ES2390524T3

ES2390524T3 - Composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas

Info

Publication number: ES2390524T3
Application number: ES08743850T
Authority: ES
Inventors: Linda F. Bisson; Angela Linderholm; Kevin L. Dietzel
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2012-11-13
Anticipated expiration: 2028-03-13
Also published as: MX2009009822A; CN101641442B; CN106222100B; JP5517342B2; HK1138328A1; AU2008229168A1; RU2476590C2; CN106222100A; EP2132318B1; CN101641442A; KR101449972B1; BRPI0808821A2; EP2132318A4; PT2132318E; RU2009138248A; WO2008115759A3; JP2010521169A; WO2008115759A2; US8216803B2; BRPI0808821B1

Abstract

Un procedimiento para reducir niveles de H2S en un medio de fermentación, procedimiento que comprende poner en contacto el medio de fermentación con una célula de levadura que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5) .

Description

Composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas.

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE.UU. nº 60/918.616 presentada el 16 de marzo de 2007 y la solicitud provisional de EE.UU. nº 60/959.366 presentada el 12 de julio de 2007.

Declaración de los derechos a invenciones hechas bajo investigación y desarrollo federalmente patrocinadas

No aplicable.

Antecedentes de la invención

La producción de compuestos de azufre volátiles tales como sulfuro de hidrógeno (H2S) durante la fermentación alcohólica es un asunto que afecta a las industrias cerveceras y vitivinícolas. El sulfuro de hidrógeno (H2S) es un subproducto no deseable de la vía de reducción de sulfato (Figura 1). Se forma en Saccharomyces cerevisiae bajo condiciones de fermentación. La producción de H2S por cepas de S. cerevisiae oscila de 0 ug/l a 290 ug/l, muy por encima del umbral de detección humano de 11 ng/l (Amoore y Hautala 1983). Su calidad no deseable procede del hecho de que introduce un olor a huevo podrido característico a los vinos y, aunque el H2S es un compuesto volátil y puede eliminarse por aireación, tiene la posibilidad de formar mercaptanos y tioles que persistirán en el vino debido al bajo pH (Thoukis 1962). Los mercaptanos y tioles presentan por sí mismos aromas a cebolla o verduras enlatadas y si el H2S volátil puede controlarse, la eliminación de otros compuestos de azufre no deseados es técnicamente difícil y despoja al vino de otros compuestos de aroma.

La formación de sulfuro de hidrógeno por Saccharomyces cerevisiae es un problema bien documentado en la industria del vino, la cerveza y el sake (Acree y col. 1972, Eschenbruch y col. 1978, Giudici y Kunkee 1994, Jiranek y col. 1995, Rauhut y Kurbel 1994, Walker y Simpson 1993). Factores nutricionales tales como niveles de nitrógeno, vitaminas y cofactores (Giudici y Kunkee 1994, Jiranek y col. 1995) y factores medioambientales tales como temperatura, pH, niveles de azufre elemental (Rauhut y Kurbel 1994), presencia de dióxido de azufre (Stratford y Rose 1985) y niveles de compuestos orgánicos que contienen azufre (Acree y col. 1972) se han asociado a la producción de compuestos de azufre volátiles en bebidas fermentadas. Las diferencias en la producción de compuestos de azufre volátiles también se han atribuido a las diferencias en el metabolismo de las cepas de levadura (Acree y col. 1972, Spiropoulos y col. 2000).

Hay al menos seis clases diferentes de comportamiento de cepas de levadura con respecto a la formación de sulfuro de hidrógeno: 1) niveles elevados bajo todas las condiciones; 2) niveles bajos bajo todas las condiciones; 3) producción elevada por encima y por debajo de un nivel umbral de nitrógeno; producción reducida durante una 'ventana' de niveles de nitrógeno con sulfuro creciente a niveles de nitrógeno por encima o por debajo de esta ventana; 4) producción elevada en respuesta a niveles de micronutrientes limitantes independientemente del contenido de nitrógeno; 5) producción elevada de sulfuro sólo cuando se limita para tanto nitrógeno como micronutrientes; y 6) producción elevada de sulfuro con tasa elevada de fermentación, que puede relacionarse con la tasa de fermentación y desprendimiento de dióxido de carbono o con algún otro factor tal como la producción elevada de calor (Spiropoulos 2000, Jiranek 1995, Giudici 1994, Linderholm 2006).

El procedimiento existente para separar sulfuros de vino es la clarificación en cobre. La adición de cobre puede conducir a la catálisis de cambios en la composición perjudiciales, además de aumentar la cantidad de residuos producidos por las bodegas que requieren tratamiento especial, produciendo en último ligar mayores costes de producción para las bodegas y mayores costes del vino para el consumidor. Además, el uso de cobre como agente de clarificado puede conducir a altos niveles de cobre residuales en el vino. La Trade and Tax Bureau permite un nivel de cobre residual de 0,5 mg/l para vino (véase, por ejemplo, la página web regulations.justia.com/view/89060/). Los enólogos que usan cobre para eliminar el sulfuro de hidrógeno deben luego tomar medidas para reducir los niveles de cobre en el vino. Dados los efectos adversos para la salud asociados a la excesiva ingestión de cobre, particularmente trastornos neurológicos tales como Alzheimer, la Organización mundial de la salud ha recomendado restricciones dietéticas al consumo de este compuesto (véase la página web who.int/watersanitation health/dwq/chemicals/copper.pdf). La disponibilidad de cepas de levadura comerciales que no pueden producir sulfuro de hidrógeno o que producen niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno eliminará la necesidad del tratamiento con cobre de vinos. El nº de acceso de la base de datos EBI EF058164 desvela la CDS completa del gen de subunidad alfa de la sulfito reductasa (MET10) de la cepa aislada de Saccharomyces cerevisiae UCD932. Spiropoulos y col., Applied and Environmental Microbiology, 2000; 66(10): 4421 a 4462 desvela MET17 y la formación de sulfuro de hidrógeno en Saccharomyces cerevisiae.

Por tanto, hay una necesidad en la materia para composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en

bebidas fermentadas. La presente invención cumple estas y otras necesidades.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas.

Un aspecto de la invención proporciona procedimientos para reducir o eliminar niveles de H2S en el producto o medio de fermentación. En particular, la invención proporciona un procedimiento para reducir niveles de H2S en un medio de fermentación, procedimiento que comprende poner en contacto el medio de fermentación con una célula de levadura que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5).

Con respecto a las realizaciones de un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, el residuo de aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina o serina. El residuo de aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5). En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 está seleccionado del grupo que consiste en Lys, Arg, His, Gln y Asn (SEC ID Nº: 6). En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 es Lys (SEC ID Nº: 7).

En algunas realizaciones, el polipéptido MET10 o polinucleótido MET10 inactivo para sulfuro es un MET10 de levadura. En algunas realizaciones, el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro comparte al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencias con un MET10 de SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 4 en el que X en la posición 662 es como se ha descrito anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro comparte al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencias con SEC ID Nº: 1.

En algunas realizaciones, la célula de levadura tampoco expresa un polipéptido MET10 activo para sulfuro que puede convertir sulfito en sulfuro. En algunas realizaciones, el producto de fermentación es vino, cerveza o champán. En algunas realizaciones, los medios de fermentación pueden seleccionarse del grupo que consiste en un mosto de fruta (por ejemplo, un mosto de zumo de uva) o un mosto de grano.

Con respecto a las realizaciones de células de levadura, en algunas realizaciones, la cepa de levadura puede ser una cepa de Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, la cepa de levadura puede ser cualquier cepa comercialmente disponible para su uso en la fabricación de cerveza o vino, como se describe en el presente documento. Frecuentemente, la cepa parental o cepa de origen es una productora de sulfuro de hidrógeno que ha sido convertida en una no productora de sulfuro de hidrógeno por sustitución del ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 activo para sulfuro con un ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro. Cepas de vino de S. cerevisiae a modo de ejemplo incluyen, sin limitación, Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montachet, Lallemand K1, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22. Otras realizaciones de células de levadura son como se describen en el presente documento.

Por tanto, en el presente documento se describen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en los que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina. En algunos casos, el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina o serina (SEC ID Nº: 5). El polipéptido MET10 inactivo para sulfuro codificado por los polinucleótidos son como se han descrito anteriormente y en el presente documento. En algunos casos, el polinucleótido aislado que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro comparte al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencias con SEC ID Nº: 1. En algunos casos, el polinucleótido aislado comprende la secuencia de ácidos nucleicos proporcionada en SEC ID Nº: 1 o un complemento de la misma.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), y en el que el polinucleótido está operativamente ligado a una secuencia de control de la expresión. Otras realizaciones del polipéptido MET10 inactivo para sulfuro son como se han descrito anteriormente y en el presente documento. Adicionalmente se proporcionan células huésped que comprenden los vectores de expresión. Las células huésped pueden ser células de levadura, por ejemplo, células de Saccharomyces cerevisiae. Otras realizaciones de las células de levadura son como se han descrito anteriormente y en el presente documento. En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende un promotor que promueve la expresión en una célula de levadura.

Por tanto, en el presente documento se describen células de levadura mejoradas que no producen sulfuro de

hidrógeno detectable o producen bajos niveles de sulfuro de hidrógeno, comprendiendo las células mejoradas un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina (SEC ID Nº: 3), en el que una célula parental de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno. En algunos casos, el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina o serina (SEC ID Nº: 5). Los polipéptidos MET10 inactivos para sulfuro y células de levadura son como se han descrito anteriormente y en el presente documento.

Por tanto, en el presente documento se describen cultivos de células de levadura mejoradas que producen niveles reducidos de o no producen sulfuro de hidrógeno detectable, comprendiendo el cultivo mejorado una población de células de levadura, comprendiendo las células de levadura un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina (SEC ID Nº: 3), en el que el cultivo de células de levadura mejoradas no produce o produce sulfuro de hidrógeno reducido en comparación con un cultivo de células parentales. En algunos casos, el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina o serina (SEC ID Nº: 5). Los polipéptidos MET10 inactivos para sulfuro y células de levadura son como se han descrito anteriormente y en el presente documento.

En otro aspecto, la invención proporciona un medio de fermentación que comprende una célula de levadura mejorada que no produce sulfuro de hidrógeno que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), en el que una célula parental de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno. En otro aspecto, la invención proporciona un medio de fermentación que comprende un cultivo de células de levadura mejoradas que produce niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno que comprende una población de células de levadura, comprendiendo las células de levadura un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), en el que el cultivo de células de levadura mejoradas produce sulfuro de hidrógeno reducido en comparación con un cultivo de células parentales. En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de producción de una célula de levadura mejorada que produce niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno, procedimiento que comprende sustituir un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido MET10 activo para sulfuro con un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro introduciendo en un padre de la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 inactivo para sulfuro es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), en el que el padre de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno. El aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 no es treonina o serina (SEC ID Nº: 5). En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se introduce recombinantemente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se introduce por retrocruzamiento. Otras realizaciones de los polipéptidos MET10 inactivos para sulfuro y células de levadura son como se han descrito anteriormente y en el presente documento.

