화되었고, 그리고 조제된 mAb가 AAPH 스트레스에 종속되었다 (도 1). NAT가 없으면, 민감한 트립토판 잔기를 갖는 Fv 펩티드의 산화 수준이 AAPH 스트레스 시에 11% (mAb1의 W100b), 60% (mAb1의 W52a), 그리고 87% (mAb2의 W99/W100a/W103) 증가하였다. 이들 초기 시작 값은 NAT의 영향을 연구하기 위한 넓은 범위의 산화 민감도를 제공하였다. 트립토판 잔기를 안정시키는 데 필요한 NAT의 최소 농도는 상기 잔기의 초기 AAPH 민감도와 상관하였다 (도 1A). mAb1 W100b의 산화는 0.05 mM NAT의 첨가 시에 5%로 감소되었고, 반면 mAb1 W52a는 산화를 5%로 감소시키기 위해 0.3 mM NAT의 첨가를 필요로 하였다. 대조적으로, mAb2의 W99/W100a/W103의 산화는 0.05 mM, 0.1 mM 및 0.3 mM NAT의 첨가 시에 단지 각각 77%, 62% 및 8%로 감소되었다. mAb2 상에서 W33/M34/W36을 내포하는 펩티드는 비록 펩티드 내에 개별 트립토판과 메티오닌 잔기에 대한 상대적 효과가 명백히 결정될 순 없었지만, NAT 농도가 증가하면 유사하게 전반적으로 감소하였다. mAb 1에서 덜 민감한 M82 잔기는 NAT의 부재에서 최소한도로 (3%) 산화되었고, 그리고 NAT의 포함은 작은 효과 (0.3 mM NAT에서 1% 산화로 약간 감소)를 보여주었다.
Fc 메티오닌 산화에 대한 NAT 농도의 효과 또한 사정되었다 (도 1B). NAT가 없으면, 양쪽 mAb에 대한 M252와 M428의 산화 수준이 AAPH 노출 후 11% 및 16% 사이에 있었다. NAT에 의해 산화로부터 거의 보호되는 CDR 잔기와는 대조적으로, Fc 메티오닌 잔기의 산화는 NAT의 첨가에 의해 악화되었다. 검사된 가장 높은 수준 (0.3 mM NAT)에서, Fc 메티오닌 잔기의 산화는 NAT가 없는 상응하는 조건에 비하여 6%-12% 증가하였다.
NAT가 CDR과 Fv 트립토판 잔기를 산화로부터 보호 (0.3 mM NAT에서 <10% 산화)하지만 (도 1A), Fc 메티오닌 잔기의 산화를 악화 (도 1B)시키기 때문에, NAT와 공동조제된 L-메티오닌을 포함하는 실험 부문이 항산화제 효능 연구에 포함되었다. L-메티오닌 단독 (5 mM)은 AAPH-민감성 트립토판 잔기에 대한 혼합 효과를 갖는데, mAb1에서 약간 향상 및 mAb2 산화 수준의 영향 없음 또는 약간 악화를 보여주었다 (도 2A). Fc 메티오닌 산화 수준은 L-메티오닌 단독의 첨가 시에 양쪽 분자에 대해 2% 또는 그 이하로 감소되었다 (도 2B). 0.3 mM NAT 및 5 mM L-메티오닌의 조합은 AAPH-유도된 산화를 CDR 트립토판 잔기의 경우 <5% 및 Fc 메티오닌 잔기의 경우 <2%로 효과적으로 감소시켰고, 이런 이유로 항산화성 부형제의 이러한 조합은 검사된 조건 하에 산화 수준을 제어하기 위한 가장 효과적인 접근법이 되었다 (도 2A-B).
광 노출 스트레스: 높은 강도 UV
광산화에 대항하여 항산화제로서 NAT의 효능을 결정하기 위해, 단백질 (10 mg/mL)이 다양한 NAT 농도 (0-1 mM NAT)에서 높은 강도 UV 성분을 포함하는 광 스트레스 (6-시간 기간에 걸쳐 300 킬로럭스-시간 가시광선 및 50 Wㆍh/m2의 근거리 UV (320-400nm) 광)에 노출되었다 (도 3A-B). NAT가 광민감성이라는 보고 (Chin et al. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130(22):6912-6913)에 근거하여, AAPH 연구와 비교하여, 더욱 넓은 NAT 농도 범위가 포함되었다. 검사된 조건 하에, mAb1 및 mAb2에서 대부분의 CDR과 Fv 잔기는 ≤ 1%의 산화 수준을 가졌다. 단지 2개의 펩티드만 검사된 광 조건에 민감성을 보였다 (mAb1 W52a (3%) 및 mAb2의 W99/W100a/W103 (6%)) (도 3A). 이들 부위에서 산화는 ≥ 0.1 mM NAT의 첨가에 의해 최소한도의 영향을 받았다 (mAb1 W52a의 경우 <1% 변화, mAb2의 W99/W100a/W103의 경우 1-2% 증가). 항산화제-없는 조건 하에 광 산화에 둔감한 것으로 결정된 잔기는 검사된 조건 하에 NAT가 제제에 첨가될 때 광에 둔감한 상태로 남아있었다.
