JP2667695B2 - 試料中のエンドトキシンの存在を決定する方法 - Google Patents
試料中のエンドトキシンの存在を決定する方法Info
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- JP2667695B2 JP2667695B2 JP63504681A JP50468188A JP2667695B2 JP 2667695 B2 JP2667695 B2 JP 2667695B2 JP 63504681 A JP63504681 A JP 63504681A JP 50468188 A JP50468188 A JP 50468188A JP 2667695 B2 JP2667695 B2 JP 2667695B2
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- G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシ
ン様物質の存在を決定する方法、モノクローナル抗体及
び該方法に有効な試験キットに関する。
ン様物質の存在を決定する方法、モノクローナル抗体及
び該方法に有効な試験キットに関する。
背景技術 カブトガニであるリムルスポリフェムス(Limulus po
lyphemus)、タキプレアストリデンテイタス(Tachyple
us tridentatus)、タキプレアシギガス(Tachypleus g
igas)及びカルシノスコーピアスローツンディカウダ
(Carcinoscorpius rotundicauda)は、過去3億年にわ
たってあまり進化しなかった系統発生学的に原始的な海
洋節足動物である(1)。
lyphemus)、タキプレアストリデンテイタス(Tachyple
us tridentatus)、タキプレアシギガス(Tachypleus g
igas)及びカルシノスコーピアスローツンディカウダ
(Carcinoscorpius rotundicauda)は、過去3億年にわ
たってあまり進化しなかった系統発生学的に原始的な海
洋節足動物である(1)。
カブトガニは、青色血リンパを含有する開放循環系を
有しており、血リンパに存在する唯一の生成元素は変形
細胞と呼ばれる細胞である(2)。
有しており、血リンパに存在する唯一の生成元素は変形
細胞と呼ばれる細胞である(2)。
リムルス変形細胞溶解産物(LAL)をエンドトキシン
の試験管内試験に使用することは、バング(Bang)によ
りなされた重要な考察が直接端著となった(3)。バン
グは、カブトガニが、海洋グラム陰性菌での全身感染が
生じたときに、一種の血管内凝固症候群(DIC)を示す
ことを見出した。この最初の生体内観察は、その後に、
生存可能なグラム陰性菌又はグラム陰性菌の細胞壁から
の精製エンドトキシンの添加により、リムルス血リンパ
の凝固が試験管内で生じることが発見される端著となっ
た(2)。又、同じ研究者(1)により、変形細胞が、
血リンパの凝固に必要な因子源の全てであることも発見
された。
の試験管内試験に使用することは、バング(Bang)によ
りなされた重要な考察が直接端著となった(3)。バン
グは、カブトガニが、海洋グラム陰性菌での全身感染が
生じたときに、一種の血管内凝固症候群(DIC)を示す
ことを見出した。この最初の生体内観察は、その後に、
生存可能なグラム陰性菌又はグラム陰性菌の細胞壁から
の精製エンドトキシンの添加により、リムルス血リンパ
の凝固が試験管内で生じることが発見される端著となっ
た(2)。又、同じ研究者(1)により、変形細胞が、
血リンパの凝固に必要な因子源の全てであることも発見
された。
現在上記試験をエンドトキシンの試験管内アッセイと
して用いているのは、遠心分離により血リンパから分離
した変形細胞を物理的粉砕することにより、細菌性エン
ドトキシンでのみ活性化できる凝固成分を含有する懸濁
液(LAL)を生じるという事実に基づくものである。こ
の原理を応用することにより、LAL試験がグラム陰性
菌、エンドトキシン及びリポ多糖類の検出に関して最も
感度の高い方法となった。現在の精製方法により調製さ
れるLALは、精製大腸菌標準エンドトキシン0.1ng/mlを
信頼性よく検出できる。LALにより、実質的に全てのグ
ラム陰性菌の細胞壁に取り入れられている結合(細胞関
連)エンドトキシン又は遊離エンドトキシン(4)を検
出できることが判明した。しかしながら、異なる抽出操
作、即ち、異なる種から調製されたエンドトキシンは、
反応性(5,6)が大きく異なることがある。これらの理
由で、対照標準エンドトキシン(RSE)が、米国食料医
薬品局(USFDA)によりLAL及びウサギ発熱性試験(米国
薬局XX)(7)の標準化の手段として調製されてきた。
して用いているのは、遠心分離により血リンパから分離
した変形細胞を物理的粉砕することにより、細菌性エン
ドトキシンでのみ活性化できる凝固成分を含有する懸濁
液(LAL)を生じるという事実に基づくものである。こ
の原理を応用することにより、LAL試験がグラム陰性
菌、エンドトキシン及びリポ多糖類の検出に関して最も
感度の高い方法となった。現在の精製方法により調製さ
れるLALは、精製大腸菌標準エンドトキシン0.1ng/mlを
信頼性よく検出できる。LALにより、実質的に全てのグ
ラム陰性菌の細胞壁に取り入れられている結合(細胞関
連)エンドトキシン又は遊離エンドトキシン(4)を検
出できることが判明した。しかしながら、異なる抽出操
作、即ち、異なる種から調製されたエンドトキシンは、
反応性(5,6)が大きく異なることがある。これらの理
由で、対照標準エンドトキシン(RSE)が、米国食料医
薬品局(USFDA)によりLAL及びウサギ発熱性試験(米国
薬局XX)(7)の標準化の手段として調製されてきた。
エンドトキシンと類似体の反応性を有する変形細胞溶
解産物は、カブトガニの4種全てから調製できる。
解産物は、カブトガニの4種全てから調製できる。
リムリダエ(Limulidae)における凝固工程 リムリダエにおける現在公知の凝固工程を、表1にま
とめて示す。
とめて示す。
細胞性コウギュローゲン:コアギュローゲンは、分子
の重合性形態の安定性にとって重要である内部ジスフィ
ド結合を有するポリペプチド鎖からなっている(8)。
リムルスポリフェムスにおいて、コアギュローゲンは、
残基18個の半シスチン含量を有するアミノ酸220個から
なっていることが見出された(9)。遊離のSH器が検出
されず、グリシンが唯一のN末端残基で、セリンがその
C末端残基のように思われる(9)。コアギュローゲン
は、常に、セリンプロテアーゼ酵素により転化される。
凝固後のゲルタンパク質は、電子顕微鏡観察でらせん構
造を示す(10)。タキプレアストリデンテイタスにおい
ては、コアギュローゲンは、高レベルの塩基性アミノ酸
をを含むアミノ酸132〜135個で、N末端がアラニンでC
末端がフェニルアラニンからなっている。リムルスにお
いては、凝塊生成には、コアギュローゲンについてのAr
g−Lysペプチド単結合の開裂が伴うと思われる(11,
9)。N−ペプチドは、それら同士の間で、非共有形態
で相互作用して、不溶性凝塊を形成する。タキプレアス
トリデンテイタスでは、ゲルの酵素的生成には、コアギ
ュローゲンのN末端に位置するArg−Gly及びArg−Thrペ
プチド結合の限定タンパク質分解が伴うことにより、ペ
プチドが放出される(12,13)。リムルスのC断片に
は、主に、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含まれて
いる(14)。リウ(Liu)等(9)はアミノ酸45個を有
するC−ペプチドを検出したが、一方、中村(Nakamur
a)等(13)及びシシクラ(Shishikura)等(15)は、
このC−ペプチドは、種特異性配列で配列した28個のア
ミノ酸残基を有していると主張している。
の重合性形態の安定性にとって重要である内部ジスフィ
ド結合を有するポリペプチド鎖からなっている(8)。
リムルスポリフェムスにおいて、コアギュローゲンは、
残基18個の半シスチン含量を有するアミノ酸220個から
なっていることが見出された(9)。遊離のSH器が検出
されず、グリシンが唯一のN末端残基で、セリンがその
C末端残基のように思われる(9)。コアギュローゲン
は、常に、セリンプロテアーゼ酵素により転化される。
凝固後のゲルタンパク質は、電子顕微鏡観察でらせん構
造を示す(10)。タキプレアストリデンテイタスにおい
ては、コアギュローゲンは、高レベルの塩基性アミノ酸
をを含むアミノ酸132〜135個で、N末端がアラニンでC
末端がフェニルアラニンからなっている。リムルスにお
いては、凝塊生成には、コアギュローゲンについてのAr
g−Lysペプチド単結合の開裂が伴うと思われる(11,
9)。N−ペプチドは、それら同士の間で、非共有形態
で相互作用して、不溶性凝塊を形成する。タキプレアス
トリデンテイタスでは、ゲルの酵素的生成には、コアギ
ュローゲンのN末端に位置するArg−Gly及びArg−Thrペ
プチド結合の限定タンパク質分解が伴うことにより、ペ
プチドが放出される(12,13)。リムルスのC断片に
は、主に、グルタミン酸及びアスパラギン酸が含まれて
いる(14)。リウ(Liu)等(9)はアミノ酸45個を有
するC−ペプチドを検出したが、一方、中村(Nakamur
a)等(13)及びシシクラ(Shishikura)等(15)は、
このC−ペプチドは、種特異性配列で配列した28個のア
ミノ酸残基を有していると主張している。
凝固酵素:凝固酵素は、セリンプロテアーゼ酵素であ
る。この酵素は、分子量78,000及び40,000で、非常に類
似したアミノ酸組成を有し、単量体・二量体の関係を示
す2つの活性形態で存在する(9)。タキプレアストリ
デンテイタスでは、未還元凝固系が、分子量42,000を有
する糖タンパク質で、凝集して分子量350,000を有する
タンパク質を生成するものとして記載されている。凝固
酵素は、不活性前駆凝固酵素(inactive pro−clotting
enzyme)に由来する。前駆凝固酵素は、2つの独立し
た経路(表1)を経由して、ラム陰性菌のLPS又は一定
の菌類及び藻類の細胞壁からの(1−3)−β−D−グ
ルカンにより活性化することができる。
る。この酵素は、分子量78,000及び40,000で、非常に類
似したアミノ酸組成を有し、単量体・二量体の関係を示
す2つの活性形態で存在する(9)。タキプレアストリ
デンテイタスでは、未還元凝固系が、分子量42,000を有
する糖タンパク質で、凝集して分子量350,000を有する
タンパク質を生成するものとして記載されている。凝固
酵素は、不活性前駆凝固酵素(inactive pro−clotting
enzyme)に由来する。前駆凝固酵素は、2つの独立し
た経路(表1)を経由して、ラム陰性菌のLPS又は一定
の菌類及び藻類の細胞壁からの(1−3)−β−D−グ
ルカンにより活性化することができる。
LPS介在凝固:第一に、エンドトキシン又はLPSは、セリ
ンプロテアーゼ型の前駆凝固酵素を活性化することが実
証された(16,11)。第二に、更に、因子B又は前駆賦
活体も、前駆凝固酵素を活性化したことから、LALのLPS
誘発凝固に関与することが判明した(17,18)。この活
性化には、前駆凝固酵素の限定タンパク質分解、即ち、
アルギニリル又はリシル−X結合のタンパク質分解が伴
うと思われる(18)。最後に、この前駆賦活体は、LPS
依存型と思われるプロテアーゼN(タキプレアストリデ
ンテイタスにおける因子C)と呼ばれる別のタンパク質
分解酵素により、活性B因子又は賦活体(即ち、トリプ
シン型セリンプロテアーゼ)に転化されることが認めら
れた(18,19)。この一連の知見は、上記凝固工程が、
他の未知の因子(表1)も含んでいるかもしれない複雑
な酵素カスケードを示すことを明らかにしている。
ンプロテアーゼ型の前駆凝固酵素を活性化することが実
証された(16,11)。第二に、更に、因子B又は前駆賦
活体も、前駆凝固酵素を活性化したことから、LALのLPS
誘発凝固に関与することが判明した(17,18)。この活
性化には、前駆凝固酵素の限定タンパク質分解、即ち、
アルギニリル又はリシル−X結合のタンパク質分解が伴
うと思われる(18)。最後に、この前駆賦活体は、LPS
依存型と思われるプロテアーゼN(タキプレアストリデ
ンテイタスにおける因子C)と呼ばれる別のタンパク質
分解酵素により、活性B因子又は賦活体(即ち、トリプ
シン型セリンプロテアーゼ)に転化されることが認めら
れた(18,19)。この一連の知見は、上記凝固工程が、
他の未知の因子(表1)も含んでいるかもしれない複雑
な酵素カスケードを示すことを明らかにしている。
抗凝固因子:変形細胞膜からの80Kdタンパク質は、エン
ドトキシンに特異的に結合する(9,20)。著者によれ
ば、この受容タンパク質は、多量の脈管内凝固を生じる
ことなく、リムルス血液における少量のLPSを認識し固
定化できる。更に、LPS誘発凝固を妨げる抗凝血剤(抗L
PS因子)が、タキプレアストリデンテイタス及びリムス
ポリフェムスの血リンパからの変形細胞に存在する(2
1)。この抗凝固剤は、B因子の活性化を妨げるが、そ
の活性は抑制しない。他の介在する凝固経路は、抗LPS
因子によっては影響されない(21)。
ドトキシンに特異的に結合する(9,20)。著者によれ
ば、この受容タンパク質は、多量の脈管内凝固を生じる
ことなく、リムルス血液における少量のLPSを認識し固
定化できる。更に、LPS誘発凝固を妨げる抗凝血剤(抗L
PS因子)が、タキプレアストリデンテイタス及びリムス
ポリフェムスの血リンパからの変形細胞に存在する(2
1)。この抗凝固剤は、B因子の活性化を妨げるが、そ
の活性は抑制しない。他の介在する凝固経路は、抗LPS
因子によっては影響されない(21)。
(1−3)−β−D−グルカン介在凝固:抗腫瘍剤とし
ての(1−3)−β−D−グルカン及び他の抗腫瘍多糖
類の両方とも、前駆凝固酵素(23)に作用するG因子を
活性化することにより、LAL(22)のゲル化を生じさせ
る大きな能力がある。
ての(1−3)−β−D−グルカン及び他の抗腫瘍多糖
類の両方とも、前駆凝固酵素(23)に作用するG因子を
活性化することにより、LAL(22)のゲル化を生じさせ
る大きな能力がある。
LALによりエンドトキシンを検出する別法 いままで最もよく用いられている方法は凝固試験であ
る。この方法は、エンドトキシンと反応するとき、LAL
における反応カスケードで、最終的に不透明のゲル又は
凝塊が得られること基本としている。この試験は、以下
のように行われる。LAL0.1mlを試験管に入れた試験液0.
1mlと混合する。この混合液を、水浴中で1時間37℃で
インキュベーションする。この試験では、凝塊が生成
し、試験管を180゜逆にしても凝塊が安定であるとき陽
性とみなされる。もっと穏やかな反応も報告されてお
り、この場合、粘度が増加し、澱粉状の粒子が生成して
試験管の壁に付着し、しばしば不透明度が増加する。ゲ
ル化が完了する前に終点とみなされることがあり、この
方法での試験の問題点とされてきた。
る。この方法は、エンドトキシンと反応するとき、LAL
における反応カスケードで、最終的に不透明のゲル又は
凝塊が得られること基本としている。この試験は、以下
のように行われる。LAL0.1mlを試験管に入れた試験液0.
1mlと混合する。この混合液を、水浴中で1時間37℃で
インキュベーションする。この試験では、凝塊が生成
し、試験管を180゜逆にしても凝塊が安定であるとき陽
性とみなされる。もっと穏やかな反応も報告されてお
り、この場合、粘度が増加し、澱粉状の粒子が生成して
試験管の壁に付着し、しばしば不透明度が増加する。ゲ
ル化が完了する前に終点とみなされることがあり、この
方法での試験の問題点とされてきた。
LALにおける反応機構の上記した研究に基づいてなさ
れたLAL試験の他の変法も発表された。変法の例として
は、濁度法(24)、色素法(25)、比色法(26)、比濁
法(27)、カイネチック(kinetic method)(28〜3
0)、異スライド法(31〜36)、毛管法(38,39)、微小
希釈法(40)、LALビーズ法(41)、コアギュローゲン
の放射性同位元素標識法(42)、及びLPS活性化酵素に
より開裂したときのコアギュローゲンの抗原性の損失を
測定する免疫電気泳動法(43)が挙げられる。免疫電気
泳動法(43)を除くこれらの全ての方法において、試験
結果は、視覚的又はある種の装置により容易に読み取ら
れる。
れたLAL試験の他の変法も発表された。変法の例として
は、濁度法(24)、色素法(25)、比色法(26)、比濁
法(27)、カイネチック(kinetic method)(28〜3
0)、異スライド法(31〜36)、毛管法(38,39)、微小
希釈法(40)、LALビーズ法(41)、コアギュローゲン
の放射性同位元素標識法(42)、及びLPS活性化酵素に
より開裂したときのコアギュローゲンの抗原性の損失を
測定する免疫電気泳動法(43)が挙げられる。免疫電気
泳動法(43)を除くこれらの全ての方法において、試験
結果は、視覚的又はある種の装置により容易に読み取ら
れる。
エンドトキシンに対するLALの特異性 エンドトキシン又はLPSに対するLAL反応の特異性は、
何人かの研究者により疑問がなげかけられている。トロ
ンビン、トロンポプラスチン及び一定の合成ポリヌクレ
オチドの全てが、LAL試験において陽性を示した(4
4)。グラム陽性菌からのペプチドグリカン(45)、A
属連鎖球菌由来のエンドトキシン(46)、酵母マンナン
及び細菌デキストラン(47)、合成デキストラン誘導体
(48)及びジチオール類(49)は、LALのゲル化を生じ
る。
何人かの研究者により疑問がなげかけられている。トロ
ンビン、トロンポプラスチン及び一定の合成ポリヌクレ
オチドの全てが、LAL試験において陽性を示した(4
4)。グラム陽性菌からのペプチドグリカン(45)、A
属連鎖球菌由来のエンドトキシン(46)、酵母マンナン
及び細菌デキストラン(47)、合成デキストラン誘導体
(48)及びジチオール類(49)は、LALのゲル化を生じ
る。
LAL試験は、種々の生物の膜物質から精製されたエン
ドトキシン様分子の生物活性を測定するのに使用されて
きた。陽性LAL試験は、大便連鎖球菌から得たリポテイ
コ酸(50)、マイコプラズマの異種株から得たリポグリ
カン酸(51,52)、ミクロポリポラファーニ(Micropoly
spora faeni)(53)及びオウム病クラミジア(Chlamyd
ia psittaci)(54)から得た細胞壁分画、プラスモジ
ウムベルグヘイ(Plasmodium berghei)の純枠標本(5
5)及びリステリア菌(listeriamonocytogenes)(56)
の熱フェノール・水抽出物を用いて行うことができる。
ドトキシン様分子の生物活性を測定するのに使用されて
きた。陽性LAL試験は、大便連鎖球菌から得たリポテイ
コ酸(50)、マイコプラズマの異種株から得たリポグリ
カン酸(51,52)、ミクロポリポラファーニ(Micropoly
spora faeni)(53)及びオウム病クラミジア(Chlamyd
ia psittaci)(54)から得た細胞壁分画、プラスモジ
ウムベルグヘイ(Plasmodium berghei)の純枠標本(5
5)及びリステリア菌(listeriamonocytogenes)(56)
の熱フェノール・水抽出物を用いて行うことができる。
最近、LAL試験を臨床に用いることに異議を唱えるも
のがいる。即ち、エリン(Elin)(57)は、LAL及び血
液を用いて、ヒトにおける異なる17の研究の統計解析を
行い、グラム陰性敗血症診断用LAL試験は、臨床に用い
るには不十分であると結論した。更に、それぞれタブス
(Tubbs)(58)及びガロウエイ(Galloway)等(59)
による研究により、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium f
alciparum)に感染した患者からの血漿及び回帰熱ボレ
リア(Borrelia recurentis)に感染した患者からの血
漿が、LAL試験で陽性に反応することが分かった。
のがいる。即ち、エリン(Elin)(57)は、LAL及び血
液を用いて、ヒトにおける異なる17の研究の統計解析を
行い、グラム陰性敗血症診断用LAL試験は、臨床に用い
るには不十分であると結論した。更に、それぞれタブス
(Tubbs)(58)及びガロウエイ(Galloway)等(59)
による研究により、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium f
alciparum)に感染した患者からの血漿及び回帰熱ボレ
リア(Borrelia recurentis)に感染した患者からの血
漿が、LAL試験で陽性に反応することが分かった。
上記したほぼ全ての研究では、目的とする方法がLAL
試験の読み取りに用いられており、陽性試験がゲル化又
は濁り度の増加で定義されている。
試験の読み取りに用いられており、陽性試験がゲル化又
は濁り度の増加で定義されている。
いまままでのLAL試験に関して最も困難なこととし
て、血液又は血漿中のエンドトキシンの検出が挙げられ
る。第一に、肝臓における循環エンドトキシンの除去が
迅速であるため、通常、血液中の循環エンドトキシン
は、低い。第二に、血漿は、LALに対する阻害物質、エ
ンドトキシン不活性化物質及びエンドトキシン結合タン
パク質を含有している。
て、血液又は血漿中のエンドトキシンの検出が挙げられ
る。第一に、肝臓における循環エンドトキシンの除去が
迅速であるため、通常、血液中の循環エンドトキシン
は、低い。第二に、血漿は、LALに対する阻害物質、エ
ンドトキシン不活性化物質及びエンドトキシン結合タン
パク質を含有している。
エンドトキシンを血漿から抽出するのに種々の方法が
用いられてきた。これらのうち、血漿の希釈と加熱とを
組み合わせることにより、最良の結果が得られた(4
3)。
用いられてきた。これらのうち、血漿の希釈と加熱とを
組み合わせることにより、最良の結果が得られた(4
3)。
ロケット免疫電気泳動法を用いてLALとエンドトキシ
ンとの反応性を測定する実験(43)では、他のいくつか
の方法よりも高度の正確さと感度が得られ、この方法
は、診断用に適している。
ンとの反応性を測定する実験(43)では、他のいくつか
の方法よりも高度の正確さと感度が得られ、この方法
は、診断用に適している。
LALと緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)及び黄色ブ
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)から得た可溶性抗
原との間の相互作用についての免疫電気泳動法による研
究から、LALがLPSと非常によく反応するが、他のグラム
陰性菌及びグラム陽性菌からの抗原とも反応することが
できることが分かった(60)。
ドウ球菌(Staphylococcus aureus)から得た可溶性抗
原との間の相互作用についての免疫電気泳動法による研
究から、LALがLPSと非常によく反応するが、他のグラム
陰性菌及びグラム陽性菌からの抗原とも反応することが
できることが分かった(60)。
製薬業界におけるLAL試験 LAL試験を主に使用してきたのは、現在、種々の大容
積及び小容積の非経口液、生化学薬品及び医療用具につ
いて、年間無数の試験を行っている製薬業界であった。
このLAL試験は、現在一般適に、世界中の製薬業界で製
造される多くの注射液及び観血適医療用具についての、
工程内(in−process)試験及び最終放出(final−rele
ase)試験の両方で行われている。
積及び小容積の非経口液、生化学薬品及び医療用具につ
いて、年間無数の試験を行っている製薬業界であった。
このLAL試験は、現在一般適に、世界中の製薬業界で製
造される多くの注射液及び観血適医療用具についての、
工程内(in−process)試験及び最終放出(final−rele
ase)試験の両方で行われている。
LAL試験の臨床用途 LAL試験の臨床用途については、ジョルゲセン(JΦr
gensen)により徹底適に検討された(61)。LAL試験の
臨床用途についてのこの検討から、1960年後半にこの試
験が紹介されてから、うまくいく可能性のある多数の使
用法が記載されてきたことが結論として得られる。これ
らの使用法は、全て、速度、感度、及び生存グラム陰性
菌からの結合エンドトキシンであるか、事前又は周期的
細胞成長の残留物としての遊離エンドトキシンであると
は無関係に細菌性エンドトキシンに対するLAL試験の特
異性の点で有利である。これらの全ての用途において、
LAL試験が、ある点で、従来の細菌性エンドトキシン診
断法よりも優れていることが判明した。しかしながら、
これらの用途のいずれも、従来の方法に取って代わって
LAL試験単独で診断に用いるようにはならなかった。そ
の代わり、LAL試験は、種々の臨床例においてグラム陰
性菌の存在を確認する補助手段として非常に有効であ
る。LAL試験は、現在有効な診断用途(髄膜炎、眼球感
染、細菌尿症)があり、最終的には、エンドトキシンの
他の病態生理学的な結果、即ち、内毒血症がよりよく理
解できるようになる。
gensen)により徹底適に検討された(61)。LAL試験の
臨床用途についてのこの検討から、1960年後半にこの試
験が紹介されてから、うまくいく可能性のある多数の使
用法が記載されてきたことが結論として得られる。これ
らの使用法は、全て、速度、感度、及び生存グラム陰性
菌からの結合エンドトキシンであるか、事前又は周期的
細胞成長の残留物としての遊離エンドトキシンであると
は無関係に細菌性エンドトキシンに対するLAL試験の特
異性の点で有利である。これらの全ての用途において、
LAL試験が、ある点で、従来の細菌性エンドトキシン診
断法よりも優れていることが判明した。しかしながら、
これらの用途のいずれも、従来の方法に取って代わって
LAL試験単独で診断に用いるようにはならなかった。そ
の代わり、LAL試験は、種々の臨床例においてグラム陰
性菌の存在を確認する補助手段として非常に有効であ
る。LAL試験は、現在有効な診断用途(髄膜炎、眼球感
染、細菌尿症)があり、最終的には、エンドトキシンの
他の病態生理学的な結果、即ち、内毒血症がよりよく理
解できるようになる。
発明の開示 本発明者等は、リムルス又はタキプレアス変形細胞溶
解産物とエンドトキシンとの間の反応を確認するための
新規な方法を開発した。この方法は、エンドトキシンに
対する感度及び特異性は、ロケット免疫電気泳動法(4
3)と同じであるが、高度に専門化した装置又は高度に
熟練した操作要員を必要とせず、実質的にいずれの試験
所でも行うことができる。又、ロケット免疫電気泳動法
よりも、簡単であり、即ち、時間がかからないととも
に、経済的に実施でき、変形細胞溶解産物の必要量は少
量でよい。新規な方法は、従って、公知の方法と比較し
て、重要な経済的利点がある。即ち、本発明は、 a)試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リ
ンパの成分又はその合成類似体とともにインキュベーシ
ョンすることにより、エンドトキシン又はエンドトキシ
ン様物質が試料中に存在する場合に前記成分が変性され
て、前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に
対する抗体、又は実質的に前記成分若しくは類似体又は
それらの免疫決定基のみに対する抗体との反応が生じな
いか、前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又
はエンドトキシン様物質との反応の精製物が前記成分若
しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又
は実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決
