NO303852B1 - FremgangsmÕte ved pÕvisning av analyttvarianter, samt sett for utf°relse av fremgangsmÕten - Google Patents

Description

Fremgangsmåte ved påvisning av analyttvarianter,

samt sett for utførelse av fremgangsmåten

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å påvise konsentrasjonen av et subsett av analyttvarianter innen en gruppe av forskjellige analyttvarianter, samt undersøkelsessett og reagensblandinger for bruk ved slike fremgangsmåter.

Biologiske molekyler, slik som enzymer, antigener og andre biologisk viktige proteiner forekommer ofte som en populasjon av varianter som, selv om de har en felles biologisk funksjon eller egenskap, såsom antigenisitet eller enzymak-tivitet, er litt forskjellige fra hverandre i sin struktur. Denne variasjon i struktur kan være grunnet forskjeller i primære, sekundære eller tertiære strukturer i aminosyrese-kvensene hos proteiner eller polypeptider eller forskjeller i karbohydratenhetene eller den lipide sammensetning hos molekylet. Selv om en felles karakteriserende egenskap eller funksjon mellom variantmolekylene i en gitt populasjon blir opprettholdt, virker slike forskjeller i deres struktur ofte til å endre andre egenskaper av variantene, f. eks. størrelse, ladning, isoelektrisk punkt (pl), som i sin tur endrer oppførselen i forskjellige fraksjonerings- og separasjonssystemer og kan brukes som basis for adskillelse av én eller flere slike varianter i en variantblanding.

Enzymer forekommer ofte som varianter, f.eks. isoenzymer og mange andre biologiske proteiner er nå kjent å forekomme i to eller flere variante former, ofte med forskjeller i utstrekningen av glykosylering av proteinet eller karbohydrat sammensetning . De relative konsentrasjoner av slike varianter i et gitt kroppsvev eller -væske er generelt konstant, men kan forstyrres ved visse lidelser eller patologiske tilstander eller som et resultat av andre forstyrrelser av kroppen. Således er f.eks. forholdet mellom glykosylerte og ikke-glykosylerte hemoglobiner kjent for å øke i serumet hos pasienter som lider av diabetes. På lignende måte kan visse strukturelle proteiner av analytisk interesse, f.eks. myoglobiner, ha svakt strukturelle forskjeller i forskjellige organer og kan frigjøres inn i blodstrømmen etter celleødeleggelse som stammer fra sykdom eller skade.

Således, ved å måle nivåene til de forskjellige varianter i blodet eller andre kroppsvev eller -væsker kan en diagnose eller påvisning av tilstanden til en sykdom eller celleskade bli foretatt.

Av spesiell viktighet i denne sammenheng er påvisningen av nivåene til forskjellige varianter av proteinet transferrin i serumet. Transferrin opptrer generelt i sialylerte former, d.v.s. det bærer tre eller flere sialylresiduer. Imidlertid, hos kroniske alkoholikere er desialylert transferrin, dvs. transferrin som bærer to eller færre sialylresiduer, relativt øket i innhold sammenlignet med ikke-alkoholikker, dvs. fra et normalt nivå på omkring 1-3% til 6-25% av det totale transferrininnhold fra pasientes serum. Desialylert transferrin, ofte betegnet karbohydrat-defisient transferrin (CDT) blir nå generelt betraktet som en klinisk pålitelig markør for kronisk alkoholisme. Imidlertid er de eksisterende metoder for mengdebestemmelse av transferrinvarianter tidskrevende og krever avansert biokjemisk utstyr, således, i mangel av en enkel og passende test for den desialylerte transferrinmarkør, blir kronisk alkoholisme for tiden fremdeles diagnostisert på basis av klinisk historie, informasjon fra pasientene selv angående deres alkoholforbruk, og et antall laboratorie-forsøk, hvorav alle har begrenset følsomhet og spesi-fisitet. Blodalkoholnivå er et pålitelig mål kun når blod blir tatt i løpet av 24 timer etter alkoholinntak. Alle kjente kliniske kjemiske tester har følsomheter og spesi-fisitet som er for lave til pålitelig å kunne identifisere alle alkoholmisbrukere. Mikroheterogeniteten hos transferrin og dets korrelasjon med alkoholmisbruk ble først påvist i 1980. (Stibler H, Sydow 0, Borg S. "Quantitative estimation of abnormal microheterogeneity of serum transferrin in alcoholics". Pharmac. Biochem. Behav, 1980, 13 Suppl. 1,47-51). Den kliniske viktighet av denne mikroheterogenenitet er blitt ytterligere undersøkt, og isoelektrisk fokusering og kromatofokuseringsmetoder for kvantitativ adskillelse av de forskjellige transferrinvarianter er blitt studert (Vesterberg 0, Petren S. og Schmidt E., Illncreased concentrations of a transferrin variant after alcohol abusell. Clinical Chemica Acta, 141 33-39, 1984. Storey E.L., Mark U., Powell L.W. and Halliday J.W.: IlUse of chromatofocusing to detect a transfer-rinvariant in serum of alcoholic subjectsll. Clin. Chem. 31: 1543-1545, 1985). Joustra and Blanche innleverte i 1984 en fremgangsmåtepatentansøkning i Sverige og Stibler, Borg og Joustra publiserte i 1984 en minikolonneanionebyt-terkromatograferingsmetode for kvanti-filtrering av karbohydrat-defisient transferrin i serum i forbindelse med alkoholforbruk. (Stibler H., Borg S. og Joustra M.: Al-coholism 10; 535-544, 1986. Joustra M. & Blanche C. svensk patentsøknad 8400587-5). Disse metoder er basert på isokratisk ionebytterkromatograferingsadskillelse av transferrinvariantfraksjonene i serumsprøver, fulgt av dobbelt antistoff-radioimmunoassay bestemmelse av transfer-rininnholdet av de forskjellige fraksjoner. Denne ionebytterkromatograf eringsteknikk adskiller alle transferrinkom-ponenter som har 2 eller mindre sialinsyreresiduer som således har isoelektrisitet over pH 5,65. Ved å bruke denne metode kunne 77 alkoholpasienter klart bli adskilt fra 80 friske "normale forbrukere" og 33 total-avholdspersoner ved at de hadde økete transferrinvarianter med isoelektriske punkter (pl) over pH 5,65.

Hovedproblemet med disse metoder er at de er tungvinte og tidskrevende å utføre. En totrinns-fremgangsmåte krever nødvendigvis en kromatografisk adskillelse av transferrinvariantene i serumsprøvene, fulgt av en immunoassay mengdebestemmelse av transferrinvariantene som således er adskilt. En behov finnes således for en pålitelig og enkel undersøkelse for forskjellige analyttvarianter i en blandet populasjon av analyttvarianter og spesielt for en forbedret metode for å påvise de forskjellige varianter av transferrin .

