CN107727863A - 酵母浸出物中内毒素含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母浸出物中内毒素含量的检测方法，其通过干热程序有效性试验、灵敏度复核试验、干扰试验和凝胶半定量试验成功建立了酵母浸出物中内毒素含量检测方法，其简便易操作，重复性好，可作为酵母浸出物中内毒素的评估方法，值得推广应用。试验样品和检测方法符合《中华人民共和国药典》和国家食品药品监督管理总局发布的《细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验》行业标准的相关规定要求。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酵母浸出物中内毒素含量的检测方法。
背景技术
酵母浸出物是以蛋白质含量丰富的食用酵母为原料，采用生物技术，将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解后精制而成的天然调味料，它含有20种氨基酸和多肽，此外还含有核苷酸、维生素、有机酸和矿物质等多种有效成分。酵母浸出物中氨基酸平衡良好，味道鲜美浓郁，具有肉香味，因而酵母抽提物是兼具有营养、调味和保健三大功能的优良食品调味料，广泛应用于生物实验室、制药业、发酵行业、医用保健以及动物营养等方面。由于酵母浸出物可为细胞的生长提供氨基酸和维生素等营养成分、可促进细胞生长。近年来，国内外已开始将它作为动物细胞培养基的添加成分进行了应用研究。
目前，我国已有成熟酵母细胞破壁获取酵母浸出物技术，拥有前期研发出了培养基酵母浸出物，已在国内细菌培养、发酵行业开始应用，为进行动物细胞培养基的研究积累了经验和技术，该公司研发出培养基级酵母浸出物，可以作为无血清培养基的添加因子，且非动物源的成分，完全可作为无血清培养基的组成配方。作为无血清培养基除了保证培养基中成分满足细胞生成和发育的需要外，重要的一个要求是培养基的中内毒素含量必须严格控制在规定的范围内。为此，酵母浸出物要想成功取代血清作为无血清培养基的重要组成成分，必须对其内毒素含量有一个明确的标示，以便在配制培养基选择应用，然而当前未见有酵母浸出物内毒素检测方法研究。
发明内容
本发明的目的提供一种酵母浸出物中内毒素含量的检测方法，能够快速准确的检查出酵母浸出物中内毒素的含量，为其应用提供指导。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种酵母浸出物中内毒素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)干热程序有效性试验
分别配制未干热内毒素系列溶液及经干热处理后的内毒素系列溶液，采用鲎试剂进行测试，计算内毒素衰减并确定具体有效的干热处理条件。
2)灵敏度复核试验
配制待复核的鲎试剂及不同浓度的内毒素工作标准品系列溶液，然后将鲎试剂与内毒素工作标准品系列溶液分别进行混合，同时采用检查用水做阴性对照，计算鲎试剂灵敏度的测定值λc，当其结果在0.5λ～2.0λ之间，则灵敏度合格；如果不合格，需更换鲎试剂进行复核试验直至合格。另外，购买的不同生产批次的鲎试剂也必须进行复核实验。
3)干扰试验
分别设置酵母浸出物供试品系列溶液、内毒素标准工作品与酵母浸出物供试品混合系列溶液、内毒素标准工作品系列溶液及检查用水阴性对照溶液，然后利用经灵敏度复核合格的鲎试剂进行测试，确保供试品在何浓度下不干扰试验；
4)凝胶半定量试验
分别设置酵母浸出物供试品系列溶液，内毒素标准工作品与酵母浸出物供试品混合溶液、内毒素标准工作品系列溶液及检查用水阴性对照溶液，再利用经灵敏度复核合格的鲎试剂进行测试，最后计算处供试品溶液的内毒素浓度；其中酵母浸出物供试品通过步骤3)中的干扰试验。
进一步地，步骤1)中干热处理条件：烘烤温度为220～280℃，保温时间为70～110min。
另外，在干热程序有效性试验中，所用的内毒素为内毒素指示剂，未干热内毒素系列溶液稀释的倍速在1000-50000之间；经干热处理的内毒素系列溶液的稀释倍数在1-20倍之间。优选地方案中，未干热内毒素系列溶液稀释的倍速分别为2500、5000、10000、20000和40000；经干热处理的内毒素系列溶液的稀释倍数分别为1、2、4、6、8。
优选地，步骤2)中，鲎试剂灵敏度标示值λ为0.015～0.500EU/mL；进一步优选为0.125EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度在0.1～2.0EU/mL，进一步地优选稀释浓度分别为：0.125、0.250、0.500、1.000EU/mL。