定基のみに対する抗体と反応するようにし、 b)工程a)から得られる前記試料と前記成分又は類似
体とのインキュベーション混合物を、前記成分若しくは
類似体又は免疫決定基に対する抗体又は実質的に前記成
分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する
抗体と反応させることにより試料中に存在する前記成分
又は類似体に抗体を結合させるか、前記反応生成物若し
くはその免疫決定基のみに対する抗体と反応させること
により試料中に存在する前記反応生成物に抗体を結合さ
せ、そして c)工程b)から得られる反応混合物の結合抗体を検出
して、抗体が前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫
決定基に対する抗体又は実質的に前記成分若しくは類似
体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体である場合
には、結合抗体量の減少が検出されたときにはエンドト
キシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示し
ており、一方、抗体が前記反応生成物若しくはその免疫
決定基対する抗体又は実質的に前記反応生成物若しくは
その免疫決定基のみに対する抗体である場合には、結合
抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又は
エンドトキシン様物質が存在することを示していること
から、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物
質の存在を確認する、以上の工程を含むが、但し、工程
a)における試料と前記成分又は類似体とのインキュベ
ーション後に存在する前記成分若しくは類似体又は前記
反応生成物を固体支持体に結合させるか、前記抗体を固
体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合する
か、試料中存在するエンドトキシン又はエンドトキシン
様物質を固体支持体に結合すことを特徴とするエンドト
キシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認する方法
に関する。
解産物とエンドトキシンとの間の反応を確認するための
新規な方法を開発した。この方法は、エンドトキシンに
対する感度及び特異性は、ロケット免疫電気泳動法(4
3)と同じであるが、高度に専門化した装置又は高度に
熟練した操作要員を必要とせず、実質的にいずれの試験
所でも行うことができる。又、ロケット免疫電気泳動法
よりも、簡単であり、即ち、時間がかからないととも
に、経済的に実施でき、変形細胞溶解産物の必要量は少
量でよい。新規な方法は、従って、公知の方法と比較し
て、重要な経済的利点がある。即ち、本発明は、 a)試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リ
ンパの成分又はその合成類似体とともにインキュベーシ
ョンすることにより、エンドトキシン又はエンドトキシ
ン様物質が試料中に存在する場合に前記成分が変性され
て、前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に
対する抗体、又は実質的に前記成分若しくは類似体又は
それらの免疫決定基のみに対する抗体との反応が生じな
いか、前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又
はエンドトキシン様物質との反応の精製物が前記成分若
しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対する抗体、又
は実質的に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決
定基のみに対する抗体と反応するようにし、 b)工程a)から得られる前記試料と前記成分又は類似
体とのインキュベーション混合物を、前記成分若しくは
類似体又は免疫決定基に対する抗体又は実質的に前記成
分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基のみに対する
抗体と反応させることにより試料中に存在する前記成分
又は類似体に抗体を結合させるか、前記反応生成物若し
くはその免疫決定基のみに対する抗体と反応させること
により試料中に存在する前記反応生成物に抗体を結合さ
せ、そして c)工程b)から得られる反応混合物の結合抗体を検出
して、抗体が前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫
決定基に対する抗体又は実質的に前記成分若しくは類似
体又はそれらの免疫決定基のみに対する抗体である場合
には、結合抗体量の減少が検出されたときにはエンドト
キシン又はエンドトキシン様物質が存在することを示し
ており、一方、抗体が前記反応生成物若しくはその免疫
決定基対する抗体又は実質的に前記反応生成物若しくは
その免疫決定基のみに対する抗体である場合には、結合
抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又は
エンドトキシン様物質が存在することを示していること
から、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物
質の存在を確認する、以上の工程を含むが、但し、工程
a)における試料と前記成分又は類似体とのインキュベ
ーション後に存在する前記成分若しくは類似体又は前記
反応生成物を固体支持体に結合させるか、前記抗体を固
体支持体又は固体支持体に結合した架橋分子に結合する
か、試料中存在するエンドトキシン又はエンドトキシン
様物質を固体支持体に結合すことを特徴とするエンドト
キシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認する方法
に関する。
本明細書において、「エンドトキシン又はエンドトキ
シン様物質(endotoxin or endotoxin−like materia
l)」とは、通常、細菌膜の外表面成分であり且つパイ
ロジェンである、即ち、熱病を誘発する物質を意味す
る。グラム陰性菌のエンドトキシンの生化学的に活性な
部分はリポ多糖体であり、リポ多糖体の発熱性及び内毒
素性は脂質成分(リピドA)に依存していることが判明
した。しかしながら、グラム陽性菌の表面抗原をはじめ
とする他の表面抗原も、LALと反応することのあること
が分かった(45,46,60)。従って、LALと反応する細菌
又はカビ、酵母若しくは藻類等の他の微生物から得られ
るいずれの物質又は成分も、エンドトキシン又はエンド
トキシン様物質に含まれる(22,23,47,48)。
シン様物質(endotoxin or endotoxin−like materia
l)」とは、通常、細菌膜の外表面成分であり且つパイ
ロジェンである、即ち、熱病を誘発する物質を意味す
る。グラム陰性菌のエンドトキシンの生化学的に活性な
部分はリポ多糖体であり、リポ多糖体の発熱性及び内毒
素性は脂質成分(リピドA)に依存していることが判明
した。しかしながら、グラム陽性菌の表面抗原をはじめ
とする他の表面抗原も、LALと反応することのあること
が分かった(45,46,60)。従って、LALと反応する細菌
又はカビ、酵母若しくは藻類等の他の微生物から得られ
るいずれの物質又は成分も、エンドトキシン又はエンド
トキシン様物質に含まれる(22,23,47,48)。
「カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパの成分
(component of horseshoe crab amoebocyte lysate or
haemolymph)」とは、全溶解産物又は全血リンパだけ
でなく、その中の個々の反応性をも意味する。この全溶
解酸物又は全血リンパは、エンドトキシン又はエンドト
キシン様物質と反応する上記反応成分を含有している。
現時点で本発明の方法に使用するのに適した成分は、コ
アギュローゲン(全溶解産物に存在するような)であ
る。溶解産物及び血リンパは、カブトガニの4種、即
ち、リムルスポリフェムス(Limulus polypemus)、タ
キプレアストリデンテイタス(Tachypleus tridentatu
s)、タキプレアスギガス(Tachypleus gigas)及びカ
ルシノスコーピアスローツンディカウダ(Carcinoscorp
ius rotundicauda)の全てに由来するものでよく、これ
らのうち、リムルス溶解産物及びタキプレアス溶解産物
が好ましい。
(component of horseshoe crab amoebocyte lysate or
haemolymph)」とは、全溶解産物又は全血リンパだけ
でなく、その中の個々の反応性をも意味する。この全溶
解酸物又は全血リンパは、エンドトキシン又はエンドト
キシン様物質と反応する上記反応成分を含有している。
現時点で本発明の方法に使用するのに適した成分は、コ
アギュローゲン(全溶解産物に存在するような)であ
る。溶解産物及び血リンパは、カブトガニの4種、即
ち、リムルスポリフェムス(Limulus polypemus)、タ
キプレアストリデンテイタス(Tachypleus tridentatu
s)、タキプレアスギガス(Tachypleus gigas)及びカ
ルシノスコーピアスローツンディカウダ(Carcinoscorp
ius rotundicauda)の全てに由来するものでよく、これ
らのうち、リムルス溶解産物及びタキプレアス溶解産物
が好ましい。
「合成類似体(synthetic analogue)」とは、カブト
ガニ変形細胞溶解産物又は血リンパ自然発生する成分
と、エンドトキシン又はエンドトキシン様物質に対する
反応性が同じか又は実質的に同じである物質を意味す
る。このような類似体は、従来のペプチド合成、好まし
くは固相ペプチド合成等の化学合成か、前記成分をオー
ドしている遺伝子を適当な発言ベクター中にクローニン
グし、得られる組み換えベクターで適当な微生物を形質
転換し、適当な媒体中で生物を成長させて前記遺伝子を
発言させ、そして酸生した成分を培地から分離する工程
を温む組み換えDNA法により調製できる。本発明で使用
される特異的成分、凝固因子、例えば、B因子、C因
子、G因子、N因子、前駆動凝酵素、活性化凝固酵素、
抗LPS因子又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、
リムリン又はポリフェミン等のレクチンから選択でき
る。この凝固因子は一般的に変形細胞中の見出され、一
方、凝集素は通常血リンパ中に見出される。
ガニ変形細胞溶解産物又は血リンパ自然発生する成分
と、エンドトキシン又はエンドトキシン様物質に対する
反応性が同じか又は実質的に同じである物質を意味す
る。このような類似体は、従来のペプチド合成、好まし
くは固相ペプチド合成等の化学合成か、前記成分をオー
ドしている遺伝子を適当な発言ベクター中にクローニン
グし、得られる組み換えベクターで適当な微生物を形質
転換し、適当な媒体中で生物を成長させて前記遺伝子を
発言させ、そして酸生した成分を培地から分離する工程
を温む組み換えDNA法により調製できる。本発明で使用
される特異的成分、凝固因子、例えば、B因子、C因
子、G因子、N因子、前駆動凝酵素、活性化凝固酵素、
抗LPS因子又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、
リムリン又はポリフェミン等のレクチンから選択でき
る。この凝固因子は一般的に変形細胞中の見出され、一
方、凝集素は通常血リンパ中に見出される。
「前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又は
エンドトキシン様物質との反応の生成物(reaction pro
duct of a reaction cf said component or analogue w
ith an endotoxin or endotoxin−like material in th
e sample)」とは、上記した酵素カスケードにおける試
料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在
により活性化させる基質(上記した酵母カスケードにお
ける他の酵母をはじめとする)の酵素的に触媒された開
裂又は他の酵素的に誘発された変化(例えば、三次タン
パク質構造における)から生じる生成物を意味する。反
応生成物は、コアギュリン、C−ペプチド、活性化凝固
酵素、活性化B、C、G若しくはN因子、並びにこれら
の因子及び前駆凝固酵素からの開裂生成物から選択でき
る。
エンドトキシン様物質との反応の生成物(reaction pro
duct of a reaction cf said component or analogue w
ith an endotoxin or endotoxin−like material in th
e sample)」とは、上記した酵素カスケードにおける試
料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在
により活性化させる基質(上記した酵母カスケードにお
ける他の酵母をはじめとする)の酵素的に触媒された開
裂又は他の酵素的に誘発された変化(例えば、三次タン
パク質構造における)から生じる生成物を意味する。反
応生成物は、コアギュリン、C−ペプチド、活性化凝固
酵素、活性化B、C、G若しくはN因子、並びにこれら
の因子及び前駆凝固酵素からの開裂生成物から選択でき
る。
「試料」とは、エンドトキシンの存在に関して試料す
る物質を意味する。「試料」には、通常パイロジェン試
験を受ける物質を含めることが好ましい。従って、試料
は、非経口液又は注射等の製剤、即ち、薬剤又は栄養剤
等の活性物質及び患者の体内に挿入するのに様いられる
医薬用具、例えば、カニューレ又はカテーテル等の観消
的用具から選択できる。通常パイロジェン試験を受ける
他の物質としては、マイトシェン、栄養素媒体及び緩衝
液をはじめとする生化学約品、食品、食料水並びに製薬
工業で使用する水が得られる。更に、試料は、尿、髄
液、血液、血清、血漿又は血液若しくはリンパ液から製
造される生成物等の体液から選択でき、従って、発明に
より、エンドトキシン誘発室病を診断することが可能と
なる。臨床試料中のパイロジェンを検出する公知の方法
欠点は、公知の試料を、体液、種に血漿及び血清の試料
について行うとき、菌血症及び敗血症の正確な診断に必
要な特異性及び感度示さないことにあった。驚くべきこ
とに、本発明を用いることにより、血漿及び血清中のエ
ンドトキシンが少量でも(ピコグラムのレベルでも)正
確に検出できることが判明した。
る物質を意味する。「試料」には、通常パイロジェン試
験を受ける物質を含めることが好ましい。従って、試料
は、非経口液又は注射等の製剤、即ち、薬剤又は栄養剤
等の活性物質及び患者の体内に挿入するのに様いられる
医薬用具、例えば、カニューレ又はカテーテル等の観消
的用具から選択できる。通常パイロジェン試験を受ける
他の物質としては、マイトシェン、栄養素媒体及び緩衝
液をはじめとする生化学約品、食品、食料水並びに製薬
工業で使用する水が得られる。更に、試料は、尿、髄
液、血液、血清、血漿又は血液若しくはリンパ液から製
造される生成物等の体液から選択でき、従って、発明に
より、エンドトキシン誘発室病を診断することが可能と
なる。臨床試料中のパイロジェンを検出する公知の方法
欠点は、公知の試料を、体液、種に血漿及び血清の試料
について行うとき、菌血症及び敗血症の正確な診断に必
要な特異性及び感度示さないことにあった。驚くべきこ
とに、本発明を用いることにより、血漿及び血清中のエ
ンドトキシンが少量でも(ピコグラムのレベルでも)正
確に検出できることが判明した。
本明細書において、「免疫決鉄基(immunological de
terminant)」とは、本発明の試験方法に所望の性質を
示す抗体を生じさせることのできる前記成分若しくは類
似体のサブ配列又は抗体と反応する前記成分若しくは類
似体のサブ配列を意味する。従って、免疫決定基は、例
えば、上記した酵素カスケードにおいて、成分又は類似
体が開裂される開裂部位を埋めている配列でよい。「抗
体」とは、動物又は動物細胞を、前記成分、類似体又は
反応生成物に暴露したときの応答として生成される物質
を意味する。本発明のアッセイ法に適した特異性及び感
度を確保するために抗体は、カブトガニ変形細胞の種類
の成分、全血リンパに対して特異性を示すのではなく、
カブトガニ変形細胞を溶解産物又は血リンパの単一成分
に対して特異性を示す単一特性抗体であることが好まし
い。目的によって、抗体ポリクローナル抗体でもよい
が、一般的には、モノクローナル抗体であることが好ま
しい。これは、モノクローナル抗体の場合、アッセイの
特異性及び感度が高いので、従来のLAL試験法よりもエ
ンドトキシン又は類似物質が正確に測定できると同時
に、試験成分又は類似体が少量で済むので本発明の方法
を使用する場合の経済性が高まることによる。
terminant)」とは、本発明の試験方法に所望の性質を
示す抗体を生じさせることのできる前記成分若しくは類
似体のサブ配列又は抗体と反応する前記成分若しくは類
似体のサブ配列を意味する。従って、免疫決定基は、例
えば、上記した酵素カスケードにおいて、成分又は類似
体が開裂される開裂部位を埋めている配列でよい。「抗
体」とは、動物又は動物細胞を、前記成分、類似体又は
反応生成物に暴露したときの応答として生成される物質
を意味する。本発明のアッセイ法に適した特異性及び感
度を確保するために抗体は、カブトガニ変形細胞の種類
の成分、全血リンパに対して特異性を示すのではなく、
カブトガニ変形細胞を溶解産物又は血リンパの単一成分
に対して特異性を示す単一特性抗体であることが好まし
い。目的によって、抗体ポリクローナル抗体でもよい
が、一般的には、モノクローナル抗体であることが好ま
しい。これは、モノクローナル抗体の場合、アッセイの
特異性及び感度が高いので、従来のLAL試験法よりもエ
ンドトキシン又は類似物質が正確に測定できると同時
に、試験成分又は類似体が少量で済むので本発明の方法
を使用する場合の経済性が高まることによる。
本発明によれば、エンドトキシン又はエンドトキシン
様物質の存在が、陰性法及び陽性法の両方で確認でき
る。陰性での確認は、試料と成分又は類似体とのインキ
ュベーション混合物との反応に成分又は類似体に対する
抗体を用い、試料を成分又は類似体とともにインキュベ
ーションして得た反応生成物が抗体とは反応しないこと
を利用することにより行うことができる。反応後に結合
抗体がほとんど検出されないか、少なくとも、エンドト
キシンを含まない対照と比較して結合抗体の量が相当に
減少した場合には、成分又は類似体が酵素的に開裂され
たか、さもなければエンドトキシンの存在により構造的
に変化して成分又は類似体の抗体がもはや結合できない
ことを示しているので、試料中にエンドトキシン又はエ
ンドトキシン様物質が存在しているとみなされる。一
方、抗体が前記反応生成物の抗体である場合、本発明の
方法の工程b)で添加される抗体は、試験において結合
する(又は少なくとも、エンドトキシンを含まない対照
よりも多量の抗体が結合する)ことにより、試料中のエ
ンドトキシン又はエンドトキシン様物質が陽性確認がで
きる。
様物質の存在が、陰性法及び陽性法の両方で確認でき
る。陰性での確認は、試料と成分又は類似体とのインキ
ュベーション混合物との反応に成分又は類似体に対する
抗体を用い、試料を成分又は類似体とともにインキュベ
ーションして得た反応生成物が抗体とは反応しないこと
を利用することにより行うことができる。反応後に結合
抗体がほとんど検出されないか、少なくとも、エンドト
キシンを含まない対照と比較して結合抗体の量が相当に
減少した場合には、成分又は類似体が酵素的に開裂され
たか、さもなければエンドトキシンの存在により構造的
に変化して成分又は類似体の抗体がもはや結合できない
ことを示しているので、試料中にエンドトキシン又はエ
ンドトキシン様物質が存在しているとみなされる。一
方、抗体が前記反応生成物の抗体である場合、本発明の
方法の工程b)で添加される抗体は、試験において結合
する(又は少なくとも、エンドトキシンを含まない対照
よりも多量の抗体が結合する)ことにより、試料中のエ
ンドトキシン又はエンドトキシン様物質が陽性確認がで
きる。
本発明の方法は、エンドトキシンの定性試験又は定量
試験に適している。定量測定の場合、試験結合した抗体
の量は、自体公知の方法における試料の希釈例により限
定できる(43参照)。
試験に適している。定量測定の場合、試験結合した抗体
の量は、自体公知の方法における試料の希釈例により限
定できる(43参照)。
本発明により、上記した方法の工程a)において試料
を成分又類似体とともにインキュベーションした後に残
存する前記成分若しくは類似体又は前記反応生成物を固
体支持体に結合するときには、成分若しくは類似体に対
する抗体又は反応生成物に対する抗体を固体支持体に添
加することができ、このとき、結合抗体が検出されない
か、エンドトキシンを含まない対照と比較して結合抗体
の量が少ない場合には、前者の場合(抗体が成分若しく
は類似体に対するものの場合)、試料中にエンドトキシ
ンが存在することを示す。一方、後者の場合(抗体が反
応生成物に対する抗体の場合)、結合抗体が存在するこ
とが、試料中にエンドトキシンが存在することを示す。
を成分又類似体とともにインキュベーションした後に残
存する前記成分若しくは類似体又は前記反応生成物を固
体支持体に結合するときには、成分若しくは類似体に対
する抗体又は反応生成物に対する抗体を固体支持体に添
加することができ、このとき、結合抗体が検出されない
か、エンドトキシンを含まない対照と比較して結合抗体
の量が少ない場合には、前者の場合(抗体が成分若しく
は類似体に対するものの場合)、試料中にエンドトキシ
ンが存在することを示す。一方、後者の場合(抗体が反
応生成物に対する抗体の場合)、結合抗体が存在するこ
とが、試料中にエンドトキシンが存在することを示す。
別法として、抗体を、固体支持体又は固体支持体に結
合した架橋分子に結合し、本発明の方法の工程a)にお
ける試料を成分又は類似体とともにインキュベーション
した後に残存する成分を、抗体に結合して異なる量の抗
体と反応させてもよい。
合した架橋分子に結合し、本発明の方法の工程a)にお
ける試料を成分又は類似体とともにインキュベーション
した後に残存する成分を、抗体に結合して異なる量の抗
体と反応させてもよい。
更に、別法として、試料中に存在するエンドトキシン
又はエンドトキシン様物質を、固体支持体に結合しても
よい。その後、固体支持体に成分又は類似体を添加する
ことにより、成分又は類似体とともにインキュベーショ
ン後、成分若しくは類似体の標識抗体か、試料とともに
成分若しくは類似体をインキュベーションすることによ
り得られる反応生成物の標識抗体を添加する。この場
合、成分(又は類似体)は、全溶解産物、全血リンパ、
又はエンドトキシンが反応して上記した酵素カスケード
を誘発する溶解産物中に含まれる化合物でなければなら
ない。
又はエンドトキシン様物質を、固体支持体に結合しても
よい。その後、固体支持体に成分又は類似体を添加する
ことにより、成分又は類似体とともにインキュベーショ
ン後、成分若しくは類似体の標識抗体か、試料とともに
成分若しくは類似体をインキュベーションすることによ
り得られる反応生成物の標識抗体を添加する。この場
合、成分(又は類似体)は、全溶解産物、全血リンパ、
又はエンドトキシンが反応して上記した酵素カスケード
を誘発する溶解産物中に含まれる化合物でなければなら
ない。
別の態様によれば、本発明は、本発明の方法に使用す
るためのモノクローナル抗体に関する。この抗体は、カ
ブトガニ変細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その
合成類似体はその免疫決定基に対する抗体か、実質適に
カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、
その合成類似体又はその免疫決定基のみに対する抗体で
ある。
るためのモノクローナル抗体に関する。この抗体は、カ
ブトガニ変細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、その
合成類似体はその免疫決定基に対する抗体か、実質適に
カブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパの成分、
その合成類似体又はその免疫決定基のみに対する抗体で
ある。
更に、別の態様によれば、本発明は、試料中のエンド
トキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認するた
めの試験キットであって、 a)カブトガニ変形細胞溶解産物若くは血リンパの成
分、その合成類似体又はその免疫決定基に対する抗体
か、実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リ
ンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基のみに
対する抗体、又は前記成分若しくは類似体とエンドトキ
シン若しくはエンドトキシン様物質との反応の生成物又
はその免疫決定基に対する抗体か、実質的に前記成分若
しくは類似体とエンドトキシン若しくはエンドトキシン
様物質との反応の生成物又はその免疫決定基のみに対す
る抗体、及び b)カブトガニ変形細胞若しくは血リンパの成分又はそ
の合成類似体からなることを特徴とする試験キットに関
する。
トキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確認するた
めの試験キットであって、 a)カブトガニ変形細胞溶解産物若くは血リンパの成
分、その合成類似体又はその免疫決定基に対する抗体
か、実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若しくは血リ
ンパの成分、その合成類似体又はその免疫決定基のみに
対する抗体、又は前記成分若しくは類似体とエンドトキ
シン若しくはエンドトキシン様物質との反応の生成物又
はその免疫決定基に対する抗体か、実質的に前記成分若
しくは類似体とエンドトキシン若しくはエンドトキシン
様物質との反応の生成物又はその免疫決定基のみに対す
る抗体、及び b)カブトガニ変形細胞若しくは血リンパの成分又はそ
の合成類似体からなることを特徴とする試験キットに関
する。
上記で説明したように、前記成分若しくは類似体と結
合する抗体又は前記反応生成物と結合する抗体は、カブ
トガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパ(又はその合
成類似体)中の特異的成分に対する単一特異的抗体が好
ましい。単一特異的抗体は、適当な動物に、当該成分又
は類似体の実質的に純枠な試料を注射後、最初の放血前
に最大6か月まで、適当な間隔(例えば、2週間〜1か
月)でブースター注射する。その後、この確立された免
疫養生を継続しながら、各ブースター免疫後約1週間動
物を放血させ、従来の方法、例えば、ハーボエ(Harbo
e)及びインギルド(Ingild)、スカンド・ジェイ・イ
ムン(Scand.J.Immun)、2(補遺1)、161〜164(197
3)に記載されている方法で血清から抗体を分離する。
合する抗体又は前記反応生成物と結合する抗体は、カブ
トガニ変形細胞溶解産物若しくは血リンパ(又はその合
成類似体)中の特異的成分に対する単一特異的抗体が好
ましい。単一特異的抗体は、適当な動物に、当該成分又
は類似体の実質的に純枠な試料を注射後、最初の放血前