Slike analyttvarianter av klinisk interesse er normalt proteininneholdende av natur og har ofte en lett påviselig proteininnholdende bindingspartner med hvilket de danner et kompleks. Oftest er analyttvarianten antigenisk og bindingspartneren er derfor et antistoff, selv om mange proteiner er spesielt kjent for å binde andre proteiner eller peptider og kan således betraktes som bindingspartenere. Således er f.eks. proteinet haptoglobin en spesifikk bindingspartner for hemoglobin. Slike bindingspartnere kan bli merket, f.eks. med et enzym eller annet reporter-atom eller gruppe og kan så bli brukt ved påvisningsfremgangsmåter for å merke analyttvariantene av interesse.

Foreliggende oppfinnelse er basert på konseptet at proteininneholdende analyttvarianter kan bli merket før separasjonen ved å bruke merkete bindingspartnere, slik at påvisning av markøren etter separasjon i de separerte fraksjoner gir en kvantitativ indikasjon på de relative mengder av variantene. Imidlertid er det blitt funnet viktig at analyttvariantene omsettes med en populasjon av merkete bindingspartnere som er reaktive overfor alle de forskjellige analyttvarianter som skal analyseres, men har en i hovedsak uniform fordeling eller mobilitet i et gitt fraksjonerings- eller separasjonssystem.

En slik fremgangsmåte er vesentlig enklere i sin virkning enn tidligere systemer som anvender separasjon fulgt av konvensjonelle immunoassays på de enkelte fraksjoner.

Således fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å bestemme konsentrasjonen av et subsett av varianter i en populasjon av proteinholdige analyttvarianter med evne til å bli separert med et fraksjoneringssystem, hvor fremgangsmåten er særpreget ved at nevnte populasjon av varianter settes i kontakt med en populasjon av merkete proteinholdige spesifikke bindingspartnere for disse for å danne merkete bindingspartner-analyttkomplekser som så blir underkastet separasjon med nevnte fraksjoneringssystem i én eller flere fraksjoner inneholdende nevnte subsett av analyttvarianter i kompleks-bunnet form og bestemmelse av mengden av markør i én eller flere således erholdte fraksjoner hvor nevnte populasjon av spesifikke bindingspartnere har, før reaksjonen i hovedsak, uniform fordeling eller mobilitet i nevnte fraksjoneringssystem.

Som brukt heri er uttrykket "proteinholdig" ment å inn-befatte alle molekyler som i hovedsak har proteinnatur, innbefattende både peptider og polypeptider, men som kan bære ytterligere enheter av ikke-proteinnatur, f.eks. lipid- eller karbohydratgrupper.

Siden bindingspartneren i variant/bindingspartnerkomplekset oppviser en i hovedsak uniform fordeling eller mobilitet i det valgte fraksjoneringssystem, er forskjellene mellom mobilitetene eller fordelingene av variant/bindingspartner-kompleksene bunnet i forskjellene mellom variantene i disse komplekser, med andre ord, analyttvariansen. En eller flere fraksjoner av disse således erholdte variant/bindingspart-nerkomplekser kan bli adskilt av det valgte fraksjoneringssystem, og mengden av markør i hver adskilt fraksjon blir funnet.

I et ytterligere aspekt fremskaffer oppfinnelsen også en blanding for å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og som omfatter merkete proteinholdige bindingspartnere, f.eks. antistoff eller immunoreaktive fragmenter derav, som har en i hovedsak uniform mobilitet eller fordeling i én eller flere fraksjoneringssystemer. I enda et ytterligere aspekt er det fremskaffet et analytisk forsøkssett omfattende nevnte blanding sammen med reagensene og/eller materialene som er nødvendige for å utføre nevnte fraksj onering.

Passende er analyttvariantene forskjellige i henhold til deres ladning i et gitt buffersystem og kan således lett adskillles med et ladningsbasert system slik som ionebytterkromatografi eller elektroforese. Alternativt kan analyttvariantene være forskjellige i sine isoelektriske punkter (pl) og kan adskilles med isoelektrisk eller kromatofokusering. Således kan f.eks. "Mono-P"-kolonnen og "Polybuffer" kromatofokuseringssystemet til Pharmacia, Sverige bli brukt. Isoelektrisk fokusering av kompleksene kan finne sted i to-dimensjonelle gelark, eller alternativt kan kompleksene bli adskilt ved enkelt elektroforese i agarosegel. Et bredt område av ioneutbyttermedia og fastfaser kan bli brukt i fremgangsmåten fremskaffet ved foreliggende oppfinnelse. De ioniserbare kjemiske residuer på disse media kan bli erstattet med, men er ikke begrenset til, aminresiduer eller sulfonerte eller kar-boksylerte residuer, og kan være støttet på kuler, partikler, geler, membraner, filtre eller enhver annen egnet fast fase. Selv om slike fraksjoneringssystemer er enkle å bruke og gir gode resultater og således er foretrukket i henhold til oppfinnelsen kan ethvert annet fraksjoneringssystem som anvender en egenskap hvor analytten er variant, og hvor den valgte bindingspartner derfor er konstant, bli brukt.

Resiner eller partikler kan bli brukt i oppslemmete pors-jonsformer eller i kolonner.,Kolonner kan bli eluert med salt eller pH-gradienter eller ved isokratisk eluering. Fra et praktisk synspunkt er oppslemningsporsjonsformer og isokratisk eluering foretrukket. Magnetiserbare partikler ble funnet å være spesielt fordelaktige. Ionebytter-fastfase kan også være konstituert av en stiv tre-dimensjonal struktur eller av ionebytterfiltre. Hvis et filter blir brukt kan filtreringen utføres parallelt med overflaten, f.eks. radielt eller langs en filterstrimmel.

Passende foreligger alle eller enkelte av de forskjellige reagenser og komponenter som er nødvendige for å utføre separasjonstrinnet i settform sammen med den merkete bind-ingspartnerblanding. Som nevnt ovenfor danner dette et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen. Slike reagenser og materialer innbefatter generelt buffersalter eller -opp-løsninger, surfaktanter, f.eks. "Tween"® og lignende, preservativer, f.eks. natriumazid, de forskjellige geler, resiner eller andre media som er nødvendige for å utføre fraksjoneringstrinnet, eventuelt ferdig sammensatt for bruk f.eks. som kolonner, etc..

Som tidligere indikert blir, etter at analyttvariant/bin-dingspartnerkompleksene har dannet seg, kompleksene isolert og mengden av markør som er tilstede i kompleksfraksjo-nen(e) blir bestemt.

Slike markører kan bestå av ethvert konvensjonelt markørsy-stem som er kjent i faget. Således kan markørene være fluorescente, fargete, radioaktive eller enzymatiske og kan bli påvist på kjent måte. Radioaktive markører vil generelt bli valgt fra radioisotoper som vanligvis blir brukt i radioimmunoassay, f. eks. I<125>, og mange fluorescente og fargete markører er blitt beskrevet. Således innbefatter passende fluorescente markører dimetylaminonaftalen, fluorescein, diklortriazinyl-aminofluorescein eller fluorescente metallforbindelser. Eksempler på fargete markører innbefatter 4-dimetylaminobenzen, 4-N,N-dimetylaminoazobenzen, trinitrobenzen, benzofuraziner, tetrametylrhodamin, texas rødt, morfolinorhodamin og derivater derav, azobenzener, antrakinaner, oksaziner, tiaziner, triaziner, porfyriner, fykobiliner, korofyll, indigo fargematerialer og analoger eller derivater derav.

