WO2007097093A1

WO2007097093A1 - 分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途

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Publication number: WO2007097093A1
Application number: PCT/JP2006/324606
Authority: WO
Inventors: Yoshihiro Nakao; Yukiko Kodama; Tomoko Shimonaga
Original assignee: Suntory Limited
Priority date: 2006-02-27
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2007-08-30
Also published as: JPWO2007097093A1

Abstract

本発明は、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、分枝アミノ酸資化能が制御された醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の分枝アミノ酸トランスポーターであるBap3pをコードする遺伝子BAP3、特にビール酵母に特徴的なnonScBAP3遺伝子の発現量を制御することによって、分枝アミノ酸資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。

Description

明細書

分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途 ' 技術分野

本発明は、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子及びその用途に関し、特に、分枝アミノ酸資化性を制御した醸造酵母、該酵母を用いて製造した酒類、その製造方法などに関する。さらに具体的には、本発明は、醸造酵母の分枝アミノ酸トランスポーターである Bap3p をコードする遺伝子 BAP3、特にビール酵母に特徴的な nonScBAP3 遺伝子の発現量を.制御することによって、分枝アミノ酸資化能を制御した酵母、当該酵母を用いた酒類の製造方法などに関する。背景技術

一般にアミノ酸は酒類の呈味成分として重要であり、品質を左右する重要な要素であることが知られている。そのため、目的の酒質にあわせてアミノ酸の量をコントロールする事は、新しいタイプの酒類の開発において重要である。

しかしながら、アミノ酸は発酵中に酵母によって窒素源として資化されるため、発酵終了時のアミノ酸の含有量をコントロールする事はきわめて困難である。

酵母が細胞外のアミノ酸を窒素源として利用 _するためには、 ·アミノ酸を菌体内に取り込むことが必須である。このようなアミノ酸の取り込みには酵母の細胞膜に存在するアミノ酸トランスポーターが関与していることが明らかとなっている。

酵母のアミノ酸トランスポーターとしては基質特異性の低い Gapl や基質特異性の異なる多くのアミノ酸トランスポーター（分枝アミノ酸トランスポーター Bap2、 LgBap2、 Bap3、アルギニントランスポーター Canl、プロリントランスポーター Put4 等 ( Biochim Biophys Acta. 1269 : 275 - 280， 1995、 Appl Environ Microbiol. 67 : 3455—3462, 2001、 Mol Microbiol 30 : 603—613, 1998、 Curr Genet 36 : 317 - 328， 1999) が知られている。

これまでに、酒類中のアミノ酸含量をコントロールするためにアミノ酸の取り込みに関与する遺伝子（gapl, shr3, canl, put4， uga4)の変異を有する酵母を用いた例 (特開 2001-321159 号公報）や分枝アミノ酸トランスポーター BAP2 を高発現させた例（特開 2000-316559号公報）が報告されている。発明の開示

上記のような状況下、酒類中のァミノ酸組成を改変し、特徴ある品質を有する酒類を製造するために、アミノ酸の資化がコントロールされた酵母が望まれていた。本発明者らは、上記課題を解決する.ため鋭意検討を重ねた結果、ビール酵母から分枝アミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子を同定 ·単離することに成功した。また、.得られた遺伝子を酵母に導入し発現させた形質転換酵母を作製し、分枝アミノ酸の資化が促進されることを確認して、本発明を完成した。

すなわち本発明は、ビール酵母に存在する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、該遺伝子の発現が調節された形質転換酵母、該遺伝子の発現が調節された酵母を用いることによる酒類の製造方法などに関する。本発明は、具体的には、次に示すポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、該ベクターが導入された形質転換酵母、該形質転換酵母を用いる酒類の製造方法などを提供する。 .

( 1 ) 以下の（a；)〜（ f ) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：

(a) .配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド； ―

(b)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオ. チドを含有するポリヌクレオチド；

(c)配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入およびノまたは付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；

(d)配列番号： 2のアミノ酸配列に対して 60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；

( 配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチ ,ド；及び

( f )配列番号： 2のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。

(2) 以下の（g)〜（i) 力なる群から選択される上記（1) に記載のポリヌクレォチド： . '

(g)配列番号： 2のアミノ酸配列又は配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1〜 10 個のアミノ酸が欠失、置換、 '挿入およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；

(h) 配列番号： 2.のアミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び、

(i)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ分枝アミノ酸ドランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド

(3) 配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記（1) に記 ¾のポリヌクレオチド。

(4) 配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記（1) に記載のポリヌクレオチド。

(5) DNAである、上記（1) 〜（4) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

(6) 上記（1) 〜（5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。

(7) 上記（1) 〜（5) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するべクタ

(7a) 以下の（x)〜（z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記（7) に記載のベクター： , (X)酵母細胞内で転写可能なプロモーター

(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合し fこ、上記

(I) 〜（5) のいずれかに記載のポリヌクレオチド；及び

(z)RNA 分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。 (8) 以下の（j)〜（！ η)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：

G)上記（5) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の転写産物に対して相補的な塩基配列を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；

•0 上記（5) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を RNAi効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチド；

(1) 上記（5),に記載のポリヌクレオチド（DNA) の転写産物を特異的に切断する活性を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；及び

(m) 上記（ 5 ) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を共抑制効果により抑制する RNAをコ一ドするポリヌクレオチド。

(9) 上記（8) に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。 .