に最大6か月まで、適当な間隔(例えば、2週間〜1か
月)でブースター注射する。その後、この確立された免
疫養生を継続しながら、各ブースター免疫後約1週間動
物を放血させ、従来の方法、例えば、ハーボエ(Harbo
e)及びインギルド(Ingild)、スカンド・ジェイ・イ
ムン(Scand.J.Immun)、2(補遺1)、161〜164(197
3)に記載されている方法で血清から抗体を分離する。
高い特異性を必要としない目的の場合には、抗体はポ
リクローナルでよい。ポリクローナ抗体は、ハーボエ
(Harboe)及びインギルド(Ingild)(同書)に記載さ
れているのと実質的に同様な方法で得ることができる。
しかしながら、ほとんどの場合、本発明の方法で用いら
れる抗体は、モノクローナル抗体であることが好まし
い。これは、モノクローナル抗体の場合、一般的に、ポ
リクローナル抗体よりもアッセイの特異性及び感度が高
いと同時に、測定時間が少なくと済む。更に、試験の検
出限界及び感度が増加することから、2種以上のモノク
ローナル抗体の混合物を用いてもよい。モノクローナル
抗体は、下記の方法により得ることができる。
リクローナルでよい。ポリクローナ抗体は、ハーボエ
(Harboe)及びインギルド(Ingild)(同書)に記載さ
れているのと実質的に同様な方法で得ることができる。
しかしながら、ほとんどの場合、本発明の方法で用いら
れる抗体は、モノクローナル抗体であることが好まし
い。これは、モノクローナル抗体の場合、一般的に、ポ
リクローナル抗体よりもアッセイの特異性及び感度が高
いと同時に、測定時間が少なくと済む。更に、試験の検
出限界及び感度が増加することから、2種以上のモノク
ローナル抗体の混合物を用いてもよい。モノクローナル
抗体は、下記の方法により得ることができる。
本発明の方法に用いる抗体は、アッセイの正確さを向
上させるために、実質的に純枠であることが好ましい。
上させるために、実質的に純枠であることが好ましい。
抗体がそれに対する物質(即ち、成分、類似体又は反
応生成物)と反応すると凝集を生じる固体粒子(後述す
る)に抗体を結合させる場合等、場合によっては、抗体
を未変性の形態で用いてもよい。しかしながら、ほとん
どの目的の場合、抗体に結合抗体の検出用の標識を付け
るか、(二抗体アッセイのように)標識抗体と未標識抗
体を組み合わせて用いてもよい。標識に使用される物質
は、それ自体で検出可能である物質又は別の物質と反応
させて検出可能な最終生成物を生成することのできる物
質から選択できる。即ち、標識は、酵素、螢光物質、化
学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生成剤から選
択できる。
応生成物)と反応すると凝集を生じる固体粒子(後述す
る)に抗体を結合させる場合等、場合によっては、抗体
を未変性の形態で用いてもよい。しかしながら、ほとん
どの目的の場合、抗体に結合抗体の検出用の標識を付け
るか、(二抗体アッセイのように)標識抗体と未標識抗
体を組み合わせて用いてもよい。標識に使用される物質
は、それ自体で検出可能である物質又は別の物質と反応
させて検出可能な最終生成物を生成することのできる物
質から選択できる。即ち、標識は、酵素、螢光物質、化
学発光物質、発色団、放射性同位体及び錯生成剤から選
択できる。
標識として有効な酵素としては、例えば、ペルオキシ
ダーゼ(例えば、ワサビダイコンペルオキシダーゼ)、
ホシファターゼ(例えば、酸ホスファターゼ)、β−ガ
ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース、ルコースオ
キシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラー
ゼ、グコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵
素、グルコース−6−p−ホスフェート脱水素酵素及び
リボヌクレアーゼが挙げられる。
ダーゼ(例えば、ワサビダイコンペルオキシダーゼ)、
ホシファターゼ(例えば、酸ホスファターゼ)、β−ガ
ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース、ルコースオ
キシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチルコリンエステラー
ゼ、グコアミラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵
素、グルコース−6−p−ホスフェート脱水素酵素及び
リボヌクレアーゼが挙げられる。
酵素はそれ自体では検出できないので、基質と併用し
て検出可能な最終生成物を生成する反応を触媒する必要
がある。即ち、上記した工程b)から得られる反応混合
物に基質を添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を
生じさせるか、色の変化を生じさせるか、色、螢光又は
化学発光の強度の変化を生じさせてもよい。上記した酵
素用基質として本発明の方法に有効な基質としては、例
えば、H2O2、p−ニトロフェニルホスフェート、ラクト
ース、尿素、β−D−グルコース、CO2、コリンエステ
ル、デンプン、リゾデイクチカス(lysodeikticus)、
マレート、グコース−6−ホスフェート及びRNAが挙げ
られる。この基質は、例えば、供与体が受容体である発
色団と併用してもよい。結合抗体を直接的に検出するた
めの標識として使用できる螢光物質は、4−メチルウン
ベリフェリル−D−ガラクトピラノシド、4−メチルウ
ンベリフェリル−ホスフェート及び3−(p−ヒドロキ
シフェニル)プロピオン酸から選択できる。これらの物
質自体は、螢光分光光度計により検出でき、螢光を定性
的にも定量的にも測定できる。
て検出可能な最終生成物を生成する反応を触媒する必要
がある。即ち、上記した工程b)から得られる反応混合
物に基質を添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を
生じさせるか、色の変化を生じさせるか、色、螢光又は
化学発光の強度の変化を生じさせてもよい。上記した酵
素用基質として本発明の方法に有効な基質としては、例
えば、H2O2、p−ニトロフェニルホスフェート、ラクト
ース、尿素、β−D−グルコース、CO2、コリンエステ
ル、デンプン、リゾデイクチカス(lysodeikticus)、
マレート、グコース−6−ホスフェート及びRNAが挙げ
られる。この基質は、例えば、供与体が受容体である発
色団と併用してもよい。結合抗体を直接的に検出するた
めの標識として使用できる螢光物質は、4−メチルウン
ベリフェリル−D−ガラクトピラノシド、4−メチルウ
ンベリフェリル−ホスフェート及び3−(p−ヒドロキ
シフェニル)プロピオン酸から選択できる。これらの物
質自体は、螢光分光光度計により検出でき、螢光を定性
的にも定量的にも測定できる。
抗体結合を直接的に検出するための標識として用いる
ことのできる化学発光物質は、イソルミノール/EDTA/H2
O2、ペルオキシダーゼ/エオシン/EDTA及びルシフェラ
ーゼ並びにそれらの基質から選択できる。これらの物質
自体は、分光光度計により検出でき、化学発光を定性的
にも定量的にも測定できる。結合抗体を直接的に検出す
るのに使用できる発色団は、5−アミノサリチル酸、2,
2′−アジノ−ジ−(3−エチルベンズチアゾリン−6
−スルホン酸、o−フェニレンジアミン、o−ジアミン
イシジン(o−diamiicidine)、3−メチル−2−ベン
ゾチアゾリンヒドラゾン、3−(ジメチルアミノ)安息
香酸、o−トルイジン、3,3′,5,5′−テトラメチルベ
ンジジン、o−ニトオフェニル−β−D−ガラクトシド
及びp−ニトロフェニルホスフェートから選択でる。こ
れらの物質自体は、分光光度計により検出でき、色、例
えば、色の強度又は色の変化を、定性的にも定量的にも
測定できる。
ことのできる化学発光物質は、イソルミノール/EDTA/H2
O2、ペルオキシダーゼ/エオシン/EDTA及びルシフェラ
ーゼ並びにそれらの基質から選択できる。これらの物質
自体は、分光光度計により検出でき、化学発光を定性的
にも定量的にも測定できる。結合抗体を直接的に検出す
るのに使用できる発色団は、5−アミノサリチル酸、2,
2′−アジノ−ジ−(3−エチルベンズチアゾリン−6
−スルホン酸、o−フェニレンジアミン、o−ジアミン
イシジン(o−diamiicidine)、3−メチル−2−ベン
ゾチアゾリンヒドラゾン、3−(ジメチルアミノ)安息
香酸、o−トルイジン、3,3′,5,5′−テトラメチルベ
ンジジン、o−ニトオフェニル−β−D−ガラクトシド
及びp−ニトロフェニルホスフェートから選択でる。こ
れらの物質自体は、分光光度計により検出でき、色、例
えば、色の強度又は色の変化を、定性的にも定量的にも
測定できる。
結合抗体は直接的にも検出するのに使用できる放射性
同位体は、125I,3H,35P,131I及び14Cから選択できる。
同位体により放出される放射能は、γ−カウンター又は
シンチレーションカウンターで測定でき、結合放射能を
定性的及び定量的に測定できる。
同位体は、125I,3H,35P,131I及び14Cから選択できる。
同位体により放出される放射能は、γ−カウンター又は
シンチレーションカウンターで測定でき、結合放射能を
定性的及び定量的に測定できる。
結合抗体を検出するのに使用できる錯生成剤は、ビオ
チン(アジビン及びストレプトアビジンと錯体を形成す
る)及びレクチン(炭水化物決定基、例えば、レセプタ
ーと錯体を形成する)から選択できる。この場合、錯体
自体は、検出できないので、錯生成剤が錯体を生成する
相手物質を標識する必要がある。マーキングは、抗体の
標識に関して上記した物質、即ち、螢光物質、化学発光
物質、発色団、酵素又は放射性物質のいずれを用いて行
ってもよい。
チン(アジビン及びストレプトアビジンと錯体を形成す
る)及びレクチン(炭水化物決定基、例えば、レセプタ
ーと錯体を形成する)から選択できる。この場合、錯体
自体は、検出できないので、錯生成剤が錯体を生成する
相手物質を標識する必要がある。マーキングは、抗体の
標識に関して上記した物質、即ち、螢光物質、化学発光
物質、発色団、酵素又は放射性物質のいずれを用いて行
ってもよい。
本発明の方法において、固体支持体に結合した架橋分
子に抗体を結合するとき、固体支持体と抗体との間の結
合の役割を果たす架橋分子は、グルタルアルデヒド、カ
ルボジイミド、リジン、プロテインA及びヒドラジドか
ら選択できる。この抗体は、標識しても未標識でもよ
く、本発明の方法の一実施態様においては、未標識抗体
を固体支持体上に結合させた後、成分又は類似体と試料
とのインキュベーション混合物と未標識抗体を順次添加
する。
子に抗体を結合するとき、固体支持体と抗体との間の結
合の役割を果たす架橋分子は、グルタルアルデヒド、カ
ルボジイミド、リジン、プロテインA及びヒドラジドか
ら選択できる。この抗体は、標識しても未標識でもよ
く、本発明の方法の一実施態様においては、未標識抗体
を固体支持体上に結合させた後、成分又は類似体と試料
とのインキュベーション混合物と未標識抗体を順次添加
する。
本発明の方法で用いられる固体支持体は、ポリマーを
包含することが好ましい。この支持体は、それ自体ポリ
マーから構成されていてもよいし、マトリックスにポリ
マーを被覆したものでもよい。マトリックスは、ガラ
ス、紙又はプラスチック等の本発明の目的に適したいず
れの物質でもよい。それ自体で固体支持体を構成する
か、マトリックス上に適用するポリマーは、プラスチッ
ク、ニトロセルロース紙、臭化シアン活性化紙、1−
(3−ニトロベンジルオキシメチル)ピリジウムクロリ
ド紙、ジアゾベンジルオキシメチル紙、ニトロベンジル
オキシメチル紙又はアミノベンジルオキシメチル紙等の
セルロース、シリコーンポリマー及びシリカ又はシリケ
ートから選択できる。適当なプラスチックとしては、例
えば、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リウレタン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル及び
それらの適当な共重合体が挙げられる。シリコーンポリ
マーとしては、例えば、シロキサンが挙げられ、シリケ
ートとしては、例えば、ガラスが挙げられる。ポリマー
には、必要に応じて、上記で説明した酵素カスケードの
特定試薬生成部分の結合を容易にするための官能基が付
いていてもよい。このような官能基としては、例えば、
必要に応じて固体支持体に結合した上記の架橋分子が挙
げられる。
包含することが好ましい。この支持体は、それ自体ポリ
マーから構成されていてもよいし、マトリックスにポリ
マーを被覆したものでもよい。マトリックスは、ガラ
ス、紙又はプラスチック等の本発明の目的に適したいず
れの物質でもよい。それ自体で固体支持体を構成する
か、マトリックス上に適用するポリマーは、プラスチッ
ク、ニトロセルロース紙、臭化シアン活性化紙、1−
(3−ニトロベンジルオキシメチル)ピリジウムクロリ
ド紙、ジアゾベンジルオキシメチル紙、ニトロベンジル
オキシメチル紙又はアミノベンジルオキシメチル紙等の
セルロース、シリコーンポリマー及びシリカ又はシリケ
ートから選択できる。適当なプラスチックとしては、例
えば、ラテックス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポ
リウレタン、ポリアクリルアミド、ポリ酢酸ビニル及び
それらの適当な共重合体が挙げられる。シリコーンポリ
マーとしては、例えば、シロキサンが挙げられ、シリケ
ートとしては、例えば、ガラスが挙げられる。ポリマー
には、必要に応じて、上記で説明した酵素カスケードの
特定試薬生成部分の結合を容易にするための官能基が付
いていてもよい。このような官能基としては、例えば、
必要に応じて固体支持体に結合した上記の架橋分子が挙
げられる。
目的によっては、ある種の形状が、他の形状よりも使
用するのに便利なことがあるけれども、固体支持体の物
理的形状は特に重要ではない。即ち、固体支持体は、板
上、例えば、薄層若しくは好ましくはマイクロタイタプ
レート、ストリップ、フィルム、プロテインA被覆バク
テリア等の固体粒子、又は紙の形態でよい。本発明の方
法で使用する固体粒子は、約1〜10μmの範囲のサイズ
を有している。
用するのに便利なことがあるけれども、固体支持体の物
理的形状は特に重要ではない。即ち、固体支持体は、板
上、例えば、薄層若しくは好ましくはマイクロタイタプ
レート、ストリップ、フィルム、プロテインA被覆バク
テリア等の固体粒子、又は紙の形態でよい。本発明の方
法で使用する固体粒子は、約1〜10μmの範囲のサイズ
を有している。
一実施態様によれば、本発明は、 a)コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体
か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ
に対する抗体、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド
又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ
リン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対
する抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合した架橋
分子に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)から得られるインキュベーション混合物を
固体支持体に添加して、固体支持体に結合した抗体がコ
アギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実
質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対す
る抗体の場合には、試料中に存在するコアギュローゲン
を結合するようにし、固体支持体に結合した抗体がコア
ギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基に対
する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチ
ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コ
アギュリン又はC−ペプチドを結合するようにし、 d)固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定
基に対する標識抗体か、実質的にコアギュローゲン又は
その免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して固体支
持体上に存在する結合コアギュローゲンに結合するよう
にするか、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド又は
その免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン
若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する
抗体を添加して固体支持体上に存在する結合コアギュロ
ーゲン、結合コアギュリン又は結合C−ペプチドに結合
するようにし、そして e)工程d)の固体支持体に結合した標識抗体を検出し
て、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対す
る抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定
基のみに対する抗体の場合には、蹴散号抗体量の減少が
検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン
様物質が存在することを示しており、一方、抗体がコア
ギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基に対
する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチ
ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結
合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又
はエンドトキシン様物質が存在することを示しているこ
とから、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質の存在を確認することを含む。
か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ
に対する抗体、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド
又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ
リン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対
する抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合した架橋
分子に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)から得られるインキュベーション混合物を
固体支持体に添加して、固体支持体に結合した抗体がコ
アギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体か、実
質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対す
る抗体の場合には、試料中に存在するコアギュローゲン
を結合するようにし、固体支持体に結合した抗体がコア
ギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基に対
する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチ
ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、コ
アギュリン又はC−ペプチドを結合するようにし、 d)固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定
基に対する標識抗体か、実質的にコアギュローゲン又は
その免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して固体支
持体上に存在する結合コアギュローゲンに結合するよう
にするか、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド又は
その免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン
若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する
抗体を添加して固体支持体上に存在する結合コアギュロ
ーゲン、結合コアギュリン又は結合C−ペプチドに結合
するようにし、そして e)工程d)の固体支持体に結合した標識抗体を検出し
て、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対す
る抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定
基のみに対する抗体の場合には、蹴散号抗体量の減少が
検出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン
様物質が存在することを示しており、一方、抗体がコア
ギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基に対
する抗体か、実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチ
ド又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結
合抗体量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又
はエンドトキシン様物質が存在することを示しているこ
とから、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質の存在を確認することを含む。
別の実施態様によれば、本発明の方法は、 a)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 b)工程a)のインキュベーション混合物を固体支持体
に添加して、混合物中に存在するコアギュローゲンを結
合するか、混合物中に存在するコアギュリン又はCペプ
チドを結合ずるようにし、 c)固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定
基に対する標識抗体か、実質的にコアギュローゲン又は
その免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して固体支
持体上に結合したコアギュローゲンに結合するようにす
るか、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド又はその
免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若し
くはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体
を添加して固体支持体上に結合したコアギュリン又はC
−ペプチドに結合するようにし、 e)工程c)の固体支持体に結合した標識抗体を検出し
て、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対す
る抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定
基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の減少が検
出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質が存在することを示しており、一方、抗体がコアギ
ュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基に対す
る抗体か、実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチド
又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結合
交替量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又は
エンドトキシン様物質が存在することを示していること
から、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物
質の存在を確認することを含む。
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 b)工程a)のインキュベーション混合物を固体支持体
に添加して、混合物中に存在するコアギュローゲンを結
合するか、混合物中に存在するコアギュリン又はCペプ
チドを結合ずるようにし、 c)固体支持体に、コアギュローゲン又はその免疫決定
基に対する標識抗体か、実質的にコアギュローゲン又は
その免疫決定基のみに対する標識抗体を添加して固体支
持体上に結合したコアギュローゲンに結合するようにす
るか、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド又はその
免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若し
くはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗体
を添加して固体支持体上に結合したコアギュリン又はC
−ペプチドに結合するようにし、 e)工程c)の固体支持体に結合した標識抗体を検出し
て、抗体がコアギュローゲン又はその免疫決定基に対す
る抗体か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定
基のみに対する抗体の場合には、結合抗体量の減少が検
出されたときにはエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質が存在することを示しており、一方、抗体がコアギ
ュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基に対す
る抗体か、実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチド
又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合には、結合
交替量の増加が検出されたときにはエンドトキシン又は
エンドトキシン様物質が存在することを示していること
から、試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物
質の存在を確認することを含む。
上記両方の実施態様において、固体支持体を、インキ
ュベーション混合物と抗体との反応後に、少なくとも一
回、できる限り最高4回洗浄することにより未結合抗体
を除去するのがよい(上記に概略述べた2つの実施態様
は、それぞれ、直接酵素結合免疫吸着剤アッセイ及び二
重酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)によく対応し
ている)。これらのELISA法は、用いられる特異成分
(即ち、LALに存在するコアギュローゲン)の必要量が4
0倍少なくとよいことが判明したので特に有利である。
更に、この試験を行うのに必要とする時間は、数百個の
試験について約4時間であり、公知の試験法に対して顕
著な向上を達成できる。これらの利点とは別に、本発明
の方法により、臨床試料、特に血液又は血漿に関して得
られる結果は、血液中に妨害物質が存在していても悪影
響を受けない利点がある。ELISA法は、十分確立されて
おり、既存の実験装置を用いて行うことができ且つ自動
化も可能である。従って、本発明の方法は、臨床試験所
では、診断目的で、一方、製薬業界においては原料又は
製剤中におけるアッセイとして幅広く適用できる。
ュベーション混合物と抗体との反応後に、少なくとも一
回、できる限り最高4回洗浄することにより未結合抗体
を除去するのがよい(上記に概略述べた2つの実施態様
は、それぞれ、直接酵素結合免疫吸着剤アッセイ及び二
重酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)によく対応し
ている)。これらのELISA法は、用いられる特異成分
(即ち、LALに存在するコアギュローゲン)の必要量が4
0倍少なくとよいことが判明したので特に有利である。
更に、この試験を行うのに必要とする時間は、数百個の
試験について約4時間であり、公知の試験法に対して顕
著な向上を達成できる。これらの利点とは別に、本発明
の方法により、臨床試料、特に血液又は血漿に関して得
られる結果は、血液中に妨害物質が存在していても悪影
響を受けない利点がある。ELISA法は、十分確立されて
おり、既存の実験装置を用いて行うことができ且つ自動
化も可能である。従って、本発明の方法は、臨床試験所
では、診断目的で、一方、製薬業界においては原料又は
製剤中におけるアッセイとして幅広く適用できる。
更に、別の実施態様によれば、本発明の方法は、 a)コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体
か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ
に対する抗体、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド
又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ
リン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対
する抗体を、固体粒子に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)から得られるインキュベーション混合物を
工程a)の抗体に添加して、抗体がコアギュローゲン又
はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュロ
ーゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合に
は、コアギュローゲンの存在下で固体粒子の凝集を生じ
させるようにし、抗体がコアギュリン若しくはC−ペプ
チド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコア
ギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみ
に対する抗体の場合には、コアギュリン又はC−ペプチ
ドの存在下で固体粒子の凝集を生じさせるようにし、そ
して d)コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体
か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ
に対する抗体が結合している固体粒子が凝集しないこと
により、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド又はそ
の免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若
しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗
体が結合している固体粒子が凝集することにより試料中
のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確
認することを含む。
か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ
に対する抗体、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド
又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュ
リン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対
する抗体を、固体粒子に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)から得られるインキュベーション混合物を
工程a)の抗体に添加して、抗体がコアギュローゲン又
はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュロ
ーゲン又はその免疫決定基のみに対する抗体の場合に
は、コアギュローゲンの存在下で固体粒子の凝集を生じ
させるようにし、抗体がコアギュリン若しくはC−ペプ
チド又はその免疫決定基に対する抗体か、実質的にコア
ギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみ
に対する抗体の場合には、コアギュリン又はC−ペプチ
ドの存在下で固体粒子の凝集を生じさせるようにし、そ
して d)コアギュローゲン又はその免疫決定基に対する抗体
か、実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみ
に対する抗体が結合している固体粒子が凝集しないこと
により、又はコアギュリン若しくはC−ペプチド又はそ
の免疫決定基に対する抗体か、実質的にコアギュリン若
しくはC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対する抗
体が結合している固体粒子が凝集することにより試料中
のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を確
認することを含む。
この実施態様では、エンドトキシンの存在は、抗体が
結合している固体粒子の凝集を確認することにより、直
接的(視覚的)に検出できる。換言すれば、本方法のこ
の実施態様では、通常、抗体の標識は必要としない。
結合している固体粒子の凝集を確認することにより、直
接的(視覚的)に検出できる。換言すれば、本方法のこ
の実施態様では、通常、抗体の標識は必要としない。
上記した理由により本方法に用いるのが特に有利であ
ることが判明した本発明のモオクローナル抗体は、一般
的に抗体に関連して上記で説明した特徴を示す。このモ
ノクローナル抗体は、 a)適当な動物又は適当な動物細胞を、カブトガニ変形
細胞溶解産物若しくは血リンパ、その合成類似体又はそ
の免疫決定基から実質的になる抗原で免疫するか、前記
成分又は類似体とエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質との反応の生成物又はその免疫決定基から実質的に
なる抗原で免疫することにより、前記抗原に対する抗体
を産生する細胞を得て、 b)前記抗原に抗体を産生する細胞を適当な細胞系と融
合させ、 c)得られる前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
選択してクローニングし、 d)ハイブリドーマ細胞を適当な媒体中で成長させて前
記抗体を産生し、そして e)得られる抗体を培養から回収することにより調製で
きる。
ることが判明した本発明のモオクローナル抗体は、一般
的に抗体に関連して上記で説明した特徴を示す。このモ
ノクローナル抗体は、 a)適当な動物又は適当な動物細胞を、カブトガニ変形
細胞溶解産物若しくは血リンパ、その合成類似体又はそ
の免疫決定基から実質的になる抗原で免疫するか、前記
成分又は類似体とエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質との反応の生成物又はその免疫決定基から実質的に
なる抗原で免疫することにより、前記抗原に対する抗体
を産生する細胞を得て、 b)前記抗原に抗体を産生する細胞を適当な細胞系と融
合させ、 c)得られる前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
選択してクローニングし、 d)ハイブリドーマ細胞を適当な媒体中で成長させて前
記抗体を産生し、そして e)得られる抗体を培養から回収することにより調製で
きる。
動物の免疫は、前記成分、類似体又は反応生成物の、
緩衝使用液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又はアジュ
バント等の適当な溶媒溶液により行うのが好ましい。適
当なアジュバントとしては、例えば、フロイント完全ア
ジュバント、フロイント不完全アジュバント及び水酸化
アルミニウムが挙げられる。免疫のための適当な動物
は、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ニワトリ及
びモルモットから選択すればよい。動物の放血及び(ポ
リクローナル)抗体の分離は、自体公知の方法により行
うことができる。
緩衝使用液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又はアジュ
バント等の適当な溶媒溶液により行うのが好ましい。適
当なアジュバントとしては、例えば、フロイント完全ア
ジュバント、フロイント不完全アジュバント及び水酸化
アルミニウムが挙げられる。免疫のための適当な動物
は、ウサギ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ニワトリ及
びモルモットから選択すればよい。動物の放血及び(ポ
リクローナル)抗体の分離は、自体公知の方法により行
うことができる。
ミエローマ細胞との融合に用いられる抗体産生細胞
は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。ミエローマ
細胞と抗体産生細胞は、一方の種からの融合細胞をもう
一方の種からの細胞と融合することができれば、同じ動
物種由来のものである必要はない。しかしながら、ミエ
ローマ細胞源と抗体産生細胞源の両方は、同様の動物種
を使用することが好ましい。本発明を実施するための好
ましいハイブリドーマの一つは、マウスミエローマ細胞
を抗原感作マウス脾臓細胞と融合することにより製造で
きる。
は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。ミエローマ
細胞と抗体産生細胞は、一方の種からの融合細胞をもう
一方の種からの細胞と融合することができれば、同じ動
物種由来のものである必要はない。しかしながら、ミエ
ローマ細胞源と抗体産生細胞源の両方は、同様の動物種
を使用することが好ましい。本発明を実施するための好
ましいハイブリドーマの一つは、マウスミエローマ細胞
を抗原感作マウス脾臓細胞と融合することにより製造で
きる。
細胞融合は、ケーラー(Kohler)及びミルステイン
(Milstein)、ネーシャー(Nature)、256、495(197
5)に開示されている方法を改良して行うことができ
る。即ち、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、
ポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で行う
ことが好ましい。この際、ミエローマ細胞1個当たり抗
体産生細胞が約10個の割合が好ましい。用いられるミエ
ローマ細胞系は、選択培地中で未融合ミエローマ細胞が
死亡し、一方、融合したハイブリッド細胞が生存するよ
うに、所謂薬剤耐性型が好ましい。従来の方法では、酵
素ヒポキサチン−グアニンホスホリボシル−トランスフ
ァーゼを欠き、従ってHAT培地(ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジン含有)では成長できな8−アザ
グアニン耐性の細胞系が、細胞融合に最もよく用いられ
ている。更に、ミエローマ細胞系は、それ自体では、抗
体、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を生成
しないことを意味する「非分泌型(non−secreting)」
であることが好ましい。
(Milstein)、ネーシャー(Nature)、256、495(197
5)に開示されている方法を改良して行うことができ
る。即ち、抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、
ポリエチレングリコール等の融合促進剤の存在下で行う
ことが好ましい。この際、ミエローマ細胞1個当たり抗
体産生細胞が約10個の割合が好ましい。用いられるミエ
ローマ細胞系は、選択培地中で未融合ミエローマ細胞が
死亡し、一方、融合したハイブリッド細胞が生存するよ
うに、所謂薬剤耐性型が好ましい。従来の方法では、酵
素ヒポキサチン−グアニンホスホリボシル−トランスフ
ァーゼを欠き、従ってHAT培地(ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン及びチミジン含有)では成長できな8−アザ
グアニン耐性の細胞系が、細胞融合に最もよく用いられ
ている。更に、ミエローマ細胞系は、それ自体では、抗
体、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を生成
しないことを意味する「非分泌型(non−secreting)」
であることが好ましい。
前記成分、類似体又は反応生成物に対する抗体を産生
するハイブリドーマ細胞は、未融合抗体産生細胞、未融
合ミエローマ細胞及び融合細胞を個々の容器において、
未融合ミエローマが***しない選択培地で培養して、約
1〜2週間後にそれらが死亡するようにすることにより
選択できる。未融合抗体産生細胞のみが限られた数の細
胞***サイクルで生存し、その後、それらも死亡する
(1〜2週間)。一方、首尾よく融合した細胞は***を
続ける。これは、親のミエローマ細胞から受け継いだ永
久成長性を有するとともに、親の抗体産生細胞から酵素
ヒポキサンチンホスホリボシル−トランスフェラーゼを
合成する能力を有しているので、選択培地(casu HAT培
地)中で成長できるからである。それにもかかわらず、
同じ抗原に対して生じさせた融合細胞により産生したモ
ノクローナル抗体は、生成を誘発している特異的決定基
に依存して互いに識別し難い場合がある。しかしなが
ら、一定のハイブリドーマクローンの場合、このクロー
ンにより産生した全ての抗体は、抗原分子中の特定の決
定基に対して単一特異性である。所望の抗体を産生して
いるハイブリドーマは、例えば、限界希釈法又は他の適
当な方法により選択し、例えば、自体公知の方法におい
て限界希釈系を用いて、反復再クローニングによりクロ
ーン化し、ハイブリドーマ細胞を適当な媒体、例えば、
ダルベッコ最小エッセッシャル培地中で培養することに
より、高純度のクローン化モノクローナル抗体を得るこ
とができる。この試験管内法により、成長培地に存在す
る異種の血清、例えば、ウシ胎児血清からの少量のタン
パク質で汚染されるだけでモノクローナル抗体が産生す
る。
するハイブリドーマ細胞は、未融合抗体産生細胞、未融
合ミエローマ細胞及び融合細胞を個々の容器において、
未融合ミエローマが***しない選択培地で培養して、約
1〜2週間後にそれらが死亡するようにすることにより
選択できる。未融合抗体産生細胞のみが限られた数の細
胞***サイクルで生存し、その後、それらも死亡する
(1〜2週間)。一方、首尾よく融合した細胞は***を
続ける。これは、親のミエローマ細胞から受け継いだ永
久成長性を有するとともに、親の抗体産生細胞から酵素
ヒポキサンチンホスホリボシル−トランスフェラーゼを
合成する能力を有しているので、選択培地(casu HAT培
地)中で成長できるからである。それにもかかわらず、
同じ抗原に対して生じさせた融合細胞により産生したモ
ノクローナル抗体は、生成を誘発している特異的決定基
に依存して互いに識別し難い場合がある。しかしなが
ら、一定のハイブリドーマクローンの場合、このクロー
ンにより産生した全ての抗体は、抗原分子中の特定の決
定基に対して単一特異性である。所望の抗体を産生して
いるハイブリドーマは、例えば、限界希釈法又は他の適
当な方法により選択し、例えば、自体公知の方法におい
て限界希釈系を用いて、反復再クローニングによりクロ
ーン化し、ハイブリドーマ細胞を適当な媒体、例えば、
ダルベッコ最小エッセッシャル培地中で培養することに
より、高純度のクローン化モノクローナル抗体を得るこ
とができる。この試験管内法により、成長培地に存在す
る異種の血清、例えば、ウシ胎児血清からの少量のタン
パク質で汚染されるだけでモノクローナル抗体が産生す
る。
試験管内で産生した抗体と比較して、純度がわずかに
減少するが濃度が相当高いモノクローナル抗体を産生す
るために、選択したハイブリドーマ細胞を、動物の体腔
で成長させてもよい。この方法によれば、所望のハイブ
リドーマクローンを、マウス等の動物、好ましくは同系
又は半同系マウスに注射して、復水腫瘍を生成を生じさ
せることにより、高濃度の抗体を(約2〜10mg/ml)動
物の血液及び腹水に放出させる。たとえ動物が通常の免
疫グロブリンも産生するとしても、モノクローナル抗体
の約5%にしか過ぎない。本発明のモノクローナル抗体
は、一般的に、細胞から分泌されるので、延伸分離、濾
過、沈澱、抽出及び/又はクロマトグラフィー等の細胞
外産生物を分離するための標準操作により細胞上清又は
体液から回収できる。
減少するが濃度が相当高いモノクローナル抗体を産生す
るために、選択したハイブリドーマ細胞を、動物の体腔
で成長させてもよい。この方法によれば、所望のハイブ
リドーマクローンを、マウス等の動物、好ましくは同系
又は半同系マウスに注射して、復水腫瘍を生成を生じさ
せることにより、高濃度の抗体を(約2〜10mg/ml)動
物の血液及び腹水に放出させる。たとえ動物が通常の免
疫グロブリンも産生するとしても、モノクローナル抗体
の約5%にしか過ぎない。本発明のモノクローナル抗体
は、一般的に、細胞から分泌されるので、延伸分離、濾
過、沈澱、抽出及び/又はクロマトグラフィー等の細胞
外産生物を分離するための標準操作により細胞上清又は
体液から回収できる。
本発明による試験キットの個々の試薬a)及びb)
は、それぞれ、カブトガニ変形細胞溶解産物の抗体及び
成分に関連して上記で説明した特徴を示すことができ
る。これとは別に、キットは、標識及び未標識抗体(特
に、二抗体アッセイに使用の場合)の両方を含有するも
のでよい。本発明のキットにおける他の成分しては、特
に定量アッセイに有効で、標準対照よりも高レベル又は
低レベルの抗体結合を測定することが可能となるエンド
トキシン標準、並びに本発明の試験キット及び本発明の
方法で用いられる試薬を希釈するためのパイロジェンを
含まない水(パイロジェンで汚染された水を用いること
に起因して誤った結果が得られるのを避けるために)が
挙げられる。本発明の試薬キットは、グラム陰性菌〔例
えば、腸内細菌、例えば、大腸菌、志賀赤痢菌(Shigal
la dysenteriae)、シュードモナス(Pseudomonas)sp
p.、サルモネラ(Salmonella)spp.、ナイセリア(Neis
seria)ssp.クロストリジウム(Clostridium)spp.、コ
レラ菌(Vibrio cholerae)、パスツレラ(Pasteurell
a)ssp.〕及びグラム陽性菌〔例えば、リステリア菌(L
isteria monocytogenes)及びストレプトコッカス(Str
eptococcus)spp.〕;マイコプラズマ(Mycoplasma)sp
p.;クラミジア(Chlamydia spp.);梅毒トレポネーマ
(Treponema pallidum);カビ〔例えば、カンジダアル
ビカンス(Candida albicans)及びマラリア寄生虫(ma
laria parasite)熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium fal
siparum)等の原生動物をはじめとする多種多様の病原
体による感染から生じる臨床/病的状態の診断に用いる
ことができる。又、キットは、これらの病原体自体又は
残留発熱性エンドトキシン若しくは病原体由来の他の表
面抗原による、医薬品原料、製剤及び医療用具の汚染の
検出にも有効である。
は、それぞれ、カブトガニ変形細胞溶解産物の抗体及び
成分に関連して上記で説明した特徴を示すことができ
る。これとは別に、キットは、標識及び未標識抗体(特
に、二抗体アッセイに使用の場合)の両方を含有するも
のでよい。本発明のキットにおける他の成分しては、特
に定量アッセイに有効で、標準対照よりも高レベル又は
低レベルの抗体結合を測定することが可能となるエンド
トキシン標準、並びに本発明の試験キット及び本発明の
方法で用いられる試薬を希釈するためのパイロジェンを
含まない水(パイロジェンで汚染された水を用いること
に起因して誤った結果が得られるのを避けるために)が
挙げられる。本発明の試薬キットは、グラム陰性菌〔例
えば、腸内細菌、例えば、大腸菌、志賀赤痢菌(Shigal
la dysenteriae)、シュードモナス(Pseudomonas)sp
p.、サルモネラ(Salmonella)spp.、ナイセリア(Neis
seria)ssp.クロストリジウム(Clostridium)spp.、コ
レラ菌(Vibrio cholerae)、パスツレラ(Pasteurell
a)ssp.〕及びグラム陽性菌〔例えば、リステリア菌(L
isteria monocytogenes)及びストレプトコッカス(Str
eptococcus)spp.〕;マイコプラズマ(Mycoplasma)sp
p.;クラミジア(Chlamydia spp.);梅毒トレポネーマ
(Treponema pallidum);カビ〔例えば、カンジダアル
ビカンス(Candida albicans)及びマラリア寄生虫(ma
laria parasite)熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium fal
siparum)等の原生動物をはじめとする多種多様の病原
体による感染から生じる臨床/病的状態の診断に用いる
ことができる。又、キットは、これらの病原体自体又は
残留発熱性エンドトキシン若しくは病原体由来の他の表
面抗原による、医薬品原料、製剤及び医療用具の汚染の
検出にも有効である。
図面の簡単な説明 第1図は、リムルス変形細胞溶解産物とエンドトキシ
ンとの反応後、コアギュローゲンのバンドが消失して、
コアギュローゲンと抗体との反応性が喪失したことを示
している。
ンとの反応後、コアギュローゲンのバンドが消失して、
コアギュローゲンと抗体との反応性が喪失したことを示
している。
第2図は、ELISA試験により測定される残留コアギュ
ローゲンは、エンドトキシン濃度に逆比例することを示
しているLAL−ELISAの標準曲線である。
ローゲンは、エンドトキシン濃度に逆比例することを示
しているLAL−ELISAの標準曲線である。
第3図〜第6図は、インキュベーション時間とLALの
希釈倍数との異なる組み合わせから得られるLAL−エン
ドトキシン反応曲線である。
希釈倍数との異なる組み合わせから得られるLAL−エン
ドトキシン反応曲線である。
第7図は、血漿を10倍希釈した後75℃で10分間インキ
ュベーション処理するとエンドトキシンがほぼ100%回
収されたのに対して、他の2つの処理では回収率が約50
%にすぎなかったことを示している。
ュベーション処理するとエンドトキシンがほぼ100%回
収されたのに対して、他の2つの処理では回収率が約50
%にすぎなかったことを示している。
第8図及び第9図は、種々のグラム陰性菌株からの8
種のLPSのLAL−ELISA曲線(第8図)及び(1−3)−
β−D−グルカンの曲線(第9図)である。使用たLPS
は、腸炎菌(Salmonella enteritidis)(▲)、大腸
菌、J5(E.coli)(▽)、緑膿菌(Pseudomonas aerugi
nosa)(▼),ウマ流産菌(Salmonella abortus equ
i)(△)、大腸菌055:B5(○)、ネズミチフス菌(Sal
monella typhimurium)(■)、大腸菌0111:B4(●)及
びサルモネラミネソタ(Salmonella minnesota)(□)
であった。第8図における符号(+)は、エンドトキシ
ンを含まない水中で得られるLALの吸光度の地値を示し
ている。
種のLPSのLAL−ELISA曲線(第8図)及び(1−3)−
β−D−グルカンの曲線(第9図)である。使用たLPS
は、腸炎菌(Salmonella enteritidis)(▲)、大腸
菌、J5(E.coli)(▽)、緑膿菌(Pseudomonas aerugi
nosa)(▼),ウマ流産菌(Salmonella abortus equ
i)(△)、大腸菌055:B5(○)、ネズミチフス菌(Sal
monella typhimurium)(■)、大腸菌0111:B4(●)及
びサルモネラミネソタ(Salmonella minnesota)(□)
であった。第8図における符号(+)は、エンドトキシ
ンを含まない水中で得られるLALの吸光度の地値を示し
ている。
第10図は、ヒト血清(□)、ヒト血漿(■)、ポリミ
キシンB(polymixin B)(●)及びリムルス血漿
(○)のEIA50に及ぼす希釈倍数の影響を示している。
ヒト血清及びヒト血漿は、一人のボランティアから調製
した。リムルス血漿は、12のリムルスポリフェムスのプ
ール血液を、5000x gで30分間遠心分離して調製した無
細胞上清であった。
キシンB(polymixin B)(●)及びリムルス血漿
(○)のEIA50に及ぼす希釈倍数の影響を示している。
ヒト血清及びヒト血漿は、一人のボランティアから調製
した。リムルス血漿は、12のリムルスポリフェムスのプ
ール血液を、5000x gで30分間遠心分離して調製した無
細胞上清であった。
発明を実施するための最良の形態 以下、本発明を実施例により更に詳細説明するが、本
発明はこれらの実施例には限定されない。
発明はこれらの実施例には限定されない。
実施例1 コアギュローゲン(LAL)に対するモノクローナル抗
体の調製 1.コアギュローゲンの調製及び精製 リムルス変形細胞溶解産物(LAL)を、トベーデ・エ
ム(Tvede M)及びベーク・エル(Bek L)、アクタ パ
ソル ミクロバイオル イムノル スカンド(Acta Pat
hol.Microbiol.Immunol.Scand.)、第B91章、1983年、
第9〜15頁に開示されている従来の方法により、リムル
スポリフェムスから産生した。
体の調製 1.コアギュローゲンの調製及び精製 リムルス変形細胞溶解産物(LAL)を、トベーデ・エ
ム(Tvede M)及びベーク・エル(Bek L)、アクタ パ
ソル ミクロバイオル イムノル スカンド(Acta Pat
hol.Microbiol.Immunol.Scand.)、第B91章、1983年、