优选地，步骤3)中鲎试剂灵敏度标示值λ为0.030～1.000EU/mL，进一步优选为0.500EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度为0.1～2.0EU/mL，进一步地优选稀释浓度分别为：0.250、0.500、1.000、2.000EU/mL；酵母浸出物稀释后的浓度为0.01～0.500mg/mL，进一步优选为0.025mg/mL。
优选地，步骤4)中鲎试剂灵敏度标示值λ为0.015～0.500EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度为0.1～2.0EU/mL。进一步优选地，鲎试剂灵敏度标示值λ为0.125EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度分别为0.250、0.500、1.000、2.000EU/mL。
其中，步骤3)为初筛范围，步骤4)为在初筛范围的基础上的细化，在鲎试剂灵敏度的选择上会做出相应的调整。
本发明还涉及所述方法在酵母浸出物内毒素含量检测中的应用。
本发明还涉及所述方法在含有酵母浸出物的各种微生物、动物细胞的培养基中内毒素含量检测的应用。
本发明提供的方法通过在实际检测中应用，证实试验样品和检测方法符合《中华人民共和国药典》和国家食品药品监督管理总局发布的《细菌内毒素试验方法常规监控与跳批检验》行业标准的相关规定要求。本检测方法通过干扰程序有效性试验、灵敏度复核试验、干扰试验和凝胶半定量试验，成功建立了酵母浸出物中内毒素含量检测方法，其简便易操作，重复性好，可作为酵母浸出物中内毒素的评估方法，值得推广应用。
本发明还具有以下有益效果：
细胞和人类对对内毒素非常敏感，当细胞和人的感染浓度分别在10.0EU/mL和1.0EU/mL以上时，会引起强烈的不良反应，因此对细胞的培养基和生物制品及其用来生产生物制品的原辅料的内毒素含量要求严格控制。本研究克服了酵母浸出物中成分复杂、容易吸潮等不足，首次建立起了酵母浸出物中内毒素检测方法，用市售的鲎试剂检查酵母浸出物中内毒素方法可行。该方法对于酵母浸出物中内毒素的检测和含酵母浸出物的细胞培养基的研发均具有重要的指导意义。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：
1、试验样品
培养基级酵母浸出物：FM902，批号：2017030601B9，安琪酵母股份有限公司提供。
2、主要试剂
内毒素指示剂：湛江安度斯生物有限公司；细菌内毒素工作标准品：湛江安度斯生物有限公司；鲎试剂：规格0.1mL/支，灵敏度：0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015EU/mL：湛江安度斯生物有限公司；无热源空安瓿瓶(10mL)、无热源检查用水、无热源移液器枪头：湛江安度斯生物有限公司。
3、主要仪器
BET-40型内毒素检测仪：天津药典标准仪器厂；涡旋混合仪，美国ScientificIndustries公司；超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；超低温保存箱，青岛海尔特种电器有限公司；自动双蒸水蒸馏器，上海亚荣生化设备仪器有限公司。
具体的检测方法为：
1)干热程序有效性试验
未干热内毒素系列溶液配制及检测
具体试验步骤如下：
①用检查用水1mL溶解未干热过的1支内毒素指示剂(ECV)，在旋涡混合器上剧烈振摇15min；
②取该溶液100μL，加900μL检查用水，稀释3次，每次稀释均是取上次的溶液100及检测用水900μL进行混合，且每次稀释前要混合30～60s，得浓度为1.25EU/μL的溶液；然后依次稀释：取800μL溶液与1200μL检查用水稀释，得0.5EU/μL溶液；再取1000μL溶液与1000μL检查用水稀释，得0.25EU/μL溶液；再取1000μL溶液与1000μL检查用水稀释，得0.125EU/μL溶液；再取1000μL溶液与1000μL检查用水稀释，得0.06EU/μL溶液；再取1000μL溶液与1000μL检查用水稀释，得0.03EU/μL溶液。
③各浓度溶液分别取0.1mL加入0.1mL/支的鲎试剂原安瓿中(平行做2管)，将管轻轻混匀后，用铝箔封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60±2分钟。
④将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°。若管内形成凝胶，且凝胶不变形、不从管壁滑脱为阳性(避免震动)。
⑤反应终点是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
具体的试验结果如表1所示。
表1未干热内毒素检测试验结果
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
经干热处理内毒素系列溶液配制及检测