(10) 上記（7) に記載のベクターが導入された酵母。

(I I) 上記（7) に記載のベクターを導入することによって.、分枝アミノ酸の資化能が増強された上記（10)に記載の酵母。

(12) 上記（6) に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって分枝ァ . ミノ酸の資化能が向上した上記（1 1) に記載の酵母。

(1 3) (A) 上記（9) に記載のベクターを導入することによって、（B) 上記

(5) に記載のポリヌクレオチド（DNA) に係る遺伝子を破壊することによって、 (0 プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモーターを組み換えることによって、上記（5) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を抑制するようにした酵母。

(14) 上記（10) 〜（1 2) のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。

(1 5) 醸造する酒類が麦芽飲料である上記（14) に記載の酒類の製造方法。

(16) 醸造する酒類がワインである上記（14) に記載の酒類の製造方法。

(1 7) 上記（14) 〜 (1 6) のいずれかに記載の方法で製造された酒類。

(18) 配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法。 '

( 1 8a) 上記（1 8) に記載の方法によって、分枝アミノ酸資化能が高い酵母を選別する方法。

(1 8b) 上記（1 8 a) に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。

( 1 9) 被検酵母を培養し、配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価する方法。

( 1 9 a) 上記 Cl 9) に記載の方法で、被検酵母を評価し、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量が高いあるいは低い酵母を選別する、分枝アミノ酸資化能の高いあるいは低い酵母を選別する方法。

(1 9b) 上記（1 9a) に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類（例えば、ビール）を製造する方法。. .

(2 0) 被検酵母を培養し、上記（6) に記載のタンパク質を定量または配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝ァミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。

(2 1) 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1 の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝午が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択する、上記（2 0) 記載の酵母の選択方法。

(2 2) 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項 6に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記（20) に記載の酵母の選択方法。

(2 3) 上記（1 0) 〜（1 2) に記載の酵母および上記（2 0) 〜（2 2) に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分枝アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。

本発明の形質転換酵母を用いる酒類の製造法によれば、分枝アミノ酸の資化を制御することができるため、酒類中のアミノ酸組成を改変することができ、特徴ある品質を有する酒類の製造が可能となる。 ' 図面の簡単な説明

図 1は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸は 0D660の値を示している。

図 2は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w ) を示している。

図 3は、ビール試験醸造中の酵母における nonScBAP3遺伝子の発現挙動を示す図である。横軸は ¾酵時間、縦軸は検出されたシグナル輝度を示している。

図 4は、ビール試験醸造における酵母増殖量の経時変化を示す図である。横軸は発酵時間を、縦軸は 0D660の値を示している。

図 5は、ビール試験醸造におけるエキス消費量の経時変化を示す図であ.る。横軸は発酵時間、縦軸は外観エキス濃度（w/w%) を示して'いる。、

図 6は、ビーノレ試験醸造におけるバリンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はパリン濃度（mM) を示している。

図 7は、ビール試験醸造におけるロイシンの経時変化を示す図である。横軸は発酵時間、縦軸はロイシン濃度（mM) を示している。

図 8は、ビール試験醸造におけるイソロイシンの経時変化を示す図である。横軸は ¾酵時間、縦軸はイソロイシン濃度（mM) を示している。発明を実施するための最良の形態

本発明者らは、酵母の分枝アミノ酸トランスポーターの活性を増大させることによって、さらに効率よく分枝アミノ酸を資化させることが可能であると考えた。このような着想に基づいて研究を重ね、特開 2004-283169に開示の方法で解読したビール酵母ゲノム情報を基に、ビール酵母特有の分枝アミノ酸トランスポーターをコ ―ドする non-ScBAP3 遺伝子を単離 '同定した。この塩基配列を配列番号： 1に示す。またこの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号： 2 に示す。 1. 本発明のポリヌクレオチド ' まず、本発明は、（a)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び (b)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドするポ'リヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、 DNAであっても RNAであってもよい。

本発明で対象とする DNAは、上記のビール酵母由来の分枝アミノ酸トランスポー 'ターをコ—ドするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質しては、例えば、（c)配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝ァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。

このようなタンパク質としては、配列番号： 2のアミノ酸配列において、例えば、 1 100個、 1 90個、 1 80個、 1 70個、：! 60個、 1 50個、 1 40個

