JPS63222265A - リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法 - Google Patents
リポ多糖類の非免疫化学的結合およびそのサンドイッチ法による分析方法Info
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は特異的な結合アッセイの分野そして詳細にはダ
ラム陰性細菌のリポ多糖類(以下LPSと略記する)を
検出するためのサンドイッチアッセイ、および生物医学
的または化粧用途用物質からのLPSの除去に関する。
ラム陰性細菌のリポ多糖類(以下LPSと略記する)を
検出するためのサンドイッチアッセイ、および生物医学
的または化粧用途用物質からのLPSの除去に関する。
ダラム陰性細菌、およびいくつかの原生動物はリポ多糖
類(LPS)と呼ばれる細胞表面糖脂質物質を産生ずる
ことが知られている。リポ多糖類はヒト組織の成分でも
グラム陽性細菌の成分でもない。従ってこのものはダラ
ム陰性細菌および少数の病原性原生動物に特異的なマー
カーである。
類(LPS)と呼ばれる細胞表面糖脂質物質を産生ずる
ことが知られている。リポ多糖類はヒト組織の成分でも
グラム陽性細菌の成分でもない。従ってこのものはダラ
ム陰性細菌および少数の病原性原生動物に特異的なマー
カーである。
さらに、細胞1個当り100万分子の概算でこのものは
ダラム陰性細菌の細胞表面上に最も豊富にある成分であ
る。すべてのリポ多糖類は2種の機能的に区別される構
造領域を有する。1つは「脂質A」と呼ばれる脂肪性部
分そしてもう1つは少くて3個、そして多くて350個
まで、時にはそれ以上の糖残基を含有する炭水化物区分
である。
ダラム陰性細菌の細胞表面上に最も豊富にある成分であ
る。すべてのリポ多糖類は2種の機能的に区別される構
造領域を有する。1つは「脂質A」と呼ばれる脂肪性部
分そしてもう1つは少くて3個、そして多くて350個
まで、時にはそれ以上の糖残基を含有する炭水化物区分
である。
LPSの炭水化物部分はそれ自体2種の構造部分に分け
られうる。1つは個々の属のすべての構成員が共通して
有する、一般的に8〜11個の糖残基からなるコア、そ
してもう1つは特定の種または特定の種の個々の抗原性
サブ群に独特の〇−側鎖である。LPS上の大多数の抗
原部位は前記コアの炭水化物および〇−側鎖中に存在す
る。
られうる。1つは個々の属のすべての構成員が共通して
有する、一般的に8〜11個の糖残基からなるコア、そ
してもう1つは特定の種または特定の種の個々の抗原性
サブ群に独特の〇−側鎖である。LPS上の大多数の抗
原部位は前記コアの炭水化物および〇−側鎖中に存在す
る。
LPS構造のそれぞれの部分に特異的な抗体が開発され
た。サルモネラ(Salmonella) L P S
のコア領域に特異的な抗体はそれの超厚である種に関わ
りなくサルモネラLPSと反応しようが、種々のエシェ
リヒア(Eschcrlchla)種のような他の細菌
からのLPSとは反応しないであろう。サルモネラの個
々の種の〇−側鎖に特異的な抗体はその種の構成員との
みしか反応せず、サルモネラの他の種または他のダラム
陰性細菌からのLPSとは反応しない°であろう。
た。サルモネラ(Salmonella) L P S
のコア領域に特異的な抗体はそれの超厚である種に関わ
りなくサルモネラLPSと反応しようが、種々のエシェ
リヒア(Eschcrlchla)種のような他の細菌
からのLPSとは反応しないであろう。サルモネラの個
々の種の〇−側鎖に特異的な抗体はその種の構成員との
みしか反応せず、サルモネラの他の種または他のダラム
陰性細菌からのLPSとは反応しない°であろう。
LPSの脂質A部分はLPSの生理学的活性の大多数を
有している。脂質Aのかかる活性の2種が臨床的に特に
重要である。それらは熱を誘発しうる能力(発熱原性)
および全身的な血管崩壊(敗血症性または内毒素性ショ
ック)を誘発しうる能力である。治療における改良によ
り多くのショック罹患者の予後が良くなってきているが
、内毒素ショックの罹患者はなお死亡率が70〜80%
である(Roblns、 Cotran、 rPat
hologie Ba5isof DiscaseJ
W、 B、 5aunders Co、製米国Ph1
ladelphia、 PA、 140 (1979)
) 、脂質Aは内毒素ショックの強力な誘発物質である
。ヒトの臨床的な症候は代表的には血液1ml当りLP
S中の脂質A3〜4pgなる低いレベルからでも生ずる
(Elin氏他−rBacterlal Endoto
xins :5tructure 、 131omed
lcal 51gn1f’1cance、 andDe
tection with the Llmulus
Aiebocyte LysateTestJ 、
Cate氏他編、 Alan R,Li5s、 Inc
、、 NewYork、 307−324 (1985
)) 、 リムルス(Llmulus)変形細胞(アメ
ーバ細胞)溶解物試験についての論議は以下の記載を参
照されたい。かくの如く、LPSの構造は抗原分析およ
び細菌同定によく適した炭水化物領域、および抗原性は
乏しいが強力な生理学的活性を有する高度に保存された
脂質A区分を有すると総括されうる。
有している。脂質Aのかかる活性の2種が臨床的に特に
重要である。それらは熱を誘発しうる能力(発熱原性)
および全身的な血管崩壊(敗血症性または内毒素性ショ
ック)を誘発しうる能力である。治療における改良によ
り多くのショック罹患者の予後が良くなってきているが
、内毒素ショックの罹患者はなお死亡率が70〜80%
である(Roblns、 Cotran、 rPat
hologie Ba5isof DiscaseJ
W、 B、 5aunders Co、製米国Ph1
ladelphia、 PA、 140 (1979)
) 、脂質Aは内毒素ショックの強力な誘発物質である
。ヒトの臨床的な症候は代表的には血液1ml当りLP
S中の脂質A3〜4pgなる低いレベルからでも生ずる
(Elin氏他−rBacterlal Endoto
xins :5tructure 、 131omed
lcal 51gn1f’1cance、 andDe
tection with the Llmulus
Aiebocyte LysateTestJ 、
Cate氏他編、 Alan R,Li5s、 Inc
、、 NewYork、 307−324 (1985
)) 、 リムルス(Llmulus)変形細胞(アメ
ーバ細胞)溶解物試験についての論議は以下の記載を参
照されたい。かくの如く、LPSの構造は抗原分析およ
び細菌同定によく適した炭水化物領域、および抗原性は
乏しいが強力な生理学的活性を有する高度に保存された
脂質A区分を有すると総括されうる。
内毒素ショックに加え、ダラム陰性細菌はしばしば髄膜
炎、***、嫌気性膿瘍、尿道炎、食物中毒、および
その他のヒトまたは動物の病気の原因物である。これら
状態のすべてにとって、それ以上の感染の拡大を抑制し
そして適正な治療を確保せんがためには正確で好時機的
な診断を下す必要がある。一般に、患者から採取した検
体は最終的な診断が下されうるまでに18〜120時間
培養される必要がある。しばしば、医師は培養結果が出
るのを待たずに患者の治療を開始せねばならない。治療
開始と培養結果を受取るまでの間にこのような遅延が存
在するということは、培養結果は仮定した診断を確認す
るかまたは異論を出すのに役立ちはするが、しかし当初
の患者治療の選択には影響しないことを意味する。医師
の医療過誤保険の費用の高さ、および政府の診断関連団
体(DRGS)により課せられる費用抑制策により、医
療現場に対し不必要なそして有害な可能性もある薬剤で
の治療を排除するような圧力が高くなっている。かくの
如く、感度が良く、特異的で、そして治療剤の初期選択
決定を補助することになろう時間の枠内で、診断を下す
ための情報を提供しつる試験が必要とされる。主要な要
求はダラム陰性細菌により産生されたLPSの存在を検
出することおよび続く属/8の同定であろう。
炎、***、嫌気性膿瘍、尿道炎、食物中毒、および
その他のヒトまたは動物の病気の原因物である。これら
状態のすべてにとって、それ以上の感染の拡大を抑制し
そして適正な治療を確保せんがためには正確で好時機的
な診断を下す必要がある。一般に、患者から採取した検
体は最終的な診断が下されうるまでに18〜120時間
培養される必要がある。しばしば、医師は培養結果が出
るのを待たずに患者の治療を開始せねばならない。治療
開始と培養結果を受取るまでの間にこのような遅延が存
在するということは、培養結果は仮定した診断を確認す
るかまたは異論を出すのに役立ちはするが、しかし当初
の患者治療の選択には影響しないことを意味する。医師
の医療過誤保険の費用の高さ、および政府の診断関連団
体(DRGS)により課せられる費用抑制策により、医
療現場に対し不必要なそして有害な可能性もある薬剤で
の治療を排除するような圧力が高くなっている。かくの
如く、感度が良く、特異的で、そして治療剤の初期選択
決定を補助することになろう時間の枠内で、診断を下す
ための情報を提供しつる試験が必要とされる。主要な要
求はダラム陰性細菌により産生されたLPSの存在を検
出することおよび続く属/8の同定であろう。
この要求に合致する一つの方法は臨床的な検体中の抗原
を検出するためのイムノアッセイを開発することであっ
た。理想的には、脂質Aの構造は高度に保存されている
ゆえに脂質Aに対する抗体を利用することが希望される
であろうが、イムノアッセイに使用できるに充分に高い
親和性および交差反応性を有する抗体は何ら見出されて
いない。
を検出するためのイムノアッセイを開発することであっ
た。理想的には、脂質Aの構造は高度に保存されている
ゆえに脂質Aに対する抗体を利用することが希望される
であろうが、イムノアッセイに使用できるに充分に高い
親和性および交差反応性を有する抗体は何ら見出されて
いない。
炭水化物〇−側鎖は抗原部位のコピーを多く含有してお
りそれゆえ多くの抗体分子を結合できる。
りそれゆえ多くの抗体分子を結合できる。
このことによりサンドイッチ イムノアッセイにおける
