JP5620257B2 - 微生物夾雑物検出容器、微生物夾雑物検出システム、並びに、微生物夾雑物の検出方法 - Google Patents
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Description
一方、発色法では、凝固酵素の基質として発色合成基質を用いる。例えば、発色合成ペプチド基質を用い、遊離した発色物質の量を吸光度により測定する。
発光検出槽3は、光学セルとして機能する。すなわち、発光検出槽3内で生じた生物発光又は化学発光は、外部の発光検出器によって検出することができる。
第一試薬設置槽10は、蓋部材7と中間部仕切り部材5で仕切られた空間(上側の空間)により形成されている。図5に示すように、第一試薬設置槽10には、血球溶解物等含有試薬15が設置されている。基本姿勢において、血球溶解物等含有試薬15は中間部仕切り部材5の上にある。
一方、第二試薬設置槽11は、中間部仕切り部材5と発光検出槽側仕切り部材6で仕切られた空間(下側の空間)により形成されている。図5に示すように、第二試薬設置槽11には、発光合成基質16が設置されている。基本姿勢において、発光合成基質16は発光検出槽側仕切り部材6の上にある。
また発光合成基質16は、LAL中の活性化凝固酵素の作用によってルシフェリン(又はその誘導体)を遊離することができる合成基質、例えば、ベンゾイルLeu−Arg−Arg−アミノルシフェリンである。ベンゾイルLeu−Arg−Arg−アミノルシフェリンによれば、活性化凝固酵素によってアミノルシフェリンが遊離される。
なお、発光合成基質16の他の例としては、Leu−Gry−Arg−アミノルシフェリン、Ile−Glu−Gly−Arg−アミノルシフェリンが挙げられる。さらに、これらのN末端は保護基で保護されていてもよい。当該保護基としては、N−スクシニル基、tert−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、p−トルエンスルホニル基、などが挙げられる。
発光用試薬17は、ルシフェリン(発光酵素)とATPとの混合物である。
まず、微生物夾雑物(本実施形態ではエンドトキシン)の検出対象となる液体試料20を注射器21に量り取る。注射針22を蓋部材7に突き刺して、第一試薬設置槽10内に所定量の液体試料20を導入する(図6(a))。
血球溶解物等含有試薬15が液体試料20に溶解すると、液体試料20中に存在するエンドトキシンが血球溶解物等含有試薬15中のLALとカスケード反応を起こして凝固酵素を活性化する(LAL反応、凝固酵素の活性化反応)。
凝固酵素を確実に活性化するために、必要に応じて、微生物夾雑物検出容器1を所定温度(例えば37±1℃)にインキュベートする。インキュベートは、例えば、微生物夾雑物検出容器1全体を恒温器内に入れて行うことができる。その他、各種ヒーター、温度コントローラー、ペルチェ素子等を用いることもできる。
発光合成基質16が液体試料20に溶解すると、活性化された凝固酵素が発光合成基質たるベンゾイル−Leu−Arg−Arg−アミノルシフェリンに作用し、アミノルシフェリンが遊離される(ルシフェリン遊離反応)。
ルシフェリン遊離反応を確実に行うために、必要に応じて、微生物夾雑物検出容器1を所定温度(例えば37±1℃)にインキュベートする。インキュベートは、例えば、微生物夾雑物検出容器1全体を恒温器内に入れて行うことができる。その他、各種ヒーター、温度コントローラー、ペルチェ素子等を用いることもできる。
試薬設置槽32には、血球溶解物等含有試薬35が設置されている。第一実施形態とは異なり、血球溶解物等含有試薬35には発光合成基質が混合されている。換言すれば、本実施形態では、血球溶解物等含有試薬35がLALとベンゾイル−Leu−Arg−Arg−アミノルシフェリンとの混合物である。
微生物夾雑物検出容器31の他の構成は、第一実施形態と同じである。例えば、発光検出槽3には、発光用試薬17(ルシフェラーゼとATPの混合物)が設置されている。
本実施形態の微生物夾雑物検出容器31によれば、凝固酵素の活性化とルシフェリン遊離反応とを1つの系で同時に行うことができ、操作を簡略化できる。
微生物夾雑物検出容器36の使用方法は、第一実施形態の微生物夾雑物検出容器1の使用方法と基本的に同じである。すなわち、蓋部材7側から注射器等を用いて液体試料20を導入し、発光検出槽3で全ての反応を行えばよい。なお、液体試料20が発光検出槽3に導入されて、血球溶解物等含有試薬35と発光用試薬17を溶解すると、試薬設置槽32内でLAL反応(凝固酵素の活性化反応)とルシフェリン遊離反応が起こり、さらにルシフェラーゼによる発光反応が起こる。
第三実施形態と同様に、微生物夾雑物検出容器38は仕切り部材を備えておらず、容器本体2と発光検出槽3とが最初から連通している。
蓋部材7の裏側(容器本体2内)には、発光合成基質16(ベンゾイル−Leu−Arg−Arg−アミノルシフェリン)が設置されている。発光合成基質16は、試薬収容部40の開口部41に対向する位置を外して設けられている。換言すれば、容器本体2の隙間46のちょうど上の位置に設けられている。
発光検出槽3内には発光用試薬17(ルシフェリン+ATP)が設置されている。
試薬収容槽40内に設置された血球溶解物等含有試薬15、蓋部材7の裏側に設置された発光合成基質16、および発光検出槽3に設置された発光用試薬17は、いずれも微生物夾雑物検出容器38を天地逆方向にしても落ちないように(剥がれないように)各設置箇所に固着させてある。
図16に示すように、堰壁61は、蓋部材57の上面と容器本体2の内壁とで構成される空間を縦に仕切るものである。堰壁61は長方形状の板体であり、蓋部材57の上面に鉛直方向に立設されている。堰壁61の底辺61aは蓋部材57の上面に接触しており、左右の辺61b,61cは容器本体2の内壁に接触している。
堰壁61によって、蓋部材57の上面は2つのエリア、すなわち試料導入エリア62と試料排出エリア63に分けられている。試料排出エリア63には逆止弁60が設けられている。逆止弁60は、液体試料計量槽56から試料排出エリア63に向かう方向のみに流体を通過させるものである。試料導入エリア62には特に何も設けられておらず、注射針等を容易に貫通させる構成となっている。