Fv 잔기와는 대조적으로, Fc 메티오닌 잔기는 UV 광 스트레스 및 NAT의 첨가에 민감하였다 (도 3B). 예를 들면, Fc 메티오닌 잔기 M252의 산화는 mAb1에서 NAT의 부재에서 8%로부터 1 mM NAT의 존재에서 19%로, 그리고 mAb2의 경우 16%로부터 31%로 증가하였다. 이들 결과는 AAPH 스트레스의 경우에서와 유사하게, NAT가 UV 광 스트레스 조건 하에 Fc 메티오닌 잔기의 산화 수준을 증가시킨다는 것을 지시하였다.
NAT에 의한 Fc 메티오닌의 민감화가 L-메티오닌의 첨가에 의해 감소될 수 있는 지를 결정하기 위해, UV 광 조건 하에 개별적으로 및 조합으로 NAT 및 L-메티오닌의 영향이 사정되었다. 단독으로 또는 0.3 mM NAT와 조합으로 5 mM L-메티오닌의 첨가는 이러한 산화 모형에서 CDR과 Fv 잔기에 대한 어떤 유익한 영향도 주지 않았다 (도 4A). UV 광-유도된 Fc 메티오닌 산화는 5 mM L-메티오닌에 의해 향상되지만 (도 4B), 상기 효과는 AAPH 모형의 경우에서만큼 유의미하지는 않았다. L-메티오닌 (5 mM) 및 NAT (0.3 mM)의 조합은 이러한 강한 UV 광 산화 모형에서 부형제 없음 조건 또는 L-메티오닌 단독 중에서 어느 한 가지에 비하여 광산화로부터 CDR 트립토판 또는 Fc 메티오닌의 경미한 보호를 야기하였다.
NAT 및 L-메티오닌의 안전성 사정
NAT 및 메티오닌이 비경구 제제에 대한 FDA 비활성 성분 목록에 등재되어 있고 급성 환경에서 위험의 확인 없이 안전하게 이용되고 있다는 점을 고려하여, 피하 또는 유리체내 투여용으로 의도된 제제에서 이들의 이용을 뒷받침하기 위한 약식 안전성 위험도 평가가 수행되었다. NAT 및 L-메티오닌의 조합의 생체내 내약성 연구가 새로운 투여 루트 둘 모두에 대해 수행되었다. 추가적으로, 문헌 보고가 NAT가 NK-1 수용체의 길항제로서 행동할지도 모른다는 것을 암시하였기 때문에, NK-1 수용체 결합의 인실리코 독성 사정 및 시험관내 사정이 NAT에 대해 수행되었다.
NAT의 인실리코 사정
Derek는 자신의 데이터베이스에서 독성 효과에 대한 책임이 있는 것으로 생각되는 분자 (독성단)의 부분에 대하여 검사 화합물 (다시 말하면, NAT)의 구조적 특질을 비교함으로써 예측을 도출하는 경험적/규칙-기초된 시스템이다. NAT의 구조는 Derek Nexus 데이터베이스에 제출되었는데, 이것은 "보고할게 없음"의 결과를 회신하였다.