これら抗原の捕捉および検出が容易かつ非常に高感度と
なる。しかしながら、〇−側鎖はそれらが微生物種の中
でも極端に抗原的に異種性であるのでそれらの有用性が
制限される。内部コアの炭水化物はそれらの構造がより
保存されているのでより有用性が大きいかも知れないが
、一般的にそのコア構造は1個の抗体を結合できるのみ
であってサンドイッチ イムノアッセイは実質上不可能
である。
これら抗原の捕捉および検出が容易かつ非常に高感度と
なる。しかしながら、〇−側鎖はそれらが微生物種の中
でも極端に抗原的に異種性であるのでそれらの有用性が
制限される。内部コアの炭水化物はそれらの構造がより
保存されているのでより有用性が大きいかも知れないが
、一般的にそのコア構造は1個の抗体を結合できるのみ
であってサンドイッチ イムノアッセイは実質上不可能
である。
内毒素(LPS)汚染を監視するための最も古い試験の
一つはウサギ発熱誘発力試験である。試験すべき物質の
検体を連続希釈しそして各希釈物の一部分をウサギに注
射する。次にウサギの体温を監視する。ウサギの体温が
上昇したら、その検体は汚染されていると考えられる。
一つはウサギ発熱誘発力試験である。試験すべき物質の
検体を連続希釈しそして各希釈物の一部分をウサギに注
射する。次にウサギの体温を監視する。ウサギの体温が
上昇したら、その検体は汚染されていると考えられる。
LPS汚染の量の概算はウサギで何ら有量な体温上昇が
観察されない希釈度の逆数として得られる。このアッセ
イは不正確で、多数の動物を必要とし、そして診断操作
としてはあまり有用性がない、何故ならこれはLPSま
たはLPSの起源である細菌の性質に関する情報を何ら
提供しないからである。工業的製造者にとってルーチン
に実施するには高価でもあり、そして液体1ml当りL
PSの検出限界1100nにも達する。
観察されない希釈度の逆数として得られる。このアッセ
イは不正確で、多数の動物を必要とし、そして診断操作
としてはあまり有用性がない、何故ならこれはLPSま
たはLPSの起源である細菌の性質に関する情報を何ら
提供しないからである。工業的製造者にとってルーチン
に実施するには高価でもあり、そして液体1ml当りL
PSの検出限界1100nにも達する。
LPSの存在に関する迅速かつ高感度の試験はLcvl
nおよびBang氏の業績に基づくリムルス変形細胞溶
解物(LAL)試験である(Ta1氏他。
nおよびBang氏の業績に基づくリムルス変形細胞溶
解物(LAL)試験である(Ta1氏他。
rJ、 Biol、 Chem、J 252.217
8−2181 (1977))。
8−2181 (1977))。
カブトガニ〔リムルス・ポリフェムス(Lln+ulu
spolyphemus) )はダラム陰性細菌に対し
て原始的ではあるがしかし効果的な防御を育する。侵入
する細菌のLPSが一連の反応を刺激し、それにより浸
入者の囲りに凝血が形成される。この凝血を形成させる
のに必要な酵素および凝固誘発タンパり質はカブトガニ
の血液中を循環している変形細胞の細胞内顆粒中に存在
している。これらの変形細胞を遠心分離により血液から
分離し、洗浄しそして溶解させると、生成物は透明で液
体状の細胞溶解物である。LAL試験においては、この
細胞溶解物をピコグラム量のLPSに露出した場合です
らもそのものは混濁してゼラチン状凝血塊を形成する。
spolyphemus) )はダラム陰性細菌に対し
て原始的ではあるがしかし効果的な防御を育する。侵入
する細菌のLPSが一連の反応を刺激し、それにより浸
入者の囲りに凝血が形成される。この凝血を形成させる
のに必要な酵素および凝固誘発タンパり質はカブトガニ
の血液中を循環している変形細胞の細胞内顆粒中に存在
している。これらの変形細胞を遠心分離により血液から
分離し、洗浄しそして溶解させると、生成物は透明で液
体状の細胞溶解物である。LAL試験においては、この
細胞溶解物をピコグラム量のLPSに露出した場合です
らもそのものは混濁してゼラチン状凝血塊を形成する。
前記LAL試験の改良物はLAL色原体アッセイである
。このアッセイは、LAL試験におけるゲル化がセリン
プロテアーゼのカスケードの作用の結果であるという事
実に基づくものである。これらプロテアーゼは、哺乳動
物血液凝固酵素の監視に使用されるような色原体基質を
反応混合物に添加しそして色の生成を観察することによ
り非−LAL凝固試験フォーマットで直接監視されうる
。
。このアッセイは、LAL試験におけるゲル化がセリン
プロテアーゼのカスケードの作用の結果であるという事
実に基づくものである。これらプロテアーゼは、哺乳動
物血液凝固酵素の監視に使用されるような色原体基質を
反応混合物に添加しそして色の生成を観察することによ
り非−LAL凝固試験フォーマットで直接監視されうる
。
一般に、このアッセイはLAL凝固試験より高い感度を
示しそしてヒトの観察者よりむしろ分析器具を用いて監
視されうる。
示しそしてヒトの観察者よりむしろ分析器具を用いて監
視されうる。
LALに基づく前記の2種の試験はいずれもLPSに対
して、そしてLPSに対してのみ、それゆえダラム陰性
細菌の存在に対して極度に感度が高いが、LPSまたは
そのLPSが由来する細菌の性質に関する情報は何ら提
供しない。事実、リムルス変形細胞溶解物のLPSに対
する異例に高い感度ゆえにLAL試験におけるその有用
性は問題のLPSを含有する検体、または任意のLPS
の存在のみが関心がある検体に限定される。
して、そしてLPSに対してのみ、それゆえダラム陰性
細菌の存在に対して極度に感度が高いが、LPSまたは
そのLPSが由来する細菌の性質に関する情報は何ら提
供しない。事実、リムルス変形細胞溶解物のLPSに対
する異例に高い感度ゆえにLAL試験におけるその有用
性は問題のLPSを含有する検体、または任意のLPS
の存在のみが関心がある検体に限定される。
多くの臨床的な試料、例えば、のどまたは直腸の綿棒標
本では、共生ダラム陰性細菌が存在しようから、それゆ
え陽性リムルス溶解物試験が必ずしも病原体の存在を示
すものではなかろう。さらに、リムルス溶解物試験はセ
リンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ阻害剤のい
ずれかを含有するすべての検体、例えば血小板集合およ
び血液凝固が包含される検体には実施できない、何故な
らかかる酵素は凝血塊生成を妨害するからである。
本では、共生ダラム陰性細菌が存在しようから、それゆ
え陽性リムルス溶解物試験が必ずしも病原体の存在を示
すものではなかろう。さらに、リムルス溶解物試験はセ
リンプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼ阻害剤のい
ずれかを含有するすべての検体、例えば血小板集合およ
び血液凝固が包含される検体には実施できない、何故な
らかかる酵素は凝血塊生成を妨害するからである。
商業的に入手しうる酵素製剤が内毒素で汚染されている
か否かを判定する研究において、13ryant氏他C
rJ、 Cl1n、 Mlcroblol、 J 1
7゜1050 (1988) )はリムルス変形細胞溶
解物のミクロ滴定プレートへの固定について報告してい
る。
か否かを判定する研究において、13ryant氏他C
rJ、 Cl1n、 Mlcroblol、 J 1
7゜1050 (1988) )はリムルス変形細胞溶
解物のミクロ滴定プレートへの固定について報告してい
る。
前記溶解物はpH9,8の標準的な炭酸塩−重炭酸塩緩
衝液を用いてポリスチレン ウェルに吸着させることに
より固定された。この著者らはもし酵素力L A L−
被覆ウェル中に保持されるが、ブランクの非被覆ウェル
中には保持されないならば、その保持は検体中に存在す
るLPS汚染と酵素との間に形成された複合物の捕捉の
結果のみでありうると推定した。酵素は事実保持されて
いることが判明し、そして著者らはLPSによる汚染を
推定した。
衝液を用いてポリスチレン ウェルに吸着させることに
より固定された。この著者らはもし酵素力L A L−
被覆ウェル中に保持されるが、ブランクの非被覆ウェル
中には保持されないならば、その保持は検体中に存在す
るLPS汚染と酵素との間に形成された複合物の捕捉の
結果のみでありうると推定した。酵素は事実保持されて
いることが判明し、そして著者らはLPSによる汚染を
推定した。
LPS結合性タンパク質はまたタキプレウス争トリデン
タツス(Tachyplaus tridentatu
s)、タキブレウスーギガス(Tachypleus
glgas) 。
タツス(Tachyplaus tridentatu
s)、タキブレウスーギガス(Tachypleus
glgas) 。
およびカルシノスコルビウス・ロッンジヵウダ(Car
cinoscorplus rotundicauda
)の血液中に存在する変形細胞から単離されることも知
られている。これら変形細胞からの溶解物はリムルス変
形細胞溶解物にとって代わることができる( Naka
mura氏他、 rBiochemica et B
iophysicaActaJ 、 707. 2
17−225 (1982) ) 。
cinoscorplus rotundicauda
)の血液中に存在する変形細胞から単離されることも知
られている。これら変形細胞からの溶解物はリムルス変
形細胞溶解物にとって代わることができる( Naka
mura氏他、 rBiochemica et B
iophysicaActaJ 、 707. 2
17−225 (1982) ) 。
環境中にダラム陰性細菌が遍く存在することは生物医学
的供給物および化粧品の製造業者にとっては挑戦を受け
ることでもある。LPS汚染の影響力および臨床上の重
要性ゆえに、かかる生成物はLPS不含であることを保
証されることが必要となる。この必要性ゆえに、内毒素
検出のための速やかで、信頼できて、かつ高価でないア
ッセイに対する要求が生じた。また、汚染された生成物
からLPSを除去する必要も存在している。
的供給物および化粧品の製造業者にとっては挑戦を受け
ることでもある。LPS汚染の影響力および臨床上の重
要性ゆえに、かかる生成物はLPS不含であることを保