まず、微生物夾雑物の検出対象となる液体試料20を注射器21に量り取る。量り取る量は、液体試料計量槽56の容積を超える量とする。次に、蓋部材57の試料導入エリア62から注射針22を突き刺して、液体試料計量槽56内に液体試料20を導入していく(図17(a))。
以降の操作は図6(c)〜図6(g)に示す操作と同じである。
血球溶解物等含有試薬15を中間部仕切り部材5上に、発光合成基質16を発光検出槽側仕切り部材6上に、発光用試薬27を発光検出槽3の底にそれぞれ置き、凍結乾燥させた。
液体試料計量槽56の容積は0.5mLとした。
結果を表1に示す。すなわち、エンドトキシン濃度が0〜0.5EU/mLの範囲において、エンドトキシン濃度に応じた発光強度が得られた。また、0.05EU/mLの低濃度でも発光が検出され、エンドトキシンを高感度で検出できることが示された。
2 容器本体
3 発光検出槽
5 中間部仕切り部材(隔壁)
6 発光検出槽側仕切り部材(隔壁)
10 第一試薬設置槽(槽)
11 第二試薬設置槽(槽)
15 血球溶解物等含有試薬
16 発光合成基質
17 発光用試薬
20 液体試料
23 発光検出器
28 微生物夾雑物検出システム
31 微生物夾雑物検出容器
32 試薬設置槽(槽)
33 仕切り部材(隔壁)
35 血球溶解物等含有試薬
36 微生物夾雑物検出容器
38 微生物夾雑物検出容器
40 試薬収容槽
51 微生物夾雑物検出容器
55 微生物夾雑物検出容器
56 液体試料計量槽
58 上部仕切り部材(隔壁)
71 微生物夾雑物検出容器
72 微生物夾雑物検出容器
73 微生物夾雑物検出容器
74 微生物夾雑物検出容器
Claims (16)
- 容器内で液体試料を血球溶解物又は昆虫の体液由来成分に接触させて、液体試料中の微生物夾雑物と血球溶解物又は昆虫の体液由来成分とを反応させ、液体試料中における微生物夾雑物の存在又は量を決定するための微生物夾雑物検出容器であり、
容器本体と発光検出槽とを備え、
血球溶解物又は昆虫の体液由来成分を少なくとも含有する血球溶解物等含有試薬と、所定の基質と反応して生物発光又は化学発光を発生させる発光用試薬とを内蔵しており、
液体試料を容器本体内に導入可能であり、
導入された液体試料が前記血球溶解物等含有試薬と前記発光用試薬を溶解し、当該溶解物が発する生物発光又は化学発光を前記発光検出槽にて検出可能であり、
所定の容積を有する液体試料計量槽をさらに備え、所定量の液体試料を液体試料計量槽から容器本体内に導入可能であり、
液体試料計量槽と容器本体とが隔壁を介して連結されており、隔壁を破ることにより液体試料計量槽と容器本体とが連通することを特徴とする微生物夾雑物検出容器。 - 容器本体と発光検出槽とが隔壁を介して連結されており、隔壁を破ることにより容器本体と発光検出槽とが連通することを特徴とする請求項1に記載の微生物夾雑物検出容器。
- 血球溶解物等含有試薬は、容器本体に配置されていることを特徴とする請求項1又は2に記載の微生物夾雑物検出容器。
- 発光用試薬は、発光検出槽に配置されていることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 容器本体は隔壁を介して少なくとも2つの槽に仕切られており、隔壁を破ることにより隣接する槽同士が連通することを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 容器本体の1つの槽に、血球溶解物等含有試薬が配置され、
容器本体の別の槽に、発光基質を遊離する発光合成基質が配置され、
発光検出槽に、発光用試薬が配置され、
発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていることを特徴とする請求項5に記載の微生物夾雑物検出容器。 - 血球溶解物等含有試薬には発光基質を遊離する発光合成基質が混合されており、発光用試薬には前記発光基質と反応する発光酵素が含まれていることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 発光合成基質はルシフェリン又はその誘導体を遊離可能なものであり、発光酵素はルシフェラーゼであることを特徴とする請求項6又は7に記載の微生物夾雑物検出容器。
- 容器本体内に連通する試薬収容槽がさらに設けられており、当該試薬収容槽に血球溶解物等含有試薬が配置されていることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 試薬収容槽は、容器本体内に設けられていることを特徴とする請求項9に記載の微生物夾雑物検出容器。
- 容器本体は円筒状であり、その軸線方向における一方の端部に発光検出槽が連結されていることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 微生物夾雑物は、エンドトキシン、βグルカン、又はペプチドグリカンであることを特徴とする請求項1〜11のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 血球溶解物は、カブトガニの血球抽出成分であることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 昆虫の体液由来成分は、カイコの体液抽出成分であることを特徴とする請求項1〜12のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器と、発光検出器を備えたことを特徴とする微生物夾雑物検出システム。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の微生物夾雑物検出容器を用いて液体試料中の微生物夾雑物の存在又は量を決定することを特徴とする微生物夾雑物の検出方法。
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