第9〜15頁に開示されている従来の方法により、リムル
スポリフェムスから産生した。
溶解産物10mlを透析し、2mM CaCl2を含有する0.05Mト
リースHCl緩衝液(pH7.9)の等容量と混合した。この混
合物を、同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファロース
(商標)CL−6Bカラム(15x1.5cm)に附した。カラムに
吸着しなかった分画を、更に、同じトリス緩衝液で平衡
化したヘパリン−セファロース(商標)CL−6Bカラムに
附した。これらの条件下で、コアギュローゲンがヘパリ
ン−セファロース(商標)カラムに結合したが、0.15M
NaCl及び2mM CaCl2を含有する0.05Mトリス−HCl緩衝液
(pH7.9)を用いて溶離できた。溶離物質のSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により、溶離物質が純度>90
%のコアギュローゲンを含有していることが判明した。
リースHCl緩衝液(pH7.9)の等容量と混合した。この混
合物を、同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファロース
(商標)CL−6Bカラム(15x1.5cm)に附した。カラムに
吸着しなかった分画を、更に、同じトリス緩衝液で平衡
化したヘパリン−セファロース(商標)CL−6Bカラムに
附した。これらの条件下で、コアギュローゲンがヘパリ
ン−セファロース(商標)カラムに結合したが、0.15M
NaCl及び2mM CaCl2を含有する0.05Mトリス−HCl緩衝液
(pH7.9)を用いて溶離できた。溶離物質のSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により、溶離物質が純度>90
%のコアギュローゲンを含有していることが判明した。
2.コアギュローゲンによるBalb/cマウスの免疫化 上記工程1で得た精製コアギュローゲンを、コアギュ
ローゲン200μg/mg Al(OH)3に相当する水酸化アルミ
ニウムゲル(Al(OH)3)に吸着させ、得られた懸濁液
をAl(OH)31mg/mlに調製した。
ローゲン200μg/mg Al(OH)3に相当する水酸化アルミ
ニウムゲル(Al(OH)3)に吸着させ、得られた懸濁液
をAl(OH)31mg/mlに調製した。
一次免疫を行うため、各マウスに、フロイント不完全
アジュバント0.5mlで乳化したコアギュローゲン懸濁液
0.5ml(コアギュローゲン100μg/マウスに相当)を腹腔
内注射した。2週間後、各マウスに、フロイントアジュ
バントなしで、コアギュローゲン懸濁液0.5mlを腹腔内
にブースター注射した。
アジュバント0.5mlで乳化したコアギュローゲン懸濁液
0.5ml(コアギュローゲン100μg/マウスに相当)を腹腔
内注射した。2週間後、各マウスに、フロイントアジュ
バントなしで、コアギュローゲン懸濁液0.5mlを腹腔内
にブースター注射した。
同様の投与量を28日目に注射し、その4日後に脾臓を
取り出し、脾臓を慎重に切開及び引き裂いて脾臓細胞懸
濁液を調製した。得られた脾臓細胞を、以下の工程の細
胞融合に使用した。
取り出し、脾臓を慎重に切開及び引き裂いて脾臓細胞懸
濁液を調製した。得られた脾臓細胞を、以下の工程の細
胞融合に使用した。
3.細胞融合及び細胞の培養 上記で得た脾臓細胞を、ミエローマ細胞(x63A
g8.653)と10:1の非(脾臓細胞108に対してミエローマ
細胞107)で混合し、ポリエチレングリコール溶液〔リ
ン酸緩衝生理食塩水中50w/v%PEG1500、7w/v%DMSO(ジ
メチルスルホキシド)〕とともに、37℃で90秒間インキ
ュベーションして細胞融合を促進した。ダルベッコ最小
エッセンシャル培地(DMEM)20mlを添加し、細胞を1,00
0xgで遠心分離した。細胞ペレットを、10%ウシ胎児血
清を含有するHAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジン含有)100mlに再懸濁し、細胞を1096ウ
エルマイクロタイタプレート(NUNC、デンマーク)に分
配した。各ウエルに、細胞成長を促進し且つ微生物汚染
を防ぐためのフィーダ細胞として、清浄マウス由来の細
胞を104個/ウエルを添加した。培地は1週間に2回取
りかえた。
g8.653)と10:1の非(脾臓細胞108に対してミエローマ
細胞107)で混合し、ポリエチレングリコール溶液〔リ
ン酸緩衝生理食塩水中50w/v%PEG1500、7w/v%DMSO(ジ
メチルスルホキシド)〕とともに、37℃で90秒間インキ
ュベーションして細胞融合を促進した。ダルベッコ最小
エッセンシャル培地(DMEM)20mlを添加し、細胞を1,00
0xgで遠心分離した。細胞ペレットを、10%ウシ胎児血
清を含有するHAT培地(ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジン含有)100mlに再懸濁し、細胞を1096ウ
エルマイクロタイタプレート(NUNC、デンマーク)に分
配した。各ウエルに、細胞成長を促進し且つ微生物汚染
を防ぐためのフィーダ細胞として、清浄マウス由来の細
胞を104個/ウエルを添加した。培地は1週間に2回取
りかえた。
4.抗コアギュローゲン抗体を産生するハイブリドーマ細
胞の選択 酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)により、陽性
クローンをスクリーニングした。96ウエルマイクロタイ
タプレート(イムノプレート、NUNC、デンマーク)に、
上記した方法で精製したコアギュローゲンを塗布した。
このコアギュローゲンを、炭酸緩衝液(pH9.0)で2μg
/mlに希釈し、コアギュローゲン含有緩衝液100μを各
ウエルに添加した。4℃で一晩インキュベーション後、
ウエルを、0.05%ツイーン20(Tween20)(商標)を含
有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4回洗浄した。
胞の選択 酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)により、陽性
クローンをスクリーニングした。96ウエルマイクロタイ
タプレート(イムノプレート、NUNC、デンマーク)に、
上記した方法で精製したコアギュローゲンを塗布した。
このコアギュローゲンを、炭酸緩衝液(pH9.0)で2μg
/mlに希釈し、コアギュローゲン含有緩衝液100μを各
ウエルに添加した。4℃で一晩インキュベーション後、
ウエルを、0.05%ツイーン20(Tween20)(商標)を含
有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4回洗浄した。
ウエルを、工程3で調製した細胞融合プレートからの
培養上清100μとともに、1時間インキュベーション
し、0.02%ツイーン20(Tween20)(商標)を含有するP
BSで1:10に希釈し、洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ウサ
ギ抗マウスIg〔ダコパッツ(Dakopatts)、コペンハー
ゲン(Copenhagen)、コードP260、1:1000希釈)ととも
に1時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ
を、オルソフェニレンジアミン8mgを含有するクエン酸
・リン酸緩衝液(蒸留水1000ml)当たり、クエン酸・H2
O7.3g及びNa2HPO2・2H2O11.86g)(pH5.0)10mlに35%H
2O25μを添加した溶液と反応させた。この反応は、1M
H2SO4で停止させ、492nmで吸光度を読み取った。
培養上清100μとともに、1時間インキュベーション
し、0.02%ツイーン20(Tween20)(商標)を含有するP
BSで1:10に希釈し、洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ウサ
ギ抗マウスIg〔ダコパッツ(Dakopatts)、コペンハー
ゲン(Copenhagen)、コードP260、1:1000希釈)ととも
に1時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼ
を、オルソフェニレンジアミン8mgを含有するクエン酸
・リン酸緩衝液(蒸留水1000ml)当たり、クエン酸・H2
O7.3g及びNa2HPO2・2H2O11.86g)(pH5.0)10mlに35%H
2O25μを添加した溶液と反応させた。この反応は、1M
H2SO4で停止させ、492nmで吸光度を読み取った。
2週間の培養の後、17ウエルからのハイブリドーマ上
清は、強い陽性反応を示した。限界希釈により、これら
のウエルの内10個からハイブリドーマ細胞を選択し、ク
ローニングし且つ再クローニングを行った。このように
して安定なクローン7個を樹立した。得られたハイブリ
ドーマ細胞クローンを、10%ウシ胎児血清を補充したDM
EM培地中で細胞培養フラスコで、37℃、5%CO2及び湿
度90%の条件で成長させるとともに、一定のインキュベ
ーション時間後にマウスに腫瘍を形成しその血液及び腹
水に高濃度の抗体(2〜3mg/ml)を放出するプリスタン
(Pristane)で処理したマウス(2週間前にプリスタン
1mlを腹腔内注射したマウス)に注射(細胞107個)し
た。
清は、強い陽性反応を示した。限界希釈により、これら
のウエルの内10個からハイブリドーマ細胞を選択し、ク
ローニングし且つ再クローニングを行った。このように
して安定なクローン7個を樹立した。得られたハイブリ
ドーマ細胞クローンを、10%ウシ胎児血清を補充したDM
EM培地中で細胞培養フラスコで、37℃、5%CO2及び湿
度90%の条件で成長させるとともに、一定のインキュベ
ーション時間後にマウスに腫瘍を形成しその血液及び腹
水に高濃度の抗体(2〜3mg/ml)を放出するプリスタン
(Pristane)で処理したマウス(2週間前にプリスタン
1mlを腹腔内注射したマウス)に注射(細胞107個)し
た。
5.モノクローナル抗体の精製 培養上清を、ミリポア(Millipore)限外濾過システ
ムで濃縮した。NaClを添加して、グリシン濃度を3.3Mか
ら1.65Mに調製し、0.2M NaOHを用いてpHを8.85に調製し
た。次に、抗体を、プロテインAカラムを通した。結合
抗体を、0.1Mクエン酸・リン酸緩衝液(pH2.8)で溶離
した。トリス−HC1を用いて、pHを8.0に調製した。A280
/1%=14と仮定して、抗体の量(A280)を、分光光度計
で測定した。より精密に測定するためにELISA法を用い
て、マウス抗体のみを測定した。マイクロタイタプレー
トに、PBSで1:500に希釈したウサギ抗マウス免疫グロブ
リン(ダコバッツ、コード2109)を塗布した。既知のマ
ウスIg標準(マウス20μg Ig/ml)の希釈裂及び未知試
料の希釈物を添加した。結合マウスIgを、1:1000に希釈
したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIg(ダコパッ
ツ、コードP260)を用いて検出した。標準曲線から、マ
ウスIgの未知の濃度が計算できた。腹水からの抗体を、
実質的に同様な方法で精製した。但し、この場合、プロ
テインカラムに附する前に、上記のNaCl/グリシン/NaOH
緩衝液で1:1に希釈した。
ムで濃縮した。NaClを添加して、グリシン濃度を3.3Mか
ら1.65Mに調製し、0.2M NaOHを用いてpHを8.85に調製し
た。次に、抗体を、プロテインAカラムを通した。結合
抗体を、0.1Mクエン酸・リン酸緩衝液(pH2.8)で溶離
した。トリス−HC1を用いて、pHを8.0に調製した。A280
/1%=14と仮定して、抗体の量(A280)を、分光光度計
で測定した。より精密に測定するためにELISA法を用い
て、マウス抗体のみを測定した。マイクロタイタプレー
トに、PBSで1:500に希釈したウサギ抗マウス免疫グロブ
リン(ダコバッツ、コード2109)を塗布した。既知のマ
ウスIg標準(マウス20μg Ig/ml)の希釈裂及び未知試
料の希釈物を添加した。結合マウスIgを、1:1000に希釈
したペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスIg(ダコパッ
ツ、コードP260)を用いて検出した。標準曲線から、マ
ウスIgの未知の濃度が計算できた。腹水からの抗体を、
実質的に同様な方法で精製した。但し、この場合、プロ
テインカラムに附する前に、上記のNaCl/グリシン/NaOH
緩衝液で1:1に希釈した。
6.モノクローナル抗体の特性決定 ハイブリドーマ細胞により産生したモノクローナル抗
体のクラス及びサブグラスを、マウスIgに対するビオチ
ン標識クラス/サブクラス特異的ウサギ抗体(米国ザイ
ムド社(Zymed Corporation)を用いて、ELISA法で試験
した。この方法は、検出抗体がマウスIgG1、IgG2a、IgG
2b、IgG3、IgM又はIgAに対するビオチン標識ウサギ抗体
である以外は、マウスIgの量の測定に関連して上記で説
明した方法と実質的に同じであった。結合を、ペルオキ
シダーゼ標識ストレプタピジンで最終的に検出した。全
ての抗体が、IgG1サブクラスであり、K軽鎖を有してい
た。
体のクラス及びサブグラスを、マウスIgに対するビオチ
ン標識クラス/サブクラス特異的ウサギ抗体(米国ザイ
ムド社(Zymed Corporation)を用いて、ELISA法で試験
した。この方法は、検出抗体がマウスIgG1、IgG2a、IgG
2b、IgG3、IgM又はIgAに対するビオチン標識ウサギ抗体
である以外は、マウスIgの量の測定に関連して上記で説
明した方法と実質的に同じであった。結合を、ペルオキ
シダーゼ標識ストレプタピジンで最終的に検出した。全
ての抗体が、IgG1サブクラスであり、K軽鎖を有してい
た。
実施例2 モノクローナル抗体とリムルス変形細胞溶解産物中の
コアギュローゲンとの反応性及びエンドトキシン反応リ
ムルス変形細胞溶解産物との反応性の欠如 リムルス変形細胞溶解産物(LAL)とリポ多糖類(LP
S)反応LALの各3μを、(1%)アガロースゲルに附
した後2時間20V/cmで電気泳動した。電気泳動後、一枚
のニトロセルロース紙をアガロースゲル上に置き、5kg
の圧力を約20分間維持ずることにより、アガロースゲル
中のタンパク質をニトロセルロース紙に結合させた。ニ
トロセルロース紙の過剰の結合部位を0.05%ツイーン20
(商標)でブロックした。
コアギュローゲンとの反応性及びエンドトキシン反応リ
ムルス変形細胞溶解産物との反応性の欠如 リムルス変形細胞溶解産物(LAL)とリポ多糖類(LP
S)反応LALの各3μを、(1%)アガロースゲルに附
した後2時間20V/cmで電気泳動した。電気泳動後、一枚
のニトロセルロース紙をアガロースゲル上に置き、5kg
の圧力を約20分間維持ずることにより、アガロースゲル
中のタンパク質をニトロセルロース紙に結合させた。ニ
トロセルロース紙の過剰の結合部位を0.05%ツイーン20
(商標)でブロックした。
次に、ニトロセルロース紙を、実施例1で説明したよ
うにしてモノクローナル抗体とともにインキュベーショ
ンした。抗体を含有する培養上清200μを、0.02%ツ
イーン20(商標)を含有するPBS50mlに添加した。一晩
のインキュベーション後、1:1000に希釈した酵素標識二
次抗体(ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス;コペン
ハーゲンにあるダコパッツ社製)を添加した。最後に、
テトラメチルベンジジン及びH2O2を添加した〔テトラメ
チルベンジジン(24mg)を、ジオクチルソジウムサルフ
ァサクシナート80mgのエタノール10ml溶液で溶解し、ク
エン酸・リン酸緩衝液(pH5.0)30mlを添加後、30%H2O
2を20μ添加し、蒸留水を加えて50mlとする〕。結合
抗体が濃い青色に着色したのが眼で観察された。第1図
から、モノクローナル抗体は非反対LAL中のコアギュロ
ーゲンと反応するが、LPS反応LALとは反応しないことが
明らかである。免疫ブロット法は、シー・コッホ(C.Ko
ch)等、ジェイ イムノロジカル メソッズ(J.Immuno
logical Methods)、第84巻、1985年、第271〜278頁に
開示されている方法を用いた。
うにしてモノクローナル抗体とともにインキュベーショ
ンした。抗体を含有する培養上清200μを、0.02%ツ
イーン20(商標)を含有するPBS50mlに添加した。一晩
のインキュベーション後、1:1000に希釈した酵素標識二
次抗体(ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウス;コペン
ハーゲンにあるダコパッツ社製)を添加した。最後に、
テトラメチルベンジジン及びH2O2を添加した〔テトラメ
チルベンジジン(24mg)を、ジオクチルソジウムサルフ
ァサクシナート80mgのエタノール10ml溶液で溶解し、ク
エン酸・リン酸緩衝液(pH5.0)30mlを添加後、30%H2O
2を20μ添加し、蒸留水を加えて50mlとする〕。結合
抗体が濃い青色に着色したのが眼で観察された。第1図
から、モノクローナル抗体は非反対LAL中のコアギュロ
ーゲンと反応するが、LPS反応LALとは反応しないことが
明らかである。免疫ブロット法は、シー・コッホ(C.Ko
ch)等、ジェイ イムノロジカル メソッズ(J.Immuno
logical Methods)、第84巻、1985年、第271〜278頁に
開示されている方法を用いた。
実施例3 酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)によるエンドト
キシンの検出 再構成しパイロジェンを含まないトリス−Mg++緩衝液
で1:4に希釈した市販のLALZ剤〔米国マサチューセッシ
州のウッドショーにあるザ・アソシェーション・オブ・
ケープ・コッド(The Association of Cape Cod)〕10
μを、多数の小さなガラス製試験管に添加した。各試
験管に、米国薬局方標準エンドトキシン〔大腸菌055:B
5;米国ウオーカーズビレ(Walkersville)にあるホイッ
ターカー・エムエー・バイオプロダクツ社(Whittaker
M.A.Bioproducts,Inc.)(無エンドトキシン緩衝液であ
る陰性対照を含む)の濃度を変えた(第2図参照)試験
試料10μを添加した。混合物を、37℃で1時間インキ
ュベーションした。炭酸緩衝液(pH9.6)(蒸留水1000m
l当たりNa2CO31.59g及びNaHCO32.93g含有)0.5mlを添加
して反応を停止させ、試験管ごとに、炭酸緩衝液で1:50
希釈物を調製した。
キシンの検出 再構成しパイロジェンを含まないトリス−Mg++緩衝液
で1:4に希釈した市販のLALZ剤〔米国マサチューセッシ
州のウッドショーにあるザ・アソシェーション・オブ・
ケープ・コッド(The Association of Cape Cod)〕10
μを、多数の小さなガラス製試験管に添加した。各試
験管に、米国薬局方標準エンドトキシン〔大腸菌055:B
5;米国ウオーカーズビレ(Walkersville)にあるホイッ
ターカー・エムエー・バイオプロダクツ社(Whittaker
M.A.Bioproducts,Inc.)(無エンドトキシン緩衝液であ
る陰性対照を含む)の濃度を変えた(第2図参照)試験
試料10μを添加した。混合物を、37℃で1時間インキ
ュベーションした。炭酸緩衝液(pH9.6)(蒸留水1000m
l当たりNa2CO31.59g及びNaHCO32.93g含有)0.5mlを添加
して反応を停止させ、試験管ごとに、炭酸緩衝液で1:50
希釈物を調製した。
希釈インキュベーション混合物100μを、96ウエル
マイクロタイタフプレート(NUNC、デンマーク)の各ウ
エルに添加した。室温で1時間インキュベーション後、
プレートを、PBS〔蒸留水1000ml当たりNaCl29.2g、KCl
0.2g、KH2PO40.2g、Na2PO4・2H2O 1.15及びトリトンX
(商標)10ml含有〕で4回洗浄した。ウイルソン(Wils
on)及びナカネ(Nakane)(62)により記載されている
過ヨウ素酸塩法と実質的に同様の方法で、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼに、実施例1で記載したようにして
調製したモノクローナル抗体を結合させた。即ち、蒸留
水1mlに溶解したHRP4mgを、調製したばかりの100mM NaI
O40.1mlと混合し、30分間室温で撹拌した。この溶液
を、1mM酢酸ナトリウム緩衝液(p4.4)で一晩4℃にお
いて透析後、モノクローナル抗体(50mM炭酸緩衝液1ml
にう溶解、pH9.5)8mgと混合した。室温で2時間撹拌
後、新鮮NaBH4溶液(4mg/ml)0.mlを添加し、4℃で2
時間インキュベーションした。得られた複合体を、リン
酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.3)で4℃において一晩透
析した。その後、等容量のグリセロール(87%)に添加
し、−20℃で保存した。希釈緩衝液(洗浄緩衝液1000ml
にウシ血清アルブミン10gを溶解したもの、pH7.2)で1:
20,000に希釈したペルオキシダーゼ結合モノクローナル
抗体100μをウエルに添加し、1時間インキュベーシ
ョンした。プレートをPBSで4回洗浄後、染色溶液〔蒸
留水1000ml当たりクエン酸・H2O7.3g及びNa2HPO4・2H2O
11.86クエン酸・H2O7.3gを含有し、そこにペルオキシダ
ーゼの基質を添加した溶液(パーヒドロール40μを添
加した染色緩衝液100mlにオルソフェニレンジアミン40m
gを溶解したもの)〕100μを添加した。30後1M H2SO4
で反応を停止し、492nmで吸光度を測定した。
マイクロタイタフプレート(NUNC、デンマーク)の各ウ
エルに添加した。室温で1時間インキュベーション後、
プレートを、PBS〔蒸留水1000ml当たりNaCl29.2g、KCl
0.2g、KH2PO40.2g、Na2PO4・2H2O 1.15及びトリトンX
(商標)10ml含有〕で4回洗浄した。ウイルソン(Wils
on)及びナカネ(Nakane)(62)により記載されている
過ヨウ素酸塩法と実質的に同様の方法で、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼに、実施例1で記載したようにして
調製したモノクローナル抗体を結合させた。即ち、蒸留
水1mlに溶解したHRP4mgを、調製したばかりの100mM NaI
O40.1mlと混合し、30分間室温で撹拌した。この溶液
を、1mM酢酸ナトリウム緩衝液(p4.4)で一晩4℃にお
いて透析後、モノクローナル抗体(50mM炭酸緩衝液1ml
にう溶解、pH9.5)8mgと混合した。室温で2時間撹拌
後、新鮮NaBH4溶液(4mg/ml)0.mlを添加し、4℃で2
時間インキュベーションした。得られた複合体を、リン
酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.3)で4℃において一晩透
析した。その後、等容量のグリセロール(87%)に添加
し、−20℃で保存した。希釈緩衝液(洗浄緩衝液1000ml
にウシ血清アルブミン10gを溶解したもの、pH7.2)で1:
20,000に希釈したペルオキシダーゼ結合モノクローナル
抗体100μをウエルに添加し、1時間インキュベーシ
ョンした。プレートをPBSで4回洗浄後、染色溶液〔蒸
留水1000ml当たりクエン酸・H2O7.3g及びNa2HPO4・2H2O
11.86クエン酸・H2O7.3gを含有し、そこにペルオキシダ
ーゼの基質を添加した溶液(パーヒドロール40μを添
加した染色緩衝液100mlにオルソフェニレンジアミン40m
gを溶解したもの)〕100μを添加した。30後1M H2SO4
で反応を停止し、492nmで吸光度を測定した。
第2図は、試料に対するエンドトキシンの添加量を変
えた場合の結果を示す標準曲線である。この曲線から、
本発明の方法の感度(検出範囲)は、エンドトキシン10
〜0.75pg/mlの範囲であることが分かる。
えた場合の結果を示す標準曲線である。この曲線から、
本発明の方法の感度(検出範囲)は、エンドトキシン10
〜0.75pg/mlの範囲であることが分かる。
本実施例で説明した試験では、インキュベーション混
合物からのコアギュローゲンを、直接マイクロタイタプ
レートに結合させ、もしエンドトキシンが存在する場
合、コアギュローゲンの存在量が少なく、エンドトキシ
ンを含まない対照と比較して、試験において検出可能な
結合抗体の量が減少する。
合物からのコアギュローゲンを、直接マイクロタイタプ
レートに結合させ、もしエンドトキシンが存在する場
合、コアギュローゲンの存在量が少なく、エンドトキシ
ンを含まない対照と比較して、試験において検出可能な
結合抗体の量が減少する。
第3図〜第6図は、インキュベーション時間及びLAL
の希釈倍数を変えた条件下でLAL(コアギュローゲン)
とエンドトキシンとを反応させた場合の反応曲線であ
る。これらの曲線から、以下のことが明らかである:
(1)エンドトキシンの検出性は、全てのLAL希釈倍数
において、インキュベーション時間の増加とともに増加
する。この際、希釈倍数が高いほど急速に増加する;
(2)1:4以下の希釈では、30分のインキュベーション
後では検出性が同じであり、又、全ての希釈倍数での検
出性の差は、インキュベーション時間の増加とともに減
少した;(3)LALの希釈倍数を高めると、曲線におい
て、エンドトキシンの測定可能濃度のスパンが広がる。
本発明のELISA試験法を、ロケット免疫電気泳動法(43
に記載されている)及び従来のゲル強固法〔無パイロジ
ェントリス−Mg++緩衝液で再構成したLAL0.1mlをガラス
製試験管(10x75mm)中でエンドトキシン溶液0.1mlと混
合し、試験管をさかさにしてもそのままの状態を維持す
ることのできる強固なゲルが生成して場合を陽性とし、
他の全ての場合を陰性とした〕と比較した。結果を表2
に示す。
の希釈倍数を変えた条件下でLAL(コアギュローゲン)
とエンドトキシンとを反応させた場合の反応曲線であ
る。これらの曲線から、以下のことが明らかである:
(1)エンドトキシンの検出性は、全てのLAL希釈倍数
において、インキュベーション時間の増加とともに増加
する。この際、希釈倍数が高いほど急速に増加する;
(2)1:4以下の希釈では、30分のインキュベーション
後では検出性が同じであり、又、全ての希釈倍数での検
出性の差は、インキュベーション時間の増加とともに減
少した;(3)LALの希釈倍数を高めると、曲線におい
て、エンドトキシンの測定可能濃度のスパンが広がる。
本発明のELISA試験法を、ロケット免疫電気泳動法(43
に記載されている)及び従来のゲル強固法〔無パイロジ
ェントリス−Mg++緩衝液で再構成したLAL0.1mlをガラス
製試験管(10x75mm)中でエンドトキシン溶液0.1mlと混
合し、試験管をさかさにしてもそのままの状態を維持す
ることのできる強固なゲルが生成して場合を陽性とし、
他の全ての場合を陰性とした〕と比較した。結果を表2
に示す。
表2から、新規な方法は、ロケット免疫電気泳動法に
優るとも劣らない方法であり、ゲル凝固法よりも8倍も
低濃度のエンドトキシンを検出することができることが
明らかである。
優るとも劣らない方法であり、ゲル凝固法よりも8倍も
低濃度のエンドトキシンを検出することができることが
明らかである。
LAL−ELISAの利点の一つは、LALの希釈倍数及びイン
キュベーション時間を調整することにより、1バッチの
市販のLALから所望の感度の標準曲線を得ることができ
ることにある。
キュベーション時間を調整することにより、1バッチの