Leadscope®는 유전적 독성의 예측을 위한 사전 훈련된 모형을 포함하는 정량적 구조-활성 관계 (QSAR) 시스템이다; 상기 시스템은 US FDA와 협력하여 창출되었고, 그리고 높은 민감도 및 음성 예측성을 보여주었다 (Sutter et al. (2013) Reg. Tox. Pharm. 67(1):39-52). Leadscope®는 총 40가지 모형에서 양성 결과의 가능성을 사정하였다. 이들 중에서, 단지 2가지 모형만 양성일 것으로 예측되었고, 나머지 38가지는 음성일 것으로 예측되었다 (다시 말하면, 독성의 예측 없음). 유전적 독성 범주에서, "다른 세포에서 자매 염색분체 교환 (SCE)" 모형은 0.829의 양성 예측 확률로 양성이었다. 대조적으로, 2가지 다른 SCE 모형 (SCE 시험관내 및 SCE 시험관내 CHO) 둘 모두 음성이었다. 설치류 발암성 범주에서, "carc 생쥐 수컷" 모형은 0.622의 양성 예측 확률로 양성일 것으로 예측되었다. 0.4-0.6 사이의 예측 확률은 Leadscope® 도구에서 한계 예측인 것으로 고려된다. 상기 모형의 두 번째 실행은 음성 예측을 회신하였고, 그리고 생쥐 발암성에 대한 전반적인 예측 (수컷과 암컷 통합)은 음성이었다.
시험관내 수용체 결합 및 기능 사정
NK-1 수용체에 대한 참조 화합물, (Sar9, Met(O2)11)-SP 및 L 733,060)의 효현제와 길항제 결합에 대한 IC50은 각각 4.2-10 M 및 4.7-10 M이었다. 대조적으로, NK-1 수용체에 대한 NAT의 효현제 또는 길항제 결합에 대한 IC50 값은 계산될 수 없었는데, 이것은 검정에서 이용된 조건 하에 NAT의 활성 결여를 지시하였다.
생체내 내약성 사정 - 토끼와 시노몰구스 원숭이 독성학 연구
5 mM까지 NAT 및 25 mM까지 L-메티오닌을 내포하는 운반제 제제는 6 주까지 동안 단회와 반복 용량 투여 둘 모두에 의한 토끼에서 유리체내 투여에 의해 충분히 내약성이었다. 0.3 mM NAT 및 1 mM L-메티오닌을 내포하는 운반제 제제의 투여는 7 주까지 동안 2 주마다 유리체내 투여에 의해, 그리고 유사하게, 4 주까지 동안 주 1회 피하 투여에 의해 시노몰구스 원숭이에서 충분히 내약성이었다. 체중, 신체 검사, 신경학적 또는 안과 검사, 안압, OCT, 안구 사진술, 플루오레세인 혈관조영술, 망막전위도검사, 혈액학, 응고 및 임상 화학 파라미터, 소변 분석, 또는 육안적 또는 현미경적 병리에서 운반제-연관된 임상적 관찰 또는 변화가 어떤 종에서도 관찰되지 않았다.
종합하면, 본원에서 제공된 연구는 NAT가 AAPH 분해에 의해 생산된 ROS로부터 CDR 트립토판 잔기를 보호하는 데 효과적이긴 하지만, 이것이 Fc 메티오닌 잔기를 화학물질 및 광-유도된 산화에 민감화할 수 있다는 것을 증명하였다. NAT에 L-메티오닌의 첨가는 화학물질-유도된 산화로부터 트립토판과 메티오닌 잔기 둘 모두를 효과적으로 보호하고, 그리고 검사된 조건에 대해 항산화제가 없는 제제에서 발견되는 것들과 동등한 또는 그 미만인 광산화 수준을 유발하였다. 이들 연구는 NAT 및 L-메티오닌의 조합이 생물치료제 제조와 보관 동안 통상적으로 발생하는 산화 스트레스의 유형으로부터 보호를 제공할 수 있다는 것을 증명하였다. 중요하게는, 안전성 사정은 양쪽 부형제가 충분히 내약성이라는 것을 확증하였다. 이런 이유로, 본원에서 제시된 증거는 NAT 및 L-메티오닌이 생물치료 제제에서 항산화성 부형제로서 안전하고 효과적일 수 있다는 것을 암시하였는데, 이것은 트립토판 및/또는 메티오닌 산화의 관리를 위한 제제 개발에서 중요한 새로운 옵션을 제공한다.
실시예 2. 항산화제는 AAPH 스트레스 검사에서 산화를 감소시킨다
이중특이적 항체인 항체 Mab3이 NAT + 메티오닌의 항산화 잠재력을 평가하는 데 이용되었다. Mab3은 1 mM NAT 및 5 mM 메티오닌과 함께 또는 이들 없이 40 ℃에서 16 시간 동안 1 mM AAPH와 1 mg/mL로 혼합되었다. 이후, Mab3의 산화가 전술된 바와 같이 질량 분광분석법에 의해 계측되었고, 그리고 효능에 대해 ELISA에 의해 계측되었다. 결과는 표 1에서 제시된다.