証されることが必要となる。この必要性ゆえに、内毒素
検出のための速やかで、信頼できて、かつ高価でないア
ッセイに対する要求が生じた。また、汚染された生成物
からLPSを除去する必要も存在している。
本発明のリポ多糖類検出のためのサンドイッチアッセイ
は下記工程からなる、すなわち、(A) 捕捉試薬を
固定させて、実質的にI)水不溶性支持体、および 11)該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 (B) リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、 (C) 工程(B)で形成された活性支持体−リポ多
糖類複合物を標識された検出試薬と接触させ、そして (D) 結合されたかまたは結合されてない標識のい
ずれかを検出する。
は下記工程からなる、すなわち、(A) 捕捉試薬を
固定させて、実質的にI)水不溶性支持体、および 11)該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 (B) リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、 (C) 工程(B)で形成された活性支持体−リポ多
糖類複合物を標識された検出試薬と接触させ、そして (D) 結合されたかまたは結合されてない標識のい
ずれかを検出する。
検体からリポ多糖類を除去するための本発明による方法
は下記工程からなる、すなわち、(A) 捕捉試薬を
固定させて、実質的にi)水不溶性支持体、および 11)該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 (B) リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、そして (C) 活性支持体に結合されたLPSを検体から分
離する。
は下記工程からなる、すなわち、(A) 捕捉試薬を
固定させて、実質的にi)水不溶性支持体、および 11)該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 (B) リポ多糖類を含有するかまたは含有すること
が疑われる検体を前記活性支持体と接触させ、そして (C) 活性支持体に結合されたLPSを検体から分
離する。
リポ多糖類結合性タンパク質の支持体への結合は、その
LPS結合性タンパク質を約9.0より低いpl+で固
形支持体に吸着させることにより行われる。
LPS結合性タンパク質を約9.0より低いpl+で固
形支持体に吸着させることにより行われる。
本発明は、リムルス変形細胞溶解物(L A L)のよ
うな捕捉試薬が固形支持体上に固定されると、LALが
なおLPSを結合しうるのみならず結合されたLPSも
抗原的に完全無欠でなお抗体に接近しうるという驚くべ
き発見を利用するものである。このことはリムルスおよ
びタキプレウス変形細胞溶解物中に見出される成分のL
PSに対する幅広い反応性が一般的なLPSの捕捉およ
び固定手段として使用されうろことを意味する。これに
よりLPSの存在の検出も抗原分析も可能となる。
うな捕捉試薬が固形支持体上に固定されると、LALが
なおLPSを結合しうるのみならず結合されたLPSも
抗原的に完全無欠でなお抗体に接近しうるという驚くべ
き発見を利用するものである。このことはリムルスおよ
びタキプレウス変形細胞溶解物中に見出される成分のL
PSに対する幅広い反応性が一般的なLPSの捕捉およ
び固定手段として使用されうろことを意味する。これに
よりLPSの存在の検出も抗原分析も可能となる。
本発明方法はその種類にかかわりなくすべての種類のL
PSの存在を検出することが重要である場合に多くの異
なる種類のLPSを捕捉することができる。さらに、本
発明方法は病原性ダラム陰性細菌からの特定のLPS種
を検出および特異的に同定する能力を維持しつつ、一方
で関係のないかまたは共生する細菌からのLPSを無視
する必要がある分析検体において特に有用である。まだ
さらに、本発明はセリンプロテアーゼによってもセリン
プロテアーゼ阻害剤によっても影響されず、かかる検体
で使用されつる。また、本発明方法では30分内で病原
体について細菌特異性の確認が得られつる。これは医師
が初期治療剤を選択するに際し、それを補助するために
好時機的に与えられる重要な情報であると言えよう。
PSの存在を検出することが重要である場合に多くの異
なる種類のLPSを捕捉することができる。さらに、本
発明方法は病原性ダラム陰性細菌からの特定のLPS種
を検出および特異的に同定する能力を維持しつつ、一方
で関係のないかまたは共生する細菌からのLPSを無視
する必要がある分析検体において特に有用である。まだ
さらに、本発明はセリンプロテアーゼによってもセリン
プロテアーゼ阻害剤によっても影響されず、かかる検体
で使用されつる。また、本発明方法では30分内で病原
体について細菌特異性の確認が得られつる。これは医師
が初期治療剤を選択するに際し、それを補助するために
好時機的に与えられる重要な情報であると言えよう。
リムルス・ポリフェムス(Llsulus polyp
hemus)、タキプレウスやトリデンタッス、カルシ
ノスコルピウス・ロツンジカウダおよびタキブレウス会
ギガスのような種々の細菌から得られるリポ多糖類(L
PS)結合性タンパク質がLPSを固形支持体に結合さ
せるための特異的な、非免疫学的捕捉試薬として使用さ
れうる。これらの捕捉試薬はこれら微生物からの変形細
胞の溶解物の形態であるかまたはかかる溶解物から得ら
れる特異的なタンパク質であることができる。C因子お
よび抗LPS因子が好ましいと予想される。これらは特
異的なLPS結合活性を有すると現在認められている溶
解物内の2種のタンパク質である。支持体のLPS結合
容量および特異的な活性は精製されたLPS結合性タン
パク質を用いることにより増大させることができる。あ
るいはまた、純粋なLPS結合性タンパク質は組み換え
DNA技術を用いて製造することもできる。
hemus)、タキプレウスやトリデンタッス、カルシ
ノスコルピウス・ロツンジカウダおよびタキブレウス会
ギガスのような種々の細菌から得られるリポ多糖類(L
PS)結合性タンパク質がLPSを固形支持体に結合さ
せるための特異的な、非免疫学的捕捉試薬として使用さ
れうる。これらの捕捉試薬はこれら微生物からの変形細
胞の溶解物の形態であるかまたはかかる溶解物から得ら
れる特異的なタンパク質であることができる。C因子お
よび抗LPS因子が好ましいと予想される。これらは特
異的なLPS結合活性を有すると現在認められている溶
解物内の2種のタンパク質である。支持体のLPS結合
容量および特異的な活性は精製されたLPS結合性タン
パク質を用いることにより増大させることができる。あ
るいはまた、純粋なLPS結合性タンパク質は組み換え
DNA技術を用いて製造することもできる。
本発明方法で用いられつる支持体は多くの形態をとるこ
とができ、そして多くの異なる材料を用いて構成されう
る。好ましい支持体は一般に固形であり、最も好ましく
はポリスチレンのような重合体物質である。支持体の形
状は限定的でなく、一般に意図される適用により決定さ
れよう。支持体の表面積もアッセイ性能に影響しうる。
とができ、そして多くの異なる材料を用いて構成されう
る。好ましい支持体は一般に固形であり、最も好ましく
はポリスチレンのような重合体物質である。支持体の形
状は限定的でなく、一般に意図される適用により決定さ
れよう。支持体の表面積もアッセイ性能に影響しうる。
支持体は多孔質または非多孔質であることができる。支
持体のいくつかの好都合な形態をあげればミクロ滴定プ
レートのウェル、小球、およびミクロン以下の寸法をし
た不規則な粒子である。
持体のいくつかの好都合な形態をあげればミクロ滴定プ
レートのウェル、小球、およびミクロン以下の寸法をし
た不規則な粒子である。
LPS結合性タンパク質は多数の方法で支持体に結合さ
れつる。論議のためには、LPS結合性タンパク質が結
合される支持体は活性支持体と呼ばれる。結合性タンパ
ク質を支持体表面に吸着させるのが一般的に好ましいが
、共有結合も用いら゛ れうる。グルタルアルデヒドの
ようなホモ2官能性試薬、またはへテロ2官能性試薬が
使用されうる。選択される結合の様式に関係なく、結合
操作に使用される緩衝液のpHは約9より下、好ましく
は約8より下、そして最も好ましくは7付近に維持され
るべきである。中性付近の[)H値を有する緩衝液が好
ましい、何故ならそれより高いpH値を有する緩衝液は
LPS結合性タンパク質の実質上すべてのLPS結合活
性を破壊するからである。このことは、結合がpH9,
8で完成されると報告されているBryant氏他の前
記文献中の報告を正に対照的である。ミクロ滴定プレー
トのウェルをp)17.4のPBSまたはpH9,8の
炭酸塩中のLALで被覆し次に室温で2時間インキュベ
ーションした。
れつる。論議のためには、LPS結合性タンパク質が結
合される支持体は活性支持体と呼ばれる。結合性タンパ
ク質を支持体表面に吸着させるのが一般的に好ましいが
、共有結合も用いら゛ れうる。グルタルアルデヒドの
ようなホモ2官能性試薬、またはへテロ2官能性試薬が
使用されうる。選択される結合の様式に関係なく、結合
操作に使用される緩衝液のpHは約9より下、好ましく
は約8より下、そして最も好ましくは7付近に維持され
るべきである。中性付近の[)H値を有する緩衝液が好
ましい、何故ならそれより高いpH値を有する緩衝液は
LPS結合性タンパク質の実質上すべてのLPS結合活
性を破壊するからである。このことは、結合がpH9,
8で完成されると報告されているBryant氏他の前
記文献中の報告を正に対照的である。ミクロ滴定プレー
トのウェルをp)17.4のPBSまたはpH9,8の
炭酸塩中のLALで被覆し次に室温で2時間インキュベ
ーションした。
被覆用緩衝液のpHにおける相違以外は、すべてのウェ
ルをアッセイにおいて同一の方法で淋菌(Neisse
rla gonorrhoeae)細胞およびモノクロ
ーナル抗体−酵素接合体で処理した。pH7,4のPB
S中のLALのみを含有するウェルは630nwで0.