1 39個、 1 38個、 1 37個、 1 36個、 1 35個、 1 34個、 1 '33個、

1 32個、 1 31個、 1 30個、 1 29個、 1 28個、：！〜 27個、：！〜 '26個、

1 25個、. 1 24個、 1 ~23個、 .1 22個、 1 21個、：！〜 20個、：！〜 19個、

1 18個、 1 17個、 1 16個、 1 15個、 1 14個、：！〜 13個、：！〜 12個、 1 11個、：! 10個、 1 9個、：！〜 8個、：！〜 7個、：！〜 6個（1〜数個）

5個、 1 4個、 1 3個、 1 2個、 1個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入およびまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入およびまたは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、（d)配列番号： 2のアミノ酸配列と約 60%以上、約 70%以上、 71%以上、 72%以上、 73%以上、 74%以上、 75%以上、 76%以上、 77%以上、 78%以上、 79%以上、 80%以上、 81%以上、 82%以上、 83%以上、 84%以上、 85%以上、 86% 以上、 87%以上、 88%以上、 89%以上、 90%以上、 91%以上、 92%以上、 93%以上 94%以上、 95%以上、 96%以上、 97。/。以上、 98%以上、 99%以上、 99.1%以上、 99. 2%以上、 99. 3 %以上、 99. 4%以上、 99. 5%以上、 99. 6%以上。 99. 7%以上、 99. 8%以上、 99. 9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の黎値は一般的に大きい程好ましい。

なお、分枝アミノ酸トランスポーター活性は、例えば（Biochim Biophys Acta. 1269 : 275-280, 1995) に記載の方法によって測定することができる。

また、本発明は、（e)配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリ 'ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝ァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び（f)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含する。

ここで、「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号： 2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプ: ローブとして、コロニ一ハイブリダィゼ一シヨン法、プラークハイブリダィゼーション法またはサザンハイブリダィゼーシヨン法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、 DNA)をいう。ハイブリダィゼーシヨンの方法としては、列 XJ Molecular し loning 3rd Ed.、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons 1987-1997 などに記載されている方法を利用することができる。本明細書でいう「ストリンジェン卜な条件」は、低ストリンジェン卜な条件、中ストリンジェン卜な条件及び高ス卜リンジヱントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェン卜な条件」は、例えば、 5 X SSC、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミド、 32。Cの条件である。また、「中ストリンジ工ン卜な条件」は、例えば、 5 X SSC、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミド、 42°Cの条件である。「高ストリンジェン卜な条件」は、. 例えば、 5 X SS (：、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5%SDS、 50%ホルムアミド、 50°Cの条件である。これらの条件において、温度を '上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、 DNA) が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダィゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。

なお、ハイブリダィゼーシヨンに市販のキットを用いる場合は、例えば Alkphos Direct Labelling Reagents (アマシャムフアルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのィンキュベーシヨンをー晚行った後、メンブレンを 55°Cの条件下で 0.1% (w/v) SDS を含む 1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダィズしポリヌクレオチド（例えば、 DNA) を検出することができる。

これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、 FASTA、 BLAST などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号： 2のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド:と約 60%以上、約 70%以上、 71%以上、 72%以上、 73%以上、 74%以上、 75%以上、 76%以上、 77%以上、 78%以上、 79%以上、 80%以上、 81%以上、 82%以上、 83%以上、 84% 以上、 85%以上、 86%以上、 87%以上、 88%以上、 89%以上、.90%以上、 91%以上、 92%以上、.93%以上、 94%以上、 95%以上、 96%以上、 97%以上、 98%以上、 99% 以上、 99.1%以上、' 99.2%以上、 99.3%以上、 99.4%以上、 99.5%以上、 .99.6%以上、： 99.7%以上、 99.8%以上、 99.9%以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。

なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチユールによるァノレゴリズム B LAST (proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990； proc Natl Acad Sci USA 90 : 5873, 1993) を用いて決定できる。 BLASTのァルゴリズムに基づいた B LAS TNや B LA S TXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF， et al ： J Mol Biol 215： 403， 1990) 。 BLASTN を用いて塩基配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば s c o r e = l 00、 wo r d l e n g t h- 12とする。また、 . B L A S TXを用いてァミノ酸配列を解析する場合は、パラメータ一は、例えば s c o r e = 50、 wo r d l e n g t ,h = 3とする。 B L A S Tと G a p p e d B L A S Tプログラムを用いる場合は各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。 ' さらに、本発明のポリヌクレオチドは、（j) 上記（5 ) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の転写産物に対して相補的な塩基配列を有する R A をコードするポリヌクレオチド；（k) 上記（5 ) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を RNAi 効果により抑制する RNA をコードするポリヌクレオチド；（1) 上記（5 ) に記載のポリヌクレオチド (DNA) の転写産物を特異的に切断する活性を有する RNA をコードするポリヌクレオチド；又は（m) 上記（ 5 ) に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を共抑制効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクォチドは、ベクタ一に組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記（a)〜（i)のポリ^クレオチド（DNA) の発現を抑制することができる。したがって、.上記ポリヌクレオチド（DNA) の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。

本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有する RNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンス DNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上：新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，東京化学同人） pp. 319- 347， 1993 などを参照）。アンチセンス DNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセンス DNA の長さは少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さらに好ましくは 500塩基以上である。

