PT2132318E

PT2132318E - Composições e métodos para a redução dos níveis de h2s em bebidas fermentadas

Info

Publication number: PT2132318E
Application number: PT08743850T
Authority: PT
Inventors: Linda F Bisson; Angela Linderholm; Kevin L Dietzel
Original assignee: Univ California
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2012-11-28
Also published as: MX2009009822A; CN101641442B; CN106222100B; JP5517342B2; HK1138328A1; AU2008229168A1; RU2476590C2; CN106222100A; EP2132318B1; CN101641442A; KR101449972B1; BRPI0808821A2; EP2132318A4; RU2009138248A; WO2008115759A3; JP2010521169A; WO2008115759A2; US8216803B2; BRPI0808821B1; CA2680787A1

Description

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DESCRIÇÃO "Composições e métodos para a redução dos níveis de H2S em bebidas fermentadas"

REFERÊNCIAS A PEDIDOS RELACIONADOS 0 presente pedido reivindica o direito de prioridade relativamente ao Pedido de Patente Provisório U.S. 60/918,616, apresentado em 16 de Março, 2007, e ao Pedido Provisório U.S. 60/959,366, apresentado em 12 de Julho, 2007.

DECLARAÇÃO QUANTO AOS DIREITOS SOBRE INVENÇÕES REALIZADAS NO ÂMBITO DE INVESTIGAÇÃO E DESENVOLVIMENTO FEDERALMENTE FINANCIADOS Não aplicável.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO A produção de compostos voláteis de enxofre tais como sulfureto de hidrogénio (H2S) durante a fermentação alcoólica é uma questão que afecta as indústrias cervejeira e vinícola. O sulfureto de hidrogénio (H2S) é um subproduto indesejável da via da redução do sulfato (Figura 1) . É formado na

Saccharomyces cerevisiae sob condições de fermentação. A produção de H2S por estirpes de S. cerevisiae varia desde 0 ug/L a 290 ug/L, bem acima do limiar de detecção humano de 11 ng/L (Amoore e Hautala, 1983). A sua qualidade indesejável surge do facto de introduzir um odor a ovo podre característico nos vinhos e embora o H2S seja um composto volátil e se poder remover por arejamento, tem o potencial para formar mercaptanos e tióis que irão persistir no vinho devido ao baixo pH (Thoukis 1962). Os mercaptanos e os tióis apresentam por sua vez aromas de cebola ou vegetais enlatados e enquanto o H2S volátil pode ser gerido, a remoção de outros compostos de enxofre indesejáveis é tecnicamente difícil e despoja o vinho de outros compostos aromáticos. A formação de sulfureto de hidrogénio pela Saccharomyces cerevisiae é um problema bem documentado na indústria do vinho, da cerveja e de sake (Acree et al. 1972, Eschenbruch et al. 1978, Giudici e Kunkee 1994, Jiranek et al. 1995, Rauhut e 2

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Kurbel 1994, Walker e Simpson 1993). Factores nutricionais como os níveis de azoto, vitaminas e cofactores (Giudici e Kunkee 1994, Jiranek et al. 1995) e factores ambientais como temperatura, pH, níveis de enxofre elementar (Rauhut e Kurbel 1994), a presença de dióxido de enxofre (Stratford e Rose 1985) e os níveis de compostos orgânicos contendo enxofre (Acree et al. 1972) foram associados à produção de compostos voláteis de enxofre em bebidas fermentadas. As diferenças na produção de compostos voláteis de enxofre foram também atribuídas a diferenças no metabolismo da estirpe de levedura (Acree et al. 1972, Spiropoulos et al. 2000).

Existem pelo menos seis diferentes classes de comportamento de estirpes de levedura em relação à formação de sulfureto de hidrogénio: 1) níveis elevados sob todas as condições; 2) níveis baixos sob todas as condições; 3) produção elevada abaixo e acima de um nível limiar de azoto; produção reduzida durante uma 'janela' de níveis de azoto em que o sulfureto aumenta a níveis de azoto acima ou abaixo dessa janela; 4) produção elevada em resposta a níveis limitantes de micronutrientes independentemente do teor de azoto; 5) produção elevada de sulfureto apenas quando limitada tanto pelo azoto como por micronutrientes; e 6) produção elevada de sulfureto com velocidade de fermentação aumentada, que pode estar relacionada com a velocidade de fermentação e a libertação de dióxido de carbono ou com algum outro factor tal como produção aumentada de calor (Spiropoulos 2000, Jiranek 1995, Giudici 1994, Linderholm 2006). O método existente para a separação de sulfuretos do vinho é a clarificação ("finlng") com cobre. A adição de cobre pode conduzir à catálise de alterações prejudiciais na composição assim como aumentar a quantidade de resíduos produzido pelas vinícolas que requerem tratamento especial, ultimamente resultando em superiores custos de produção para vinícolas e custos superiores do vinho para o consumidor. Adicionalmente, a utilização de cobre como agente clarificante pode conduzir a níveis elevados de cobre residual no vinho. O Trade and Tax Bureau aceita um nível residual de cobre de 0,5 mg/L para o vinho (Veja-se, e.g., o website em regulations.justia.com/view/89060/). Os fabricantes de vinho que utilizam cobre para remover sulfureto de hidrogénio têm 3 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ que tomar medidas para reduzir os níveis de cobre no vinho. Dados os efeitos adversos na saúde associados à excessiva ingestão de cobre, particularmente desordens neurológicas tais como a doença de Alzheimer, a Organização Mundial de Saúde recomendou restrições alimentares ao consumo deste composto (veja-se, o website em who.int/water sanitation health/ dwq/chemicals/copper.pdf). A disponibilidade de estirpes comerciais de levedura incapazes de produzir sulfureto de hidrogénio ou que produzem níveis reduzidos de sulfureto de hidrogénio irá eliminar a necessidade do tratamento dos vinhos com cobre. 0 número de acesso EF058164 na base de dados EBI Database divulga o CDS completo do gene da subunidade alfa da sulfito-redutase do isolado UCD932 de Saccharomyces cerevisiae (MET10). Spiropoulos et ai., Applied and Environmental Microbiology, 2000; 66(10): 4421 a 4462, divulgam MET17 e formação sulfureto de hidrogénio em Saccharomyces cerevisiae.

Assim, existe uma necessidade na especialidade de composições e métodos para redução dos níveis de H2S em bebidas fermentadas. A presente invenção satisfaz essas e outras necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona composições e métodos para a redução dos niveis de H2S em bebidas fermentadas.

Um aspecto da invenção proporciona métodos para a redução ou eliminação dos níveis de H2S em produtos ou meios de fermentação. Em particular, a invenção proporciona um método para a redução dos níveis de H2S num meio de fermentação, o método compreendendo o contacto do meio de fermentação com uma célula de levedura compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO:5).

Em relação às concretizações de um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto, o resíduo de aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 não é treonina nem serina. O resíduo de aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 4 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5) . Em algumas concretizações, o resíduo de aminoácido na posição 662 é seleccionado do grupo que consiste em Lys, Arg, His, Gin e Asn (SEQ ID NO:6). Em algumas concretizações, o resíduo de aminoácido na posição 662 é Lys (SEQ ID NO:7).

Em algumas concretizações, o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto ou o polinucleótido de MET10 é de uma MET10 de levedura. Em algumas concretizações, o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto partilha pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, de identidade de sequência com uma MET10 de SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:4, em que X na posição 662 é como descrito acima e aqui. Em algumas concretizações, o polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto partilha pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, de identidade de sequência com SEQ ID NO:1.

Em algumas concretizações, a célula de levedura também não expressa um polipéptido de MET10 activo para sulfureto capaz de converter sulfito em sulfureto. Em algumas concretizações, o produto da fermentação é vinho, cerveja ou champanhe. Em algumas concretizações, os meios de fermentação podem ser seleccionados do grupo que consiste em mosto de frutos (e.g., um mosto de sumo de uva) e um mosto de malte.

Em relação às concretizações de células de levedura, em algumas concretizações, a estirpe de levedura pode ser uma estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas concretizações, a estirpe de levedura pode ser qualquer estirpe comercialmente disponível para utilização para o fabrico de cerveja ou de vinho, como aqui descrito. Frequentes vezes, a estirpe progenitora ou a estirpe de origem é um produtor de sulfureto de hidrogénio que foi tornado não produtor de sulfureto de hidrogénio por substituição do ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 activo para sulfureto por um ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto. Exemplos de estirpes de S.cerevisiae do vinho incluem, sem limitação, Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, 5 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Bb32, Bbl9 e Bb22. Outras concretizações de células de levedura estão aqui descritas. São aqui também descritos polinucleótidos isolados compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 não é treonina. Em alguns casos o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI 0 não é treonina nem serina (SEQ ID NO: 5) . Os polipéptidos de MET10 inactivos para sulfureto codificados pelos polinucleótidos são como aqui descrito acima. Em alguns casos, o polinucleótido isolado que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto partilha pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO:l. Em alguns casos, o polinucleótido isolado compreende a sequência de ácido nucleico proporcionada em SEQ ID NO:l ou uma sua complementar.

Num aspecto relacionado, a invenção proporciona um vector de expressão compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO:5), e em que o polinucleótido está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão. Concretizações adicionais do polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto são aqui descritas acima. São ainda proporcionadas células hospedeiras compreendendo os vectores de expressão. As células hospedeiras podem ser células de levedura, por exemplo, células de Saccharomyces cerevisiae. Concretizações adicionais das células de levedura são como aqui descrito acima. Em algumas concretizações, o vector de expressão compreende um promotor que promove a expressão numa célula de levedura. São aqui também descritas células de levedura melhoradas que não produzem sulfureto de hidrogénio detectável ou que produzem baixos níveis de sulfureto de hidrogénio, em que as células melhoradas compreendem um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do 6 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ polipéptido de ΜΕΤ10 não é treonina (SEQ ID NO:3), em que uma célula progenitora da célula de levedura melhorada produz sulfureto de hidrogénio. Em alguns casos, o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 não é treonina nem serina (SEQ ID NO:5) . Os polipéptidos de METI 0 inactivos para sulfureto e as células de levedura são como aqui descrito acima. São aqui também descritas culturas de células de levedura melhoradas que produzem niveis reduzidos de, ou não produzem, sulfureto de hidrogénio detectável, em que a cultura melhorada compreende uma população de células de levedura, as células de levedura compreendem um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 não é treonina (SEQ ID NO: 3), em que a cultura melhorada de células de levedura não produz, ou produz reduzido sulfureto de hidrogénio em comparação com uma cultura de células progenitoras. Em alguns casos, o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 não é treonina nem serina (SEQ ID NO:5). Os polipéptidos de MET10 inactivos para sulfureto e células de levedura são como aqui descrito acima.

Noutro aspecto, a invenção proporciona um meio de fermentação compreendendo uma célula de levedura melhorada que não produz sulfureto de hidrogénio compreendendo um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID N0:5), em que uma célula progenitora da célula de levedura melhorada produz sulfureto de hidrogénio. Noutro aspecto, a invenção proporciona um meio de fermentação compreendendo uma cultura melhorada de células de levedura que produz niveis reduzidos de sulfureto de hidrogénio compreendendo uma população de células de levedura, em que as células de levedura compreendem um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5), em que a cultura melhorada de células de 7 ΕΡ 2 132 318/PT levedura produz reduzido sulfureto de hidrogénio em comparação com uma cultura de células progenitoras. Noutro aspecto, a invenção proporciona um método de produção de uma célula de levedura melhorada que produz niveis reduzidos de sulfureto de hidrogénio, em que o método compreende a substituição de um polinucleótido endógeno que codifica um polipéptido de METI0 activo para sulfureto por um polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto por introdução num progenitor da célula de levedura de um polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5), em que o progenitor da célula de levedura melhorada produz sulfureto de hidrogénio. 0 aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 não é treonina nem serina (SEQ ID N0:5). Em algumas concretizações, o ácido nucleico que codifica o polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto é introduzido de forma recombinante. Em algumas concretizações, o ácido nucleico que codifica o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto é introduzido por retro-cruzamento. Outras concretizações dos polipéptidos de METI 0 inactivos para sulfureto e células de levedura são como aqui descrito acima. São aqui também descritos produtos de fermentação, e.g., vinho, cerveja, champanhe, sem sulfureto de hidrogénio detectável ou com baixos niveis de sulfureto de hidrogénio, ou seu resíduo, em que os produtos de fermentação são produzidos de acordo com os métodos aqui descritos. São aqui também descritos polinucleótidos isolados capazes de distinguir entre as sequências proporcionadas em SEQ ID NO:l ou uma sua complementar e um ácido nucleico que codifica um MET10 de tipo selvagem, vectores de expressão compreendendo os polinucleótidos operativamente ligados a uma sequência de controlo da expressão, e células hospedeiras (e.g., células de Saccharomyces cerevisiae) compreendendo o vector de expressão. São aqui também descritos polinucleótidos isolados compreendendo uma ou mais substituições (e.g., pelo menos 8

ΕΡ 2 132 318/PT duas, três, quatro ou mais substituições) em SEQ ID N0:1, em que a uma ou mais substituições são seleccionadas entre: uma A -> C na posição 404, uma A -► G na posição 514, uma A -► G na posição 1278 e uma C -► T na posição 1532, uma G -► A na posição 1768 e uma A -► C na posição 1985, vectores de expressão compreendendo os polinucleótidos operativamente ligados a uma sequência de controlo da expressão, e células hospedeiras (e.g., células de Saccharomyces cerevisiae) compreendendo o vector de expressão. São aqui também descritos polinucleótidos isolados compreendendo uma ou mais substituições (e.g., pelo menos duas, três, quatro ou mais substituições) em SEQ ID NO: 2, em que a uma ou mais substituições são seleccionadas do grupo que consiste em: uma C -> A na posição 404, uma G -> A na posição 514, uma G -> A na posição 1278 e uma T -> C na posição 1532, uma A -► G na posição 1768 e uma C -> A na posição 1985, vectores de expressão compreendendo os polinucleótidos operativamente ligados a uma sequência de controlo da expressão, e células hospedeiras (e.g., células de Saccharomyces cerevisiae) compreendendo o vector de expressão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra a via da redução do sulfato. A análise de sequências conduzida para genes está a negrito, o número de alelos encontrado está entre ( ), os alelos encontrados em UCD932 estão contornados com linha ponteada.

As Figuras 2A-2Z apresentam um alinhamento de sequências do alelo de MET10 em várias estirpes de Saccharomyces (SEQ ID NOS:8, 9, 1, 10-14, 2, 15 e 16, respectivamente) . As alterações no ácido nucleico que resultam em alterações de codões estão realçadas. A Figura 3 ilustra uma técnica de troca de genes exemplificativa. MET10S = alelo de S288C. METI0W = Alelo da estirpe de vinho. A Figura 4 ilustra o alinhamento de sequências de

aminoácidos do gene MET10 em várias estirpes de Saccharomyces (S288C = SEQ ID N0:17; UCD932 = SEQ ID N0:18; UCD950 = SEQ ID 9

ΕΡ 2 132 318/PT NO:19). As diferenças de aminoácidos entre as diferentes estirpes estão realçadas. A Figura 5 ilustra as alterações de aminoácidos que circundam o resíduo 662 na proteína MET10. As sequências de ADN dos alelos de MET10 de S288C (SEQ ID NO:20), UCD932 (SEQ ID NO:21) e UCD950 (SEQ ID NO:20) alinhadas próximo do nucleótido 1985 com a mutação chave realçadas e a negrito. Os codões (SEQ ID NOS:22 e 23) e correspondente sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:24) (realçados a cinzento claro) estão mostradas no destacado. A alteração de uma C para uma A resulta na correspondente alteração de um resíduo de treonina para uma lisina na posição 662 da proteína. A Figura 6 ilustra a localização do resíduo de aminoácido 662 em relação aos domínios funcionais conhecidos e previstos da proteína MET10. Está apresentado um mapa dos motivos e domínios conhecidos da proteína MET10. A posição da base alterada na posição 662 está marcada com uma seta preta. A mutação reside no domínio de sulfito-redutase da proteína. Os dados estão da world wide web em //db.yeastgenome.org/cgi-bin/protein/domainPage.pl?dbid=S000001926 . A Figura 7 ilustra as características estruturais do domínio de sulfito-redutase e ilustra o impacto da alteração do resíduo de treonina para uma lisina nas características estruturais da proteína. Estão representados modelos estruturais de fitas da proteína MET10 baseados na previsão de homologia estrutural. Apenas o domínio de sulfito-redutase previsto da lisina 633 à tirosina 1035 está mostrado com a região em torno do resíduo 662 aumentada no destacado. A estrutura prevista para UCD932 (Figura A) realça a lisina no resíduo 662 enquanto a estrutura prevista para UCD950 (Figura B) realça a Treonina no resíduo 662. A Figura 8 ilustra um alinhamento de uma subsequência da proteína MET10 de algumas espécies de levedura industrialmente relevantes (MetlO de UCD932 = SEQ ID NO:25; MetlO de S288c = SEQ ID NO: 26; S. cerevisiae (carlsbergensis) = SEQ ID NO: 2 7; Kluyveromyces lactis = SEQ ID NO:28; Yarowwia lipolytica = SEQ ID NO: 29; Schizosaccharomyces pombe = SEQ ID NO:30) cujas sequências na região catalítica de sulfito-redutase são 10

ΕΡ 2 132 318/PT conhecidas. Os resíduos de aminoácido conservados nas espécies alinhadas estão a negrito. Os resíduos de aminoácido conservados nas espécies mais relacionadas estão a sombreado. A treonina na posição 662 ou no interior do motivo (N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEQ ID NO:31) é conservada no polipéptido de MET10 activo em todas as espécies de levedura alinhadas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS A Tabela 1 estabelece uma lista de estirpes de levedura nativas e industriais. A Tabela 2 estabelece a composição para um meio Triple M (MMM) modificado.

A Tabela 3 estabelece os resultados da análise de isolados de levedura nativos crescidos em placas BiGGY e MMM A Tabela 4 estabelece estirpes de levedura adicionais. A Tabela 5 estabelece sequências para iniciadores de PCR para amplificação, inter alia, de MET10. A Tabela 6 estabelece sequências para iniciadores de sequenciação para inter alia, MET10. A Tabela 7 estabelece resultados que resumem a produção de H2S de estirpes de levedura transformadas com MET10. A Tabela 8 estabelece as diferenças de aminoácidos em alelos de MET10 . A Tabela 9 estabelece resultados que resumem a produção de H2S por estirpes de levedura adicionais transformadas com MET10. A Tabela 10 estabelece resultados que resumem a produção de H2S por estirpes de levedura transformadas com MET10. A Tabela 11 estabelece resultados que resumem a produção de H2S por estirpes de levedura transformadas com alelos de MET10 . 11

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Introdução A presente invenção proporciona composições e métodos para a redução dos níveis de H2S em bebidas fermentadas. A invenção é baseada em parte na verificação de que um polipéptido de METI 0 com um resíduo de aminoácido na posição 662 que é diferente de treonina não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto de hidrogénio livre ou libertado. Isto é exemplificado pela expressão de um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto a partir do alelo de MET10 na estirpe de levedura UCD932 em que uma única alteração de um nucleótido na posição 1985 no gene MET10 resulta numa alteração do aminoácido na posição 662 de treonina para lisina no domínio catalítico da proteína MET10. II. Definições A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm genericamente o mesmo significado que é vulgarmente entendido por uma pessoa competente na matéria à qual pertence a presente invenção. Genericamente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais em cultura celular, genética molecular, química orgânica e química e hibridação do ácido nucleico adiante descritos são os bem conhecidos e vulgarmente empregues na especialidade. São utilizadas técnicas padrão para síntese de ácido nucleico e peptídica. Geralmente, as reacções enzimáticas e os passos de purificação são realizados de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e procedimentos são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais na especialidade e várias referências gerais (veja-se genericamente, Sambrook e Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008)), que são proporcionados em todo este documento. A nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais de química analítica e síntese orgânica descritos adiante são os em conhecidos e vulgarmente empregues na especialidade. São utilizadas técnicas padrão, ou suas modificações, para sínteses químicas e análises químicas. 12 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ "Meios de fermentação" ou "meio de fermentação" como aqui se utilizam, referem-se a uma mistura não fermentada antes da adição de levedura. Os meios de fermentação incluem, e.g., mostos de fruta e mostos de malte. Os meios de fermentação podem ainda compreender uma fonte de açúcar adicional (e.g., mel, cana de açúcar, açúcar de beterraba, açúcar de milho, frutose, sacarose ou glucose); ácido (e.g., ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, e suas misturas) e nutrientes de leveduras (e.g., fosfato de diamónio ou outra fonte de azoto, vitaminas, e similares).

Um "mosto de frutos", como aqui se utiliza, refere-se a uma mistura não fermentada de sumo de fruta, fragmentos de caules, casca de fruta, sementes e/ou polpa, produzida por esmagamento da fruta. Podem ser utilizados quaisquer frutos contendo açúcar fermentável tais como, por exemplo, uvas, maçãs, cerejas, pêssegos, nectarinas, ameixas, alperces, peras, diospiros, ananases, mangas, kiwis, morangos, framboesa, mirtilo, fruto do sabugueiro, amora, mirtilo vermelho, figos, e nêsperas. Os frutos podem ser secos, fervidos, cozidos, ou de outro modo processados antes do esmagamento. Um mosto de frutos pode compreender dois ou mais frutos. "Mosto de malte", como aqui se utiliza, refere-se a um líquido não fermentado produzido por esmagamento de cereais e/ou cascas de cereais. Podem ser utilizados quaisquer cereais contendo açúcar fermentável tais como, por exemplo, cevada, trigo, centeio, cevada, arroz, milho e aveia. Os cereais podem ser torrados, em flocos, ou de outro modo processados antes do esmagamento. Um mosto de malte pode ser produzido a partir de uma mistura compreendendo dois ou mais cereais.

"MetlO" e "METI0", como aqui se utilizam, referem-se à subunidade a da sulfito-redutase assimilatória de Saccharomyces. Funcionalmente, um polipéptido de MET10 catalisa a conversão de sulfito em sulfureto. Estruturalmente, foram caracterizados polipéptidos de MET10, particularmente polipéptidos de MELT10 de levedura. Os polipéptidos de MET10 contêm um domínio catalítico de sulfito-redutase conservado na porção C-terminal, assim como domínios de ligação FAD e NAD. A 13 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ porção central do polipéptido contém um domínio de piruvato-ferredoxina-oxidorredutase. Nos polipéptidos de MET10 activos para sulfureto, que são capazes de catalisar a conversão de sulfito em sulfureto de hidrogénio livre ou libertado, o resíduo de aminoácido na posição 662 foi conservado, e é usualmente uma treonina ou por vezes uma serina, particularmente em levedura. Os domínios dos polipéptidos de MET10 identificados estão representados na Figura 6.