Por tanto, en el presente documento se describen productos de fermentación, por ejemplo, vino, cerveza, champán, con sulfuro de hidrógeno no detectable o bajos niveles de sulfuro de hidrógeno, o residuo de los mismos, en los que los productos de fermentación se producen según los procedimientos descritos en el presente documento.

Por tanto, en el presente documento se describen polinucleótidos aislados que pueden distinguir entre las secuencias proporcionadas en SEC ID Nº: 1 o un complemento de la misma y un ácido nucleico que codifica un MET10 natural, vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos operativamente ligados a una secuencia de control de la expresión y células huésped (por ejemplo, células de Saccharomyces cerevisiae) que comprenden el vector de expresión.

Por tanto, en el presente documento se describen polinucleótidos aislados que comprenden una o más sustituciones (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro o más sustituciones) en SEC ID Nº: 1, en los que las una o más sustituciones están seleccionadas de: una A - C en la posición 404, una A - G en la posicion 514, una A - G en la posición 1278 y una C - T en la posicion 1532, una G - A en la posicion 1768 y un A - C en la posicion 1985, vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos operativamente ligados a una secuencia de control de la expresión, y células huésped (por ejemplo, células de Saccharomyces cerevisiae) que comprenden el vector de expresión.

Por tanto, en el presente documento se describen polinucleótidos aislados que comprenden una o más sustituciones (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro o más sustituciones) en SEC ID Nº: 2, en los que la una o más sustituciones están seleccionadas del grupo que consiste en: una C - A en la posicion 404, una G - A en la posicion 514, una G

-: A en la posicion 1278 y una T- C en la posicion 1532, una A - G en la posicion 1768 y una C- A en la posición 1985, vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos operativamente ligados a una secuencia de control de la expresión y células huésped (por ejemplo, células de Saccharomyces cerevisiae) que comprenden el vector de expresión.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra la vía de reducción del sulfato. El análisis de secuencias realizado para genes está en negrita, el número de alelos encontrado está entre ( ), los alelos encontrados en UCD932 están marcados con líneas de puntos.

Las Figuras 2A-2Z exponen un alineamiento de secuencias del alelo de MET10 en diversas cepas de Saccharomyces (SEC ID Nº: 8, 9, 1, 10-14, 2, 15 y 16, respectivamente). Los cambios de ácidos nucleicos que producen cambios de codones están marcados.

La Figura 3 ilustra una técnica de cambio de genes a modo de ejemplo. MET10S = alelo de S288C. MET10W = alelo de cepa del vino.

La Figura 4 ilustra el alineamiento de secuencias de aminoácidos del gen MET10 en diversas cepas de Saccharomyces (S288C = SEC ID Nº: 17; UCD932 = SEC ID Nº: 18; UCD950 = SEC ID Nº: 19). Están marcadas diferencias de aminoácidos entre las diferentes cepas.

La Figura 5 ilustra los cambios de aminoácidos que rodean el residuo 662 en la proteína MET10. Secuencias de ADN de alelos de MET10 de S288C (SEC ID Nº: 20), UCD932 (SEC ID Nº: 21) y UCD950 (SEC ID Nº: 20) alineadas próximas al nucleótido 1985 con la mutación clave marcada y en negrita. Los codones (SEC ID Nº: 22 y 23) y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEC ID Nº: 24) (marcados en gris claro) se muestran en el recuadro. El cambio de una C a una A produce el cambio correspondiente de un residuo de treonina a una lisina en la posición 662 de la proteína.

La Figura 6 ilustra la localización del residuo 662 de aminoácido con respecto a los dominios funcionales conocidos y predichos de la proteína MET10. Se representa un mapa de los motivos y dominios conocidos de la proteína MET10. La posición de la base alterada en la posición 662 está marcada por la flecha negra. La mutación reside dentro del dominio de sulfito reductasa de la proteína. Datos de la página web //db.yeastgenome.org/cgibin/protein/domainPage.pl?dbid=S000001926.

La Figura 7 ilustra las características estructurales del dominio de sulfito reductasa e ilustra el impacto del cambio del residuo de treonina por una lisina sobre las características estructurales de la proteína. Se representan modelos de cintas estructurales de la proteína MET10 basándose en la predicción de homología estructural. Sólo el dominio de sulfito reductasa predicho de lisina 633 a tirosina 1035 se muestra con la región alrededor del residuo 662 alargada en el recuadro. La estructura predicha para UCD932 (Figura A) marca la lisina en el residuo 662 mientras que la estructura predicha para UCD950 (Figura B) marca la treonina en el residuo 662.

La Figura 8 ilustra un alineamiento de una subsecuencia de la proteína MET10 de alguna especie de levadura industrialmente relevante (Met10 de UCD 932 = SEC ID Nº: 25; Met10 de S288c = SEC ID Nº: 26; S. cerevisiae (carlsbergensis) = SEC ID Nº: 27; Kluyveromyces lactis = SEC ID Nº: 28; Yarowwia lipolytica = SEC ID Nº: 29; Schizosaccharomyces pombe = SEC ID Nº: 30) cuyas secuencias en la región catalítica de sulfito reductasa son conocidas. Los residuos de aminoácidos conservados por las especies alineadas están en negrita. Los residuos de aminoácidos conservados en las especies más relacionadas están sombreados. La treonina en la posición 662 o dentro del motivo (N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEC ID Nº: 31) está conservado en el polipéptido MET10 activo a lo largo de todas las especies de levadura alineadas.

Breve descripción de las tablas

La Tabla 1 expone una lista de cepas de levadura nativas e industriales.

La Tabla 2 expone la composición para un medio triple M (MMM) modificado.

La Tabla 3 expone resultados del análisis de cepas aisladas de levadura nativa cultivadas en placas BiGGY y MMM

La Tabla 4 expone cepas de levadura adicionales.

La Tabla 5 expone secuencias para cebadores de PCR para amplificar, entre otros, MET10.

La Tabla 6 expone secuencias para la secuenciación de cebadores para, entre otros, MET10.

La Tabla 7 expone resultados que resumen la producción de H2S de cepas de levadura transformadas con MET10.

La Tabla 8 expone diferencias de aminoácidos en alelos de MET10.

La Tabla 9 expone resultados que resumen la producción de H2S por cepas de levadura adicionales transformadas con MET10.

La Tabla 10 expone resultados que resumen la producción de H2S por cepas de levadura transformadas con

MET10.

La Tabla 11 expone resultados que resumen la producción de H2S por cepas de levadura transformadas con alelos de MET10.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas. La invención se basa en parte en el descubrimiento de que un polipéptido MET10 con un residuo de aminoácido en la posición 662 que es distinto de una treonina no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro de hidrógeno libre o liberado. Esto se ejemplifica por la expresión de un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro del alelo de MET10 en cepa de levadura UCD932 en la que un cambio de un único nucleótido en la posición 1985 en el gen MET10 produce un cambio de aminoácido en la posición 662 de treonina a lisina en el dominio catalítico de la proteína MET10.

II. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen generalmente el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química de ácidos nucleicos e hibridación descritos más adelante son aquellos muy conocidos y comúnmente empleados en la materia. Técnicas convencionales se usan para la síntesis de ácidos nucleicos y de péptidos. Generalmente, las reacciones enzimáticas y las etapas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se realizan generalmente según procedimientos convencionales en la materia y diversas referencias generales (véase generalmente Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel, y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008)), que se proporcionan en todo este documento. La nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en química analítica y síntesis orgánica descritos más adelante son aquellos muy conocidos y comúnmente empleados en la materia. Técnicas convencionales, o modificaciones de las mismas, se usan para síntesis químicas y análisis químicos.

“Medios de fermentación” o “medio de fermentación” como se usa en el presente documento se refiere a una mezcla sin fermentar antes de la adición de levadura. Los medios de fermentación incluyen, por ejemplo, mostos de fruta y mostos de grano. Los medios de fermentación pueden comprender adicionalmente una fuente de azúcar adicional (por ejemplo, miel, azúcar de caña, azúcar de remolacha, azúcar de maíz, fructosa, sacarosa o glucosa); ácido (por ejemplo, ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico, y mezclas de los mismos) y nutrientes de levadura (por ejemplo, fosfato de diamonio u otra fuente de nitrógeno, vitaminas y similares).

Un “mosto de fruta” como se usa en el presente documento se refiere a una mezcla sin fermentar de zumo de fruta, fragmentos de tallos, pieles de fruta, semillas y/o pulpa producida macerando la fruta. Puede usarse cualquier fruta que contenga azúcar fermentable tal como, por ejemplo, uvas, manzanas, cerezas, melocotones, nectarinas, ciruelas, albaricoques, peras, persimones, piñas, mangos, kiwis, fresas, frambuesas, arándanos, bayas del saúco, moras, arándanos agrios, higos y nísperos. Las frutas pueden secarse, hervirse, escalfarse o procesarse de otro antes del macerado. Un mosto de fruta puede comprender dos o más frutas.

“Mosto de grano” como se usa en el presente documento se refiere a un líquido sin fermentar producido por el macerado de granos y/o vainas de granos. Puede usarse cualquier grano que contenga azúcar fermentable tal como, por ejemplo, cebada, trigo, centeno, cebada, arroz, maíz y avena. Los granos pueden tostarse, descascarillarse o procesarse de otro modo antes del macerado. Un mosto de grano puede producirse a partir de una mezcla que comprende dos o más granos.

“Met10” y “MET10” como se usan en el presente documento se refieren a una subunidad de sulfito reductasa asimilatoria de Saccharomyces. Funcionalmente, un polipéptido MET10 cataliza la conversión de sulfito en sulfuro. Se han caracterizado estructuralmente los polipéptidos MET10, particularmente los polipéptidos MET10 de levadura. Los polipéptidos MET10 contienen un dominio catalítico de sulfito reductasa conservado en la porción del extremo C, además de dominios de unión a FAD y NAD. La porción central del polipéptido contiene un dominio piruvatoferredoxina oxidorreductasa. En los polipéptidos MET10 activos para sulfuro, que pueden catalizar la conversión de sulfito en sulfuro de hidrógeno libre o liberado, el residuo de aminoácido en la posición 662 se ha conservado, y es normalmente una treonina o algunas veces una serina, particularmente en levadura. Los dominios del polipéptido MET10 identificados se representan en la Figura 6.