本明細書中、「DNA の発現を RNAi効果により抑制する RNA をコードするポリヌクレオチド」とは、 RNA interference (RNAi) によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられる R N Aとしては、例えば、 21〜25 塩基長の RNA 干渉を生ずる二重鎖 RNA、例えば、 dsRNA (double strand RNA)、 s iRNA (smal l interfering RNA)又は shRNA (short hairpin RNA)が挙げられる。このような R N Aは、リボソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖 RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖 RNA (dsRNA、 siRNA又は shRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表 2002-516062 号公報；米国公開許第 2002/086356A 号； Nature Genetics, 24 (2) , 180 - 183, 2000 Feb.； Genes i s, 26 (4) , 240-244, 2000 Apri l ； Nature, 407 : 6802， 319 - 20, 2002 Sep. 21； Genes & Dev. , Vol. 16, (8) , 948—958， 2002 Apr. 15； Proc. Natl. Acad. Sci . USA. , 99 (8)， 5515—5520， 2002 Apr. 16； Science, 296 (5567) , 550-553， 2002 Apr. 19； Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99 : 9， 60.47 - 6052, 2002 Apr. '30； Nature Biotechnology, Vol. 20 (5)， 497-500, 2002 May ; Nature . Biotechnology, Vol. 20 (5) , 500-505， 2002 May ; Nucleic Acids Res. , 30 : 10， e46, 2002 May 15等参照:）。

本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有する RNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザィムのことをいう。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいい、ターゲットとする DNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザィムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、 FEBS Lett. 228： 228, 1988 ； FEBS Lett. 239 : 285, 1988； Nucl. Acids. Res. 17： 7059, 1989； Nature 323： 349, 1986； Nucl. Acids. Res. 19： 6751， 1991； Protein Eng 3： 733， 1990； Nucl. Acids Res. 19： 3875, 1991； Nucl. Acids Res. 19 : 5125, 1991； Biochem Biophys Res Commun 186： 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、タ一ゲットとなる DNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。

本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がレ、ずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、 Smyth DR : Curr. Biol. 7： R793, 1997、 Martienssen R : Gurr. Biol. 6： 810, 1996など参照）。 '

2 . 本発明のタンパク質

本発明は、上記ポリヌクレオチド（a)〜（i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および Zまたは付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質である。

このようなタ^パク質としては、配列番号： 2のアミノ酸配列において、上記し ' たような数のアミノ酸残基が欠失、置換、揷 Λおよびまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ分枝ァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げ ' られる。また、このようなタンパク質としては、配列番号： 2のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するァミノ酸配列を有し、かつ分枝ァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質が挙げられる。

このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第 3版」、「カレント ' プロトコールズ 'イン .モレキュラー ' ノくィォロジ一」、 "Nuc. Acids. Res. , 10, 6487 (1982) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) " 、 "Gene, 34, 315 (1985) " 、 "Nuc. Acids. Res.， 13, 4431 (1985) " 、 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) " 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。

本発明のタンパク質のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、揷入および Zまたは付加されたとは、同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のァミノ酸配列中の位置において、 1 または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち 2種以上が同時に生じてもよレ、。

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。 A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、ノくリン、ノルパリン、ァラニン、 2-アミノブタン酸、メチォニン、 0-メチルセリン、 ,t-ブチルグリシン、 t-ブチルァラニン、シクロへキシルァラニン； B 群：ァスパラギン酸、グルタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグルタミン酸、 2-アミノアジピン酸、 2-アミノスべリン酸； C 群：ァスパラギン、グルタミン； D 群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2， 4 -ジアミノブタン酸、 2， 3-ジァミノプロピオン酸； E 群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン； F 群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フエニノレアラニン、チロシン。

また、本発明のタンパク質は、 Fmoc 法（フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 tBoc 法（t-ブチルォキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマ一社製、フアルマシア社製、プロテインテクノロジーインストウルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。

3 . 本発明のベクター及びこれを導入した形質転換酵母

次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクタ一は、上記（a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA) を含有する。また/本発明のベクターは、通常、（X)酵母細胞内で転写可能なプロモ一ター；（y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記（a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA) ；及び（z) RNA 分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。

本発明においては、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記（a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述するビールの醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記（a)〜（i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド (DNA) の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記（j)〜（！ 11)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA) を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド（DNA) の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊はターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモータ一領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、 Proc. Natl. Acad. ' Sc i. USA; 76， 4951 (1979) ヽ . Methods in Enzymology, 101， 202 (1983)、特開平 6-253826 号公報など参照）。また、本発明においてはプロモーターに変異を加えることによって、、あるいはプロモーターを相同組み換えによって組み換えることによってターゲット遺伝子の発現量を制御することもできる。このような変異の導入方法は Nucleic Acids Res. 29、 4238- 4250 (2001) に、また、プロモーターの変換による遺伝子の発現制御方法は、例えば、 Appl Environ Microbiol. , 72, 5266- 5273 (2006)に記載されている。 '

酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（YEp 型）、単コピー型（YCp型）、染色体組み込み型（Yip 型）のいずれもが利用能である。例えば、 YEp 型ベクターとしては YEp24 (J. R. Broach et al.， Experimental Manipulat ion of Gene Express ion, Academi c Press, New York, 83, 1983) 、 YCp 型ベクターとしては YCp50 (M. D. Rose et al. , gene, 60， 237， 1987) 、 Yip 型ベクターとしては YIp5 (K. Struhl et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USP, 76， 1035， 1979) が知られており、容易に入手することができる。

酵母での遺伝子発現を調節するためのプロモーターノターミネータ一としては、醸造用酵母中で機能するとともに、もろみ中の成分に影響を受けなければ、任意の組み合わせでよい。例えばダリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (TDH3) のプロモーター、 3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1) のプロモ —ターなどが利用可能である。これらの遺伝子はすでにクローニングされており、例えば M. F. Tui te et al. , E B0 J. , 1， 603 (1982) に詳細に記載されており、既知の方法により容易に入手することができる。

形質転換の際に用いる選択マーカーとしては、醸造用酵母の場合は栄養要求性マ —カーが利用できないので、ジヱネチシン耐性遺伝子（G418r) 、 .銅耐性遺伝子 (CUP1) (Marin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81， 337 1984) セルレニン耐性遺伝子（fas2m， · PDR4) (それぞれ猪腰淳嗣ら，生化学， 64， 660, 1992； Hussain et et al. , gene, 101， 149， 1991) などが利用可能である。

上記のように構築されるベクターは、宿主酵母に導入される。宿主酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール，ワイン、清酒等の醸造用酵母等が挙げられる.。具体的には、サッカロマイセス Saccharomyce^) 属等の酵母が挙げられるが、. 本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌス Saccharomyces pastorianus) W34/70 等、サッカロマイセスカーノレスべノレゲンシス Saccharomyces carlsbergensis NCYC453、 NCYC456 等、サッカロマイセスセレピシェ（SaccAa O Hダ ces cerevisiae) mRCl951 , NBRC1952、 NBRC1953、 NBRC1954 等が使用できる。さらにウィスキー酵母、例えばサッカロマイセスセレピシェ NCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用 1号、同 3号、同 4号等、清酒酵母、例えば協会酵母清酒用 7号、同 9号等も'用いることが.できるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。 '

酵母の形質転換'方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクト口ポレーシヨン法 " Meth. . Enzym.， 194, pl82 (1990) " 、スフヱ口プラスト法 " Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) " 、酢酸リチウム法 "J. Bacteriology, 153， pl63 (1983) " 、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、 Methods in yeast genetics, 2000 Edit ion ： A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual などに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。

より具体的には、宿主酵母を標準酵母栄養培地（例えば YEPD 培地 "Genetic Engineering. Vol. 1, Plenum Press, New York, 117 (1979) " 等）で、 0D600nm の値が 1〜6 となるように培養する。この培養酵母を遠心分離して集め、洗浄し、濃度約 1〜2Mのアルカリ金属イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この細胞を約 3 0 °Cで、約 60分間静置した後、導入する DNA (約 1〜20 g) とともに約 30°Cで、約 60分間静置する。ポリエチレンダリコール、好ましくは約 4， 000ダノレトンのポリエチレングリコールを、最終濃度が約 20%〜50%となるように加える。約 30°Cで、約 30分間静置した後、この細胞を約 42°Cで約 5分間加熱処理する, 好ましくは、この細胞懸濁液を標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄養培地に入れて、，約 30°Cで約 60分間静置する。その後、選択マーカーとして用いる抗生物質等を含む標準寒天培地上に植えつけ、形質転換体を取得する。その他、一般的なクローニング技術に関しては、「モレキュラークローユング第 3 fe」、 'Methods in Yeast Genit ics、 A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press , Cold Spring Harbor, NY) " 等を参照することができる。 4 . 本発明の酒類の製法及びその製法によって得られる酒類

上述しだ本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによってァミノ酸の組成に特徴のある酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されな、が、例えば、ビール、発泡酒などのビ一ルティストドリンク、ワイン、ウィスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された造用酵母を用いることによって、所望の酒類でアミノ酸の組成を調節した酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド（DNA) の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によつて選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分岐アミノ酸の含有量を調節（増加又は低減）することによつて、所望の酒類で、かつ分岐アミノ酸含量が調節（増加又は低減）された酒類を製造することができる。

これらの酒類を製造する場合は、親株の代わりに本発明において得られた醸造酵母を用いる以外は公知の手法を利用することができる。したがって、原料、製造設備、製造管理等は従来法と全く同一でよく、発酵期間の短縮された酒類を製造するためのコストの増加はない。つまり、本発明によれば、既存の施設を用い、コストを増加させることなく製造することができる。 5 . 本発明の酵母の評価方法