具体试验步骤如下：
①取1支EVC，折断安瓿颈，用铝箔封闭瓶口，放入烘箱(250℃，90分钟)干热后取出。
②用检查用水1mL溶解干热过的ECV，在旋涡混合器上剧烈振摇15min。
③依次稀释2倍，稀释四次，每次用500μL溶液与500μL检查用水混匀。每次稀释前要混合30～60s。
④各浓度溶液分别取0.1mL加入0.1mL/支的鲎试剂原安瓿中(平行做2管)，将管轻轻混匀后，用铝箔封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60±2分钟。
⑤将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，观察是否凝胶。至到出现阴性结果。
具体试验结果见表2。
表2经干热内毒素检测试验结果
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
根据表1和表2检测结果进行计算：
可回收内毒素浓度：Rc＝λ·D·1mL(λ＝0.125EU/mL)＝0.125×20000×1＝2500，
残余内毒素：Rs＝λ·D·1mL(λ＝0.125EU/mL)＝0.125×1×1＝0.125。
内毒素衰减实验结果：lgRd＝lgRc-lgRs＝lg2500-lg0.125＝4.301>4。
我国的行业标准：内毒素衰减：lgRd＝lgRc-lgRs(我国2015版药典规定当lgRd>4或lgRd>3时，干热程序有效)。
由实验结果可知：拟定的干热程序：250℃，90min有效(后续实验按照此程序进行除去外源性内毒素操作)。
2)灵敏度复核试验
所选鲎试剂灵敏度标示值λ＝0.5EU/mL，细菌内毒素工作标准品14EU/支。
具体试验步骤如下：①取18支鲎试剂分别加入0.1mL检查用水溶解，得每支浓度为0.5EU/mL备用。②细菌内毒素工作标准品梯度稀释如下：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL；取100μL溶液与1300μL检查用水混匀，得到浓度为1EU/mL(2λ)；再取700μL溶液与700μL检查用水混匀，得到浓度为0.5EU/mL(λ)；再取700μL溶液与700μL检查用水混匀，得到浓度为0.25EU/mL(0.5λ)；再取700μL溶液与700μL检查用水混匀，得到浓度为0.125EU/mL(0.25λ)；上述每一步稀释均应在漩涡混合器上混匀30秒钟。③将18支溶解的鲎试剂分别取0.1mL加入18支试管中，其中16管分别加入0.1mL不同浓度的内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管，另外2管加入0.1mL检查用水做阴性对照，将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温箱中，保温60±2min后轻轻取出，缓缓倒转180°观察。
试验结果见表3。
表3鲎试剂灵敏度复核试验结果(鲎试剂灵敏度：0.5EU/mL)
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者判定为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者判定为阴性。由表3可知，当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)，λc＝antilg(∑X/4)，其中X为反应终点浓度对数值lg，反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
根据表3实验结果进行计算：X1＝X2＝X3＝lg0.25，X4＝lg0.50。λc＝antilg(∑X/4)＝antilg(lg0.25×3+lg0.50)/4＝antilg(-0.5268)＝0.2973。0.25＝0.5λ≤λc＝0.2973≤2λ＝1.0。由实验结果可知：此批次灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂合格，可用于YE内毒素检查分析。其他灵敏度为：0.25、0.125、0.06、0.03、0.015EU/mL鲎试剂复核方法与上述方法类似。
3)FM902凝胶法干扰试验