Como se usa en el presente documento, “MET10” se refiere a ácidos nucleicos y variantes polimórficas de polipéptidos, alelos, mutantes y homólogos entre especies que: (1) tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más de aproximadamente el 80% de identidad de secuencias de aminoácidos, por ejemplo, el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% o mayor identidad de secuencias de aminoácidos, preferentemente sobre una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos, o sobre su longitud completa, con una secuencia de aminoácidos de referencia codificada por un ácido nucleico de MET10 (para una secuencia de ácidos nucleicos de MET10 de levadura véase, por ejemplo, SEC ID Nº: 1, Figura 2 y los números de acceso de GenBank ejemplificados más adelante); (2) se unen a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos policlonales producidos contra un inmunogén que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido MET10 (por ejemplo, codificado por SEC ID Nº: 1) y variantes conservativamente modificadas de los mismos; (3) se hibridan específicamente bajo condiciones de hibridación rigurosas con una cadena no codificante correspondiente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína MET10, y variantes conservativamente modificadas de la misma; (4) tienen una secuencia de ácidos nucleicos que tiene más de aproximadamente el 95%, preferentemente más de aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad de secuencias de nucleótidos, preferentemente sobre una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más nucleótidos, o sobre su longitud completa, con una secuencia de ácidos nucleicos de referencia de MET10. Los ácidos nucleicos y proteínas usados en la invención incluyen tanto moléculas que se producen naturalmente como recombinantes. En algunas realizaciones, los polipéptidos MET10 y polinucleótidos MET10 son de levadura. Secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de MET10 ejemplificadas se exponen en los nº de acceso de Genbank EF058164, EF058165, EF058166, EF058167, EF058168, EF058169, EF058170, EF058171, EF058172, EF058173.

Como se usa en el presente documento, un polipéptido “MET10 activo para sulfuro” puede catalizar la conversión de sulfito en sulfuro de hidrógeno. En levadura, un polipéptido MET10 activo para sulfuro puede tener un residuo de serina o treonina en la posición de aminoácido 662. En cepas de levadura, el aminoácido en la posición 662 en S.

5 cerevisiae está conservado como una treonina o una serina y reside en el siguiente motivo en la región catalítica de sulfito reductasa:

(N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEC ID Nº: 31). Véase la Figura 8.

10 Como se usa en el presente documento, un polipéptido “MET10 inactivo para sulfuro” no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro de hidrógeno libre o liberado. En levadura, un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro no tendrá una treonina en la posición de aminoácido 662 o dentro del motivo (N/K)(R/K)R(V/L)XP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/V)EFD(I/L) (SEC ID Nº: 32), es decir, en el que X no es T. Un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro no tendrá un residuo de treonina o serina en la posición de aminoácido 662.

15 El polipéptido MET10 inactivo para sulfuro tendrá una Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Val, Trp o Tyr en la posición 662 (SEC ID Nº: 5). En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 en un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro no tienen un grupo hidroxilo, por ejemplo, no es Thr, Ser,

o Tyr (SEC ID Nº: 33). En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 en un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro es un aminoácido grande o voluminoso, por ejemplo, Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp,

20 Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp (SEC ID Nº: 34). En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 en un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro es un aminoácido básico o positivamente cargado, por ejemplo, Lys, Arg, His, Gln o Asn (SEC ID Nº: 6). En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición 662 es Lys (SEC ID Nº: 7).

25 Como se usa en el presente documento, una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos de MET10 “exógena” se introduce en una célula de levadura parental o cepa de levadura parental por la acción del hombre. La introducción en la célula de levadura de la secuencia de ácidos nucleicos exógena o secuencia de aminoácidos exógena puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, que incluye procedimientos recombinantes o procedimientos de cultivo de levadura clásicos (por ejemplo, retrocruzamiento).

30 Los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma tanto mono como bicatenaria. El término engloba ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos de esqueleto modificados o enlaces que son sintéticos, que se producen naturalmente y que se producen no naturalmente que

35 tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de un modo similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2-O-metil-ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

40 A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácidos nucleicos particular también engloba variantes conservativamente modificadas de las mismas (por ejemplo, sustituciones de codones degeneradas) y secuencias complementarias, además de la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, pueden lograrse sustituciones de codones degeneradas generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados está sustituida con residuos de base mixtos y/o de desoxiinosina (Batzer y col., Nucleic Acids Res.

45 19:5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini y col., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido y polinucleótido.

Un ácido nucleico “que puede distinguir” como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido(s) que

(1) se hibrida específicamente bajo condiciones de hibridación rigurosas con una cadena no codificante correspondiente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína MET10, y variantes conservativamente modificadas de la misma; o (2) tiene una secuencia de ácidos nucleicos que tiene más de aproximadamente el 80%, 85%, 90%, 95%, preferentemente más de aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad de secuencias de nucleótidos, preferentemente sobre una región de al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más nucleótidos, con un ácido nucleico MET10.

El término “condiciones de hibridación rigurosas” se refiere a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, normalmente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas se hibridan específicamente a mayores temperaturas. Una guía amplia para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). Generalmente, las condiciones rigurosas están seleccionadas para ser aproximadamente 5-10ºC inferiores al punto de fusión térmico I para la secuencia específica a un fuerza iónica Ph definida. La Tf es la temperatura (bajo fuerza iónica definida, Ph, y concentración nucleica) a la que el 50% de las sondas complementarias a la diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tf, el 50% de las sondas están ocupadas en equilibrio). Condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sales sea inferior a aproximadamente ión sodio 1,0 M, normalmente concentración de ión sodio de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura sea al menos aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60ºC para sondas largas (por ejemplo, superiores a 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva es al menos dos veces la referencia, opcionalmente 10 veces la hibridación de referencia. Condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo pueden ser como sigue: 50% de formamida, 5x SSC, y 1% de SDS, incubación a 42ºC, o, 5x SSC, 1% de SDS, incubación a 65ºC, con lavado en 0,2x SSC, y 0,1% de SDS a 65ºC.

Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos si los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto se produce, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico es creada usando la degeneración de codones máxima permitida por el código genético. En tales casos, los ácidos nucleicos normalmente se hibridan bajo condiciones de hibridación moderadamente rigurosas. “Condiciones de hibridación moderadamente rigurosas” a modo de ejemplo incluyen una hibridación en un tampón de 40% de formamida, NaCl 1 M, 1% de SDS a 37ºC, y un lavado en 1X SSC a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos dos veces la referencia. Aquellos expertos habituales reconocerán fácilmente qué condiciones de hibridación y lavado alternativas pueden utilizarse para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.

Los términos “aislado”, “purificado” o “biológicamente puro” se refieren a material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan como se encuentra en su estado nativo. La pureza y homogeneidad se determinan normalmente usando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un ácido nucleico de MET10 aislado se separa de marcos de lectura abiertos que franquean el gen MET10 y codifican proteínas distintas de MET10. El término “purificado” denota que un ácido nucleico o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o proteína es al menos el 85% puro, más preferentemente al menos el 95% puro, y lo más preferentemente al menos el 99% puro.

El término “heterólogo” cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que son divergentes entre sí, que pueden producirse naturalmente en la población por mutación espontánea o transposición genómica, o pueden introducirse artificialmente. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce normalmente recombinantemente, teniendo dos o más secuencias de genes sin relacionar dispuestos para preparar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente. Similarmente, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que son divergentes o no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

Un “vector de expresión” es una construcción de ácido nucleico, generada recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácidos nucleicos especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula huésped. El vector de expresión puede ser parte de un plásmido, virus o fragmento de ácido nucleico. Normalmente, el vector de expresión incluye un ácido nucleico que va a transcribirse operativamente ligado a un promotor.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácido son un mimético químico artificial de un aminoácido que se produce naturalmente correspondiente, además de a polímeros de aminoácidos que se producen naturalmente y polímero de aminoácidos

que se producen no naturalmente.

El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos que se producen naturalmente y sintéticos, además de a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de un modo similar a los aminoácidos que se producen naturalmente. Los aminoácidos que se producen naturalmente son aquellos codificados por el código genético, además de aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato y Ofosfoserina. Análogos de aminoácido se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce naturalmente, es decir, un carbono y que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos modificados con péptidos, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce naturalmente. Miméticos de aminoácidos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de un modo similar a un aminoácido que se produce naturalmente.

Los aminoácidos pueden citarse en el presente documento por cualquiera de sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por símbolos de una letra recomendados por la Comisión de nomenclatura bioquímica IUPAC-IUB. Asimismo, los nucleótidos pueden citarse por sus códigos de una letra comúnmente aceptados.

“Variantes conservativamente modificadas” se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, variantes conservativamente modificadas se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, con secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que una alanina esté especificada por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácidos nucleicos son “variaciones silenciosas” que son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácidos nucleicos en el presente documento que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es generalmente el único codón para metionina, y TGG, que es generalmente el único codón para triptófano) puede modificarse para dar una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita.

En cuanto a secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos o proteínas que altera, añade o deleciona un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una “variante conservativamente modificada” en la que la alteración produce la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son muy conocidas en la técnica. Tales variantes conservativamente modificadas son además de y no excluyen variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos.

Los ocho siguientes grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, el 60% de identidad, preferentemente el 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o el 95% de identidad sobre una región especificada de SEC ID Nº: 1), cuando se comparan y se alinean para la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineamiento manual e inspección visual. Entonces, se dice que tales secuencias son “sustancialmente idénticas”. Esta definición también se refiere al cumplimiento de una secuencia de prueba. Preferentemente, la identidad existe sobre una región que tiene al menos aproximadamente 25 aminoácidos o nucleótidos de longitud, o más preferentemente sobre una región que tiene 50-100 aminoácidos o nucleótidos de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa de secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Si se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de

prueba y de referencia se entran en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se designan parámetros de programa del algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros de programa por defecto, o pueden designarse parámetros alternativos. Entonces, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros de programa. Para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas con ácidos nucleicos y proteínas MET10 se usan los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 y los parámetros por defecto tratados más adelante.

Una “ventana de comparación”, como se usa en el presente documento, incluye referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionado del grupo que consiste en de 20 a 600, normalmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más normalmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en las que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinearse óptimamente las dos secuencias. Los procedimientos de alineamiento de secuencias para la comparación son muy conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), por la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por alineamiento manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., eds. 1995, suplemento).

Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y similitud de secuencias son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se usan, con los parámetros descritos en el presente documento, para determinar el porcentaje de identidad de secuencias para los ácidos nucleicos y proteínas. El software para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible por el Centro nacional de información de biotecnología (véase la página web ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que tanto se aparean como satisfacen alguna puntuación de valor umbral positiva T cuando se alinean como una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul y col., arriba). Estas palabras comunes vecinas iniciales actúan de semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contienen. Las palabras comunes se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en la medida en que la puntuación de alineamiento acumulado pueda aumentarse. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de apareamiento; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos de desapareamiento; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, una matriz de puntuación se usa para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las palabras comunes en cada dirección se mantienen cuando: la puntuación de alineamiento acumulado se cae de la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada tiende a cero o por debajo debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como defectos una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como defectos una longitud de palabra de 3, y esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff& Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)), alineamientos (B) de 50, esperanza (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca por casualidad un apareamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con respecto al ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,2, más preferentemente inferior a aproximadamente 0,01, y lo más preferentemente inferior a aproximadamente 0,001.

Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico sea inmunológicamente reactivo de forma cruzada con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por tanto, un polipéptido es normalmente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos sólo se diferencian por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí bajo condiciones rigurosas, como se describe más adelante. Todavía otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que los mismos cebadores pueden usarse para amplificar la secuencia.

La frase “se hibrida selectivamente (o específicamente) con” se refiere a la unión, duplexado o hibridación de una molécula sólo con una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones de hibridación rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, ADN o ARN celular total o de biblioteca).

Por “célula huésped” se indica una célula que contiene un vector de expresión y soporta la replicación o expresión del vector de expresión. Células huésped pueden ser, por ejemplo, células procariotas tales como E. coli o células eucariotas tales como levadura.

III.: Ácidos nucleicos que codifican MET10

A.: Procedimientos generales de ADN recombinante

La presente invención se basa en técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante y clásica. Generalmente, la nomenclatura y los procedimientos de laboratorio en la tecnología de ADN recombinante descrita más adelante son aquellos muy conocidos y comúnmente empleados en la materia. Técnicas convencionales se usan para la clonación, aislamiento, amplificación y purificación de ADN y ARN. Generalmente, las reacciones enzimáticas que implican ADN ligasa, ADN polimerasa, endonucleasas de restricción y similares se realizan según las especificaciones del fabricante. Textos básicos que desvelan los procedimientos generales de uso en la presente invención incluyen Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008); y Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990).

Para ácidos nucleicos, los tamaños se facilitan tanto en kilobases (kb) como en pares de bases (pb). Éstos son cálculos aproximados derivados de electroforesis en gel de agarosa o de acrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados o de secuencias de ADN publicadas. Para proteínas, los tamaños se facilitan en kilodaltons (kDa) o números de residuos de aminoácidos. Los tamaños de proteínas se estiman a partir de la electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias de aminoácidos derivadas o de secuencias de proteínas publicadas.

Los oligonucleótidos que no están comercialmente disponibles pueden sintetizarse químicamente según el procedimiento de triéster de fosforamidito en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado como se describe en Van Devanter y col., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos es tanto por electroforesis en gel de acrilamida nativa como por HPLC de intercambio aniónico como se describe en Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).

La secuencia de los genes clonados y oligonucleótidos sintéticos puede verificarse después de la clonación usando, por ejemplo, el procedimiento de terminación de cadenas para la secuenciación de moldes bicatenarios de Wallace y col., Gene 16:21-26 (1981).

B. Procedimientos de clonación para el aislamiento de secuencias de nucleótidos que codifican MET10

En general, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican MET10 y homólogos de secuencias de ácidos nucleicos relacionados se clonan en bibliotecas de ADNc y ADN genómico o se aíslan usando técnicas de amplificación con cebadores de oligonucleótidos. Por ejemplo, las secuencias de MET10 se aíslan normalmente de bibliotecas de ácidos nucleicos (genómicas o ADNc) hibridando con una sonda de ácido nucleico, cuya secuencia puede derivarse de SEC ID Nº: 1, o una subsecuencia de la misma. Puede aislarse ARN y ADNc de MET10 de cualquier cepa de levadura.

Variantes polimórficas, alelos y homólogos entre especies de MET10 que son sustancialmente idénticas a MET10 pueden aislarse usando sondas de ácido nucleico MET10 y oligonucleótidos bajo condiciones de hibridación rigurosas, cribando bibliotecas. Alternativamente, pueden usarse bibliotecas de expresión para clonar variantes polimórficas, alelos y homólogos entre especies de MET10 detectando homólogos expresados inmunológicamente con antisueros o anticuerpos purificados preparados contra el dominio de núcleo de MET10 que también reconocen y se unen selectivamente al homólogo de MET10.

Para preparar una biblioteca de ADNc, el ARNm de MET10 puede purificarse a partir de cualquier cepa de levadura Entonces, el ARNm se prepara en ADNc usando transcriptasa inversa, se liga en un vector recombinante y se transfecta en un huésped recombinante para la propagación, cribado y clonación. Los procedimientos para preparar y cribar bibliotecas de ADNc son muy conocidos (véase, por ejemplo, Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook y col., arriba; Ausubel y col., arriba).

Para una biblioteca genómica, el ADN se extrae del tejido y tanto se corta mecánicamente como se digiere enzimáticamente para dar fragmentos de aproximadamente 1-8 kb. Entonces, los fragmentos se separan por centrifugación en gradiente de tamaños no deseados y se construyen en vectores de bacteriófago lambda. Estos vectores y fago se encapsidan in vitro. El fago recombinante se analiza por hibridación en placas como se describe en Benton & Davis, Science 196:180-182 (1977). La hibridación de colonias se lleva a cabo como generalmente se describe en Grunstein y col., PNAS USA., 72:3961-3965 (1975).

Un procedimiento alternativo de aislamiento de ácidos nucleicos de MET10 y sus homólogos combina el uso de cebadores de oligonucleótidos sintéticos y amplificación de un molde de ARN o ADN (véanse las patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis y col., eds, 1990)). Pueden usarse procedimientos tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y reacción en cadena de la ligasa (LCR) para amplificar secuencias de ácidos nucleicos de MET10 directamente a partir de ARNm, de ADNc, de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. Pueden diseñarse oligonucleótidos degenerados para amplificar homólogos de MET10 usando las secuencias proporcionadas en el presente documento. Pueden incorporarse sitios de endonucleasa de restricción en los cebadores. También puede ser útil la reacción en cadena de la polimerasa u otros procedimientos de amplificación in vitro, por ejemplo, para clonar secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas que van a expresarse, para preparar ácidos nucleicos para usarlos como sondas para detectar la presencia de MET10 que codifica ARNm en muestras fisiológicas, para la secuenciación de ácidos nucleicos o para otros fines. Los genes amplificados por la reacción de PCR pueden purificarse en geles de agarosa y clonarse en un vector apropiado.

También pueden usarse técnicas de amplificación usando cebadores para amplificar y aislar ADN o ARN de MET10. Por ejemplo, pueden obtenerse ácidos nucleicos que codifican MET10 o fragmentos del mismo por amplificación de una biblioteca de ADNc de levadura o transcrito inverso de ARN de levadura usando pares de cebadores de ácidos nucleicos aislados que tienen las secuencias expuestas en la Tabla 5.

Estos cebadores pueden usarse, por ejemplo, para amplificar tanto la secuencia de longitud completa como una sonda de uno a varios cientos de nucleótidos, que luego se usa para cribar una biblioteca de ADNc para MET10 de longitud completa.

La expresión génica de MET10 también puede analizarse por técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, transcripción inversa y amplificación de ARNm, aislamiento de ARN total o ARN poli A+, transferencia Northern, transferencia puntual, hibridación in situ, protección de RNasa, sondaje de matrices de microchip de ADN y similares.

Los oligonucleótidos sintéticos pueden usarse para la construcción de genes MET10 recombinantes para su uso como sondas o para la expresión de proteína. Este procedimiento se realiza usando una serie de oligonucleótidos solapantes de normalmente 40-120 pb de longitud, representando tanto las cadenas codificantes como no codificantes del gen. Entonces, estos fragmentos de ADN se hibridan, ligan y clonan. Alternativamente, pueden usarse técnicas de amplificación con cebadores precisos para amplificar una subsecuencia específica del gen MET10. Entonces, la subsecuencia específica se liga en un vector de expresión. Pueden prepararse quimeras de MET10 que combinan, por ejemplo, una parte de MET10 con una parte de un MET10 heterólogo para crear un MET10 funcional quimérico.

El gen que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se clona normalmente en vectores intermedios antes de la transformación en células procariotas o eucariotas para la replicación y/o expresión. Estos vectores intermedios son normalmente vectores procariotas, por ejemplo, plásmidos, o vectores lanzadera. Los ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas MET10 inactivas para sulfuro comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína MET10 inactiva para sulfuro y subsecuencias, homólogos entre especies, alelos y variantes polimórficas de los mismos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado que codifica una proteína MET10 inactiva para sulfuro es SEC ID Nº: 1 o un complemento de la misma.

C. Expresión de un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro

Para obtener expresión de alto nivel de un gen clonado tal como aquellos ADNc que codifican un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, normalmente se subclona una secuencia de ácidos nucleicos de un MET10 inactivo para sulfuro en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción y, si es para un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de unión a ribosoma para la iniciación de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y col. y Ausubel y col. Sistemas de expresión bacteriana para expresar la proteína MET10 inactiva para sulfuro están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp. y Salmonella (Palva y col., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach y col., Nature 302:543-545 (1983). Kits para tales sistemas de expresión están comercialmente disponibles. Sistemas de expresión eucariotas para células de mamífero, levadura y células de insecto son muy conocidos en la técnica y también están comercialmente disponibles.

El promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promotor está preferentemente posicionado a aproximadamente la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heteróloga ya que a partir del sitio de inicio de la transcripción está en su entorno natural. Sin embargo, como se conoce en la técnica, alguna variación en esta distancia puede acomodarse sin pérdida de la función promotora.

Además del promotor, el vector de expresión normalmente contiene una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico que codifica MET10 inactivo para sulfuro en células huésped. Por tanto, un casete de expresión típico contiene un promotor operativamente ligado a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica un MET10 inactivo para sulfuro y señales requeridas para la eficiente poliadenilación del transcrito, sitios de unión a ribosoma y terminación de la traducción. Elementos adicionales del casete pueden incluir potenciadores y, si se usa ADN genómico como gen estructural, intrones con sitios de donantes y aceptores de corte y empalme funcionales.

Además de una secuencia promotora, el casete de expresión también debería contener una región de terminación de la transcripción en la dirección 3' del gen estructural para proporcionar la eficiente terminación. La región de terminación puede obtenerse a partir del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse a partir de genes diferentes.

El vector de expresión particular usado para transportar la información genética en la célula no es particularmente crítico. Puede usarse cualquiera de los vectores convencionales usados para la expresión en células eucariotas o procariotas. Vectores de expresión bacterianos convencionales incluyen plásmidos tales como plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D y sistemas de expresión de fusión tales como GST y LacZ. También pueden añadirse marcas de epítopes a proteínas recombinantes para proporcionar procedimientos convenientes de aislamiento, por ejemplo, c-myc.

