PT87524B - Processo para a determinacao da presenca de endotoxinas e para a preparacao de naticorpos monoclonais utilizados nessa determinacao - Google Patents

Description

DOMlNIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo para a determinação da presença de endotoxinas ou de substâncias semelhantes a toxinas numa amostra bem como de prepa ração de um anticorpo monoclonal e de um conjunto de análise (test kit”) que contêm esse anticorpo útil para a referida determinação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os límulos Limulus polyphenus, Tachypleus tridentatus, Tachypleus glgas e Carcinoscorpius rotundicauda são artrópodes marinhos filogeneticamente primitivos que não evoluíram significativamente durante os últimos 300 milhões de anos (1).

O límulo possui um sistema circulatório aberto que contêm hemolinfa azul e o único elemento formado presente na hemolinfa ê uma célula chamada amebócito (2).

A utilização do lisado do amebócito de límulo (LAL) como ensaio in vitro para a presença de endotoxi nas resulta directamente da observação importante feita por Bang (3). Este autor observou que o límulo sofreu um tipo de coagulação intravascular disseminada (CID) quando ocorria uma infecção generalizada com bactérias marinhas gram-negativas. Esta observa ção in vitro inicial foi mais tarde ampliada pela descoberta de que a coagulação da hemolinfa de límulo pode ser produzida in vii tro pela adição seja de bactérias gram-negativas viáveis seja de endotoxina purificada a partir da parede celular de bactérias gram-negativas (2). Foi também descoberto pelos mesmos investiga dores (1) que o amebécito era a origem de todos os factores necessários para a coagulação da hemolinfa.

A aplicação corrente do ensaio como um método de análise in vitro para endotoxinas baseia-se no facto de que a disrupção física dos amebécitos que foram isolados a partir da hemolinfa por centrifugação dá origem a uma suspensão (LAL) que contêm os componentes de coagulação que apenas podem ser em seguida activados por endotoxina bacteriana.

A aplicação deste princípio tornou o ensaio LAL o método presentemente disponível mais sensível para a detecção de bactérias gram-negativas, de endotoxinas e de lipossacarídeos (LPS). O LAL preparado por métodos de purificação correntes pode detectar com fiabilidade 0,1 ng/ml de endotoxina padrão de Escherichia coli purificada. Mostrou-se que o LAL detecta tanto as endotoxinas ligadas (associadas a células) como as endotoxinas livres (4) incorporadas na parede celular de virtualmente todas as bactérias gram-negativas. No entanto as endotoxinas preparadas por meio de diferentes métodos de extracção a partir de espécies diferentes podem variar amplamente em reactividade (5,6) . Por estas razões, foi preparada uma endotoxina padrão de referência (EPR) pela US Food and Drug Administration sssSSsaSSSS

,.US>

(USFDA) como meio de normalização dos ensaios de pirogênios de LAL e de coelhos (Farmacopeia dos Estados Unidos XX) (7).

Podem ser preparados lisados de ame bõcito de reactividade semelhante em relação âs endotoxinas a partir das 4 espécies de limulo.

Processos de coagulação em limulídeos

Os processos de coagulação em limu-j lídeos correntemente conhecidos estão resumidos no Quadro 1. j

QUADRO 1

PROCESSO DE COAGULAÇÃO EM LIMULÍDEOS

LPS OU ET . 1

Proteína de membrana de (1-3) -D-glucano ligação de ET a amebócitos I l

Factores desconhecidos (?) I

Z \ '

Protease N (polyphemus) Factor C--»Factor C activo (tridentatus) \ Factor anti-LPS ^ZPro

Proteolise Factor B — — —-->Factor B activo = activador (protease de serina tipo tripsina)

Factor G--->Factor G activo

Enzima pro-coagulação (protease de serina) proteolise--Enzima de coagulação j <---proteolise __

Peptideo C

Coagulogenio~

Coagulina reticulada por ligações não covalentes l«t—--+ transglutaminas e

Ca ++

Coagulina reticulada por ligações covalentes (COÁGULO)

I

Coagulogênio celular; 0 Coagulogênio ê constituído por uma ca- í deia polipeptídica com ligações internas de dissulfureto que são^: í

importantes para a estabilidade da forma polimerizãvel da molêcuj la (8). Verificou-se que no Limulus polyphemus o coagulogênio ê ;

I constituído por 220 ácidos aminados com um conteúdo de semi-cis-; tina de 18 resíduos (9). Não se detectou qualquer grupo SH livre| verificou-se que o único resíduo N-terminal era glicina e que ο ί seu resíduo C-terminal era serina (9). O coagulogênio ê sempre convertido por uma enzima protease de serina. Apõs coagulação, a proteína do gel apresenta uma estrutura em hélice ao microscópio electrõnico (10). Em Tachypleus tridentatus, o coagulogênio contêm 132 a 135 ácidos aminados incluindo níveis elevados de ácidos aminados de carácter básico, com uma alanina N-terminal e uma fenilalanina C-terminal. No Limulus, a formação de coágulo parece envolver a cisão da única ligação peptídica Arg-Lys no coagulogênio (11,9). Os N-peptídeos interactuam entre si de forma não covalente dando origem ao coágulo insolúvel. Em Tachypleus tridentatus, a formação enzimãtica do gel envolve uma proteõlise limitada das ligações peptídicas Arg-Gly e Arg-Thr localizadas na porção N-terminal do coagulogênio, libertando deste modo o peptídeo (12,13). O fragmento C no Limulus contêm principalmente ácidos glutâmico e aspártico (14). Embora Liu et al.

(9) tenham detectado um peptídeo C com 45 ácidos aminados nesta espécie, Nakamura et al. (13) e Shishikura et al. (15) afirmaram que este peptídeo C tinha 28 resíduos de ácidos aminados arranja dos numa sequência específica de cada espécie.

Enzima de coagulação: A enzima de coagulação ê uma protease de serina. Esta enzima existe sob duas formas activas com pesos moleculares de 78 000 e de 40 000, respectivamente, e com uma com-i posição de ácidos aminados muito similar, o que indica uma relação monõmero-dimero (9). Em Tachypleus tridentatus, a enzima de coagulação não reduzida ê descrita como uma glicoproteína com um peso molecular de 42 000 que se agrega para formar uma proteína com um PM de 350 000. A enzima de coagulação ê originada a partir de uma pro-enzima de coagulação inactiva. A pro-enzima de coagulação pode ser activada de dois modos independentes (quadro 1): pelo LPS de bactérias gram-negativas ou pelos (1-3)-D-glu

canos a partir das paredes celulares de certos fungos e algas. j Coagulação mediada pelos LPS: Em primeiro lugar foi demonstrado j que as endotoxinas ou os LPS activam uma pro-enzima de coagula- ! ção do tipo protease de serina (16,11). Em segundo lugar, verifi cou-se que estava também envolvido na coagulação de LAL induzida por LPS um factor B adicional ou pro-activador uma vez que este activava a pro-enzima de coagulação (17,18). Esta activação provavelmente envolve uma proteõlise limitada, isto ê, de uma ligação arginil-X ou lisil-X da pro-enzima de coagulação (18). Final mente, observou-se que este pro-activador era convertido num fac tor B ou activador activo (isto ê, protease de serina do tipo tripsina) por outra enzima proteolítica chamada protease N (factor C em I. tridentatus) que parece ser dependente de LPS (18,

I

19). Estas observações sucessivas indicam que este processo de ! coagulação representa uma cascata enzimãtica complexa que poderã também incluir outros factores desconhecidos (Quadro 1).

Factores anti-coagulação; Uma proteína de 80 KD da membrana do amebôcito liga-se especificamente à endotoxina ou ao LPS (9,20). De acordo com os autores, esta proteína receptora pode reconhecer e imobilizar pequenas quantidades de LPS em sangue de Limulus sem coagulação intravascular maciça. Além disso, estã presen te no amebôcito da hemolinfa de Tachypleus tridentatus e de Limulus polyphemus um anti-coagulante (factor anti-LPS) que inibe í

a coagulação induzida por LPS (21) . Este anticoagulante inibe a activação do factor B mas não a sua actividade. A outra via de coagulação mediada não ê afectada pelo factor anti-LPS (21). Coagulação mediada por (1-3)- ^-D-glucano: Tanto o agente anti-tumor (l-3-^>-D-glucano como outros polissacarideos anti-tumor possuem uma capacidade elevada de causar a gelificação de LAL (22) por meio da activação de um factor G que actua sobre a pro-enzima de coagulação (23).

Diferentes métodos para detectar endotoxinas por meio de LAL

O método mais frequentemente usado ê de longe o ensaio de coágulo. Este método baseia-se no facto de que o resultado final da cascata de reacções no LAL quando reage com uma endotoxina ê um gel opaco ou um coagulo. O ensaio

é levado a efeito como se segue: mistura-se 0,1 ml de LAL com ¹ 0,1 ml da solução a analisar num tubo de ensaio. Incuba-se a mijsj tura a 379 C num banho de agua durante uma hora. O ensaio e reco; nhecido como positivo se se forma um coagulo e se o coágulo ê esi tãvel quando o tubo de ensaio é invertido 1809. Têm sido descri-ί i

tas reacçoes menos intensas que se manifestam por um aumento de viscosidade com um aspecto de grânulos semelhantes a amido que aderem à parede do tubo de ensaio, muitas vezes simultaneamente

I com um aumento da opacidade. A subjectividade dos pontos que mar cam o fim de uma formação de gel não completa têm constituído mo tivo de crítica deste método de realização do ensaio. Esta críti ca é especialmente importante quando se ensaiam especimens clini cos por causa da interferência de várias substâncias.

Foram publicadas outras modificações do ensaio de LAL com base nos estudos acima mencionados do mecanismo da reacção em LAL. Estas modificações incluem um método turbidimêtrico (24), um método cromogênico (25), um método co lorimêtrico (26) , um método nefelométrico (27), métodos cinéticos (28 a 30), diferentes métodos de lâmina (31 a 36), métodos de tubos capilares (38, 39), um método de microdiluição (40) , um método de gotas de LAL (41), um método de marcação por radioisÕ-j tópos de coagulogênio (42) e um método imunoelectroforêtico que ' mede a perda de antigenicidade do coagulogênio quando este ê cin dido pela enzima activada por LPS (43). Em todos estes métodos, ί excepto no método imunoelectroforêtico (43), o resultado do mêtoj do ê lido visualmente ou indirectamente por meio de algum tipo j de equipamento.

Especificidade do LAL para as endotoxinas

A especificidade da reacção do LAL em relação âs endotoxinas ou aos LPS tem sido questionada por va rios investigadores. Foi descrito que a trombina, a tromboplasti na e certos polinucleõtidos sintéticos dão todos como resultado j um ensaio LAL positivo (44) . O peptidoglicano de bactérias gram-positivas (45), endotoxinas derivadas de .Streptococci do grupo A (46), vários polissacarídeos simples, incluindo mananos de levedura e dextranos bacterianos (47) , derivados sintéticos de dex

trano (48) e ditiõis (49) causam a gelificação do LAL. ^! ensaio de LAL tem sido usado parai determinar a actividade biológica de moléculas semelhantes a en-^! dotoxinas purificadas a partir de material da membrana de váriosi organismos. Foram obtidos ensaios LAL positivos com ácido lipo- ! teicôico de Streptococcus faecalis (50), com lipoglicanos de di-; ferentes estirpes de Mycoplasma (51, 52), com facções da parede ' celular de Micropolyspora faeni (53) e Chlamydia psittaci (54) e i com preparações puras de Plasmodium berghei (55) e com extractos por mistura de ãgua-fenol quentes de Listeria monocytogenes (56).

Recentemente tem sido posta em dúvi da a utilidade clínica do ensaio LAL. Elin (57) levou a efeito ' uma análise estatística de 17 estudos diferentes em pacientes hu manos com LAL e sangue e concluiu que a utilidade clínica do en-‘ saio LAL para o diagnostico de septicemia gram-negativa ê margi-i !

nal. Outros estudos por Tubos (58) e por Galloway et al. (59), j respectivamente, mostraram que o plasma de pacientes infectados í com Borrelia recurentis dava reacção positiva no ensaio com LAL.

Em quase todos os estudos mencionados acima foram usados métodos subjectivos para ler o resultado do ensaio LAL, sendo um ensaio positivo definido como a gelifica ção ou um aumento de turvação.

A prova mais difícil para o ensaio '

LAL era a detecção de endotoxinas em sangue ou em plasma. Em prjj ~ ~ í meiro lugar, a concentração de endotoxina em circulação no sangue ê normalmente baixa por causa da rápida destruição no fígado,, Em segundo lugar, o plasma contêm inibidores do LAL, substâncias| que inactivam as endotoxinas e proteínas que se ligam âs endotoxinas.

Têm sido usados vários métodos para extrair as endotoxinas do plasma. Os melhores resultados foram ; obtidos por uma combinação de diluição e de aquecimento do plas-j ma (43).

Experiências com um método imunoe- { lectroforêtico de projecção para determinar a reactividade do LAL com uma endotoxina (43) mostraram que este método possui um mais alto grau de precisão e de sensibilidade em comparação com

vários outros métodos e ê apropriado para finalidade de diagnostico.

Estudos imunoelectroforêticos da in teracção entre o LAL e os antigenes solúveis de Pseudomonas aeruginosa e de Staphylococcus aureus mostraram que o LAL ê alta- j mente reactivo com LPS mas pode também reagir com outros antige-j nes de bactérias gram-negativas e gram-positivas (60). ;

I

O ensaio LAL na indústria farmacêutica j

A principal utilização do ensaio ΐ i

LAL tem sido na indústria farmacêutica que actualmente leva a efeito centenas de milhares de ensaios por ano sobre vários flui dos parenterais de grande e de pequeno volume, produtos bioquími cos e instrumentos médicos. 0 ensaio LAL é actualmente realizado correntemente tanto para o controlo durante o processo como para a aprovação final de muitos fluidos injectáveis e de instrumentos médicos de intervenções produzidos pela indústria farmacêuti ca em todo o mundo.