所选鲎试剂灵敏度标示值λ＝0.5EU/mL，细菌内毒素工作标准品14EU/支。具体试验步骤如下：①浓度为2λ的4.2mL内毒素标准工作品母液的制备(C组)：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL，分别取150μL溶液与1.950mL检查用水混匀即得两管浓度为2λ的母液，共4.2mL。②浓度为0.1mg/mL供试品溶液的制备(A组)：称量0.5mg酵母菌粉溶于呈有5mL检查用水的试管中，摇匀即得浓度为0.1mg/mL供试品溶液。然后依次取2.5mL溶液与2.5mL检查用水混匀，得到浓度为0.05mg/mL供试品溶液；再取2.5mL溶液与2.5mL检查用水混匀，得到浓度为0.025mg/mL供试品溶液；再取2.5mL溶液与2.5mL检查用水混匀，得到浓度为0.0125mg/mL供试品溶液。③浓度为2λ的2mL内毒素标准工作品与供试品混合液的制备(B组溶液)：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL标准品，再取150μl该液与1950μL供试品溶液混匀。④取42支灵敏度为0.5EU/mL鲎试剂分别加入0.1mL检查用水溶解待用。⑤每管各加入0.1mL灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂和相应溶液，具体稀释见试验结果表4。
根据《中华人民共和国药典》(2015版)细菌检查法的规定：只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。
依据：Es＝antilg(∑Xs/4)＝antilg(0.5×4÷4)＝0.5λ，
Et＝antilg(∑Xt/4)＝antilg(0.25×4÷4)＝0.25λ
(X：为反应终点时浓度的对数值，Es为C反应终点浓度的几何平均值，Et为B反应终点浓度的几何平均值)，若符合Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包括0.5Es和2Es)的规定。所以最终认为供试品在该浓度下无干扰作用。根据表4实验结果进行计算：上述实验确定批次为FM902的浓度为0.025mg/mL时该试验有效。
4)FM902凝胶半定量试验
所选鲎试剂灵敏度标示值λ＝0.125EU/mL，细菌内毒素工作标准品14EU/支。
具体试验步骤如下：①浓度为2λ的内毒素标准工作品母液的制备(C组)：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL，再取25μl溶液与675μL检查用水混匀得0.5EU/mL溶液，再取0.5mL溶液与0.5ml检查用水混匀即得0.25EU/ml(2λ)母液。②供试品溶液的制备(A组)：通过干扰试验的供试品溶液。③浓度为2λ的内毒素标准工作品与供试品混合液的制备(B组溶液)：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL，再取25μL溶液与675μL供试品溶液混匀得0.5EU/mL溶液，再取0.5mL溶液与0.5mL供试品溶液混匀即得2λ的内毒素标准工作品与供试品混合液。④取20支鲎试剂分别加入0.1mL检查用水溶解，得每支浓度为0.5EU/mL待用。⑤每管各加入0.1mL灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂和相应溶液。具体稀释见试验结果表5。
表5 FM902凝胶法半定量试验结果(鲎试剂灵敏度：λ＝0.125EU/mL，FM902浓度：0.025mg/mL)
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
根据药典细菌检查法的规定：若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。Es＝antilg(∑Xs/4)＝0.5λ。由此判定，该试验有效。求得YE供试品溶液的内毒素浓度(系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度)。
根据表5实验结果进行计算：
CE＝antilg(∑X/2)＝antilg[(lg0.125+lg0.125)/2]＝antilg(-0.9031)＝0.125EU/mL。所以，FM902浓度为0.025mg/mL时里面含有的内毒素含量为0.125EU/mL。即：FM902浸出物里所含内毒素为5EU/mg。
试验结论
通过干热程序有效性试验、灵敏度复核试验、FM902凝胶法干扰试验和FM902凝胶半定量试验，测得FM902浸出物中所含内毒素为5EU/mg，符合《中华人民共和国药典》(2015版)的限量标准。试验结果表明在无血清培养基中，适当添加酵母浸出物FM902是可行的。
实施例2：
1、试验样品
培养基级酵母浸出物：FM905，批号：2017030611A3，安琪酵母股份有限公司提供。
2、主要试剂
同实施例1。
3、主要仪器
同实施例1。
4、试验方法
1)干热程序有效性试验
未干热内毒素系列溶液配制及检测参见实施例1，试验结果见表6。
经干热内毒素系列溶液配制及检测参见实施例1，试验结果见表7。
表6未干热内毒素检测试验结果
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