110±0.014に相当する背景光学濃度(OD)を
示しこれに対しアッセイ試験用ウェルの630nmでの
ODは0.438±0.017であった(シグナル対ノ
イズ比4,0)。これに対し、pH9,8の炭酸塩緩衝
液中のLALのみを含有するウェルは630nmで0.
118±0.013に相当する背景ODを示しこれに対
しアッセイ試験用ウェルは630nmで0.123土0
.020なるODを示した(シグナル対ノイズ比−1,
0)。これらの結果は、本発明のサンドイッチアッセイ
ではpl!約9またはそれ以下の活性支持体製造用緩衝
液を用いなければならないことを示している。
ルをアッセイにおいて同一の方法で淋菌(Neisse
rla gonorrhoeae)細胞およびモノクロ
ーナル抗体−酵素接合体で処理した。pH7,4のPB
S中のLALのみを含有するウェルは630nwで0.
110±0.014に相当する背景光学濃度(OD)を
示しこれに対しアッセイ試験用ウェルの630nmでの
ODは0.438±0.017であった(シグナル対ノ
イズ比4,0)。これに対し、pH9,8の炭酸塩緩衝
液中のLALのみを含有するウェルは630nmで0.
118±0.013に相当する背景ODを示しこれに対
しアッセイ試験用ウェルは630nmで0.123土0
.020なるODを示した(シグナル対ノイズ比−1,
0)。これらの結果は、本発明のサンドイッチアッセイ
ではpl!約9またはそれ以下の活性支持体製造用緩衝
液を用いなければならないことを示している。
緩衝液を含めたすべての試薬、および結合性タンパク質
を支持体に結合させる際に用いられる装置が実質的に挟
雑LPSを含有しないことが重要である。このことは粗
製溶解物が固形支持体に結合される場合は特に重要であ
る。少量のLPS汚染はLPS結合性タンパク質が固定
された後では受容されうる、何故なら試薬の凝固はもは
や問題ではないからである。それにも関わらずLPS汚
染は回避されるべきである。結合および洗浄工程中に導
入された外部LPSが活性支持体の結合容量を低下させ
うるし、またもし挟雑LPSが標識された検出試薬と反
応しうる場合は誤った陽性結果を惹起しうる。LPSア
ッセイに使用される試薬がLPSを含有しないことを保
証するには、パイロジエン不含の水として得られつるか
または既知方法により精製されうるLPS不含水を使用
する必要がある。水および試薬がLPSを含有しないこ
とを保証するためにそれらをLAL凝固アッセイで周期
的に検査することが賢明であると考えられる。
を支持体に結合させる際に用いられる装置が実質的に挟
雑LPSを含有しないことが重要である。このことは粗
製溶解物が固形支持体に結合される場合は特に重要であ
る。少量のLPS汚染はLPS結合性タンパク質が固定
された後では受容されうる、何故なら試薬の凝固はもは
や問題ではないからである。それにも関わらずLPS汚
染は回避されるべきである。結合および洗浄工程中に導
入された外部LPSが活性支持体の結合容量を低下させ
うるし、またもし挟雑LPSが標識された検出試薬と反
応しうる場合は誤った陽性結果を惹起しうる。LPSア
ッセイに使用される試薬がLPSを含有しないことを保
証するには、パイロジエン不含の水として得られつるか
または既知方法により精製されうるLPS不含水を使用
する必要がある。水および試薬がLPSを含有しないこ
とを保証するためにそれらをLAL凝固アッセイで周期
的に検査することが賢明であると考えられる。
緩衝液および試薬が実質的に界面活性剤を含有しないこ
とも重要である。ポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレート、ポリエチレン グリコールp−インオクチ
ルフェニルエーテルおよびデオキシコリートのような界
面活性剤は固定された変形細胞溶解物への高レベルの非
特異的結合を阻止するのでではなく惹起することが見出
された。ミクロ滴定プレートウェルをPBS中のL A
L (238g/ ml ) 100μQで被覆し
た。4個のウェルをPBSで洗いそして他の4個のウェ
ルをP B S +0.05%ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートで洗った。固定されたLALとは
何らLPSも細菌細胞もインキュベーションしなかった
。抗−淋菌LPS−特異的特異クモツクローナル抗体接
合体をウェル中でインキュベートしそしてウェルをPB
Sを用いてまたはポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレートを含有するPBSを用いて洗った。基質を添
加しそして630nmでのODを測定した。PBSで洗
ったウェルはOD−0,093±o)ooeであったが
界面活性剤含有PBSで洗ったウェルはOD−0,85
3±0.042を示した。これはシグナル対ノイズ比7
.0であった。
とも重要である。ポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレート、ポリエチレン グリコールp−インオクチ
ルフェニルエーテルおよびデオキシコリートのような界
面活性剤は固定された変形細胞溶解物への高レベルの非
特異的結合を阻止するのでではなく惹起することが見出
された。ミクロ滴定プレートウェルをPBS中のL A
L (238g/ ml ) 100μQで被覆し
た。4個のウェルをPBSで洗いそして他の4個のウェ
ルをP B S +0.05%ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートで洗った。固定されたLALとは
何らLPSも細菌細胞もインキュベーションしなかった
。抗−淋菌LPS−特異的特異クモツクローナル抗体接
合体をウェル中でインキュベートしそしてウェルをPB
Sを用いてまたはポリオキシエチレンソルビタン モノ
ラウレートを含有するPBSを用いて洗った。基質を添
加しそして630nmでのODを測定した。PBSで洗
ったウェルはOD−0,093±o)ooeであったが
界面活性剤含有PBSで洗ったウェルはOD−0,85
3±0.042を示した。これはシグナル対ノイズ比7
.0であった。
この結果は、界面活性剤含有PBS中における淋菌の不
顕性生育に続く特異的な抗体相互作用のせいではありえ
ない、何故なら淋菌は人体内または特別に配合された生
育培地上でのみ生育しうる偏性のヒト病原体だからであ
る。これらのデータは、LPS結合性タンパク質の支持
体への吸着に高いpHを有する緩衝液が使用されても、
Bryant氏他がなぜ明らかな結合活性の保持を観察
したかを示すものと考えられる。
顕性生育に続く特異的な抗体相互作用のせいではありえ
ない、何故なら淋菌は人体内または特別に配合された生
育培地上でのみ生育しうる偏性のヒト病原体だからであ
る。これらのデータは、LPS結合性タンパク質の支持
体への吸着に高いpHを有する緩衝液が使用されても、
Bryant氏他がなぜ明らかな結合活性の保持を観察
したかを示すものと考えられる。
LPS結合性タンパク質が支持体表面に結合したのち、
支持体上の余分のタンパク質結合性部位は、それが存在
するとすれば、支持体への検出試薬の非特異的結合を避
けるために遮蔽されなければならない。これは活性支持
体をカゼインまたはウシ血清アルブミン(以下BSAと
略記する)溶液とインキュベートすることにより達成さ
れつる。
支持体上の余分のタンパク質結合性部位は、それが存在
するとすれば、支持体への検出試薬の非特異的結合を避
けるために遮蔽されなければならない。これは活性支持
体をカゼインまたはウシ血清アルブミン(以下BSAと
略記する)溶液とインキュベートすることにより達成さ
れつる。
標識された検出試薬を妨害しないために、選択されたB
SAを他のタンパク質で代えることができる。
SAを他のタンパク質で代えることができる。
活性支持体調製が完了したのち、このものをLPSを含
有することが疑われる試験検体と接触させる。この試験
検体は前記したLALアッセイのいずれかによって現在
アッセイされるどの物質でもよい。さらに、検体は動物
またはヒト超厚の生理学的液体、組織または排出物であ
ることもできる。検体は周囲温度から上の広い温度範囲
で活性支持体と接触でき、37℃が好ましい。検体は検
体からの実質上すべてのLPSの捕捉が確保されるに充
分な時間、活性支持体上の固定された捕捉試薬と接触し
ていなければならない。この期間は。
有することが疑われる試験検体と接触させる。この試験
検体は前記したLALアッセイのいずれかによって現在
アッセイされるどの物質でもよい。さらに、検体は動物
またはヒト超厚の生理学的液体、組織または排出物であ
ることもできる。検体は周囲温度から上の広い温度範囲
で活性支持体と接触でき、37℃が好ましい。検体は検
体からの実質上すべてのLPSの捕捉が確保されるに充
分な時間、活性支持体上の固定された捕捉試薬と接触し
ていなければならない。この期間は。
支持体の寸法、形状および性質ならびに用いられる温度
の如何によろう。周囲温度においては、必要な時間は約
1時間から約4時間であり、2時間が好ましい。37℃
では、この時間は約15分〜2時間で、30分が好まし
い。
の如何によろう。周囲温度においては、必要な時間は約
1時間から約4時間であり、2時間が好ましい。37℃
では、この時間は約15分〜2時間で、30分が好まし
い。
検体と接触したのち、結合されたLPSを有する活性支
持体は例えば界面活性剤を含有しない緩衝液で洗浄する