Como aqui se utiliza, "METI 0" refere-se a ácidos nucleicos e polipéptidos, variantes polimórficas, alelos, mutantes e homólogos inter-espécies que: (1) possuem uma sequência de aminoácidos que possui mais do que cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, por exemplo, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência de aminoácidos, preferivelmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000, ou mais aminoácidos, ou ao longo de todo o seu comprimento, com uma sequência de aminoácidos de referência codificada por um ácido nucleico de MET10 (para uma sequência de ácido nucleico de MET10 de levedura, veja-se, e.g., SEQ ID NO:l, Figura 2, e os números de acesso no GenBank exemplificados adiante); (2) ligam-se a anticorpos, e.g., anticorpos policlonais, criados contra um imunogénio compreendendo uma sequência de aminoácidos de um polipéptido de METI0 (e.g., codificada por SEQ ID NO:l), e suas variantes modificadas de forma conservativa; (3) hibridam especificamente sob condições de hibridação rigorosas com uma cadeia anti-sentido correspondente a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína MET10, e suas variantes modificadas de forma conservativa; (4) possuem uma sequência de ácido nucleico que tem mais do que cerca de 95%, preferivelmente mais do que cerca de 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência de nucleótidos, preferivelmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleótidos, ou ao longo de todo o seu comprimento, com uma sequência de ácido nucleico de MET10 de referência. Os ácidos nucleicos e as proteínas utilizados na invenção incluem tanto moléculas de ocorrência natural como recombinantes. Em algumas concretizações, os polipéptidos de MET10 e os polinucleótidos de MET10 são de levedura. As sequências de aminoácidos e de ácido nucleico de MET10 14 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ exemplificadas estão estabelecidas nos números de acesso no Genbank, EF058164, EF058165, EF058166, EF058167, EF058168, EF058169, EF058170, EF058171, EF058172, EF058173.

Como aqui se utiliza, um polipéptido de "MET10 activo para sulfureto" é capaz de catalisar a conversão de sulfito em sulfureto de hidrogénio. Na levedura, um polipéptido de METI0 activo para sulfureto pode possuir um residuo de serina ou de treonina na posição do aminoácido 662. Em estirpes de levedura, o aminoácido na posição 662 em S. cerevisiae é conservado como uma treonina ou uma serina e reside no seguinte motivo na região catalítica de sulfito-redutase: (N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEQ ID N0:31). Veja-se a Figura 8.

Como aqui se utiliza, um polipéptido de "MET10 inactivo para sulfureto" não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto de hidrogénio livre ou libertado. Em levedura, um polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto não terá uma treonina na posição de aminoácido 662 ou no interior do motivo (N/K)(R/K)R(V/L)XP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEQ ID NO:32), i.e., em que X não é T. Um polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto não terá um resíduo de treonina ou de serina na posição de aminoácido 662. 0 polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto terá Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr na posição 662 (SEQ ID N0:5). Em algumas concretizações, o resíduo de aminoácido na posição 662 num polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto não possui um grupo hidroxilo, por exemplo, não é Thr, Ser ou Tyr (SEQ ID NO:33) . Em algumas concretizações, o resíduo de aminoácido na posição 662 num polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto é um aminoácido grande ou volumoso, por exemplo, Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp (SEQ ID NO:34). Em algumas concretizações, o resíduo de aminoácido na posição 662 num polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto é um aminoácido básico ou carregado positivamente, por exemplo, Lys, Arg, His, Gin ou Asn (SEQ ID NO:6). Em algumas concretizações, o resíduo de aminoácido na posição 662 é Lys (SEQ ID NO:7).

Como aqui se utiliza, uma sequência de ácido nucleico ou sequência de aminoácidos de MET10 "exógena" é introduzida numa 15 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ célula de levedura progenitora ou estirpe de levedura progenitora pela acção do homem. A introdução na célula de levedura da sequência de ácido nucleico exógena ou da sequência de aminoácidos exógena pode ser por qualquer meio conhecido na especialidade, incluindo métodos recombinantes ou métodos clássicos de criação de leveduras (e.g., retro-cruzamento) .

As expresses "ácido nucleico" e "polinucleótido" são aqui utilizadas indiferentemente para referir desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos e seus polímeros numa forma quer de cadeia simples quer de cadeia dupla. A expressão abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleótidos conhecidos ou resíduos do esqueleto ou ligações modificados, que são sintéticos, de ocorrência natural, e que não são de ocorrência natural, que possuem propriedades de ligação similares às do ácido nucleico de referência, e que são metabolizados de uma maneira similar aos nucleótidos de referência. Os exemplos destes análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirais, 2-0-metil-ribonucleótidos, péptido-ácido nucleico (PNA). A menos que indicado em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange as suas variantes modificadas de forma conservativa (e.g., substituições de codões degenerados) e sequências complementares, assim como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições de codões degenerados podem ser conseguidas por geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais (ou todos) codões seleccionados está substituída por bases mistas e/ou resíduos de desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). A expressão "ácido nucleico" é utilizada indiferentemente de gene, ADNc, ARNm, oligonucleótido e polinucleótido.

Um ácido nucleico "capaz de distinguir", como aqui se utiliza, refere-se a um polinucleótido(s) que (1) híbrida especificamente sob condições de hibridação rigorosas com uma cadeia anti-sentido correspondente a uma sequência de ácido 16 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ nucleico que codifica uma proteína MET10, e suas variantes modificadas de forma conservativa; ou (2) possui uma sequência de ácido nucleico que possui mais do que cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, preferivelmente mais do que cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade de sequência de nucleótidos, preferivelmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais, nucleótidos, com um ácido nucleico de MET10. A frase "condições de hibridação rigorosas" refere-se a condições sob as quais uma sonda irá hibridar com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácido nucleico, mas não com outras sequências. Condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas superiores. Encontra-se um guia extensivo da hibridação de ácidos nucleicos em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Genericamente, seleccionam-se como condições rigorosas cerca de 5-10°C abaixo do ponto de fusão térmica I para a sequência específica a um pH e força iónica definidos. A Tm é a temperatura (sob a força iónica, Ph e concentração de ácido nucleico definidos) a que 50% das sondas complementares com o alvo hibridam com a sequência alvo em equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, à Tm, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio). As condições rigorosas serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de ião de sódio, tipicamente uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de ião de sódio (ou outros sais) a pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., 10 a 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., mais do que 50 nucleótidos). As condições rigorosas podem também ser conseguidas com a adição de agentes desestabilizantes tais como a formamida. Para hibridação selectiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos de duas vezes a hibridação de fundo, opcionalmente 10 vezes a hibridação de fundo. Condições de hibridação rigorosas exemplificativas podem ser as seguintes: formamida a 50%, SSC 5x e SDS a 1%, incubação a 42°C, ou, SSC 5x, SDS a 17 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ 1%, incubação a 65°C, com lavagem com SSC 0,2x, e SDS a 0,1% a 65 °C.

Os ácidos nucleicos que não hibridam uns com os outros sob condições rigorosas são ainda substancialmente idênticos se os polipéptidos que codificam forem substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada utilizando a máxima degenerescência de codões permitida pelo código genético. Nestes casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridam sob condições de hibridação moderadamente rigorosas. Exemplos de "condições de hibridação moderadamente rigorosas" incluem uma hibridação num tampão de formamida a 40%, NaCl 1 M, SDS a 1% a 37°C, e uma lavagem com SSC IX a 45°C. Uma hibridação positiva é de pelo menos duas vezes a hibridação de fundo. As pessoas competentes na material reconhecerão prontamente que podem ser utilizadas condições alternativas de hibridação e lavagem para proporcionar condições de rigor similar.

As expresses "isolado", "purificado" ou "biologicamente puro", referem-se a um material que está substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente o acompanham como se encontra no seu estado nativo. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas utilizando técnicas de química analítica tais como electroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente numa preparação está substancialmente purificada. Em particular, um ácido nucleico de MET10 isolado está separado de quadros de leitura abertos que flanqueiam o gene MET10 e codificam proteínas outras que não a MET10. O termo "purificado" denota que um ácido nucleico ou uma proteína dão origem essencialmente a uma banda num gel electroforético. Particularmente, significa que o ácido nucleico ou a proteína são pelo menos 85% puros, mais preferivelmente pelo menos 95% puros, e o mais preferivelmente pelo menos 99% puros. O termo "heterólogo", quando utilizado com referência a porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais subsequências que são divergentes umas das outras, que podem surgir naturalmente na população através de mutação espontânea ou por rearranjo genómico, ou podem ser 18

ΕΡ 2 132 318/PT introduzidas artificialmente. Por exemplo, o ácido nucleico é tipicamente produzido de forma recombinante, possuindo duas ou mais sequências de genes não relacionados dispostos de modo a proporcionar um novo ácido nucleico funcional, e.g., um promotor de uma fonte e uma região de codificação de outra fonte. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que são divergentes ou não de encontram na mesma relação umas com as outras na natureza (e.g., uma proteína de fusão).

Um "vector de expressão" é uma construção de ácido nucleico, gerada de forma recombinante ou sintética, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular numa célula hospedeira. 0 vector de expressão pode ser parte de um plasmídeo, de um vírus ou de um fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vector de expressão inclui um ácido nucleico que vai ser transcrito operativamente ligado a um promotor.

Os termos "polipéptido", "péptido" e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para referir um polímero de residuos de aminoácido. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido correspondente de ocorrência natural, assim como a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural e polímeros de aminoácidos que não são de ocorrência natural. 0 termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como a análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles que são codificados pelo código genético, assim como os aminoácidos que são posteriormente modificados, e.g., hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e 0-fosfosserina. Análogos de aminoácidos referem-se a compostos que possuem a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural, i.e., um carbono γ que está ligado a um hidrogénio, um grupo carboxilo, um grupo amino e um grupo R, e.g., homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metilsulfónio. Estes análogos possuem grupos R modificados (e.g., norleucina) ou 19

ΕΡ 2 132 318/PT esqueletos peptídicos modificados, mas retêm a mesma estrutura química básica que um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácidos referem-se a compostos químicos que possuem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funcionam de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.

Os aminoácidos podem aqui ser referidos por qualquer um dos seus vulgarmente conhecidos símbolos três letras ou símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Os nucleótidos, do mesmo modo, podem ser referidos pelos seus códigos vulgarmente aceites de uma letra. "Variantes modificadas de forma conservativa" aplica-se a sequências tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácido nucleico particulares, as variantes modificadas de forma conservativa referem-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou quando o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam uma qualquer determinada proteína. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, em cada posição em que uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer dos codões correspondentes descritos sem alteração do polipéptido codificado. Estas variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações modificadas de forma conservativa. Todas as sequências de ácido nucleico aqui que codificam um polipéptido também descrevem todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. Um perito reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (excepto AUG, que é vulgarmente o único codão para metionina, e TGG, que é vulgarmente o único codão para triptofano) pode ser modificado para originar uma molécula funcionalmente idêntica. Deste modo, cada uma das variações silenciosas de um ácido nucleico que codifica um polipéptido estão implícitas em cada sequência descrita. 20

ΕΡ 2 132 318/PT

Quanto às sequências de aminoácidos, um perito reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais numa sequência de ácido nucleico, de um péptido, de um polipéptido ou de uma proteína, que alterem, adicionem ou eliminem um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada, constituem uma "variante modificada de forma conservativa" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. São bem conhecidas na especialidade tabelas de substituições conservativas que proporcionam aminoácidos funcionalmente similares. Estas variantes modificadas de forma conservativa são em adição, e não excluem, variantes polimórficas, homólogos inter-espécies e de alelos.

Os oito grupos que se seguem contêm, cada um, aminoácidos que são substituições conservativas uns dos outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (veja-se, e.g., Creighton, Proteins (1984)).

Os termos "idêntico" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou de polipéptidos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou possuem uma percentagem especificada de resíduos de aminoácido ou de nucleótidos que são iguais (i.e., 60% de identidade, preferivelmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ao longo de uma região especificada de uma região de SEQ ID NO:l), quando em comparação e alinhadas para uma correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação, ou região designada como medido utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspecção visual. Estas sequências dizem-se então "substancialmente idênticas". Esta 21 ΕΡ 2 132 318/PT definição refere-se também à complementar de uma sequência de teste. Preferivelmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento, ou mais preferivelmente ao longo de uma região que tem 50-100 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento.

Para comparação de sequências, tipicamente, uma sequência actua como uma sequência de referência, com a qual são comparadas sequências de teste. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são introduzidas num computador, são desenhadas coordenadas de subsequências, se necessário, e são designados os parâmetros do programa do algoritmo de sequências. Podem ser utilizados os parâmetros pré-estabelecidos do programa, ou podem ser designados parâmetros alternativos. O algoritmo de comparação de sequências calcula então a percentagem de identidades de sequências para as sequências de teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa. Para a comparação de sequências de ácidos nucleicos e de proteínas com ácidos nucleicos e proteínas MET10, utilizam-se os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 e os parâmetros pré-estabelecidos discutidos adiante.

Uma "janela de comparação", como aqui se utiliza, inclui a referência a um segmento de qualquer uma de várias posições contíguas seleccionadas do grupo que consiste em de 20 a 600, usualmente de cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente de cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas de forma óptima. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na especialidade. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser conduzido, e.g., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no pacote Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por 22 ΕΡ 2 132 318/PT alinhamento manual e inspecção visual (veja-se, e.g., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento).

Os exemplos de algoritmo preferido que é adequado para a determinação da percentagem de identidade de sequências e similaridade de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. Os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 utilizam-se, com os parâmetros aqui descritos, para determinar a percentagem de identidade de sequências para os ácidos nucleicos e as proteínas. O software para a realização das análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (Veja-se, o worldwide website em ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de sequências com pontuação elevada (HSP) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência interrogada, que correspondem ou satisfazem uma pontuação limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra com o mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como o limiar de pontuação das palavras da vizinhança (Altschul et al., supra). Estas correspondências de palavras na vizinhança iniciais actuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSP mais longas que as contenham. As correspondências de palavras são estendidas em ambos os sentidos ao longo de cada sequência tão longe quanto a pontuação cumulativa do alinhamento possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas utilizando, para sequências de nucleótidos, os parâmetros M (pontuação recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, utiliza-se uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das correspondências de palavras em cada sentido é parada quando: a pontuação cumulativa do alinhamento cai a quantidade X desde o seu valor máximo atingido; a pontuação cumulativa cai para zero ou menos, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com pontuação negativa; ou é atingida a extremidade de uma das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. 0 23 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza como valores pré-estabelecidos um comprimento de palavra (W) de 11, uma espectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como valores pré-estabelecidos um comprimento de palavra de 3, e espectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja-se Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, espectativa (E) de 10, M=5, N=—4, e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja-se, e.g., Karlin & Altschul, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)).

Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade com que uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos poderá ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade soma numa comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência é inferior a cerca de 0,2, mais preferivelmente inferior a cerca de 0,01, e o mais preferivelmente inferior a cerca de 0,001.

Uma indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico seja imunologicamente reactivo de modo cruzado com os anticorpos criados contra o polipéptido codificado pelo segundo ácido nucleico, como se descreve adiante. Assim, um polipéptido é tipicamente substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, por exemplo, quando os dois péptidos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou as suas complementares hibridem uma com a outra sob condições rigorosas, como se descreve adiante. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que se possam utilizar os mesmos iniciadores para amplificar a sequência. A frase "híbrida selectivamente (ou especificamente) com" refere-se à ligação, formação de dúplices ou hibridação de uma 24 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ molécula apenas com uma sequência de nucleótidos particular sob condições de hibridação rigorosas quando essa sequência está presente numa mistura complexa (e.g., ADN ou ARN celular total ou biblioteca de ADN ou ARN).

Por "célula hospedeira" entenda-se uma célula que contém um vector de expressão e suporta a replicação ou a expressão do vector de expressão. As células hospedeiras podem ser, por exemplo, células procariotas tais como E. coli ou células eucariotas tais como de levedura. III. Ácidos nucleicos que codificam MET10 A. Métodos Genéricos de ADN Recombinante A presente invenção assenta em técnicas de rotina no campo da genética recombinante e clássica. Genericamente, a nomenclatura e os procedimentos laboratoriais na tecnologia do ADN recombinante adiante descritos são bem conhecidos e vulgarmente empregues na especialidade. Utilizam-se técnicas padrão para clonagem, isolamento, amplificação e purificação de ADN e ARN. Genericamente as reacções enzimáticas que envolvem ADN-ligase, ADN-polimerase, endonucleases de restrição, e similares, são realizadas de acordo com as especificações do fabricante. Os textos básicos que divulgam os métodos gerais úteis na presente invenção incluem Sambrook e Russell, Molecular Clonlng, A Laboratory Manual (3d ed.,

Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel et ai., eds., Current Protocols in Molecular Blology (John Wiley & Sons 1987-2008); e Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990) .

Para ácidos nucleicos, os tamanhos são dados em quilobases (kb) ou pares de bases (pb) . Estes são estimativas derivadas de electroforese em gel de agarose ou acrilamida, de ácidos nucleicos sequenciados, ou de sequências de ADN publicadas. Para proteínas, os tamanhos são dados em quilodaltons (kDa) ou números de resíduos de aminoácido. Os tamanhos das proteínas são estimados a partir de electroforese em gel, de proteínas sequenciadas, e sequências de aminoácidos derivadas, ou de sequências de proteínas publicadas.

Os oligonucleótidos que não estão comercialmente disponíveis podem ser quimicamente sintetizados de acordo com 25 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ ο método do triéster fosforamidito em fase sólida descrito pela primeira vez por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), utilizando um sintetizador automático, como descrito em Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). A purificação de oligonucleótidos é efectuada por electroforese em gel de acrilamida nativa ou por HPLC de permuta aniónica como descrito em Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983). A sequência dos genes clonados e dos oligonucleótidos sintéticos pode ser verificada após clonagem utilizando, e.g., o método da terminação de cadeias para sequenciação de moldes de cadeia dupla de Wallace et al., Gene 16:21-26 (1981). B. Métodos de clonagem para o isolamento de sequências de nucleótidos que codificam MET10

Em geral, as sequências de ácido nucleico que codificam MET10 e homólogos de sequência de ácido nucleico relacionados, são clonados a partir de bibliotecas de ADNc e ADN genómico ou são isolados utilizando técnicas de amplificação com iniciadores oligonucleotidicos. Por exemplo, as sequências de MET10 são tipicamente isoladas a partir de bibliotecas de ácido nucleico (genómico ou ADNc) por hibridação com uma sonda de ácido nucleico, cuja sequência pode ser derivada de SEQ ID N0:1, ou uma sua subsequência. 0 ARN e o ADNc de MET10 podem ser isolados de qualquer estirpe de levedura.

Variantes polimórficas, alelos e homólogos inter-espécies de MET10 que são substancialmente idênticos a MET10 podem ser isolados utilizando sondas de ácido nucleico e oligonucleótidos de MET10 sob condições de hibridação rigorosas, por rastreio de bibliotecas. Alternativamente, podem utilizar-se bibliotecas de expressão para clonar variantes polimórficas, alelos e homólogos inter-espécies de MET10, por detecção de homólogos expressos imunologicamente com anti-soros ou anticorpos purificados criados contra o domínio nuclear de MET10 que também reconhecem e se ligam selectivamente ao homólogo de MET10 .

Para preparar uma biblioteca de ADNc, ARNm de MET10 pode ser purificado a partir de qualquer estirpe de levedura. 0 ARNm é então transformado em ADNc utilizando transcritase 26 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ inversa, ligado a um vector recombinante, e transfectado num hospedeiro recombinante para propagação, rastreio e clonagem. Os métodos para a preparação e rastreio de bibliotecas de ADNc são bem conhecidos (veja-se, e.g., Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra) .

Para uma biblioteca genómica, o ADN é extraído do tecido e cortado mecanicamente ou digerido enzimaticamente para se obterem fragmentos de cerca de 1-8 kb. Os fragmentos são então separados por centrifugação em gradiente dos tamanhos indesejados e são construídos em vectores bacteriófagos lambda. Estes vectores e fagos são empacotados in vitro. Os fagos recombinantes são analisados por hibridação de placas fágicas como descrito em Benton & Davis, Science 196:180-182 (1977) . A hibridação de colónias é realizada como genericamente descrito em Grunstein et al., PNAS USA., 72:3961-3965 (1975) .

Um método alternativo de isolamento de ácidos nucleicos de MET10 e seus homólogos combina a utilização de iniciadores oligonucleotidicos sintéticos e amplificação de um molde de ARN ou ADN (vejam-se as Patentes U.S. 4,683,195 e 4,683,202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)). Métodos tais como reacção em cadeia pela polimerase (PCR) e reacção em cadeia pela ligase (LCR) podem ser utilizados para amplificar sequências de ácido nucleico de MET10 directamente a partir de ARNm, de ADNc, de bibliotecas genómicas ou bibliotecas de ADNc. Podem ser desenhados oligonucleótidos degenerados para amplificar homólogos de MET10 utilizando as sequências aqui proporcionadas. Podem ser incorporados locais para endonucleases de restrição nos iniciadores. A reacção em cadeia pela polimerase ou outros métodos de amplificação in vitro podem também ser úteis, por exemplo, para clonar sequências de ácido nucleico que codificam para proteínas a expressar, para preparar ácidos nucleicos para utilização como sondas para a detecção da presença de ARNm que codifica MET10 em amostras fisiológicas, para sequenciação de ácido nucleico ou para outras finalidades. Os genes amplificados pela reacção PCR podem ser purificados a partir de géis de agarose e clonados num vector apropriado. 27 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Podem também ser utilizadas técnicas de amplificação utilizando iniciadores para amplificar e isolar ADN ou ARN de MET10. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam MET10 ou seus fragmentos podem ser obtidos por amplificação de uma biblioteca de ADNc de levedura ou transcritos de forma inversa a partir de ARN da levedura utilizando pares de iniciadores de ácido nucleico isolados possuindo as sequências: estabelecidas na Tabela 5.