Aplicações clinicas do ensaio LAL

I

As aplicações clínicas do ensaio LAL foram discutidas exaustivamente por J0rgensen (61) . A conclu são que se pode tirar deste estudo de conjunto das aplicações ! clínicas do ensaio LAL ê que foram descritas várias aplicações úteis desde a introdução do ensaio no fim dos anos 1960. Todas estas aplicações beneficiaram da velocidade, sensibilidade e especificidade geral do ensaio LAL para as endotoxinas bacterianas, tanto para as endotoxinas ligadas de bactérias gram-negativas viáveis como de endotoxinas livres como evidência residual de crescimento bacteriano anterior ou periódico. Em todas estas apli

I cações, verificou-se que o ensaio LAL ê superior em alguns aspecí tos aos métodos convencionais de diagnostico de endotoxinas bacterianas. No entanto, nenhuma destas aplicações substituiu métodos convencionais de modo que o ensaio LAL seja usado isoladamen te para diagnostico. Em vez disso o ensaio LAL ê um meio auxiliar poderoso para a determinação da presença de bactérias gram-ne

gativas numa variedade de casos clínicos. Tem utilizações de di-* agnóstico correntes válidas (meningite, infecções oculares, bacteriuria) e pode eventualmente conduzir a uma melhor compreensão de outras consequências patofisiolôgicas das endotoxinas, isto ê, a endotoxemia.

RESUMO DA INVENÇÃO

Os inventores da presente invenção i desenvolveram agora um novo processo para a determinação da reacção entre o lisado do amebócito de Limulus ou de Tachypleus e as endotoxinas. 0 processo apresenta a mesma sensibilidade e a mesma especificidade para as endotoxinas que o método imunoelectroforético de projecção (43) mas não necessita de equipamento muito especializado ou de pessoal de alto grau de preparação para a sua realização de tal modo que pode ser levado a efeito pra ticamente em todos os laboratórios clínicos. Ê também mais simples pois ê menos demorado e mais económico e necessita de menores quantidades de reagente de lisado de amebócito. 0 novo processo apresenta por conseguinte uma importante vantagem económica em comparação com os métodos conhecidos.

Deste modo, a presente invenção refere-se a um processo para a determinação da presença de uma endotoxina ou de material semelhante a uma endotoxina numa amostra, compreendendo:

a) a incubação da amostra com um componente do lisado do amebóci to ou da hemolinfa do límulo ou de um análogo sintético deste, i

sendo as propriedades do referido componente alteradas se es-; tiver presente na amostra uma endotoxina ou um material seme-i lhante a uma endotoxina, de tal modo que nao tenha lugar qual quer reacção com um anticorpo suscitado contra ou dirigido i substancialmente apenas contra o referido componente ou anãlo;

i go ou com um seu determinante imunológico, ou de tal modo que o produto da reacção do referido componente ou análogo com ; uma endotoxina ou com um material semelhante a uma endotoxina! na amostra reaja com um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido produto da reacção ou um seu determinante imunológico,

b) reacção da mistura incubada da referida amostra e do referido) componente ou anãlogo resultante da fase a) com um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido componente ou anãlogo ou com um seu determinante imu nolõgico, estando o anticorpo ligado ao referido componente ou ao referido anãlogo presente na mistura, ou com um anticor po suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido produto da reacção ou um seu determinante imunolõgico, estando o anticorpo ligado ao referido produto da reacção presente na mistura, e

c) determinação da presença de qualquer endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da detecção de qualquer anticorpo ligado na misturada reacção resultante da fase b), de tal modo que a detecção de quantidades decrescentes de anticorpo ligado mostre a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido componente ou anãlo go ou contra um seu determinante imunolõgico e a detecção de quantidades crescentes de anticorpo ligado mostre a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxi na na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido produto da reacção ou contra um seu determinante imunolõgico, com a condição de que quer o referido componente ou anãlogo quer o produto da reacção presente depois da incubação da amostra com o componente ou anãlogo na fase a) estão ligados a um suporte solido ou o referido anticorpo estã ligado a um J suporte sólido ou a uma molécula que forme uma ponte ligada ai í

um suporte solido ou uma endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina presentes na amostra estão ligados a um suporte solido.

No presente contexto, endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina ê definido como uma subs tância que ê normalmente um componente da superfície exterior da membrana bacteriana e que ê normalmente um pirogênio, isto ê, in duz febre. Demonstrou-se que a parte biologicamente activa de ι n

rídeo, sendo a fracção lipídica (lípido a) responsável pelas proí priedades pirogénicas e endotõxicas do lipopolissacarídeo. Demonstrou-se no entanto (45, 46, 60) que outros antigenes superfi ciais também podem reagir com LAL, incluindo antigenes superfíci ais de bactérias gram-positivas, e deste modo a expressão inclui qualquer material ou componente bacteriano ou de outro microorga nismo, como seja de fungos, leveduras ou algas, que apresente re acção com LAL (22, 23, 47, 48).

O termo componente do lisado do amebócito ou hemolinfa de límulo deverá ser entendido como incluindo o lisado integral ou a hemolinfa bem como os componentes reactivos individuais destes, contendo o lisado integral ou a he molinfa estes componentes reactivos que reagem com a endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina. Um componente normalmen te preferido para a utilização no processo da presente invenção ê o coagulogênio (tal como se encontra presente no lisado integral) . O lisado e a hemolinfa podem ser derivados de qualquer das espécies de límulos, isto ê, de Limulus polyphemus, de Tachypleus tridentatus e de Carcinoscorpius rotundicauda, sendo normalmente preferidos os lisados de Limulus e de Tachypleus.

O termo análogo sintético deve ser compreendido como significando uma substância que apresente a mesma ou substancialmente a mesma reactividade com uma endotoxina ou com um material semelhante a uma endotoxina como um componente de ocorrência natural no lisado do amebócito ou na hemolinfa do límulo. Este análogo pode ser preparado por síntese qul mica, por exemplo por um método habitual de síntese de peptídeos, de preferência por síntese de peptídeos em fase sólida, ou por técnicas de ADN recombinante envolvendo a clonagem de um gene que codifique para o referido componente num vector de expressão conveniente, transformação de um microorganismo apropriado com o vector recombinante resultante, cultura do organismo num meio apropriado para a expressão do referido gene e isolamento a partir do meio de cultura do componente produzido deste modo. Os componentes específicos a utilizar no processo da presente inven ção podem ser seleccionados de entre o grupo constituído por um factor de coagulação, por exemplo factor B, factor C, factor G,

factor N, pro-enzima de coagulação, enzima de coagulação activada factor anti-LPS ou coagulogênio, e uma aglutinina, por exemplo uma lecitina, como limulina ou polifemina, sendo o factor de coagulação normalmente encontrado nos amebôcitos e a aglutinina na hemolinfa.

termo produto da reacção do refe rido componente ou análogo com uma endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina na amostra deve ser compreendido como significativa qualquer produto resultante de uma cisão catalisada enzimaticamente ou de outra alteração induzida enzimaticamente (por exemplo, na estrutura terciária de uma proteína) de uma substância (incluindo outras enzimas na cascata enzimãtica acima descrita) activada pela presença de uma endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina na amostra na cascata enzimãtica aci ma descrita. 0 produto da reacção pode ser seleccionado de entre o grupo constituído por coagulina, peptídeo C, enzima de coagula ção activada, factor b, C, G ou N activado ou produtos de cisão destes factores e da pro-enzima de coagulação.

termo amostra ê definido como qualquer material a ser ensaiado para determinação da presença de uma endotoxina. Este termo inclui de preferência qualquer dos materiais habitualmente submetidos a análise de pirogénios.

Assim, a amostra pode ser seleccionada de entre preparados farma cêuticos, tais como fluidos parenterais ou fluidos injectáveis, isto ê, preparados contendo uma substância activa, como seja um produto químico ou um nutriente, e instrumentos médicos usados para inserção no corpo de um paciente, por exemplo, instrumentos para implantação, tais como cânulas ou cateteres. Outros materiais normalmente submetidos a análise de pirogénios incluem mitogênios, produtos bioquímicos, incluindo meios nutrientes e tampões, produtos alimentares, água potável e água usada para a industria farmacêutica. Alêm disso, a amostra pode ser seleccionada de entre fluídos corporais, tais como urina, fluído cerebroespinal, sangue, soro, plasma ou qualquer produto preparado a j partir de sangue ou linfa, tornando deste modo possivel o diagnostico de doenças induzidas por endotoxinas pelo processo da presente invenção. Um inconveniente dos métodos conhecidos para

,ι5 a detecção de pirogênios em amostras clínicas tem sido que estas análises conhecidas, quando realizadas em amostras de fluídos corporais, principalmente plasma e soro, não apresentam a especi ficidade e a sensibilidade necessárias para o diagnóstico de bac teremia e de septicemia. Surpreendentemente constatou-se que o processo da presente invenção pode ser utilizado para a detecção de modo preciso de mesmo quantidades diminutas (ao nível do pico grama) de endotoxinas no plasma e no soro.

No contexto presente, o termo determinante imunológico refere-se a uma subsequência do referido componente ou análogo contra o qual podem ser suscitados anticor pos que apresentam propriedades desejáveis no processo de ensaio da presente invenção ou que reagem com um anticorpo. Deste modo, o determinante imunológico pode ser por exemplo uma sequência in eluindo um local de cisão pelo qual o componente ou o análogo ê cindido na cascata enzimãtica acima descrita. 0 termo anticorpo refere-se a uma substância que é formada como uma resposta de um animal ou de uma célula animal â exposição ao referido componente ou análogo ou produto de reacção. A fim de assegurar uma espe cificidade e uma sensibilidade adequadas no processo de ensaio da presente invenção, o anticorpo é de preferência um anticorpo monoespecífico que apresente especificidade em relação a um componente único do lisado do amebócito ou da hemolinfa de límulo e não em relação a vários componentes ou ao lisado integral ou à hemolinfa. Para alguns fins, o anticorpo pode ser um anticorpo policlonal mas ê geralmente preferível que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal uma vez que deste modo se assegura uma espe cificidade e uma sensibilidade da análise mais elevadas permitin do por conseguinte uma determinação mais precisa da endotoxina ou de materiais semelhantes do que os métodos de ensaio LAL habi, tuais, necessitando simultaneamente de uma menor quantidade do componente ou do análogo do ensaio, o que torna o processo da mais económica.

acordo com a presente invenção, de um material semelhante a uma i

tanto de modo negativo como de modo positivo. A determinação negativa resulta da utilização de presente invenção de utilização De a presença de uma endotoxina ou endotoxina pode ser determinada

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um anticorpo contra o referido componente ou análogo para a reac ção com a mistura incubada da amostra e do componente ou análogo, utilizando a incapacidade do anticorpo para se ligar a um produto da reacção da incubação da amostra com o componente ou análogo. Se após a reacção se detecta pouco ou nenhum anticorpo, ou se, pelo menos, se detecta uma quantidade de anticorpo ligado di minuida de modo significativo em. comparação com a amostra de com paração isenta de endotoxina, este facto indica a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra, uma vez que mostra que o componente ou análogo foi cindido por via enzimãtica ou teve a sua estrutura alterada de outro modo por via enzimãtica devido â presença da endotoxina de tal modo que o anticorpo dirigido contra o componente ou o anãlo go jã não ê capaz de se ligar. Por outro lado, se o anticorpo ê um anticorpo dirigido contra o referido produto de reacção, o an ticorpo adicionado na fase b) do processo da presente invenção liga-se no ensaio (ou, pelo menos, quantidades crescentes do anticorpo se ligam em comparação com uma amostra de comparação isen ta de endotoxina), proporcionando deste modo uma determinação po sitiva da endotoxina ou do material semelhante a uma endotoxina na amostra.

método da presente invenção e ade quado tanto para a análise qualitativa como para a análise quantitativa de endotorinas. Para determinações quantitativas, a quantidade de anticorpo ligado no ensaio pode ser determinada por diluições em série das amostras de modo conhecido em si (cf.

43)

Quando, de acordo com a presente in venção, qualquer dos referidos componentes ou análogos ou qualquer dos referidos produtos de reacção que permaneça presente após a incubação da amostra com o componente ou análogo na fase

a) do método acima está acoplado a um suporte sólido, é possível então adicionar ao suporte sólido um anticorpo contra o componen te ou análogo ou contra o produto de reacção, demonstrado a ausência de anticorpo ligado ou a presença de uma quantidade menor do anticorpo ligado em comparação com uma amostra de comparação isenta de endotocina, no primeiro caso, a presença de endotocina l â

na amostra. No último caso, a presença de anticorpo ligado demonstra a presença de endotocina na amostra.

Em alternativa, o anticorpo ê acoplado a um suporte sólido ou a uma molécula que forme uma ponte acoplada a um suporte sólido e qualquer componente que reste após a incubação da amostra com o componente ou com o análogo na fase a) do processo da presente invenção ê ligado ao anticorpo para reacção adicional com uma quantidade adicional de anticorpo.

Uma outra alternativa consiste em acoplar qualquer endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina na amostra a um suporte sólido. Neste momento pode incubar-se com o componente ou análogo por adição do componente ou análogo ao suporte sólido e em seguida adicionar um anticorpo marca do que pode ser um anticorpo contra o componente ou análogo ou então contra o produto da reacção resultante da incubação do com ponente ou análogo com a amostra. Neste caso, o componente (ou análogo) deverá ser o lisado integral ou a hemolinfa ou o compos to no lisado com o qual a endotoxina reage para induzir a cascata enzimãtica acima descrita.

De acordo com um outro seu aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um anticorpo monoclonal utilizado no processo de análise da presente invenção, sendo o anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra um componente do lisado do amebócito ou da hemolinfa do llmulo ou contra um seu análogo sintêti-j co ou um seu determinante imunológico. !