市販のLALから所望の感度の標準曲線を得ることができ
ることにある。
パイロジェンとしてLAL試験が公式に承認されるとと
もに、市販のLAL試薬にたして大きな需要が生じた。唯
一のLAL源が、絶滅しかけている無脊椎動物のカブトガ
ニであるので、LALの消費量が最少で済む感度の良いLAL
試験の開発が重要となっている。コアギュローゲンを検
出するためのELISA法では感度が高く(最初のLALが1000
0倍に希釈されたときでも、A492の値は2.0に達した)、
LALの使用量が最少限で済む可能性がある。計算では、L
ALの体積及び希釈倍数を考慮して同じ感度で比較する
と、LAL−ELISAで必要とするLALの量は、凝固−ゲル法
で使用されるLALの量のわずか1/160でよい。一般的に、
凝固−ゲル法よりも10倍以上感度のよいLAL−ELISAで
は、凝固−ゲル法で使用されるLALの必要量の約1/40で
よい。
もに、市販のLAL試薬にたして大きな需要が生じた。唯
一のLAL源が、絶滅しかけている無脊椎動物のカブトガ
ニであるので、LALの消費量が最少で済む感度の良いLAL
試験の開発が重要となっている。コアギュローゲンを検
出するためのELISA法では感度が高く(最初のLALが1000
0倍に希釈されたときでも、A492の値は2.0に達した)、
LALの使用量が最少限で済む可能性がある。計算では、L
ALの体積及び希釈倍数を考慮して同じ感度で比較する
と、LAL−ELISAで必要とするLALの量は、凝固−ゲル法
で使用されるLALの量のわずか1/160でよい。一般的に、
凝固−ゲル法よりも10倍以上感度のよいLAL−ELISAで
は、凝固−ゲル法で使用されるLALの必要量の約1/40で
よい。
LAL−ELISAでは、LAL試薬の消費量が最少で済む他
に、試料の量が非常に少なくて済む。即ち、他のLALア
ッセイでは通常100μの試料を用いるのに対して、LAL
−ELISAでは、一回の試験を行うのに10μの試料で十
分である。試料が微量でしか入手できない場合には、こ
の利点は重要となる。
に、試料の量が非常に少なくて済む。即ち、他のLALア
ッセイでは通常100μの試料を用いるのに対して、LAL
−ELISAでは、一回の試験を行うのに10μの試料で十
分である。試料が微量でしか入手できない場合には、こ
の利点は重要となる。
実施例4 臨床試料中のエンドトキシンの検出 緩衝液の場合と同じ高検出限界を有する血清試料中の
エンドトキシンの存在を検出する際の本発明の方法の性
能を示すために、米国薬局方標準エンドトキシン(実施
例3参照)を、水で10倍希釈して最終濃度を200pg/mlと
した無LPSヒト血漿に添加した。
エンドトキシンの存在を検出する際の本発明の方法の性
能を示すために、米国薬局方標準エンドトキシン(実施
例3参照)を、水で10倍希釈して最終濃度を200pg/mlと
した無LPSヒト血漿に添加した。
LPSを添加後、異なる3つの試料について、血漿を、
それぞれ、65℃で15分間、75℃で10分間及び100℃で5
分間熱処理した。同一に希釈し且つ加熱した無LPS血漿
を希釈剤として用いて、上記で得られた各血漿溶液の希
釈列を調製することにより、実施例3で説明したのと実
質的に同様の方法で試験を2回行った。結果を第7図に
示す。図から、LPSの定量測定には血漿を10分間75℃で
処理するのが最適であることが明らかである。対照であ
る無エンドトキシン水で観察されたA492値は、血漿試料
で観察された値とは大きな差はなく(LAL−ELISAの変動
限界内)、これらの試料中のエンドトキシンレベルがエ
ンドトキシン4pg/ml(検出限界)未満であり且つLAL−E
LISAは血漿の色及び濁りには妨害されなかったことを示
している。得られた結果から、本発明の方法は、臨床試
料中のエンドトキシンの存在を測定するための感度のよ
いアッセイ法としても有効であることが分かる。
それぞれ、65℃で15分間、75℃で10分間及び100℃で5
分間熱処理した。同一に希釈し且つ加熱した無LPS血漿
を希釈剤として用いて、上記で得られた各血漿溶液の希
釈列を調製することにより、実施例3で説明したのと実
質的に同様の方法で試験を2回行った。結果を第7図に
示す。図から、LPSの定量測定には血漿を10分間75℃で
処理するのが最適であることが明らかである。対照であ
る無エンドトキシン水で観察されたA492値は、血漿試料
で観察された値とは大きな差はなく(LAL−ELISAの変動
限界内)、これらの試料中のエンドトキシンレベルがエ
ンドトキシン4pg/ml(検出限界)未満であり且つLAL−E
LISAは血漿の色及び濁りには妨害されなかったことを示
している。得られた結果から、本発明の方法は、臨床試
料中のエンドトキシンの存在を測定するための感度のよ
いアッセイ法としても有効であることが分かる。
実施例5 コアギュローゲン(TAL)に対するモノクローナル抗体
の調製 LALの代わにタキプレアス変形細胞溶解産物(タキプ
レアストリデンテイタス)を出発物質として用いた以外
は、実施例1に記載したのと実質的に同じ方法により、
TALからのコアギュローゲンに対するモノクローナル抗
体を調製した。得られた抗体は、実施例3に記載したEL
ISA試験において反応性を示した。
の調製 LALの代わにタキプレアス変形細胞溶解産物(タキプ
レアストリデンテイタス)を出発物質として用いた以外
は、実施例1に記載したのと実質的に同じ方法により、
TALからのコアギュローゲンに対するモノクローナル抗
体を調製した。得られた抗体は、実施例3に記載したEL
ISA試験において反応性を示した。
実施例6 ビオチン−モノクローナル抗コアギュローゲン抗体複合
体の調製 ビオチンを、実施例1に記載した方法で調製したモノ
クローナル抗コアギュローゲン抗体と、以下のようにし
て結合させた。精製したモノクローナル抗体溶液(1mg
I gG/ml)1mlを、100mM NaHCO3(pH8.0)緩衝液で4℃
において一晩透析後、N−ヒドロキシサクシンイミドビ
オチン〔40mg/ml;シグマケミカル社(Sigma Chemical C
o.)製〕5μと混合した。室温で2時間撹拌後、混合
物を、PBS(pH7.3)で4℃において一晩透析した。得ら
れた複合体を、等容量のグリセロール(87%)に添加
し、−20℃で保存した。
体の調製 ビオチンを、実施例1に記載した方法で調製したモノ
クローナル抗コアギュローゲン抗体と、以下のようにし
て結合させた。精製したモノクローナル抗体溶液(1mg
I gG/ml)1mlを、100mM NaHCO3(pH8.0)緩衝液で4℃
において一晩透析後、N−ヒドロキシサクシンイミドビ
オチン〔40mg/ml;シグマケミカル社(Sigma Chemical C
o.)製〕5μと混合した。室温で2時間撹拌後、混合
物を、PBS(pH7.3)で4℃において一晩透析した。得ら
れた複合体を、等容量のグリセロール(87%)に添加
し、−20℃で保存した。
この複合体を下記のようにELISA法に用いた。LALと標
準エンドトキシン(実施例3に記載の方法で調製した)
との希釈インキュベーション混合物100μを、96カウ
エルマイクロタイタプレート(NUNC、デンマーク)の各
ウエルに添加後、室温で1時間インキュベーションし
た。実施例3に記載した洗浄緩衝液で4回洗浄後、希釈
緩衝液で1:2000に希釈したモノクローナル抗体−ビオチ
ン複合体100μを添加した。1時間のインキュベーシ
ョン後、プレートを4回洗浄した。希釈緩衝液で1:4000
に希釈したアビジン−HRP複合体(シグマケミカル社
製)100μを添加し、プレートを1時間インキュベー
ションした。プレートを4回洗浄し、基質溶液100μ
を添加した(実施例3に記載の方法で)。10分間のイン
キュベーション後、1M H2SO4を150μ添加して反応を
停止した。吸光度をA492で測定した。
準エンドトキシン(実施例3に記載の方法で調製した)
との希釈インキュベーション混合物100μを、96カウ
エルマイクロタイタプレート(NUNC、デンマーク)の各
ウエルに添加後、室温で1時間インキュベーションし
た。実施例3に記載した洗浄緩衝液で4回洗浄後、希釈
緩衝液で1:2000に希釈したモノクローナル抗体−ビオチ
ン複合体100μを添加した。1時間のインキュベーシ
ョン後、プレートを4回洗浄した。希釈緩衝液で1:4000
に希釈したアビジン−HRP複合体(シグマケミカル社
製)100μを添加し、プレートを1時間インキュベー
ションした。プレートを4回洗浄し、基質溶液100μ
を添加した(実施例3に記載の方法で)。10分間のイン
キュベーション後、1M H2SO4を150μ添加して反応を
停止した。吸光度をA492で測定した。
HRP−モノクローナル抗体複合体を用いたELISAでは、
モノクローナル抗体−ビオチン複合体(HRP−アビジン
の使用)を使用する場合よりも工程が一つ少ないが、HR
P−モノクローナル抗体複合体よりもビオチン−モノク
ローナル抗体複合体を調製する方がはるかに容易であっ
た。複合体は0℃未満に保ったとき安定であった。20,0
00個の単一試験を行うのにモノクローナル抗体は1mgで
あれば十分であるので、モノクローナル抗体を使用して
も、LAL−ELISA試験は高価とはならない。
モノクローナル抗体−ビオチン複合体(HRP−アビジン
の使用)を使用する場合よりも工程が一つ少ないが、HR
P−モノクローナル抗体複合体よりもビオチン−モノク
ローナル抗体複合体を調製する方がはるかに容易であっ
た。複合体は0℃未満に保ったとき安定であった。20,0
00個の単一試験を行うのにモノクローナル抗体は1mgで
あれば十分であるので、モノクローナル抗体を使用して
も、LAL−ELISA試験は高価とはならない。
実施例7 LAL−ELISAによる種々の異なるエンドトキシン及び(1
−3)−β−D−グルカンの試験 標準エンドトキシンを、ホイッタカー・エムエー・バ
イオプロダクツ社(Whittaker M.A.Bioproducts,Inc.)
から購入した(10ng/バイアル)。サルモネラミンソタ
(Salmonellaminnesota)、大腸菌0111:B4、大腸菌055:
B5、ウマ流産菌(Solmonella abortus equi)、ネズミ
チフス菌(Salmonella typhimurium)及び腸炎菌(Salm
onella enteritidis)由来の精製LPS(W)を、ディフ
コ・ラボラトリーズ社(Difco Laboratories)(所在
地:ミシガン州のデトロイト)から購入した。大腸菌J5
及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来の高度に精
製したLPSは、アンダース・フォムスガード博士(Dr.An
ders Fomsgaard)〔コペンハーゲンにあるタグショスピ
タレット(Rigshospitalet)のインフェクシャス・ジィ
ズィーズ(infectious Diseases)部門〕から提供され
た。
−3)−β−D−グルカンの試験 標準エンドトキシンを、ホイッタカー・エムエー・バ
イオプロダクツ社(Whittaker M.A.Bioproducts,Inc.)
から購入した(10ng/バイアル)。サルモネラミンソタ
(Salmonellaminnesota)、大腸菌0111:B4、大腸菌055:
B5、ウマ流産菌(Solmonella abortus equi)、ネズミ
チフス菌(Salmonella typhimurium)及び腸炎菌(Salm
onella enteritidis)由来の精製LPS(W)を、ディフ
コ・ラボラトリーズ社(Difco Laboratories)(所在
地:ミシガン州のデトロイト)から購入した。大腸菌J5
及び緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来の高度に精
製したLPSは、アンダース・フォムスガード博士(Dr.An
ders Fomsgaard)〔コペンハーゲンにあるタグショスピ
タレット(Rigshospitalet)のインフェクシャス・ジィ
ズィーズ(infectious Diseases)部門〕から提供され
た。
これらのLPSは全て再構成し、1mg/mlの濃度に希釈
後、使用するまでの−20℃に凍結しておいた。アッセイ
直前に、無エンドトキシン水により、LPSの種々の希釈
物を調製した。LPSアッセイの全てを2回づつ行い、特
記のない限り、得られた値を平均した。
後、使用するまでの−20℃に凍結しておいた。アッセイ
直前に、無エンドトキシン水により、LPSの種々の希釈
物を調製した。LPSアッセイの全てを2回づつ行い、特
記のない限り、得られた値を平均した。
アルカリ大便菌var(Alcaligenes faecalis var.)ミ
クソゲネス(myxogenes)IF03140〔カードラン(Curdla
n);和光純薬工業株式会社製〕由来の(1−3)−β
−D−グルカンを、大林等(63)に記載されている方法
によりエンドトキシンフリーとした。濃縮液(1mg/ml)
を、使用するまで4℃で保存した。
クソゲネス(myxogenes)IF03140〔カードラン(Curdla
n);和光純薬工業株式会社製〕由来の(1−3)−β
−D−グルカンを、大林等(63)に記載されている方法
によりエンドトキシンフリーとした。濃縮液(1mg/ml)
を、使用するまで4℃で保存した。
HRP−モノクローナル抗体複合体を用いて、実施例3
に記載の方法によりLAL−ELISAを行った。
に記載の方法によりLAL−ELISAを行った。
第8図及び第9図は、8種のLPSのLAL−ELISA曲線及
び(1−3)−β−D−グルカンの曲線である。LPS曲
線は、明らかに、勾配がシャープであり且つお互いに平
行となっており、これらは、効力には大きな差があるけ
れども、LALとの反応性が本質的に類似していることを
示している。(1−3)−β−D−グルカンは、LPSよ
りも効力が少なくとも1000倍低く且つ反応曲線の勾配が
はるかに小さく、LALとの反応速度がはるかに小さいこ
とを示している。
び(1−3)−β−D−グルカンの曲線である。LPS曲
線は、明らかに、勾配がシャープであり且つお互いに平
行となっており、これらは、効力には大きな差があるけ
れども、LALとの反応性が本質的に類似していることを
示している。(1−3)−β−D−グルカンは、LPSよ
りも効力が少なくとも1000倍低く且つ反応曲線の勾配が
はるかに小さく、LALとの反応速度がはるかに小さいこ
とを示している。
エンドトキシン以外にいくつかの物質が高濃度で陽性
反応を生じるとの報告がある(60,47)。又、(1−
3)−β−D−グルカンは、1ng/mlの濃度でLALと反応
できることが判明し、エンドトキシンの次に効力の大き
な物質であるとの報告もある(23)。しかしながら、試
験される物質にエンドトキシンが混入する恐れがあり、
これらの研究の結論は、疑問視されることがよくある。
本発明者等による研究では、LAL−ELISAを用いて(1−
3)−β−D−グルカンを試験したところ、その反応性
は、エンドトキシンよりも、少なくとも1000倍低かっ
た。LALとの反応速度がエンドトキシンよりもはるかに
遅いことから、(1−3)−β−D−グルカンはエンド
トキシンとは本質的に異なる挙動を示すものと思われ
る、このことは、(1−3)−β−D−グルカンによる
LALの活性化は、エンドトキシンとは異なる経路を経由
して起きることを見い出した森田等(23)から説明でき
る。2つの経路は、共通の一工程、即ち、前駆凝固酵素
の活性化工程を有すると思われる。従って、2つの経路
のどちらの活性化でも、コアギュローゲンの分解が生
じ、抗原性の喪失が起きる。エンドトキシンとLALとの
反応は、(1−3)−β−D−グルカンとLALとの反応
と、速度論的に区別できるので、LAL−ELISAは、LALと
反応することのできる物質を更に研究するのに有効な手
段である。
反応を生じるとの報告がある(60,47)。又、(1−
3)−β−D−グルカンは、1ng/mlの濃度でLALと反応
できることが判明し、エンドトキシンの次に効力の大き
な物質であるとの報告もある(23)。しかしながら、試
験される物質にエンドトキシンが混入する恐れがあり、
これらの研究の結論は、疑問視されることがよくある。
本発明者等による研究では、LAL−ELISAを用いて(1−
3)−β−D−グルカンを試験したところ、その反応性
は、エンドトキシンよりも、少なくとも1000倍低かっ
た。LALとの反応速度がエンドトキシンよりもはるかに
遅いことから、(1−3)−β−D−グルカンはエンド
トキシンとは本質的に異なる挙動を示すものと思われ
る、このことは、(1−3)−β−D−グルカンによる
LALの活性化は、エンドトキシンとは異なる経路を経由
して起きることを見い出した森田等(23)から説明でき
る。2つの経路は、共通の一工程、即ち、前駆凝固酵素
の活性化工程を有すると思われる。従って、2つの経路
のどちらの活性化でも、コアギュローゲンの分解が生
じ、抗原性の喪失が起きる。エンドトキシンとLALとの
反応は、(1−3)−β−D−グルカンとLALとの反応
と、速度論的に区別できるので、LAL−ELISAは、LALと
反応することのできる物質を更に研究するのに有効な手
段である。
実施例8 血漿中のエンドトキシンの検出 入院中の敗血症の疑いのある患者から採取した静脈血
を、ヘパリン(血液1ml当たり10 IU)を入れた無エンド
トキシンガラス管を吸引した。2000rpmで15分間遠心分
離して調製した血漿を、無エンドトキシン水で10倍に希
釈後、75℃で10分間加熱した。以下のLAL−ELISA操作
を、LALを業者が指定した通り再構成した以外は、実施
例3に記載の方法で行った。エンドトキシンに関するLA
L−ELISAの検出限界は、エンドトキシン4pg/mlであっ
た。検体中のエンドトキシン濃度は、希釈倍率を考慮し
て、標準曲線から計算した。
を、ヘパリン(血液1ml当たり10 IU)を入れた無エンド
トキシンガラス管を吸引した。2000rpmで15分間遠心分
離して調製した血漿を、無エンドトキシン水で10倍に希
釈後、75℃で10分間加熱した。以下のLAL−ELISA操作
を、LALを業者が指定した通り再構成した以外は、実施
例3に記載の方法で行った。エンドトキシンに関するLA
L−ELISAの検出限界は、エンドトキシン4pg/mlであっ
た。検体中のエンドトキシン濃度は、希釈倍率を考慮し
て、標準曲線から計算した。
表3に、患者10人の血漿試料中のエンドトキシンの測
定結果を示す。これらの敗血症患者のエンドトキシンレ
ベルは、一般的に低く且つかならずしも血液又は髄液
(CSF)の細菌検査の結果とは相関がない。
定結果を示す。これらの敗血症患者のエンドトキシンレ
ベルは、一般的に低く且つかならずしも血液又は髄液
(CSF)の細菌検査の結果とは相関がない。
No.1の患者は、淋病菌感染したことがあり、入院して
敗血症の疑いがもたれていた。検査では、細菌は認めら
れなかったが、血液中に特異的淋菌抗体が相当に増加し
ていることが分かった。No.4の患者は、血液及び髄液中
にグラム陽性菌が存在しており、入院4日後に敗血症性
ショックで死亡した。No.8の患者は、尿路性敗血症の疑
いがあり且つかなりの細菌尿がある。No.9の患者は、髄
膜炎菌性敗血症の疑いがあるが、入院前にペニシリン治
療をしたため、検査では細菌は見出されなかった。敗血
症患者の血液中にエンドトキシン濃度が極めて低い場合
には(表3)、感度の高いLAL試験が必要であることが
分かる。興味深いことに、LAL−ELISAの検出限界(エン
ドトキシン4pg/ml)よりも高い濃度でエンドトキシンを
含有している正常血漿試料はなかった。
敗血症の疑いがもたれていた。検査では、細菌は認めら
れなかったが、血液中に特異的淋菌抗体が相当に増加し
ていることが分かった。No.4の患者は、血液及び髄液中
にグラム陽性菌が存在しており、入院4日後に敗血症性
ショックで死亡した。No.8の患者は、尿路性敗血症の疑
いがあり且つかなりの細菌尿がある。No.9の患者は、髄
膜炎菌性敗血症の疑いがあるが、入院前にペニシリン治
療をしたため、検査では細菌は見出されなかった。敗血
症患者の血液中にエンドトキシン濃度が極めて低い場合
には(表3)、感度の高いLAL試験が必要であることが
分かる。興味深いことに、LAL−ELISAの検出限界(エン
ドトキシン4pg/ml)よりも高い濃度でエンドトキシンを
含有している正常血漿試料はなかった。
結論として、LAL−ELISAは、感度が高く、血漿からの
妨害が少なく、LAL試薬及び試験材料の消費量が最少限
でよく、再現性がよく且つ実行が容易であることから、
エンドトキシンを臨床的に検出するための有望なLAL試
験と言うことができる。
妨害が少なく、LAL試薬及び試験材料の消費量が最少限
でよく、再現性がよく且つ実行が容易であることから、
エンドトキシンを臨床的に検出するための有望なLAL試
験と言うことができる。
実施例9 ヒト血漿のエンドトキシン不活性化活性のアッセイ ヒト血清、ヒト血漿、リムルス血漿、LAL及びポリミ
キシンB(polymyxin B)によるLPSの投与量依存不活性
化が、実施例3に記載されたLAL−ELISAにより示され
た。
キシンB(polymyxin B)によるLPSの投与量依存不活性
化が、実施例3に記載されたLAL−ELISAにより示され
た。
各無エンドトキシンガラス管、試験試料(ヒト血清、
ヒト血漿、リムルス血漿、LAL及びポリミキシンB)各5
0μ、及び無菌生理食塩水で種々の濃度に希釈したLPS
(大腸菌0111:B4)50μを順次加えた。各管の内容物
を、よく混合して37℃で1時間インキュベーションし
た。上記の溶液を、無エンドトキシン水で少なくとも10
00倍に希釈してLPSアッセイ範囲(1〜100pg/ml)に到
達させるとともに、続いて行うLAL試験での試験試料に
より妨害をなくした。残留LPSの定量化を、実施例3で
説明した方法により、LALとコアギュローゲンのELISA測
定との組み合わせを用いて行った。
ヒト血漿、リムルス血漿、LAL及びポリミキシンB)各5
0μ、及び無菌生理食塩水で種々の濃度に希釈したLPS
(大腸菌0111:B4)50μを順次加えた。各管の内容物
を、よく混合して37℃で1時間インキュベーションし
た。上記の溶液を、無エンドトキシン水で少なくとも10
00倍に希釈してLPSアッセイ範囲(1〜100pg/ml)に到
達させるとともに、続いて行うLAL試験での試験試料に
より妨害をなくした。残留LPSの定量化を、実施例3で
説明した方法により、LALとコアギュローゲンのELISA測
定との組み合わせを用いて行った。
全てのアッセイを、それぞれ少なくとも2回行い、得
られた値を平均した。
られた値を平均した。
LALとLPSとの反応で、実施例3で説明した方法でコア
ギュローゲンに対するモノクローナル抗体を用いてLAL
−ELISAにより測定した吸光度とLPS濃度の間に、直線関
係が得られた。血清による反応妨害は、血清試料を100
倍に希釈しても顕著であった。しかしながら、この妨害
は、血清を250倍以上に希釈したとき完全に消失した。
ギュローゲンに対するモノクローナル抗体を用いてLAL
−ELISAにより測定した吸光度とLPS濃度の間に、直線関
係が得られた。血清による反応妨害は、血清試料を100
倍に希釈しても顕著であった。しかしながら、この妨害
は、血清を250倍以上に希釈したとき完全に消失した。
第10図は、血清、ヒト血漿、ポリミキシンB及びリム
ルス血漿によるLPSの投与量依存不活性化を示してい
る。ヒト血清のEIA50と血漿のEIA50との間には、差異は
見られなかった。リムルス血漿は、ヒト血漿よりもLPS
の不活性化能がかなり高いことが明らかとなった。
ルス血漿によるLPSの投与量依存不活性化を示してい
る。ヒト血清のEIA50と血漿のEIA50との間には、差異は
見られなかった。リムルス血漿は、ヒト血漿よりもLPS
の不活性化能がかなり高いことが明らかとなった。
これらの結果から、実施例3で説明したLAL−ELISA
は、血漿のエンドトキシン不活性化効果を試験するのに
使用できることが分かる。このアッセイで高いエンドキ
シン中性化効果を有することが見出された血漿は、敗血
症患者に投与して回復を早めることができる。
は、血漿のエンドトキシン不活性化効果を試験するのに
使用できることが分かる。このアッセイで高いエンドキ
シン中性化効果を有することが見出された血漿は、敗血
症患者に投与して回復を早めることができる。
中村等に開示されている方法により精製C因子を調製
し、エンドトキシンによりC因子の活性化を検出するこ
とができる(64)。次に、精製C因子に対するモノクロ
ーナル抗体を、実施例1に記載の方法により調製でき
る。このモノクローナル抗体は、次に、実施例1又は実
施例6に記載の方法で結合して複合体を形成し、実施例
3で記載したLAL−ELISA法に使用できる。
し、エンドトキシンによりC因子の活性化を検出するこ
とができる(64)。次に、精製C因子に対するモノクロ
ーナル抗体を、実施例1に記載の方法により調製でき
る。このモノクローナル抗体は、次に、実施例1又は実
施例6に記載の方法で結合して複合体を形成し、実施例
3で記載したLAL−ELISA法に使用できる。
この操作は、エンドトキシンとの反応でC因子を活性
C因子に転換して、コアギュローゲンではなくC因子の
抗原生理食塩水の喪失を測定する以外は、実質的に、実
施例3に記載したものに相当する。
C因子に転換して、コアギュローゲンではなくC因子の
抗原生理食塩水の喪失を測定する以外は、実質的に、実
施例3に記載したものに相当する。
又、森田等(23)に開示されている方法で精製G因子
を調製し、実施例1又は実施例6に記載されている方法
によりG因子に対するモノクローナル抗体を調製及び複
合化して、(1−3)−β−D−グルカンによりG因子
の活性化を検出することもできる。この複合モノクロー
ナル抗体は、実施例3に記載したLAL−ELISA法に使用で
きる。
を調製し、実施例1又は実施例6に記載されている方法
によりG因子に対するモノクローナル抗体を調製及び複
合化して、(1−3)−β−D−グルカンによりG因子
の活性化を検出することもできる。この複合モノクロー
ナル抗体は、実施例3に記載したLAL−ELISA法に使用で
きる。
C因子及びG因子に対するモノクローナル抗体を一度
調製したら、G因子、C因子及びコアギュローゲンを溶
解産物成分(存在を検出する)として用いた3つの異な
る試験に、同じ溶解産物を用いることができる。更に、
これらの試験は、同じマイクロタイタプレートで行うこ
とができるので、例えば、敗血症患者における敗血症の
原因を決定する操作の迅速化がはかれる。
調製したら、G因子、C因子及びコアギュローゲンを溶
解産物成分(存在を検出する)として用いた3つの異な
る試験に、同じ溶解産物を用いることができる。更に、
これらの試験は、同じマイクロタイタプレートで行うこ
とができるので、例えば、敗血症患者における敗血症の
原因を決定する操作の迅速化がはかれる。
参考文献 (1)レビン・ジェイ(Levin J)、バング・エフビー
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ate test as an end−product endotoxin test for hum
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「ゲル生成中のカブトガニコアギュローゲンから調製し
た断片についてのアミノ酸配列研究:霊長類フィブリノ
ペプチドとの相同性(Amino acid sequence studies on
the fragments produced from horseshoe crab coagul
ogen during gel formation:homologies with primate
fibrinopeptide)」、ビー バイオケム アンド バイ
オヒィズ リサーチ コムン(B.Biochem.and Biophys.