표 1. Mab3의 산화
표본 1 2
완충액 및 pH His-Ac pH 5.5 His-Ac pH 5.5
N-아세틸-Trp - 1 mM
L-met - 5 mM
% WW Ox 96.6 12.3
Ag3에 결합 (상대적 효능 %) 영향을 받음 89
용액에 NAT + 메티오닌의 첨가는 Mab3의 산화를 극적으로 감소시켰다.
실시예 3. 항산화제의 첨가는 화학적 산화 위험을 경감한다
IgG1 항체인 Mab4가 20 mM 히스티딘 HCl, 50 mM 염화나트륨, 200 mM 수크로오스, 0.04% 폴록사머 188에서 100 mg/mL로 조제되었다. 항체 제제는 이후, 40 ℃에서 24 시간 동안 0, 5, 10 mM에서 AAPH 또는 10 mM AAPH + 1 mM NAT + 5 mM 메티오닌의 존재에서 배양되었다. 표본은 이후, 전술된 바와 같이 MS에 의해 평가되었다.
결과는 도 5에서 도시된다. Fc M272의 대략 15% 산화가 5 mM AAPH에서 관찰되었다. 이것은 10% trp 산화에 상응한다. 1 mM NAT + 5 mM 메티오닌의 첨가는 산화를 Trp의 경우 약 50% 및 Fc Met 272의 경우 약 80% 감소시켰다. Met CDR에서 변화는 어떤 수준에서도 관찰되지 않았다. NAT + met의 첨가는 ELISA에 의해 계측될 때, Ag4에 결합하는 Mab4의 특이적 활성에서 감소를 개선하였다.
표 2. 항체의 효능
AAPH 특이적 활성 %
0 106
5 63
10 43
10 + 1 mM NAT/5 mM 메티오닌 88
실시예 4. 광 산화 위험 완화를 위한 NAT/met의 첨가
NAT/met이 광 산화를 감소시킬 수 있는 지를 결정하기 위한 연구가 수행되었다. IgG1과 상이한 아이소타입을 갖는 IgG 항체인 Mab5는 NAT 및 met 없이, 0.3 mM NAT + 5 mM 메티오닌과 함께, 또는 0.3 mM NAT + 10 mM 메티오닌과 함께 200 mM 아르기닌 숙신산염, pH 5.5에서 150 mg/ml로 조제되었다. 표본은 위험을 사정하기 위해 300,000 럭스 시간에 노출되었다. 결과는 표 3에서 제시된다.
표 3. 환경 광 스트레스
NAT/met 수준 처리 Fc
M251 		CDR-H3
W104 		HMWS 컬러
0 mM NAT/met 포일
(광 없음)		 3.0% 1.6% 0.80% B5.3
0 mM NAT/met 주위 환경 15.5% 6.1% 1.30% BY2.2
0.3 mM NAT/5 mM met 주위 환경 6.1% 3.2% 0.90% B5.1
0.3 mM NAT/10 mM met 주위 환경 5.4% 3.0% 0.90% B5.2
NAT/met는 Mab5를 환경 광 관련된 산화로부터 보호하였다.
실시예 5. NAT/met의 첨가는 산화와 효능 보호를 제공한다
항체 의약품은 전형적으로 5 ℃에서 2 년 이상인 보관 수명의 종결 시점에서 Met251의 대략 7-8% 산화를 나타낼 수 있다. 이것을 모의하기 위해, 항체는 Met251의 약 15% 산화를 유발하는 5 mM AAPH로 처리되었다. 표본은 NAT/met와 함께 또는 이들 없이 5 mM AAPH로 처리되고, 그리고 이후 W104 및 M251의 산화에 대해 분석되었다. 항체의 효능 또한 계측되었다. 표 4에서 도시된 바와 같이, 항체의 풀에 0.3 mM NAT + 5 mM 메티오닌의 첨가는 W104 및 M251의 산화를 감소시키고, 그리고 AAPH 스트레스 이후에 항체의 효능에서 감소를 축소시켰다.
표 4. NAT/met는 산화와 효능 보호를 제공한다
물질 NAT (mM) Met (mM) W104 산화% Fc M251 산화% 효능
클론의 풀 0 0 36.6 12.2 ~70
클론의 풀 0.3 5 26.4 4.6 ~80
이에 더하여, 클론의 풀은 전술된 바와 같이 환경 광 스트레스에 종속되었다. 표 5에서 도시된 바와 같이, 클론의 풀은 전술된 바와 동일한 컬러 변화를 경험한다.