本発明は、配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝ァミノ酸資化能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、 WO 0 1 / 0 4 0 5 1 4号公報、特開平 8— 2 0 5 9 0 0号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。まず、被.検酵のゲノムを調製する。調製方法は、 Hereford 法や酢酸カリウム法など、公知の如何なる方法を用いることができる（例えば、 Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl30 (1990) ) 。得られたゲノムを対象にして、、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列（好ましくは、 0RF 配列）に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のゲノムにその遺伝子あるいはその遺伝子に特異的な配列が存在するか否かを調べる。プライマーまたはプローブの設計は公知の手法を用いて行うことができる。

'遺伝子またば特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて実施す.ることができる例えば、特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い. もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、 PCR 法によって酵母の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定する。プライマーに使用するポリヌクレオチドの塩基数は、通常、 10bp 以上であり、 15〜25bp であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、 300 〜2000bpが適当である。

PCR 法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、変性温度： 90〜95°C、ァニーリング温度： 40〜60°C、伸長温度： 60〜75°C、サイクル数： 10 回以上などの条件を用いることができる。得られる反応生成物はァガロースゲルなどを用いた電気泳動法等によって分離され、増幅産物の分子量を測定することができる。この方法により、増幅産物の分子量が特異部分の DNA 分子を含む大きさかどうかによつて, その酵母の分枝ァミノ酸資化能について予測 ·評価する。また、増幅物の塩基配列を分析することによって、さらに上記性能についてより正確に予測 ·評価すること可能である。

また、本発明においては、被検酵母を培養し、配列番号： 1 の塩基配列を有する分枝ァミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の分枝アミノ酸資化能を評価することもできる。なお、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量の測定は、被検酵母を培養し、分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の転写産物である mRNA 又はタンパク質を定量することによって可能である。 mRNA 又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。 mRNA の定量は例えばノーザンハイブリダィゼーシヨンや定量的 RT-PCR によって、タンパク質の定量は例えばウェスタンブロッティングによって行うことができる（Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons 1994-2003)。なお、被検酵母を培養した際に得られる発酵液中の分枝アミノ酸濃度を測定することによって、その被検酵母における上記遺伝子の発現量を予測することも可能である。

さちに、被検酵母を培養して、配列番号： 1 の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記遺伝子発現量の酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。また、基準酵母および被検酵母を培養し、各酵母における前記遺伝子発現 ¾を測定し、基準酵母と被検酵母の前記遺伝子発現量を比較して、所望の酵母を選択してもよい。具体的には、例えば、基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1 の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは低発現である被検酵母を選択することによって所望の酒類の醸造に好適な酵母を選択することができる。

あるいは、被検酵母を培養して、分枝アミノ酸資化能の高いまたは低い酵母を選択することによって、所望の酒類の醸造に好適な被検酵母を選択することができる。これらの場合、被検酵母又は基準酵母としては、例えば、上述した本発明のべクターを導入した酵母、突然変異処理が施された酵母、自然変異した酵母などが使用され得る。突然変異処理は、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、 EMS (ェチルメタンスルホネート）、 N-メチル -N-ニトロソグァ二ジンなどの薬剤処理による化学的方法など、いかなる方法を用いてもよい（例えば大嶋泰治編著、生物化学実験法 39 酵母分子遺伝学実験法、 p67-75、学会出版センターなど参照）。なお、分枝アミノ酸資化能の評価は、例えば、発酵終了後のビールのアミノ酸組成をアミノ酸分析計（例えば、 L - 8800 高速アミノ酸分析計；日立社製）、標準アミノ酸分析カラム P/N855- 3506；日立製作所社製）を用いて分析し、アミノ酸組成中の分枝ァミノ酸濃度を評価することによって行うことができる。

なお、基準酵母、被検酵母として使用され得る酵母としては、醸造用に使用可能な任意の酵母、例えばビール、ワイン、清酒等の醸造用酵母などが挙げられる。具体的には、サッカロマイセス ^Ssccl romyces) 属等の酵母（例えば、サッカロマイセスパストリアヌス、サッカロマイセスセレピシェ及びサッカロマイセス力一ルスベルゲンス）が挙げられるが、本発明においては、ビール酵母、例えばサッカロマイセスノヽ⁰ストリアヌス Saccharo寧 es pastorianus) W34/70 等、サッカロマイセスカーノレスべノレゲンシス Saccharomyces carlsbergensis) NCYC453、 CYC456 等、サッカロマイセスセレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951 , NBRC1952、 BRC1953 , NBRC1954 等が使用できる。さらにウィスキー酵母、例えばサッカロマイセスセレピシェ NCYC90等、ワイン酵母、例えば協会ぶどう酒用 1号、同 3号、同 4号等、清酒酵母、例えば協会酵母清酒用 7号、同 9号等も用いることができるが、これに限定されない。本発明においては、ビール酵母、例えばサッ ' カロマイセスパストリアヌスが好ましく用いられる。基準酵母、被検酵母は、上記酵母群から任意の組合せで選択してもよい。実施例