Normalmente se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores del SV40, vectores del virus del papiloma y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucariotas a modo de ejemplo incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO I 0/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano del SV40, promotor tardío del SV40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de la polihedrina, u otros promotores que muestran ser eficaces para la expresión en células eucariotas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan amplificación génica tal como timidina cinasa, higromicina B fosfotransferasa y dihidrofolato reductasa.

Los elementos que están normalmente incluidos en vectores de expresión también incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia a antibióticos para permitir la selección de bacterias que alojan plásmidos recombinantes y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucariotas. El gen de resistencia a antibiótico particular elegido no es crítico, son adecuados cualquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica. Las secuencias procariotas se eligen preferentemente de forma que no interfieran con la replicación del ADN en células eucariotas, si fuera necesario.

D. Células huésped y procedimientos de su producción

La invención también proporciona células huésped que no producen sulfuro de hidrógeno o producen bajos niveles de sulfuro de hidrógeno y expresan un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro exógeno, como se describe en el presente documento. Un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 no es una treonina o una serina, se introduce en la célula huésped parental mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando procedimientos recombinantes o de cruce genético. En algunas realizaciones, las células huésped tampoco expresan un polipéptido MET10 activo para sulfuro, es decir, debido a que la secuencia codificante para el polipéptido MET10 activo ha sido inactivado y sustituido con la secuencia codificante para un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro.

Células huésped que producen niveles bajos o disminuidos o reducidos de sulfuro de hidrógeno producen el 50% o menos H2S en comparación con la cepa parental antes de introducir el ácido nucleico que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro. En algunas realizaciones, células huésped que producen niveles bajos o disminuidos de sulfuro de hidrógeno producen el 40%, 30%, 25%, 20% o menos de H2S en comparación con la cepa parental antes de introducir el ácido nucleico que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro.

Las células huésped pueden ser, por ejemplo, eucariotas o procariotas. Las células huésped pueden ser células bacterianas, de mamífero, levadura o de insecto. En algunas realizaciones la célula huésped es una célula de levadura, por ejemplo, una célula de levadura S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarowwia lipolytica o Schizosaccharomyces pombe. Las células de levadura usadas en la producción de bebidas fermentadas, por ejemplo, vino, oporto, madeira, cerveza, champán, etc. (por ejemplo, “levadura de vino”, “levadura de cerveza”, “levadura de champán”, etc.) se usan para la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro exógeno. Cepas de células de levadura para su uso en la preparación de bebidas fermentadas, y que son candidatas para la inactivación de MET10 (es decir, son productoras de sulfuro de hidrógeno), están comercialmente disponibles de numerosas fuentes que incluyen, sin limitación, Lallemand (Lalvin) (Petaluma, CA; en la web lallemandwine.us/products/yeast_chart.php), Red Star (en la web www.redstaryeast.net/), White Labs (Boulder, CO; en la web whitelabs.comlyeast_search.html), Wyeast (Odell, OR; en la web wyeastlab.com),

Kitzinger's, J. Laffort, Vierka, Gervin, SB Active, Unican, Siebel Inst., y Fermentis (en la web fermentis.com/FO/EN/00-Home/10-10_home.asp). Véase, por ejemplo, la web winemaking.jackkeller.net/strains.asp para una lista representativa de cepas de levadura de vino y champán y en byo.com/referenceguide/yeaststrains/ para una lista representativa de cepas de levadura de cerveza.

En algunas realizaciones, la cepa de células de levadura es una cepa de S. cerevisiae. En algunas realizaciones, la cepa de células de levadura de S. cerevisiae es una levadura de vino, por ejemplo, seleccionada de Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montachet, Lallemand K1, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.140.108. Cepas de levadura adicionales que son candidatas para la inactivación de MET10, es decir, para la introducción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, se enumeran en las Tablas 1, 3 y 4.

Se usan procedimientos de transfección convencionales para producir líneas de células bacterianas, de mamífero, levadura o de insecto que expresan grandes cantidades de un proteína MET10 inactiva para sulfuro, que luego se purifican usando técnicas convencionales (véanse, por ejemplo, Colley y col., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, en Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). La transformación de células eucariotas y procariotas se realiza según técnicas convencionales (véanse, por ejemplo, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu y col., eds, 1983).

Puede usarse cualquiera de los procedimientos muy conocidos para introducir secuencias de nucleótidos extrañasen células huésped. Éstos incluyen el uso de transfección con fosfato de calcio, polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas, microinyección, vectores de plasma, vectores víricos y cualquiera de los otros procedimientos muy conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped (véase, por ejemplo, Sambrook y col., arriba). Sólo es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular usado pueda introducir satisfactoriamente al menos un gen en la célula huésped que puede expresar MET10 inactiva para sulfuro. Células huésped mejoradas para no producir sulfuro de hidrógeno (es decir, productoras de H2S nulas) también tendrán generalmente MET10 activo inactivado, sustituido o mutado. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica MET10 activo para sulfuro en la cepa parental puede mutarse en el codón (posiciones de ácido nucleico 1984-1986) que codifica el aminoácido en la posición 662 de manera que este codón no codifique una treonina (o una serina). Técnicas de recombinación homólogas también se usan en la sustitución de un ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 activo para sulfuro con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, como se describe en el presente documento. Véase, por ejemplo, la Figura 3 y Baudin, y col., Nucleic Acids Res (1993) 21(14):3329.

Después de introducir el vector de expresión en las células, las células transfectadas se cultivan en condiciones que favorecen la expresión de MET10 inactivo para sulfuro, que se recupera del cultivo usando técnicas convencionales identificadas más adelante.

Un ácido nucleico de MET10 exógeno que codifica la enzima inactiva también puede transferirse a contextos genéticos novedosos usando tecnologías genéticas de levadura clásicas de aislamiento de esporas, apareamiento de esporas del tipo de apareamiento opuesto y aislamiento de las cepas diploides resultantes. Pueden usarse varias rondas de cruces genéticos para aislar el alelo de MET10 novedoso en una referencia de cepa diferente. No necesitan usarse herramientas recombinantes para la creación de las cepas modificadas. Procedimientos ejemplificados para introducir un ácido nucleico que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro en una célula de levadura huésped usando tecnologías genéticas de levadura clásicas se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6.140.108.

E. Purificación de la proteína MET10

Puede purificarse proteína MET10 que se produce tanto naturalmente como recombinante para su uso en ensayos funcionales. Las proteínas MET10 que se producen naturalmente se purifican, por ejemplo, a partir de levadura y cualquier otra fuente de un homólogo de MET10. MET10 recombinante se purifica a partir de cualquier sistema de expresión adecuado.

MET10 puede purificarse a pureza sustancial por técnicas convencionales, que incluyen precipitación selectiva con sustancias tales como sulfato de amonio; cromatografía en columna, procedimientos de inmunopurificación y otros (véase, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); patente de EE.UU. nº 4.673.641; Ausubel y col., arriba; y Sambrook y col., arriba).

Pueden emplearse varios procedimientos cuando la proteína MET10 recombinante está siendo purificada. Por ejemplo, proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecida pueden fusionarse reversiblemente con MET10. Con el ligando apropiado, MET10 puede adsorberse selectivamente a una columna de purificación y luego liberarse de la columna de una forma relativamente pura. Entonces, la proteína fusionada se elimina por actividad enzimática. Finalmente, MET10 podría purificarse usando columnas de inmunoafinidad.

IV. Determinación de si una cepa de levadura producirá H2S detectando secuencias de ácidos nucleicos de MET10

Los procedimientos de determinación de si una cepa de levadura particular es productora de H2S se describen en el presente documento. Según estos procedimientos, el alelo de MET10 de la cepa de levadura se analiza y se compara con los alelos de MET10 desvelados en el presente documento para determinar si la cepa de levadura es un alta, baja o no productora de H2S. La determinación de la presencia o ausencia de un alelo de MET10 particular se realiza generalmente analizando una muestra de ácido nucleico que se obtiene de una levadura (por ejemplo, del género Saccharomyces) que va a analizarse. Frecuentemente, la muestra de ácido nucleico comprende ADN genómico. También es posible analizar muestras de ARN para la presencia de alelos de MET10.

Las técnicas de detección para evaluar ácidos nucleicos para la presencia de un cambio de una única base implican procedimientos muy conocidos en el campo de la genética molecular. Además, muchos de los procedimientos implican la amplificación de ácidos nucleicos. En la materia se proporciona una amplia orientación para realizar los procedimientos. Referencias a modo de ejemplo incluyen manuales tales como PCR Technology: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N. Y., 1992); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (eds. Innis, y col., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, 1994-2008, Wiley Interscience, que incluyen revisiones suplementarias durante abril de 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed, 2001).

Los procedimientos para detectar cambios de una única base muy conocidos en la técnica frecuentemente suponen uno de varios protocolos generales: hibridación usando oligonucleótidos específicos para secuencia, extensión de cebadores, ligación específica para secuencia, secuenciación o técnicas de separación electroforética, por ejemplo, análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios (SSCP) y de heterodúplex. Ensayos a modo de ejemplo incluyen ensayos de 5'-nucleasa, incorporación de terminador de colorante dirigido a molde, ensayos de oligonucleótidos específicos para alelos de balizas moleculares, ensayos de extensión de una única base y puntuación de SNP por secuencias de pirofosfato en tiempo real. El análisis de secuencias amplificadas puede realizarse usando diversas tecnologías tales como microchips, ensayos de polarización por fluorescencia y espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI). Además de estas metodologías frecuentemente usadas para el análisis de muestras de ácido nucleico para detectar cambios de una única base, cualquier procedimiento conocido en la técnica puede usarse para detectar la presencia de las mutaciones de MET10 descritas en el presente documento.

Aunque los procedimientos normalmente emplean etapas de PCR, también pueden usarse otros protocolos de amplificación. Procedimientos de amplificación adecuados incluyen reacción en cadena de la ligasa (véase, por ejemplo, Wu & Wallace, Genomics 4:560-569, 1988); ensayo de desplazamiento de cadenas (véase, por ejemplo, Walker y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; patente de EE.UU. nº 5.455.166); y varios sistemas de amplificación basados en la transcripción, que incluyen los procedimientos descritos en las patentes de EE.UU. nº 5.437.990; 5.409.818; y 5.399.491; el sistema de amplificación de la transcripción (TAS) (Kwoh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989); y la replicación de secuencia autosostenida (3SR) (Guatelli y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:1874-1878, 1990; documento WO 92/08800). Alternativamente, pueden usarse procedimientos que amplifican la sonda a niveles detectables, tales como amplificación por Q�-replicasa (Kramer & Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli y col., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989). Se proporciona una revisión de procedimientos de amplificación conocidos, por ejemplo, por Abramson y Myers en Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993.