De acordo com um outro seu aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação dej um conjunto de análise (test kit) para a determinação da pre- ; sença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina numa amostra, contendo ;

a) um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente i apenas contra um componente do lisado do amebócito ou da hemo! linfa do límulo ou contra um seu análogo sintético ou um seu determinante imunológico ou um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra um produto da reacção τ r

do referido componente ou analogo com uma endotoxina ou com um material semelhante a uma endotoxina ou um seu determinante imunológico, e

b) um componente de lisado de amebõcito ou de hemolinfa de límulo ou um seu análogo sintético.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Conforme indicado acima, a ligação do anticorpo com o referido componente ou análogo ou com o referido produto de reacção ê de preferência um anticorpo monoespecí fico contra um componente específico no lisado do amebócito ou hemolinfa do límulo (ou um seu análogo sintético). 0 anticorpo moespecífico pode ser preparado por injecção num animal adequado com um preparado substancialmente puro do componente ou análogo em questão seguida de uma ou mais injecções de reforço a interva los adequados (por exemplo, duas semanas a um mês) atê seis meses antes da primeira sangria. Em seguida, enquanto se continua este regime estabelecido de imunização, os animais são sangrados cerca de uma semana depois de cada reforço de imunização, e o an ticorpo ê isolado a partir do soro de um modo normal, por exemplo conforme descrito em Harboe e Ingild, Scand. J. Immun. 2 (Supl. 1), 1973, pp. 161-164.

Para finalidades que não requeiram uma especificidade elevada, o anticorpo pode ser um anticorpo po liclonal. Podem ser obtidos anticorpos policlonais substancialmente conforme descrito em Harboe e Ingild, op. cit.. Na maioria dos casos, no entanto, ê preferível que o anticorpo usado no pro cesso da presente invenção seja um anticorpo monoclonal uma vez que este geralmente proporciona uma maior especificidade e uma maior precisão da análise, necessitando ao mesmo tempo de menos tempo para a sua realização. Para alem disso, pode utilizar-se uma mistura de dois ou de mais anticorpos monoclonais diferentes, uma vez que deste modo ê possível aumentar o limite de detecçao e a sensibilidade do ensaio. 0 anticorpo monoclonal pode ser obtido de acordo com o processo descrito seguidamente.

O anticorpo usado no processo de análise da presente invenção encontra-se de preferência sob forΊ <

I

ma substancialmente pura a fim de melhorar a precisão da análise^

Em alguns casos, como por exemplo quando o anticorpo esta acoplado a partículas sólidas (como explicado abaixo) que se aglutinam quando o anticorpo reage com a substância contra a qual estã dirigido (isto ê, o componente, o análogo ou o produto da reacção), o anticorpo pode ser usado sob uma forma não modificada. No entanto, para a maior parte das finalidades, o anticorpo ê de preferência proporcionado com uma marcação para a detecção de anticorpo ligado ou, em alternativa (como seja numa análise de anticorpo duplo), pode utilizar-se uma combinação de um anticorpo marcado com um anticorpo não marcado. A substância usada para marcação pode ser seleccionada de qualquer substância que seja detectãvel por si própria ou que possa ser feita reagir com outra substância a fim de produzir um produto final detectãvel. Deste modo, a marcação pode ser seleccionada de entre o grupo constituído por enzimas, substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, cromóforos, isótopos radio activos e agentes complexantes.

Exemplos de enzimas úteis como marcação são peroxidases (por exemplo, peroxidase de rábano bastardo) , fosfatases (por exemplo, fosfatase ãcida), -galactosidase, urease, glucose-oxidase, anidrase carbónica, glucoamilase, lisozima, malato-de-hidrogenase, glucose-6-fosfato-de-hidrogenase e ribonuclease.

As enzimas não são detectãveis por si mas podem ser combinadas com um substrato a fim de catalisar uma reacção cujo produto final seja detectãvel. Deste modo, pode ser adicionado um substrato â mistura reaccional resultante da fase b) acima dando como resultado um produto colorido, fluorescente ou quimioluminescente ou uma mudança de cor ou uma mudança na intensidade da cor da fluorescência ou da quimioluminescênciaí i

São exemplos de substratos úteis no processo da presente inven- ^! ção como substratos para as enzimas mencionadas acima HgOg, p-nij trofenilfosfato, lactose, ureia, ^-D-glucose, CC^z éster de colina, amido, M. lysodeikticus, maleato, glucose-6-fosfato e ARN.

substrato pode ser combinado com, por exemplo, um cromõforo que pode tanto ser um dador como um aceitador.

τ n

As substâncias fluorescentes que po dem ser usadas como marcação para a detecção directa de anticorpo ligado podem ser seleccionadas de entre o grupo constituído í por 4-metilumbeliferil-D-galactopiranosido, 4-metilumbeliferil- í -fosfato e ácido 3-(p-hidroxifenil)-propiônico. Estas substânci-i as são detectãveis por si próprias por meio de um espectrofotôme tro de fluorescência, permitindo uma medida da fluorescência tan to qualitativa como quantitativa.

As substâncias quimioluminescentes ! que podem ser usadas como marcação para a detecção da ligação do anticorpo podem ser seleccionadas de entre o grupo constituído por isoluminol/EDTA/í^C^, peroxidase/eosina/EDTA e luciferase e um substrato apropriado. Estas substâncias são elas próprias detectãveis por meio de um espectrofotômetro, permitindo uma medida da quimioluminescência tanto qualitativa como quantitativa.

Os cromÔforos que podem ser usados como marcação para a detecção do anticorpo ligado podem ser seleccionados de entre o grupo constituído por ácido 5-aminossalicílico, acido 2,2'-azino-di-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfónico, o-fenilenodiamina, o-diaminoicidina, 3-metil-2-benzotiazolina-h_i drazona, ãcido 3-(dimetilamino)-benzõico, o-toluidina, 3,3', 5,5/ -tetrametilbenzidina, o-nitrofenil--D-galactósido e p-nitrofenil-fosfato. Estas substâncias podem ser detectadas por si próprias por meio de um espectrofotômetro e ser usadas para a deter minação tanto quantitativa como qualitativa da cor, por exemplo da intensidade da cor ou de uma mudança de cor. í

Os isótopos radioactivos que podem ser usados para a detecção do anticorpo ligado podem ser selec- I

125 3 35 131 ' cionados de entre o grupo constituído por ³I, ^JH, ³P, e i ·* '

C. A radioactividade emitida pelos isotopos pode ser medida { num contador ou num contador de cintilação, permitindo uma me/ dição qualitativa e quantitativa da radioactividade ligada.

Os agentes complexantes que podem ser usados para a detecção do anticorpo ligado podem ser seleccionados de entre o grupo constituído por biotina (que forma um complexo com avidina e com estreptavidina), proteína A (que forma um complexo com imunoglobulinas) e lectina (que forma um comcom

plexo com determinantes de hidratos de carbono, por exemplo com ' receptores). Neste caso, o complexo não ê detectãvel directamen-, te por si próprio, necessitando de marcação da substância com a I qual o agente complexante forma um complexo. A marcação pode seri

I levada a efeito com qualquer das substâncias indicadas acima para a marcação do anticorpo, isto ê, um cromôforo, uma enzima ou i uma substância radioactiva. |

Quando, no processo da presente invenção, o anticorpo estã acoplado a uma molécula em ponte ligada; a um suporte sólido, a molécula em ponte que serve de ligação en tre o suporte sólido e o anticorpo pode ser seleccionada de entre o grupo constituído por glutaraldeído, carbodiimida, lisina, proteína A e hidrazina. 0 anticorpo pode ser marcado ou não marcado e, de acordo com um modo de concretização do processo da presente invenção, um anticorpo não marcado pode estar acoplado ] j

a um suporte sólido adicionando-se em seguida de forma sequencial a mistura incubada do componente ou análogo e a amostra e o anticorpo marcado.

suporte sólido empregado no processo da presente invenção contêm de preferência um polímero. 0 suporte pode ser constituído ele próprio por um polímero ou pode conter uma matriz revestida com o polímero. A matriz pode ser de; qualquer material sólido adequado para a presente finalidade, tal como vidro, papel ou plástico. 0 polímero que pode constituir por si próprio o suporte sólido ou que estã aplicado sobre uma matriz pode ser seleccionado de entre o grupo constituído por plástico, celulose, tal como papel de nitrocelulose, papel activado por brometo de cianogénio, papel de cloreto de l-(3-nitrobenziloximetil)-piridínio, papel de diazobenziloximetilo, papel de nitrobenziloximetilo ou papel de aminobenziloximetilo, um polímero de silicone e sílica ou um silicato. São exemplos de pl㣠ticos adequados látex, um poliestireno, cloreto de polivinilo, poliuretano, poliacrilamida, acetato de polivinilo e qualquer ! coplímero adequado destes plásticos. Exemplos de polímeros de si licone incluem siloxano; exemplos de silicatos incluem vidro. 0 polímero pode, opcionalmente, conter grupos funcionais a fim de facilitar a ligação de um reagente particular que forme parte da

Ί Λ

X cascata enzimãtica acima explicada, sendo exemplos destes grupos! as moléculas em ponte mencionadas anteriormente, opcionalmente í acopladas a um suporte sólido.

A forma física do suporte sólido não ê particularmente crítica, embora algumas formas possam ser mais convenientes ao uso do que outras para finalidades específi cas. Deste modo, o suporte sólido pode ter a forma de uma placa, por exemplo uma camada fina ou, de preferência, uma placa de microtitulação, ou de tiras, películas ou partículas sólidas, incluindo bactérias revestidas de proteína A, ou papel. As particu las sólidas para utilização no processo da presente invenção têm normalmente uma dimensão na gama de cerca de 1 a 10 um.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS PREFERIDAS DE CONCRETIZAÇÃO

De acordo com uma forma de concretjL zação, o processo da presente invenção compreende

a) o acoplamento de um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogenio ou contra um seu determinante imunolõgico ou suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou peptldeo C ou contra um seu determinante imunolõgico a um suporte sólido ou a uma molécula em ponte acoplada a um suporte sólido,

b) a incubação de uma amostra com um material contendo coagulogê nio de modo a provocar a cisão do coagulogênio dando origem a coagulina e peptídeo C se estiver presente na amostra uma endotoxina ou um material semelhante a uma endotoxina,

c) a adição da mistura incubada resultante da fase b) ao suporte sólido de modo a ligar todo o coagulogenio presente na amostra se o anticorpo acoplado ao suporte sólido ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico, ou de modo a provocar a ligação de toda a coagulina ou todo o peptí deo C presentes na amostra se o anticorpo acoplado ao suporte sólido ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico, • d) adição ao suporte sólido de um anticorpo marcado suscitado

o n contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico de modo a provo car a ligação a todo o coagulogênio presente ligado ao suporte sólido ou suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico de modo a provocar a ligação a todo o coa gulogênio presente ligado ao suporte sólido ou a toda a coagu lina ou todo o peptídeo C presentes ligados ao suporte sólido, e

e) determinação da presença de qualquer endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da detecção de qualquer anticorpo ligado na mistura da reacção resultante da fase d), de tal modo que a detecção de quantidades decrescentes de anticorpo ligado mostra a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico e a detecção de quantidades crescentes de anticorpo ligado mostra a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substan cialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico.

De acordo com uma outra forma de concretização, o processo da presente invenção compreende

a) a incubação de uma amostra com um material contendo coagulogê nio de modo a provocar a cisão do coagulogênio dando origem a coagulina e peptídeo C se estiver presente na amostra uma endotoxina ou um material semelhante a uma endotoxina,

b) a adição da mistura incubada da fase a) a um suporte sólido a fim de ligar todo o coagulogênio presente na mistura ou a fim de ligar toda a coagulina ou peptídeo C presente na mistura.

c) adição ao suporte sólido de um anticorpo marcado suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunológico de modo a provo car a ligação a todo o coagulogênio presente ligado ao suporte sólido ou suscitado contra ou dirigido substancialmente tf**

apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunologico de modo a provocar a ligação a todo o coa gulogênio presente ligado ao suporte solido ou a toda a coaguj lina ou todo o peptídeo C presentes ligados ao suporte sõlidoj e |

d) determinação da presente de qualquer endotoxina ou material ~ ί semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da detecçao de qualquer anticorpo ligado na mistura da reacção resultante da fase c) , de tal modo que a detecção de quantidades decrescentes d e anticorpo ligado mostra a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunologico e a detecção de quantidades crescentes de anticorpo ligado mostra a presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substan cialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunologico.

Em ambas estas formas de concretiza ção pode ser vantajoso lavar o suporte sólido pelo menos uma vez e possivelmente várias vezes depois da reacção da mistura incuba da com o anticorpo a fim de eliminar toto o anticorpo não ligado (deve notar-se que as duas formas de concretização acima resumidas correspondem aos métodos de análise de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) respectivamente directo e duplo). Estes métodos de ELISA são particularmente vantajosos uma vez que se constatou que requerem 40 vezes menos quantidade do componente específico utilizado (isto ê, coagulogênio presente no LAL) do que os métodos normais de coagulação de gel. Para alêm disso, o tempo neces sãrio para realizar o ensaio ê de cerca de 4 horas para várias centenas de ensaios, representando um melhoramento importante so bre os métodos de ensaio conhecidos. Para alêm destas vantagens, os resultados obtidos com amostras clínicas, especialmente com sangue ou plasma, pelo processo da presente invenção não são pre judicados pela presença no sangue de substâncias que interferem de tal modo que o processo pode ser usado para análise de todas

as amostras clinicas. 0 método ELISA ê um método bem estabelecido e pode ser levado a efeito com equipamento de laboratório existente, podendo ainda ser automatizado. 0 presente método tem, por conseguinte, uma ampla aplicação em laboratórios clínicos pa ra fins de diagnóstico e na industria farmacêutica para analise de contaminantes em matérias primas ou em preparados.