ことにより非結合物質から分離されうる。次にこの複合
物を標識された検出試薬とインキュベーションする。分
離工程を含むこの連続添加操作が好ましいが、分離工程
を排除(交互添加操作)しそして活性支持体を検体およ
び標識された検出試薬と実質上同時に接触させるような
他の操作を用いることもできる。これらの代替操作によ
り、アッセイ遂行に要する時間が短縮されうるが、しか
しながらアッセイ感度が低下しつる。
持体は例えば界面活性剤を含有しない緩衝液で洗浄する
ことにより非結合物質から分離されうる。次にこの複合
物を標識された検出試薬とインキュベーションする。分
離工程を含むこの連続添加操作が好ましいが、分離工程
を排除(交互添加操作)しそして活性支持体を検体およ
び標識された検出試薬と実質上同時に接触させるような
他の操作を用いることもできる。これらの代替操作によ
り、アッセイ遂行に要する時間が短縮されうるが、しか
しながらアッセイ感度が低下しつる。
標識された検出試薬と複合物との反応温度およびそれに
要する時間は第一工程において用いられているのと同様
でありうる。一般的には、それに要する反応時間を減少
させるには比較的高い温度が好ましい。しかしながら、
高められた温度での標識された検出試薬の安定性が最適
反応温度の判定に際して考慮される必要がある。
要する時間は第一工程において用いられているのと同様
でありうる。一般的には、それに要する反応時間を減少
させるには比較的高い温度が好ましい。しかしながら、
高められた温度での標識された検出試薬の安定性が最適
反応温度の判定に際して考慮される必要がある。
標識された検出試薬は特異的な結合性タンパク質と標識
との接合体である。特異的な結合性タンパク質はイムノ
グロブリン(類)、レクチン(類)、あるいはリムルス
またはタキブレウス変形細胞溶解物からの精製LPS結
合性タンパク質(類)であることができる。適当な特異
性または反応性を有する検出試薬は特定の適用に関する
要求に合致するように選択されそして抗体の混合物に基
づくもののような混合物であることができる。
との接合体である。特異的な結合性タンパク質はイムノ
グロブリン(類)、レクチン(類)、あるいはリムルス
またはタキブレウス変形細胞溶解物からの精製LPS結
合性タンパク質(類)であることができる。適当な特異
性または反応性を有する検出試薬は特定の適用に関する
要求に合致するように選択されそして抗体の混合物に基
づくもののような混合物であることができる。
特異性は例えば、淋菌からのLPSに特異的な抗体を用
いることにより個々の種に限定することができるし、ま
た結合性タンパク質は精製LPS結合性タンパク質にお
けるように広く反応性であることもできる。アッセイ目
的を達成しうるためには、検出試薬がLPS分子の限定
されたセットにとって特異的であることが重要である。
いることにより個々の種に限定することができるし、ま
た結合性タンパク質は精製LPS結合性タンパク質にお
けるように広く反応性であることもできる。アッセイ目
的を達成しうるためには、検出試薬がLPS分子の限定
されたセットにとって特異的であることが重要である。
例えば、糞便検体が淋菌を含有するか否か判定するため
には、検出試薬(類)は淋菌LPSに特異的でなければ
ならない。検出試薬が腸内グラム陰性細菌からのLPS
とも反応すべき場合はそのものは淋菌LPSと正常な細
菌叢のLPSとの間を区別する必要はない。しかしなが
らその超厚にかかわりなくすべてのLPSの検出を意図
する場合またはLPS挟雑物の除去を意図する場合は、
検出試薬(または試薬類)は広く反応性である必要があ
り、LPS種のサブセットに限定されるべきでない。
には、検出試薬(類)は淋菌LPSに特異的でなければ
ならない。検出試薬が腸内グラム陰性細菌からのLPS
とも反応すべき場合はそのものは淋菌LPSと正常な細
菌叢のLPSとの間を区別する必要はない。しかしなが
らその超厚にかかわりなくすべてのLPSの検出を意図
する場合またはLPS挟雑物の除去を意図する場合は、
検出試薬(または試薬類)は広く反応性である必要があ
り、LPS種のサブセットに限定されるべきでない。
検出試薬接合体中の標識は通常アッセイに用いられる任
意のレポータ一部分であることができる。
意のレポータ一部分であることができる。
好ましい標識には放射性同位元素、その活性がアッセイ
されうる酵素、および蛍光性分子でありうる。標識は直
接結合、リンカ−アームによる結合または抗イムノグロ
ブリン抗体またはタンパク質Aのような二次試薬を用い
る結合を含む知られた化学的方法を利用することにより
特異的な結合性タンパク質に結合されつる。二次試薬が
用いられる場合は、これらは特異的な結合性タンパク質
を活性支持体/LPS複合物と接触させる前または後に
特異的な結合タンパク質と結合されうる。
されうる酵素、および蛍光性分子でありうる。標識は直
接結合、リンカ−アームによる結合または抗イムノグロ
ブリン抗体またはタンパク質Aのような二次試薬を用い
る結合を含む知られた化学的方法を利用することにより
特異的な結合性タンパク質に結合されつる。二次試薬が
用いられる場合は、これらは特異的な結合性タンパク質
を活性支持体/LPS複合物と接触させる前または後に
特異的な結合タンパク質と結合されうる。
これら代替例をあげれば、抗体−酵素接合体の使用、お
よびはじめに抗体の使用とそれに続くタンパク質入−酵
素接合体の結合である。
よびはじめに抗体の使用とそれに続くタンパク質入−酵
素接合体の結合である。
インキュベーション後、固相を分離しそして界面活性剤
を含有しないPBSで洗浄しうる。次に結合された検出
試薬は、その接合体に用いられている個々の標識に対し
て適切に検出されうる。標識および検出方法に基づき、
定性的または定量的結果が得られうる。
を含有しないPBSで洗浄しうる。次に結合された検出
試薬は、その接合体に用いられている個々の標識に対し
て適切に検出されうる。標識および検出方法に基づき、
定性的または定量的結果が得られうる。
特異的な結合アッセイに有用であることに加え、本発明
の活性支持体は生物医学または化粧品適用のような種々
の他の適用に意図される水性試薬からLPSを除去する
のにも用いられうる。これらの適用に有用な活性支持体
は特異的な結合アッセイに有用なものとは異なる形態、
例えば比較的広い表面積および比較的大きい結合容量を
とりうる。
の活性支持体は生物医学または化粧品適用のような種々
の他の適用に意図される水性試薬からLPSを除去する
のにも用いられうる。これらの適用に有用な活性支持体
は特異的な結合アッセイに有用なものとは異なる形態、
例えば比較的広い表面積および比較的大きい結合容量を
とりうる。
これら活性支持体はフィルター、小さい磁性粒子等の形
態で好都合に構成されうる。
態で好都合に構成されうる。
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例 1
淋菌LPSについてのサンドイッチアッセイ淋菌(Ne
isseria gonorrhoeae)をチョコレ
ート寒天プレート上37℃で5%CO2雰囲気中で生育
させた。淋菌の純粋な培養物を、商業的に入手しつる栄
養補充物(IsoVitalc X Enrichme
nt、 BBLMicrobio!ogy Syste
ms、 Bccton Dickcrsonand
Go、製、Cockcysvllle、 MD) 1%
を補充した、プロテアーゼペプトンNo、3(米国Di
f’c。
isseria gonorrhoeae)をチョコレ
ート寒天プレート上37℃で5%CO2雰囲気中で生育
させた。淋菌の純粋な培養物を、商業的に入手しつる栄
養補充物(IsoVitalc X Enrichme
nt、 BBLMicrobio!ogy Syste
ms、 Bccton Dickcrsonand
Go、製、Cockcysvllle、 MD) 1%
を補充した、プロテアーゼペプトンNo、3(米国Di
f’c。
Laboratories製)15gを含有する1gの
シェーカーフラスコに移し、そして37℃でブロス培養
物として生育させた。18時間生育させたのち検体をと
り出した。この検体を連続希釈しそしてチョコレート寒
天プレートに接種して生存能力のある細菌数/mlを測
定した。生きた培養物の残余を加熱処理により殺した。
シェーカーフラスコに移し、そして37℃でブロス培養
物として生育させた。18時間生育させたのち検体をと
り出した。この検体を連続希釈しそしてチョコレート寒
天プレートに接種して生存能力のある細菌数/mlを測
定した。生きた培養物の残余を加熱処理により殺した。
殺された細胞を遠心分離により収穫し、滅菌培地で洗い
、少量の滅菌培地中に再懸濁させ、そして必要時まで凍
結させた。
、少量の滅菌培地中に再懸濁させ、そして必要時まで凍
結させた。
凍結乾燥されたリムルス変形細胞溶解物(LAL。
Pyrogent、 Mailinckrodt、 I
nc、製、 St、 Louis。
nc、製、 St、 Louis。
No)をLPSを含有しない燐酸塩緩衝食塩水CP B
S)を用いタンパク質濃度440■/mlに再構成し
た。再構成したリムルス溶解物のPBS中の115およ
び1/10希釈物を調製した。pHは7.2〜7,4で
あった。
S)を用いタンパク質濃度440■/mlに再構成し
た。再構成したリムルス溶解物のPBS中の115およ
び1/10希釈物を調製した。pHは7.2〜7,4で
あった。
活性支持体を調製するには、下記のもの、すなわちPB
S中の0.5%(v/v) B S A tooμ+!