En algunas realizaciones, el alelo de MET10 se detecta usando cebadores de oligonucleótidos y/o sondas. Pueden prepararse oligonucleótidos por cualquier procedimiento adecuado, que incluye síntesis química. Pueden sintetizarse oligonucleótidos usando reactivos e instrumentos comercialmente disponibles. Alternativamente, pueden comprarse de fuentes comerciales. Los procedimientos de síntesis de oligonucleótidos son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Narang y col., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown y col., Meth. Enzymol. 68:109151, 1979; Beaucage y col., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; y el procedimiento de soporte sólido de la patente de EE.UU. nº 4.458.066).

A. Identificación por PCR de alelos de MET10

En algunas realizaciones se usa PCR para amplificar ácidos nucleicos que codifican alelos de MET10. Una visión general de la tecnología aplicable puede encontrarse en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis y col. eds. (1990)) y PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed. (1992)). Además, la tecnología de amplificación se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.683.195 y 4.683.202.

PCR permite la copia, y amplificación resultante, de un ácido nucleico diana, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica MET10. Brevemente, un ácido nucleico diana, por ejemplo, ADN de una muestra que comprende cepas de levadura de interés, se combina con cebadores de sentido directo y de sentido contrario, dNTP, ADN polimerasa y otros componentes de reacción (véase, Innis y col., arriba). El cebador de sentido directo puede hibridarse con la cadena no codificante de una secuencia de ADN de interés. El cebador de sentido contrario puede hibridarse con la

cadena codificante de la secuencia de ADN, en la dirección 3' de la localización en la que el cebador de sentido directo se hibrida con la diana de ADN. En la primera ronda de amplificación, la ADN polimerasa se extiende en los cebadores de sentido inverso y de sentido directo que están hibridados con el ácido nucleico diana. Las primeras cadenas se sintetizan como cadenas largas de longitud indiscriminada. En la segunda ronda de amplificación, los cebadores de sentido inverso y de sentido directo se hibridan con el ácido nucleico diana parental y con las secuencias complementarias sobre las cadenas largas. Entonces, la ADN polimerasa extiende los cebadores hibridados para formar cadenas de longitud discreta que son complementarias entre sí. Las rondas posteriores sirven para amplificar predominantemente las moléculas de ADN de la longitud discreta.

En general, la PCR y otros procedimientos de amplificación usan cebadores que se hibridan con cualquier extremo del ADN de interés. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican alelos de MET10 o fragmentos de los mismos pueden amplificarse usando pares de cebadores de ácido nucleico aislado que tienen las secuencias expuestas en la Tabla 5.

B. Detección de productos amplificados

Los productos amplificados pueden detectarse usando cualquier medio conocido en la técnica que incluye, por ejemplo, análisis de polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP); electroforesis en gel desnaturalizante (véase, por ejemplo, Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY, PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION, W. H. Freeman y Co, Nueva York, 1992, Capítulo 7), secuenciación directa y análisis basado en HPLC. Procedimientos de secuencia adecuados incluyen, por ejemplo, procedimientos basados en secuenciación didesoxi y secuencia de Maxam y Gilbert (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, arriba). Análisis basados en HPLC adecuados incluyen, por ejemplo, HPLC desnaturalizante (dHPLC) como se describe, por ejemplo, en Premstaller y Oefner, LC-GC Europe 1-9 (julio de 2002); Bennet y col., BMC Genetics 2:17 (2001); Schrimi y col., Biotechniques 28(4):740 (2000); y Nairz y col., PNAS USA 99(16):10575-10580 (2002); y HPLC de fase inversa de pares de iones-espectrometría de masas por ionización por electropulverización (ICEMS) como se describe, por ejemplo, en Oberacher y col.; Hum. Mutal. 21(1):86 (2003). Otros procedimientos para caracterizar cambios de una única base en alelos de MET10 incluyen, por ejemplo, extensiones de una única base (véase, por ejemplo, Kobayashi y col., Mol. Cell. Probes, 9:175-182, 1995); análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios como se describen, por ejemplo, en Orita y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989), hibridación de oligonucleótidos específicos para alelo (ASO) (por ejemplo, Stoneking y col., Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991; Saiki y col., Nature 324, 163-166, 1986; documentos EP 235.726; y WO 89/11548); y amplificación específica para secuencias o procedimientos de extensión de cebadores como se describen, por ejemplo, en el documento WO 93/22456; patentes de EE.UU. nº 5.137.806; 5.595.890; 5.639.611; y la patente de EE.UU. nº 4.851.331; ensayos de 5'-nucleasa como se describen en las patentes de EE.UU. nº 5.210.015; 5.487.972; y 5.804.375; y Holland y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280.

V. Procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas

Cepas de levadura que comprenden las secuencias nucleicas de MET10 descritas en el presente documento pueden usarse para reducir los niveles de H2S en bebidas fermentadas (por ejemplo, vino y cerveza).

Según los procedimientos de la invención, células de levadura transformadas con una secuencia de ácidos nucleicos exógena que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro, como se describen en el presente documento, se ponen en contacto con un medio de fermentación (por ejemplo, un mosto de fruta o un mosto de grano) y la mezcla se incuba durante una cantidad de tiempo adecuada (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 días) en un primer recipiente de fermentación adecuado (por ejemplo, un tanque, barril, vasija de barro, tarro, cubeta o recipiente de polietileno) a una temperatura adecuada (por ejemplo, aproximadamente 70-75ºF (21,2-23,9ºC)) para que continúe la fermentación. Entonces, el líquido puede transferirse a un segundo recipiente de fermentación. El segundo recipiente puede o puede no estar cerrado y el contenido se incuba durante una cantidad de tiempo adecuada (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas) a una temperatura adecuada (por ejemplo, aproximadamente 60-65ºF (15,6-18,3ºC)) para que continúe la fermentación anaerobia y el envejecimiento. Entonces, el líquido se transfiere a un tercer recipiente para el trasiego (es decir, clarificación). Se cierra el tercer recipiente y se deja que el sedimento sedimente una cantidad de tiempo adecuada (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas). El trasiego puede repetirse una, dos, tres o más veces antes de embotellar la bebida fermentada. El alelo de MET10 nativo puede reemplazarse tanto usando tecnologías de ADN recombinante como cruzarse a través de estrategias de cultivo clásicas. El alelo de MET10 de UCD932 confiere un color de colonia blanco sobre agar BiGGY, permitiendo que este alelo sea seguido en cruces genéticos y se cribe fácilmente durante la producción para demostrar la implantación satisfactoria de la cepa.

Cuando el vino está transparente y se ha detenido toda la fermentación y el envejecimiento antes del embotellado, trasvasar a botellas de vino y encorchar bien las botellas. Dejar las botellas encorchadas verticales durante 3-5 días y luego guardarlas tumbadas a 55 grados Fahrenheit (12,8ºC) durante seis meses (vino blanco) a una año (vino tinto) antes del muestreo. Si no cumplen las expectativas, dejarlas envejecer otro año o más.

La levadura puede transformarse usando cualquier procedimiento conocido en la materia que incluye, por ejemplo, procedimiento de ADN/PEG con soporte Liac/SS descrito por Gietz y Woods Methods in Enzymology 350: 87-96 (2002); Agatep y col., Technical Tips Online Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the litium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) protocol (1998); y el procedimiento de dos híbridos de levadura descrito en Gietz y col., Mol Cell Biochem 172:67-79 (1997). Los procedimientos para preparar células de levadura que son competentes para la transformación se exponen, por ejemplo, en Dohmen y col. (1991) Yeast 7: 691-692.

VI. Kits

MET10 y sus homólogos son herramientas útiles para la identificación más específica y sensible de cepas de

5 levadura que son bajas productoras de H2S. Por ejemplo, ácidos nucleicos que se hibridan específicamente con ácidos nucleicos de MET10, tales como sondas y cebadores de MET10 (por ejemplo, como se exponen en la Tabla 5), ácidos nucleicos de MET10 (por ejemplo, como se exponen en la Figura 2), se usan para identificar cepas de levadura que son bajas productoras de H2S.

10 Por tanto, en el presente documento se describen kits y disoluciones para detectar los alelos de MET10 descritos en el presente documento. Por ejemplo, se describen kits que incluyen uno o más recipientes de reacción que tienen alícuotas de algunos o todos los componentes de reacción en ellos. Las alícuotas pueden estar en forma líquida o seca. Los recipientes de reacción pueden incluir cartuchos de procesamiento de muestras u otros recipientes que permitan la contención, procesamiento y/o amplificación de muestras en el mismo recipiente. Tales kits permiten la

15 fácil detección de productos de amplificación de la invención en dispositivos de amplificación convencionales o portátiles. Los kits también pueden incluir instrucciones escritas para el uso del kit para amplificar y controlar la amplificación de una muestra diana.

Los kits pueden incluir, por ejemplo, reactivos de amplificación que comprenden cebadores suficientes para

20 amplificar al menos un alelo de MET10, y al menos una sonda para amplificar y detectar la secuencia de polinucleótidos. Además, el kit puede incluir nucleótidos (por ejemplo, A, C, G y T), una ADN polimerasa y tampones apropiados, sales y otros reactivos para facilitar las reacciones de amplificación.

En algunas realizaciones, los kits comprenden recipientes tales como cartuchos de procesamiento de muestra útiles

25 para la rápida amplificación de una muestra como se describe en Belgrader, y col., Biosensors and Bioelectronics 14:849-852 (2000); Belgrader, y col., Science, 284:449-450 (1999); y Northrup, M.A. y col. “A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems” en PCR PROTOCOLS (Sninsky, J.J. y col. (eds.)) Academic, San Diego, Capítulo 8 (1998)).

30 Ejemplos

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la invención reivindicada.

Ejemplo 1: Identificación de genes que afectan la producción de H2S

35 Para entender mejor los mecanismos y vías por los que se forma H2S, y para desarrollar la futura prevención o estrategias de gestión, se realizó un cribado del conjunto de cepas de deleción de levadura, que comprendió 4.827 mutantes, para identificar genes que afectaban la producción de H2S. Se cribó una colección de cepas aisladas nativas de fermentaciones de vino (Mortimer 1994) con el fin de definir la base del sesgo de productor de color de

40 colonias frente a la producción de H2S real. Además, una colección de mutantes nulos para levadura cuya cepa parental es una no productora de H2S se cribó para genes que cuando se mutaron produjeron la elevada formación de H2S. También se evaluaron los posibles efectos aditivos sobre la formación de H2S de estas mutaciones.