De acordo com uma outra forma de concretização, o processo da presente invenção compreende

a) o acoplamento de um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico ou suscitado contra ou dirigido subs tancialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico à superfície de partículas sólidas,

b) a incubação de uma amostra com um material contendo coaguloge nio de modo a provocar a cisão do coagulogênio dando origem a coagulina e peptideo C se estiver presente na amostra uma endotoxina ou um material semelhante a uma endotoxina,

c) a adição da mistura incubada resultante da fase b) ao anticor po da fase a) de modo a causar a aglutinação das partículas sólidas na presença de coagulogênio se o anticorpo ê suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico, ou de modo a causar aglutinação das partículas sólidas na presença de coagulina ou de peptídeo C se o anticorpo ê suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico, e

d) determinação da presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da ausência de aglutinação de partículas sólidas âs quais se encontra aco piado um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico ou por aglutinação das partículas sólidas âs quais se encontra acoplado um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico.

Nesta forma de concretização, a pre sença de uma endotoxina pode ser detectada directamente (visualmente) por determinação da aglutinação das partículas sólidas às quais o anticorpo se encontra ligado. Por outras palavras, normalmente não ê necessária qualquer marcação do anticorpo nesta forma de concretização do processo da presente invenção.

anticorpo monoclonal da presente invenção, que se verificou ser de utilização particularmente van tajosa no presente processo pelas razões acima expostas, pode apresentar as características acima descritas para os anticorpos em geral. Este anticorpo monoclonal pode ser preparado por meio de um processo que compreende

a) a imunização de um animal adequado ou de uma célula de um ani mal adequado com um antigene constituído essencialmente por um componente do lisado de amebócito ou da hemolinfa de límulo ou por um seu anãlogo sintético, ou por um seu determinante imunolõgico ou constituído essencialmente por um produto da reacção do referido componente ou anãlogo com uma endotoxi na ou com um material semelhante a uma endotoxina ou por um seu determinante imunolõgico a fim de obter células que produ zem um anticorpo do referido antigene,

b) a fusão das células que produzem o anticorpo do referido anti. gene com células de mieloma de uma linha de células adequada,

c) a selecção e a clonagem das células de hibridoma resultantes que produzem o referido anticorpo,

d) a cultura das células de hibridoma num meio adequado a fim de produzir o referido anticorpo e

e) a recuperação a partir da cultura do anticorpo resultante.

A imunização do animal ê de preferên cia levada a efeito por meio de uma solução do referido componen te, anãlogo ou produto da reacção num solvente adequado como seja um tampão aquoso, por exemplo uma solução salina tamponizada com fosfato ou um adjuvante. São exemplos de adjuvantes apropria dos o adjuvante de Freund completo ou incompleto e hidróxido de alumínio. Os animais adequados para a imunização podem ser escolhidos de entre o grupo constituído por coelhos, cabras, cavalos, carneiros, ratos, galináceos e cobaias. A colheita de sangue do animal e o isolamento do anticorpo (policlonal) podem ser leva24 dos a efeito de um modo conhecido em si.

As células produtoras de anticorpo usadas para as fusões com as células de mieloma são de preferência células de baço ou células de gânglios linfáticos. As células de mieloma e as células produtoras de anticorpo não necessitam ser derivadas da mesma espécie animal desde que seja possível fundir as células de uma espécie com as células da outra, por exemplo células de rato com células de ratazana, células de ratazana com células humanas ou células de rato com células huma nas. No entanto, ê preferível usar a mesma espécie animal como origem comum das células de mieloma e produtoras de anticorpo. Uma linha de células de hibridoma preferida para a prática da presente invenção pode ser construída por fusão de uma célula de mieloma de rato com uma célula de baço de rato provocada por um antigene.

As fusões de células podem ser leva das a efeito de acordo com uma modificação do método descrito por Kohler e Milstein, Nature 256, 1975, p. 495. Deste modo, a fusão das células produtoras de anticorpo com as células de mieloma ê realizada de preferência na presença de um promotor de fu são, como seja de polietilenoglicol. Ê prêferida uma proporção de cerca de 10 células produtoras de anticorpo por célula de mie loma. A linha de células de mieloma utilizada ê de preferência do tipo designado por resistente a fãrmacos de tal modo que, num meio selectivo, as células de mieloma não fundidas morrem enquan to que as células fundidas, células híbridas, sobrevivem. Na prã tica habitual, as linhas de células que são resistentes à 8-azaguanina e não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil -transferase, sendo por conseguinte incapazes de crescer em meio HAT (contendo hipoxantina, aminopterina e timidina) são mais fre quentemente usadas para a fusão celular. Para além disso, a linha de células de mieloma deverá de preferência ser do tipo não secreção o que significa que não forma por si própria anticorpos ou cadeias de imunoglobulinas pesadas ou leves.

As células de hibridoma produtoras de anticorpo contra o referido componente, análogo ou produto da reacção podem ser seleccionadas por meio de cultura de células

produtoras de anticorpo não fundidas, células de mieloma não fun didas e células fundidas em recipientes individuais e num meio selectivo no qual as células de mieloma não fundidas não se divi dem de modo que acabam por morrer depois de cerca de 1 a 2 semanas. As células produtoras de anticorpo não fundidas vivem apenas durante um número limitado de ciclos de divisão celular, após o que morrem (1 a 2 semanas), enquanto que as células fundidas com êxito continuam a dividir-se porque herdaram as propriedades de crescimento permanente das células de mieloma progenitoras e a capacidade de sintetizarem a enzima hipoxantina-fosforribosiltransferase das células produtoras de anticorpo progenitoras de tal modo que. estas células fundidas só sao capazes de crescer no meio selectivo (no caso presente meio HAT).

Deverã notar-se que os anticorpos monoclonais produzidos pelas células fundidas suscitados contra o mesmo antigene podem, no entanto, ser distintos uns dos outros, dependendo do determinante específico que induz a sua formação.

No entanto, para qualquer clone de hibridoma dado, todos os anti corpos produzidos pelo clone são monoespecíficos para um determi nante particular na molécula de antigene.. Os hibridomas que produzem o anticorpo pretendido podem ser seleccionados, por exemplo por diluição limitante ou por outro método adequado, e podem ser clonados por reclonagem repetida, por exemplo usando um sistema de diluição limitante de um modo conhecido em si, e ê possí^ vel obter anticorpos monoclonais clonados de alta pureza por cul tura das células de hibridoma num meio adequado, por exemplo em meio essencial mínimo de Dulbecco. Por meio desta técnica in vitro , produzem-se anticorpos monoclonais que apenas estão contami nados por quantidades reduzidas de proteínas do soro heterólogo, por exemplo de soro fetal de vitela, presentes no meio de cultura.

A fim de produzir uma concentração significativamente mais elevada de anticorpos monoclonais com uma pureza que apenas ê ligeiramente reduzida em comparação com a dos anticorpos produzidos in vitro, as-células de hibridoma se leccionadas podem também ser cultivadas numa cavidade corporal de um animal. De acordo com este método, injecta-se o clone de

hibrídona pretendido num animal, por exemplo num rato, de preferência um rato singênico ou semi-singênico, dando como resultado a formação de um tumor ascitico que liberta altas concentrações do anticorpo (cerca de 2 a 10 mg/ml) no sangue e no fluído ascítlco do animal. Embora estes animais também produzam imunoglobulinas normais, a quantidade destas serã apenas de cerca de 5% da quantidade de anticorpos monoclonais.

Uma vez que os anticorpos monoclonais da presente invenção são normalmente segregados a partir das células, ê possível recuperã-los a partir do sobrenadante ce lular ou do fluído corporal por técnicas normais de isolamento de produtos extracelulares, incluindo centrifugação, filtração, precipitação, extracção e/ou cromatografia.

Os reagentes individuais a) e b) do conjunto de analise de acordo com a presente invenção podem apre sentar qualquer das características 'descritas acima para o anticorpo e o componente do lisado do amebõcito de límulo, respectivamente. Para além disso,, o conjunto de analise pode ser do tipo que contêm tanto anticorpo marcado como não marcado (em particular para utilização na analise de duplo anticorpo). Outros ingre dientes do conjunto de analise da presente invenção podem ser um padrão de endotoxina, o qual é útil para análises quantitativas em particular, tornando possível a determinação de níveis mais elevados ou mais reduzidos de ligação do anticorpo em comparação com o padrão de comparação, bem como água isenta d.e pirogênios (a fim de evitar resultados erróneos do ensaio em resultado do uso de água contaminada por pirogênios) para a diluição dos reagentes utilizados no conjunto de análise e no processo da presen te invenção.

O conjunto de análise da presente in venção pode ser empregue para o diagnostico de condições clínicas/patológicas que resultem de infecções por uma ampla variedade de agentes patogênicos, incluindo bactérias gràm-negativas (por exemplo Enterobacteraceae, por exemplo E. coli, Shigella dysenteriae, Pseudomonas spp., Salmonella spp., Neisseria spp., Clostridlum spp., Vibrio cholerae, Pasteurella spp.) e bactérias gram-positivas (por exemplo Listeria monocytogenes e Streptococ_ 0-7 _

cus spp.); Mycoplasma spp.; Chlamydia spp; Treponema pallidum; fungos (por exemplo Candida alblcans) e protozoários como sejam os parasitas da matéria Plasmodium falsiparum. 0 conjunto de anã lise é também útil para a detecção da contaminação de matérias primas e preparados farmacêuticos e de instrumentos médicos quer por estes agentes patogênicos por si próprios quer pelas endotoxinas residuais ou por outros antigenes de superfície derivados dos agentes patogênicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra que a banda do coagulogênio desaparece depois da reacção de lisado de amebócito de Limulus com uma endotoxina, indicando a perda de reactividade do coagulogênio com o anticorpo.

A Figura 2 mostra que o coagulogênio residual medido por um ensaio de ELISA ê inversamente propor cional â concentração de endotoxina.

AS Figuras 3 a 6 apresentam curvas de reacção LAL-endotoxina resultantes de diferentes combinações de tempos de incubação e de diferentes diluições do LAL.

A Figura 7 mostra que o tratamento do plasma com uma diluição de 10 vezes seguido de 10 minutos de incubação a 759 C dá origem a uma recuperação de quase 100% de endotoxina, enquanto que apenas se conseguia cerca de 50% pelos outros dois tratamentos.

As Figuras 8 e 9 apresentam curvas de ELISA de LAL de 8 LPS de várias estirpes de bactérias gram-ne gativas (Fig. 8) e de (1-3) - ^-D-glucano (Fig. 9). Os LPS usados foram de Salmonella enteritidis (A), E. coli J5 (V), Pseudomonas aeruginosa (¥), Salmonella abortus equi (Δ), E. coli 055:B5 (o), Salmonella typhlmurium (), E. coli 0111:B4 (·) e Salmonella min· nesota ( ). O símbolo (+) na Figura 8 indica as posições do valor da absorvância do LAL obtido em água isenta de endotoxinas.

A Figura 10 apresenta o efeito da diluição sobre EIA50 de soro humano (D), plasma humano (g), poli mixina (t) e plasma de Limulus (o). 0 soro humano e o plasma foram preparados a partir de um voluntário. 0 plasma de Limulus

foi o sobrenadante isento de células preparado por centrifugação do sangue reunido de doze Limulus polyphemus a 5000 x g durante minutos.

A invenção ê ilustrada adicionalmen te por meio dos exemplos não limitativos que se seguem.

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EXEMPLO 1

Preparação de um anticorpo monoclonal contra coagulogênio (LAL)

1. Preparação e purificação de coagulogênio

Produziu-se um lisado de amebõcito de Limulus a partir de Limulus polyphemus por métodos usuais con forme descrito por Tvede M, e Baek L, Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B 91, 1983, pp. 9-15.

Dialisaram-se 10 ml de lisado e mis.

turaram-se com um volume igual de tampão de Tris.HCl 0,05 M de pH 7,9 contendo CaCl₉ 2 mM. Aplicou-se a mistura a uma coluna de (R)

DEAE-Sepharose CL-6B (15 x 1,5 cm) equilibrada com o mesmo tampão. A fracção que não foi absorvida na coluna foi em seguida aplicada a uma outra coluna de Heparina-Sepharose( ) CL-6B equilibrada com o mesmo tampão de Tris. Nestas condições o coagulogê nio ficou ligado â coluna de Heparina-Sepharose' ⁷ mas foi possí^ vel eluí-lo com um tampão de Tris.HCl 0,05 M de pH 7,9 contendo NaCl 0,15 M e CaC^ 2 mM. O material eluido continha coagulogênio de pureza >90%, conforme determinado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

2. Imunização de ratos Balb/c com coagulogênio

Adsorveu-se coagulogênio purificado conforme obtido na fase 1 acima em gel de hidróxido de alumínio (Al(OH)g) correspondendo a 200 pg de coagulogênio/mg de A1(OH)₃) e ajustou-se a suspensão a 1 mg de Al(OH)₃)/ml.

Para a imunização primária, cada ra to foi injectado por via intraperitoneal com 0,5 ml de suspensão de coagulogênio emulsifiçada com 0,5 ml de adjuvante de Freund incompleto (correspondente a 100 pg de coagulogénio/rato). Duas

semanas mais tarde, cada rato recebeu uma injecção de reforço por via intraperitoneal de 0,5 ml de suspensão de coagulogênio sem adjuvante de Freund.

No dia 28 injectou-se uma dose simi lar e 4 dias mais tarde retirou-se o baço e preparou-se uma suspensão de células de baço por dissecação cuidadosa e disrupção do baço. As células de baço resultantes foram usadas para fusão de células na fase seguinte.

3. Fusão e cultura de células

As células de baço obtidas acima fo ram misturadas com células de mieloma (X63Ag8.653) numa proporção de 10:1 (10 células de baço para 10?· células de mieloma) e foram incubadas com uma solução de polietileno-glicol (50% p/v de PEG 1500, 7% p/v de DMSO (dimetilsulfóxido) em solução salina tamponizada) durante 90 segundos a 379 C a fim de promover a fusão das células. Adicionaram-se'20 ml de meio essencial mínimo de Dulbecco (MEMD) e centrifugaram-se as células a 1 000 x g. O aglomerado celular foi ressuspenso em 100 ml de meio HAT (conten do hipoxantina, aminopterina e timidina) contendo 10% de soro fe tal de vitela e distrlbuiram-se as células em 10 placas de micro titulação de 96 alvéolos (NUNC, Dinamarca). A cada alvéolo ti4 nham sido adicionadas 10 celulas/alveolo de ratos normais como células de alimentação a fim de promover o crescimento celular e de inibir a contaminação microbiana. O meio foi mudado duas vezes por semana.