Estes iniciadores podem ser utilizados, e.g., para amplificar quer a sequência de comprimento completo quer uma sonda de um a várias centenas de nucleótidos, que é então utilizada para o rastreio de uma biblioteca de ADNc quanto a MET10 de comprimento completo. A expressão génica de MET10 pode também ser analisada por técnicas conhecidas na especialidade, e.g., transcrição inversa e amplificação de ARNm, isolamento de ARN total ou ARN poli A+, Northern blotting, dot blotting, hibridação in situ, protecção com ARNase, sondagem de arranjos de microchips de ADN, e similares.

Podem ser utilizados oligonucleótidos sintéticos para construir genes de MET10 recombinantes para utilização como sondas ou para expressão de proteína. Este método é realizado utilizando uma série de oligonucleótidos sobrepostos usualmente de 40-120 pb de comprimento, representando ambas as cadeias, com sentido e sem sentido, do gene. Estes fragmentos de ADN são então hibridados, ligados e clonados. Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de amplificação com iniciadores precisos para amplificar uma subsequência específica do gene MET10. A subsequência específica é então ligada num vector de expressão. Podem ser preparadas quimeras de MET10, que combinam, e.g., uma porção de MET10 com uma porção de um MET10 heterólogo para criar um MET10 funcional, quimérico. O gene que codifica um polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto é tipicamente clonado em vectores intermediários antes da transformação em células procariotas ou eucariotas para replicação e/ou expressão. Estes vectores intermediários 28

ΕΡ 2 132 318/PT são tipicamente vectores procariotas, e.g., plasmídeos ou vectores vaivém. Os ácidos nucleicos isolados que codificam proteínas METI0 inactivas para sulfureto compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína METI0 inactiva para sulfureto e suas subsequências, seus homólogos inter-espécies, alelos e suas variantes polimórficas. Em algumas concretizações, o ácido nucleico isolado que codifica uma proteína MET10 inactiva para sulfureto é SEQ ID N0:1 ou uma sua complementar. C. Expressão de um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto

Para obter um elevado nivel de expressão de um gene clonado, tal como os ADNc que codificam um polipéptido de METI 0 inactivo para sulfureto, subclona-se tipicamente uma sequência de ácido nucleico de uma METI 0 inactiva para sulfureto num vector de expressão que contém um promotor forte para dirigir a transcrição, um terminador de transcrição/tradução, e se for um ácido nucleico que codifica uma proteína, um local de ligação ao ribossoma para iniciação da tradução. Os promotores bacterianos adequados são bem conhecidos na especialidade e estão descritos, e.g., em Sambrook et al. e Ausubel et al. Sistemas de expressão bacterianos para a expressão da proteína MET10 inactiva para sulfureto estão disponíveis em, e.g., E. coli, Bacillus sp., e Salmonella (Paiva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983). Estão disponíveis comercialmente kits para estes sistemas de expressão. Os sistemas de expressão eucariotas para células de mamífero, de levedura e de insecto são bem conhecidos na especialidade e estão também comercialmente disponíveis. O promotor utilizado para dirigir a expressão de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação particular. O promotor é preferivelmente posicionado aproximadamente à mesma distância do local de início da transcrição heterólogo que está do local de início da transcrição no seu cenário natural. Como é conhecido na especialidade, contudo, pode ser acomodada alguma variação nesta distância sem perda de função promotora.

Em adição ao promotor, o vector de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que 29 ΕΡ 2 132 318/PT contém todos os elementos adicionais necessários para a expressão do ácido nucleico que codifica MET10 inactiva para sulfureto em células hospedeiras. Uma cassete de expressão típica contém assim um promotor operativamente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica uma METI0 inactiva para sulfureto e sinais necessários para a eficiente poliadenilação do transcrito, locais de ligação ao ribossoma e terminação da tradução. Os elementos adicionais da cassete podem incluir potenciadores e, se for utilizado ADN genómico como gene estrutural, intrões com locais dadores e aceitadores de splicing funcionais.

Em adição a uma sequência promotora, a cassete de expressão deverá também conter uma região de terminação da transcrição a jusante do gene estrutural para proporcionar uma eficiente terminação. A região de terminação pode ser obtida a partir do mesmo gene que a sequência promotora ou pode ser obtida de genes diferentes. 0 vector de expressão particular utilizado para transportar a informação genética para a célula não é particularmente crítico. Podem ser utilizados quaisquer dos vectores convencionais utilizados para expressão em células eucariotas ou procariotas. Os vectores de expressão bacterianos padrão incluem plasmídeos tais como plasmídeos baseados no pBR322, pSKF, pET23D e sistemas de expressão de fusão tais como GST e LacZ. Marcadores epitópicos podem também ser adicionados a proteínas recombinantes para proporcionar métodos de isolamento convenientes, e.g., c-myc.

Vectores de expressão contendo elementos reguladores de vírus de eucariotas são tipicamente utilizados em vectores de expressão eucariotas, e.g., vectores de SV40, vectores de papilomavírus e vectores derivados de vírus de Epstein-Barr. Outros exemplos de vectores eucariotas incluem pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovírus, e qualquer outro vector que permita a expressão de proteínas sob a direcção do promotor precoce de SV40, o promotor tardio de SV40, o promotor de metalotioneína, o promotor do vírus do tumor mamário murino, o promotor do vírus do sarcoma de Rous, o promotor da poli-hedrina, ou outros promotores que se mostrem eficazes para expressão em células eucariotas. 30 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Alguns sistemas de expressão possuem marcadores que proporcionam amplificação génica tais como timidina-quinase, higromicina B-fosfotransferase e di-hidrofolato-redutase.

Os elementos que são tipicamente incluídos em vectores de expressão também incluem um replicão que funciona em E. coli, um gene que codifica resistência a antibióticos para permitir a selecção de bactérias que alojam plasmídeos recombinantes, e locais de restrição únicos em regiões não essenciais do plasmideo para permitir a inserção de sequências eucariotas. O gene particular de resistência a antibiótico escolhido não é crítico, sendo adequado qualquer dos muitos genes de resistência conhecidos na especialidade. As sequências de procariotas são preferivelmente escolhidas de modo a que não interfiram com a replicação do ADN em células eucariotas, se necessário. D. Células Hospedeiras e Métodos para a Sua Produção A invenção também proporciona células hospedeiras que não produzem sulfureto de hidrogénio ou produzem baixos níveis de sulfureto de hidrogénio e expressam um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto exógeno, como aqui descrito. Um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 não é uma treonina nem uma serina, é introduzido na célula hospedeira progenitora por métodos conhecidos na especialidade, e.g., utilizando métodos recombinantes de cruzamento ou genéticos. Em algumas concretizações, as células hospedeiras também não expressam um polipéptido de METI 0 activo para sulfureto, i.e., porque a sequência de codificação para o polipéptido de METI0 activo foi silenciada ("knocked out") e substituída pela sequência de codificação para um polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto.

As células hospedeiras que produzem niveis baixos ou diminuídos ou reduzidos de sulfureto de hidrogénio produzem 50% ou menos H2S em comparação com a estirpe progenitora antes da introdução do ácido nucleico que codifica o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto. Em algumas concretizações, as células hospedeiras que produzem níveis baixos ou diminuídos de sulfureto de hidrogénio produzem 40%, 30%, 25%, 20%, ou 31 ΕΡ 2 132 318/PT menos, H2S em comparação com a estirpe progenitora antes da introdução do ácido nucleico que codifica o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto.

As células hospedeiras podem ser, por exemplo, eucariotas ou procariotas. As células hospedeiras podem ser células bacterianas, de mamífero, de levedura ou de insecto. Em algumas concretizações a célula hospedeira é uma célula de levedura, por exemplo, uma célula de levedura S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarowwia lipolytica ou

Schizosaccharomyces pombe. As células de levedura utilizadas na produção de bebidas fermentadas, e.g., vinho, vinho do Porto, vinho da Madeira, cerveja, champanhe, etc. (e.g., "levedura do vinho", "levedura da cerveja", "levedura do champanhe", etc.) são úteis para a introdução de um ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto exógeno. As estirpes de células de levedura para utilização no fabrico de bebidas fermentadas, e que são candidatas para inactivação de MET10 (i.e., são produtoras de sulfureto de hidrogénio), estão comercialmente disponíveis a partir de numerosas fontes, incluindo sem limitação, Lallemand (Lalvin) (Petaluma, CA; na web em lallemandwine.us/products/yeast_chart.php) Red Star (na web em www.redstaryeast.net/), White Labs (Boulder, CO; na web em whitelabs.comlyeast_search.html), Wyeast (Odell, OR; na web em wyeastlab.com), Kitzinger's, J. Laffort, Vierka, Gervin, SB Active, Unican, Siebel Inst., e Fermentis (na web em fermentis.com/FO/EN/00-Home/10-10_home.asp). Veja-se, e.g., a worldwide web em winemaking.jackkeller.net/strains.asp para uma listagem representativa de estirpes de levedura do vinho e do champanhe e em byo.com/referenceguide/yeaststrains/ para uma listagem representativa de estirpes de levedura da cerveja.

Em algumas concretizações, a estirpe de células de levedura é uma estirpe de S. cerevisiae. Em algumas concretizações, a estirpe de célula de levedura de S. cerevisiae é uma levedura do vinho, por exemplo, seleccionada entre Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25,

Bal26, Bal3 7, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22.

Veja-se, e.g., a Patente U.S. 6,140,108. As estirpes de 32 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ levedura adicionais que são candidatas para inactivação de METI0, i.e., para a introdução de um ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto, estão listadas nas Tabelas 1, 3 e 4. São utilizados métodos de transfecção padrão para produzir linhas celulares bacterianas, de mamífero, de levedura ou de insecto que expressam grandes quantidades de uma proteína METI0 inactiva para sulfureto, que são então purificadas utilizando técnicas padrão (veja-se, e.g., Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, em Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). A transformação de células eucariotas e procariotas é realizada de acordo com técnicas padrão (veja-se, e.g., Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983) .

Podem ser utilizados quaisquer dos procedimentos bem conhecidos para a introdução de sequências de nucleótidos estranhas em células hospedeiras. Estes incluem a utilização de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, lipossomas, micro-injecção, vectores plasmáticos, vectores virais e quaisquer dos outros métodos bem conhecidos para a introdução de ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético ou outro material genético estranho numa célula hospedeira (veja-se, e.g., Sambrook et al., supra). É apenas necessário que o procedimento de engenharia genética particular utilizado seja susceptível de introdução bem-sucedida de pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressar MET10 inactiva para sulfureto. As células hospedeiras melhoradas para não produzir sulfureto de hidrogénio (i.e., produtores nulos de H2S), terão também geralmente ο MET10 activo silenciado {''knocked-out") , substituído ou mutado. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica uma MET10 activa para sulfureto na estirpe progenitora pode ser mutado no codão (posições 1984-1986 do ácido nucleico) que codifica o aminoácido na posição 662 de modo a que este codão não codifique uma treonina (ou uma serina). As técnicas de recombinação homóloga também são úteis na substituição de um ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 activo para sulfureto por uma sequência 33

ΕΡ 2 132 318/PT de ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto, como aqui descrito. Veja-se, e.g., a

Figura 3 e Baudin, et al., Nucleic Acids Res (1993) 21 (14) :3329.

Após o vector de expressão ser introduzido nas células, as células transfectadas são cultivadas sob condições que favorecem a expressão de METI0 inactiva para sulfureto, que é recuperada da cultura utilizando técnicas padrão identificadas adiante.

Um ácido nucleico exógeno de MET10 que codifica a enzima inactiva pode também ser transferido para novos fundos genéticos utilizando tecnologias genéticas clássicas para leveduras de isolamento de esporos, acasalamento de esporos de tipos de acasalamento opostos e isolamento das estirpes diplóides resultantes. Podem ser utilizados vários ciclos de cruzamentos genéticos para isolar o novo alelo de MET10 num fundo de estirpe diferente. Não são necessárias ferramentas recombinantes para a criação das estirpes modificadas. Métodos exemplificados para a introdução de um ácido nucleico que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto numa célula hospedeira de levedura utilizando tecnologias genéticas clássicas para leveduras estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. 6,140,108. E. Purificação de Proteína MET10 A proteína MET10, quer de ocorrência natural quer recombinante, pode ser purificada para utilização em ensaios funcionais. As proteínas MET10 de ocorrência natural são purificadas, e.g., a partir de levedura e qualquer outra fonte de um homólogo de MET10. A MET10 recombinante é purificada a partir de qualquer sistema de expressão adequado. A METI0 pode ser purificada até uma pureza substancial por técnicas padrão, incluindo precipitação selectiva com substâncias como sulfato de amónio; cromatografia em coluna, métodos de imunopurificação, e outras (veja-se, e.g., Scopes, Protein Purification: Principies and Practice (1982); Patente U.S. 4,673,641; Ausubel et al., supra; e Sambrook et ai., supra) . 34

ΕΡ 2 132 318/PT

Podem ser empregues vários procedimentos quando se está a purificar a proteina MET10 recombinante. Por exemplo, proteínas possuindo propriedades de adesão molecular estabelecidas podem ser reversivelmente fundidas com MET10. Com o ligando apropriado, a MET10 pode ser selectivamente adsorvida numa coluna de purificação e depois ser libertada da coluna numa forma relativamente pura. A proteína fundida é então removida por actividade enzimática. Finalmente, a MET10 pode ser purificada utilizando colunas de imunoafinidade. IV. Determinação se uma Estirpe de Levedura Irá Produzir H2S por Detecção de Sequências de Ácido Nucleico de MET10 São aqui descritos métodos para determinação se uma estirpe de levedura particular é um produtor de H2S. De acordo com estes métodos, o alelo de MET10 da estirpe de levedura é analisado e comparado com os alelos de MET10 aqui divulgados para determinar se a estirpe de levedura é um alto, baixo ou não produtor de H2S. A determinação da presença ou da ausência de um alelo de MET10 particular é geralmente realizada por análise de uma amostra de ácido nucleico que é obtida a partir de uma levedura (e.g., do género Saccharomyces) a analisar. Frequentemente, a amostra de ácido nucleico compreende ADN genómico. É também possível analisar amostras de ARN quanto à presença de alelos de MET10.

As técnicas de detecção para avaliação de ácidos nucleicos quanto à presença de uma alteração de uma única base envolvem procedimentos bem conhecidos no campo da genética molecular. Adicionalmente, muitos dos métodos envolvem a amplificação de ácidos nucleicos. É proporcionada na especialidade ampla orientação para a realização dos métodos. Os exemplos de referências incluem manuais tais como PCR Technology: Principles And Applications For DNA Amplification (ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide To

Methods And Applications (eds. Innis, et ai., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel, 1994-2008, Wiley Interscience, incluindo suplementos de actualização de April 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001).

Os métodos para a detecção de alterações de uma única base bem conhecidos na especialidade implicam frequentemente 35 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ um de vários protocolos gerais: hibridação utilizando oligonucleótidos específicos de sequências, extensão de iniciadores, ligação especifica de sequências, sequenciação ou técnicas de separação electroforética, e.g., análise de polimorfismo conformacional em cadeia simples (SSCP) e análise de heterodúplices. Os exemplos de ensaios incluem ensaios de 5'-nuclease, incorporação de terminadores corantes dirigida por moldes, ensaios de oligonucleótidos específicos de alelos "faróis" moleculares, ensaios de extensão de uma única base, e pontuação SNP por sequências de pirofosfato em tempo real. A análise de sequências amplificadas pode ser realizada utilizando várias tecnologias tais como microchips, ensaios de polarização de fluorescência e espectrometria de massa de ionização de dessorção de laser assistida por matriz (MALDI). Em adição a estas metodologias frequentemente utilizadas para análise de amostras de ácido nucleico para detectar alterações de uma única base, pode ser utilizado qualquer método conhecido na especialidade para detectar a presença das mutações de MET10 aqui descritas.

Embora os métodos empreguem tipicamente passos de PCR, podem também ser utilizados outros protocolos de amplificação. Os métodos adequados de amplificação incluem a reacção em cadeia pela ligase (veja-se, e.g., Wu & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988); ensaio de deslocamento de cadeias (veja-se, e.g., Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:392-396, 1992; Pat. U.S. 5,455,166); e vários sistemas de amplificação à base de transcrição, incluindo os métodos descritos nas Pat. U.S. 5,437,990; 5,409,818; e 5,399,491; o sistema de amplificação da transcrição (TAS) (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-1177, 1989); e replicação de sequências auto-sustentada (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 87:1874-1878, 1990; WO 92/08800). Alternativamente, podem ser utilizados métodos que amplificam a sonda para níveis detectáveis, tais como amplificação com Qp-replicase (Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989). Uma revisão de métodos de amplificação conhecidos é proporcionada, por exemplo, por Abramson e Myers em Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993.

Em algumas concretizações, o alelo de MET10 é detectado utilizando iniciadores oligonucleotídicos e/ou sondas. Os 36

ΕΡ 2 132 318/PT oligonucleótidos podem ser preparados por qualquer método adequado, incluindo síntese química. Os oligonucleótidos podem ser sintetizados utilizando reagentes e instrumentos comercialmente disponíveis. Alternativamente, podem ser adquiridos através de fontes comerciais. Os métodos de síntese de oligonucleótidos são bem conhecidos na especialidade (veja-se, e.g, Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979;

Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; e o método em suporte sólido de Pat. U.S. 4,458,066). A. Identificação por PCR de Alelos de MET10

Em algumas concretizações, utiliza-se PCR para amplificar ácidos nucleicos que codificam alelos de MET10. Uma revisão geral da tecnologia aplicável pode ser encontrada em PCR Protocols: A Gulde to Methods and Applications (Innis et al. eds. (1990)) e PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed. (1992)). Em adição, a tecnologia da amplificação está descrita nas Patentes U.S. 4,683,195 e 4,683,202. A PCR permite a cópia, e a amplificação resultante de um ácido nucleico alvo, e.g., um ácido nucleico que codifica MET10. Resumidamente, um ácido nucleico alvo, e.g. ADN de uma amostra compreendendo estirpes de levedura de interesse, é combinado com iniciadores de sentido directo e anti-sentido, os dNTP, ADN-polimerase e outros componentes da reacção. (Veja-se, Innis et al., supra). O iniciador de sentido directo pode hibridar com a cadeia anti-sentido de uma sequência de ADN de interesse. O iniciador anti-sentido pode hibridar com a cadeia de sentido directo da sequência de ADN, a jusante da localização onde o iniciador de sentido directo híbrida com o ADN alvo. No primeiro ciclo de amplificação, a ADN-polimerase alonga os iniciadores anti-sentido e de sentido directo que estão hibridados com o ácido nucleico alvo. As primeiras cadeias são sintetizadas na forma de cadeias longas de comprimento indiscriminado. No segundo ciclo de amplificação, os iniciadores anti-sentido e de sentido directo hibridam com o ácido nucleico alvo progenitor e com as sequências complementares nas cadeias longas. A ADN-polimerase alonga então os iniciadores hibridados para formar cadeias de comprimento discreto que são complementares uma das outras. Os 37

ΕΡ 2 132 318/PT ciclos subsequentes servem para predominantemente amplificar as moléculas de ADN de comprimento discreto.

Em geral, a PCR e outros métodos de amplificação utilizam iniciadores que hibridam com cada uma das extremidades do ADN de interesse. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam alelos de MET10 ou seus fragmentos podem ser amplificados utilizando pares de iniciadores de ácido nucleico isolados possuindo as sequências estabelecidas na Tabela 5. B. Detecção de produtos amplifiçados

Os produtos amplificados podem ser detectados utilizando quaisquer meios conhecidos na especialidade, incluindo, e.g., análise de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP); electroforese em gel desnaturante (veja-se, e.g., Erlich, ed., PCR Technology, Principles And Applications For DNA Amplification, W.H. Freeman and Co, New York, 19 92, Chapter 7), sequenciação directa e análise à base de HPLC. Os métodos adequados de sequenciação incluem e.g., métodos baseados na sequenciação de didesoxi e sequenciação de Maxam e Gilbert (veja-se, e.g., Sambrook e Russell, supra). As análises adequadas à base de HPLC incluem, e.g., HPLC desnaturante (dHPLC) como descrito em e.g., Premstaller e Oefner, LC-GC Europe 1-9 (July 2002); Bennet et ai., BMC Genetics 2:17 (2001); Schrimi et al., Biotechniques 28 (4):740 (2000); e

Nairz et al. , PNAS USA 99(16):10575-10580 (2002); e espectrometria de massa de ionização por electropulverização -HPLC de fase inversa com pares iónicos (ICEMS) como descrito em e.g., Oberacher et al.; Hum. Mutal. 21 (1) :86 (2003) . Outros métodos para a caracterização de alterações de uma única base em alelos de MET10 incluem, e.g., extensões de uma única base (veja-se, e.g., Kobayashi et al., Mol. Cell. Probes, 9:175- 182, 1995); análise de polimorfismos de conformação de cadeia simples, como descrito, e.g, em Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 86, 2766-2770 (1989), hibridação de oligonucleótidos específica de alelos (ASO) (e.g., Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48 : 70-382, 1991; Saiki et al., Nature 324, 163- 166, 1986; EP 235, 726; e WO 89/11548); e métodos de amplificação específica da sequência ou extensão de iniciadores como descrito em, por exemplo, WO 93/22456; Pat. U.S. 5,137,806; 5,595,890; 5,639,611; e Pat. U.S. 4,851,331; ensaios de 5'-nuclease, como descrito nas Pat. U.S. 5,210,015; 38 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ 5,487,972; e 5,804,375; e Holland et al.r 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7276-7280. V. Métodos para Redução dos Níveis de H2S em Bebidas Fermentadas

Podem ser utilizadas estirpes de levedura compreendendo as sequências nucleicas de MET10 aqui descritas para reduzir os níveis de H2S em bebidas fermentadas (e.g., vinho e cerveja).

De acordo com os métodos da invenção, células de levedura transformadas com uma sequência de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto, como aqui descrito, são colocadas em contacto com um meio de fermentação (e.g., um mosto de frutos ou um mosto de malte) e a mistura é incubada durante um período de tempo adequado (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias) num primeiro vaso de fermentação adequado (e.g., um tanque, um barril, um recipiente de barro, um boião, uma selha ou um recipiente de polietileno) a uma temperatura adequada (e.g., cerca de 70-75°F) para a fermentação prosseguir. O líquido pode então ser transferido para um segundo vaso de fermentação. O segundo vaso pode ou não ser selado e o conteúdo é incubado durante um período de tempo adequado (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas) a uma temperatura adequada (e.g., cerca de 60-65°F) para prosseguimento da fermentação anaeróbica e do envelhecimento. O líquido é então transferido para um terceiro vaso para trasfega (i.e., clarificação) . O terceiro vaso é selado e o sedimento é deixado assentar durante um período de tempo adequado (e.g., 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas) . A trasfega pode ser repetida uma, duas, três ou mais vezes antes do engarrafamento da bebida fermentada. O alelo de MET10 nativo pode ser substituído utilizando tecnologias de ADN recombinante ou cruzado por estratégias clássicas de melhoramento. O alelo de MET10 de UCD932 confere uma cor branca às colónias em ágar BiGGY, o que permite que este alelo seja seguido em cruzamentos genéticos e seja prontamente rastreado durante a produção para demonstrar o sucesso da implantação da estirpe.