Materiales y procedimientos

45 Cepas de levadura y condiciones de cultivo. La cepas de levadura usadas para este estudio y cuyos resultados se presentan se enumeran en la Tabla 1. Las cepas de levadura se mantuvieron y se cultivaron en medio de extracto de levadura-peptona-dextrosa con 2% de glucosa (YPD) (Sherman y col. 1974). Se usó el mismo medio (YPD) con geneticina (G418, 0,2 mg/ml) para el mantenimiento de las cepas de deleción que llevan el marcador

50 G418R.

Tabla 1. Cepas de levadura nativas e industriales

Cepas: Genotipos o descripciones conocidas Referencia o fuente

UCD522: Cepas aisladas industriales UCD

UCD713: Cepas aisladas industriales UCD

UCD819: Cepas aisladas industriales UCD

UCD932 (Ba2): Cepas aisladas nativas UCD

UCD933: Cepas aisladas nativas UCD

Tabla 1. Cepas de levadura nativas e industriales

Cepas: Genotipos o descripciones conocidas Referencia o fuente

UCD934 (Ba25): Cepas aisladas nativas UCD

UCD935: Cepas aisladas nativas UCD

UCD936: Cepas aisladas nativas UCD

UCD937: Cepas aisladas nativas UCD

UCD938 (Ba86): Cepas aisladas nativas UCD

UCD939 (Ba99): Cepas aisladas nativas UCD

UCD940 (Ba111): Cepas aisladas nativas UCD

UCD941: Cepas aisladas nativas UCD

UCD942 (Ba126): Cepas aisladas nativas UCD

UCD943: Cepas aisladas nativas UCD

UCD944: Cepas aisladas nativas UCD

UCD945: Cepas aisladas nativas UCD

UCD946: Cepas aisladas nativas UCD

UCD947: Cepas aisladas nativas UCD

UCD948: Cepas aisladas nativas UCD

UCD949: Cepas aisladas nativas UCD

UCD950 (Ba196): Cepas aisladas nativas UCD

UCD951: Cepas aisladas nativas UCD

UCD952: Cepas aisladas nativas UCD

UCD953: Cepas aisladas nativas UCD

UCD954: Cepas aisladas nativas UCD

UCD955: Cepas aisladas nativas UCD

UCD956 (Ba224): Cepas aisladas nativas UCD

UCD957 (Ba229): Cepas aisladas nativas UCD

UCD958: Cepas aisladas nativas UCD

YLR303W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0met17::G418 Open Biosystems

YGR155W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0cys4::G418 Open Biosystems

YHL031CBY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0 gos1::G418 Open Biosystems

YER060W-A BY4742: MATa his3l1 /eu2l0 lys2l0 ura3l0fcy22::G418 Open Biosystems

YGR138CBY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0tpo2::G418 Open Biosystems

YDR158W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0hom2::G418 Open Biosystems

YJR139C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0hom6::G418 Open Biosystems

YNL315C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0tp11::G418 Open Biosystems

YIL074C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 /ys2l0 ura3l0ser33::G418 Open Biosystems

YNL031C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0hht2::G418 Open Biosystems

YBR095C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0rxt2::G418 Open Biosystems

YLR384C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0iki3::G418 Open Biosystems

YPL035C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2f0 ura3l0ypl035c::G418 Open Biosystems

YDL047W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys3l0 ura3l0sit4::G418 Open Biosystems

YBL046W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0psy4::G418 Open Biosystems

YGL029W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0cgr1::G418 Open Biosystems

ADN y manipulaciones genéticas. Las manipulaciones genéticas que incluyen cruces, esporulación y análisis de tétradas se llevaron a cabo usando procedimientos convencionales (Gunthrie 1991). Las deleciones de genes se confirmaron por PCR usando el cebador directo en la dirección 5' y un cebador inverso interno para el marcador de

5 ruptura de KanMX - JKKanRE. Las condiciones de amplificación fueron del siguiente modo: 30 ciclos de 94ºC durante 2 min, 92ºC durante 45 s, 56ºC durante 30 s, 72ºC durante 1 min y una extensión final a 72ºC durante 7 min. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 5.

Cribado del conjunto de deleción y cepas nativas. El conjunto de deleción (Open Biosystems, Huntsville, AL) y la

10 colección de cepas aisladas nativas se cribaron sobre agar BiGGY, un agar de bismuto-glucosa-glicina-levadura (Nickerson 1953). También se cribaron en medio de zumo de uva sintético “medio de mosto de fruta mínimo” (MMM) (Spiropoulos y col. 2000) inicialmente con 123 mg de equivalentes de nitrógeno/litro. El nivel de nitrógeno se generó usando 0,2 g de L-arginina/litro y 0,5 g de fosfato de amonio/litro.

15 Análisis de la formación de sulfuro de hidrógeno. La producción de sulfuro de hidrógeno se evaluó usando el procedimiento de acetato de plomo (Spiropoulos y col. 2000; Giudici, P., y R. E. Kunkee, 1994). La formación de sulfuro de hidrógeno se detectó inicialmente usando tiras de papel (papel de filtro Whatman de 2 x 10 cm, 3 mm) que previamente había sido tratado con 50 μl de disolución al 5% de acetato de plomo y se dejó secar a temperatura ambiente. Las tiras de acetato de plomo se doblaron por la mitad y se insertaron en tubos de cultivo de 50 ml con la

20 tapa del tubo de cultivo asegurando cualquier de los dos extremos de la tira, encerrando la porción media de la tira de acetato de plomo en el entorno gaseoso sobre el medio líquido. La formación de sulfuro de hidrógeno se midió cualitativamente por el grado de ennegrecimiento de la tira de acetato de plomo. Este cribado fue realizado por Carrie Findleton como parte de su disertación de la tesis de maestría de ciencias.

Todos los positivos se confirmaron usando un procedimiento más sensible y semi-cuantitativo. Se enrolló una tira de

5 papel de filtro Whatman (1,5 x 8,0 cm, 3 mm) y se colocó en una pipeta de plástico sin bulbo de 1 ml y se trató con 250 μl de una disolución al 3% de acetato de plomo. El papel se dejó secar a temperatura ambiente y la columna de acetato de plomo de plástico se unió luego al tubo de cultivo de 50 ml con un tapón de silicona. La formación de sulfuro de hidrógeno se midió por mm de oscurecimiento sobre el papel.

10 En experimentos posteriores, para cuantificar la producción de H2S, se usaron columnas de acetato de plomo empaquetadas, en las que cada mm de ennegrecimiento sobre la columna denotó 4 μg/l de H2S. Las columnas de acetato de plomo se compraron de Figasa International Inc. (Seúl, Corea).

Condiciones de fermentación. Para identificar cepas de levadura y condiciones nutritivas que impactaron en la

15 formación de sulfuro de hidrógeno, cultivos de levadura se cultivaron en 5 ml de medio triple M modificado en tubos de cultivo de 50 ml a 25ºC sobre mesas agitadoras a 120 rpm. El medio de zumo de uva sintético “medio de mosto de fruta mínimo” (MMM) (Giudici y col. 1993) se usó y se modificó a partir de la receta originaria para producir siete composiciones diferentes de nitrógeno y micronutrientes. Se manipularon las adiciones de arginina, fosfato de amonio, y casaminoácidos para ajustar la concentración de nitrógeno, y se ajustaron las adiciones de YNB (base de

20 levadura de nitrógeno sin aminoácidos y sulfato de amonio) para controlar la concentración de nutrientes y vitamina. Las modificaciones de triple M se ilustran en la Tabla 2.

Tabla 2 Composición del medio triple M modificado

Variedad de MMM: Arginina (g/litro) Fosfato de amonio (g/litro) Casaminoácidos (g/litro) YNB (g/litro)

433 g de equivalentes de nitrógeno/litro: 0,8 1 2 1,7

123 g de equivalentes de nitrógeno/litro: 0,2 0,1 2 1,7

123 g de equivalentes de nitrógeno/litro y 1/5 YNB: 0,2 0,1 2 0,34

65 g de equivalentes de nitrógeno/litro. Sin casaminoácidos: 0,2 0,03 0 1,7

65 g de equivalentes de nitrógeno/litro: 0,107 0,015 1 1,7

65 g de equivalentes de nitrógeno/litro y 1/2 YNB: 0,107 0,015 1 0,85

65 g de equivalentes de nitrógeno/litro y 1/3 YNB: 0,107 0,015 1 0,567

Los inóculos de levadura se obtuvieron de colonias de levadura sembradas en placa. Este procedimiento puede

25 haber producido alguna variación en el número de células en la inoculación, pero fue necesario debido al gran número de cepas de levadura implicadas en el procedimiento de cribado preliminar. La formación de sulfuro de hidrógeno se evaluó después de cuatro días por el grado de ennegrecimiento de la tira de acetato de plomo. Las cepas que no se cultivaron en cuatro días se repitieron para asegurar que no había otra variable que se produjera en ausencia de crecimiento.

30 Para las cepas de interés seleccionadas, la formación de sulfuro de hidrógeno se cuantificó usando columnas de acetato de plomo. Para este fin, las fermentaciones se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 300 ml de MMM, con una columna de acetato de plomo asegurada a la parte superior del matraz en un tapón de goma. Para este fin, 123 mg/l de MMM de nitrógeno se usó para imitar con más exactitud las condiciones de zumo

35 de uva de bajo nitrógeno. Las fermentaciones se iniciaron a una densidad de 1,33 x 105 células/ml por inoculación con células de fase estacionaria de un cultivo previamente cultivado en medio triple M de la misma composición. Las fermentaciones se realizaron por triplicado, se incubaron a 25ºC y 120 rpm y se monitorizaron durante siete días por pérdida de peso y oscurecimiento sobre la columna de acetato de plomo.

40 Cribado del conjunto de deleción y cepas aisladas nativas sobre agar BiGGY. Para evaluar la producción de H2S de las cepas de deleción y cepas aisladas nativas, todas ellas se sembraron inicialmente sobre agar BiGGY y se evaluó el color de las colonias. Los colores de las colonias fueron blanco, tostado claro, tostado (color de la cepa parental del conjunto de deleción), marrón claro, marrón o negro (Linderholm y col. 2006). Del conjunto de deleción, cuatro colonias fueron blancas, 258 fueron tostadas claras, 4478 fueron tostadas, 59 fueron marrones claras, 28

45 fueron marrones y una colonia fue negra que oscilaba en el color de colonia de claro a oscuro.