4· Selecção de células de hibridoma que produzem um anticorpo anti-coagulogénio

Seleccionaram-se clones positivos por meio de uma analise de imunosorvente ligado a enzima (ELISA). Revestiram-se placas de microtitulação de 96 alvéolos (Immunopla tes, NUNC, Dinamarca) com coagulogênio que tinha sido purificado conforme descrito acima. O coagulogênio foi diluído num tampão de carbonato de pH 9,0 até 2 pg/ml e adicionaram-se 100 p.1 de tampão contendo coagulogênio a cada alvéolo. Após incubação de um dia para o outro a 49 C, lavaram-se os alvéolos quatro vezes

- in com solução salina tamponizada com fosfato (SSTF) contendo 0,05% de Tween20.

Incubaram-se os alvéolos durante uma hora com 100 μΐ de sobrenadante das culturas das placas de fusão das células preparadas na fase 3 diluído 1:10 em SSTF con(R) tendo 0,02% de Tween^{K 7}, lavaram-se e incubaram-se durante uma hora com Ig de coelho anti-rato conjugado com peroxidase (Dakopatts, Copenhaga, cédigo P260, diluído 1:1000). Fez-se reagir a peroxidase com 5 F¹ de uma solução de H₂O₂ a 35% em 10 ml de um tampão de citrato-fosfato (7,3 g de ácido cítrico.H₂O e 11,86 g de Na₂HPO₄.2H₂O por 1000 ml de água destilada) a pH 5,0 contendo 8 mg de ortofenileno-diamina. A reacção foi feita parar com H₂SO₂ e a absorvância foi lida a 492 nm.

Após uma cultura durante 2 semanas, os sobrenadantes de 17 alvéolos apresentaram uma reacção fortemente positiva. As células de hibridoma de 10 destes alvéolos fo ram seleccionadas e clonadas e reclonadas por diluições limitantes. Foram estabelecidos 7 clones estáveis. Os clones de células de hibridoma resultantes foram cultivados em balões de cultura de células em meio MEMD suplementado com 10% de soro fetal de vi 7 tela a 379 C, 5% de CO₂ e 90% de humidade e ingectaram-se 10 ce lulas em ratos tratados com pristano (ratos injectados por via intraperitoneal duas semanas antes com 1 ml de pristano) o que, apôs um certo tempo de incubação, leva â formação de um tumor no rato libertando altas concentrações de anticorpo (2,3 mg/ml) no respectivo sangue e no líquido ascítico.

5· Purificação dos anticorpos monoclonais

Concentraram-se os sobrenadantes das culturas num sistema de ultrafiltração Milipore. Adicionou-se NaCl até 3,3 M, glicina até 1,65 M e ajustou-se o pH a 8,85 com NaOH 0,2 M. Os anticorpos foram em seguida feitos passar através de uma coluna de proteína A. Os anticorpos ligados foram eluídos com citrato-fosfato 0,1 M de pH 2,8. Ajustou-se o pH a 8,0 com tris.HCI. A quantidade de anticorpo foi medida num espec trofotômetro por meio da Α₂θθ, admitindo-se que Α₂θθ/1% =14. Pa ra uma determinação mais precisa usou-se um método de ELISA que apenas mede o anticorpo de rato. Revestiram-se placas de microti tulação com imunoglobulina anti-rato de coelho (Dakopatts, código 2109) diluída a 1:1500 em SSTF. Adicionaram-se séries de diluição de um padrão conhecido de Ig de rato (20 jig de Ig de rato/ml) e diluições de amostras desconhecidas. A Ig de rato ligada foi detectada com Ig anti-rato de coelho conjugada com peroxi dase (Dakopatts código P260) diluída a 1:1000. Ê possível calcular as concentrações desconhecidas de Ig de rato a partir de uma curva padrão.

anticorpo do fluído ascítico foi purificado essencialmente do mesmo modo. No entanto, o fluído as cítico foi diluído 1:1 com um tampão NaCl/glicina/NaOH tal como descrito acima antes de ser aplicado na coluna de proteína A.

6. Caracterização dos anticorpos monoclonais

Ensaiaram-se as classes e as subclasses dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma por meio de um método de ELISA com anticorpos de coelho contra Lg de rato específicos em relação às classes/subclasses marcados com biotina (Zymed Corporation, EUA). O método era essencialmente idêntico ao descrito acima para as medidas das quantidades de Ig de rato, excepto em que a detecção dos anticor pos foi levada a efeito com anticorpos de coelho contra IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM ou IgA de rato marcados com biotina. A ligação foi finalmente detectada com estreptavidina marcada com peroxidase. Todos os anticorpos eram da subclasse IgGl e tinham cadeias K leves.

EXEMPLO 2

Reactividade dos anticorpos monoclonais com coagulogénlo em lisado de amebócitos de Limulus e falta de reactividade com lisado de amebócito de Limulus previamente reagido com endotoxina

Aplicaram-se 3 μΐ de lisado de amebócito de Limulus (LAL) e LAL que se tinha previamente feito rea gir com lipossacarídeos (LPS) a um gel de agarose (1%) e subme-

teu-se a electroforese durante duas horas a 20 V/cm. Depois da electroforese, colocou-se um pedaço de papel de nitrocelulose por cima do gel de agarose e manteve-se uma pressão de 5 kg durante cerca de 20' minutos a fim de ligar as proteínas no gel de agarose ao papel de nitrocelulose. Os locais de ligação em exce£ so no papel de nitrocelulose foram bloqueados com 0,05% de Tween 20.

O papel de nitrocelulose foi em seguida incubado com um anticorpo monoclonal conforme descrito no

Exemplo 1. Adicionaram-se 200 pl do sobrenadante da cultura con(R) tendo o anticorpo a 50 ml de SSTF contendo 0,02% de Tween^k ' 20. Depois de se incubar de um dia para o outro, adicionou-se um anticorpo secundário marcado com uma enzima (de coelho anti-rato conjugado com peroxidase, Dakopatts, Copenhaga) diluído a 1:1000. Por fim, adicionou-se tetrametilbenzidina e H₂O₂ (dissolveu-se tetrametilbenzidina (24 mg) com 80 mg de sulfassuccinato de dioc tilo e sódio em 10 ml de etanol e adicionou-se a 30 ml de tampão de citrato-fosfato a pH 5,0 e 20 pl de ^H2°2 ^a 3θ%· Adicionou-se água destilada atê 50 ml). O anticorpo ligado foi visualizado sob a forma de uma mancha de azul forte. Verifica-se na Figura 1 que o anticorpo monoclonal reage com coagulogênio em LAL que não tinha reagido mas não com LAL que tinha reagido com LPS. O método de mancha imunológica empregado foi no restante conforme descrito em C. Koch et al., J. Immunological Methods 84, 1985, pp. 271-278.

EXEMPLO 3

Detecção de endotoxina por meio de uma análise de imunosorvente ligado a enzima (ELISA)

A cada um de vários tubos de ensaio pequenos adicionaram-se 10 pl de uma preparação comercial de LAL (adquirida a Association of Cape Cod, Woodshole, MA, EUA) que ti nha sido reconstituída e diluída a 1:4 num tampão de tris.Mg⁺⁺ isento de pirogênios. Adicionaram-se a cada tubo 10 pl de uma amostra contendo várias concentrações (ver Fig. 2) de endotoxina • do padrão de referência da USP /E. coli 055:B5, Whitaker M.A.

Bioproducts, Inc., Walkersville, EUA/ (incluindo uma amostra de comparação negativa que ê um tampão isento de toxina). Incubou-se a mistura a 379 C durante uma hora. Fez-se parar a reacção por adição de 0,5 ml de tampão de carbonato a pH 9,6 (contendo 1,59 g de Na2COg por 1000 ml de ãgua destilada) a cada tubo, Fizeram-se diluições 1:50 de cada tubo no tampão de carbonato.

Adicionaram-se 100 pl da mistura in cubada diluída a cada alvéolo de uma placa de microtitulação de 96 alvéolos (NUNC, Dinamarca). Depois de incubar durante uma hora à temperatura ambiente, lavaram-se as placas quatro vezes com SSTF (contendo 29,2 g de NaCl, o,2 de KC1, 0,2 g de KH PO., 1,15 g de NaHPO^^H^O e 10 ml de Triton^v ' x por 1000 ml de ãgua destilada) . Conjugou-se peroxidase de rãbano bastardo com um anticorpo anti-coagulogênio monoclonal preparado conforme descrito no Exemplo 1 pelo método do periodato essencialmente conforme descrito por Wilson e Nakane (62). Deste modo, misturaram-se 4 mg de PRB dissolvidos em 1 ml de ãgua destilada com 0,1 ml de uma solução de NaIO₄ 100 mM preparada de fresco e agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Esta solução foi dialisada de um dia para o outro a 49 C contra tampão de acetato de sódio 1 mM (pH 4,4) e em seguida foi misturada com 8 mg de anticorpo monoclonal (dissolvido em 1 ml de tampão de carbonato 50 mM de pH 9,5). Depois de agitar durante 2 horas â temperatura ambiente, adicionou-se 0,1 ml de solução de NaBH^ preparada de fresco (4 mg/ml) e incubou-se durante 2 horas a 49 C. O conjugado resultante foi dialisado contra solução salina tamponizada por fosfato (SSTF, pH 7,3) a 49 C de um dia para o outro. Adicionou-se em se guida um volume igual de glicerol (87%) e conservou-se a -209 C. Adicionaram-se aos alvéolos 100 jil do anticorpo monoclonal conju gado com peroxidase diluído a 1:20 000 em tampão de diluição (10 g de albumina de soro de bovino em 1000 ml de tampão de lavagem de pH 7,2) e incubou-se durante uma hora. Depois de lavar as pia cas quatro vezes com SSTF adicionaram-se 100 jul da solução de co loração /contendo 7,3 g de acido cítrico.I^O, 11,86 g de Na2HPO_4< 2H2O por 1000 ml de ãgua destilada a que se tinha adicionado um substrato de peroxidase (40 mg de ortofenileno-diamina dissolvidos em 100 ml de tampão de coloração a que se tinham adicionado

p.1 de peridrol)_7. Depois de 30 minutos, fez-se parar a reacção com H₂SO^ 1 M e mediu-se a absorvância a 492 nm.

A Figura 2 apresenta uma curva padrão que mostra os resultados da adição de várias quantidades de endotoxina â amostra. É evidente a partir da curva que a sensibi lidade (gama de detecçao) do processo da presente invenção se si tua na gama de 10 a 0,75 pg de endotoxina/ml.

No ensaio descrito neste exemplo, o coagulogénio da mistura incubada ê acoplado directamente à placa de microtitulação e, se está presente uma endotoxina, estarão presentes menores quantidades de coagulogénio, dando como resultado uma diminuição detectãvel na quantidade do anticorpo ligado no ensaio em comparação com uma amostra de comparação isenta de endotoxina.

As Figuras 3 a 6 mostram curvas de reacção de LAL (coagulogénio) com endotoxina em diferentes condi ções de tempos de incubação e de diluição do LAL; verifica-se a partir das curvas que (1) a detectabilidade da endotoxina aumenta com o aumento dos tempos de incubação para todas as diluições de LAL, sendo mais rapida para as diluições superiores; (2) observou-se a mesma detectabilidade a uma diluição de 1:4 e a diluições inferiores depois de 30 minutos de incubação e a diferen ça de detectabilidade entre todas as diluições diminuía com o au mento do tempo de incubação; (3) a distribuição mais ampla da con centração de endotoxina que era possível medir foi verificada nas curvas em que se usaram altas diluições de LAL.

O método de ensaio de ELISA usando o processo da presente invenção foi comparado com um método imunoelectroforêtico de projecção (descrito em 43) e com o método convencional de coágulo de gel (no qual se misturou 0,1 ml de LAL reconstituído em tampão de tris-MG⁺⁺ isento de pirogênios num tubo de ensaio de vidro (10 x 75 mm) com 0,1 ml de solução de en dotoxina. A formação de um gel firme capaz de se conservar intac to quando se invertia o tubo foi considerada como um resultado positivo, sendo considerados negativos todos os outros resultados. Os resultados são apresentados no Quadro II.

QUADRO II

Comparação de três métodos de análise de endotoxina

ELISA-LAL

Endotoxina (pg/ml)

A₄₉₂ nm

RIE-LAL projecção cm

COÁGULO DE GEL + ou -

0	2.02	4.7
0.78	1.96	4.2
1.56	1.64	3.0
3.12	1.00	1.5
6.25	0.15	0
12.5	0.07	0
25	0.07	0

Consumo relativo 1/40 1/2 de LAL tempo necessário 4 (horas) quantificação sim sim aplicabilidade a plasma sim sim ?

Verifica-se a partir do Quadro II que o novo processo ê mais favorável quando comparado com o mêto do imunoelectroforêtico de projecção e que pode detectar uma con centração 8 vezes inferior de endotoxina em relação ao método do coágulo de gel.

Uma das vantagens do método de ELISA-LAL reside em que as curvas padrão com a sensibilidade deseja da podem ser obtidas a partir de um lote de LAL comercial por ajuste da diluição e do tempo de incubação do LAL. Conseguiu-se uma sensibilidade de 0,1 pg de endotoxina (Fig. 6).

·'····..

4B«W .