Res.Commun.)、72、902〜908(1976a) (13)ナカムラ・エス(Nakamura S)、タカギ・テー
(Takagi T)、イワナガ・エス(Iwanaga S)、ニワ・
エム(Niwa M)、タカハシ・ケー(Takahashi K)、
「カブトガニの血球細胞由来の凝固性タンパク質(コア
ギュローゲン)。ゲル生成中のポリペプチド鎖の構造的
変化(A clottable protein(coagulogen)from horses
hoe crab hemocytes.Structural change of its polype
ptide chain during gel formation.)」、ジェイ バ
イオケム(J.Biochem)、80、649〜652(1976b) (14)ガフィン・エスエル(Gaffin SL)、「エンドト
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mura T)、モリタ・テー(Morita T)、イワナガ・エス
(Iwanaga S)、「カブトガニ(リムリダエ)の血リン
パ凝固系に関連した新規なエンドトキシン感受性因子
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h hemolymph coagulation system of horseshoe crab
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ンドトキシン介在活性化剤による前駆凝固酵素の活性化
の特定決定。(Fractionation of Limulus amoebocyte
lysate.Characterization of activation of the procl
otting enzyme by an endotoxin−mediated activato
r.)、バイオケム バイオフィズ アクタ(Biochim.Bi
ophys.Acta.)、707、217〜225(1982a) (19)ナカムラ・エス(Nakamura S)、レビン・ジェイ
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Limulus proclotting enzyme activator and detection
of previously undescribed protease(protease
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iochem.Biophys.Res.Commun.)、108、1619〜1623(198
2b) (20)リアング・エスエム(Liang SM)、サクマー・テ
ーピー(Sakmar TP)、リウ・テーワイ(Liu TY)、
「リムルス変形細胞溶解産物の研究。III.リムルス変形
細胞膜由来エンドトキシン結合タンパク質の精製(Stud
ies of Limulus amoebocytelysate.III.Purification o
f endotoxin−binding protein from Limulus amoebocy
te membranes)」、ジェイ バイオル ケム(J.Biol.C
hem.)、255、5586〜5590(1980) (21)タナカ・エス(Tanaka S)、ナカムラ・テー(Na
kamura T)、モリタ・テー(Morita T)、イワナガ・エ
ス(Iwanaga S)、「リムルス抗LPS因子:リムルス凝固
系のエンドトキシン介在活性化を妨害する抗凝固剤(Lu
mulus anti−LPS factor:ananticoagulant which inhib
its the endotoxin−mediated activation the Lumulus
coagulation system)」、バイオケム バイオフィズ
リサーチ コムン(Biochem.Biophys.Res.Commu
n.)、105、717〜723(1982) (22)カキムラ・エー(Kakimura A、アサノ・テー(As
ano T)、トーア・エイチ(Torh H)、スギノ・ワイ(S
ugino Y)、「抗腫瘍(1−3)−β−D−グルカンに
よるリムルス変形細胞溶解産物のゲル化(Gelation of
Limulus amoebocyte lysate by an ant itumor(1−
3)−β−D−glucan)」、バイオケム リサーチ コ
ムン(Biochem.Res.Commun.)、101、434〜439(1981) (23)モリタ・テー(Morita T)、タナカ・エス(Tana
ka S)、ナカムラ・テー(Nakamura T)、イワナガ・エ
ス(Iwanaga S)、「リムルス変形細胞中に見出される
新規な(1−3)−β−D−グルカン介在凝固経路(A
new(1−3)−β−D−glucan mediated coagulation
pathway found in Limulus amoebocytes)」、フェブ
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胞溶解産物(LAL)のための自動化方法論(Automated m
ethodology for the Limulus amoebocyte lysate(LA
L)assay using the multiskan microplate reade
r)」、ワトソン・エス(Watson S)、レビン・ジェイ
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TJ)(編集)、「エンドトキシン及びリムルス溶解産物
試験を用いたそれらの検出(Endotoxins and their det
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eparation and application of a new endotoxin deter
mination kit,Pyrodick,using a chromogenic substrat
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(Levin J)、ノボビツスキー・テージェイ(Novitsky
TJ)(編集)、「エンドトキシン及びリムルス溶解産物
試験を用いたそれらの検出(Endotoxins and their det
eotion with the Lumulus lysate test)」、ニューヨ
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173〜182(1982) (26)ナンダン・アール(Nandan R)、ブラウン・デー
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善:リムルス変形細胞溶解産物を用いた静脈液へのエン
ドトキシン混入をピコグラムで検出(An improved in v
itro pyrogen test:todetect picogram of endotoxin c
ontamination in intravenous fluids using Limulus a
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イクロバイオル(J.Clin.Microbiol.)、17、1013〜102
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用具の最終製品エンドトキシン試験としてリムルス変形
細胞溶解産物私権を適用するための指針案(Draft guid
eline for validation of the Limulus amoebocyte lys
ate test as an end−product endotoxin test for hum
an and animal parenteral drugs、biological product
s,and medical devices)」、ファーマコピアル フォ
ーラム(Pharmacopeial Forum)、9、3012〜3021(198
3) (8)ソルム・エヌオー(Solum NO)、「リムルスポリ
フェムス 血球細胞の凝固。分子の凝固形態と非凝固形
態との比較(The coagulation of Limulus polyphemus
hemocytes.A comparison of the clotted and non clot
ted forms of the molecule.)」、トロンブ リサーチ
(Thromb.Res.)、2、55〜70(1973) (9)リウ・テーワイ(Liu TY)、セイド・アールシー
・ジュニア(Seid RC Jr)、タイ・ジェイワイ(Tai J
Y)、リアング・エスエム(Liang SM)、サクマー・テ
ーピー(Sakmar TP)、ロビンズ・ジェイビー(Robbins
JB)、「リムルス溶解産物凝固系の研究(Studies of
Limulus lysate coagulation system)」、バイオメデ
ィカル アプリケーションズ オブ ザ ホースショー
クラブ(リムリダエ)(Biomedical Applications of
the Horseshoe Crab(Limulidae)、イー・コーエン
(E.Cohen)編集、ニューヨークのアラン・アール・リ
ス社(Alan R.Liss)、147〜158(1979) (10)ホルメ・アール(Holme R)、ソルム・エヌオー
(Solum NO)、「リムルスポリフェムス血球細胞抽出物
の凝固により生成したゲルタンパク質の電子鏡検法(El
ectron microscopy of the gel protein formed by clo
tting of Limulus poly phemus hemocyte extract
s)」、ジェイ ウルトラストラクチャー リサーチ
(J.Ultrastructure Res.)、44、329〜338(1973) (11)タイ・ジェーワイ(Tai JY)、セイド・アールシ
ー(Seid RC)、フーン・アールデー(Huhn RD)、ルイ
・テーワイ(Lui TY)、「リムルス変形細胞溶解産物の
研究(Studies on Lumulus amoebocyte lysate)。II.
コアギュローゲンの精製及び凝固の機構(Purification
of the coagulogen and the mechanism of clottin
g)」、ジェイ バイオル ケム(J.Biol.Chem.)、25
2、4773〜4776(1977) (12)ナカムラ・エス(Nakamura S)、タカギ・テー
(Takagi T)、イワナガ・エス(Iwanaga S)、ニワ・
エム(Niwa M)、タカハシ・ケー(Takahashi K)、
「ゲル生成中のカブトガニコアギュローゲンから調製し
た断片についてのアミノ酸配列研究:霊長類フィブリノ
ペプチドとの相同性(Amino acid sequence studies on
the fragments produced from horseshoe crab coagul
ogen during gel formation:homologies with primate
fibrinopeptide)」、ビー バイオケム アンド バイ
オヒィズ リサーチ コムン(B.Biochem.and Biophys.
Res.Commun.)、72、902〜908(1976a) (13)ナカムラ・エス(Nakamura S)、タカギ・テー
(Takagi T)、イワナガ・エス(Iwanaga S)、ニワ・
エム(Niwa M)、タカハシ・ケー(Takahashi K)、
「カブトガニの血球細胞由来の凝固性タンパク質(コア
ギュローゲン)。ゲル生成中のポリペプチド鎖の構造的
変化(A clottable protein(coagulogen)from horses
hoe crab hemocytes.Structural change of its polype
ptide chain during gel formation.)」、ジェイ バ
イオケム(J.Biochem)、80、649〜652(1976b) (14)ガフィン・エスエル(Gaffin SL)、「エンドト
キシンにより誘発されたリムルスの溶菌白血球の凝固。
I.凝固生成タンパク質の調製及び特性決定(The clotti
ng of the lysed white cells of Limulus induced by
endotoxin.Preparation and characterization of clot
forming proteins.)」、バイオロロジ(Biorheolog
i)、13、273〜280(1976) (15)シシクラ・エフ(Shishikura F)、ナカムラ・エ
ス(Nakamura S)、タカハシ・ケー(Takahashi K)、
セキグチ・けー(Sekiguchi K)、「フィブリノペプチ
ド様ペプチドのアミノ酸配列に基づくカブトガニの系統
学(Horseshoe crab phylogeny based on amino acid s
equence of the fibronopeptide like peptide)」、シ
ー ジェイ エクスプ ズール(C.J.Exp.Zool.)、22
3、89〜91(1982) (16)タイ・ジェイワイ(Tai JY)、リウ・テーワイ
(Liu TY)、「リムルス変形細胞溶解産物についての研
究。I.前駆凝固酵素の単離(Studies on Limulus amoeb
ocyte lysate.I.Isolation of proclotting enzym
e)」、ジェイ バイオル ケム(J.Biol.Chem.)、25
2、2178〜2181(1977) (17)オオキ・エム(Ohki M)、ナカムラ・テー(Naka
mura T)、モリタ・テー(Morita T)、イワナガ・エス
(Iwanaga S)、「カブトガニ(リムリダエ)の血リン
パ凝固系に関連した新規なエンドトキシン感受性因子
(A new endotoxin−sensitive factor associated wit
h hemolymph coagulation system of horseshoe crab
(Limulidae)」、フェブス レターズ(FEBS Letter
s)、120、217〜220(1980) (18)ナカムラ・エス(Nakamura S)、レビン・ジェイ
(Levin J)、「リムルス変形細胞溶解産物の分画。エ
ンドトキシン介在活性化剤による前駆凝固酵素の活性化
の特定決定。(Fractionation of Limulus amoebocyte
lysate.Characterization of activation of the procl
otting enzyme by an endotoxin−mediated activato
r.)、バイオケム バイオフィズ アクタ(Biochim.Bi
ophys.Acta.)、707、217〜225(1982a) (19)ナカムラ・エス(Nakamura S)、レビン・ジェイ
(Levin J)、「エンドトキシン介在リムルス前駆凝固
酵素活性化剤及び今まで記載されたことのないプロテア
ーゼ(プロテアーゼN)の検出(Endotoxin−mediated
Limulus proclotting enzyme activator and detection
of previously undescribed protease(protease
N)、バイオケム バイオフィズ リサーチ コムン(B
iochem.Biophys.Res.Commun.)、108、1619〜1623(198
2b) (20)リアング・エスエム(Liang SM)、サクマー・テ
ーピー(Sakmar TP)、リウ・テーワイ(Liu TY)、
「リムルス変形細胞溶解産物の研究。III.リムルス変形
細胞膜由来エンドトキシン結合タンパク質の精製(Stud
ies of Limulus amoebocytelysate.III.Purification o
f endotoxin−binding protein from Limulus amoebocy
te membranes)」、ジェイ バイオル ケム(J.Biol.C
hem.)、255、5586〜5590(1980) (21)タナカ・エス(Tanaka S)、ナカムラ・テー(Na
kamura T)、モリタ・テー(Morita T)、イワナガ・エ
ス(Iwanaga S)、「リムルス抗LPS因子:リムルス凝固
系のエンドトキシン介在活性化を妨害する抗凝固剤(Lu
mulus anti−LPS factor:ananticoagulant which inhib
its the endotoxin−mediated activation the Lumulus
coagulation system)」、バイオケム バイオフィズ
リサーチ コムン(Biochem.Biophys.Res.Commu
n.)、105、717〜723(1982) (22)カキムラ・エー(Kakimura A、アサノ・テー(As
ano T)、トーア・エイチ(Torh H)、スギノ・ワイ(S
ugino Y)、「抗腫瘍(1−3)−β−D−グルカンに
よるリムルス変形細胞溶解産物のゲル化(Gelation of
Limulus amoebocyte lysate by an ant itumor(1−
3)−β−D−glucan)」、バイオケム リサーチ コ
ムン(Biochem.Res.Commun.)、101、434〜439(1981) (23)モリタ・テー(Morita T)、タナカ・エス(Tana
ka S)、ナカムラ・テー(Nakamura T)、イワナガ・エ
ス(Iwanaga S)、「リムルス変形細胞中に見出される
新規な(1−3)−β−D−グルカン介在凝固経路(A
new(1−3)−β−D−glucan mediated coagulation
pathway found in Limulus amoebocytes)」、フェブ
ス レターズ(FEBS Letters)、129、318〜321(198
1) (24)アルバウフ・ビーアール(Albaugh BR)、チャン
ドラー・シービー(Chandler CB)、「マルチスキャン
・マイクロプレート・リーダーを用いたリムルス変形細
胞溶解産物(LAL)のための自動化方法論(Automated m
ethodology for the Limulus amoebocyte lysate(LA
L)assay using the multiskan microplate reade
r)」、ワトソン・エス(Watson S)、レビン・ジェイ
(Levin J)、ノボビツスキー・テージェイ(Novitsky
TJ)(編集)、「エンドトキシン及びリムルス溶解産物
試験を用いたそれらの検出(Endotoxins and their det
eotion with the Lumulus lysate test)」、ニューヨ
ークのアラン・アール・リス社(Alan R.Liss,Inc.)、
183〜194(1982) (25)フジタ・ワイ(Fujita Y)、ナカハラ・シー(Na
kahara C)、「色素産生基質を用いた新規なエンドトキ
シン測定キット、パイロディック、の調製及び用途(Pr
eparation and application of a new endotoxin deter
mination kit,Pyrodick,using a chromogenic substrat
e)」、ワトソン・エス(Watson S)、レビン・ジェイ
(Levin J)、ノボビツスキー・テージェイ(Novitsky
TJ)(編集)、「エンドトキシン及びリムルス溶解産物
試験を用いたそれらの検出(Endotoxins and their det
eotion with the Lumulus lysate test)」、ニューヨ
ークのアラン・アール・リス社(Alan R.Liss,Inc.)、
173〜182(1982) (26)ナンダン・アール(Nandan R)、ブラウン・デー
アール(Brown DR)、「試験管内パイロジェン試験の改
善:リムルス変形細胞溶解産物を用いた静脈液へのエン
ドトキシン混入をピコグラムで検出(An improved in v
itro pyrogen test:todetect picogram of endotoxin c
ontamination in intravenous fluids using Limulus a
moecoyte lysate)」、ジェイ ラブ クリニク メデ
(J.Lab.Clin.Med.)、89、910〜918(1977) (27)ダンツァク・ジェイエー(Dunczak JA)、コッタ
ー・アール(Cotter R)、ダストリ・エフアール(Dast
ori FR)、「比濁法によるエンドトキシンの定量的検出
(Quantitative detetion of endotoxin by nephelomet
ry)」、イー・コーエン(E.Cohen)(編集)、「カブ
トガニ(リムリダエ)の生物医学的用途(Biomedical A
pplications of the Horseshoe Crab(Limulida
e))」、ニューヨークのアラン・アール・リス社(Ala
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ス変形細胞溶解産物パイロジェン試験の自動化(Automa
tion of the Limulus amoebocyte lysate pyrogen test
ing)」、ジェイ サイ テクノル(J.Parenter.Sci.Te
chnol.)、36、11〜16(1982) (29)ノウイツキ・テージェイ(Nowitsky TJ)、リサ
ー(Ryther SS)、ケース・エムジェー(Case MJ)、ワ
トソン(Watson)、「アボットMS−Tにおける非経口薬
剤の自動化LAL試験(Automated LAL testing of parent
eral drugs in Abbot MS−2)」、ジェイ ペアレンタ
ー サイ テクノル(J.Parenter.Sci.Technol.)、3
6、11〜16(1982) (30)ディッダー・ブイビー(Ditter VB)、ベッカー
・ケーピー(Becker KP)、ウルバシェック・アール(U
rbascheck R)、ウルバシェック・ビー(Urbascheck
B)、「マイクロタイタプレートにおける側光的に登録
したLAL反応動力学の評価についての血液及び他の検体
中のエンドトキシンの検出(Detection of endotoxin i
n blood and other specimens of evaluation of photo
metrically registered LAL kinetics in microtiter p
lates)」、プログ クリニ バイオル リサーチ(Pro
g.Cuin.Biol.Res.)、93、385〜392(1982) (31)フラウチ・ピー(Frauch P)、「変性リムルスエ
ンドトキシン試験のマイクロ法としてのスライド試験
(Slide test as a micro−method of a modified Limu
lus endotoxin test)」、ジェイ ファーム サイ(J.