以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。実施例 1 ：分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子（nonScBAP3) のクローニング

特開 2004-283169に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子、 nonScBAP3 を見出した（配列番号： 1 ) 。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマー nonScBAP3_F (配列番号： 3 ) /nonScBAP3_R (配列番号： 4 ) を設計し、グノム解読株サッカロマイセスパストリアヌスバイへンステフアン 34/70 株 ( 「W34/70株」と略記することがある）の染色体 DNA を铸型とした PCRによって nonScBAP3の全長遺伝子を含む DNA断片を取得した。

上記のようにして得られた nonScBAP3 遺伝子断片を、 TA クローニングによって pCR2. 1-T0P0 ベクター（インビトロジン社製）に挿入した。 nonScBAP3 遺伝子の塩基配列をサンガーの方法（F. Sanger, Science, 214, 1215, 1981) で分析し、塩基配列を確認した。実施例 2 ：ビール試醸中の nonScBAP3遺伝子発現解析

ビール酵母サ' カロマイセスパストリアヌス W34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出した mRNAをビール酵母 DNAマイクロアレィで検出した。麦汁エキス濃度 12. 69%

麦汁容量 70L

' 麦汁溶存酸素濃度 8. 6ppm

発酵温度 15°C

酵母投入量 12. 8 X 10⁶cel ls/mL 発酵液を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（図 1 ) 、外観エキス濃度（図 2 ) の経時変化を観察した。またこれと同時に酵母菌体をサンプリングし、調製した mRNAをピオチンラベルして、特開 2004-283169に記載のビール酵母 DNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。シグナルの検出はジーンチップオペレーティングシステム（GC0S ; GeneChip Operating Software 1. 0、ァフィメトリクス社製）を用いて行った。 nonScBAP3 遺伝子の発現パターンを図 3に示す。この結果より、通常のビール発酵において nonScBAP3遺伝子が発現していることを確認した。実施例 3 ： nonScBAP3高発現株の作製

実施例 1に記載の nonScBAP3/pCR2. 1-T0P0を制限酵素 Saclおよび Notl消化しタンパク質コード領域全長を含む DM 断片を調製した。この断片を制限酵素 Sacl および Notl 処理した pYCGPYNot に連結させ、 nonScBAP3 高発現べ'クタ一 nonScBAP3/pYCGPYNot を構築した。 pYCGPYNotは YCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子 PYK1 のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジエネチシン耐性遺伝子 G418^f を、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子 Amp^rを含んでいる。

上述の方法で作製した高発現べクタ一を用い、特開平 07- 303475に記載された方法でサッカロマイセスパストリアヌスバイへンステフアン 34/70株を形質転換した。ジヱネチシン 300mg/Lを含む YPD平板培地（1%酵母エキス、 2%ポリぺプトン、 ₂%グルコース、 2%寒天）で形質転換体を選択した。実施例 4 ：ビール試験醸造におけるァミノ酸資化量の測定

親株ならびに実施例 3で得られた nonScBAP3高発現株を用いた発酵試験を以下の条件で行った。麦汁エキス濃度 12%

麦汁容量 , 1L

麦汁溶存酸素濃度糸勺 8ppm - 発酵温度 15。C一定

酵母投入量 5g湿酵母菌体 ZL麦汁発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母增殖量（0D660) (図 4 )、エキス消費量 (図 5 )、分枝アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）（図 6、 7及び 8 )の経時変化を調べた。図 6、 7及び 8に示すように nonScBAP3高発現株では親株に比べて分枝アミノ酸の資化が促進されていた。また、表 1に示すように、 nonScBAP3高発現株を用いて製造したビールのアミノ酸組成は、親株を用いて製造したビールに比べてバリン、ロイシン、イソロイシン、フエ二ルァラニンなどの分枝アミノ酸が減少し、またグルタミン酸、グリシン、ァラニン等が増加しており、異なる特徴を示していた。表 1

ァミノ酸量（mM) 親株 nonScBAP3高発現株

ァスパラギン酸未検出 0. 0268

トレ才ニン 0. 04875 未検出

セリン未検出 0. 01825

グルタミン酸 0. 0907 0. 2158

ダリシン 0. 23375 0. 34065

ァラニン 0. 66285 0. 85045

システィン' 0. 0178 0. 0186

バリン . 0. 36535 0. 05005

メチォニン木検出未検出

イソロイシン 0. 05845 未検出

口ィシン 0. 07995 0. 02175

チロシン 0. 47585 . 0. 25385

フエ二ルァラニン 0. 3432 0. 1159

オノレニチン 0. 037 0. 0406

リジン未検出未検出

ヒスチジン 0. 1154 0. 16615

ト.リブトフアン 0. 13535 0. 12125

アルギニン未検出 0. 0424

プロリン 4. 0057 3. 41835

総アミノ酸量（mM) 6. 6701 5. 70085 実施例 5 ： nonScBAP3遺伝子の破壊

文献（Goldstein et al. , yeast. 15 1541 (1999) ) の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド（pFA6a (G418r) , pAG25 (nat l) , pAG32 (hph) ) をテンプレートとした PCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。