표 5. 항체의 광 보호
표본 처리 HMWS 컬러
0 mM NAT/met 포일 대조 0.71% B5.3
0 mM NAT/met 환경 광 0.92% BY3.0
0.3 mM NAT/5 mM met 환경 광 0.74% B5.4
실시예 6. NAT/met는 화학적 산화 위험을 경감한다
AAPH 스트레스 검사가 NAT 및/또는 메티오닌에 의한 산화 보호를 사정하는 데 이용되었다. 이중특이적 항체인 Mab6은 NAT 및/또는 메티오닌과 함께 또는 이들 없이, 40 C에서 16 시간 동안 1 mM AAPH와 함께 20 mM 히스티딘 아세트산염에서 1 mg/mL로 배양되었다. 표본은 전술된 바와 같이 산화에 대해 분석되었다. 표 X에서 도시된 바와 같이, 0.1 내지 0.5 m M의 NAT 농도는 산화 보호를 제공하고, met 단독 또한 AAPH로부터 일부 보호를 제공한다.
표 6. NAT/met는 화학적 산화 위험을 경감한다
1 2 3 4 5 6
NAT 0.1 mM 0.4 mM 0.5 mM 0.3 mM 0 mM 0 mM
Met 5 mM 5 mM 5 mM 0 mM 5 mM 0 mM
W104
산화		 25.6% 5.7% 3.5% 8.0% 49.0% 59.0%
실시예 7. NAT/met는 화학적으로-유도된 산화로부터 보호한다.
이중특이적 항체인 항체 Mab7은 상기 분자를 NAT 및 메티오닌과 함께 또는 이들 없이 40 ℃에서 16 시간 동안 1 mM AAPH와 함께 20 mM 히스티딘 아세트산염에서 1 mg/mL로 배양함으로써, 위치 W52의 화학적으로-유도된 산화에 대해 평가되었다. 표본은 펩티드 지도에 의해 산화에 대해 분석되었다. 도 6에서 도시된 바와 같이, NAT + met의 조합은 W52를 화학적으로 유도된 산화로부터 보호하였다.

Claims (67)

  1. 폴리펩티드, N-아세틸-DL-트립토판 (NAT), 및 L-메티오닌을 포함하는 액체 제제이며,
    상기 NAT는 상기 폴리펩티드 내 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되고,
    상기 L-메티오닌은 상기 폴리펩티드 내 하나 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되는 것인
    액체 제제.
  2. 제1항에 있어서, 제제 중 NAT의 농도가 약 0.01 내지 약 25 mM인 액체 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제 중 NAT의 농도가 약 0.05 내지 약 1.0 mM인 액체 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 NAT의 농도가 약 0.05 내지 약 0.3 mM인 액체 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 NAT의 농도가 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.3 mM, 및 약 1.0 mM로 구성된 군에서 선택되는 농도인 액체 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 L-메티오닌의 농도가 약 1 내지 약 125 mM인 액체 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 L-메티오닌의 농도가 약 5 내지 약 25 mM인 액체 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 L-메티오닌의 농도가 약 5 mM인 액체 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    제제 중 NAT의 농도가 약 0.3 mM이고,
    제제 중 L-메티오닌의 농도가 약 5.0 mM인
    액체 제제.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    제제 중 NAT의 농도가 약 1.0 mM이고,
    제제 중 L-메티오닌의 농도가 약 5.0 mM인
    액체 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 액체 제제.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 항체의 가변 영역 내에 위치되는 것인 액체 제제.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 W103을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른 것인 액체 제제.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 항체의 HVR 내에 위치되는 것인 액체 제제.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 항체의 HVR-H1 및/또는 HVR-H3 내에 위치되는 것인 액체 제제.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 W33, W36, W52a, W99, W100a 및/또는 W100b를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른 것인 액체 제제.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 항체의 가변 영역 내에 위치되는 것인 액체 제제.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 M34 및/또는 M82를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른 것인 액체 제제.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 항체의 불변 영역 내에 위치되는 것인 액체 제제.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 M252 및/또는 M428을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따른 것인 액체 제제.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체인 액체 제제.
  22. 제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인 액체 제제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 내 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화가, NAT가 결여된 액체 제제 중 폴리펩티드 내 하나 이상의 상응하는 트립토판 잔기의 산화에 비해 감소되는 것인 액체 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 내 하나 이상의 메티오닌 잔기의 산화가, L-메티오닌이 결여된 액체 제제 중 폴리펩티드 내 하나 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비해 감소되는 것인 액체 제제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 내 하나 이상의 트립토판 잔기 및 하나 이상의 메티오닌 잔기의 산화가, NAT 및 L-메티오닌이 결여된 액체 제제 중 폴리펩티드 내 하나 이상의 상응하는 트립토판 잔기 및 하나 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비해 감소되는 것인 액체 제제
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 산화가 약 40%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소되는 것인 액체 제제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 폴리펩티드 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인 액체 제제.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는 액체 제제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 부형제를 더 포함하는 액체 제제.