«— niÊ^tniSgpa

Com a aceitação oficial do ensaio de LAL como um ensaio para pirogenios, verificou-se uma grande procura para o reagente comercial de LAL. Uma vez que a única fonte de LAL ê o límulo, um invertebrado que se encontra em vias de extinção, o desenvolvimento de um ensaio de LAL sensível que minimize o consumo de LAL tem uma grande importância. A alta sen sibilidade do método de ELISA para a detecção de coagulogênio (foi atingido um valor de ^-^2 ⁼ 2/0 mesmo quando a diluição ori ginal do LAL era de dez mil vezes) proporciona a possibilidade de se poderem usar quantidades de LAL muito pequenas neste método. Calcula-se que, considerando o volume e a diluição do LAL, apenas se necessite no método de ELISA-LAL de 1/160 da quantidade de LAL usada no método de coágulo de gel para a mesma sensibi lidade. Normalmente o método de ELISA-LAL que tem uma sensibilidade 10 vezes superior ao método do coagulo de gel necessita de apenas 1/40 da quantidade de LAL usada neste último método.

Para além do consumo mínimo de reagente de LAL, o método de ELISA-LAL necessita de quantidades mui to pequenas de amostras. 10 pl de amostra são suficientes para a realização de um ensaio, em contraste com os 100 p.1 normalmente usados noutros ensaios de LAL. Esta vantagem pode tornar-se importante nos casos em que apenas se dispõe de quantidades muito pequenas de amostras.

EXEMPLO 4

Detecção de endotoxinas numa amostra clínica

A fim de demonstrar a capacidade do método da presente invenção para detectar a presença de uma endo toxina numa amostra de soro com o mesmo limite de detecção da so lução tampão, adicionou-se endotoxina padrão de referência USP (ver Exemplo 3) a plasma humano isento de LPS diluído 10 vezes em âgua até uma concentração final de 200 pg/ml. A amostra de comparação era endotoxina em âgua isenta de pirogenios.

Depois de se ter adicionado o LPS, submeteu-se o plasma a um tratamento térmico durante 15 minutos a 659 C, 10 minutos a 759 C e 5 minutos a 1009 C, respectivamen37

Λ·¹»»!·

IWiefeAtt te, para três amostras diferentes.

ensaio foi levado a efeito em duplicado de modo substancialmente idêntico ao descrito no Exemplo 3 por preparação de uma série de diluições de cada uma das soluções de plasma obtidas acima usando como diluente plasma isento de LPS diluído e aquecido de modo idêntico. Os resultados são apresentados na Figura 7, a partir da qual se verifica que o tra tamento do plasma durante 10 minutos a 759 C era o tratamento õp timo para a determinação quantitativa de LPS. Os valores de A^g₂ observados na amostra de comparação de agua isenta de endotoxina não eram significativamente diferentes dos observados nas amostras de plasma (dentro da limitação da variação do método de ELI SA-LAL), indicando que os níveis de endotoxina nestas amostras estavam abaixo de 4 pg de endotoxina/ml (o limite de detecção) e que o método de ELISA-LAL não sofria interferência pela cor nem pela turvação do plasma. Os resultados obtidos demonstram que o processo da presente invenção é também útil como um processo sen sível de analise de amostras clínicas para a presença de endotoxina.

EXEMPLO 5

Preparação de um anticorpo monoclonal contra coagulogênio (LAT)

Usando essencialmente o mesmo proce dimento descrito no Exemplo 1 mas substituindo o LAL por lisado de amebõcito de Tachypleus (LAT) (Tachypleus tridentatus) como material de partida, preparou-se um anticorpo monoclonal contra coagulogênio de LAT. O anticorpo era reactivo no ensaio de ELISA descrito no Exemplo 3.

EXEMPLO 6

Preparação de um conjugado de anticorpo anti-coagulogênio monoclonal com blotlna

Conjugou-se biotina com um anticorpo anti-coagulogênio preparado conforme descrito no Exemplo 1 co

- 38 7

cu

mo se segue:

Dialisou-se 1 ml de uma solução de anticorpo monoclonal purificado (1 mg de IgG/ml) contra tampão de NaHCOg 100 mM (pH 8,0) a 4? C de um dia para o outro e em seguida misturou-se com 5 pl de N-hidroxi-succinimidobiotina (40 mg/ml; Sigma Chemical Co.). Após agitação à temperatura ambiente durante 2 horas, a mistura foi dialisada contra SSTF (pH 7,3) a 49 C de um dia para o outro. Adicionou-se o conjugado a um volume igual de glicerol (87%) e conservou-se a -209 C.

Este conjugado foi utilizado num procedimento de ELISA por adição de 100 pl de uma mistura de LAL e endotoxina padrão diluída incubada (preparada conforme descrito no Exemplo 3) a cada alvéolo de uma placa de microtitulação de 96 alvéolos (NUNC, Dinamarca) e incubação durante uma hora â temperatura ambiente. Após quatro lavagens com tampão de lavagem conforme descrito no Exemplo 3, adicionaram-se 100 pl do conjuga do anticorpo monoclonal-biotina diluído a 1:2000 em tampão de di luição. Após incubação durante 1 hora, lavou-se a placa 4 vezes. Em seguida adicionaram-se 100 pl de conjugado de avidina-PRB (Sigma Chemical Co.) diluído a 1:4000 em tampão de diluição e in cubou-se a placa durante 1 hora. A placa foi lavada 4 veezes e adicionaram-se 100 pl de solução de substrato (conforme descrito no Exemplo 3). Depois de 10 minutos de incubação, fez-se parar a reacção por meio da adição de 150 pl de I^SO^ 1 Μ. A absorvância foi medida a ^A4g₂·

O método de ELISA que usa um conjugado de PRB com anticorpo monoclonal inclui menos uma fase do que o método de ELISA que usa um conjugado de anticorpo monoclonal com biotina (a utilização de PRB-avidina) mas ê muito mais fácil de produzir o conjugado de anticorpo monoclonal com biotina do que o conjugado de PRB com anticorpo monoclonal. Os conjugados eram estáveis quando conservados abaixo de 09 C. Uma vez que 1 mg do anticorpo monoclonal é suficiente para 20 000 ensaios simples, a utilização do anticorpo monoclonal não tornará caro o mê todo ELISA-LAL.

Ensaio de varias endotoxinas diferentes e de (1-3)-^3-D-glucano

EXEMPLO Ί por ELISA-LAL padrão de referência de endotoxi-) na foi adquirido a Whittaker M.A. Bioproducts, Inc. (10 ng/frasco). Os LPS (W) de Salmonella minnesota, Escherichia coli 0111: :B4, Escherichia coli 055:B5, Salmonella abortus egui, Salmonella typhimurium e Salmonella enteritidis foram adquiridos a Difco Laboratories (Detroit, Michigan). Os LPS de alto grau de pureza de Escherichia coli J5 e de Pseudomonas aeruginosa foram gentilmente cedidos pelo Dr. Anders Fomsgaard (Departamento de Doenças Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhaga).

Todos estes LPS foram reconstituídos e diluídos atê a uma concentração de 1 mg/ml e congelados a -209 C atê serem usados. Imediatamente antes da análise, prepara ram-se várias diluições de LPS em ãgua isenta de endotoxina. Todas as analises de LPS foram levadas a efeito em duplicado e foram calculadas médias dos valores salvo indicação em contrário.

Tornou-se (1-3)-D-glucano de Alcaligenes faecalis var. myxogenes IFO 13140 (Curdlan, Wako Pure

Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão) isento de endotoxina conforme descrito por Obayashi et al. (63). A solução concentrada (1 mg/ml) foi conservada a 49 C até utilização.

O método ELISA-LAL foi levado a efei to conforme descrito no Exemplo 3 usando um conjugado de PRB-anticorpo monoclonal.

As Figuras 8 e 9 apresentam as curvas da analise por ELISA-LAL de 8 LPS purificados e a curva de (1-3)- jô-D-glucano. As curvas dos LPS apresentam um declive acen tuado sendo aparentemente paralelas entre si, o que implica uma similaridade intrínseca na sua reacção com LAL apesar de existir uma grande diferença de actividade. A actividade do (1-3)-^$ -D-glucano era pelo menos 1000 vezes mais baixa e o declive da res pectiva curva de reacção era muito menos acentuado do que o da dos LPS, indicando uma velocidade de reacção com LAL muito mais baixa.

Tem sido descrito que vãrias outras

substâncias para além das endotoxinas causam reacções positivas a altas concentrações (60,47). Mostrou-se que o (1-3) -β -D-gluca no podia reagir com LAL a uma concentração de 1 ng/ml, sendo a substância mais activa a seguir âs endotoxinas (23). No entanto, as conclusões destes estudos foram frequentemente postas em causa devido à possível contaminação de endotoxinas nos materiais ensaiados. No presente estudo o (1-3) - -D-glucano foi ensaiado selectivamente usando o método de ELISA-LAL e a sua reactividade era pelo menos 1000 vezes inferior à das endotoxinas. Para além disso, o (1-3)-(5 -D-glucano parece comportar-se de um modo intrinsecamente diferente do das endotoxinas, como ê evidenciado pela sua velocidade de reacção com LAL muito mais baixa. Este facto pode ser explicado pela descoberta de Morita et al. (23) de que a activação do LAL por (1-3)-β -D-glucano ê realizada por uma via diferente da das endotoxinas. Julga-se que as duas vias têm uma fase em comum, nomeadamente a activação da pro-enzima de coagulação. Deste modo, a activação de qualquer das duas vias re sulta na cisão do coagulogênio e na perda da sua antigenicidade. O método de ELISA-LAL pode ser uma ferramenta útil para um estudo mais aprofundado das substâncias com capacidade de reagir com LAL, uma vez que as reacções das endotoxinas e do (1-3)-D-glu cano com LAL podem ser distinguidas cineticamente.

EXEMPLO 8

Detecção de endotoxina em plasma

Depositou-se sangue venoso de pacientes com suspeita de sepsia quando admitidos em tubos de vidro isentos de endotoxinas e contendo heparina (10 IU/ml de sangue). Diluiu-se plasma preparado por centrifugação a 2000 rpm durante 15 minutos 10 vezes em água isenta de endotoxinas e em seguida submeteu-se a aquecimento a 75? C durante 10 minutos. A analise por ELISA-LAL subsequente foi levada a efeito conforme descrito no Exemplo 3, excepto em que o LAL foi reconstituído conforme in dicado pelo fornecedor. 0 limite de detecção da analise de ELISA * -LAL para endotoxinas em plasma foi de 4 pg de endotoxina/ml. As • concentrações de endotoxinas em especimens foram calculadas a

- 41 partir da curva padrão tomando em consideração o factor de dilui ção.

Quadro III apresenta os resultados da determinação de endotoxina nas amostras de plasma de 10 pacientes. Os níveis de endotoxina nestes pacientes com sepsia era geralmente baixo e nem sempre estava em relação com os resul tados da cultura bacteriana do sangue ou do fluído cerebroespinal (FCE).

O paciente nÇ. 1 tinha uma história de infecção por gonorreia e ao ser admitido suspeitou-se de sepsia. Não se conseguiu efectuar uma cultura das bactérias mas encontrou-se um aumento significativo do anticorpo específico da gonorreia no sangue. 0 paciente n?. 4 tinha bactérias gram-positivas no sangue e no FCE e morreu de shock séptico 4 dias depois da admissão. O paciente n9. 8 tinha uma suspeita de urosepsia e tinha uma bacteriuria significativa. O paciente n9. 9 tinha uma suspeita de sepsia meningocõcica mas não se conseguiu qualquer cultura de bactérias por ter sido tratado com penicilina antes da admissão.

A presença de concentrações muito baixas de endotoxina no sangue dos pacientes com sepsia (Quadro III) mostra a necessidade de um ensaio de LAL sensível. Ê interessante notar que não foram encontradas amostras de sangue normal com um conteúdo de endotoxina superior ao limite de detecção do ensaio de ELISA-LAL (4 pg de endotoxina/ml).

Para conclusão, o método de ELISA-LAL constitui um ensaio de LAL promissor para a detecção clínica de endotoxina porque tem uma alta sensibilidade, sofre menos interferências do plasma, tem um consumo mínimo de reagente de LAL e de amostra, apresenta boa reproductibilidade e ê de fácil realização.

»

ι
		QUADRO	III
	Detecção	de endotoxina	em amostras de plasma
		de pacientes	com sepsia
Pac.	Diagnóstico	Cultura de	Cultura	ELISA-LAL	Outros
η9.	clínico	sangue	de FCE	pg de	critérios
				CSE/ml	de diag.
1.	Gonorreia	neg	neg	200	Febre, artrite, vas culjLte, TAG+ elev.
2.	Mielomatose	P.aeruginosa	neg	24
3.	Meningite	neg	N.menin gitidis	28	Petêquia na pele, sepsia
4.	Meningite purulenta	S.pneumoniae	S. pneu	20	K.pneumoniae no pulmão
5.	Meningite purulenta	neg	N.men-	8	Petêquia na pele, sepsia
6.	Febre tifóide	S. typhosa	neg	9
7.	Meningite purulenta	N.meningiti	neg	8	Petêquia na pele, septicemia
8.	Meningite	neg	neg	8	Petêquia na pele, sepsia
9.	Septicemia	neg	neg	11	>10^E.coli
				na urina
10.	Meningite	neg	N.me-	8	Petêquia na pele, sepsia
+	Titulo de Anticorpos de Gonorreia
		- 43

EXEMPLO 9

Análise da actividade de inactivação de endotoxina do plasma humano

A inactivação em dependência da dose de LPS por soro e plasma humanos, plasma de Limulus, LAL e po limixina B foi demonstrada pelo método de ELISA-LAL descrito no Exemplo 3.

A cada tubo de vidro isento de endo toxina adicionaram-se secessivamente 50 μΐ de cada uma das amostras a analisar (soro e plasma humanos, plasma de Limulus, LAL e polimixina B) e 50 μΐ de LPS (E. coli 0111:B4) em várias diluições em solução salina estéril. Misturou-se bem o conteúdo de ca da tubo e incubou-se a 379 C durante 1 hora. As soluções referidas foram diluídas pelo menos 1000 vezes em ãgua isenta de endotoxina a fim de alcançar a gama de análise de LPS (1 a 100 pg/mí bem como para eliminar a possível interferência de amostras com o ensaio LAL subsequente. A determinação quantitativa do LPS residual foi feita usando LAL combinado com uma determinação por ELISA de coagulogênio, conforme descrito no Exemplo 3.