Quando o vinho está límpido e toda a fermentação e envelhecimento pré-engarrafamento parou, sifona-se em garrafas 39 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ de vinho e rolham-se as garrafas firmemente. Deixam-se as garrafas rolhadas em pé durante 3-5 dias e depois armazenam-se deitadas a 55 graus Fahrenheit durante de seis meses (vinho branco) a um ano (vinho tinto) antes da amostragem. Se não corresponder às espectativas, deixa-se envelhecer mais um ano ou mais. A levedura pode ser transformada utilizando qualquer método conhecido na especialidade incluindo, e.g., o método de LiAc/ADNcs transportador/PEG descrito por Gietz e Woods Methods in Enzymology 350: 87-96 (2002); Agatep et al. ,

Technical Tips Online Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol (1998); e o método de dois híbridos de levedura descrito em Gietz et al., Mol Cell Biochem 172:67-79 (1997). Os métodos para a preparação de células de levedura que são competentes para transformação estão estabelecidos em, e.g., Dohmen et al. (1991) Yeast 1: 691-692. VI. Kits Ο MET10 e os seus homólogos são ferramentas úteis para a identificação mais específica e sensível de estirpes de levedura que são fracos produtores de H2S. Por exemplo, ácidos nucleicos que hibridam especificamente com ácidos nucleicos de METI 0, tais como sondas e iniciadores de MET10 {e.g., como estabelecido na Tabela 5), ácidos nucleicos de MET10 {e.g. como estabelecido na Figura 2), são utilizados para identificar estirpes de levedura que são fracos produtores de H2S.

Também são aqui descritos kits e soluções para a detecção dos alelos de MET10 aqui descritos. Por exemplo, são descritos kits que incluem um ou mais vasos reaccionais que contêm alíquotas de alguns ou todos os componentes da reacção. As alíquotas podem estar na forma líquida ou seca. Os vasos reaccionais podem incluir cartuchos de processamento de amostras ou outros vasos que permitem a retenção, o processamento e/ou a amplificação de amostras no mesmo vaso. Estes kits permitem a pronta detecção de produtos de amplificação da invenção em dispositivos de amplificação convencionais ou portáteis. Os kits podem também incluir 40 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ instruções escritas para a utilização do kit para amplificar e controlar a amplificação de uma amostra alvo.

Os kits podem incluir, por exemplo, reagentes de amplificação compreendendo iniciadores suficientes para amplificar pelo menos um alelo de METI 0, e pelo menos uma sonda para amplificação e detecção da sequência polinucleotidica. Em adição, o kit pode incluir nucleótidos (e.g., A, C, G e T), uma ADN-polimerase e tampões apropriados, sais e outros reagentes para facilitar as reacções de amplificação.

Em algumas concretizações, os kits compreendem vasos tais como cartuchos de processamento de amostras úteis para a rápida amplificação de uma amostra como descrito em Belgrader, et ai., Biosensors and Bioelectronics 14:849-852 (2000);

Belgrader, et al., Science, 284:449-450 (1999); e Northrup, M.A., et al. "A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems" em PCR PROTOCOLS (Sninsky, J.J. et al. (eds.)) Academic, San Diego, Chapter 8 (1998)).

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1: Identificação de Genes que Afectam a Produção de H2S

Para mais bem entender os mecanismos e vias através dos quais se forma H2S, e para desenvolver futuras estratégias de prevenção ou gestão, foi realizado um rastreio do conjunto de estirpes mutantes de deleção de levedura, constituído por 4827 mutantes, para identificar genes que afectam a produção de H2S. Uma colecção de isolados nativos de fermentações de vinho (Mortimer 1994) foi rastreada de modo a definir a base do desvio da cor das colónias versus a actual produção de H2S. Em adição, uma colecção de mutantes nulos de levedura cuja estirpe progenitora é um não produtor de H2S, foi rastreado quanto a genes que, quando mutados, resultaram em elevada formação de H2S. Os possíveis efeitos aditivos sobre a formação de H2S destas mutações foram também avaliados. 41

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Materiais e Métodos

Estirpes de levedura e condições das culturas. As estirpes de levedura utilizadas para este estudo e cujos resultados estão apresentados estão enumeradas na Tabela 1. As estirpes de levedura foram mantidas e crescidas em meio de extracto de levedura, peptona e dextrose com 2% de glucose (YPD) (Sherman et al. 1974). Utilizou-se o mesmo meio (YPD) com geneticina (G418, 0,2 mg/ml) para a manutenção de estirpes de deleção portadoras do marcador G418R.

Tabela 1. Estirpes de Levedura Nativas e Industriais Estirpes Genótipos conhecidos ou descrições Referência ou Fonte UCD522 Isolados industriais UCD UCD713 Isolados industriais UCD UCD819 Isolados industriais UCD UCD932 (Ba2) Isolados nativos UCD UCD933 Isolados nativos UCD UCD934 (Ba25) Isolados nativos UCD UCD935 Isolados nativos UCD UCD936 Isolados nativos UCD UCD937 Isolados nativos UCD UCD938 (Ba86) Isolados nativos UCD UCD939 (Ba9 9) Isolados nativos UCD UCD940 (Balll) Isolados nativos UCD UCD941 Isolados nativos UCD UCD942 (Bal26) Isolados nativos UCD UCD943 Isolados nativos UCD UCD944 Isolados nativos UCD UCD945 Isolados nativos UCD UCD946 Isolados nativos UCD UCD947 Isolados nativos UCD UCD948 Isolados nativos UCD UCD949 Isolados nativos UCD UCD950 (Bal96) Isolados nativos UCD UCD951 Isolados nativos UCD UCD952 Isolados nativos UCD UCD953 Isolados nativos UCD UCD954 Isolados nativos UCD UCD955 Isolados nativos UCD UCD956 (Ba224) Isolados nativos UCD UCD957 (Ba229) Isolados nativos UCD UCD958 Isolados nativos UCD 42 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Tabela 1. Estirpes de Levedura Nativas e Industriais Estirpes Genótipos conhecidos ou descrições Referência ou Fonte YLR303W BY4742 MATa his3ãl 1θιι2Δ0 lys2A0 ura3A0metl 7: : G41 8 Open Biosystems YGR155W BY4742 MATa hís3A1 leu2A0 Iys2à0ura3à0cys4::G418 Open Biosystems YHLO 31CBY 4 7 42 MATa his3Al leu2A0 lys2&0ura3A0gosl::G418 Open Biosystems YER060W—A BY4742 MATa hís3Al /eu2A0 lys2A0ura3A0fcy22::G418 Open Biosystems YGR138CBY4742 MATa hrs3Al leu2A0 lys2A0ura3A0tpo2::G418 Open Biosystems YDR158W BY4742 MATa hís3Al Ieu2à0 lys2A0ura3A0hom2::G418 Open Biosystems YJR139C BY4742 MATa hís3Al leu2A0 lys2A0ura3A0hom6::G418 Open Biosystems YNL315C BY4742 MATa his3Al leu2à0 Iys2à0ura3à0tpl1::G418 Open Biosystems YIL074C BY4742 MATa his3à 1 leu2b.Q /ys2b.Q ura3b.Qser33:: G418 Open Biosystems YNL031C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0ura3A0hht2::G418 Open Biosystems YBR095C BY4742 MATa híξ3Δ1 leu2A0 lys2A0ura3A0rxt2::G418 Open Biosystems YLR384C BY4742 MATa hís3A1 leu2A0 lys2A0ura3A0íkí3::G418 Open Biosystems YPL035C BY4742 MATa hís3A1 leu2A0 Iys2ã0 ura3A0yplO35c::G418 Open Biosystems YDL047W BY4742 MATa hís3A1 leu2A0 lys3A0ura3A0sít4::G418 Open Biosystems YBL046W BY4742 MATa hís3A1 leu2A0 lys2A0ura3A0psy4::G418 Open Biosystems YGL029W BY4742 MATa his3A1 leu2A0 lys2A0ura3ã0cgrl::G418 Open Biosystems ADN e Manipulações Genéticas. As manipulações genéticas incluindo cruzamentos, esporulação e análise de tétrades, foram realizadas utilizando procedimentos padrão (Gunthrie 1991). As deleções dos genes foram confirmadas por PCR utilizando o iniciador directo a montante e um iniciador inverso interno para o marcador de ruptura de KanMX - JKKanRE. As condições da amplificação foram as seguintes: 30 ciclos de 94°C durante 2 min., 92°C durante 45 s, 56°C durante 30 s, 72°C durante 1 min e um extensão final a 72°C durante 7 min. As sequências iniciadoras estão enumeradas na Tabela 5.

Rastreio do conjunto de deleção e estirpes nativas. O conjunto de deleção (Open Biosystems, Huntsville, AL) e a colecção de isolados nativos foram rastreados em ágar BiGGY, um ágar para levedura de bismuto, glucose e glicina (Nickerson 1953). Foram também rastreados em meio de sumo de uva sintético, "Meio Minimo de Mosto" (MMM) (Spiropoulos et al. 2000) inicialmente com 123 mg de equivalentes de azoto/litro. O nível de azoto foi gerado utilizando 0,2 g de L-arginina/litro e 0,5 g de fosfato de amónio/litro. 43 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Análise da formação de sulfureto de hidrogénio. A produção de sulfureto de hidrogénio foi avaliada utilizando o método do acetato de chumbo (Spiropoulos et al. 2000; Giudici, P., e R.E. Kunkee, 1994). A formação de sulfureto de hidrogénio foi inicialmente detectada utilizando tiras de papel (2 x 10 cm, papel de filtro Whatman de 3mm) que tinham sido previamente tratadas com 50 pL de solução a 5% de acetato de chumbo e deixadas secar à temperatura ambiente. As tiras de acetato de chumbo foram dobradas ao meio e inseridas em tubos de cultura de 50 mL com a tampa do tubo de cultura a segurar cada extremidade da tira, encerrando a porção média da tira de acetato de chumbo no ambiente gasoso sobre o meio líquido. A formação de sulfureto de hidrogénio foi qualitativamente medida pelo grau de escurecimento da tira de acetato de chumbo. Este rastreio foi conduzido por Carrie Findleton como parte da sua dissertação da tese de MS.

Todos os positivos foram confirmados utilizando um método mais sensível e semi-quantitativo. Enrolou-se uma tira de papel de filtro Whatman (1,5 x 8,0 cm, 3mm) e colocou-se numa pipeta de plástico sem bolha de lml e tratou-se com 250 μΐ de uma solução a 3% de acetato de chumbo. Deixou-se secar o papel secar à temperatura ambiente e fixou-se então a coluna de plástico de acetato de chumbo ao tubo de cultura de 50 mL com uma tampa de silicone. A formação de sulfureto de hidrogénio foi medida por mm de escurecimento do papel.

Em experiências subsequentes, para quantificar a produção de H2S, utilizaram-se colunas de acetato de chumbo compactadas, em que cada mm de escurecimento da coluna denotava 4 pg/L de H2S. As colunas de acetato de chumbo foram adquiridas a Figasa International Inc. (Seoul, Coreia).

Condições de fermentação. Para identificar estirpes de levedura e condições nutricionais com impacto na formação de sulfureto de hidrogénio, cresceram-se culturas de levedura em 5 mL de Meio Triple M modificado em tubos de cultura de 50 mL a 25°C em tábuas agitadoras a 120 rpm. O meio de sumo de uva sintético "Meio Mínimo de Mosto" (MMM) (Giudici et al. 1993) foi utilizado e modificado a partir da receita original para produzir sete diferentes composições de azoto e micronutrientes. Manipularam-se as adições de arginina, 44

ΕΡ 2 132 318/PT fosfato de amónio e casaminoácidos para ajustar a concentração de azoto, e ajustaram-se as adições de YNB (Base de Azoto de Levedura sem Aminoácidos e Sulfato de amónio) para controlar a concentração de nutrientes e vitaminas. As modificações ao Triple M estão ilustradas na Tabela 2.

Tabela 2 Composição do Meio Triple M Modificado Variedade de MMM Arginina (g/litro) Fosfato de Amónio (g/litro) Casamino- ácidos (g/litro) YNB (g/litro) 433 g de equivalentes de azoto/litro 0, 8 1 2 1, 7 123 g de equivalentes de azoto/litro 0,2 0,1 2 1,7 123 g de equivalentes de azoto/litro e 1/5 de YNB 0, 2 0,1 2 0, 34 65 g de equivalentes de azoto/litro, sem Casaminoácidos 0, 2 0, 03 0 1, 7 65 g de equivalentes de azoto/litro 0,107 0,015 1 1,7 65 g de equivalentes de azoto/litro e 1/2 de YNB 0,107 0,015 1 0, 85 65 g de equivalentes de azoto/litro e 1/3 de YNB 0,107 0,015 I 0, 567

Os inóculos de levedura foram obtidos a partir de colónias de levedura plaqueadas. Este procedimento pode ter resultado em alguma variação no número de células na inoculação, mas foi necessário devido ao grande número de estirpes de levedura envolvido no processo de rastreio preliminar. A formação de sulfureto de hidrogénio foi avaliada após quatro dias pelo grau de escurecimento da tira de acetato de chumbo. As estirpes que não cresceram em quatro dias foram repetidas para assegurar que não havia outras variáveis que resultassem na ausência de crescimento.

Para estirpes de interesse seleccionadas, a formação de sulfureto de hidrogénio foi quantificada utilizando colunas de acetato de chumbo. Para este fim, conduziram-se fermentações em balões de Erlenmeyer de 500 mL, contendo 300mL de MMM, com uma coluna de acetato de chumbo segura no topo do balão numa rolha de borracha. Para este fim, utilizou-se MMM de azoto a 123 mg/L para mais precisamente emular as condições de baixo teor de azoto do sumo de uva. As fermentações foram iniciadas a uma densidade de 1,33 x 105 células/ml por inoculação com células em fase estacionária de uma cultura pré-crescida em Meio Triple M com a mesma composição. As fermentações foram realizadas em triplicado, incubadas a 25°C e 120rpm, e 45 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ monitoradas ao longo de sete dias em termos de perda de peso e escurecimento na coluna de acetato de chumbo.

Rastreio do conjunto de deleção e isolados nativos em ágar BiGGY. Para avaliar a produção de H2S das estirpes de deleção e isolados nativos estes foram inicialmente todos plaqueados em ágar BiGGY e foi avaliada a cor das colónias. As cores das colónias foram branco, cor de bronze claro, cor de bronze (cor da estirpe progenitora do conjunto de deleção), castanho claro, castanho ou preto (Linderholm et al. 2006). Do conjunto de deleção, quatro colónias eram brancas, 258 eram cor de bronze claro, 4478 eram cor de bronze, 59 eram castanho claro, 28 eram castanhas e uma colónia era preta variando em cor da colónia de claro para escuro.

Rastreio de isolados nativos e comerciais em sumo sintético. Trinta isolados nativos foram rastreados em sumo sintético MMM com 123 mg/L de azoto para avaliar a produção de H2S versus as cores das colónias. Os não produtores de H2S (i.e., UCD932, UCD713 UCD819, UCD938, UCD942, UCD954 e UCD956) tinham cores de colónias que variavam desde branco até castanho claro. As estirpes produtoras de H2S variavam desde cor de bronze claro (3) até cor de bronze (10) até castanho claro (5) até castanho (5). As colónias mais escuras (castanhas) variavam de 2-6 mm de H2S e estão na gama média de produção. Os três melhores produtores (mais de 10 mm) são cor de bronze claro, cor de bronze e castanho claro em BiGGY. Os isolados nativos em BiGGY e em MMM estão mostrados na Tabela 3. 46

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Tabela 3. Isolados nativos em BiGGY e em MMM Estirpe Cor das colónias H2S (mm) UCD522 cor de bronze 4 UCD713 cor de bronze 0 UCD819 cor de bronze 0 UCD932 branco 0 UCD933 castanho 3 UCD934 cor de bronze 5,5 UCD935 cor de bronze 10,5 UCD936 castanho 2 UCD937 cor de bronze claro vestígios UCD938 cor de bronze 0 UCD939 cor de bronze claro 14,5 UCD940 castanho 6 UCD941 castanho 2 UCD942 cor de bronze claro 0 UCD943 castanho claro 3,5 UCD944 castanho claro vestígios UCD945 cor de bronze 8 UCD946 cor de bronze 2 UCD947 cor de bronze 1, 75 UCD948 cor de bronze 2,5 UCD949 cor de bronze claro vestígios UCD950 castanho claro 19 UCD951 cor de bronze 5,5 UCD952 cor de bronze 8 UCD953 castanho claro vestígios UCD954 castanho claro 0 UCD955 castanho 4 UCD956 branco 0 UCD957 cor de bronze 9 UCD958 castanho claro 1 47

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Exemplo 2: Identificação de mutações no alelo de MET10 de UCD932

Como estabelecido no Exemplo 1 acima, a UCD932 foi identificada como uma estirpe de levedura que produz pouco a nenhum sulfureto de hidrogénio detectável sob uma variedade de condições ambientais. Esta estirpe também produz colónias brancas em ágar BiGGY, associadas a baixa actividade de sulfito-redutase. Um rastreio do conjunto de deleção de estirpes para S. cerevisiae originou quatro possíveis mutações resultantes em colónias brancas, todas codificando componentes de sulfito-redutase. Cruzamentos genéticos revelaram que o fenótipo de colónia branca em BiGGY em UCD932 se devia a uma alteração do gene MET10. A estirpe de deleção de MET10 era um auxotrofo relativamente a metionina mas a UCD932 não é um auxotrofo relativamente a metionina, o que indica que a actividade de sulfito-redutase é ainda retida pela célula. Para definir a base genética desta baixa capacidade de produção de sulfureto, ο MET10 e vários outros genes na via da redução do sulfato, identificados como possivelmente desempenhando um papel na supressão de H2S em S. cerevisiae, (Linderholm et al. 2006) foram sequenciados. Isto permitiria a identificação de alelos que podem ser substituídos em estirpes de vinho produtoras de H2S para eliminar a característica indesejável do sulfureto.

Materiais e Métodos

Estirpes de levedura e condições de cultura. As estirpes de levedura utilizadas para este estudo estão enumeradas na Tabela 4. As estirpes de levedura foram mantidas e crescidas em meio de extracto de levedura, peptona e dextrose com 2% de glucose (YPD) (Sherman et al. 1974). Utilizou-se o mesmo meio (YPD) com geneticina (G418, 0,2 mg/ml) ou higromicina (Hph, 0,3 mg/ml) para a manutenção de estirpes de deleção portadoras do marcador G418R ou HphMX. Os meios mínimos (YNB) foram preparados com 0,67% de base de azoto de levedura sem aminoácidos e suplementados com casaminoácidos conforme recomendado (Sherman). Os meios de queda selectiva -met foram preparados de forma similar ao YNB sem a metionina. 48

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Tabela 4. Estirpes de levedura adicionais

Estirpes Genótipos ou descrições conhecidos Referência ou Fonte UCD932 (Ba2) Isolados nativos UCD UCD934 (Ba25) Isolados nativos UCD UCD938 (Ba86) Isolados nativos UCD UCD939 (Ba99) Isolados nativos UCD UCD940 (Balll) Isolados nativos UCD UCD942 (Bal26) Isolados nativos UCD UCD950 (Bal96) Isolados nativos UCD UCD956 (Ba224) Isolados nativos UCD UCD957 (Ba229) Isolados nativos UCD UCD522 Isolados industriais UCD YKR069W BY4742 MATa his3A1 leu2A0 lys2A0ura3A0metl::G418 Open Biosystems YJR137C BY4742 MATa his3A1 leu2A0 lys2A0ura3A0met5::G418 Open Biosystems YBR213W BY4742 MATa his3A1 leu2A0 lys2A0ura3A0met8::G418 Open Biosystems YFR030W BY4742 MATa his3A1 leu2A0 lys2AOura3AOmetlO::G418 Open Biosystems ALY38 UCD932 MET10s288c Presente Estudo ALY39 UCD932 MET10W2O932 Presente Estudo ALY95 UCD932 METI oDCD950 Presente Estudo ALY72 BY4742 MET10VCD95° Presente Estudo ALY40 UCD950 MET10s288c Presente Estudo ALY41 UCD950 MET108CD982 Presente Estudo ALY126 UCD950 MET10UCD50 Presente Estudo ALY127 UCD939 MET10ucd939 Presente Estudo ALY 128 UCD939 MET10s288c Presente Estudo ALY130 UCD940 MET10s288c Presente Estudo ALY129 UCD940 METiOUCD94° Presente Estudo ALY131 UCD940 MET10DCD932 Presente Estudo ALY132-1A UCD522 ME TIO::KanMX4 Presente Estudo ALY133-1B UCD522 MET10szaac Presente Estudo ALY134-1C UCD522 MET10s288c Presente Estudo AL Y135-1D UCD522 ΜΕΤ10::KanMX4 Presente Estudo ALY136-1A UCD522 MET10DCD522 Presente Estudo ALY137-1B UCD522 ME TIO::hphNTl Presente Estudo ALY138-1C UCD522 MET10: .-hphNTl Presente Estudo ALY139-1D UCD522 MET10DCD522 Presente Estudo ALY140-1A UCD522 METl(fCD932 Presente Estudo ALY141-1B UCD522 METI oDCD932 Presente Estudo ALY142-1C UCD522 METI 0::KanMX4 Presente Estudo ALY143-1D UCD522 ME TIO::KanMX4 Presente Estudo 49

ΕΡ 2 132 318/PT

Rastreio de conjunto de deleção. 0 conjunto de deleção de levedura (Open Biosystems, Huntsville, AL) foi rastreado em ágar BiGGY, um ágar para levedura de bismuto, glucose e glicina (Nickerson 1953), suplementado com casaminoácidos (Sherman 1974) . Cada estirpe foi plaqueada em ágar BiGGY e incubada a 30°C durante 48 horas. As colónias resultantes foram avaliadas quanto à cor.