Som nevnt ovenfor kan enhver proteinholdig bindingspartner for den aktuelle analytt bli brukt forutsatt at den har uniform mobilitet eller fordeling i de valgte fraksjoneringssystemer. Antistoff er generelt foretrukne bindingspartnere for antigener og haptener, men andre bindingspart-nersystemer kan bli anvendt for å passe situasjonen, f.eks. haptoglobin-hermoglobin eller hormonreseptorsystemer.

Immunoreaktive antstoff-fragmenter f.eks. F(ab) eller F(ab<1>)2fragmenter kan også bli brukt sålenge oppførslen til det gitte fraksjoneringssystem forblir uniform. Slike fragmenter kan passende bli S-blokkert, f.eks. med S-kar-boksymetyl-grupper.

F(v) fragmenter, dvs. de hypervariable områder av F(ab) fragmenter kan også bli brukt og kan være av syntetisk opprinnelse, via rekombinant DNA-teknologi eller kjemisk syntese.

Søker har funnet at hvor den molare mengde av et merket antistoff eller f(ab)2 fragment er omtrent lik eller i overskudd av den til analytten inntreffer signifikant kryssbinding grunnet den divalente reaktivitet av det merkete reagens. Dette gir en lav beregning av antallet analyttmolekyler. I mange tilfeller er det følgelig foretrukket å anvende monovalente merkete analyttbindings-partnere, spesielt F'(ab) eller F (v) fragmenter av passende antistoff.

Det bør bemerkes at slike monovalente fragmenter sann-synligvis er utsatt for mindre variabilitet, spesielt når de dannes syntetisk, og dersom de merkes nøye på en uniform måte behøver de ikke kreve et fraksjoneringstrinn for å oppnå kriteriet med uniform mobilitet eller fordeling i det gitte fraksjoneringssystem.

Nedenfor, for enkelthets skyld, innbefatter referanser til"antistoff" fragmenter av antistoff med mindre annet er angitt. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for analyse av nivåene til forskjellige varianter av transferrin. Således i en spesiell utførelsesform fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å bestemme varianter av transferrin ofte betegnet iso-transferriner i blodplasma, serum, fullblod eller hemo-lysat. Som tidligere nevnt er transferrinvariantene forskjellige i hovedsak ved det forskjellige antall sialinsyreresiduer på transferrinmolekylene. Den nye fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis å sette prøven i kontakt med en populasjon av merkete antistoff som er reaktive mot human transferrin og som har en i hovedsak uniform mobilitet eller fordeling i et fraksjoneringssystem valgt fra elektroforese, ionebytting, kromatofokusering eller isoelektrofokusering. Foretrukket finner antistof-fbindingstrinnet sted i en jernioneinneholdende buf-feroppløsning som tillater antigen-antistoff-komplekser å bli dannet. Slike antigenantistoffreaksjoner finner fortrinnsvis sted nær nøytralt pH, fortrinnsvis mellom pH 5 og pH 9, og ved en saltkonsentrasjon og sammensetning som ikke hemmer slike antigenantistoffkomplekser i å bli dannet.

De merkete antistoff er fortrinnsvis monoklonale antistoff, men polyklonale antistoff kan bli brukt siden opprensk-ningsbehandlingene beskrevet heri sikrer uniforme egenskaper .

Merkete F(ab) eller F(v) fragmenter av antitransferrinantl-stoff er nye substanser med spesiell bruk i transferrinvariantanalyse. Selv når de er relativt ikke-uniforme er de i stand til å gi bedre resultater enn hele antistoff. Fraksjonerte merkete F(ab) og F(v) fragmenter som er av uniform mobilitet eller sammensetning i ett eller flere fraksjoneringssystemer er spesielt foretrukket.

Transferrinene i prøven kan være mettet med jernioner før eller samtidig med eller etter eksponering til antistoffene. Jernionemetting av transferrinene før eller samtidig med separasjonen av antigen-antistoffkompleksene ved hjelp av nevnte separasjonssystemer er generelt nødvendig for transferrinvariantanalyse med denne teknologi, siden forskjeller i jernioneinnholdet av variantene vil viske ut fordelingsmønstret i de nevnte erholdte sep-arajonssystemer grunnet forskjell i sialinsyreinnhold.

Den foretrukne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen for transferrinvariantanalyse krever å utsette blandingen av variant/antistoffkomplekser for en kromatofokusering, ionebytting, elektroforese eller isoelektrisk fokuserings-separasjonssystem. Siden de merkete antistoff har en i hovedsak uniform mobilitet eller fordeling i én av disse separasjonssystemer danner disse merkete antistoff antigenantistoffkomplekser med transferrinvariantene (iso-transferriner) med forskjeller i mobilitet eller fordeling i én av nevnte separasjonssystemer tilsvarende, men ikke nødvendigvis, identisk med mobilitets- eller fordel-ingsforskjellene mellom transferrinvariantene. Monoklonale antistoff som er reaktive mot humantransferrin generelt, og som har en i hovedsak uniform mobilitet eller fordeling i én av nevnte separasjonssystemer kan bli dannet ved konvensjonelle hybridomteknikker, og kan modifiseres med kjemiske teknikker om nødvendig, opprenskning av de øns-kede antistoff er generelt nødvendig og blir fortrinnsvis oppnådd ved å bruke én av de nevnte systemer, f.eks. f.eks. kromatofokusering, ionebytterkromatografi, isoelektrisk fokusering eller elektroforese.

Et undersøkelsessett ifølge oppfinnelsen for bruk ved transferrinanalyse omfatter fortrinnsvis merkete anti-transferrinantistoff, eller spesielt foretrukket merkete Fabfragmenter av slike antistoff, sammen med minst ett jernionisk salt eller oppløsning.

I flere utførelsesformer av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er merkete antistoff eller andre proteinholdige bindingspartnere med utvalgte områder for isoelek triske unkter, eller som oppviser en spesiell fordeling eller mobilitet i nevnte separasjonssystemer, foretrukket. For å erholde slike modifiserte proteiner, kan proteinene bli modifisert før eller etter merketrinnet. Generelt vil slike modifikasjoner endre antallet ladete grupper, f.eks. sure eller basiske grupper, i molekylet. En slik modifikasjon kan bli oppnådd ved bruk av reagenser som reagerer med sidekjedene av aminosyrene hos proteinene, som beskrevet f.eks. i Glazer, Delange and Sigman: "Chemical modification of proteins", Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford 1975, og annen relevant litteratur. Som et eksempel kan aminresiduer bli modifisert ved karbamylering, acetylering, benzylering elle succinylering og karboksyl-syreresiduer kan bli modifisert ved estrifisering og kobling til nukleofiler ved bruk av karbodiimider eller andre koblingsmidler. På lignende måte kan karbohydratenhetene av antistoffene eller andre proteinholdige bindingspartnere modifiseres.