表7经干热内毒素检测试验结果
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
根据表6和表7检测结果进行计算：
可回收内毒素浓度：Rc＝λ·D·1mL(λ＝0.125EU/mL)＝0.125×20000×1＝2500，
残余内毒素：Rs＝λ·D·1mL(λ＝0.125EU/mL)＝0.125×1×1＝0.125。
内毒素衰减实验结果：lgRd＝lgRc-lgRs＝lg2500-lg0.125＝4.301>4。我国的行业标准：内毒素衰减：lgRd＝lgRc-lgRs(我国2015版药典规定当lgRd>4或lgRd>3时，干热程序有效)。由实验结果可知：我们拟定的干热程序：250℃，90min有效(后续实验按照此程序进行除去外源性内毒素操作)。
2)灵敏度复核试验
参见实施例1，试验结果见表8。
表8鲎试剂灵敏度复核试验结果(鲎试剂灵敏度：0.5EU/mL)
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者判定为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者判定为阴性。由表8可知，当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管均为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc)，λc＝antilg(∑X/4)，其中X为反应终点浓度对数值lg，反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
根据表8实验结果进行计算：X1＝X2＝X3＝lg0.25，X4＝lg0.50。λc＝antilg(∑X/4)＝antilg(lg0.25×3+lg0.50)/4＝antilg(-0.5268)＝0.2973。0.25＝0.5λ≤λc＝0.2973≤2λ＝1.0。由实验结果可知：此批次灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂合格，可用于YE内毒素检查分析。其他灵敏度为：0.25、0.125、0.06、0.03、0.015EU/mL鲎试剂复核方法与上述方法类似。
3)FM905凝胶法干扰试验
参见实施例1，试验结果见表9。
根据《中华人民共和国药典》(2015版)细菌检查法的规定：只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。依据：Es＝antilg(∑Xs/4)＝antilg(0.5×4÷4)＝0.5λ，Et＝antilg(∑Xt/4)＝antilg(0.25×4÷4)＝0.25λ(X：为反应终点时浓度的对数值，Es为C反应终点浓度的几何平均值，Et为B反应终点浓度的几何平均值)，若符合Es在0.5λ～2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es～2Es(包括0.5Es和2Es)的规定。所以最终认为供试品在该浓度下无干扰作用。根据表9实验结果进行计算：上述实验确定批次为FM905的浓度为0.025mg/mL时该试验有效。
4)FM905凝胶半定量试验
所选鲎试剂灵敏度标示值λ＝0.125EU/mL，细菌内毒素工作标准品14EU/支。具体试验步骤如下：①浓度为2λ的内毒素标准工作品母液的制备(C组)：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL，再取25μl溶液与675μL检查用水混匀得0.5EU/mL溶液，再取0.5mL溶液与0.5ml检查用水混匀即得0.25EU/ml(2λ)母液。②供试品溶液的制备(A组)：通过干扰试验的供试品溶液。③浓度为2λ的内毒素标准工作品与供试品混合液的制备(B组溶液)：取1支细菌内毒素工作标准品，加入1mL检查用水，在漩涡混合器上混匀15min，得浓度为14EU/mL，再取25μL溶液与675μL供试品溶液混匀得0.5EU/mL溶液，再取0.5mL溶液与0.5mL供试品溶液混匀即得2λ的内毒素标准工作品与供试品混合液。④取20支鲎试剂分别加入0.1mL检查用水溶解，得每支浓度为0.5EU/mL待用。⑤每管各加入0.1mL灵敏度为0.5EU/mL的鲎试剂和相应溶液。具体稀释见试验结果表10。
表10 FM905凝胶法半定量试验结果(鲎试剂灵敏度：λ＝0.125EU/mL，FM905浓度：0.025mg/mL)
+标示阳性结果，-标示阴性结果。
根据药典细菌检查法的规定：若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。Es＝antilg(∑Xs/4)＝0.5λ。由此判定，该试验有效。求得YE供试品溶液的内毒素浓度(系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度)。