Análise de Sequências. As análises de sequências de METI 0, H0M2, HOM6, SER33, METI, MET5 e MET8 foram realizadas a 169 estirpes de levedura nativas e industriais. 0 ADN cromossómico foi extraído das peletes de células utilizando o protocolo de "smash-and-grab" (Hoffman e Winston 1987) e a amplificação dos genes foi realizada utilizando High Fidelity Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) e os iniciadores PCR-MET10-F /PCR-MET10-R para MET10, HOM2-F/HOM2-R para HOM2, HOM6-F/HOM6-R para HOM6,SER33-F/SER33-R para SER33, MET1-F/MET1-R para METI, MET5-F/MET5-R para MET5 e MET8-F/MET9-R para MET8 (Tabela 5) . As condições de amplificação foram as seguintes: 30 ciclos de 94°C durante 1 min., 94°C durante 30 s, 50°C durante 30 s, 68°C durante 4 min. e uma extensão final a 68°C durante 7 min.

Tabela 5. Iniciadores de PCR

Iniciador Sequência (5' -► 3') SEQ ID NO: H0M2 HOM2-F CAC T T AAGT ACACATACAAA 35 HOM2-R GGGTCAGCGAGAGAATT 36 HOM6 HOM6-F CCTGGTGGTAAAGTTGGG 37 HOM6-R GATTGTAGAAGATTGAGTAG 38 SER33 SER33-F GGAATCTCCCAGGTTTAAT 39 SER33-R GGGCAATCAAAGGCTAT 40 METI MET1-F C GC T AAT AAAC T C GC T ACAAAAG 41 50 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Iniciador Sequência (5' ^3') SEQ ID NO: H0M2 MET1-R CGTCCTTTTTGCTCAATATCC 42 MET5 MET5-F GCTGCAAGCAGTTATATAAAGTG 43 MET5-R AAAAC C GAAC T AGC C GAAG 44 METS MET8-F AAAATCGCTACAAAGTCCG 45 MET8-R GCATTGTTGTTCGTTCTCC 46 iniciadores de MET10 PCR-MET10-F CGGATCCCCAATCACCATAACACTT 47 PCR-MET10-R GCCGCGGTAGGGTCTTCAGGACGAG 48 METIO-F-KO CAAATAGTTTCGTTTAGATGG 49 METIO-R-KO GTATAATGTGATGGTTAGTT 50 METI0-hphMX-F ACTGTGTTTATCACTTATGGGTCTTTAGAATCC GAATTGTATTTTGATGGCCGCACGG 51 METI0-hphMX-R AACAATTCAAAAATGTCAGCATATGTATAATA CTCCACATAATCGACAGCAGTATAGCGACCA 52 Iniciadores de Confirmação JKKanRE GGGCGACAGTCACATCAT 53 HYGROB CHK R TGACGGTGTCGTCCATCAC 54

Todas as sequenciações foram realizadas no College of Biological Sciences Sequencing Facility na University of Califórnia, Davis utilizando um analisador genético de electroforese capilar ABI 3730 e química de sequenciação em ciclos ABI BigDye Terminator versão 3.1 (Foster City, CA) . Os iniciadores utilizados estão enumerados na Tabela 6. Os dados das sequências foram editados e analisados com o editor de alinhamento de sequências BioEdit (versão 5.0.9; Nucleic Acids Symp. Ser. 41:95-98). 51

ΕΡ 2 132 318/PT

Tabela 6 Iniciadores de Sequenciação MET

Iniciador Sequência (5' -^3') SEQ ID NO: METI MET1-S1F TGGGGAGAGTTCTGGTATGCAAG 55 MET1-S2F CAGATGGTTATCTCAGATAATGGAG 56 MET1-S3F TTTCTTCAAAGATCACGGATATATT 57 MET1-S1R GCTATATCACGTTGAGTAGCGG 58 MET1-S2R GGTACTACACCCTCTGTGACAGTT 59 MET1-S3R CTCAGTTTTTGGCATTGCCA 60 MET5 MET5-S1F CCTAATAAACTTCCATTGGTGATTA 61 MET5-S2F CCGTTTTACAGGGTGTCTCTAAGA 62 MET5-S3F GACGCGATCTTGACGAAGCT 63 MET5-S4F GAATCTGGTTACTGGCCATTGT 64 MET5-S5F CTGAAAAATGACACCGACTTGG 65 MET5-S6F TGGCTTGCTCTGGATCACTT 66 MET5-S7F CGATGTCGGTTTAGTTGCTATAGTT 67 MET5-S8F TGGTAATCAACATTTGGTTATCTCT 68 MET5-S1R GGGCAACCAGTCATTCTCATAA 69 MET5-S2R CTTCGACACCCATATCATCTACAG 70 MET5-S3R CAATTTTCCCATATCAGCGA 71 MET5-S4R CATCATCAACAGCAGCGCCG 72 MET5-S5R CTGATCGAAGGCAGCCTTGC 73 MET5-S6R CATATGGCTCTGAATCAATCAATAA 74 MET5-S7R T T CACAAC T T T T T TGACAGAAGAA 75 MET5-S8R CGTTAGCAATCTCCAAGGTAGGAA 76 MET8 MET8-S1F GCAGTGACTTCAAAGACGAATACC 77 MET8-S2F CTGGAGGACGCTGTCGTCAA 78 MET8-S1R TCATCTCTTACTAGAGCGCCAA 79 MET8-S2R GGTCCCAGTTCGGATTGATAA 80 52 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ MET10 MET10 SEQ1-F AGTCATCTTCGAGCAAA 81 MET10 SEQ2-F TCATGATGGTAAGTTTC 82 MET10 SEQ3-F TCAACGTCAGAGTGCCATT 83 MET10 SEQ4-F ATCAGTCGTTGAAGATGTC 84 MET10 SEQ5-F CTGAGATCTCTGATATTGC 85 MET10 SEQ6-F T GCAGTAGATT TGAAGAGAT 86 MET10 SEQ7-F CACACACATCGGCGCT 87 MET10 SEQ1-R CGGAGTCACGACACCAT 88 MET10 SEQ2-R GGCTGAAACTTGAGATCTC 89 METI0 SEQ3-R C T T GACGTAACT T TC TACAG 90 METI0 SEQ4-R TCATAATCAGCAGGCGTAAC 91 METI0 SEQ5-R CTTCTCTTCAATGGTTCAAT 92 METI0 SEQ6-R AGTAGGGCCAGACAAGT 93

Os números de acesso na GenBank para estas sequências são: UCD932MET10 (EF058164), UCD938 MET10 (EF058165), UCD939 METI 0(EF058166) , UCD940 MET10 (EF058167), UCD942 METI 0(EF05816 8) , UCD956 (EF058169), UCD522 MET10 (EF 05 8170), UCD957 MET10 (EF058171), UCD934 MET10 (EF058172), UCD950MET10 (EF0581 73) , UCD932 SER33 (EF058174), UCD939 SE.R33 (EF 0 5 81 75 ) , UCD940 SER33 (EF058176), UCD956 SER33 (EF058177), UCD950 SER33 (EF0581 78) , UCD932 HOM6 (EF058179), UCD932MET1 (EF058180) , UCD939 METI (EF058181), UCD940 METI(EF058182 ) , UCD950 METI (EF0581 83) , UCD956 METI (EF058184), UCD956 MET5 (EF058185) , UCD932 MET5 (EF058186), UCD940MET5 (EF058187), UCD939 MET5 (EF0581 88) , UCD932 METS(EF058189) , UCD939 MET8 (EF058190), UCD940 MET8 (EF058191), UCD950 MET8 (EF058192), UCD956 MET8 (EF0581 93) .

Manipulações Genéticas. As manipulações genéticas incluindo cruzamentos, esporulação e análise de tétrades foram realizadas utilizando procedimentos padrão (Guthrie 1991).

Plasmídeos, manipulações de ADN e métodos transformação.

Foram utilizados neste estudo os plasmídeos pAL51 (MET10S288C) , pAL52 (MET10ucm32) . Os iniciadores, PCR-MET10-F/PCR-MET10-R 53

ΕΡ 2 132 318/PT (Tabela 5), portadores dos locais de restrição BarnHI e SacII foram desenhados para amplificar MET10 a partir de ADN cromossómico das estirpes de levedura UCD932 e S288C (Invitrogen, Carlsbad, CA). 0 plasmídeo pYC130 (Olesen et al. 2000), um vector centromérico portador do marcador seleccionável G418R, foi digerido com BarnHI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, MA) para permitir a ligação de MET10. Os plasmideos resultantes, pAL51 (MET10S2SSC) , pAL52 (ΜΕΓ10UCD932) , foram utilizados para transformação. As deleções génicas de MET10 foram criadas utilizando uma técnica à base de PCR, Figura 3 (Baudin 1993). Uma cassete de deleção contendo KanMX (Colecção de Deleção de Levedura) com extremidades protuberantes de regiões não codificantes de cada lado de MET10 foi amplificada por PCR utilizando iniciadores, METIO-F-KO/METIO-R-KO, e o fragmento de PCR linear foi transformado nas estirpes diplóides de levedura UCD522, UCD932, UCD939, UCD940 e UCD950. Por recombinação homóloga, uma cópia do MET10 intacto foi substituída pela cassete knockout gerando estirpes portadoras de uma cópia de uma cópia intacta de MET10 e de um marcador KanMX. Todas as estirpes, excepto UCD522 MET10/KanMX, foram então esporuladas e as homólogas para G418R foram utilizadas para experiências posteriores. As deleções génicas foram confirmadas por PCR utilizando o iniciador directo a montante e um iniciador inverso interno para o marcador de ruptura de KanMX JKKanRE.

Para silenciar a cópia intacta remanescente de MET10 em UCD522 MET10/KanMX, amplificou-se uma cassete HphMX a partir de pYC140 linearizado com BarnHI (Hansen et al. 2003) utilizando os iniciadores METIO-hphMX-F/METIO-hphMX-R, e o fragmento de PCR linear foi transformado em ALY29. Uma colónia auxotrófica para metionina apresentando G418R e HphR foi seleccionada e a deleção de HphMX foi confirmada por PCR utilizando o iniciador directo a montante e um iniciador inverso interno para o marcador de ruptura de HphMX - HYGROB CHK_R.

Foram também criadas trocas de alelos de MET10 utilizando uma técnica à base de PCR (Figura 3) (Baudin 1993). Os alelos de MET10 foram amplificados a partir de S288C, UCD932, UCD939, UCD940, UCD950 e UCD522 utilizando iniciadores MET10-F- 54

ΕΡ 2 132 318/PT KO/METIO-R-KO. Os fragmentos de PCR lineares amplificados a partir de S288C e UCD932 foram então transformados nas estirpes auxotróficas para metionina. Os outros fragmentos foram transformados em estirpes individuais para criar as correspondentes estirpes de controlo.

As estirpes que apresentam a capacidade para crescer sobre placas auxotróficas para metionina foram seleccionadas e esporuladas para criar estirpes homólogas para MET10 para experiências adicionais. A S. cerevisiae foi transformada utilizando o método do acetato de litio adaptado de Schiestl e Gietz (1989) e a E. coli foi transformada utilizando o método descrito por Inoue et al. (Inoue et al. 1990) . A E. coli INVaF' (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizada para preparações de plasmídeos. Utilizou-se o meio de Luria-Bertani (Miller 1972) com ampicilina para a selecção de células de E. coli transformadas.

Condições de fermentação. Nas experiências de fermentação, o meio de sumo de uva sintético "Meio Mínimo de Mosto" (MMM) (Spiropoulos et al. 2000) foi utilizado com 208 mg de equivalentes de azoto/litro. O nível de azoto foi gerado utilizando 0,2 g de L-arginina/litro e 0,5 g de fosfato de amónio/litro. As fermentações foram iniciadas a uma densidade de 1,33 x 105 células/ml por inoculação com células em fase estacionária a partir de uma cultura pré-crescida em meio iniciador MMM. As fermentações foram conduzidas em balões de Erlenmeyer de 500 ml contendo 300 ml de meio. Cada balão foi equipado com uma rolha de silicone com um tubo de acetato de chumbo fixado. Os balões foram incubados a 25 °C com agitação a 120 rpm. As fermentações foram monitoradas durante sete dias utilizando a perda de peso como uma estimativa da produção de CO2.

Resultados

Caracterização da produção de sulfureto de hidrogénio das estirpes de deleção. De modo a avaliar a produção de sulfureto de hidrogénio de todo o conjunto de estirpes de deleção, estas foram inicialmente todas plaqueadas em ágar BiGGY e a cor das colónias foi avaliada. As colónias eram brancas, cor de bronze claro, cor de bronze (cor da estirpe progenitora), castanho claro, castanho ou preto. Quatro colónias eram brancas, 258 55 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ eram cor de bronze claro, 4478 eram cor de bronze, 59 eram castanho claro, 28 eram castanhas e uma colónia era preta. As quatro com deleção que originaram colónias brancas eram de MET10, MET8, MET5 ou METI. Identificámos também H0M2, H0M6 e SER33 como possivelmente desempenhando um papel na supressão da formação de sulfureto de hidrogénio (Linderholm et al. 2006) .

Identificação do gene responsável pelo clareamento numa estirpe nativa. UCD932, uma estirpe nativa isolada de Itália (Mortimer et al. 1994) é um não produtor de H2S branco em ágar BiGGY. Para identificar o gene que é responsável pelo seu fenótipo branco, foi acasalado com cada uma das estirpes de deleção brancas. Apenas uma estirpe não complementou o fenótipo branco de UCD932, YFR030W BY4742.

Quando um vector portador da cópia de tipo selvagem de MET10, pAL51 {METI 0S288C) , foi transformado em UCD932, resultou uma estirpe de UCD932 que produzia colónias cor de bronze mas não conduziu a formação de sulfureto (Tabela 7). Isto sugeriu que mais do que um gene, possivelmente em combinação com ME TIO, é responsável pelo fenótipo de baixa produção de H2S de UCD932.

Tabela 7

Propriedades de Fermentações com Produção de Sulfureto de Hidrogénio Transformadas com MET10

Estirpes3 Taxa de Fermentação Máxima (g/h)bcd H2S Total (pg) vector UCD932 0,437 <1 UCD932pMET10s288c 0,446 <1 UCD932pMET10DCD932 0,408 <1 â Vector: pYC130; pMET10s288c: pAL51; pMET10DCD932 : pAL52 b A taxa de fermentação máxima foi calculada a partir dos dados da taxa de fermentação utilizando pontos temporais correspondentes ao declínio mais acentuado em peso. c Os valores representam a média de determinações independentes de duas réplicas. d As fermentações atingiram a secura (definida por <0,5% de açúcar remanescente).

Análise de sequências de genes na via de redução do sulfato. Foi anteriormente demonstrado que UCD932 é portador 56 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ de mutações em CYS4 e MET6, ambas codificando para importantes enzimas na via da redução do sulfato (Linderholm et al. 2006) . Contudo, a introdução de alelos de tipo selvagem neste fundo não alterou a característica de baixa produção de H2S. Foi portanto interessante identificar de que outras mutações esta estirpe pode ser portadora em outros genes na via. Vários genes da via de redução do sulfato, METI 0, HOM2, HOM6, SER33, METI, MET5 e MET8 foram sequenciados a partir de UCD932 assim como de várias outras estirpes nativas e industriais que variam em cor no ágar BiGGY e na produção de H2S em sumo sintético (Spiropoulos et al. 2000) para determinar a diversidade genética da via de redução do sulfato (encontra-se um alinhamento de sequências de MET10 de várias estirpes de Saccharomyces na Figura 2) . As diferenças de aminoácidos de METIOp estão mostradas na Tabela 8.

Tabela 8 Diferenças de aminoácidos de METIOp

Posições de aminoácidos 135 172 314 475 511 590 662 896 Consenso T Nenhuma P D Nenhuma Nenhuma T P Modi ficação* (Estirpes) N (UCD932) T (UCD522, 932, 940, 938, 942,956) I (UCD934, 950,957) K (UCD934, 950, 957) T ou N (UCD940) A (S288C, UCD934, 957, 950) P ou S (UCD940) A (UCD938, 942) T (S288C, UCD932, 938, 939, 940, 942, 956) E (S288C, UCD522, 932, 938, 940, 942, 956) K (UCD932) s (UCD956) A ou T (UCD939) T ou I (UCD522) Q (UCD939) aEstirpes com duas possibilidades de aminoácidos indica que a estirpe é portadora de dois alelos. A análise da sequência de MET10 (uma componente da enzima sulfito-redutase) demonstrou que este não é conservado entre as estirpes de levedura (Tabela 9). Encontraram-se seis alelos, diferentes dos de S288C, nas dez estirpes que foram sequenciadas. Foram agrupados sem grande rigor pela cor no BiGGY e produção de H2S. UCD934, UCD957 e UCD950, produtores de H2S cor de bronze, possuíam alelos idênticos. UCD938 e UCD942, não produtores de H2S cor de bronze possuíam o mesmo alelo. UCD522 e UCD940, produtores de H2S castanhos, eram heterozigotas mas ambos os alelos eram idênticos aos encontrados em outras estirpes. UCD932 e UCD956, não produtores de H2S brancos, e UCD939, um produtor de H2S cor de bronze, possuíam, cada um, diferentes alelos. 57 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Tabela 9

Propriedades de Fermentações com Produção de Sulfureto de Hidrogénio com diferentes MET10

Estirpes Alelo Taxa Máxima de Fermentação (g/h)31,0 H2S Total (ug) UCD932 METI 0S288C 0,37 <1 METI 0UCD932 0,34 <1 METI 0UCD95° 0,41 <1 BY4742 METI 0UCD95° 0,26 <1 UCD950 METI 0S288C 0, 42 32 METI 0UCD932 0, 40 <1 METI 0UCD95° 0, 41 29 UCD939 METI 0S288C 0, 46 <1 METI 0UCD932 inviável METI 0UCD939 0,35 41 UCD940 METI 0S288C 0,40 54 METI 0ucm32 0,42 <1 METI 0UCIJ94° 0, 42 49 a A taxa máxima de fermentação foi calculada a partir dos dados de taxa de fermentação utilizando pontos temporais correspondentes ao declínio mais acentuado em peso. b Os valores representam a média de determinações independentes de duas réplicas. cAs fermentações atingiram a secura (definida por <0,5% de açúcar remanescente).

Mostrou-se que os outros genes na via de redução do sulfato são mais conservados. Não houve diferenças na sequência de aminoácidos ou de ADN em HOM2 (codifica para aspártico-beta-semi-aldeido-desidrogenase) , houve diferença de um aminoácido em HOM6 (codifica para homosserina-desidrogenase) em UCD932, diferença de um aminoácido em SER33 (codifica para 3-fosfoglicerato-desidrogenase) entre S288C e todas as outras estirpes de vinho e diferenças de vários aminoácidos em METI, MET5 e MET8 (todos componentes da enzima sulfito-redutase)).

Troca de alelos de MET10. A diversidade genética de alelos de MET10 e a evidente correlação com a produção de H2S 58 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ e a cor das colónias suportaram a hipótese de que os genes na via de redução do sulfato podem ser responsáveis pelo fenótipo de H2S em estirpes de vinho, pois a cor no ágar BiGGY é correlacionada genericamente com a produção de H2S através da detecção de actividade de sulfito-redutase. Foi portanto avaliado o efeito de MET10 na produção de H2S em estirpes produtoras de H2S. Os alelos de MET10 de estirpes de levedura produtoras de H2S foram substituídos pelo alelo ΜΕΤ10υοΌ932 (Figura 3). Os genes MET10 nativos em UCD950, UCD940, UCD939, UCD522 e UCD932 foram eliminados com uma cassete KanMX ou HphMX e depois as cassetes KanMX ou HphMX foram substituídas por um alelo de MET10 de UCD932, S288C ou pelos seus próprios alelos como controlo. Todas as estirpes portadoras de MET10l]cm32 fermentaram à mesma taxa que as estirpes progenitoras e de controlo mas tornaram-se não produtoras de H2S e tinham cor mais clara no ágar BiGGY. As estirpes portadoras de um alelo de S288C ou do seu próprio alelo mantiveram o seu fenótipo de produtor de H2S (Tabela 9).

As estirpes UCD939 portadoras do alelo MET10VCD932 não foram restabelecidas para prototrofos de metionina, ao contrário dos outros isolados de vinho e comerciais. Isto pode ser explicado pela presença de outras mutações de que esta estirpe é portadora na via da redução do sulfato. UCD939 possui duas mutações nos genes que codificam outras subunidades na enzima sulfito-redutase. A adição de uma terceira mutação pode diminuir a actividade da enzima sulfito-redutase drasticamente de modo que há menos sulfureto disponível para ser incorporado em aminoácidos que contêm enxofre, tais como metionina ou cisteína. Assim, a estirpe não consegue crescer em placas sem metionina. Podem também existir efeitos da acumulação de intermediários tóxicos a montante da sulfito-redutase porque a repressão da via do sulfato foi aliviada pela ausência de aminoácidos contendo enxofre tais como S-adenosil-metionina. Contudo a estirpe era viável quando o alelo MET10SZ88C foi substituído pelo seu próprio alelo, a cor da estirpe em BiGGY mudou de cor de bronze para branco e a sua produção de H2S foi significativamente reduzida. UCD522, uma estirpe de vinho comercial que foi caracterizada como aneuplóide (Bakalinsky e Snow 1990) um desequilíbrio do número de cromossomas que conduz a morte celular após esporulação. Portanto ambos os alelos precisavam 59

ΕΡ 2 132 318/PT de ser destruídos individualmente (Figura 3) em oposição ao silenciamento ("knocking out") de um alelo e depois esporulação da estirpe para ganhar um silenciamento homólogo como foi realizado com as outras estirpes. Um alelo de MET10 foi transformado nas estirpes knockout que depois foram esporulados para ganhar duas estirpes que eram G418R/hphNTlR e duas estirpes que eram portadoras do alelo de MET10. Cada estirpe foi utilizada nas experiências para observar se havia alguma inconsistência devido às manipulações genéticas (Tabela 10). As estirpes fermentaram até ao fim e comportaram-se como esperado em termos de produção de H2S. Cada uma das estirpes portadoras do marcador de resistência a fármacos eram auxotrofos para metionina e não produziam H2S. As estirpes portadoras do alelo MET10SZ88C ou MEriOUCD522 produziam H2S e a estirpe portadora do MEriOUCD932 não produzia h2s . 60

ΕΡ 2 132 318/PT

Tabela 10 Propriedades de Fermentações com Produção de Sulfureto de Hidrogénio da Estirpe Heteróloga UCD522 Estirpesa Alelo Taxa Máxima de Fermentação (g/h)bcd H2S Total (ug) UCD522-1A metlOA::KanMX4 0,35 <1 UCD522-1B METI osZ88c 0,35 16 UCD522-1C METI 0S288C 0,42 33 UCD522-1D metlOAd::KanMX4 0,24 <1 UCD522-1A METI 0UCD522 0,43 26 UCD522-1B meti0Δ:;hphNTl 0,24 <1 UCD522-1C metlOA:;hphNTl 0,34 <1 UCD522-1D METI oUCD522 0,38 4 UCD522-1A METI 0UCD932 0,36 <1 UCD522-1B METI 0UCD93Z 0,37 <1 UCD522-1C metlOA:;KanMX4 0,36 <1 UCD522-1D metlOA:;KanMX4 0,22 <1 aA,B,C,D - designam os diferentes esporos. b A taxa máxima de fermentação foi calculada a partir dos dados de taxa de fermentação utilizando pontos temporais correspondentes ao declínio mais acentuado no peso. c Os valores representam a média de determinações independentes de duas réplicas. dAs fermentações atingiram a secura (definida por <0,5% de açúcar remanescente).