En passende metode for modifikasjonene som ofte er nødvendig for fremstillingen av de merkete glykoprotein-bindingspartnerblandinger ifølge foreliggende oppfinnelse er perjodatoksyderingen av karbohydratenhetene av glyko-proteiner fulgt av reaksjon av det resulterende aldehyd med reagenser som innfører sure eller basiske grupper. Andre egnete metoder som er passende for proteiner med disulfidbroer'er partiell reduksjon av disulfidbroene hos cystin mellom aminosyrepolypeptidkjedene av proteinene. Antistoff inneholder spesielt flere slike disulfid-bindinger, og flere, men ikke alle, av disulfidbindingene kan reduseres til frie tioler uten å påvirke affiniteten av antistoffene for antigenene. Disse bindinger, og således de resulterende tioler, ligger i hengselområdet hos antistoffene fjernt fra de antigenbindende seter av antistoffene. 2-tioetanol og ditiotreitol er eksempler på slike reduksjonsmidler, men ikke i en begrensende for-stand. Etter fjerning av reduksjonsmidlet bli reagenser som innfører sure eller basiske grupper bunnet til de fri tioler ved hjelp av bifunksjonelle koblingsmidler som reagerer med tiolenheter og nukleofile enheter, f.eks. sulfosuccinimidyl-4- (N-maleimidometyl)cykloheksan-1-karboksylat, sulfosuccinimidyl(4-jodoacetyl)aminobenzoat eller andre succinimidylmaleimidinneholdende reagenser, i en enkel eller to-trinns prosedyre. Alternativt kan reagenser som innfører sure eller basiske grupper bli bundet ved hjelp av substituerte pyridyldisulfider eller tiol-inneholdende reagenser som reetablerer en disul-fidbinding, men som bærer en kjemisk enhet med sure eller basiske kjemiske egenskaper.

I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen kan det nukleofile reagens bestå av en sur polymer, f.eks. polypeptider med én eller flere sure sidekjeder på aminosyrene.

Fordelen med karbohydratmodifisering og/eller modifikasjon ved reduksjon av cystin i hengselområdet er den minimale interferens med antigenbindingssetene til de således erholdte antistoffene. Imidlertid kan sure polypeptider også bli bundet til lysinresiduer eller andre residuer av polypeptidstrukturen hos antistoffene.

I tilfellet med transferrinvariantanalyse er transferrinvarianter som bærer to eller ferre sialinsyreresiduer og som har en pl verdi høyere enn transferrinvariantene med tre eller flere sialinsyreresiduer, av spesiell interesse. En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse bruker anionebytterresiner ved en pH og bufrende saltkonsentrasjon og blanding hvor antigen-antistoffkompleksene av transferrinvariantene med tre eller flere sialinsyreresiduer binder seg til anionebytterfastfasen, i mot-setning til antigenantistoffkompleksene med transferrinvarianter som har 2 eller ferre sialinsyreresiduer, som ikke gjør dette. I denne utførelsesform er merkete antistoff, om nødvendig modifisert, som binder anion-ebytterf ast f asen foretrukket for således å etterlate alene i oppløsning kun det merkete antistoff som har dannet komplekser med transferrinvarianter med 2 eller ferre sialinsyreresiduer. Bette er illustrert skjematisk i fig. 1. Den faktiske separasjon, pH og buffersammensetning er valgt basert på pl av de merkete monoklonale antistoff og kompleksene som blir dannet. Etter separasjon f.eks. ved sentrifugering eller filtrering, dersom fastfasen er i oppslemmet porsjonsform eller ved magnetisk separasjon dersom den faste anionebytterfase er magnetiserbar eller ved eluering dersom den faste fase er i en stiv eller en kolonneform, blir målinger av den gjenværende markør i oppløsningen brukt for å erholde et mål for konsentrasjonen av antigen-antistoffkompleksene som tilsvarer konsentrasjonen av transferrinvariantene som har to eller mindre sialinsyreresiduer.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli utført med merkete bindingspartnere ved en konsentrasjon som ligger over den totale mengde av analytt (alle varianter) eller med analytten i overskudd av bindings-partnerne. Når bindingspartnere blir brukt i overskudd blir signaler som tilsvarer den totale konsentrasjon av de forskjellige varianter erholdt. Nå analytt er tilstede i overskudd blir signaler som tilsvarer den relative mengde av de forskjellige varianter i forhold til den totale konsentrasjon av alle varianter erholdt.

Hvor den merkete bindingspartner skal brukes i overskudd er den fortrinnsvis monovalent. Som indikert ovenfor har divalente bindingspartnere, slik som antistoff, en tendens til å kryssbinde til to separate analyttmolekyler spesielt når de brukes i passende ekvimolare mengder. Således, for dette formål er F(ab) eller F(v) fragmenter foretrukket.

I tilfellet med et bindingspartnersystem under anvendelse av antistoff eller fragmenter mot antigenanalytter, kan dersom et antigenoverskudd blir brukt, merkete antistoff, om nødvendig modifisert, renset ved hjelp av affinitets- kromatografi ved å bruke immobiliserte antigener eventuelt bli brukt. Således kan nære på 100 % av antistoffene eller fragmentene være immunoreaktive, for således å redusere fraskjonen av fri ikke-komplekse antistoff eller fragmenter i undersøkelsen til en meget lavt nivå. På denne måte kan potensiell interferens i antigenvariantanalysemetoden bli redusert eller unngått.

Fordelen med foreliggende oppfinnelse er kombinasjonen av immunologisk mengdebestemmelse og fraksjonering i én opera-sjon erholdt ved å adskille kompleksene dannet mellom de merkete bindingspartnere og de forskjellige analyttvarianter fulgt av immunologisk mengdebestemmelse. Således gjør foreliggende oppfinnelse det mulig å måle transferriner og andre analyttvarianter mye lettere enn ved tidligere teknikk, spesielt for det formål å måle transferrinvariantene med lavt sialinsyreinnhold i blod-serum av plasma fra personer som undergår undersøkelser relatert til alkoholforbruk.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen på en ikke-begrensende måte under henvisning til tegning-ene ,

hvor

Figur 2 representerer en isoelektrisk fokusserende gel som viser pl av modifiserte og merkete antistoff mot humant transferrin; Figur 3 viser grafisk separasjonen av antitransferrin FITC derivater med ionebytterkromatografi på en sterk anionebyt terkolonne (Buffer: 20 nM natriumfosfat pH 6,5). Den heltrukne linje indikerer UV absorbanse ved 280 nm, den stiplete linje saltgradienten (M NaCl); Figur 4 viser grafisk den ytterligere separasjon ved re kromatografering på en sterk anionebytterkolonne av 3 sideliggende fraksjoner av anti-transferrin FITC derivater erholdt fra fremstillingen vist i fig. 2. (Buffer: 20 mM natriumfosfat pH 6,5); Figur 5 viser grafisk fluorescenssignalene av fraksjoner av serumprøver blandet med FITC-merkete anti-transferrinmono klonale anstistoff, erholdt fra ionebytterkromatografi (representerer serum fra en alkoholmisbruker, + serum fra en avholdsmann), Figur 6 viser grafisk fluorescenssignalene av fraksjoner erholdt fra ionebytterkromatografi av komplekser av anti-transferrinmonoklonale antistoff og disialo- og tetrasialo- (+) humant transferrin, Figur 7 viser grafisk resultatene av preparativ anionebytterkromatografi av et merket, ikke-renset preparat av monoklonale anti-transferrinantistoff; Figur 8 viser grafisk mobiliteten i et anionebyttersystem av en enkelt fraksjon erholdt fra kromatograferingen ifølge fig. 7, Figur 9 viser grafisk fluorescensen av fraksjoner av FITC Fab-transferrinkomplekser fra serumprøver fra en alvorlig alkoholist (- -) og en normal pasient ( ) eluert fra en anionebytter (mono Q) kolonne.