、および440.88および44μg/ml濃度のリム
ルス溶解物100μgをミクロ滴定プレートの異なるウ
ェルに添加した。この溶液をウェル中室温で2時間放置
した。プレートをPBS中で6回洗浄した。非特異的結
合を遮蔽するために、PBS中の0.5%(w/v)B
SA200μgを各ウェルに添加しそしてプレートを室
温で1時間放置した。このプレートをPBSで6回洗っ
た。次にすべてのウェルに1×107CFV/ml濃度
の淋菌の懸濁液100μgを加えた。
S中の0.5%(v/v) B S A tooμ+!
、および440.88および44μg/ml濃度のリム
ルス溶解物100μgをミクロ滴定プレートの異なるウ
ェルに添加した。この溶液をウェル中室温で2時間放置
した。プレートをPBS中で6回洗浄した。非特異的結
合を遮蔽するために、PBS中の0.5%(w/v)B
SA200μgを各ウェルに添加しそしてプレートを室
温で1時間放置した。このプレートをPBSで6回洗っ
た。次にすべてのウェルに1×107CFV/ml濃度
の淋菌の懸濁液100μgを加えた。
このプレートを再び室温で1時間放置した。このプレー
トをPBSで6回洗浄した。次にすべてのウェルに、ヘ
テロ2官能性結合剤N−スクシンイミジル−4−(N−
マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレ
ート(SMCC)を介してセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼに接合した淋菌LPS特異的なモノクローナル抗体
N(Li2Q(IgG抗体)の1/40希釈物100μ
gを加えた。
トをPBSで6回洗浄した。次にすべてのウェルに、ヘ
テロ2官能性結合剤N−スクシンイミジル−4−(N−
マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレ
ート(SMCC)を介してセイヨウワサビペルオキシダ
ーゼに接合した淋菌LPS特異的なモノクローナル抗体
N(Li2Q(IgG抗体)の1/40希釈物100μ
gを加えた。
このモノクローナル抗体およびその酵素接合体は現在よ
く知られている慣用の方法により得られた。
く知られている慣用の方法により得られた。
このプレートを室温で45分間放置した。このプレート
をPBSで6回洗浄した。次にすべてのウェルに新たに
調製された色原体基質である1、5μMテトラメチルベ
ンジジン(TBM)溶液100μgを加え、そして室温
で15分間放置した。光学濃度は、参照光線を490n
11に設定してミクロ滴定プレート用読み取り装置(M
lcroplate ReaderMR800,米国o
ynatech社製)を用いB30nmで読み取った。
をPBSで6回洗浄した。次にすべてのウェルに新たに
調製された色原体基質である1、5μMテトラメチルベ
ンジジン(TBM)溶液100μgを加え、そして室温
で15分間放置した。光学濃度は、参照光線を490n
11に設定してミクロ滴定プレート用読み取り装置(M
lcroplate ReaderMR800,米国o
ynatech社製)を用いB30nmで読み取った。
その結果を第1表に示す。これは4回測定した平均であ
る。
る。
第1表
淋菌LPSの検出
ウェルに添加されたLAL 光学濃度(μg/
ml ) (630na+)なしく0
.5%B S A) 0.017±0.00
444 0.2B4±0.02488
0.515±0.043440
1.123±0.078LALで被覆されたウ
ェルは淋菌からのLPSを捕促し、洗浄工程を通してそ
のLPSを保有しており、そしてそのものを抗原的に完
全無欠でサンドイッチアッセイ用の淋菌LPS特異的な
モノクローナル抗体に接近しうる形態で提示した。
ml ) (630na+)なしく0
.5%B S A) 0.017±0.00
444 0.2B4±0.02488
0.515±0.043440
1.123±0.078LALで被覆されたウ
ェルは淋菌からのLPSを捕促し、洗浄工程を通してそ
のLPSを保有しており、そしてそのものを抗原的に完
全無欠でサンドイッチアッセイ用の淋菌LPS特異的な
モノクローナル抗体に接近しうる形態で提示した。
捕促されたLPS抗原の量はウェルに吸着されたLAL
濃度が増大するに伴い増加した。
濃度が増大するに伴い増加した。
実施例 2
エシェリヒア・コリ(Escherichla col
、1) (大腸菌)LPSについてのサンドイッチ ア
ッセイ大腸菌菌性に235から精製されたリポ多糖類を
ListBiolog1ca1社から購入した。凍結乾
燥されたリムルス変形細胞溶解物(Pyrogent)
を滅菌蒸留水中に5 、4 tng/ml濃度に再構成
し、0.39m1ずつに分け、使用時まで一20℃で冷
凍した。使用直前に、LALを解凍し、そしてLPSを
含まないPBS8mlを添加してLAL濃度250■/
mlとした。
、1) (大腸菌)LPSについてのサンドイッチ ア
ッセイ大腸菌菌性に235から精製されたリポ多糖類を
ListBiolog1ca1社から購入した。凍結乾
燥されたリムルス変形細胞溶解物(Pyrogent)
を滅菌蒸留水中に5 、4 tng/ml濃度に再構成
し、0.39m1ずつに分け、使用時まで一20℃で冷
凍した。使用直前に、LALを解凍し、そしてLPSを
含まないPBS8mlを添加してLAL濃度250■/
mlとした。
ミクロ滴定プレートの異なるウェルにLAL100μg
を添加しそしてこのプレートを室温で2時間放置した。
を添加しそしてこのプレートを室温で2時間放置した。
このプレートをPBSで6回洗った。
次にこのウェルをPBE中の0.5%(w/v) B
S A200μgで遮断しそしてプレートを室温で1時
間放置した。このプレートを再びPBSで6回洗ったL
ALで被覆されたウェルを大腸菌に235からのLPS
(各ウェル当りそれぞれ10.50および250ng
)と室温で1時間接触させた。このプレートを再びPB
Sで6回洗った。次にすべてのウェルにウサギの抗−大
腸菌K 235LPS (PBS中の0.1%BSA中
に1/ 100に希釈)100μQを加え、室温で1時
間放置した。このプレートをPBSで6回洗浄した。
S A200μgで遮断しそしてプレートを室温で1時
間放置した。このプレートを再びPBSで6回洗ったL
ALで被覆されたウェルを大腸菌に235からのLPS
(各ウェル当りそれぞれ10.50および250ng
)と室温で1時間接触させた。このプレートを再びPB
Sで6回洗った。次にすべてのウェルにウサギの抗−大
腸菌K 235LPS (PBS中の0.1%BSA中
に1/ 100に希釈)100μQを加え、室温で1時
間放置した。このプレートをPBSで6回洗浄した。
次に各ウェルに、PBS中の0.1%BSA中に1 :
2000に希釈したセイヨウワサビ ペルオキシダー
ゼ−タンパク質入接合体の溶液100μaずつを添加し
た。これを室温で1時間放置した。このプレートをPB
Sで6回洗い、次に新たに調製された色原体基質1.5
μM TMB溶液100μgをすべてのウェルに加え
た。基質溶液の光学濃度を、参照光線を490nllに
設定してMR−600ミクロ滴定プレート読み取り装置
を用い10分後に630nmで読み取った。その結果を
第2表に示す。
2000に希釈したセイヨウワサビ ペルオキシダー
ゼ−タンパク質入接合体の溶液100μaずつを添加し
た。これを室温で1時間放置した。このプレートをPB
Sで6回洗い、次に新たに調製された色原体基質1.5
μM TMB溶液100μgをすべてのウェルに加え
た。基質溶液の光学濃度を、参照光線を490nllに
設定してMR−600ミクロ滴定プレート読み取り装置
を用い10分後に630nmで読み取った。その結果を
第2表に示す。
0 0.007±0.00210
0.045±0.00650 0.190
±0.004250 0.403±0.02
3この実施例により、大腸菌に235LPSが固定され
たLALにより捕捉されることおよび検体中のわずか1
0ngのLPSが特異的な抗体を用いるサンドイッチ
アッセイにおいて免疫学的に検出されうろことが示され
る。何らアッセイ最適化が行われておらず、しかも未精
製ポリクローナルウサギ抗血清が使用されているゆえに
、このアッセイ感度は特に驚くべきものであった。
0.045±0.00650 0.190
±0.004250 0.403±0.02
3この実施例により、大腸菌に235LPSが固定され
たLALにより捕捉されることおよび検体中のわずか1
0ngのLPSが特異的な抗体を用いるサンドイッチ
アッセイにおいて免疫学的に検出されうろことが示され
る。何らアッセイ最適化が行われておらず、しかも未精
製ポリクローナルウサギ抗血清が使用されているゆえに
、このアッセイ感度は特に驚くべきものであった。
実施例 3
種々の菌株からの淋菌LPSについてのサンドイッチ
アッセイ血清型特異性が異なる9種類の淋菌菌株を生育
させ、収穫しそして実施例1記載のようにして熱不活性
化した。細菌懸濁液をI×106CF U/mlの濃度
に調製した。実施例2記載のLALの一部分を解凍し、
PBS中215q/mlに調製し、そして100μgず
つをミクロ滴定プレートのウェル中に入れた。このプレ
ートを室温で2時間放置し、次にPBS中で6回洗った
。次に各ウェルにPBS中の0,5%B5A200μg
ずつを加え、室温で1時間放置した。このプレートを再
びPBS中で6回洗った。次に各ウェルに柾々の不活性
淋菌懸濁液100μgずつを加えた。対照には、LPS
を含まないPBSが用いられた。このプレートを室温で
1時間放置し、次にPBS中で6回洗った。次にウェル
内容物を、Q、1%BSA中1/200に希釈された淋
菌特異的なモノクローナル抗体[06B41gMクラス
、R,Mandrel1氏他。
アッセイ血清型特異性が異なる9種類の淋菌菌株を生育
させ、収穫しそして実施例1記載のようにして熱不活性
化した。細菌懸濁液をI×106CF U/mlの濃度
に調製した。実施例2記載のLALの一部分を解凍し、
PBS中215q/mlに調製し、そして100μgず
つをミクロ滴定プレートのウェル中に入れた。このプレ
ートを室温で2時間放置し、次にPBS中で6回洗った