  30. 제29항에 있어서, 하나 이상의 부형제가 안정제, 완충액, 계면활성제, 및 긴장성 작용제로 구성된 군에서 선택되는 것인 액체 제제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 투여하는데 적합한 제약학적 제제인 액체 제제.
  32. 제31항에 있어서, 제약학적 제제가 피하, 정맥내, 또는 유리체내 투여하는데 적합한 것인 액체 제제.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 개체가 인간인 액체 제제.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 액체 제제를 포함하는 제조 물품 또는 키트.
  35. 수성 제제 중 폴리펩티드의 산화를 감소시키는 방법이며,
    NAT 및 L-메티오닌을 상기 제제에 첨가하는 단계
    를 포함하고,
    상기 NAT는 상기 폴리펩티드 내 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되고,
    상기 L-메티오닌은 상기 폴리펩티드 내 하나 이상의 메티오닌 잔기의 산화를 예방하는 데 충분한 양으로 제공되는 것인
    방법.
  36. 제35항에 있어서, NAT가 약 0.01 내지 약 25 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, NAT가 약 0.05 내지 약 1 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, NAT가 약 0.05 내지 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, NAT가 약 0.05 mM, 약 0.1 mM, 약 0.3 mM, 및 약 1.0 mM로 구성된 군에서 선택되는 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌이 약 1 내지 약 125 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌이 약 5 내지 약 25 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, L-메티오닌이 약 5 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인 방법.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    NAT가 약 0.3 mM의 농도로 제제에 첨가되고,
    L-메티오닌이 약 5.0 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인
    방법.
  44. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    NAT가 약 1.0 mM의 농도로 제제에 첨가되고,
    L-메티오닌이 약 5.0 mM의 농도로 제제에 첨가되는 것인
    방법.
  45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 항체의 가변 영역 내에 위치되는 것인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 W103을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른 것인 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 항체의 HVR 내에 위치되는 것인 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 항체의 HVR-H1 및/또는 HVR-H3 내에 위치되는 것인 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 트립토판 잔기가 W33, W36, W52a, W99, W100a 및/또는 W100b를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른 것인 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 항체의 가변 영역 내에 위치되는 것인 방법.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 M34 및/또는 M82를 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 Kabat 넘버링에 따른 것인 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 항체의 불변 영역 내에 위치되는 것인 방법.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 메티오닌 잔기가 M252 및/또는 M428을 포함하고, 여기서 잔기 넘버링은 EU 넘버링에 따른 것인 방법.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체인 방법.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 다중클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체, 또는 항체 단편인 방법.
  57. 제35항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 내 하나 이상의 트립토판 잔기의 산화가, NAT가 결여된 액체 제제 중 폴리펩티드 내 하나 이상의 상응하는 트립토판 잔기의 산화에 비해 감소되는 것인 방법.
  58. 제35항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 내 하나 이상의 메티오닌 잔기의 산화가, L-메티오닌이 결여된 액체 제제 중 폴리펩티드 내 하나 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비해 감소되는 것인 방법.
  59. 제35항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드 내 하나 이상의 트립토판 잔기 및 하나 이상의 메티오닌 잔기의 산화가, NAT 및 L-메티오닌이 결여된 액체 제제 중 폴리펩티드 내 하나 이상의 상응하는 트립토판 잔기 및 하나 이상의 상응하는 메티오닌 잔기의 산화에 비해 감소되는 것인 방법.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 산화가 약 40%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 감소되는 것인 방법.
  61. 제35항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 중 폴리펩티드 농도가 약 1 mg/mL 내지 약 250 mg/mL인 방법.
  62. 제35항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 약 4.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는 것인 방법.
  63. 제35항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 하나 이상의 부형제를 더 포함하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 하나 이상의 부형제가 안정제, 완충액, 계면활성제, 및 긴장성 작용제로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
  65. 제35항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 개체에게 투여하는데 적합한 제약학적 제제인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 제약학적 제제가 피하, 정맥내, 또는 유리체내 투여하는데 적합한 것인 방법.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 개체가 인간인 방법.
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