EKSEMPEL 1

Fra kommersielt tilgjengelig bukvæske fremstilt i mus med anti-transferrin IgG-dannende hybridoma blir monoklonale antistoff renset' ved hjelp av ionebytterkromatograf i og gelkromatografi i fosfatbuffer. Immunoaffiniteten av antistoffene ble undersøkt med et mikrotiter ELISA system under anvendelse av immobilisert humant transferrin og peroksydase-konjugerte polyklonale anti-muse-IgG antistoff i oppløsning. De rensete antitransferrinantistoff ble dialysert mot 0,1 M eddiksyrebuffer med pH 5,6, og oksydert av perjodationer (50 nM endelig konsentrasjon). Etter fjerningen av perjodationene med gelkromatografi ble antistoffene omsatt med det sure polypeptid N-ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu- glu-COOH i 50 gangers molart overskudd til antistoffene fulgt av en stabilisering av bindingen ved hjelp av cyanoborhydridioner i oppløsning (endelig konsentrasjon = 15 mM). De resulterende modifiserte antistoff ble dialysert mot 0,1 M natriumkarbonatbuffer pH 9,5, og omsatt med 2-tioetanol ved en endelig konsentrasjon på 10 mm i 30 minutter ved romtemperatur, fulgt av fjerning av 2-tioetanolen ved gelkromatografi i fosfatbuffer ved pH 7,4. N-ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu-COOH ble omsatt med de resulterende frie tioler av proteinet ved hjelp av sul-fosuccinimidyl-4-(N-maleimidometyl)(cykloheksan-l-karboksyl at, med molare forhold på 1:33:40 av antistoff:koblings-reagens: peptid. Etter påfølgende dialyse mot karbonat-buffer ble de modifiserte antistoff omsatt med fluorescein-isotiocyanat og deretter renset ved gelkromatografi. Ved hvert trinn av disse modifikasjoner ble antigen-affiniteten undersøkt og kun en meget liten reduksjon ble funnet. Figur 2 viser resultatene av isoelektrisk fokusering utført i gelelektro forese (Phast System, Pharmacia), og oppviser reduksjonen i den oppnådde pl. En vesentlig fraksjon av modifiserte og merkete antistoff har en pl som er lik eller lavere enn isotransferrinene med to eller flere sialinsyreresiduer. I denne figur angir (a) til (e) det følgende:

a) Humant transferrin

b) Umodifisert monoklonalt antitransferrin IgG

c) Samme som b), men hvor ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu er blitt koblet til karbohydratenhetene d) Samme, som c), men hvor i tillegg ala-ala-ala-ala-glu-glu-glu-glu-glu er blitt koblet til hengselområdet e) Samme som d), men hvor fluoresceinisotiocyanat er blitt omsatt med proteinet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er en i hovedsak uniform fordeling eller mobilitet av antistoffene i det relevante separasjonssystem nødvendig. Om ikke, vil heterogeniteten av antistoffkompleksene gjøre separasjonen og mengde-bestemmelsen av kompleksene og antistoffene med de forskjellige antigenvarianter umulig.

Figur 3 viser heterogeniteten av modifisert monoklonale antistoff vurdert ved preparativ anionebytterkromatografi.

De stiplete vertikale kolonner indikerer oppsamlingen av 20 fraksjoner fra denne preparative anionebytterkromatografi for å erholde fraksjoner med et smalt pH område.

Figur 4 viser resultatene fra en analytisk kromatografi av porsjoner fra tre av de forskjellige naboliggende fraksjoner erholdt fra nevnte preparative kromatografi, som viser at nære på uniforme mobiliterer ble erholdt for hver fraksjon. Enda mere uniforme fraksjoner kan bli erholdt ved bruken av en mindre bratt gradientprofil ved elueringen, gjentatte kromatograferinger eller andre kromatografiske teknikker. Alternativt eller i kombinasjon kan preparativ isoelektrisk fokusering eller kromatofokusering bli benyt-tet . Når forsøksprøven blir blandet med nevnte merkete monoklonale anti-human-transferrin-antistoff som har en uniform eller nære på uniform mobilitet eller fordeling, blir antigen-antistoffkompleksene med forskjellige mobiliteter eller fordeling i det tilsvarende separasjonssystem dannet, noe som reflekterer forskjellene mellom transferrinvariantene. De forskjellige antigen-antistoff-komplekser blir adskilt med ionebytterkromatografi, kromatofokusering eller isoelektrisk fokusering eller elektroforese eller andre kjemiske teknikker som anvender forskjellene i elektrisk ladning av de dannet komplekser.

EKSEMPEL 2

Analyse av prøver av sera fra alkoholmisbrukere og av holdspersoner

Fast fase:

En 1 ml's kolonne av • polystyrenpartikler med kvaternære aminsubstituerte overflateresiduer (Mono-Q kolonne fra Pharmacia, Uppsala, Sverige).

Elueringsmiddel:

20 mM bis-tris buffer med 100 mM natriumklorid pH 6,50.

Fremgangsmåte:

En 10 p.1 serumprøve ble blandet med j erneitratoppløsning i 20 ganger molart overskudd i forhold til transferrininnhol-det av prøven, fulgt av tilsetning av monoklonale musean-tihumane transferrinantistoff som er reaktive overfor alle varianter av humant transferrin og som har blitt modifisert og merket med fluorescein og renset for å ha en meget homogen mobilitet i nevnte ionebyttersystem - i en 1:1 molar konsentrasjon av serumkonsentrasjonen av transferrin, og i nevnte elueringsbuffer. Etter en kort inkulbering ved romtemperatur (5-10 minutter), ble blandingen eulert gjennom kolonnen, fulgt av ytterligere eluering med elue-ringsbuf f er. 1,0 mils fraksjoner ble samlet opp og fluorescensen av fraksjonene ble målt (Excitation 485 nm, Emmission 52 0 nm, målt på en Shimadzu spektrofotometer RF-540). Figur 5 viser et typisk mønster erholdt med sera fra alkoholikere og avholdspersoner. For sammenligning er tilsvarende mønster erholdt med prøver av oppløsningsrenset disialo- og tetrasialo-transferriner i stedet for serum vist i figur 6.

EKSEMPEL 3

Analyse av antistoff- fraksjonen anvendt i eksempel 2

Figur 7 er et kromatogram som viser resultatene fra preparativ anionebytterkromatografi av et merket ikke-renset preparat av monoklonalt antistoff fra eksempel 2. Fra dette ble kromaografifraksjoner hver på 0,5 ml samlet opp og figur 8 er et kromatogram som viser hvordan hver fraksjon har en meget smal eller homogen mobilitet i anionebytterkro-matograf isystemene . Kromatografi ble utført på en Pharmacia Mono Q HR5 anionebytterkolonne, ekvilibrert med 2 0 mM Tris buffer, pH 8,0 (Buffer A) og eluert ved å bruke en elue-ringsgradient med Buffer B (Buffer A inneholdende 0,7M NaCl).

