JP4578401B2 - 固定化抗体の製造方法 - Google Patents
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Description
該方法は、抗原抗体反応に基づく不溶性担体の凝集反応を利用して、糖鎖抗原抽出液中の抗原を検出、定量する方法である。半定量的方法としてはラテックス凝集法、マイクロタイター法等が、定量的測定方法としてはラテックス定量法等がある。
該方法は、抗体と糖鎖抗原抽出液とを接触させて抗原抗体反応を行った場合に、抗原抗体反応の結果生じる凝集物の濁度の変化を検出する方法、又は抗体を固定化した薄層(以下、抗体層ともいう。)に糖鎖抗原抽出液を接触させ、抗原抗体反応の結果生じる抗体層の屈折率の変化を透過光や表面プラズモン波等の変化として検出する方法等、抗原抗体反応の有無を光学的に検出する方法のことである。
該方法は、抗体に放射性物質、酵素、各種色素類、コロイド類、各種粒子等の各種標識物質を結合させて得た標識抗体を含む測定試薬と、糖鎖抗原抽出液とを接触させて抗原抗体反応を行った後に、糖鎖抗原抽出液中の抗原に結合した標識物質の量、すなわち標識物質に由来する放射活性、酵素活性、蛍光強度、着色等を測定することによって、糖鎖抗原抽出液中の抗原を検出、定量する方法である。
(1)[菌体試料懸濁液の調製]
ブレインハートインフュージョン(以下「BHI」と略すこともある)(DIFCO社)3.7gを100mlの純水に溶解後、オートクレーブ処理し、BHI液体培地を調製した。BHI液体培地2ml中でIngbritt(ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型c)を37℃、5時間、嫌気条件下(N2:H2:CO2=80:10:10)で培養した後、培養液を4000g、5分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
免疫は以下のように実施した。即ち、第1週は0.5mlのIngbritt菌体試料懸濁液を、5日連続で5回ウサギに対し耳介静脈注射した。第2週は1.0mlの該菌体試料懸濁液を、5日連続で5回ウサギに対し耳介静脈注射した。第3週は2.0mlの該菌体試料懸濁液を、5日連続で5回ウサギに対し耳介静脈注射した。第4週は第3週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より1週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
オートクレーブ処理したBHI液体培地1L中でIngbrittを37℃、12時間、嫌気条件下で培養した。培養液を4000g、5分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を100mlのPBSに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を3回行い、沈殿物を洗浄した。
製造例1で調製した抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体を使用し、トリスとグリシンを含む10mMリン酸緩衝液からなる抗体溶液(抗体濃度0.1mg/ml)を調製した。抗体溶液中のトリスとグリシンの濃度を表1に示す。次いで、この抗体溶液(1ml)に0.5%のポリスチレンラテックス粒子(JSR社)1mlを加え、室温で1時間放置した。次いで、遠心分離により抗体の結合したラテックス粒子を単離し、0.05Mの塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸緩衝液(以下緩衝液Aとよぶ場合がある)で1回洗浄し、抗体固定化ラテックス粒子が0.5%となるように緩衝液Aで懸濁した。
0.01Mリン酸緩衝液に製造例1で調製した抗ストレプトコッカス・ミュータンス抗体を0.1mg/mlとなるように懸濁した。次いで、この抗体溶液(1ml)に0.5%のポリスチレンラテックス粒子(JSR社)1mlを加え、室温で1時間放置した。次いで2mlの2%BSA溶液を添加し、室温で1時間放置し、抗体固定化ラテックス粒子を調製した。抗体固定化ラテックス粒子の洗浄、Ingbritt菌体からの亜硝酸抽出法による糖鎖抗原の抽出、ラテックス凝集法による測定は実施例1と同様に実施した。結果を表1に示す。BSAでブロッキングを行うと、感度が低下した。
10mMトリス共存下でグリシンの代わりに表2に示す非極性アミノ酸を使用した以外は実施例1と同様の方法によりストレプトコッカス・ミュータンスの測定を行った。結果を表2に示す。
Claims (2)
- 糖鎖抗原を微生物より亜硝酸抽出法によって抽出した糖鎖抗原抽出液中の糖鎖抗原量を免疫学的方法により測定するに際して使用する固定化抗体の製造方法であって、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンと非極性アミノ酸の共存下に、上記糖鎖抗原に対応した抗体と固定化用担体とを接触させることを特徴とする、固定化抗体の製造方法。
- 非極性アミノ酸がグリシンであることを特徴とする請求項1記載の固定化抗体の製造方法。
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