Pharm.Sci.)、63、808〜809(1974) (32)ゴトー・エイチ(Goto H)、ワタナベ・エム(Wa
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リムルス試験、スライド法についての研究(Studies on
a simple Limulus test,a slide method)」、ジャパ
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kamura S)、「ゲル化阻害物質除去のための新規な手法
を用いた変更リムルス試験としてのドライ・アップ法
(Dry up method asa revised Limulus test with a ne
w technique for gelation inhibitor removing)」、
ジャパン ジェイ エクスプ メディ(Jpn.J.Exp.Me
d.)、49、19〜25(1979) (34)メルベーア・ケーエル(Melvaer KL)、フィスト
ロ・デー(Fystro D)、「エンドトキシン用リムルス変
形細胞溶解産物アッセイの変更マイクロ法(Modified m
icro−method of the Limulus amoebocyte lysate assa
y for endotoxin)」、アプル エンバイロン マイク
ロバイオル(Appl.Environ.Microbiol.)」、43、493〜
494(1982) (35)フラウワーズ・デージェイ(Flowers DJ)、「リ
ムルス溶解産物を用いたエンドトキシンアッセイのため
のマイクロ法(A microtechnique for endotoxin assay
using Limulus lisate)」、メディ ラブ サイ(Me
d.Lab.Sci.)、36、171〜176(1979) (36)オクグチ・エス(Okuguchi S)、「リムルス溶解
産物試験用マイクロ法の改善(Improvement of the mic
romethod for the Limulus lysate test)、マイクロバ
イオル イミノル(Microbiol.Immunol.)、22、113〜1
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G)、ロッゲン・エイチジー(Loggen HG)、ファン・ラ
ムショースト・ジェーディー(Van Ramshorst JD)、ボ
ーベリー・イーシー(Bauvery EC)、「リムルス変形細
胞溶解さ物試験マイクロ法及び血清及びワクチンの制御
における用途(The Limulus amoebocyte lysate test m
icromethod and application in the control of sera
and vaccines)」、デブ バイオル スタンダード(De
v.Biol.Standard)、34、15〜20(1977) (39)ガーディ・エー(Gardi A)、アーパガス・ジー
アール(Arpagaus GR)、「リムルス変形細胞溶解産物
試験によるエンドトキシンアッセイの改善されたマイク
ロ法(improved microtechnique for endotoxin assay
for the Limulus amoebocyte lysate test)」、アナル
バイオケム(Anal.Biochem.)、109、382〜385(198
0) (40)プライヤー・アールビー(Prior RB)、スパグナ
・ブイエイ(Spagna VA)、「エンドトキシンのリムル
ス溶解産物アッセイへのミクロ希釈操作の適用(Adapta
tion of a microdilution procedure to the Limulus l
ysate assay for endotoxin)」、ジェイ クリン マ
イクロバイオル(J.Microbiol.)、10、394〜395(197
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ガニ(リムリダエ)の生物医学的用途(Biomedical App
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ニューヨークのアラン・アール・リス社(Alan.R.Liss,
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ンドトキシン活性の定量的リムルス溶解産物アッセイ:
放射性ヨウ素標識コアギュローゲンモノマー(Quantita
tive Limulus lysate assay for endotoxin activity:a
ggregation of radioiodinated coagulogen monomer
s)」、アナル バイオケム(Anal.Biochem.)、91、50
9〜515(1978)( (43)ベーク・エル(Baek L)、「エンドトキシン及び
リムルス変形細胞溶解産物との間の反応を測定するため
の新規な感度のよいロケット免疫電気泳動アッセイ(Ne
w,sensitive rocket immunoeleotrophoretic assay for
measurement of the reaction between endotoxin and
Limulus amoebocyte lysate)」、ジェイ クリン マ
イクロバイオル(J.Clin.Microbiol.)、17、1013〜102
0(1083) (44)エリン・アールジエイ(Elin RJ)、ウオルフ・
エスエム(Wolff SM)、「リムルス変形細胞溶解産物試
験の非特異性:ポリヌクレオチド及びタンパク質を用い
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te lysate test:positive reaction with polynucleoti
des and proteins)」、ジェイ インフェクト ディス
(Nonspecificity of the Limulus amoebocyte lysate
test:positive reaction with polynucueotides and pr
oteins)」、ジェイ インフェクト ディス(J.Infec
t.Dis.)」、128、349〜352(1973) (45)ウイルドフェール・エー(Wildfeuer A)、ヘイ
マー・ビー(Heymer B)、シュレイファー・ケーエイチ
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O)、「エンドトキシンの検出に対するリムルス試験の
特異性についての研究(Investigation on the specifi
city of the Limulus test for the detection of endo
toxin)」、アプル マイクロバイオル(Appl.Microbic
l.)、28、867〜871(1974) (46)ブルンソン・ケーダブリュ(Brunson KW)、ワト
ソン・デーダブリュ(Watson DW)、「連鎖球菌性発熱
エキソトキシンとリムルス変形細胞溶解産物との反応
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occal pyrogenic exotoxin)」、インフェクト イムン
(Infect.Immun.)、14、1256〜1258(1976) (47)ミカミ・テー(Mikami T)、ナガセ・テー(Naga
se T)、マツモト・テー(Matsumoto T)、スズキ・S
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of Limulus amoebocyte lysate by simple polysaccha
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unol)、26、403〜409(1982) (48)スズキ・エム(Suzuki M)、ミカミ・テー(Mika
mi T)、マツモト・テー(Matsumoto T)、スズキ・S
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lysaccharides and mycoplasmal lipoglycans:a compar
ison between their abilities to induce macrophage
−medifted tumor cell killing and Limulus amoebocv
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agna VA)、クレイエル・ジェイピー(Kreier JP)、
「リムルス溶解産物アッセイによるエンドトキシンのプ
ラスモジウムバーグヘイの評価(Evaluation of Plasmo
dium berghei for endotoxin by the Limulus lysate a
ssay)」、ジェイ パラシトール(J.Parasitol)、6
6、846〜847(1980) (56)ウエックスラー・エイチ(Wexler H)、オッペン
ハイム・ジェイデー(Oppenheim JD)、「グラム陽性微
生物リステリア菌由来のエンドトキシン様物質の単利、
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on,and biological properties of an endotoxin−like
material from the gram−positive organism Listeri
a monocytogens)」、インフェクト イムン(Infect.I
mmun.)23、845〜857(1979) (57)エリン・アールジェイ(Elin RJ)、「血液、CSF
及び滑液を用いたリムルス試験の臨床的効用(Clinical
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ビン・ジェイ(Levin J)、ブトラー・テー(Butler
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研究された、リムルス変形細胞溶解産物と、緑膿菌及び
黄色ブドウ球菌由来の溶解性抗原との間の相互作用(In
teraction between Limulus amoebocyte lysate and so
luble antigens from Pseudomonas aeruginosa and Sta
phylococcus aureus studied by quantitative immunoe
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ケミカアクタ(Clinica Chimica Acta)、149、55〜65
(1985) (64)ナラムラ・テー(Nakamura T)、モリタ・テー
(Morita T)及びイワナガ・エス(Iwanaga S)、「リ
ムルス血球細胞中に見出されるリポ多糖類感受性セリン
プロテアーゼチモーゲン(C因子)、単離と特定決定
(Lipopolysaccharide−sensitive serine protease zy
mogen(Factor C)found in Limulus hemocytes.Isolat
ion and characterization)」、154、511〜521(198
6)
フロントページの続き (72)発明者 コッホ,クラウス デンマーク国,デーコー‐1415 コペン ハーゲン コー,オーバーガーデン オ ーベン バンデット 26,1
Claims (65)
- 【請求項1】a)試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物
若しくはカブトガニ血リンパの成分又はそのような成分
の合成類似体とともにインキュベーションし、それによ
ってエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が試料中
に存在する場合に前記成分の性質が変性されて、その結
果前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対
し生起させてある抗体、又は実質的に前記成分若しくは
類似体に対し又はそれらの免疫決定基に対してのみ特異
的な抗体との反応が生じない、 b)工程a)から得られる前記試料と前記成分のインキ
ュベーション混合物を、前記成分若しくは類似体に対し
又は免疫決定基に対し生起させてある抗体、又は実質的
に前記成分若しくは類似体又はそれらの免疫決定基に対
してのみ特異的な抗体と反応させ、これにより抗体を、
混合物中に存在する前記成分又は類似体に結合させ、そ
して、 c)工程b)から得られる反応混合物中の結合抗体を検
出することにより、試料中のエンドトキシン又はエンド
トキシン様物質の存在を決定し、結合せしめられた抗体
の減少量の検出は、試料中のエンドトキシン又はエンド
トキシン様物質の存在を示す、 但し、工程a)における試料のインキュベーション後に
存在する前記成分を固体支持体に結合させるか、 前記抗体を前記支持体に又は前記支持体に結合した架橋
分子に結合させるか、又は 試料中に存在するエンドトキシン又はエンドトキシン様
物質を前記支持体に結合させることを含んでなる、試料
中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を
決定する方法。 - 【請求項2】a)試料を、カブトガニ変形細胞溶解産物
若しくはカブトガニ血リンパの成分又はそのような成分
の合成類似体とともにインキュベーションし、それによ
ってエンドトキシン又はエンドトキシン様物質が試料中
に存在する場合に前記成分の性質が変性されて、その結
果前記成分又は類似体と試料中のエンドトキシン又はエ
ンドトキシン様物質との反応の反応生成物は、前記反応
生成物又はそのような反応生成物の合成類似体に対し又
はそれらの免疫決定基に対して生起させてある抗体と、
又は実質的に前記反応生成物又はそのような反応生成物
の合成類似体に対し又はそれらの免疫決定基に対しての
み特異的な抗体と反応し、 b)工程a)から得られる前記試料と前記成分のインキ
ュベーション混合物を、前記反応正生物若しくは類似体
に対し又はそれらの免疫決定基に対し生起させてある抗
体、又は実質的に前記反応生成物もしくは類似体に対し
又はそれらの免疫決定基に対し特異的な抗体と反応さ
せ、これにより抗体を混合物中に存在する前記反応生成
物のいずれかと結合させ、そして c)工程b)から得られる反応混合物中の結合抗体を検
出することにより、試料中のエンドトキシン又はエンド
トキシン様物質の存在を決定し、結合せしめられた抗体
の増加量の検出は、試料中のエンドトキシン又はエンド
トキシン様物質の存在を示す、 但し、工程a)における試料のインキュベーション後に
存在する前記反応生成物を固体支持体に結合させるか、 前記抗体を前記支持体に又は前記支持体に結合した架橋
分子に結合させるか、又は 試料中に存在するエンドトキシン様物質を前記支持体に
結合させることを含んでなる、試料中のエンドトキシン
又はエンドトキシン様物質の存在を決定する方法。 - 【請求項3】カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リンパ
の成分が、凝固因子、例えば、B因子、C因子、G因
子、N因子、前駆凝固酵素、活性化凝固酵素、抗LPS因
子又はコアギュローゲン及び凝集素、例えば、リムリン
又はポリフェミン等のレクチンから選択されたものであ
る請求の範囲第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項4】前記成分又は類似体と試料中の前記エンド
トキシン又はエンドトキシン様物質との反応の生成物
が、コアギュリン、C−ペプチド、活性化凝固酵素、活
性化B,C,G若しくはN因子、並びにこれらの因子及び前
駆凝固酵素からの開裂生成物から選択されたものである
請求の範囲第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項5】試料が、尿、髄液、血液、血清、血漿、血
液から製造される生成物又はリンパ液等の体液、非経口
液又は注射液等の製剤、医療用具、マイトジェン、栄養
培地及び緩衝液等の生化学薬品、食品、飲料水並びに製
薬工業で使用する水から選択されたものである請求の範
囲第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項6】エンドトキシン又はエンドトキシン様物質
が、エンドトキシン、又はグラム陰性菌、グラム陽性
菌、カビ、酵母及び藻類等の微生物由来の表面抗原から
選択されたものである請求の範囲第1又は2項に記載の
方法。 - 【請求項7】抗体が、単一特異性抗体である請求の範囲
第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項8】抗体が、ポリクローナル抗体である請求の
範囲第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項9】抗体が、モノクローナル抗体であるか、2
種以上のモノクローナル抗体からなる混合物である請求
の範囲第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項10】抗体が標識を有している請求の範囲第1
又は2項に記載の方法。 - 【請求項11】標識が、酵素、螢光物質、化学発光物
質、発色団、放射性同位体及び錯生成剤から選択された
ものである請求の範囲第10項に記載の方法。 - 【請求項12】酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコー
ス、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチル
コリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、
リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−p−ホスフェー
ト脱水素酵素及びリボヌクレアーゼから選択されたもの
である請求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項13】酵素を標識として使用し、酵素の基質を
請求の範囲第1又は2項の工程b)で得られる反応混合
物に添加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさ
せるか、色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発
光の強度の変化を生じさせる請求の範囲第11項に記載の
方法。 - 【請求項14】螢光物質が、4−メチルウンベリフェリ
ル−ホスフェート、4−メチルウンベリフェリル−D−
ガラクトピラノシド及び3−(p−ヒドロキシフェニ
ル)プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲
第11項に記載の方法。 - 【請求項15】化学発光物質は、イソルミノール/EDTA/
H2O2、ペルオキシダーゼ/エオシン/EDTA及びルシフェ
ラーゼ並びにそれらの基質から選択されたものである請
求の範囲第11項に記載の方法。 - 【請求項16】発色団は、5−アミノサリチル酸、2,
2′−アジノ−ジ−(3−エチルベンズチアゾリン−6
−スルホン酸、o−フェニレンジアミン、o−ジアミン
イシジン、3−メチル−2−ベンゾチアゾリンヒドラゾ
ン、3−(ジメチルアミノ)安息香酸、o−トルイジ
ン、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン、o−ニト
ロフェニル−β−D−ガラクトシド及びp−ニトロフェ
ニルホスフェートから選択されたものである請求の範囲
第11項に記載の方法。 - 【請求項17】放射性同位体は、125I,3H,35P,131I及び
14Cから選択されたものである請求の範囲第10項に記載
の方法。 - 【請求項18】錯生成剤は、ビオチン、プロテインA及
びレクチンから選択されたものである請求の範囲第11項
に記載の方法。 - 【請求項19】抗体を、固体支持体又は固体支持体に結
合した架橋分子に結合させるとともに、請求の範囲第1
又は2項の方法の工程a)における成分又は類似体と試
料とのインキュベーション後に残存している前記成分
は、抗体に結合させ更なる量の抗体と反応させる請求の
範囲第1又は2項に記載の方法。 - 【請求項20】固体支持体がポリマーを包含する請求の
範囲第19項に記載の方法。 - 【請求項21】固体支持体が、ポリマーを被覆したマト
リックスを包含する請求の範囲第20項に記載の方法。 - 【請求項22】ポリマーが、プラスチック、ニトロセル
ロース紙、臭化シアン活性化紙、1−(3−ニトロベン
ジルオキシメチル)ピリジウムクロリド紙、ジアゾベン
ジルオキシメチル紙、ニトロベンジルオキシメチル紙又
はアミノベンジルオキシメチル紙等のセルロース、シリ
コーンポリマー及びシリカ又はシリケートから選択され
たものである請求の範囲第20項又は第21項に記載の方
法。 - 【請求項23】プラスチックがラテックス、ポリスチレ
ン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミ
ド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体から選
択されたものである請求の範囲第22項に記載の方法。 - 【請求項24】固体支持体が、板状、ストリップ、フィ
ルム、プロテインA被覆バクテリア等の固体粒子、又は
紙の形態である請求の範囲第19項に記載の方法。 - 【請求項25】a)コアギュローゲンに対しもしくはそ
の免疫決定基に対してのみ生起せしめてある抗体か、又
は実質的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに
対し特異的な抗体を、固体支持体又は固体支持体に結合
した架橋分子に結合させ、b)試料をコアギュローゲン
含有物質とともにインキュベーションして、試料中にエ
ンドトキシン又はエンドトキシン様物質が存在する場合
にはコアギュローゲンが開裂されてコアギュリン及びC
−ペプチドとなるようにし、 c)工程b)から得られるインキュベーション混合物を
固体支持体に添加し、 d)固体支持体に、コアギュローゲンに対しもしくはそ
の免疫決定基に対して生起させてある標識抗体か、又は
実質的にコアギュローゲンもしくはその免疫決定基のみ
に対し特異的な標識抗体を添加して固体支持体上に存在
する結合コアギュローゲンに結合するようにし、そして e)工程d)の固体支持体に結合した標識抗体を検出す
ることにより、試料中のエンドトキシン又はエンドトキ
シン様物質の存在を決定し、結合抗体の減少量の検出
は、エンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存在を
示す、ことを含んでなる、請求の範囲第1項記載の方
法。 - 【請求項26】a)コアギュリン若しくはC−ペプチド
に対し又はその免疫決定基に対する抗体か、又は実質的
にコアギュリン若しくはC−ペプチド又はその免疫決定
基に対して特異的な抗体を、固体支持体又は固体支持体
に結合した架橋分子に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)から得られるインキュベーション混合物を
固体支持体に添加して、試料中に存在するコアギュロー
ゲンを結合するようにし、 d)固体支持体に対する標識抗体か、又は実質的にコア
ギュローゲンもしくはその免疫決定基のみに対する標識
抗体を添加して固体支持体上に存在する結合コアギュロ
ーゲンに結合するようにするか、又はコアギュリン若し
くはC−ペプチドに対し又はその免疫決定基に対し生起
せしめてある標識抗体又は実質的にコアギュリン若しく
はC−ペプチド又はその免疫決定基のみに対して特異的
な標識抗体を添加して固体支持体上に存在する結合コア
ギュリン又は結合C−ペプチドに結合するようにし、そ
して e)工程d)の固体支持体に結合した標識抗体を検出す
ることにより試料中のエンドトキシン又はエンドトキシ
ン様物質の存在を決定し、結合抗体の増加量の検出は、
試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質の存
在を示すものを含んでなる、請求の範囲第2項記載の方
法。 - 【請求項27】a)試料をコアギュローゲン含有物質と
ともにインキュベーションして、試料中にエンドトキシ
ン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギ
ュローゲンが開裂されてコアギュリン及びC−ペプチド
となるようにし、 b)工程a)のインキュベーション混合物を固体支持体
に添加して、混合物中に存在するコアギュローゲンを結
合するようにし、 c)固体支持体に、コアギュローゲンに対し又はその免
疫決定基に対して生起させてある標識抗体か、又は実質
的にコアギュローゲン又はその免疫決定基のみに対して
特異的な標識抗体を添加して、固体支持体に結合したコ
アギュローゲンに結合するようにし、 d)工程c)の固体支持体に結合した標識抗体の存在を
検出することにより試料中のエンドトキシン又はエンド
トキシン様物質の存在を決定し、結合抗体の減少量の検
出が試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質
の存在を示すものであることを含んでなる、請求の範囲
第1項記載の方法。 - 【請求項28】a)コアギュローゲンに対しもしくはそ
の免疫決定基に対して生起させてある抗体又は実質的に
コアギュローゲンもしくはその免疫決定基のみに対して
特異的な抗体を、固体粒子の表面に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)のインキュベーション混合物を、工程a)
の抗体に添加し、コアギュローゲンの存在下固体粒子の
凝集を生起せしめるようにし、そして d)該固体粒子の凝集の不存在下により試料中のエンド
トキシン又はエンドトキシン様物質の存在を決定するこ
とを含んでなる、請求の範囲第1項記載の方法。 - 【請求項29】a)試料をコアギュローゲン含有物質と
ともにインキュベーションして、試料中にエンドトキシ
ン又はエンドトキシン様物質が存在する場合にはコアギ
ュローゲンが開裂されて、コアギュリン及びC−ペプチ
ドとなるようにし、 b)工程a)のインキュベーション混合物を固体支持体
に添加して、混合物中に存在するコアギュリン又はCペ
プチドを結合するようにし、 c)固体支持体にコアギュリン若しくはC−ペプチドに
対し又はその免疫決定基に対して生起させてある標識抗
体又は実質的にコアギュリン若しくはC−ペプチド又は
その免疫決定基のみに対し特異的な標識抗体を添加し
て、固体支持体上に結合したコアギュリン又はC−ペプ
チドに結合するようにし、 d)工程c)の固体支持体に結合した標識抗体の存在を
検出することにより試料中のエンドトキシン又はエンド
トキシン様物質の存在を決定し結合抗体量の増加量の検
出は試料中のエンドトキシン又はエンドトキシン様物質
が存在することを示すことを含んでなる、請求の範囲第
2項記載の方法。 - 【請求項30】a)コアギュローゲンもしくはC−ペプ
チドに対し又はその免疫決定基に対して生起させてある
抗体又は実質的にコアギュローゲンもしくはC−ペプチ
ドに対し又はその免疫決定基のみに対して特異的な抗体
を、固体粒子の表面に結合させ、 b)試料をコアギュローゲン含有物質とともにインキュ
ベーションして、試料中にエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質が存在する場合にはコアギュローゲンが開
裂されてコアギュリン及びC−ペプチドとなるように
し、 c)工程b)のインキュベーション混合物を、工程a)
の抗体に添加し、コアギュローゲン又はC−ペプチドの
存在下固体粒子の凝集を生起せしめるようにし、そして d)該固体粒子の凝集により試料中のエンドトキシン又
はエンドトキシン様物質の存在を決定することを含んで
なる、請求の範囲第2項記載の方法。 - 【請求項31】カブトガニ変形細胞溶解産物若しくはカ
ブトガニ血リンパの成分又はそのような成分の合成類似
体に対し又はその免疫決定基に対して生起させてあるモ
ノクローナル抗体又は実質的にカブトガニ変形細胞溶解
産物若しくはカブトガニ血リンパの成分又はそのような
成分の合成類似体に対し又はその免疫決定基のみに対し
て特異的なモノクローナル抗体、又はカブトガニ変形細
胞溶解産物若しくはカブトガニ血リンパの成分又はその
ような成分の合成類似体とエンドトキシン又はエンドト
キシン様物質との反応の反応生成物に対するか、又は実
質的に前記反応生成物にのみ特異的であるモノクローナ
ル抗体、又は前記反応生成物の免疫決定基に対するモノ
クローナル抗体であって、前記抗体が標識を有すること
を特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項32】標識が、酵素、螢光物質、化学発光物
質、発色団、放射性同位体及び錯生成剤から選択された
ものである請求の範囲第31項に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項33】酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコー
ス、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチル
コリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、
リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−p−ホスフェー
ト脱水素酵素及びリボヌクレアーゼから選択されたもの
である請求の範囲第32項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項34】酵素を標識として使用し、酵素の基質を
請求の範囲第2項の工程b)で得られる反応混合物に添
加して、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせる
か、色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光の
強度の変化を生じさせる請求の範囲第32項に記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項35】螢光物質が、4−メチルウンベリフェリ
ル−ホスフェート、4−メチルウンベリフェリル−D−
ガラクトピラノシド及び3−(p−ヒドロキシフェニ
ル)プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲
第32項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項36】化学発光物質は、イソルミノール/EDTA/
H2O2、ペルオキシダーゼ/エオシン/EDTA及びルシフェ
ラーゼ並びにそれらの基質から選択されたものである請
求の範囲第32項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項37】発色団は、5−アミノサリチル酸、2,
2′−アジノ−ジ−(3−エチルベンズチアゾリン−6
−スルホン酸、o−フェニレンジアミン、o−ジアミン
イシジン、3−メチル−2−ベンゾチアゾリンヒドラゾ
ン、3−(ジメチルアミノ)安息香酸、o−トルイジ
ン、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン、o−ニト
ロフェニル−β−D−ガラクトシド及びp−ニトロフェ
ニルホスフェートから選択されたものである請求の範囲
第32項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項38】放射性同位体は、125I,3H,35P,131I及び
14Cから選択されたものである請求の範囲第32項に記載
のモノクローナル抗体。 - 【請求項39】錯生成剤は、ビオチン、プロテインA及
びレクチンから選択されたものである請求の範囲第32項
に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項40】カブトガニ変形細胞溶解産物若しくはカ
ブトガニ血リンパの成分又はそのような成分の合成類似
体又はその免疫決定基に対して生起させてあるモノクロ
ーナル抗体又は実質的にカブトガニ変形細胞溶解産物若
しくはカブトガニ血リンパの成分又はそのような成分の
合成類似体に対し又はその免疫決定基のみに対して特異
的なモノクローナル抗体、又はカブトガニ変形細胞溶解
産物若しくはカブトガニ血リンパの成分又はそのような
成分の合成類似体とエンドトキシン又はエンドトキシン
様物質との反応の反応生成物に対するか、又は実質的に
前記反応生成物にのみ特異的であるモノクローナル抗
体、又は前記反応生成物の免疫決定基に対するモノクロ
ーナル抗体であって、前記抗体が固体支持体又は固体支
持体に結合した架橋分子に結合していることを特徴とす
るモノクローナル抗体。 - 【請求項41】架橋分子が、グルタルアルデヒド、カル
ボジイミド、リジン、プロテインA及びヒドラジドから
選択されたものである請求の範囲第40項に記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項42】試料中のエンドトキシン又はエンドトキ
シン様物質の存在を決定するための試験キットであっ
て、 a1)カブトガニ変形細胞溶解産物若しくはカブトガニ血
リンパの成分又はそのような成分の合成類似体又はその
免疫決定基に対して生起させてある抗体又は実質的にガ
ブトガニ変形細胞溶解産物若しくはカブトガニ血リンパ
の成分又はそのような成分の合成類似体又はその免疫決
定基のみに対して特異的な抗体、又は a2)カブトガニ変形細胞溶解産物若しくはカブトガニ血
リンパの成分又はそのような成分の合成類似体とエンド
トキシンもしくは合成エンドトキシン様物質の反応の反
応生成物に対して生起させてあるか、又はカブトガニ変
形細胞溶解産物若しくはカブトガニ血リンパの成分又は
そのような成分の合成類似体とエンドトキシンもしくは
合成エンドトキシン様物質の反応の反応生成物に対して
特異的な抗体、又はそのような反応生成物の免疫学的検
出に対して生起させてある抗体、および b)カブトガニ変形細胞若しくはカブトガニ血リンパの
成分又はそのような成分の合成類似体を含んでなり、前
記抗体a1)又はa2)が固体支持体に結合した架橋分子に
結合しているか、又は前記成分もしくは類似体が固体支
持体に結合していることを特徴とする、前記試験キッ
ト。 - 【請求項43】カブトガニ変形細胞溶解産物又は血リン
パの成分は、凝固因子、例えば、B因子、C因子、G因
子、N因子、前駆凝固酵素、抗LPS因子又はコアギュロ
ーゲン及び凝集素、例えば、リムリン又はポリフェミン
等のレクチンから選択されたものである請求の範囲第24
項に記載のキット。 - 【請求項44】前記成分又は類似体と前記試料中の前記
エンドトキシン又はエンドトキシン様物質との反応の生
成物は、コアギュリン、C−ペプチド、凝固酵素、活性
化B,C,G若しくはN因子、並びにこれらの因子からの開
裂生成物から選択されたものである請求の範囲第42項に
記載のキット。 - 【請求項45】抗体が単一特異性抗体である請求の範囲
第42項に記載のキット。 - 【請求項46】抗体がポリクローナル抗体である請求の
範囲第42項に記載のキット。 - 【請求項47】抗体がモノクローナル抗体又は2種以上
のモノクローナル抗体の混合物である請求の範囲第42項
に記載のキット。 - 【請求項48】抗体が標識を有している請求の範囲第42
項に記載のキット。 - 【請求項49】標識が、酵素、螢光物質、化学発光物
質、発色団、放射性同位体及び錯生成剤から選択された
ものである請求の範囲第48項に記載のキット。 - 【請求項50】酵素が、ペルオキシダーゼ、ホスファタ
ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコー
ス、グルコースオキシダーゼ、炭酸脱水酵素、アセチル
コリンエステラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、
リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−6−p−ホスフェー
ト脱水素酵素及びリボヌクレアーゼから選択されたもの
である請求の範囲第49項に記載のキット。 - 【請求項51】標識として酵素を含むとともに、請求の
範囲第1又は2項の工程b)で得られる反応混合物を添
加したとき、着色、螢光又は化学発光生成物を生じさせ
るか、色の変化を生じさせるか、色、螢光又は化学発光
の強度の変化を生じさせる酵素の基質を更に含有する請
求の範囲第49項に記載のキット。 - 【請求項52】螢光物質が、4−メチルウンベリフェリ
ル−ホスフェート、4−メチルウンベリフェリル−D−
ガラクトピラノシド及び3−(p−ヒドロキシフェニ
ル)プロピオン酸から選択されたものである請求の範囲
第49項に記載のキット。 - 【請求項53】化学発光物質は、イソルミノール/EDTA/
H2O2、ペルオキシダーゼ/エオシン/EDTA及びルシフェ
ラーゼ並びにそれらの基質から選択されたものである請
求の範囲第49項に記載のキット。 - 【請求項54】発色団は、5−アミノサリチル酸、2,
2′−アジノ−ジ−(3−エチルベンズチアゾリン−6
−スルホン酸、o−フェニレンジアミン、o−ジアミン
イシジン、3−メチル−2−ベンゾチアゾリンヒドラゾ
ン、3−(ジメチルアミノ)安息香酸、o−トルイジ
ン、3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン、o−ニト
ロフェニル−β−D−ガラクトシド及びp−ニトロフェ
ニルホスフェートから選択されたものである請求の範囲
第49項に記載のキット。 - 【請求項55】放射性同位体は、125I,3H,35P,131I及び
14Cから選択されたものである請求の範囲第49項に記載
のキット。 - 【請求項56】錯生成剤は、ビオチン、プロテインA及
びレクチンから選択されたものである請求の範囲第49項
に記載のキット。 - 【請求項57】固体支持体を包含する請求の範囲第42項
に記載のキット。 - 【請求項58】固体支持体が、ポリマーを包含する請求
の範囲第57項に記載のキット。 - 【請求項59】固体支持体が、ポリマーが結合したマト
リックスを包含する請求の範囲第58項に記載のキット。 - 【請求項60】ポリマーが、プラスチック、ニトロセル
ロース紙、臭化シアン活性化紙、1−(3−ニトロベン
ジルオキシメチル)ピリジウムクロリド紙、ジアゾベン
ジルオキシメチル紙、ニトロベンジルオキシメチル紙又
はアミノベンジルオキシメチル紙等のセルロース、シリ
コーンポリマー及びシリカ又はシリケートから選択され
たものである請求の範囲第58項又は第59項に記載のキッ
ト。 - 【請求項61】プラスチックがラテックス、ポリスチレ
ン、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、ポリアクリルアミ
ド、ポリ酢酸ビニル及びそれらの適当な共重合体から選
択されたものである請求の範囲第60項に記載のキット。 - 【請求項62】固体支持体が、板状、ストリップ、フィ
ルム、プロテインA被覆バクテリア等の固体粒子、又は
紙の形態である請求の範囲第57項に記載のキット。 - 【請求項63】標識抗体と未標識抗体の両方を包含する
請求の範囲第42項に記載のキット。 - 【請求項64】エンドトキシン標準を更に包含する請求
の範囲第42項に記載のキット。 - 【請求項65】無パイロジェン水を更に包含する請求の
範囲第42項に記載のキット。
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