。次に各ウェルにPBS中の0,5%B5A200μg
ずつを加え、室温で1時間放置した。このプレートを再
びPBS中で6回洗った。次に各ウェルに柾々の不活性
淋菌懸濁液100μgずつを加えた。対照には、LPS
を含まないPBSが用いられた。このプレートを室温で
1時間放置し、次にPBS中で6回洗った。次にウェル
内容物を、Q、1%BSA中1/200に希釈された淋
菌特異的なモノクローナル抗体[06B41gMクラス
、R,Mandrel1氏他。
rlnrection and 1mn+unityJ
、 54. [13−89(1988))iooμg
で、またはl/looに希釈された口6134の50μ
gおよび0.OI%BSA中1/250に希釈されたモ
ノクローナル抗体179の50μqを含有する、2種の
モノクローナル抗体の混合物で別々に処理した。
、 54. [13−89(1988))iooμg
で、またはl/looに希釈された口6134の50μ
gおよび0.OI%BSA中1/250に希釈されたモ
ノクローナル抗体179の50μqを含有する、2種の
モノクローナル抗体の混合物で別々に処理した。
室温で1時間インキュベーションしたのち、ウェルをP
BSで6回洗い、次にタンパク質入−セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)接合体(Miles La
boratories) 100μRで処理した。室
温で1時間インキュベーションしたのち、プレートをP
BS中で6回洗い、そして新たに調製した1、5μM
TMB溶液100μgで処理した。参照光線を490
nmに設定してMR−1300ミクロ滴定プレート読み
取り装置を用い、室温で10分後に630nmでの吸収
を読み取った。
BSで6回洗い、次にタンパク質入−セイヨウワサビ
ペルオキシダーゼ(HRP)接合体(Miles La
boratories) 100μRで処理した。室
温で1時間インキュベーションしたのち、プレートをP
BS中で6回洗い、そして新たに調製した1、5μM
TMB溶液100μgで処理した。参照光線を490
nmに設定してMR−1300ミクロ滴定プレート読み
取り装置を用い、室温で10分後に630nmでの吸収
を読み取った。
別の実験で、L A L (23Gt1g/ ml )
をミクロ滴定プレートのウェル上に被覆しそして同じ9
種の淋菌菌株(血清型1〜9)を高濃度(8X 10”
〜I Xl09CF U/ml)で活性支持体とインキ
ュベーションした。洗浄後、抗体179とHRPとの接
合体、次に基質を細胞に添加した。光学濃度は前記した
ようにして830n11で測定した。これら別々の実験
の結果を第3表に示す。
をミクロ滴定プレートのウェル上に被覆しそして同じ9
種の淋菌菌株(血清型1〜9)を高濃度(8X 10”
〜I Xl09CF U/ml)で活性支持体とインキ
ュベーションした。洗浄後、抗体179とHRPとの接
合体、次に基質を細胞に添加した。光学濃度は前記した
ようにして830n11で測定した。これら別々の実験
の結果を第3表に示す。
(以下余白)
第 3 表
ブランク 0.025 0.025 0.0
B71 0.0410.037 2 0.0810.202 3 0.0190.000 4 0.0300.000 5 0.0511.005 0.2816 0.129
0468 7 0.1340.175 8 0.0740.:(850,17390,0910
,9260,377 この表から判るように、抗体06B4は例えば血清型6
および7とよく反応するが、一方抗体179は血清型5
,8および9とは強く反応するが例えば血清型2. 3
.4および7とは弱くかまたは全熱反応しない。従って
、この実験は検出試薬の特異性を拡大させるために検出
試薬として多重抗体を使用することの可能性を示し、L
ALにより捕捉されたLPSが大きいイムノグロブリン
分子(08B4はIgM抗体)にすらも接近可能なまま
であることを示し、そして本発明の方法が種々のそして
多数の細菌血清型を検出しうろことを示している。
B71 0.0410.037 2 0.0810.202 3 0.0190.000 4 0.0300.000 5 0.0511.005 0.2816 0.129
0468 7 0.1340.175 8 0.0740.:(850,17390,0910
,9260,377 この表から判るように、抗体06B4は例えば血清型6
および7とよく反応するが、一方抗体179は血清型5
,8および9とは強く反応するが例えば血清型2. 3
.4および7とは弱くかまたは全熱反応しない。従って
、この実験は検出試薬の特異性を拡大させるために検出
試薬として多重抗体を使用することの可能性を示し、L
ALにより捕捉されたLPSが大きいイムノグロブリン
分子(08B4はIgM抗体)にすらも接近可能なまま
であることを示し、そして本発明の方法が種々のそして
多数の細菌血清型を検出しうろことを示している。
実施例 4
アッセイ能に及ぼす反応温度の影響
血清型5を有する淋菌を生育させ、収穫しそして実施例
1記載のようにして不活化した。この実験においては、
アッセイが行われる温度が本発明のLAL捕捉アッセイ
に及ぼす影響について検査した。2つの別々のミクロ滴
定プレートを使用した。全工程は一方のプレートでは室
温でそしてもう一方のプレートでは37℃で行われた。
1記載のようにして不活化した。この実験においては、
アッセイが行われる温度が本発明のLAL捕捉アッセイ
に及ぼす影響について検査した。2つの別々のミクロ滴
定プレートを使用した。全工程は一方のプレートでは室
温でそしてもう一方のプレートでは37℃で行われた。
プレートをPBS中250回g/ mlのL A L
100μRで被覆し、放置し、次にPBSで洗い、PB
S中の0,5%B5A200μaで遮断しそして再びP
BSで洗った。
100μRで被覆し、放置し、次にPBSで洗い、PB
S中の0,5%B5A200μaで遮断しそして再びP
BSで洗った。
次に両方のプレートに加熱して殺した淋菌(血清型5)
の種々の希釈物100μgを添加し、一方対照ウエルに
はPBS100μgを添加した。1方のプレートは室温
で1時間そしてもう一方は37℃で30分間放置した。
の種々の希釈物100μgを添加し、一方対照ウエルに
はPBS100μgを添加した。1方のプレートは室温
で1時間そしてもう一方は37℃で30分間放置した。
両方のプレートをPBSで6回洗いそして次に0.1%
BSA中に11500に希釈したウサギ抗淋菌ポリクロ
ーナル抗体looμQを加えた。このプレートをそれぞ
れ室温で1時間および37℃で30分間放置した。両方
のプレートを洗浄し、次いて” 1/2000に希釈し
たセイヨウワサビ−タンパク質A接合体100μ2をす
べてのウェルに添加した。ここでまたプレートを前述の
ようにしてインキュベートし、PBSで6回洗い、続い
て新たに調製した1、5μM TMB溶液100μg
ずつをすべてのウェルに加えた。参照光線を498On
−に設定してMR−600ミクロ滴定プレート読み取り
装置を用い室温で(両方のプレート共)10分後に63
0nmでのODを読み取った。その結果を第4表に示す
。
BSA中に11500に希釈したウサギ抗淋菌ポリクロ
ーナル抗体looμQを加えた。このプレートをそれぞ
れ室温で1時間および37℃で30分間放置した。両方
のプレートを洗浄し、次いて” 1/2000に希釈し
たセイヨウワサビ−タンパク質A接合体100μ2をす
べてのウェルに添加した。ここでまたプレートを前述の
ようにしてインキュベートし、PBSで6回洗い、続い
て新たに調製した1、5μM TMB溶液100μg
ずつをすべてのウェルに加えた。参照光線を498On
−に設定してMR−600ミクロ滴定プレート読み取り
装置を用い室温で(両方のプレート共)10分後に63
0nmでのODを読み取った。その結果を第4表に示す
。
シグナル/ノイズ比は細胞の存在下と非存在下における
吸収比でありそしてアッセイ感度を表示するものである
。
吸収比でありそしてアッセイ感度を表示するものである
。
細 胞 i イン手ュベーシ3ノ 光 学 濃
度 (シグナル)/(’C/分) (830
nm) ノイズ−25/60 0.019
±0.005 −−IXLO25/60 0.0
13±0.003 0.75X10 25/
130 0.015±o、oot o、alX
l0 25/80 0.021±0.004
1.15x10 25/no 0.04
8±0.002 2.5lXl0 25/6
0 0.082±0.002 4.3lXl0
25/GO0,274±0.014 14.
4lXl0 25/60 0J71±0.01
3 19.5− 37/30 0.00
4±0.004 −−lXl0 37/30
0.029±0.007 7.35X10
37/30 0.045±0.019 11
.2lXl0 37/30 0.030±0.
010 7.55X 10’ 37/3
0 0.091±0.007 22.8第
4 表 細胞数 インキュベーション 光学 濃 度
(シグナル)/(’C/分) (630nm
) ノイズLX 10 37/30
0.177±0.016 44.3LXlo
37/30 0.796±0.055 19
9.0lXl0 37/30 1.179±0
.037 294.8本発明のサンドイッチ アッセ
イにおけるインキュベーション工程を室温で1時間の代
りに37℃で30分間行うと、アッセイ感度が大きく改
善されそしてまたアッセイ実施に要する時間も短縮する
ことができた。25℃では、2をこえるシグナル/ノイ
ズ比を達成するには5 X 10’個の細胞を必要とす
るが、一方37℃ではI X to”個の細胞で7より
大きいシグナル/ノイズ比を生じ、感度が50倍増大し
ている。
度 (シグナル)/(’C/分) (830
nm) ノイズ−25/60 0.019
±0.005 −−IXLO25/60 0.0
13±0.003 0.75X10 25/
130 0.015±o、oot o、alX
l0 25/80 0.021±0.004
1.15x10 25/no 0.04
8±0.002 2.5lXl0 25/6
0 0.082±0.002 4.3lXl0
25/GO0,274±0.014 14.