Todas as análises foram realizadas de forma independente pelo menos em duplicado e os valores foram calculados como médias.

A reacção do LAL com LPS gerou uma curva linear entre a absorvância e a concentração de LPS, determinada por um método de ELISA-LAL usando um anticorpo monoclonal contra coagulogênio, conforme descrito no Exemplo 3. A inibição pelo soro da reacção foi significativa mesmo guando a amostra de soro estava diluída 100 vezes. No entanto, a inibição desapareceu totalmente quando o soro estava diluído mais de 250 veezes.

A Figura 10 apresenta a inactivação de forma dependente da dose de LPS por soro e plasma humanos, po limixina B e plasma de Limulus. Não se observou qualquer diferen ça entre a EIA50 do soro e do plasma humanos. O plasma de Limulus aparentemente tinha uma capacidade significativamente mais elevada de inactivação de LPS do que o plasma humano.

Estes resultados indicam que o meto do de ELISA-LAL descrito no Exemplo 3 pode ser usado para anali- 44 -

sar o plasma a fim de determinar o seu efeito de inactivação de endotoxinas. 0 plasma que, de acordo com esta análise, possua um alto efeito de neutralização das endotoxinas pode ser administra do a pacientes com sepsia a fim de melhorar o respectivo estado.

INSTRUÇÕES

Ê possível detectar a activação do factor C por uma endotoxina por preparação do factor C de acordo com o método descrito por Nahamura et al. (64). Pode preparar-se então um anticorpo monoclonal contra o factor C purificado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. Este anticorpo monoclonal pode então ser conjugado tal como descrito nos Exemplos 1 ou 6 e pode ser usado num método de ELISA-LAL conforme descrito no Exemplo 3.

Este procedimento corresponde essen cialmente ao descrito no Exemplo 3 com a excepção de que se determina a perda de antigenicidade do factor C e não do coagulogê nio à medida que o factor C ê convertido em factor C activo ao reagir com endotoxina.

Ê também possível detectar a activa ção do factor G por (1-3)-β -D-glucano por preparação de factor G de acordo com o método descrito por Morita et al. (23) e prepa ração e conjugação de um anticorpo monoclonal contra o factor G pelo procedimento descrito nos Exemplos 1 ou 6. Este anticorpo monoclonal conjugado pode então ser usado num método de ELISA-LAL conforme descrito no Exemplo 3.

Admite-se que, uma vez preparados os anticorpos monoclonais contra os factores C e G, ê possível empregar o mesmo lisado para três ensaios diferentes usando factor G, factor C e coagulogênio como componentes do lisado, cuja presença ou ausência ê detectada. Admite-se ainda que estes ensaios podem ser levados a efeito na mesma placa de microtitulação, acelerando deste modo o procedimento de, por exemplo, deter minação da causa de sepsia em pacientes sépticos.

REFERÊNCIAS

1. Levin J, Bang FB (1968). Clottable Protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197.

2. Levin J, Bang FB (1964). A description of cellular coagulogen in limulus. Buli. Johns. Hopkins Hosp. 115, 337-345.

3. Bang FB (1958). A bacterial disease of Limulus polyphemus. Buli. Johns. Hopkins Hosp. 98, 325-351.

4. Jorgensen JH, Smith RF (1974). Measurement of bound and free endotoxin by the Limulus assay. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 146, 1024-1031.

5. Fleishman J, Fowlkes F (1982). A comparison of pyrogenicity of bacterial endotoxins from a variety of Gram-negative bactéria as determined by the LAL test. Prog. Clin. Biol. Res. 93, 131-140.

6. Weary ME, Donohue G, Pearson FC, Stony K (1980). Relative po tencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Appl. Environ. Microbiol. 40, 1148-1151.

7. Food and Drug Administration 1983. Draft guideline for validation of the Limulus amoebocyte lysate test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, biological products, and medicai devices. Pharmacopeial Fórum. 9, 3012-3021.

8. Solum NO (1973). The coagulation of Limulus polyphemus hemocytes. A comparison of the clotted and non clotted forms of the molecule. Thromb. Res. 2, 55-70.

9. Liu TY, Seid RC Jr, Tai JY, Liang S-M, Sakmar TP, Robbins JB (1979). Studies of Limulus lysate coagulation system. In Bio medicai Applications of the Horseshoe Crab (Limulidae) (ed.

E. Cohen), pp. 147-158. Alan R. Liss, New York.

10. Holme R, Solum NO (1973). Electron microscopy of the gel pro tein formed by clotting of Limulus polyphemus hemocyte extracts. J. Ultrastructure Res. 44, 329-338.

11. Tai JY, Seid RC, Huhn RD, Lui TY (1977). Studies on Limulus amoebocyte lysate. II. Purification of the coagulogen and

the mechanism of clotting. J. Biol. Chem. 252, 4773-4776.

12. Nakamura S, Takagi T, Iwanaga S, Niwa M, Takahashi K (1976a). Amino acid sequence studies on the fragments produced from horseshoe crab coagulogen during gel formation: homologies with primate fibrinopeptide. B. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 72, 902-908.

13. Nakamura S, Takagi T, Iwanaga S, Niwa M, Takaheshi K (1976b). A clottable protein (coagulogen) from horseshoe crab hemocutes. Structural change of its polypeptide chain during gel formation. J. Biochem. 80, 649-652.

14. Gaffin SL (1976). The clotting of the lysed white cells of Li mulus induced by endotoxin. I. Preparation and characterization of clot forming proteins. Biorheologi. 13, 273-280.

15.Shishikura F, Nakamura S, Takahashi K, Segiguchi K (1982). Horseshoe crab phylogeny based on amino acid sequence of the fibrinopeptide like peptide C. J. Exp. Zool. 223, 89-91.

16.Tai JY, Liu TY (1977). Studies on Limulus amoebocyte lysate. I. isolation of proclotting enzyme. J. Biol. Chem. 252, 2178-2181.

17.0hki M, Nakamura T, Morita T, Iwanaga S (1980). A new endotoxinsensitive factor associated with hemolymph coagulation sys tem of horseshoe crab (Limulidae). FEBS Letters 120, 217-220.

18. Nakamura S, Levin J (1982a). Fractionation of Limulus amoebocyte lysate. Characterization of activation of the proclotting enzyme by an endotoxin-mediated activator. Biochim. Biophys. Acta. 707, 217-225.

19. Nakamura S, Levin J (1982b). Endotoxin-mediated Limulus proclotting enzyme activator and detection of previously undescribed protease (protease N). Biochem. Biophys. Res. Commun. 108, 1619-1623.

20. Liang SM, Sakmar TP, Liu TY (1980). Studies of Limulus amoebo cyte lysate. III. Purification of an endotoxin-binding protein from Limulus amoebocyte membranes. J. Biol. Chem. 255, 5586-5590.

21. Tanaka S, Nakamura T, Morita T, Iwanaga S (L982). Limulus antiLPS factor: an anticoagulant which inhibits the endotoxin-mediated activation of the Limulus coagulation system. Bio47

chem. Biophys. Res. Commun. 105, 717-723.

22. Kakinuma A, Asano T, Torh H, Sugino Y (1981) . Gelation of Li| mulus amoebocyte lysate by an antitumor (1-3)- -D-glucan. Biochem. Biophys. Res. Commun. 101, 434-439.

23. Morita T, Tanaka S, Nakamura T, Iwanaga S (1981). A new (1-3)- -D-glucan mediated coagulation pathway found in Limulus amoebocytes. FEBS Letters 129, 318-321.

24. Albaugh BR, Chandler CB (1982). Automated methodology for the Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay using the multiskan microplate reader, pp. 183-194. In Watson S, Levin J, Novitsky TJ (eds), Endotoxins and their detection with the Limulus lysate test. Alan R. Liss, Inc., New York.

25. Fujita Y, Nakahara C (1982). Preparation and application of a new endotoxin determination kit, Pyrodick, using a chromogenic substrate, pp. 173-182, In Watson S, Levin J, Novitsky TJ (eds), Endotoxins and their detection with the Limulus lysate test. Alan R. Liss, Inc., New York.

26. Nandan R, Brown DR (1977). An improved in vitro pyrogen test: to detect picograms of endotoxin contamination in intravenous fluids using Limulus amoebocyte lysate. J. Lab. Clin. Med. 89, 910-918.

27. Dunczak JA, Cotter R, Dastoli FR (1979). Quantitative detection of endotoxin by nephelometry, pp. 403-414. In E. Cohen (ed.), Biomedical Applications of the Horseshoe Crab (Limuli dae). Alan R. Liss, Inc., New York.

28. Jorgensen JH, Reichler AS (1982). Automation of the Limulus amoebocyte lysate pyrogen testing. J. Parenter. Sei. Technol. 36, 11-16.

29. Nowitsky TJ, Ryther SS, Case MJ, Watson (1982). Automated LAL testing of parenteral drugs in Abbot MS-2. J. Parenter. Sei. Technol. 36, 11-16.

30. Ditter VB, Becker KP, Urbascheck R, Urbascheck B (1982). Detection of endotoxion in blood and other specimens of evalua tion of photometrically registered LAL reaction kineties in microtiter plates. Prog. Clin. Biol. Res. 93, 385-392.

31. Frauch P (1974). Slide test as a micro-method of a modified Limulus endotoxin test. J. Pharm. Sei. 63, 808-809.

i

32. Goto H, Watababe M, Nakamura S (1977). Studies on a simple Limulus test, a slide method. Jpn. J. Exp. Med. 47, 523-524.

33. Goto H, Nakamura S (1979). Dry up method as a revised Limulus test with a new tecnique for gelation inhibitor removing Jpn. J. Exp. Med. 49, 19-25.

34. Melvaer KL, Fystro D (1982). Modified micro-method of the Li mulus amoebocyte lysate assay for endotoxin. Appl. Environ. Microbiol. 43, 493-494.

35. Flowers DJ (1979). A microtechnique for endotoxin assay by using Limulus lysate. Med. Lab. Sei. 36, 171-176.

36. Okuguchi S (1978). Improvement of the micromethod for the Li mulus lysate test. Microbiol. Immunol. 22, 113-121.

38. Kreeftenberg JG, Loggen HG, Van Ramshorst JD, Beuvery EC (1977). The Limulus amoebocyte lysate test micromethod and application in the control of sera and vaccines. Dev. Biol. Standard. 34, 15-20.

39. Gardi A, Arpagaus GR (1980). Improved microtechnique for endotoxin assay by the Limulus amoebocyte lysate test. Anal. Biochem. 109, 382-385.

40. Prior RB, Spagna VA (1979). Adaptation of a microdilution procedure to the Limulus lysate assay for endotoxin. J. Clin. Microbiol. 10. 394-395.

41. Harris NS, Feinstein R (1979). The LAL-bead assay for endoto xin, pp. 265-274. In E. Cohen (ed.), Biomedical Applications of the Horseshoe crab (Limulidae), Alan R. Liss, Inc., New York.

42. Munford RS (1978). Quantitative Limulus lysate assay for endotoxin activity: aggregation of radioiodinated coagulogen monomers. Anal. Biochem. 91, 509-515.

43. Baek L (1983). New, sensitive rocket immunoelectrophoretic assay for measurement of the reaction between endotoxin and Limulus amoebocyte lysate. J. Clin. Microbiol. 17, 1013-1020.

44. Elin RJ, Wolff SM (1973). Nonspecificity of the Limulus amoe bocyte lysate test: positive reactions with polynucleotides and proteins. J. Infect. Dis. 128, 349-352.

45. Wildfeuer A, Heymer B, Schleifer KH, Haferkamp O (1974). Investigations on the specificity of the Limulus test for the

detection of endotoxin. Appl. Microbiol. 28, 867-871.

46. Brunson KW, Watson DW (1976). Limulus amoebocyte lysate reac tion with streptococcal pyrogenic exotoxin. Infect. Immun. 14, 1256-1258.

47. Mikami T, Nagase T, Matsumoto T, Suzuki S, Suzuki M (1982). Gelation of Limulus amoebocyte lysate by simple polysacchari des. Microbiol. Immunol. 26, 403-409.

48. Suzuki M, Mikami T, Matsumoto T, Suzuki S (1977) Gelation of Limulus lysate by synthetic dextran derivatives. Microbiol. Immunol. 21, 419-425.

49. Platica M, Harding W, Hollander VP (1978). Dithiols simulate endotoxin in the Limulus reaction. Experientia 34, 1154-1155,

50. Fine DH, Kessler RE, Tabak LA, Shockman GD (1977). Limulus lysate activity of lipoteichoic acid. J. Dent. Res. 56, 1500.

51. Seid RC Jr., Smith PF, Guevarra G, Hochstein HD, Barile MF (1980). Endotoxin-like activities of mycoplasmal lipopolysac charides (lipoglycans) Infect. Immun. 29, 990-994.

52. Weinberg JB, Smith PF, Kahane I (1980). Bacterial lipopolysaccharides and mycoplasmal lipoglycans: a comparison between their abilities to induce macrophage-mediated tumor cell killing and Limulus amoebocyte lysate clotting. Biochem. Bio phys. Res. Commun. 97, 493-499.

53. Smith SM, Hill Jo, Snyder IS, Burrel R (1978). Mitogenicity of cell wall fractions of Micropolyspora faeni. Ann. Allergy 40, 12-14.

54. Lewis VJ, Thacher L, Mitchell SH (1979) . Demonstration of Chlamydia endotoxin-like acitivity. J. Gen. Microbiol. 144, 215-216.

55. Felton SC, Prior RB, Spagna VA, Kreier JP (1980). Evaluation of Plasmodium berghei for endotoxin by the Limulus lysate assay J. Parasitol 66, 846-847.