Eksempel 4

Fremstillingen av fluorescein- merkete monoklonale Fab-fragmenter med en i hovedsak uniform mobilitet på en anionebvttermatrise

Fra kommersielt tilgjengelig bukvæske fremstilt i mus ved etablert teknologi ved å bruke et anti-transferrin IgG-produserende hybridoma, ble monoklonale antistoff renset ved hjelp av ionebytterkromatografi og påfølgende størrel-sesutskillende gelkromatografi i en fosfatbuffer. Bufferen ble så endret til en karbonatbuffer før fordøying av IgG antistoffene til Fab antistoff- fragmenter ved bruken av papain i kombinasjon med ditiotreitol.

Etter denne enzymatiske modifisering ble frie tiolgrupper (innbefattende frie tiolgrupper på antistoffet) blokkert med jod-acetainid som også stopper den enzymatiske aktivitet. De dannete Fab-fragmenter renses med en kombinasjon av dialyse og anionebytterkromatografi.

Rensete antistoff-fragmenter (Fab) dialyseres mot en karbonatbuffer pH 9,5 før modifisering med fluorescein-isotiocyanat. Fluorescein binder til aminogrupper på antistoffet og fluorescein-merket Fab renses med størrel-sesutskillende kromatografi før endelig isolering av en fraksjon av merket Fab fra en anionebytterkromatografi-kolonne. Denne fraksjon er særpreget ved å ha en høy grad av homogenitet med hensyn til det isoelektriske punkt og har således i hovedsak uniform mobilitet på en anionebyttermatrise.

Immunoaffiniteten av det merkete Fab undersøkes med et mikro-titer ELISA system ved å bruke immobilisert humant transferrin og peroksydase-konjugerte polyklonale antimuse-IgG antistoff i oppløsning.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av AMCA- merkete monoklonale Fab- fraqnenter med en i hovedsak uniform mobilitet på en anionebvtternatrise

Fra kommersielt tilgjengelig bukvæske fremstilt i mus med etablert teknologi ved å bruke et anti-transferrin IgG-dannende hydridoma, ble monoklonale antistoff renset ved hjelp av ionebytterkromatografi og etterfølgende størrel-sesutskillende gelkromatografi i en fosfatbuffer. Bufferen blir så endret til en karbonatbuffer før fordøying av IgG antistoffene til Fab antistoff-fragmenter ved bruk av papain i kombinasjon med ditiotreitol. Etter denne enzymatiske modifisering ble frie tiolgrupper (innbefattende frie tiolgrupper på antistoffet) blokkert med jod-acetamid som også stopper den enzymatiske aktivitet. De dannete Fab fragmenter renses med en kombinasjon av dialyse og anione-bytterkromatograf i .

Rensete antistoff-fragmenter dialyseres mot en boratbuffer pH 8,0 før tilsetningen av 7-amino-4-metyl-kumarin-3-eddiksyre-N-hydroksy-succinimid (AMCA-NHS). MCA-NHS tilsettes fra en DMSO oppløsning og reagerer med de frie aminogrupper hos Fab-molekylet. AMA-Fab renses ved mole-kylær størrelseseksklusjonskroinatografi og endelig med en anionebytterkromatografi for å oppnå en fraksjon med en i hovedsak uniform mobilitet- i en anionebyttermatrise.

Immunoaffiniteten av det merkete Fab undersøkes med et mikro-titer ELISA system ved å bruke immobilisert humant transferrin og peroksydase-konjugerte polyklonale antimuse-IgG antistoff i oppløsning.

EKSEMPEL 6

Fremstilling av RESO- merkete monoklonale Fab- fragnenter med en i hovedsak uniform mobilitet i en anionebvttermatrise

Fra kommersielt tilgjengelig bukvæske fremstilt i mus med etablert teknologi ved å bruke et anti-transferrin IgG-produserende hybridom ble monoklonale antistoff renset ved hjelp av ionebytterkromatografi og etterfølgende størrel-sesekskluderende gelkromaografi i en fosfatbuffer. Bufferen ble deretter endret til en karbonatbuffer før fordøying av IgG antistoffene til Fab antistoff-fragmenter ved å bruke papain i kombinasjon med ditiotreitol.

Etter denne enzymatiske modifikasjon blir de frie tiolgrupper (innbefattende frie tiolgrupper på antistoffet) blokkert med jod-acetamid som også stopper den enzymatiske aktivitet. De dannete Fab fragmenter renses ved en kombinasjon av dialyse og anionebytterkromatografi.

Renset antistoff-fragment dialyseres mot en 0,1 M karbonat-buf f er pH 8,5. N-(resorufin-4-karbonyl)-piperidin-4karbok-sylsyre-NI-hydroksysuccinimidester (RESOS) i en DMSO oppløsning tilsettes i molart overskudd og reagerer med aminogruppene hos antistoffer under romtemperaturinkube-ring. Merket Fab renses med en molekylstørrelseseksklu-sjonskolonne fulgt av anionebytterkromatografi. En fraksjon med i hovedsak uniform mobilitet på anionebyttermatrisen isoleres.

Immunoaffiniteten av det merkete Fab undersøkes med et mikro-titer ELISA system under anvendelse av immobilisert humant transferrin og peroksydase-konjugerte polyklonale antimuse-IgG antistoff i oppløsning.

EKSEMPEL 7

Påvisning av desialvlerte transferriner i sera fra pasienter

Undersøkelsen for desialylert transferrin utføres på jern-mettete serumprøver. Jernmetning utføres ved å_tilsette 5 ul FeCl3, 0,25 mg/ml i en 0,2 M Tris-maleat pH 7,0 oppløs-ning til 2 0 ul serum og inkubering ved romtemperatur i 2 0 minutter.

Forsøksoppløsningen består av 10,2 ul jern-mettet-serum tilsatt 500 ul 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % "Tween 20", pH 8,0 inneholdende 5<*>10"<8>M FITC-Fab (fluorescein-merket anti-transferrin-Fab, ifølge eksempel 4 ovenfor). Denne oppløsning inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur før separasjon på en sterk anionebytterkolonne. 500 ul av den FITC-Fab-transferrin-kompleksinneholdende oppløsning separeres ved eluering med 20 mM TRIS-HCl, 70 mM NaCl,0,05% "Tween", pH 8,0 på en Mono Q (Pharmacia) kolonne. Fig. 9 viser resultatene av elueringen av FITC-Fab-transfer-rinkompleksene fra serumsprøver fra en alvorlig alkoholiker og en normal pasient. Fluorescensen i fraksjon i representerer ubunnet Fab, fluorescensen i fraksjonene 3-7 representerer FITC-Fab bunnet til desialylert transferrin og fluorescens i fraksjoner større enn 9 representerer FITC-Fab bunnet til normalt transferrin. Forskjeller i fluorescens i fraksjoner lavere enn nr. 7 skiller mellom alvorlige alkoholmisbrukere og individer som ikke misbruker alkohol.