Substituímos também a cassete KanMX em YFR030W BY4742 e UCD932 pelo alelo de MET10 de UCD950 e ambas eram cor de bronze em ágar BiGGY mas nenhum era produtor de H2S. Os cruzamentos entre BY4742 ou UCD932 e UCD950 indicaram que existem pelo menos quatro a cinco alelos que segregam para a produção de H2S.

Discussão

Uma das possibilidades para as diferenças de surgimento natural observadas na produção de sulfureto em S. cerevisiae é a ocorrência de alterações genéticas da expressão ou actividade de enzimas na via de redução do sulfato. A via de redução do sulfato exibe uma regulação complexa (Mountain et 61 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ al. 1991) e um aumento numa actividade enzimática pode ser tamponado por alterações na actividade de outras proteínas no interior da via.

Investigações prévias no nosso laboratório identificaram, num não produtor de H2S nativo, UCD932, vários alelos no interior da via de redução do sulfato. Contudo, demonstrámos que estes alelos particulares isoladamente não são responsáveis pelo fenótipo de H2S (Linderholm et al. 2006). No nosso rastreio da colecção de deleções para supressores da formação de H2S, identificámos vários outros genes na via de redução do sulfato nesse papel, H0M2, HOM6, SER33, METI, MET5, MET8 e MET10 (Linderholm et al. 2006). Quando esses genes foram sequenciados em UCD932 e outras estirpes de levedura nativas e industriais que variam em produção de H2S, foi revelado que a UCD932 é portadora de diferentes alelos em cinco dos nove genes, incluindo CYS4 e MET6 (Linderholm et al. 2006). Foram encontrados muitos alelos de MET10 na colecção de estirpes que foi sequenciada.

Neste estudo foi demonstrado que MET10 desempenha um importante papel na formação de H2S, embora isoladamente não seja responsável pelo fenótipo de não formação de H2S em UCD932; altera drasticamente o fenótipo de H2S em outras estirpes produtoras de H2S. Nas experiencias descritas acima, METI 0UCD932 foi trocado com sucesso pelos alelos nativos em três estirpes produtoras de H2S e isto alterou-as para não produtoras de H2S. Estes resultados têm muitas implicações positivas para a indústria vinícola devido à capacidade de construção de estirpes comerciais com reduzida produção de enxofre em qualquer fundo genético através da transferência dos alelos apropriados ou prever a característica de produção de H2S para qualquer estirpe de Saccharomyces cerevisiae. Ambas as técnicas seriam bastante simples e úteis para os produtores de vinho.

As experiências para a troca de MET10vcm32 em UCD939 não foram bem-sucedidas; a UCD93 9 ΜΕΤ10υθΌ932 não foi viável em placas deficientes em metionina. Contudo, isto pode ser explicado por outras mutações de que é portador na via de redução do sulfato. UCD939 é portador de duas mutações nos genes que codificam outras subunidades na enzima sulfito- 62 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ redutase e embora não seja um auxotrofo de metionina, a adição de uma terceira mutação pode diminuir a actividade drasticamente de modo que se torna um auxotrofo para metionina pois as enzimas a jusante não conseguem reforçar suficientemente a sua actividade para compensar. A regulação da redução do sulfato por aminoácidos contendo enxofre pode também ruir porque a estirpe deixa de produzir metionina e podem-se acumular intermediários tóxicos acima das enzimas sulfito-redutase e também tornam a estirpe inviável. UCD522 foi caracterizada como uma estirpe aneuplóide (Bakalinsky e Snow 1990). Quando o gene MET10 foi sequenciado em UCD522 observou-se que UCD522 é uma estirpe heterozigota, é portadora de dois alelos de MET10. Pode haver algum tipo de associação entre os componentes que conduzem à incapacidade de a manipular geneticamente como as outras estirpes. É possivel que algum tipo de complexo se forme entre os alelos de MET10 ou as proteínas que codificam, que não permita a sua correcta agregação durante a esporulação se for eliminado apenas um dos alelos. Contudo, quando cada alelo é substituído individualmente, a estirpe pode esporular correctamente. A UCD522 MET10UCD932 foi esporulada para originar duas estirpes que eram G418R/hphNTlR e auxotrofos para metionina e duas estirpes que eram sensíveis a fármacos e portadoras do alelo de MET10. Cada estirpe fermentou até ao fim e as suas características de H2S foram as esperadas.

Exemplo 3: Caracterização adicional do alelo METIOp de UCD932

Como demonstrado nos Exemplos acima, o alelo de MET10 presente na estirpe de levedura UCD932 é capaz de converter uma estirpe altamente produtora de sulfureto de hidrogénio (H2S) numa estirpe que não produz H2S detectável. Isto foi mostrado claramente com as estirpes altamente produtoras UCD522 e UCD950, que não produziram H2S detectável quando portadoras do alelo de MET10 de UCD932. A capacidade de converter uma estirpe num fraco produtor de H2S possui implicações em qualquer indústria que utilize levedura incluindo as indústrias do vinho, da cerveja e do etanol combustível. Em adição a apresentarem um problema para o produto final por adição de um forte cheiro a ovo podre, o CO2 criado na fermentação é frequentemente um subproduto útil, quer para ser vendido na forma de gás quer para ser utilizado 63 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ como um gás motor para o movimento do produto (produção de cerveja). Portanto, evitar que o gás cheire a ovos podres representa um claro beneficio. 0 trabalho anterior determinou que os alelos de MET10 de UCD932 e UCD950 diferem em seis nucleótidos, e que cinco destas alterações resultam em alterações na sequência primária da proteína (veja-se, Figura 2). Para adicionalmente caracterizar o alelo de MET10 de UCD932, os alelos nativos de MET10 foram clonados no vector vaivém pUG6. A técnica de mutagénese por PCR Quick Change foi utilizada para preparar alterações de nucleótidos únicos (veja-se, e.g., Cormack, B. e Castano, I. (2002) Introduction of Point Mutations into Cloned Genes. Methods in Enzymology (350) 199-218). Em reacções separadas, a técnica foi utilizada para converter a diferença de um nucleótido no nucleótido similar do outro alelo. Por exemplo, MET10 de UCD932 possui uma adenina na posição 404 enquanto UCD950 possui uma citosina. Verificou-se que a alteração da citosina de UCD950 na posição 1985 para uma adenina é necessária e suficiente para a perda de produção de sulfureto no fundo de UCD950. (Tabela 11) A conversão da adenina no alelo de UCD932 na citosina de 950 eliminou a capacidade da proteína de UCD932 eliminar a produção de sulfureto (Tabela 11). Portanto, a alteração única da treonina na posição 662 para um resíduo de lisina resulta na criação de uma proteína MetlO modificada que conduz a reduzida libertação de sulfureto. 64

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Tabela 11 Produção de H2S por Diferentes Alelos de MET10 Alelo de MET10 Nucleótido em 1985 Estirpe de Fundo Produz H2S? UCD932 Adenina UCD522 Não UCD932 Adenina UCD932 Não UCD932 Adenina UCD940 Não UCD932 Adenina UCD950 Não UCD950 Citosina UCD522 Sim UCD950 Citosina UCD932 Não* UCD950 Citosina UCD940 Sim UCD950 Citosina UCD950 Sim UCD932 1985 A-C Citosina UCD522 Sim UCD932 1985 A-C Citosina UCD932 Não* UCD932 1985 A-C Citosina UCD940 Sim UCD932 1985 A-C Citosina UCD950 Sim UCD950 1985 C-A Adenina UCD522 Não UCD950 1985 C-A Adenina UCD932 Não UCD950 1985 C-A Adenina UCD940 Não UCD950 1985 C-A Adenina UCD950 Não * A estirpe de fundo 932 possui outros determinantes de produção de H2S e não produz H2S sob nenhumas das condições testadas.

Exemplo 4: Diferenças alélicas na posição 1985 do gene MET10 determinam a produção de sulfureto de hidrogénio por Saccharomyces cerevisiae 0 alelo de MET10 da estirpe UCD932 conduz à incapacidade para produzir sulfureto de hidrogénio (H2S) quando utilizado numa estratégia de substituição de alelos para substituir o alelo nativo em isolados comerciais e nativos de levedura de vinho. Verificou-se que este alelo contém alterações de vários pares de bases que conduzem a diferenças na sequência de aminoácidos da proteína codificada. Estas alterações de aminoácidos foram avaliadas para determinar qual/quais tem/têm impacto na capacidade para produzir H2S. 65

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Para identificar a mutação ou combinação de mutações exactas responsáveis por estas diferenças drásticas na produção de H2S, clonámos os alelos de MET10 de UCD932 e UCD950 e sistematicamente convertemos cada diferença de base individual na base do alelo oposto utilizando Mutagénese Dirigida ao Local. Os alelos resultantes eram idênticos ao alelo progenitor com a excepção da única base trocada. Os alelos modificados foram então inseridos de novo em ambas as estirpes e utilizou-se ágar BiGGY como indicador de uma alteração na redução de sulfito e provavelmente na produção de H2S. Foi identificada uma alteração de base única na posição 1985 por este rastreio como a mutação responsável pela alteração na cor da colónia. Estas estirpes foram examinadas quanto à produção de H2S em duplicado durante fermentações em pequena escala em sumo de vinho sintético. Inocularam-se 10 mL de meio de vinho sintético com as estirpes respectivas e detectou-se o H2S utilizando colunas de acetato de chumbo após quatro dias de fermentação. O alelo de MET10 inalterado de UCD950 e o alelo de UCD932 com a mutação para o alelo de UCD950 na posição 1985 (932 MET10 1985 A-C) resultaram em produção de H2S enquanto o alelo de MET10 inalterado de UCD932 e o alelo de UCD950 com a alteração para UCD932 na posição 1985 (950 MET10 1985C-A) resultaram em ausência de produção detectável de H2S. Estes resultados indicam que a alteração de uma única base na posição 1985 é uma determinante chave da diferença na produção de H2S destes alelos. Estes resultados foram então reforçados pelo exame da produção de H2S quando os alelos mutantes simples foram colocados em duas estirpes altamente produtoras de H2S comerciais, UCD522 e UCD940. Ambas estas estirpes produziram H2S com o alelo 932 MET10 1985A-C mas não foi detectado H2S com o alelo 950 MET10 1985C-A. Os resultados estão resumidos na Tabela 11, acima.

Este estudo demonstra que uma alteração de uma única base na posição 1985 no alelo de MET10 dita a produção de sulfureto de hidrogénio. A diferença do nucleótido em 1985 altera o aminoácido codificado, portanto qualquer alteração na sequência de nucleótidos circundante que altere o aminoácido codificado irá provavelmente eliminar também a produção de H2S. A treonina presente nos alelos altamente produtores pode actuar como ponto regulador que altera o fluxo da via pois os resíduos de aminoácido contendo um grupo fosfato podem ser

ΕΡ 2 132 318/PT 6 6 regulados através de fosforilação. Prevê-se que o resíduo de aminoácido 662 esteja dentro do domínio catalítico de sulfito-redutase (Figura 6). A análise da estrutura putativa da proteína com esta alteração (Figura 7) indica que a estrutura global da proteína está inalterada, mas a área local do local activo que circunda esta alteração de resíduo é afectada. Assim, esta alteração modifica a estrutura da proteína apenas ligeiramente.

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<130> 023070-177920PC <140> WO ainda não atribuído <141> Ainda não atribuído <150> US 60/918,616 <151> 2007-03-16 <150> US 60/959,366 <151> 2007-07-12 <160> 93 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, ΜΕT10), alelo da estirpe UCD932 70 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ <400> 1 atgccagttg aaatatggta tttgcttaca gaaaagcgtg ggcgctggtt gctccagggt aagtttcttt gattatgtaa tccgctaacg aactccggag gtcgaatctg gctgcctttg ttccaatact tccgaattgt agagtaccat caaattgttg gtttcagccg caaecagatt gaattcactt aagagtatca aaatttgtgt caatttgtga gtcgttgaag ggttcaattg agttacgtca atcaaattgt atccaagccç atctggaaaa actggtgcat gaaataaaca aatgaaacat tctgagatct aaactaagac gttaagcctg ggaatgactt gtcaaagaat aaggacaacc gatattttcg gaagaggaga agatttcaag cgcccatctc attgcctcct tgggtggata gctgtcggtt ccaaagcaac gttgaagaga ctaggttcaa gatgcaggta tacattcaag aaaggttcat caagacattc attgaagaat agtttgctac cacccgtaac agtccttttc gtaacgaatc tggctccttt tttcactgcc tgaatgttgg ccgcattgga aggtacaaag ctatcaattt ttcctgaggc atgatgtctt ttggtgctca tcaactctgc taccttttaa ttataggcca ccttatttta tcatttggtc acaatgccga atattgatgt ctttgagaac cctcgaaaga atgtcagttt cgttggtttc agaatttggg ttatcatcga ttttctggaa gcattgattc tcaaaaactt ttgaaaagaa ctttcctccc ctgatattgc ccgatttacc ctgattatga atgacatcgg tcttaacctt accatttgtt gtaaaccacc agaaaaaatt atgtggagta ttgaggaact ctcagaaagt ataaaggaag cagaattggt cagttattat aattatggca gacacaaaag ttatcacaca atcgtatcaa tttacttgtg tggctaaaga taaaggaagc caatcctttt tgccatttca tcaacccgat acgtgggaag agggttttct atacttcatt tgctttaaac tgctgcttcc tgtcgcctta atttgacgga atctattttg ggataagttt ggatgctgaa gattagtggt cgttgctaag aactttggat ccacggccgc cccaaaagct ttcatctttc tgcctccaaa gaaatttgat acagatacct attgaagcat ceaaaaggca aattcctgaa tggtgagacc attggccttc aggtgcagac cctcagtgag agaggatgag aaataacagt caaçaagttg cgtcaagaac tagatatatt tgaagccctc ctatggtcta agaaacaaga aaaaagattt agaggatttg ttatacatat tgttactatc tcatccaaat aaaaaggtac cgttagcgtt gagtggttta aaagcagcaa agaagaatat catcggcgct agagaatttg tggccctact cgccgaggaa atcaagatac ggcgaggcca tctgtgctgt ttgttacacc ccatttttcc catggattga aactctttga tacgacaatg aagotgaagt ctgacattgg ttaaactact gcaaaactat aatgaattga actgtgttta aataattcca tttgtcactc ggttcttcgc acctcaatta gtcaaatcaa ggcgaaggat cttgtgaaag aacttggcta gtttcaaaca ttagacgtag gttaaagatt tcattcctaa actaacgacg ggtctagatg atttcagcag gttccgctag gaagagcctg accattgaag tccttcaaag ttcgtcgtga ttccatattg ggtattcatg aatgaatccg accgtcttac tacgaatcat gttactcctg gctgacattt attgaaccat çaagttcatt ggtcaagctt aaaccatctg ggtactggtt ggttatgaga ttatatggtg gctttctcaa gatgaattaa tggccagttc agaggcatca attttagaag aaaatgcaac tcaataacgt aagatctaaa aagagctgga agaacactac aaaccgtctc ctaacggctc atggtgtcgt cgattgccac cgaaaaccgt ccaaagttat ctggattgag tcacttatgg aaatcgggtt acgttccatc cttctttctt gcgtttctga ttgtatcgtc tcatttattg ctctgtcttt atgctggtac tcgattctac ctgctaccgt tggatttaaa tatctattgc agtccaaatt tcgcagaatg cctcgatttc cgctgtacac cagctttacc aaataccatt aggcatatga aagttaaaga aattcgatat ccagaaacaa atgttgtctt aagcatttgt tgattccata ccggtgcagt ttgaattgtt tgaagagaag tattgatcgt ctaagtatat ttatgaaatt tggcaccatt ttggtgaagt agttatggga gagaccaacc aaactgcaat cagatattac aagtcgactt tctactaa ttcactgcca ggactccatt aaaatggtct tatcagatct agcaattgtt tcatgatggt tgtcaccaac gactccgatt tttcagtaat cttgccgttg tgcaccagat actacataat gtctttagaa aatcaacgtc cactaccaaa gagatctcaa gtacatctat attcatccct ggcctctgat ggaagatggg cttccaagct gaaattatca cgcagaacaa ttctgtagaa gaagaaaaac gtccttgttt taccaaccgt tgaatttctc taaattttct aattttcgtt acctgagacc agttgagaat aaatagacgt ttctggtact tgaatctttg agtccccaac ggaaaatttg tgcctctaac agatttgaag cccatctgtt agaatactca tgttgttgat ctcagacctt accaccatct caaggccatt cttcctatat ggcttacaaa tcaaaaaatt gattgataat tcaagctttg ggatgccgca 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3108

<210> 2 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa da sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD950 71 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ <400> 2 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctggcattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaagga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc attaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggataag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataceatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108

<210> 3 <211> 1035 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência de consenso da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva para sulfureto (Met 10, MET10) 72

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr ou Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala ou Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr ou Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu ou Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662) <223> Xaa = Ala , Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr, não Thr

Met, <400> 3

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Vai Thr Ala Ile Ser Ser Vai 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Vai Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala ile Vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Vai Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Vai Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Vai Thr Asn Asp Tyr Vai Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Vai Vai Thr Pro Ile 145 150 155 160 73

ΕΡ 2 132 318/PT

Ser Ala Asn Glu Val Gin Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr HÍS Val Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Vai Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Val Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu AI a Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Val Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro Val Ser 420 425 430 Asn ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Val Ala Ala Thr Val Ala Glu Gin Gly Ser lie Ala 450 455 460 Leu Vai Ser Gin Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Val Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu ile Ser Ile 485 4 90 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 74 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile -Asp Ser Gly Ala Asp 550 Ile Ser Ala Ala Ser ne Ser Glu Phe Leu 54;S 553 SSÓ Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu val Pro Leu AI a Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro ile· Phe Vàl Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr íle Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu ile Ser 610 615 620 Asp íle Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Val xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 íle Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser ASp val val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 val Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 7 65 ASp Leu val Thr Pro Ala Gly Ala Val ASp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Val Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe ΡΓΟ Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu val Thr Ile He Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Val Val Ser Val Lys Pro Ser Val Met Ly3 Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 75 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Pro Lys Gin Pro Val ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 92 0 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 94 0 ile Thr HiS Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035 <210> 4 <211> 1035

<212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva para sulfureto modificada (Met 10, MET10) baseada na sequência da estirpe UCD932 <2 2 0 > <2 21 > <222> <223> MOD_RES (662)

Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr, não Thr <400> 4

Met 1 Pro Val Glu Phe 5 Ala Thr Asn Pro Phe 10 Gly Glu Ala Ly s Asn 15 Ala Thr Ser Leu Pro 20 Lys Tyr Gly Thr Pro 25 Val Thr Ala Ile Ser 30 Ser Val Leu Phe Asn 35 Asn val Asp Ser Ile 40 Phe Ala Tyr Lys Ser 45 Phe Ser Gin Pro Asp 50 Leu Leu His Gin Asp 55 Leu Lys Lys Trp Ser 60 Glu Lys Arg Gly 76 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala ile val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser HiS Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Asn Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu val Gin Ser Val Ala Leu Leu Thr Leu Ala iie Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 iie Leu Ala Lys Leu Ser Lys val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Val Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His val Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser ile Ser val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala val Lys 340 345 350 Ser Ile val Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser ile Asn 370 375 380 Ile Asp Val Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Val Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Val Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro Val Ser 420 425 430 77 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

As η Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys HÍS Leu Asp Vai Ala Ala Thr Val Ala Glu Gin Gly Ser Ile Ala 450 455 460 Leu Vai Ser Gin Lys Ala vai Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Thr Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Vai Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 lie Asp Ser Gly Ala ASp iie Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Glu Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro ile Phe val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 535 640 Lys Leu Arg P ro Asp Leu Pro vai Lys Asn Phe Val Val Lys val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Vai Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe HiS 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 Vai Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 78 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Asp Leu Vai Thr Pro Ala Gly Ala Val Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Val Thr Ile ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Vai val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Val Lys PrO Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Vai ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 97 0 975 Met Ile ASp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cy s Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035

<210> 5 <211> 1035 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> de para <223> Descrição de Sequência Artificial: subunidade alfa sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva sulfureto (Met 10, MET10) <2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr ou Asn 79

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala ou Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr ou Ile <2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu ou Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662)

Met, <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr, não Thr nem Ser <400> 5

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Vai Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Vai Asp Ser ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Vai Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Vai Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Vai Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Vai Gin Ser Vai Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 no ns 80 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn vai 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His Val Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val Val 290 2 95 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Vai Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Vai Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr phe Gin Ala Gin Phe val Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro Val Ser 420 425 430 Asn ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Val Ala Ala Thr val Ala Glu Gin Gly Ser ile Ala 450 455 4 60 Leu Vai Ser Gin Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser val Glu 465 47Q 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser iie 485 490 495 81

ΕΡ 2 132 318/PT

Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Vai Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Vai Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 He Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Vai Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro ile Phe vai Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Vai Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Vai Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Vai Val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 Vai Glu Asn Leu Asp ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 Asp Leu Vai Thr Pro Ala Gly Ala vai Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Vai Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 82

ΕΡ 2 132 318/PT

Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu ile Vai val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai vai Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Vai Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 92 0 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Vai Pro Asp lie Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035

<210> 6 <211> 1035 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> de para <223> Descrição de Sequência Artificial: subunidade alfa sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva sulfureto (Met 10, MET10) <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr ou Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala ou Thr ΕΡ 2 132 318/ΡΤ 83 <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr ou Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu ou Lys <2 2 0 > <221> MOD_RES <222> (662) <223> Xaa = Lys, Arg, His, Gin ou Asn <400> 6