4lXl0 25/60 0J71±0.01
3 19.5− 37/30 0.00
4±0.004 −−lXl0 37/30
0.029±0.007 7.35X10
37/30 0.045±0.019 11
.2lXl0 37/30 0.030±0.
010 7.55X 10’ 37/3
0 0.091±0.007 22.8第
4 表 細胞数 インキュベーション 光学 濃 度
(シグナル)/(’C/分) (630nm
) ノイズLX 10 37/30
0.177±0.016 44.3LXlo
37/30 0.796±0.055 19
9.0lXl0 37/30 1.179±0
.037 294.8本発明のサンドイッチ アッセ
イにおけるインキュベーション工程を室温で1時間の代
りに37℃で30分間行うと、アッセイ感度が大きく改
善されそしてまたアッセイ実施に要する時間も短縮する
ことができた。25℃では、2をこえるシグナル/ノイ
ズ比を達成するには5 X 10’個の細胞を必要とす
るが、一方37℃ではI X to”個の細胞で7より
大きいシグナル/ノイズ比を生じ、感度が50倍増大し
ている。
実施例 5
連続的交互および同時アッセイ
本実施例においては、種々の試薬添加順序について検査
した、すなわち本発明のサンドイッチアッセイを実施す
るに際しての連続法、交互法および同時法である。
した、すなわち本発明のサンドイッチアッセイを実施す
るに際しての連続法、交互法および同時法である。
ミクロ滴定プレートのウェルをL A L (250■
/mL実施例2参照)で被覆しそして37℃で2時間放
置した。次にウェルをPBSで6回洗いそしてPBS中
の0.5%B5A200μgで遮断した(37℃、1時
間)。検出試薬としてはウサギのポリクローナル抗淋菌
抗体が用いられた。
/mL実施例2参照)で被覆しそして37℃で2時間放
置した。次にウェルをPBSで6回洗いそしてPBS中
の0.5%B5A200μgで遮断した(37℃、1時
間)。検出試薬としてはウサギのポリクローナル抗淋菌
抗体が用いられた。
連続添加法は実施例1−4に記載されている。
加熱により殺された淋菌細胞の懸濁液(50μQ1細胞
5X106個)をPB350μQと共にウェルに添加し
た。これをインキュベー)L(37℃、30分)そして
次にPBSで6回洗った。かくして形成されたLAL−
LPS複合物を各ウェル中抗血清(11500に希釈)
100μ9で処理し、そして37℃で30分間インキュ
ベーションした。抗体の結合は実施例4記載の操作に従
いHRP−タンパク質A接合体を用いて測定された。
5X106個)をPB350μQと共にウェルに添加し
た。これをインキュベー)L(37℃、30分)そして
次にPBSで6回洗った。かくして形成されたLAL−
LPS複合物を各ウェル中抗血清(11500に希釈)
100μ9で処理し、そして37℃で30分間インキュ
ベーションした。抗体の結合は実施例4記載の操作に従
いHRP−タンパク質A接合体を用いて測定された。
同時添加法は淋菌懸濁液(細胞5 X 106個)およ
び抗体(11500希釈物、100μg)の両方をLA
L被覆されたウェル(活性支持体)に同時に添加するこ
とにより行われた。37℃で30分インキュベーション
したのち、プレートをPBSで6回洗いそして前記した
ようにしてHRP−タンパク質A接合体を用いて抗体結
合を測定した。
び抗体(11500希釈物、100μg)の両方をLA
L被覆されたウェル(活性支持体)に同時に添加するこ
とにより行われた。37℃で30分インキュベーション
したのち、プレートをPBSで6回洗いそして前記した
ようにしてHRP−タンパク質A接合体を用いて抗体結
合を測定した。
交互添加アッセイはLAL被覆されたウェルに淋菌細胞
懸濁液(細胞5 X 108個)を添加し、37℃で1
5分間インキュベートし、そして次に抗体添加に先立つ
分、!iI/洗浄工程を行うことなく抗体(11500
希釈、100μQ)を添加した。37℃でさらに15分
間インキュベートしたのち、ウェルをPBSで6回洗い
そして前記したHRP−タンパク質A接合体を用いて抗
体結合について測定した。
懸濁液(細胞5 X 108個)を添加し、37℃で1
5分間インキュベートし、そして次に抗体添加に先立つ
分、!iI/洗浄工程を行うことなく抗体(11500
希釈、100μQ)を添加した。37℃でさらに15分
間インキュベートしたのち、ウェルをPBSで6回洗い
そして前記したHRP−タンパク質A接合体を用いて抗
体結合について測定した。
それぞれの方法についての対照ウェルは淋菌細胞の代り
にPBSが添加される他は試験ウェルと同様に処理され
た。結果を第5表に示す。
にPBSが添加される他は試験ウェルと同様に処理され
た。結果を第5表に示す。
第 5 表
試 薬 試 料 光学濃度(630nm) ′グf′
′/添 加 ノイズ連続め 対
照 0.011±0.001 −細胞 0.3
13±0.009 28.5同、jj対照 0.024
±0.川 −細胞 0.167±0.007 ’7.
0交互対照 0.017±0.002 =細胞 0.
205±0.007 12.1これらの結果は、連続的
操作が生成される総シグナルおよびシグナル/ノイズ比
の両方に関して最良の性能をもたらすことを示している
。アッセイ時間は種々のアッセイ工程を組み合せること
により短縮できるが、アッセイ性能は付随して低下した
。交互操作は同時操作に比較して総シグナルおよびシグ
ナル/ノイズ比を改善した。同時添加操作では連続添加
の47.4%の特異的なシグナル(細胞を含有するウェ
ルと対照との吸収値の差)が生じ、一方交互添加では特
異的なシグナルの62.3%を生じた。
′/添 加 ノイズ連続め 対
照 0.011±0.001 −細胞 0.3
13±0.009 28.5同、jj対照 0.024
±0.川 −細胞 0.167±0.007 ’7.
0交互対照 0.017±0.002 =細胞 0.
205±0.007 12.1これらの結果は、連続的
操作が生成される総シグナルおよびシグナル/ノイズ比
の両方に関して最良の性能をもたらすことを示している
。アッセイ時間は種々のアッセイ工程を組み合せること
により短縮できるが、アッセイ性能は付随して低下した
。交互操作は同時操作に比較して総シグナルおよびシグ
ナル/ノイズ比を改善した。同時添加操作では連続添加
の47.4%の特異的なシグナル(細胞を含有するウェ
ルと対照との吸収値の差)が生じ、一方交互添加では特
異的なシグナルの62.3%を生じた。
特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
・アンド・コンパニー 外2名
・アンド・コンパニー 外2名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)下記工程、すなわち (A)捕捉試薬を固定させて、実質的に i)水不溶性支持体、および ii)該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 (B)リポ多糖類を含有するかまたは含有することが疑
われる検体を前記活性支持体と接触させ、 (C)工程(B)で形成された活性支持体−リポ多糖類
複合物を標識された検出試薬と接触させ、そして (D)結合されたかまたは結合されてない標識のいずれ
かを検出する ことからなるリポ多糖類検出のためのサンドイッチアッ
セイ。 2)前記リポ多糖類結合性タンパク質が、リムルス・ポ
リフェムス(Limulus polyphemus)
、タキプレウス・トリデンタツス(Tachypleu
s tridentatus)、カルシノスコルピウス
・ロツンジカウダ(Carcinoscorpius
rotundicauda)またはタキプレウス・ギガ
ス(Tachypleus gigas)からの変形細
胞の結合性タンパク質から選択される請求項1記載のサ
ンドイッチアッセイ。 3)前記リポ多糖類結合性タンパク質がリムルス・ポリ
フェムス、タキプレウス・トリデンタツス、カルシノス
コルピウス・ロツンジカウダおよびタキプレウス・ギガ
スの変形細胞溶解物からなる群から選択される請求項1
記載のサンドイッチアッセイ。 4)前記捕捉試薬がpH9より下で支持体上に固定され
る請求項1または2記載のサンドイッチアッセイ。 5)前記捕捉試薬が界面活性剤の非存在下に支持体上に
固定される請求項1または2記載のサンドイッチアッセ
イ。 6)工程(B)で形成される前記複合物がすべての非結
合物質から分離される請求項1記載のサンドイッチアッ
セイ。 7)前記活性支持体を検体および標識された検出試薬と
実質上同時に接触させる請求項1記載のサンドイッチア
ッセイ。 8)前記標識された検出試薬が特異的な結合性タンパク
質と標識との接合体である請求項1記載のサンドイッチ
アッセイ。 9)前記特異的な結合性タンパク質がイムノグロブリン
、レクチンおよび純粋なリポ多糖類結合性タンパク質か
らなる群から選択される請求項8記載のサンドイッチア
ッセイ。 10)前記標識が放射性同位元素、酵素および蛍光性分
子からなる群から選択される請求項8記載のサンドイッ
チアッセイ。 11)下記工程、すなわち (A)捕捉試薬を固定させて、実質的に i)水不溶性支持体、および ii)該支持体に結合されたリポ多糖類結合性タンパク
質 からなる活性支持体を形成させ、 (B)リポ多糖類を含有するかまたは含有することが疑
われる検体を前記活性支持体と接触させ、そして (C)活性支持体に結合されたリポ多糖類を検体から分
離する ことからなる、検体からのリポ多糖類の除去法。
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