EKSEMPEL 8

Påvisning av desialvlerte transferriner i sera fra pasienter ved å bruke engangs- minikolonner

Engangskolonner fremstilles fra sterk anionebyttergel ("A-Sepharosell, Pharmacia) under anvendelse av 0,5 ml av gelen i en kolonne med en indre diameter på 0,7 cm. Kolonnen ekvilibreres med 20 inM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05% "Tween-20", pH 8,0

Undersøkelsen på minokolonnen for desialylert transferrin utføres på jern-mettete serumsprøver. Jernmetning utføres ved å tilsette 5 ul FeCl3 0,25 mg/ml i en 0,2 M Tris-maleat pH 7,0 oppløsning til 20 ul serum og inkubering ved romtemperatur i 20 minutter.

Forsøksoppløsningen består av 10,2 ul jern-mettet serum tilsatt til 500 ul 20 mM Tris-HCl, 70 mM NaCl, 0,05 % "Tween-20", pH 8,0 inneholdende 5<*>10"<8>M FITC-Fab (fluorescein-merket anti-transferrin-Fab i henhold til eksempel 4 foran). Denne oppløsning inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur før separasjon på en sterk anionebytterkolonne. 100 ul av FITC-Fab-transferrin-kompleks-inneholdende oppløsning tilsettes til kolonnen og 3,0 ml av 20 mM Tris-HCl, 70 nM NaCl, 0,05% "Tween-20", pH 8,0 anvendes for å eluere de desialylerte transferrin-FITC-Fab komplekser. Det totale eluat samles opp og fluorescensen fra fluorescein måles og sammenlignes med en standard fortynning av de anvendte fluorescein-merkete Fab fragmenter. Resultatene blir brukt for å skjelne mellom alvorlige alkoholmisbrukere og individer som ikke misbruker alkohol.

EKSEMPEL 9

Et forsøk for desialvlert transferrin ( CDT) i serum ( 1)

MATERIALER

i. Oppløsning A: 150 kBq/ml<125>I-antitransferrin-Fab, 20 mM bis TRIS, 3,7<*>IO"<5>M Fe<3+->citrat, 66 mM NaCl,

5,,9 mM HC1, 3,1 mM Na-azid, 0,05 % "Tween 20", pH

7,0.

i.i. Oppløsning B: 2 0 mM bis-TRIS, 55 mM NaCl,' 5, 9 mM

HC1,

3,1 mM Na-azid, 0,05 % "Tween 20", pH 7,0.

iii. Kolonner for separasjon: 0,5 ml sterk anionebyttergel

("Q-Sepharose Fast FLowll, Pharmacia) ekvilibrert med oppløsning B.

iv. Forsøksrør.

Reagenser og kolonner lagres ved 4-8°C over lengere tidsperioder .

FREMGANGSMÅTE

1 : FORSØKSPREPARATOPPLøSNING

1.1: 30 ul serum tilsettes til 220 ul oppløsning A i et forsøksrør. Kun vanlige serumsprøver blir

brukt

1.2: Prøvene inkuberes i 1-10 minutter ved romtemperatur .

2: KOLONNESEPARASJON

2.1: Kolonnen tømmes for overflødig oppløsning ved å

fjerne først topp- og deretter bunnproppen. Oppløsningen tillates å elueres gjennom kolonnen

og eluatet kastes.

2.2: Et rør plasseres under kolonnen.

2.3: 200 ul forsøksoppløsning tilsettes. Det utvises forsiktighet ved å tilsette forsøksprøven direkte til toppfiltret i kolonnen. Prøven tillates å synke inn i toppfiltret før eluering ved å tilsette 3,0 ml oppløsning B. Kolonnen elueres inntil eluering stopper.

3: MÅLING

3.1: Den oppsamlete oppløsning måles ved gamma-telling

3.2: En referansekurve etableres basert på referan-seprøvene inneholdende kjente %-mengder av CDT 3.3: % CDT i ukjente serumsprøver beregnes ved å

bruke referansekurven.

EKSEMPEL 10

Et forsøk for desialvlert transferrin ( CDT) i serum ( 2)

MATERIALER

i. Oppløsning A: 0,14 mg/ml fluorescein-merket-antitransf errin-Fab, 5 mM TRIS, 55 mM NaCl, pH 8,0, 3,1 mM natriumazid.Oppløsning B: 2 0 mM bis-TRIS, 3,7<*>IO"5 M Fe3 + -citrat, 66 mM NaCl,

5,9 mM HC1, 3,1 mM Na-azid, 0,05 % "Tween 20",

pH 7,0.

iii: Oppløsning C: 20 mM bis-TRIS, 66 nM NaCl, 5,9

mM HC1, 3,1 nM Na-azid, 0,05 % "Tween 20", pH

7,0.

iv: Oppløsning D: 1,0 M TRIS-base, 3,1 mM Na-azid. v: Kolonner for separasjon: 0,5 ml sterk anionebyttergel ("Q-Sepharose Fast Flow",

Pharmacia)ekvilibrert med oppløsning C.

vi: Forsøksrør

Reagenser og kolonner lagres ved 4-8°C'over lengere tidsperioder.

Oppløsninger og kolonner ekvilibreres til romtemperatur før bruk.

Oppløsning A og oppløsninger inneholdende A bør beskyttes fra lys.

FREMGANGSMÅTE

1: DAGLIG FREMSTILLING AV INKUBERINGSOPPLøSNING

1.1: Oppløsning B blandes med oppløsning A ved å

blande 1 del oppløsning A med

10 deler oppløsning B

1.2: Inkuberingsoppløsning fremstilles som kun er tilstrekkelig for én dags undersøkelse. Et minimum på 23 0 ul er nødvendig for hvert forsøk, pluss 20 ul for referansemåling.

2: FORSØKSPREPARAT

2.1: 30 ul serum tilsettes til 220 ul inkuberingsoppløsning (se ovenfor) i et forsøksrør. Kun vanlige serumprøver bør

benyttes.

2.2: Prøvene inkuberes i 1-10 minutter ved romtemperatur .

3: KOLONNESEPARASJON

3.1Kolonnen tømmes for overflødig oppløsning ved først å fjerne topp- og deretter bunnproppen. Oppløsningen tillates å eluere gjennom kolonnen og eluatet kastes.

3.2: En kuvette plasseres under kolonnen.

3.3: 200 ul forsøksoppløsning tilsettes. Forsiktighet oppvises ved å tilsette forsøksprøven direkte til toppfiltret i kolonnen. Prøven tillates å synke inn i toppfiltret før eluering

ved å tilsette 3,0 ml oppløsning C. Eluering fortsettes- inntil den stopper.

3.4: 0,1 ml oppløsning D tilsettes til det oppsamlete eluat og blandes ved å snu kuvetten.

4: MÅLING

4.1: Den oppsamlete oppløsning måles ved fluorescens. Eksitasjon 485 nm (område 480-490) og emisjon 520 nm (område 515-525).