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn val Asp Ser ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 55 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Vai Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly vai val Thr Pro ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu vai Gin Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 84 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr His Val Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile vai Ser Ser Phe ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 3 60 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ue Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 He Asp Vai Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Val Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Val Ala Ala Thr Val Ala Glu Gin Gly Ser He Ala 450 455 460 Leu vai Ser Gin Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr val Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Sor 530 535 540 ile ASp Ser Gly Ala Asp ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 85 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn lie Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Vai Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp ile Ala LyS Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu vai Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Vai Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Vai Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr vai Leu Gin Ala Phe 725 730 735 Vai Glu Asn Leu Asp ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu lie Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 7 60 7 65 Asp Leu Vai Thr Pro Ala Gly Ala Vai Asp Leu T.we —j -1 Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Vai Thr ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Vai Vai Vai Asp Trp vai ASp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Vai Lys Pro Ser Vai Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 86 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Pro Lys Gin Pro Vai lie Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 97 0 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Vai Asp Leu Asp Ala Ala ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Vai Tyr 1025 1030 1035

<210 > 7 <211> 1035 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> de para <223> Descrição de Sequência Artificial: subunidade alfa sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva sulfureto (Met 10, MET10) <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr ou Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala ou Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr ou Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu ou Lys 87

ΕΡ 2 132 318/PT <400> 7

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro val Thr Ala ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Vai Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Vai Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Vai Gin Ser Vai Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Vai Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Val Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Val Arg val Pro Leu Pro Phe Asn val 275 280 285 Ala Lys Phe Vai Thr His Vai Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 88

ΕΡ 2 132 318/PT

Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Vai Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala vai Lys 340 345 350 Ser Ile Vai Ser Ser Phe He Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Aia Ser Asp Lys Ser lie Asn 370 375 380 ile Asp Vai Ala Ser Lys Leu Vai Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Vai Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro Vai Ser 420 425 430 Asn ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Vai Vai Glu Asp vai Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Vai Ala Ala Thr Vai Ala Glu Gin Gly Ser Ile Ala 450 455 4 60 Leu Vai Ser Gin Lys Ala Vai Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Vai Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 4 95 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Lys Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe ile Gin Ala Vai Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Vai Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Vai Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Vai Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu ile Ser 610 615 620 Asp ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Vai Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe Vai Vai Lys Val Lys 645 650 655

Glu Asn Arg Arg Vai Lys Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 89

ΕΡ 2 132 318/PT

Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp He Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile Hi S Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp vai Vai Leu val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 Vai Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 Asp Leu vai Thr Pro Ala Gly Ala Vai Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Vai Thr lie Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys Vai His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Vai Vai Vai Asp Trp Vai Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Vai Lys Pro Ser Vai Met Lys Leu Pro Pro Ser 8 65 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Vai Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu ile Gly Glu Vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly lie 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys GlU Asn Leu A3P Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Vai Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Vai Tyr 1025 1030 1035 <210 > 8 90 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

<211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, METI0), alelo da estirpe S288c <400> 8 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtcctttte tcaacccgat ttgctacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctggcattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtgccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcageeg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaaaga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc actaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg fctttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggatgag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtçgata ataaaggaag aaaaaggtac çgtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 91

ΕΡ 2 132 318/PT

<210> 9 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, METI0), alelo da estirpe UCD522 <400> 9 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctgacattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaarga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc aytaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggatgag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag agçcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 92

ΕΡ 2 132 318/PT

<210> 10 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, METI0), alelo da estirpe UCD934 <400> 10 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctggcattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ceaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaagga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc attaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctçgaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtçcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggataag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattçaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttaoc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 93

ΕΡ 2 132 318/PT

<210> 11 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD938 <400> 11 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaacggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 430 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctgacattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaaaga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggctttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc actaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agagçatgag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 94 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

<210> 12 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD939 <400> 12 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatçgta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatgçtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctçgtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgoctta ctgrcattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattaçtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgCtg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaaaga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc actaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggatcag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttaçaag tctactaa 3108 95

ΕΡ 2 132 318/PT

<210> 13 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD940 <400> 13 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aaçatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctamcggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atçgtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctgacattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgy cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga octcgaaaga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc actaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggatgag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc eaagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 96

ΕΡ 2 132 318/PT

<210> 14 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD942 <400> 14 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaacggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctgacattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaaaga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggctttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc actaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggatgag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaaetaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctect ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 97

ΕΡ 2 132 318/PT

<210> 15 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevísíae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD956 <400> 15 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaaç tgtcgcctta ctgacattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt Ccaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctcoaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaaaga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaagatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc actaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ttttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggatgag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtçgagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcatcatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000 caagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 98 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

<210> 16 <211> 3108 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD957 <400> 16 atgccagttg agtttgctac caatcctttt ggcgaggcca aaaatgcaac ttcactgcca 60 aaatatggta cacccgtaac tgccatttca tctgtgctgt tcaataacgt ggactccatt 120 tttgcttaca agtccttttc tcaacccgat ttgttacacc aagatctaaa aaaatggtct 180 gaaaagcgtg gtaacgaatc acgtgggaag ccatttttcc aagagctgga tatcagatct 240 ggcgctggtt tggctccttt agggttttct catggattga agaacactac agcaattgtt 300 gctccagggt tttcgctgcc atacttcatt aactctttga aaaccgtctc tcatgatggt 360 aagtttcttt tgaatgttgg tgctttaaac tacgacaatg ctaccggctc tgtcaccaac 420 gattatgtaa ccgcattgga tgctgcttcc aagctgaagt atggtgtcgt gactccgatt 480 tccgctaacg aggtacaaag tgtcgcctta ctggcattgg cgattgccac tttcagtaat 540 aactccggag ctatcaattt atttgacgga ttaaactact cgaaaaccgt cttgccgttg 600 gtcgaatctg ttcctgaggc atctattttg gcaaaactat ccaaagttat tgcaccagat 660 gctgcctttg atgatgtctt ggataagttt aatgaattga ctggattgag actacataat 720 ttccaatact ttggtgctca ggatgctgaa actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa 780 tccgaattgt tcaactctgc gattagtggt aataattcca aaatcgggtt aatcaacgtc 840 agagtaccat taccttttaa cgttgctaag tttgtcactc acgttccatc cactaccaaa 900 caaattgttg ttataggcca aactttggat ggttcttcgc cttctttctt gagatctcaa 960 gtttcagccg ccttatttta ccacggccgc acctcaatta gcgtttctga gtacatctat 1020 caaccagatt tcatttggtc cccaaaagct gtcaaatcaa ttgtatcgtc attcatccct 1080 gaattcactt acaatgccga ttcatctttc ggcgaaggat tcatttattg ggcctctgat 1140 aagagtatca atattgatgt tgcctccaaa cttgtgaaag ctctgtcttt ggaagatggg 1200 aaatttgtgt ctttgagaac gaaatttgat aacttggcta atgctggtac cttccaagct 1260 caatttgtga cctcgaagga acagatacct gtttcaaaca tcgattctac gaaattatca 1320 gtcgttgaag atgtcagttt attgaagcat ttagacgtag ctgctaccgt cgcagaacaa 1380 ggttcaattg cgttggtttc ccaaaaggca gttaaaçatt tggatttaaa ttctgtagaa 1440 agttacgtca agaatttggg aattcctgaa tcattcctaa tatctattgc gaagaaaaac 1500 atcaaattgt ttatcatcga tggtgagacc attaacgacg agtccaaatt gtccttgttt 1560 atccaagccg ctttctggaa attggccttc ggtctagatg tcgcagaatg taccaaccgt 1620 atctggaaaa gcattgattc aggtgcagac atttcagcag cctcgatttc tgaatttctc 1680 actggtgcat tcaaaaactt cctcagtgag gttccgctag cgctgtacac taaattttct 1740 gaaataaaca ttgaaaagaa agaggataag gaagagcctg cagctttacc aattttcgtt 1800 aatgaaacat ctttcctccc aaataacagt accattgaag aaataccatt acctgagacc 1860 tctgagatct ctgatattgc caagaagttg tccttcaaag aggcatatga agttgagaat 1920 aaactaagac ccgatttacc cgtcaagaac ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt 1980 gttacgcctg ctgattatga tagatatatt ttccatattg aattcgatat ttctggtact 2040 ggaatgactt atgacatcgg tgaagccctc ggtattcatg ccagaaacaa tgaatctttg 2100 gtcaaagaat tcttaacctt ctatggtcta aatgaatccg atgttgtctt agtccccaac 2160 aaggacaacc accatttgtt agaaacaaga accgtcttac aagcatttgt ggaaaatttg 2220 gatattttcg gtaaaccacc aaaaagattt tacgaatcat tgattccata tgcctctaac 2280 gaagaggaga agaaaaaatt agaggatttg gttactcctg ccggtgcagt agatttgaag 2340 agatttcaag atgtggagta ttatacatat gctgacattt ttgaattgtt cccatctgtt 2400 cgcccatctc ttgaggaact tgttactatc attgaaccat tgaagagaag agaatactca 2460 attgcctcct ctcagaaagt tcatccaaat gaagttcatt tattgatcgt tgttgttgat 2520 tgggtggata ataaaggaag aaaaaggtac ggtcaagctt ctaagtatat ctcagacctt 2580 gctgtcggtt cagaattggt cgttagcgtt aaaccatctg ttatgaaatt accaccatct 2640 ccaaagcaac cagttattat gagtggttta ggtactggtt tggcaccatt caaggccatt 2700 gttgaagaga aattatggca aaagcagcaa ggttatgaga ttggtgaagt cttcctatat 2760 ctaggttcaa gacacaaaag agaagaatat ttatatggtg agttatggga ggcttacaaa 2820 gatgcaggta ttatcacaca catcggcgct gctttctcaa gagaccaacc tcaaaaaatt 2880 tacattcaag atcgtatcaa agagaatttg gatgaattaa aaactgcaat gattgataat 2940 aaaggttcat tttacttgtg tggccctact tggccagttc cagatattac tcaagctttg 3000

Gaagacattc tggctaaaga cgccgaggaa agaggcatca aagtcgactt ggatgccgca 3060 attgaagaat taaaggaagc atcaagatac attttagaag tctactaa 3108 99 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

<210> 17 <211> 1035 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe S288c <400> 17

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Vai Thr Ala Ile Ser Ser Vai 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Vai Asp Ser lie Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr vai Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn vai Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Thr Gly Ser Vai Thr Asn Asp Tyr Vai Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Vai Vai Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu vai Gin Ser vai Ala Leu Leu Ala Leu Ala ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala lie Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Vai Leu Pro Leu Vai Glu Ser vai Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Vai Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Vai Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 100 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Vai Arg Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Vai Thr His Vai Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro LyS Ala val Lys 340 345 350 Ser Ile Vai Ser Ser Phe ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Vai Ala Ser Lys Leu Vai Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Vai Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro Val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser val val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Vai Ala Ala Thr Vai Ala Glu Gin Gly Ser Ile Ala 450 455 4 60 Leu Vai Ser Gin Lys Ala Vai Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 4 65 470 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Thr Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp vai Ala Glu Cys Thr Asn Arg lie Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 5 65 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Glu Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Vai Asn Glu Thr Ser Phe Leu Prc Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 101

ΕΡ 2 132 318/PT

Asp ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu vai Glu Asn 625 630 635 64 0 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe Vai Vai Lys Vai Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Vai Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 67 0 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Vai Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Vai Vai Leu Vai Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Vai Leu Gin Ala Phe 725 730 7 35 Vai Glu Asn Leu Asp ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 Asp Leu Vai Thr Pro Ala Gly Ala Vai Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Vai 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Vai Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser lie Ala Ser Ser Gin Lys Vai His Pro Asn Glu Vai 820 825 830 His Leu Leu Ile Vai Vai Vai Asp Trp Vai Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Vai Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Vai Lys Pro Ser Vai Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Vai Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys ile 945 950 955 960 Tyr ile Gin ASp Arg ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 102 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Met Ile Asp Asn 980 Lys Gly Ser Phe Tyr 985 Leu Cys Gly Pro Thr 990 Trp Pro Vai Pro ASp 995 Ile Thr Gin Ala 1 Leu 000 Gin Asp Ile Leu Ala 1005 Lys Asp Ala Glu Glu 1010 Arg Gly ile Lys vai 1015 Asp Leu Asp Ala Ala 1020 ile Glu Glu Leu Lys Glu Ala Ser Arg Tyr lie Leu Glu Vai Tyr 1025 1030 1035

<210> 18 <211> 1035 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, ME TIO), alelo da estirpe UCD932 <400> 18

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro vai Thr Ala Ile Ser Ser val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Vai Asp Ser ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly LyS Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Vai Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Asn Gly Ser vai Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Vai Gin Ser Vai Ala Leu Leu Thr Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr vai Leu Pro Leu val Glu ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Vai Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 103

ΕΡ 2 132 318/PT

As p Vai Leu Asp Lys Phe ASn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Glrs Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr vai Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys Ile Gly Leu Ile Asn Vai Arg Vai Pro Leu Pro Phe Asn Vai 275 280 285 Ala Lys Phe Vai Thr His Vai Pro Ser Thr Thr Lys Gin ile Vai Vai 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser ile Ser Vai Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Vai Lys 340 345 350 Ser Ile Vai Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser ile Asn 370 375 380 Ile Asp Vai Ala Ser Lys Leu Vai Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe vai Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro vai Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Vai Vai Glu Asp Vai Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu ASp Vai Ala Ala Thr vai Ala Glu Gin Gly Ser Ile Ala 450 455 4 60 Leu Vai Ser Gin Lys Ala Vai Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Vai Glu 4 65 470 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile LyS Leu Phe lie Ile Asp Gly Glu Thr Thr Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Vai Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp vai Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile ASp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu vai Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 104

ΕΡ 2 132 318/PT

Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys : Lya Glu Asp Glu Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val val Lys vai Lya 645 550 655 Glu Asn Arg Arg val Lys Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp ile Gly Glu S75 680 635 Ala Leu Gly Ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Val Leu val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 Vai Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 7 65 Asp Leu Vai Thr Pro Ala Gly Ala Val Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 7 90 7 95 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Val Thr ile ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys vai His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu lie Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 105

ΕΡ 2 132 318/PT

Glu Ile Gly Glu Vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 92 5 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly ile 930 935 940 Ile Thr His ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Vai Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr ile Leu Glu Vai Tyr 1025 1030 1035

<210 > 19 <211> 1035 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevísiae <220> <223> subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD950 <400> 19

Met Pro Vai Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn val Asp Ser iie Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile vai Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr val Ser HiS Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Thr Gly Ser vai Thr Asn Asp Tyr val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lya Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 150 106

ΕΡ 2 132 318/PT S6r Ala Asn Glu Vai Gin Ser Vai Ala Leu Leu Ala Leu Ala lie Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Vai Leu Pro Leu Vai Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Vai Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp Vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Giy Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys ile Gly Leu Ile Asn Vai Arg Vai Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Vai Thr His Vai Pro Ser Thr Thr Lys Gin Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr HiS Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Ehe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile vai Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser lie Asn 370 375 380 Ile Asp Vai Ala Ser Lys Leu Vai Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Vai Thr Ser Lys Glu Gin ile Pro val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Vai Val Glu Asp val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys HÍS Leu Asp Vai Ala Ala Thr Vai Ala Glu Gin Gly Ser ile Ala 450 455 4 60 107 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Leu vai Ser Gin Lys Ala Vai Lys ASp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly Ile Pro Glu Ser Phe Leu Ile Ser Ile 485 4 90 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Ile Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Val Phe Irp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp vai Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Sêr Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Lys Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Vai Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Vai Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp Ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His HiS Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 vai Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu Ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 Asp Leu Vai Thr PrO Ala Gly Ala Vai Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 108 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Val Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala Val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu val Val Ser Val Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Val Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Val Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Val Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Val Pro Asp ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Val Asp Leu Asp Ala Ala Ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Val Tyr 1025 1030 1035 <210> 20 <211> 50

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência de ADN que circunda o resíduo 662 da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, METI 0), alelos das estirpes S288c e UCD950 <400> 20 ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt gttacgcctg ctgattatga 50 109

ΕΡ 2 132 318/PT <210> 21 <211> 50

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência de ADN que circunda o resíduo 662 da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, ΜΕ TIO), alelo da estirpe UCD932 <400> 21 ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt gttaagcctg ctgattatga 50 <210> 22 <211> 27

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência de ADN que circunda o resíduo 662 da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelos das estirpes S288c e UCD950 <400> 22 aatagacgtg ttacgcctgc tgattat 27 <210> 23 <211> 27

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência de ADN que circunda o resíduo 662 da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelo da estirpe UCD932 <400> 23 aatagacgtg ttaagcctgc tgattat 27

<210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência de aminoácidos que circunda o resíduo 662 da subunidade alfa de sulfito- 110 ΕΡ 2 132 318/PT redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10), alelos das estirpes S288c, UCD932 e UCD950 <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa = Thr ou Lys <400> 24

Asn Arg Arg Vai Xaa Pro Ala Asp Tyr 1 5

<210> 25 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subsequência da região catalítica da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10) de Saccharomyces cerevisiae estirpe UCD932 <400> 25

Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn Lys leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro vai Lys Asn Phe val vai Lys val Lys Glu Asn Arg 20 25 30 Arg Vai Lys Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45

Asp ile 50 <210> 26 <211> 50

<212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subsequência da região catalítica da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, ΜΕT10) de Saccharomyces cerevisiae estirpe S288c <400> 26

Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Vai Glu Asn Lys Leu Arg 15 10 15

Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe Vai Vai Lys Vai Lys Glu Asn Arg 20 25 30

Arg Vai Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45

Asp Ile 50 111 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

<210> 27 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subsequência da região catalítica da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10) de Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis) <400> 27

Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Gly Vai Glu Asn Lys Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asa Phe vai Vai Lys Vai Lys Glu Asn Arg 20 25 30 Arg Vai Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr lie Phe His Ile Glu Phe 35 40 45

Asp lie 50

<210> 28 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subsequência da região catalítica da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10) de Kluyveromyces lactis <400> 28

Lys 1 Lys Leu Thr Phe 5 Gin GlU Ala Tyr Gly 10 Vai Ser Gin Gin Leu 15 Arg Pro Asp Leu Pro 20 Vai Asn Asn Tyr Vai 25 Vai Lys Vai Lys Glu 30 Asn Arg Arg Vai Thr 35 Pro Asp Asp Tyr Asp 40 Arg Tyr Ile Phe His 45 ile Glu Phe

Asp lie 50

<210> 29 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subsequência da região catalítica da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10) de Yarowwia lipolytica 112

ΕΡ 2 132 318/PT <400> 29

Lys Arg Vai Vai Phe Lys Glu Ala Tyr Gly Thr Glu Asn Ser Leu Arg 15 10 15

Pro Asp Ile Ser Thr Lys Asn Phe Vai Vai Lys Vai Gin Glu Lys Arg 20 25 30

Arg Vai Thr Pro Glu Asn Tyr Asp Arg Asn Ile Phe His Vai Glu Phe 35 40 45

Asp Ile 50

<210> 30 <211> 50 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subsequência da região catalítica da subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura (Met 10, MET10) de Schizosaccharomyces pombe <400> 30

Lys Gin Ile Ile Phe Pro Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Asp Ala Leu Arg 1 5 10 15 Pro Asp Vai Ser Glu Lys Vai Phe Thr Vai His Vai Arg Ala Asn Lys 20 25 30 Arg Leu Thr Pro Ala Glu Tyr Asn Arg Asn Ile Phe His Ile Glu Phe 35 40 45

Asp Leu 50

<210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: motivo conservado de levedura na região catalítica de sulfito-redutase activa para sulfito <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Xaa = Asn ou Lys <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Xaa = Arg ou Lys

113 ΕΡ 2 132 318/PT <2 2 0 > <2 21 > MOD_RES <222> (4) <223> Xaa = Vai ou Leu <220> <2 21 > MOD_RES <222> (7) <223> Xaa = Ala, Asp ou Glu <2 2 0 > <2 21 > MOD_RES <222> (8) <223> Xaa = Asp, Asn ou Glu <2 2 0 > <2 21 > MOD_RES <222> (12) <223> Xaa = Tyr ou Asn <2 2 0 > <221> M0D_RES <222> (16) <223> Xaa = Ile ou Vai <2 2 0 > <2 21 > MOD_RES <222> (20) <223> Xaa = Ile ou Leu <400> 31 Xaa Xaa l Arg Xaa Thr Pro Xaa Xaa Tyr Asx Arg Xaa Ile Phe His Xaa 15 10 15

Glu Phe Asp Xaa 20 <210 > 32 <211> 20 <212> PRT Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Arti <2 2 0 > <223> Descrição de levedura na para sulfito <2 2 0 > <2 21 > MOD_RES <222> (D <223> Xaa = Asn ou L; <220> <2 21 > MOD_RES <222> (2)

Sequência Artificial: motivo conservado eqião catalítica de sulfito-redutase inact de iva 114

ΕΡ 2 132 318/PT <223> Xaa = Arg ou Lys <2 2 0 > <2 21 > MOD_ _RES <222> (4) <223> Xaa = Vai ou Leu <220> <2 21 > MOD_ _RES <222> (5) <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr, <220> <2 21 > MOD_ _RES <222> (7) <223> Xaa = Ala, Asp ou Glu <2 2 0 > <2 21 > MOD_ _RES <222> (8) <223> Xaa = Asp, Asn ou Glu <2 2 0 > <2 21 > MOD_ _RES <222> (12) <223> Xaa = Tyr ou Asn <2 2 0 > <221> MOD_ _RES <222> (16) <223> Xaa = Ile ou Vai <2 2 0 > <2 21 > MOD_ _RES <222> (20) <223> Xaa = Ile ou Leu <400> 32 Xaa Xaa i Arg Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Asx Arg Xaa Ile 1 5 10 Glu Phe Asp Xaa 20

Met, 15 <210> 33 <211> 1035 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223>

Descrição de Sequência Artificial: subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva para sulfureto (Met 10, MET10) 115 ΕΡ 2 132 318/PT <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr ou Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala ou Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr ou Ile <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu ou Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662)

Met, <223> Xaa = Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai ou Trp, não Thr, Ser ou Tyr <4 00> 33

Met Pro val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser Val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Val Gin Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala ile Ala 165 170 175 116