根据表10实验结果进行计算：
CE＝antilg(∑X/2)＝antilg[(lg0.125+lg0.125)/2]＝antilg(-0.9031)＝0.125EU/mL。所以，FM905浓度为0.025mg/mL时里面含有的内毒素含量为0.125EU/mL。即：FM905浸出物里所含内毒素为5EU/mg。
试验结论
通过干热程序有效性试验、灵敏度复核试验、FM905凝胶法干扰试验和FM905凝胶半定量试验，测得FM905浸出物中所含内毒素为5EU/mg，符合《中华人民共和国药典》(2015版)的限量标准。试验结果表明在无血清培养基中，适当添加酵母浸出物FM905是可行的。
安琪公司提供的FM902与FM905通过检测内毒素水平，发现其内毒素含量是一样的。
综上所述，建立的酵母浸出物中内毒素含量检测方法，该方法简便易操作，重复性好，可作为酵母浸出物中内毒素的评估方法。
Claims (10)
1. 一种酵母浸出物中内毒素含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）干热程序有效性试验
分别配制未干热内毒素系列溶液及经干热处理后的内毒素系列溶液，采用鲎试剂进行测试，计算内毒素衰减并确定具体有效的干热处理条件，在后续试验中按照前面确定的干热处理条件除去外源性内毒素；
2）灵敏度复核试验
配制待复核的鲎试剂及不同浓度的内毒素工作标准品系列溶液，然后将鲎试剂与内毒素工作标准品系列溶液分别进行混合，同时采用检查用水做阴性对照，计算鲎试剂灵敏度的测定值λc，当其结果在0.5λ~2.0λ之间，则灵敏度合格；如果不合格，需更换鲎试剂进行复核试验直至合格；
3）干扰试验
分别设置酵母浸出物供试品系列溶液、内毒素标准工作品与酵母浸出物供试品混合系列溶液、内毒素标准工作品系列溶液及检查用水阴性对照溶液，然后利用经灵敏度复核合格的鲎试剂进行测试，确保供试品在何浓度下不干扰试验；
4）凝胶半定量试验
分别设置酵母浸出物供试品系列溶液，内毒素标准工作品与酵母浸出物供试品混合溶液、内毒素标准工作品系列溶液及检查用水阴性对照溶液，再利用经灵敏度复核合格的鲎试剂进行测试，最后计算处供试品溶液的内毒素浓度；其中酵母浸出物供试品通过步骤3）中的干扰试验。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中干热处理条件：烘烤温度为220~280℃，保温时间为70~110min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：干热程序有效性试验中，所用的内毒素为内毒素指示剂，未干热内毒素系列溶液稀释的倍速在1000-50000之间；经干热处理的内毒素系列溶液的稀释倍数在1-20倍之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：未干热内毒素系列溶液稀释的倍速分别为2500、5000、10000、20000和40000；经干热处理的内毒素系列溶液的稀释倍数分别为1、2、4、6、8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中，鲎试剂灵敏度标示值λ为0.015~0.500EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度在0.1~2.0EU/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中鲎试剂灵敏度标示值λ为0.030~1.000EU/mL，内毒素标准工作品稀释后的浓度为0.1~2.0EU/mL；酵母浸出物稀释后的浓度为0.01~0.500mg/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中鲎试剂灵敏度标示值λ为0.015~0.500EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度为0.1~2.0EU/mL。
8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：鲎试剂灵敏度标示值λ为0.125EU/mL；内毒素标准工作品稀释后的浓度分别为0.250、0.500、1.000、2.000EU/mL。
9.根据权利要求1-8任意一项所述方法在酵母浸出物内毒素含量检测中的应用。
10.根据权利要求1-8任意一项所述方法在含有酵母浸出物的各种微生物、动物细胞的培养基中内毒素含量检测的应用。
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