作製した遺伝子破壊用断片で W34/70株あるいは胞子クローン W34/70- 2株を形質転換する。形質転換は特開平 07-303475に記載された方法で行い、選択薬剤の濃度はそれぞれジエネチシン（Genet icin) 300mg/レノーセォスリシン（Nourseothricin) 50mg/Lとする。実施例 6 ：ビール試験醸造におけるアンモニアおよびアミノ酸資化量の測定親株ならびに実施例 5で得られた nonScBAP3破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。麦汁エキス濃度 12% ' 麦汁容量 1L

麦汁溶存酸素濃度約 8ppm

発酵温度 ' 15°C—定

酵母投入量 5g湿酵母菌体 ZL麦汁実施例 4と同様に、発酵醪を経時的にサンプリングし、酵母増殖量（OD660) 、エキス消費量及び各種ァミノ量の経時変化を調べる。産業上の利用可能性

本発明の酒類製造法によれば、酵母の分枝ァミノ酸資化能を制御することができるため、分枝アミノ酸含有量が調節された、アミノ酸組成に特徴のある酒類を製造することが可能'となる。

Claims

請求の範囲

1 . 以下の（a)〜（f) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：

(a)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌグレォチド；

(b)配列蕃号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレォチドを含有するポリヌクレオチド；

(c)配列番号： 2のアミノ酸配列において、 .1 もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝ァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；

(d) 配列番号： 2のアミノ酸配列に対して 60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；

(e)配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリ'ヌクレオチドとス卜リンジェンドな条件下でハイブリダイズし、かつ分枝ァミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び

.(f)配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレォチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。

2 . 以下の（g)〜（i) からなる群から選択されるポリヌクレオチド：

(g)配列番号： 2のァミノ酸配列又は配列番号： 2のアミノ酸配列において、 1 〜10 個のアミノ酸が欠失、置換、挿入およびまたは付加したアミノ酸配列からなり、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；

(h) 配列番号： 2のアミノ酸配列に対して 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；及び

(i)配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号： 1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ分枝アミノ酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。

3 . 配列番号： 1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項 1に記載のポリヌクレオチド。

4 . 配列番号： 2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレォチドを含有する請求項 1に記载のポリヌクレオチド。

5 . DNAである、請求項 1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。

6 . 請求項 1〜 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。

7 . 請求項 1〜 5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有す.るベクター。

8 . 以下の（j)〜（m)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：

(j) 請求項 5に記載のポリヌクレオチ.ド (DNA) の転写産物に対して相補的な塩基配列を有する R Aをコードするポリヌクレォチド； '

(k)請求項 5に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を RNAi効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチド；

(1) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド（DNA) の転写産物を特異的に切断する活性を有する RNAをコードするポリヌクレオチド；及び

(m)請求項 5に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を共抑制効果により抑制する RNAをコードするポリヌクレオチド。

9 . 請求項 8に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。

1 0 . 請求項 7に記載のベクターが導入された酵母。

1 1 . 請求項 7に記載のベクターを導入することによって、分枝アミノ酸資化能が向上した請求項 1 0に記載の酵母。

1 2 . 請求項 6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって分枝ァミノ酸資化能が向上した請求項 1 1に記載の酵母。

1 3 . (A) 請求項 9に記載のベクターを導入することによって、（B) 請求項 5に記載のポリヌクレオチド（DNA) に係る遺伝子を破壊することによって、（C) プロモーターに変異を加えることによって、またはプロモータ一を組み換えることによって、請求項 5に記載のポリヌクレオチド（DNA) の発現を抑制するようにした酵母。

1 4 . 請求項 1 0から 1 2のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。

1 5 . 癍造する酒類が麦芽飲料である請求項 1 4に記載の酒類の製造方法。

1 6 . 醸造する酒類が.ワインである請求項 1 4に記載の酒類の製造方法。

1 7 . 請求項. 1 4〜1 6のいずれかに記載の方法で製造された酒類。

1 8 . 配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母の分枝アミノ酸資化能について評価する方法。

1 9 . 被検酵母を培養し、配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の.分枝ァミノ酸資化能を評価する方法。

2 0 . 被検酵母を培養し、請求項 6に記載のタンパク質を定量または配列番号： 1の塩基配列を有する分枝アミノ酸トランスポーター遺伝子の発現量を測定し、目的とする分枝アミノ酸資化能に応じた前記タンパク質の生成量または前記遺伝子の発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。

：2 1 . 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号： 1 の塩基配列を有する分枝ァミス酸トランスポーター遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現あるいは高発現である被検酵母を選択する、請求項 2 0 記載の酵母の選択方法。

2 2 . 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項 6に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項 2 0に記載の酵母の選択方法。

2 3 . 請求項 1 0〜 1 2に記載の酵母および請求項 2 0〜 2 2に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、分枝アミノ酸含有量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。