4.2: Prøve for null-stilling:

3,0 ml oppløsning C + 0,1 ml oppløsning D. 4.3: % CDT i en ukjent prøve kan bestemmes fra en standard kurve etablert ved å måle standard sera.

EKSEMPEL 11

Fraksjonering i porsionsformat

Assay- op<p>løsning:

300 ul Bis-Tris med 50 mM NaCl og 0,05 % "Tween", pH 7,0 +

1,3 ul 50 mM tris-maleat 9,25 mmol/1 Fe<3+->citrat + 9 ul av en oppløsning omfattende 0,5 ug fluorescein-merkete FAB-fragmenter.

Partikler:

AQ kvaternære aminpartikler fra Dyno Particies, Norge

FREMGANGSMÅTE:

1. Til assay-oppløsningen tilsettes en 4 ul serumprøve. 2. En partikkelsuspensjon i 20 mM Bis-Tris buffer med 50 nM NaCl2 og 0,05 % "Tween", pH 7, tilsettes til et endelig volum på 40 volum% partikkelsuspensjon, og suspensjonen omrøres i 10 minutter fulgt av sentrifugering ved 1500 g

i 5 minutter.

3. Fluorescensen av supernatanten måles.

EKSEMPEL 12

Fluorescens- merking av antistoff Fab- fragmenter

1. 2,5 mg Fab i 50 mM karbonat-buffer pH 9,5 tilsettes til 25 ug fluorescein-isotiocyanat (FITC). FITC fremstilles fra FITC på celitt

(10%) oppløst i dimetylsulfoksyd.

2. Fab- og FITC-oppløsningen inkuberes ved romtemperatur i mørket i 18-24 timer. 3 . Flurescein-Fab renses med molekyllær størrelsesgelkromatografi (IlSuperose 6 PrepGradell, Pharmacia, 1,3 0 cm). Det merkete Fab-fragment elueres med 10 mM Na-fosfat, 0,5 M NaCl, pH 7,4 buffer. Antistoff-fraksjonen

isoleres.

4. Den oppsamlete fluorescein-Fab oppløsning bufferendres til 2,5 mM TRIS-HCl, pH 8,0 og behandles ytterligere med sterk anionebyt terkromatografi.

Den ovennevnte fremgangsmåte er blitt brukt for å merke Fab fragmenter erholdt fra monoklonale antistoff som er reaktive mot alle varianter av transferrin. Anti-transferrinantistoff (IgG) ble renset fra kommersielt tilgjengelig bukvæske hvori IgG molekylene ble fordøyet ved å bruke papain og de derved dannete frie tiolgrupper ble blokkert ved å bruke jodacetamid ved å følge konvensjonelle fremgangsmåter. De resulterende Fab fragmenter ble renset med anionebytterkromatografi og ble så underkastet merkingsprosedyren angittovenfor.

EKSEMPEL 13

Jod- l25I- merking av antistoff Fab- fragmenter

1. 5 mCi<125>I-"Bolton Hunter"-reagens oppløst i benzen inndampes til tørrhet ved bruken av

nitrogengass.

2. 0,65 mg Fab oppløst i 0,1 M boratoppløsning pH 8,5, volum 0,96 ml tilsettes til 125I - "Bolton Hunter"-reagens og inkuberes/rystes på is i 30

minutter.

3. 50 mM glycin i 0,1 M borat, pH 8,5, 0,5 ml tilsettes for å stoppe reaksjonen. Oppløsningen

inkuberes ytterligere på is i 10 minutter.

4. Reaksjonsoppløsningen blir så kromatografert på en størrelsesekskluderende kolonne ("Superose 6 PrepGrade", Pharmacia, 1 x 30 cm). Det

merkete Fab-fragment elueres med en 10 mM Na-fosfat, 0,1 M NaCl, pH 7,4 buffer.

Antistoff-fraksjonen isoleres.

5. Isolert<125>I-Fab blir bufferendret til 2, 5 mM TRIS-HC1, pH 8,0 ved ultrasentrifugering med molekylar cut-off 10.000 og konsenterert til 1,5 ml. 6. Ytterligere behandling foretas med sterk ionebytterkromatografi.

Anti-transferrin Fab-fragmenter, erholdt som beskrevet i eksempel 12, ble merket ved å bruke ovennevnte fremgangsmåte .

Claims (14)

1. Fremgangsmåte ved bestemmelse av konsentrasjonen av et subsett av varianter i en populasjon av proteinholdige analyttvarianter som er i stand til separasjon i et fraksjoneringssystem, karakterisert vedat populasjonen av varianter settes i kontakt med en populasjon av merkete proteinholdige spesifikke bindingspartnere for disse for å danne merkete bindingspartner-analyttkomplekser med disse som så blir underkastet separasjon med nevnte fraksjone ringssystem til én eller flere fraksjoner inneholdende nevnte subsett av analyttvarianter i kompleksbundet form og bestemmelse av mengden markør i én eller flere slik erholdte fraksjoner, hvor nevnte populasjon av spesifikke bindingspartnere har, før reaksjonen, i hovedsak uniform fordeling eller mobilitet i nevnte fraksjonseringssystem.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke bindingspartner for analyttvarianten er et antistoff eller et fragment derav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den spesifikke bindingspartner er monovalent.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat den spesifikke bindingspartner er et F(ab) fragment av et antistoff.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4,karakterisert vedat fraksjonerings systemet er basert på ladning eller isoelektrisk punkt.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5,karakterisert vedat den er egnet for bestemmelse av varianter av transferrin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat fraksjoneringssy-stemet er valgt fra elektroforese, ionebytterkromatofokuse ring eller isoelektrisk fokusering.

8. Fremganmgsmåte ifølge krav 6 eller 7,karakterisert vedat den ytterligere omfatter å mette populasjonen av transferrinvarianter med jernioner før eller samtidig med separasjonstrinnet.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8karakterisert vedat en i hovedsak uniform fordeling eller mobilitet av den spesifikke bindingspartnerpopulasjon i nevnte fraksjoneringssystem erholdes ved modifisering og/eller fraksjonering.

10. Blanding for bruk ved fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 - 9, karakterisert vedat den omfatter merkete proteinholdige bindingspartnere for analytten av interesse, hvilke bindingspartnere har en i hovedsak uniform mobilitet eller fordeling i én eller flere fraksj oneringssystemer.

11. Blanding ifølge krav 10,karakterisert vedat den omfatter merkete F(ab) eller F(v) fragmenter av anti-transferrinan tistoff.

12. Analytisk forsøkssett, karakterisert vedat det omfatter en blanding ifølge krav 10 eller krav11 sammen med reagensene og/eller materialene som er nødvendige for å utføre nevnte fraksj onering.

13. Analytisk forsøkssett ifølge krav 12,karakterisert vedat det omfatter en blanding ifølge krav 10 eller krav 11, sammen med et fraksjoneringsmedium og ett eller flere midler valgt fra buffersalter eller -oppløsninger, overflateaktive midler og preservativer.

14. Analytisk forsøkssett ifølge krav 13,karakterisert vedat det er egnet forbruk ved påvisning av varianter av transferrin, og som ytterligere omfatter minst ett jernionesalt eller -oppløs ning.