ΕΡ 2 132 318/PT

Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala Ile Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Vai Leu Pro Leu Vai Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 Ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys Vai Ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp vai Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 Ser Lys ile Gly Leu Ile Asn Vai Arg val P ro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Vai Thr His Vai Pro Ser Thr Thr Lys Gin ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 Vai Ser Ala Ala Leu Phe Tyr His Gly Arg Thr Ser Ile Ser Val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Vai Ser Ser Phe Ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly Glu Gly Phe ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser Ile Asn 370 375 380 Ile Asp Vai Ala Ser Lys Leu Vai Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe Vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Vai Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro val Ser 420 425 430 Asn ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Vai Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys His Leu Asp Vai Ala Ala Thr Vai Ala Glu Gin Gly Ser Ile Ala 450 455 460 Leu Vai Ser Gin Lys Ala Vai Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser Val Glu 465 470 475 480 Ser Tyr Vai Lys Asn Leu Gly lie Pro Glu Ser Phe Leu ile Ser Ile 485 490 495 117 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala Val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser GlU Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Ile Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr ne G1U Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu Ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu Val Glu Asn 625 630 635 640 Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Val Lys Asn Phe Val Val Lys Val Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg Val Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe Asp ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp val Val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr Val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 val Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 765 Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Ala Val Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Val Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp Ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu val Thr Ile Ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Val Val Val Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 118

ΕΡ 2 132 318/PT

Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr Ile Ser Asp Leu Ala vai Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Vai Lys Pro Ser Vai Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Vai Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu Ile Gly Glu Vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 94 0 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys ile 945 950 955 960 Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 9S5 970 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp Ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Vai Asp Leu Asp Ala Ala ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Vai Tyr 1025 1030 1035

<210> 34 <211> 1035 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: subunidade alfa de sulfito-redutase assimilatória de levedura inactiva para sulfureto (Met 10, MET10) <220> <221> MOD_RES <222> (135) <223> Xaa = Thr ou Asn <220> <221> MOD_RES <222> (172) <223> Xaa = Ala ou Thr <220> <221> MOD_RES <222> (511) <223> Xaa = Thr ou Ile 119

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <221> MOD_RES <222> (590) <223> Xaa = Glu ou Lys <220> <221> MOD_RES <222> (662)

Asn, <223> Xaa = aminoácido grande ou volumoso, Lys, Arg, His, Gin, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp <400> 34

Met Pro Val Glu Phe Ala Thr Asn Pro Phe Gly Glu Ala Lys Asn Ala 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Lys Tyr Gly Thr Pro Val Thr Ala Ile Ser Ser val 20 25 30 Leu Phe Asn Asn Val Asp Ser Ile Phe Ala Tyr Lys Ser Phe Ser Gin 35 40 45 Pro Asp Leu Leu His Gin Asp Leu Lys Lys Trp Ser Glu Lys Arg Gly 50 55 60 Asn Glu Ser Arg Gly Lys Pro Phe Phe Gin Glu Leu Asp Ile Arg Ser 65 70 75 80 Gly Ala Gly Leu Ala Pro Leu Gly Phe Ser His Gly Leu Lys Asn Thr 85 90 95 Thr Ala Ile Val Ala Pro Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Phe Ile Asn Ser 100 105 110 Leu Lys Thr Val Ser His Asp Gly Lys Phe Leu Leu Asn Val Gly Ala 115 120 125 Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Xaa Gly Ser Val Thr Asn Asp Tyr Val Thr 130 135 140 Ala Leu Asp Ala Ala Ser Lys Leu Lys Tyr Gly Val Val Thr Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ala Asn Glu Val Gin Ser Val Ala Leu Leu Xaa Leu Ala Ile Ala 165 170 175 Thr Phe Ser Asn Asn Ser Gly Ala lie Asn Leu Phe Asp Gly Leu Asn 180 185 190 Tyr Ser Lys Thr Val Leu Pro Leu Val Glu Ser Val Pro Glu Ala Ser 195 200 205 ile Leu Ala Lys Leu Ser Lys val ile Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp 210 215 220 Asp val Leu Asp Lys Phe Asn Glu Leu Thr Gly Leu Arg Leu His Asn 225 230 235 240 Phe Gin Tyr Phe Gly Ala Gin Asp Ala Glu Thr Val Phe Ile Thr Tyr 245 250 255 Gly Ser Leu Glu Ser Glu Leu Phe Asn Ser Ala Ile Ser Gly Asn Asn 260 265 270 120 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Ser Lys Ile Gly Leu ile Asn Val Arg ' Val Pro Leu Pro Phe Asn Val 275 280 285 Ala Lys Phe Val Thr HiS val Pro Ser Thr ' rhr Lys Gin Ile Val Val 290 295 300 Ile Gly Gin Thr Leu Asp Gly Ser Ser Pro : Ser Phe Leu Arg Ser Gin 305 310 315 320 val Ser Ala Ala Leu Phe Tyr HlS Gly Arg Thr Ser ile Ser val Ser 325 330 335 Glu Tyr Ile Tyr Gin Pro Asp Phe Ile Trp Ser Pro Lys Ala Val Lys 340 345 350 Ser Ile Val Ser Ser Phe ile Pro Glu Phe Thr Tyr Asn Ala Asp Ser 355 360 365 Ser Phe Gly GlU Gly Phe Ile Tyr Trp Ala Ser Asp Lys Ser lie Asn 370 375 380 Ile Asp Val Ala Ser Lys Leu Val Lys Ala Leu Ser Leu Glu Asp Gly 385 390 395 400 Lys Phe vai Ser Leu Arg Thr Lys Phe Asp Asn Leu Ala Asn Ala Gly 405 410 415 Thr Phe Gin Ala Gin Phe Val Thr Ser Lys Glu Gin Ile Pro val Ser 420 425 430 Asn Ile Asp Ser Thr Lys Leu Ser Val Val Glu Asp Val Ser Leu Leu 435 440 445 Lys Hi s Leu Asp val Ala Ala Thr Val Ala Glu Gin Gly Ser Ile Ala 450 455 460 Leu Val Ser Gin Lys Ala Val Lys Asp Leu Asp Leu Asn Ser vai Glu 4 65 470 475 480 Ser Tyr vai Lys Asn Leu Gly ile Pro Glu Ser Phe Leu ile Ser Ile 485 490 495 Ala Lys Lys Asn Ile Lys Leu Phe Ile Ile Asp Gly Glu Thr Xaa Asn 500 505 510 Asp Glu Ser Lys Leu Ser Leu Phe Ile Gin Ala val Phe Trp Lys Leu 515 520 525 Ala Phe Gly Leu Asp Val Ala Glu Cys Thr Asn Arg Ile Trp Lys Ser 530 535 540 Ile Asp Ser Gly Ala Asp Ile Ser Ala Ala Ser Ile Ser Glu Phe Leu 545 550 555 560 Thr Gly Ala Phe Lys Asn Phe Leu Ser Glu Val Pro Leu Ala Leu Tyr 565 570 575 Thr Lys Phe Ser Glu Ile Asn Tle Glu Lys Lys Glu Asp Xaa Glu Glu 580 585 590 Pro Ala Ala Leu Pro Ile Phe Val Asn Glu Thr Ser Phe Leu Pro Asn 595 600 605 Asn Ser Thr Ile Glu Glu Ile Pro Leu Pro Glu Thr Ser Glu ile Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Lys Lys Leu Ser Phe Lys Glu Ala Tyr Glu val Glu Asn 625 630 635 640 121 ΕΡ 2 132 318/ΡΤ

Lys Leu Arg Pro Asp Leu Pro Vai Lys Asn Phe Val Val Lys vai Lys 645 650 655 Glu Asn Arg Arg vai Xaa Pro Ala Asp Tyr Asp Arg Tyr Ile Phe His 660 665 670 Ile Glu Phe ASp ile Ser Gly Thr Gly Met Thr Tyr Asp Ile Gly Glu 675 680 685 Ala Leu Gly ile His Ala Arg Asn Asn Glu Ser Leu Val Lys Glu Phe 690 695 700 Leu Thr Phe Tyr Gly Leu Asn Glu Ser Asp Val Val Leu Val Pro Asn 705 710 715 720 Lys Asp Asn His His Leu Leu Glu Thr Arg Thr val Leu Gin Ala Phe 725 730 735 Vai Glu Asn Leu Asp Ile Phe Gly Lys Pro Pro Lys Arg Phe Tyr Glu 740 745 750 Ser Leu ile Pro Tyr Ala Ser Asn Glu Glu Glu Lys Lys Lys Leu Glu 755 760 7 65 Asp Leu vai Thr Pro Ala Gly Ala val Asp Leu Lys Arg Phe Gin Asp 770 775 780 Vai Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ala Asp ile Phe Glu Leu Phe Pro Ser Val 785 790 795 800 Arg Pro Ser Leu Glu Glu Leu Vai Thr ile ile Glu Pro Leu Lys Arg 805 810 815 Arg Glu Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Gin Lys Val His Pro Asn Glu Val 820 825 830 His Leu Leu Ile Vai Vai Vai Asp Trp Val Asp Asn Lys Gly Arg Lys 835 840 845 Arg Tyr Gly Gin Ala Ser Lys Tyr ile Ser Asp Leu Ala val Gly Ser 850 855 860 Glu Leu Vai Vai Ser Vai Lys Pro Ser Val Met Lys Leu Pro Pro Ser 865 870 875 880 Pro Lys Gin Pro Vai Ile Met Ser Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Pro 885 890 895 Phe Lys Ala Ile Vai Glu Glu Lys Leu Trp Gin Lys Gin Gin Gly Tyr 900 905 910 Glu ile Gly Glu vai Phe Leu Tyr Leu Gly Ser Arg His Lys Arg Glu 915 920 925 Glu Tyr Leu Tyr Gly Glu Leu Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Ala Gly Ile 930 935 940 Ile Thr His Ile Gly Ala Ala Phe Ser Arg Asp Gin Pro Gin Lys Ile 945 950 955 960 122

ΕΡ 2 132 318/PT

Tyr Ile Gin Asp Arg Ile Lys Glu Asn Leu Asp Glu Leu Lys Thr Ala 965 910 975 Met Ile Asp Asn Lys Gly Ser Phe Tyr Leu Cys Gly Pro Thr Trp Pro 980 985 990 Vai Pro Asp Ile Thr Gin Ala Leu Gin Asp ile Leu Ala Lys Asp Ala 995 1000 1005 Glu Glu Arg Gly Ile Lys Vai Asp Leu Asp Ala Ala ile Glu Glu Leu 1010 1015 1020 Lys Glu Ala Ser Arg Tyr Ile Leu Glu Vai Tyr 1025 1030 1035

<210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR HOM2-F <400> 35 cacttaagta cacatacaaa 20

<210> 36 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR HOM2-R <400> 36 gggtcagcga gagaatt 17

<210> 37 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR HOM6-F <400> 37 cctggtggta aagttggg 18

<210> 38 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR HOM6-R 123 ΕΡ 2 132 318/PT <400> 38 gattgtagaa gattgagtag 20 <210 > 39 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência <400> 39 ggaatctccc aggtttaat 19 <210 > 40 <211 > 17 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência <400> 40 Artificial Artificial gggcaatcaa aggctat 17 <210> 41 <211 > 23 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência <400> 41 cgctaataaa ctcgctacaa aag 23 Artificial <210 > <211 > <212> <213> 42 21 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência <400> 42 cgtccttttt gctcaatatc c 21 <210 > <211 > <212> <213> 43 23 ADN Sequência Artificial Artificial

iniciador de PCR SER33-F

iniciador de PCR SER33-R iniciador de PCR MET1-F iniciador de PCR MET1-R 124

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR MET5-F <400> 43 gctgcaagca gttatataaa gtg 23 <210> <211 > <212> <213> 44 19 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR MET5-R <400> 44 aaaaccgaac tagccgaag 19 <210> <211 > <212> <213> 45 19 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR MET8-F <400> 45 aaaatcgcta caaagtccg 19 <210 > <211 > <212> <213> 46 19 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR MET8-R <400> 46 gcattgttgt tcgttctcc 19

<210 > <211> <212> <213> 47 25 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> ME TIO- Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR PCR--F <400> 47 cggatcccca atcaccataa cactt 25 125

ΕΡ 2 132 318/PT <210> 48 <211 > 25 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador MET10-R de PCR PCR- <400> 48 gccgcggtag ggtcttcagg acgag 25 <210 > 49 <211> 21 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de KO PCR MET10-F- <400> 49 caaatagttt cgtttagatg g 21 <210 > 50 <211 > 20 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de KO PCR MET10-R- <400> 50 gtataatgtg atggttagtt 20 <210 > 51 <211 > 58 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR MET10- hphMX-F <400> 51 actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa tccgaattgt attttgatgg ccgcacgg 58 <210 > 52 <211 > 63 <212> ADN Λ 00 \—1 CN V Sequência Artificial 126

ΕΡ 2 132 318/PT <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de PCR MET10-hphMX-R <400> 52 aacaattcaa aaatgtcagc atatgtataa tactccacat aatcgacagc agtatagcga 60 cca 63

<210> 53 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de confirmação por PCR, JKKanRE <400> 53 gggcgacagt cacatcat 18

<210> 54 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de confirmação por PCR, HYGROB CHK_R <400> 54 tgacggtgtc gtccatcac 19

<210> 55 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET1-S1F <400> 55 tggggagagt tctggtatgc aag 23

<210> 56 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 >

<223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET1-S2F 127 ΕΡ 2 132 318/PT <400> 56 cagatggtta tctcagataa tggag 25 <210 > <211> <212> <213> 57 25 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET1-S3F <400> 57 tttcttcaaa gatcacggat atatt 25 <210 > <211 > <212> <213> 58 22 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET1-S1R <400> 58 gctatatcac gttgagtagc gg 22 <210> <211 > <212> <213> 59 24 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET1-S2R <400> 59 ggtactacac cctctgtgac agtt 24

<210 > <211> <212> <213> 60 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET1-S3R <400> 60 ctcagttttt ggcattgcca 20

ΕΡ 2 132 318/PT 128 <210> <211 > <212> <213> 61 25 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S1F <400> 61 cctaataaac ttccattggt gatta 25 <210 > <211> <212> <213> 62 24 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial iniciador de sequenciação de MET, MET5-S2F <400> 62 ccgttttaca gggtgtctct aaga 24 <210 > <211 > <212> <213> 63 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S3F <400> 63 gacgcgatct tgacgaagct 20 <210 > <211 > <212> <213> 64 22 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S4F <400> 64 gaatctggtt actggccatt gt 22 <210 > <211 > 65 22 <212> <213> ADN Sequência Artificial 129

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S5F <400> 65 ctgaaaaatg acaccgactt gg 22 <210 > <211 > <212> <213> 66 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S6F <400> 66 tggcttgctc tggatcactt 20 <210> <211 > <212> <213> 67 25 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S7F <400> 67 cgatgtcggt ttagttgcta tagtt 25 <210 > <211> <212> <213> 68 25 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S8F <400> 68 tggtaatcaa catttggtta tctct 25

<210 > <211 > <212> <213> 69 22 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S1R 130 ΕΡ 2 132 318/PT <400> 6 9 gggcaaccag tcattctcat aa 22 <210 > <211> <212> <213> 70 24 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S2R <400> 70 cttcgacacc catatcatct acag 24 <210 > <211 > <212> <213> 71 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S3R <400> 71 caattttccc atatcagcga 20 <210> <211 > <212> <213> 72 20 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S4R <400> 72 catcatcaac agcagcgccg 20

<210 > <211> <212> <213> 73 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S5R <400> 73 ctgatcgaag gcagccttgc 20 131

ΕΡ 2 132 318/PT <210> <211 > <212> <213> 74 25 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S6R <400> 74 catatggctc tgaatcaatc aataa 25 <210 > <211> <212> <213> 75 24 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S7R <400> 75 ttcacaactt ttttgacaga agaa 24 <210 > <211 > <212> <213> 76 24 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET5-S8R <400> 76 cgttagcaat ctccaaggta ggaa 24 <210 > <211 > <212> <213> 77 24 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET8-S1F <400> 77 gcagtgactt caaagacgaa tacc 24 <210 > <211 > <212> <213> 78 20 ADN Sequência Artificial 132

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET8-S2F <400> 78 ctggaggacg ctgtcgtcaa 20 <210 > <211 > 79 22 <212> <213> ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET8-S1R <400> 79 tcatctctta ctagagcgcc aa 22 <210> <211 > <212> <213> 80 21 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET8-S2R <400> 80 ggtcccagtt cggattgata a 21 <210 > <211> <212> <213> 81 17 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ1-F <400> 81 agtcatcttc gagcaaa 17

<210 > <211 > <212> <213> 82 17 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ2-F 133 ΕΡ 2 132 318/PT <400> 82 tcatgatggt aagtttc 17 <210 > <211> <212> <213> 83 19 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ3-F <400> 83 tcaacgtcag agtgccatt 19 <210 > <211 > <212> <213> 84 19 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ4-F <400> 84 atcagtcgtt gaagatgtc 19 <210> <211 > <212> <213> 85 19 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ5-F <400> 85 ctgagatctc tgatattgc 19

<210 > <211> <212> <213> 86 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ6-F <400> 86 tgcagtagat ttgaagagat 20 134

ΕΡ 2 132 318/PT <210> <211 > <212> <213> 87 16 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ7-F <400> 87 cacacacatc ggcgct 16 <210 > <211> <212> <213> 88 17 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, METI0-SEQ1-R <400> 88 cggagtcacg acaccat 17 <210 > <211 > <212> <213> 89 19 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ2-R <400> 89 ggctgaaact tgagatctc 19 <210 > <211 > <212> <213> 90 20 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ3-R <400> 90 cttgacgtaa ctttctacag 20 <210 > <211 > <212> <213> 91 20 ADN Sequência Artificial 135

ΕΡ 2 132 318/PT <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ4-R <400> 91 tcataatcag caggcgtaac 20 <210 > <211 > <212> <213> 92 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ5-R <400> 92 cttctcttca atggttcaat 20 <210> <211 > <212> <213> 93 17 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: iniciador de sequenciação de MET, MET10-SEQ6-R <400> 93 agtagggcca gacaagt 17

Lisboa, 2012-11-14

Claims

ΕΡ 2 132 318/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método para redução dos níveis de H2S num meio de fermentação, o método compreendendo o contacto do meio de fermentação com uma célula de levedura compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5).
2. Método da reivindicação 1, em que: a) é produzida uma bebida fermentada, em que a bebida fermentada é opcionalmente seleccionada entre vinho, cerveja, champanhe, vinho do porto e vinho da madeira; b) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO:34, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp; c) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 6, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin ou Asn; d) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 7, em que X na posição 662 é lisina; e) o polinucleótido partilha pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: i; f) é produzido um produto de fermentação não possuindo níveis detectáveis de H2S; g) a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae; h) o meio de fermentação é seleccionado do grupo que consiste em: um mosto de frutos e um mosto de malte; ou i) o meio de fermentação é um mosto de sumo de uva.
3. Método da reivindicação 2, em que a célula de levedura é uma estirpe de levedura de vinho seleccionada do grupo que consiste em: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22. ΕΡ 2 132 318/PT 2/5
4. Vector de expressão compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5), e em que o polinucleótido está operativamente ligado a uma sequência de controlo da expressão.
5. Vector de expressão da reivindicação 4, em que o polinucleótido: a) codifica um polipéptido de METI0 de SEQ ID NO: 34, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp; b) codifica um polipéptido de METI0 de SEQ ID NO: 6, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin ou Asn; c) codifica um polipéptido de METI0 de SEQ ID NO: 7, em que X na posição 662 é lisina; ou d) partilha pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.
6. Célula hospedeira compreendendo um vector de expressão de qualquer uma das reivindicações 4 e 5.
7. Célula hospedeira da reivindicação 6, em que a célula é uma célula de levedura ou é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.
8. Meio de fermentação compreendendo uma célula de levedura melhorada que não produz sulfureto de hidrogénio compreendendo um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO:5), em que a célula progenitora da célula de levedura melhorada produz sulfureto de hidrogénio.
9. Meio de fermentação compreendendo uma célula de levedura da reivindicação 8, em que: ΕΡ 2 132 318/ΡΤ 3/5 a) ο polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 34, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp; b) o polinucleótido codifica um polipéptido de METI0 de SEQ ID NO: 6, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin ou Asn; c) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 7, em que X na posição 662 é lisina. d) o polinucleótido partilha pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: i; e) a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae; ou f) a célula de levedura é uma estirpe de levedura de vinho seleccionada do grupo que consiste em: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22.
10. Meio de fermentação compreendendo uma cultura melhorada de células de levedura que produz níveis reduzidos de sulfureto de hidrogénio, compreendendo uma população de células de levedura, as células de levedura compreendendo um polinucleótido exógeno que codifica um polipéptido de MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de MET10 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5), em que a cultura melhorada de células de levedura produz reduzido sulfureto de hidrogénio em comparação com uma cultura de células progenitoras.
11. Meio de fermentação compreendendo uma cultura de células de levedura da reivindicação 10, em que: a) a cultura não produz níveis detectáveis de sulfureto de hidrogénio; b) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 34, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp; c) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 6, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin ou Asn; ΕΡ 2 132 318/ΡΤ 4/5 d) ο polinucleótido codifica um polipéptido de METI0 de SEQ ID NO: 7, em que X na posição 662 é lisina; e) o polinucleótido partilha pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1; f) a população de células de levedura compreende células de Saccharomyces cerevisiae; ou g) a população de células de levedura é de uma estirpe de levedura de vinho seleccionada do grupo que consiste em: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22.
12. Método de produção de uma célula de levedura melhorada que produz níveis reduzidos de sulfureto de hidrogénio, o método compreendendo a substituição de um polinucleótido endógeno que codifica um polipéptido de METI0 activo para sulfureto por um polinucleótido que codifica um polipéptido de METI 0 inactivo para sulfureto por introdução num progenitor da célula de levedura de um polinucleótido que codifica um polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto que não catalisa a conversão de sulfito em sulfureto, em que o aminoácido na posição 662 do polipéptido de METI0 inactivo para sulfureto é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5), em que o progenitor da célula de levedura melhorada produz sulfureto de hidrogénio.
13. Método da reivindicação 12, em que: a) o polinucleótido que codifica o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto é introduzido de forma recombinante; b) o polinucleótido que codifica o polipéptido de MET10 inactivo para sulfureto é introduzido por retro-cruzamento; c) a célula de levedura melhorada não produz níveis detectáveis de sulfureto de hidrogénio; d) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 34, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp; ΕΡ 2 132 318/PT 5/5 e) o polinucleótido codifica um polipéptido de METI0 de SEQ ID NO: 6, em que X na posição 662 é Lys, Arg, His, Gin ou Asn; f) o polinucleótido codifica um polipéptido de MET10 de SEQ ID NO: 7, em que X na posição 662 é lisina; g) o polinucleótido partilha pelo menos 95% de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: i; h) a célula de levedura melhorada compreende células de Saccharomyces cerevisiae; ou i) a célula de levedura melhorada é de uma estirpe de levedura de vinho seleccionada do grupo que consiste em: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22. Lisboa, 2012-11-14