56. Wexler H, Oppenheim JD (1979). Isolation, characterization, and biological properties of an endotoxin-like material from the gram-positive organism Listeria monocytogenes. Infect. Immun. 23, 845-857.

57. Elin RJ (1979). Clinicai utility of the Limulus test with blood, CSF and synovial fluid, pp. 279-292. In E. Cohen (ed.)

Biomedical Applications of the Horseshoe Crab (Limulidae). Alan R. Liss, Inc., New York.

58. Tubbs H (1980). Endotoxin in human and murine malaria. Trans, R. Soc. Trop. Med. Hyg. 74, 121-123.

59. Galloway RE, Levin J, Butler T, Naff GB, Goldsmith GH, Saito H, Awoke S, Wallace CK (1977). Activation of protein mediators of inflammation and evidence for endotoxemia in Borrelia recurrentis infection. Am. J. Med. 63, 933-938.

60. Baek L, H^iby N, Hertz JB, Espersen F (1985). Interaction between Limulus amoebocyte lysate and soluble antigens from Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus studied by quantitative immunoelectrophoresis. J. Clin. Microbiol. 22, 229-237.

61. Jorgensen JH (1986). Clinicai applications of the Limulus amoebocyte lysate test. In Proctor RA (ed.), Handbook of Endotoxin 4: Clinicai aspects of endotoxin shock. Elsevier Sei ence Publisher B.V., Amsterdam.

62. Wilson MB and PK Nakane, in Immunofluorescence and Related Techniques (W. Knapp, H. Holubar and G. Wick, eds.), Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1978, pp. 215-221.

63. Obayashi T, et al., Clinica Chimica Acta 149, 1985, pp. 55-65.

64. Nakamura T, Morita T and Iwanaga S. Lipopolysaccharide-sensi tive serine protease zymogen (Factor C) found in Limulus hemocytes. Isolation and characterization. Eur. J. Biochem.

154, 1986, pp. 511-521.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   Processo para a determinação da pre sença de uma endotoxina ou dum material semelhante a uma endoto-j xina caracterizado por compreender as fases de: |

   a) incubação de uma amostra com um componente dum lisado ou de hemofinfa de amebõcito de límulo ou de um análogo sintético daqueles, estando as propriedades do referido componente alte radas se está presente na amostra qualquer endotoxina ou mate rial semelhante a uma endotoxina de tal modo que não tem lugar qualquer reacção com um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido componente ou análogo ou com um seu determinante imunolõgico ou de tal modo que um produto da reacção do referido componente ou análogo com uma endotoxina ou com um produto semelhante a uma en toxina na amostra reaja com um anticorpo suscitado contra o referido produto de reacção ou com um seu determinante imunolõgico.

   b) reacção da mistura incubada da referida amostra e do referido componente ou análogo resultantes da fase a) com um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido componente ou análogo ou contra um seu determinante imunolõgico, estando o anticorpo ligado ao referido componente ou ao referido análogo presentes na mistura, ou com um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido produto de reacção ou contra um seu determi nante imunolõgico, estando o anticorpo ligado a qualquer dos referidos produtos presentes na mistura., e

   c) determinação da presença de uma endotoxina ou dé um material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da detecção de qualquer anticorpo na mistura de reacção resultante da fase b), mostrando a detecção de quantidades decrescentes do an ticorpo ligado ã presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um an ticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas ‘ contra o referido componente ou análogo ou contra um seu de- | terminante imunolõgico, e mostrando a detecção de quantidades crescentes do anticorpo ligado à presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substan cialmente contra o referido produto da reacção ou contra um seu determinante imunológico, com a condição de que o referido componente ou análogo de qua], quer dos referidos produtos de reacção presentes após a incubação da amostra com o componente ou análogo na fase a) estã imobilizado num suporte sólido ou de que o referido anticorpo estã imobilizado num suporte sólido ou acoplado a uma molécula intermédia ligada a um suporte sólido, ou de que qualquer endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina presente na amostra estã imobilizada num suporte sólido.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o lisado ou a hemolinfa de amebócito de limulo ser seleccionado do grupo constituído por um factor de coagulação, p. ex. factor B, factor C, factor G, factor N, enzima pró-coagulação, enzima de coagulação activada, factor anti-LPS e coagulogênio, e uma aglutinina, p. ex. uma lecitina tal como limulina ou polifemina, ou por o produto da reacção do refe rido componente ou análogo com a referida endotoxina ou com o re ferido material semelhante a uma endotoxina ser seleccionado do grupo constituído por coagulina, peptídeo C, enzima de coagulação activada, factor B, C, G ou N activado e produtos de cisão destes factores e da enzima pré-coagulação.

   3- _

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por a endotoxina ou material semelhante a uma endotoxina serem seleccionados de entre o grupo constituído por endotoxinas ou antigenes de superfície de microorganismos tais como bactérias gram-negativas ou gram-positivas, fungos, le veduras e algas.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo específico, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou uma mistura de dois ou de mais anticorpos monoclonais.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o anticorpo ter uma marcação, p. ex. se leccionada de entre o grupo enzimas, substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, cromóforos, isótopos radioactivos e agen tes de complexação.

   - 6- Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por o anticorpo estar imobilizado num supor te sólido ou acoplado a uma molécula intermédia ligada a um suporte sólido e qualquer componente referido que reste após a inJ cubação da amostra com o componente ou análogo na fase a) do pro cesso da reivindicação 1 ser ligado ao anticorpo para reacção i adicional com uma nova quantidade de anticorpo. '

   -¾.

   Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por o suporte sólido conter um polímero ou uma matriz revestida com um polímero.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por compreender as fases de

   a) imobilização de um anticorpo suscitado contra ou dirigido subs tancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunológico ou suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou contra peptídeo C ou acoplamento do referido anticorpo a uma molécula intermédia ligada ao referido suporte,

   b) incubação da amostra com um material que contenha coagulogênio de modo a cindir o coagulogênio em coagulina e peptídeo C se estiver presente na amostra uma endotoxina ou um material semelhante a uma endotoxina,

   c) adição da mistura incubada resultante da fase b) ao suporte sólido de modo a que qualquer coagulogênio presente na amostra fique ligado se o anticorpo imobilizado no suporte sólido ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico ou de modo a que qualquer coagulina ou peptídeo C pre sente na amostra fiquem ligados se o anticorpo imobilizado ao referido suporte ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substahcialmente apenas contra coagulina ou contra peptídeo C ou contra um seu determinante imunolõgico,

   d) adição ao suporte solido de um anticorpo marcado suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico de modo a que qualquer coagulogênio ligado presente no suporte solido fique ligado, ou suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou contra peptídeo C ou contra um seu de terminante imunolõgico, de modo a que qualquer coagulogênio ligado ou qualquer coagulina ou peptídeo C ligado presentes no suporte solido fiquem ligados, e

   e) determinação da presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da detecção de qualquer anticorpo marcado ligado ao suporte solido da fase d), mostrando a detecção de quantidades decrescentes do an ticorpo ligado à presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um an ticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra o referido coagulogênio ou contra um seu determinante imunolõgico, e mostrando a detecção de quantidades crescentes do anticorpo ligado à presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente contra coagulina ou peptldeo C ou contra um seu determinante imunolõgico.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por compreender as fases de

   a) incubação de uma amostra com um material contendo coagulogênio de modo a cindir o coagulogênio para formar coagulina ou peptídeo C se estiver presente na amostra uma endotoxina ou um material semelhante a uma endotoxina,

   b) adição da mistura incubada resultante da fase a) a um suporte solido de modo a que qualquer coagulogênio presente na amos- tra fique ligado ou a que qualquer coagulina ou peptídeo C presente na amostra fique ligada,

   c) adição ao suporte sólido de um anticorpo marcado suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulôge- > nio ou contra um seu determinante imunolôgico de modo a que j qualquer coagulogênio ligado presente no suporte sólido fique' ligado, ou suscitado contra ou dirigido substancialmente ape-J nas contra coagulina ou contra peptídeo C ou contra um seu de!

   !

   terminante imunolôgico, de modo a que qualquer coagulina ou peptídeo C ligado presente no suporte sólido fique ligado, e

   d) determinação da presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da detecção de qualquer anticorpo marcado ligado ao suporte sólido da fase c) , mostrando a detecção de quantidades decrescentes do ani ticorpo ligado à presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra se o anticorpo ê um an ticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolôgico, e mostrando a detecção de -quantidades crescentes do anticorpo ligado â presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma adotoxina na amostra se o anticorpo é um anticor po suscitado contra ou dirigido substancialmente contra coagu lina ou peptídeo C ou contra um seu determinante imunolôgico.

   Processo de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por compreender as fases de

   a) imobilização de um anticorpo suscitado contra ou dirigido subs tancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolôgico ou suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou contra peptídeo C ou contra um seu determinante imunolôgico na superfície de parti cuias sólidas,

   b) incubação da amostra com um material que contenha coagulogê57 nio de modo a cindir o coagulogênio em coagulina e peptídeo C se estiver presente na amostra uma endotoxina ou um material semelhante a uma endotoxina,

   c) adição da mistura incubada resultante da fase b) ao anticorpo! da fase b) de modo a causar a aglutinação das partículas sõli das na presença de coagulogênio se o anticorpo ê um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolôgico ou de , modo a causar a aglutinação das partículas sólidas na presença de coagulina ou de peptídeo C se o anticorpo é um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou contra peptídeo C ou contra um seu determinante imunolôgico, e

   d) determinação da presença de uma endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina na amostra por meio da ausência de aglutinação de partículas sólidas âs quais se encontra ligado um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmen te apenas contra coagulogênio ou contra um seu determinante imunolôgico ou pela aglutinação das partículas âs quais se en contra ligado um anticorpo suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra coagulina ou contra peptídeo C ou contra um seu determinante imunolôgico. !

   Processo para a produção de um anti_ corpo monoclonal suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas contra um componente de lisado ou hemolinfa de amebôcito de límulo ou contra um seu análogo sintético ou contra um seu de terminante imunolôgico caracterizado por compreender as fases de

   a) imunização de um animal adequado ou de células de um animal adequado com um antigene constituído essencialmente por um componente de lisado ou de hemolinfa de amebôcito de límulo ou de um seu análogo sintético ou de um seu determinante imunolôgico ou constituído essencialmente por um produto da reac ção do referido componente ou anãlogo com uma endotoxina ou com um material semelhante a uma endotoxina ou com um seu de-j terminante imunolõgico de modo a obter células que produzem !

   i um anticorpo do referido antigene,

   b) fusão das células que produzem o anticorpo do referido antige ne com células de mieloma de uma linha de células adequada,

   c) selecção e clonagem das células de hibridoma resultantes que produzem o referido anticorpo e

   d) cultura das células de hibridoma num meio adequado a fim de produzir o referido anticorpo.

   - 12Processo de acordo com a reivindica ção 11, caracterizado por o componente de lisado ou de hemolinfa de amebócito de límulo ser seleccionado de entre o grupo constituído por um factor de coagulação, p. ex. factor B, factor c, factor G, factor N, enzima prõ-coagulação, enzima de coagulação activada, factor anti-LPS ou coagulogênio, e uma aglutinima, p. ex. uma lecitina, tal como limulina ou polifemina.

   Processo de acordo com a reivindica ção 11, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser suscitado contra ou dirigido substancialmente apenas um produto da reacção de um composto de lisado ou de hemolinfa de amebócito de límulo ou dum seu anãlogo sintético com uma endotoxina ou com um materi al semelhante a uma endotoxina ou contra um determinante imunolõ gico do referido produto de reacção.

   - 14- 59

   Processo de acordo com a reivindica çao 13, caracterizado por o referido produto de reacção ser seleccionado de entre o grupo constituído por coagulina, peptídeo C, enzima de coagulação activada, factor B, C, G ou N activado ί ou produtos de cisão destes factores e de enzima pró-coagulação.i

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 13, caracterizado por o anticorpo ter uma marcação, p. ex. seleccionada de entre o grupo enzimas, substâncias fluorescentes ou quimioluminescentes, cromõforos, isótopos radioactivos e agentes de complexação.

   - 16- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 13, caracterizado por o anticorpo estar imo bilizado num suporte sólido ou acoplado a uma molécula intermédia ligada a um suporte sólido.

   - 17- Processo para a preparação de um conjunto de analise (test kit) para a determinação da presença de um endotoxina ou de um material semelhante a uma endotoxina . numa amostra caracterizado por se incorporar

   a) um anticorpo quando preparado de acordo com qualquer das rei- ífl _ vindicações 11 a 16 e

   b) um componente de um lisado ou hemolinfa de um amebócito de lí mulo ou de um seu análogo sintético.

   - 18- Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o componente de lisado ou de hemolinfa de amebócito de límulo ser seleccionado de entre o grupo constituído por um factor de coagulação, p. ex. factor B, factor C, factor G, factor N, enzima pró-coagulação, enzima de coagulação activada, factor anti-LPS ou coagulogênio, e uma aglutina, p. ex uma lecitina, tal como limulina ou polifemina.

   - 19- Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo específico, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou uma mistura de dois ou de mais anticorpos monoclonais.

   Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o anticorpo ter uma marcação, p. ex. seleccionada de entre o grupo enzimas, substâncias fluorescentes ou quimioluminiscentes, cromóforos, isótopos radioactivos e agen tes de complexação.

   - 21- C. T ção 17, caracterizado por o referido conjunto de analise conter ;

   i um suporte sólido. í

   Processo de acordo com a reivindica ção 21, caracterizado por o suporte sólido conter um polímero ou uma matriz com um polímero ligado.

   - 23- Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o referido conjunto de analise conter tanto um anticorpo ligado como não ligado.

   Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o referido conjunto de analise conter adicionalmente uma endotoxina padrão.

   - 25- Processo de acordo com a reivindica ção 17, caracterizado por o referido conjunto de análise conter

   I i

   adicionalmente agua isenta de pirogênios.

   Os requerentes declaram que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Dinamarca em 20 de Maio de 1987, sob o n9. 2558/87.

   Lisboa, 19 de Maio de 1988.