Cribado de cepas aisladas nativas y comerciales en zumo sintético. Treinta cepas aisladas nativas se cribaron en zumo sintético MMM con 123 mg/l, nitrógeno para evaluar la producción de H2S frente al color de la colonia. Las no productoras de H2S (es decir, UCD932, UCD713 UCD819, UCD938, UCD942, UCD954 y UCD956) tuvieron colores de colonias que oscilaron de blancas a marrones claras. Las cepas productoras de H2S oscilaron de tostadas claras (3) a tostadas (10) a marrones claras a marrones (5). Las colonias más oscuras (marrones) oscilaron de 2-6 mm de H2S y están en el intervalo medio de producción. Las tres mayores productoras (más de 10 mm) son tostadas claras, tostadas y marrones claras sobre BiGGY. Las cepas aisladas nativas sobre BiGGY y en MMM se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Cepas aisladas nativas sobre BiGGY y en MMM

Cepa: Color de la colonia H2S (mm)

UCD522: Tostado 4

UCD713: Tostado 0

UCD819: Tostado 0

UCD932: Blanco 0

UCD933: Marrón 3

UCD934: Tostado 5,5

UCD935: Tostado 10,5

UCD936: Marrón 2

UCD937: Tostado claro Traza

UCD938: Tostado 0

UCD939: Tostado claro 14,5

UCD940: Marrón 6

UCD941: Marrón 2

UCD942: Tostado claro 0

UCD943: Marrón claro 3,5

UCD944: Marrón claro Traza

UCD945: Tostado 8

UCD946: Tostado 2

UCD947: Tostado 1,75

UCD948: Tostado 2,5

UCD949: Tostado claro Traza

UCD950: Marrón claro 19

UCD951: Tostado 5,5

UCD952: Tostado 8

UCD953: Marrón claro Traza

UCD954: Marrón claro 0

UCD955: Marrón 4

UCD956: Blanco 0

UCD957: Tostado 9

UCD958: Marrón claro 1

Ejemplo 2: Identificación de mutaciones en el alelo de MET10 de UCD932

10 Como se expone en el Ejemplo 1 anteriormente, UCD932 se identificó como una cepa de levadura que producía de poco a indetectable sulfuro de hidrógeno bajo una variedad de condiciones medioambientales. Esta cepa también produce colonias blancas sobre agar BiGGY, asociadas a baja actividad de sulfito reductasa. Un cribado del conjunto de deleción de las cepas para S. cerevisiae dio cuatro posibles mutaciones que produjeron colonias

15 blancas, codificando todas ellas componentes de sulfito reductasa. Los cruces genéticos revelaron que el fenotipo BiGGY de colonia blanca en UCD932 fue debido a una alteración del gen MET10. La de cepa de deleción de MET10 fue una metionina auxótrofa, pero UCD932 no es una metionina auxótrofa, que indica que la actividad de sulfito reductasa es todavía retenida por la célula. Para definir la base genética de esta baja capacidad de producción de sulfuro se secuenciaron MET10 y varios otros genes en la vía de reducción del sulfato, identificados como que

20 desempeñaban posiblemente una función en la supresión de H2S en S. cerevisiae, (Linderholm y col. 2006). Esto permitiría la identificación de alelos que podrían reemplazarse en cepas de vino productoras de H2S para eliminar la característica de sulfuro no deseable.

Materiales y procedimientos

25 Cepas de levadura y condiciones de cultivo. Las cepas de levadura usadas para este estudio se enumeran en la Tabla 4. Las cepas de levadura se mantuvieron y se cultivaron sobre medio de extracto de levadura-peptonadextrosa con 2% de glucosa (YPD) (Sherman y col. 1974). Se usó el mismo medio (YPD) con geneticina (G418, 0,2 mg/ml) o higromicina (Hph, 0,3 mg/ml) para el mantenimiento de cepas de deleción que llevan el marcador G418R o

30 HphMX. Se prepararon medios mínimos (YNB) con 0,67% de base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos y complementado con casaminoácidos como se recomendó (Sherman). Los medios de privación -met selectivos se prepararon similarmente a YNB sin la metionina.

Tabla 4 Cepas de levadura adicionales

Cepas: Genotipos o descripciones conocidas Referencia o fuente

UCD932 (Ba2): Cepas aisladas nativas UCD

UCD934 (Ba25): Cepas aisladas nativas UCD

UCD938 (Ba86): Cepas aisladas nativas UCD

UCD939 (Ba99): Cepas aisladas nativas UCD

UCD940 (Ba111): Cepas aisladas nativas UCD

UCD942 (Ba126): Cepas aisladas nativas UCD

UCD950 (Ba196): Cepas aisladas nativas UCD

UCD956 (Ba224): Cepas aisladas nativas UCD

UCD957 (Ba229): Cepas aisladas nativas UCD

UCD522: Cepas aisladas industriales UCD

YKR069W BY4742: MATa his3l1 /eu2l0 lys2l0 ura3l0met1::G418 Open Biosystems

YJR137C BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0met5::G418 Open Biosystems

YBR213W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 /ys2l0 ura3l0met8::G418 Open Biosystems

YFR030W BY4742: MATa his3l1 leu2l0 lys2l0 ura3l0met10::G418 Open Biosystems

ALY38: UCD932 MET10S288C Este estudio

ALY39: UCD932 MET10UCD932 Este estudio

ALY95: UCD932 MET10UCD950 Este estudio

ALY72: BY4742 MET10UCD950 Este estudio

ALY40: UCD950 MET10S288C Este estudio

ALY41: UCD950 MET10UCD932 Este estudio

ALY126: UCD950 MET10UCD50 Este estudio

ALY127: UCD939 MET10UCD939 Este estudio

ALY 128: UCD939 MET10S288C Este estudio

ALY130: UCD940 MET10S288C Este estudio

ALY129: UCD940 MET10UCD940 Este estudio

ALY131: UCD940 MET10UCD932 Este estudio

ALY132-1A: UCD522 MET10::KanMX4 Este estudio

ALY133-1B: UCD522 MET10S288C Este estudio

ALY134-1C: UCD522 MET10S288C Este estudio

AL Y135-1D: UCD522 MET10::KanMX4 Este estudio

ALY136-1A: UCD522 MET10UCD522 Este estudio

ALY137-1B: UCD522 MET10::hphNT1 Este estudio

ALY138-1C: UCD522 MET10::hphNT1 Este estudio

ALY139-1D: UCD522 MET10UCD522 Este estudio

ALY140-1A: UCD522 MET10UCD932 Este estudio

ALY141-1B: UCD522 MET10UCD932 Este estudio

ALY142-1C: UCD522 MET10::KanMX4 Este estudio

ALY143-1D: UCD522 MET10::KanMX4 Este estudio

Cribado del conjunto de deleción. El conjunto de deleción de levadura (Open Biosystems, Huntsville, AL) se cribó sobre agar BiGGY, un agar de bismuto-glucosa-glicina-levadura (Nickerson 1953) complementado con 5 casaminoácidos (Sherman 1974). Cada cepa se sembró en placa sobre agar BiGGY y se incubó a 30ºC durante 48 horas. Las colonias resultantes se evaluaron para el color.

Análisis de secuencias. El análisis de secuencias de MET10, HOM2, HOM6, SER33, MET1, MET5 y MET8 se realizó en 169 cepas de levadura nativas e industriales. Se extrajo ADN cromosómico de los sedimentos de células 10 usando el protocolo de Smash y Grab (Hoffman y Winston 1987) y la amplificación de los genes se llevó a cabo usando High Fidelity Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) y los cebadores PCR-MET10-F /PCR-MET10-R para MET10, HOM2-F/HOM2-R para HOM2, HOM6-F/HOM6-R para HOM6, SER33-F/SER33-R para SER33, MET1-F/MET1-R para MET1, MET5-F/MET5-R para MET5 y MET8-F/MET9-R para MET8 (Tabla 5). Las condiciones de amplificación fueron del siguiente modo: 30 ciclos de 94ºC durante 1 min, 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s,

15 68ºC durante 4 min y una extensión final a 68ºC durante 7 min.

Tabla 5. Cebadores de PCR

Cebador: Secuencia (5' - 3') SEC ID Nº:

HOM2

HOM2-F: CACTTAAGTACACATACAAA 35

HOM2-R: GGGTCAGCGAGAGAATT 36

HOM6

HOM6-F: CCTGGTGGTAAAGTTGGG 37

Cebador: Secuencia (5' - 3') SEC ID Nº:

HOM6-R: GATTGTAGAAGATTGAGTAG 38

SER33

SER33-F: GGAATCTCCCAGGTTTAAT 39

SER33-R: GGGCAATCAAAGGCTAT 40

MET1

MET1-F: CGCTAATAAACTCGCTACAAAAG 41

MET1-R: CGTCCTTTTTGCTCAATATCC 42

MET5

MET5-F: GCTGCAAGCAGTTATATAAAGTG 43

MET5-R: AAAACCGAACTAGCCGAAG 44

MET8

MET8-F: AAAATCGCTACAAAGTCCG 45

MET8-R: GCATTGTTGTTCGTTCTCC 46

Cebadores de MET10

PCR-MET10-F: CGGATCCCCAATCACCATAACACTT 47

PCR-MET10-R: GCCGCGGTAGGGTCTTCAGGACGAG 48

MET10-F-KO: CAAATAGTTTCGTTTAGATGG 49

MET10-R-KO: GTATAATGTGATGGTTAGTT 50

MET10-hphMX-F: ACTGTGTTTATCACTTATGGGTCTTTAGAATCC GAATTGTATTTTGATGGCCGCACGG 51

MET10-hphMX-R: AACAATTCAAAAATGTCAGCATATGTATAATA CTCCACATAATCGACAGCAGTATAGCGACCA 52

Cebadores de confirmación

JKKanRE: GGGCGACAGTCACATCAT 53

HYGROB CHK R: TGACGGTGTCGTCCATCAC 54

Toda la secuenciación se llevó a cabo en las Instalaciones de secuenciación del Colegio de ciencias biológicas en la Universidad de California, Davis, usando un analizador genético de electroforesis capilar ABI 3730 y química de secuenciación de ciclos ABI BigDye Terminator versión 3.1 (Foster City, CA), los cebadores usados se enumeran en la Tabla 6. Los datos de secuencias se editaron y se analizaron con el editor de alineamiento de secuencias BioEdit (versión 5.0.9; Nucleic Acids Symp. Ser. 41:95-98).

Tabla 6 Cebadores de secuenciación de MET

Cebador: Secuencia (5' - 3') SEC ID Nº:

MET1

MET1-S1F: TGGGGAGAGTTCTGGTATGCAAG 55

MET1-S2F: CAGATGGTTATCTCAGATAATGGAG 56

MET1-S3F: TTTCTTCAAAGATCACGGATATATT 57

MET1-S1R: GCTATATCACGTTGAGTAGCGG 58

MET1-S2R: GGTACTACACCCTCTGTGACAGTT 59

MET1-S3R: CTCAGTTTTTGGCATTGCCA 60

MET5

MET5-S1F: CCTAATAAACTTCCATTGGTGATTA 61

MET5-S2F: CCGTTTTACAGGGTGTCTCTAAGA 62

MET5-S3F: GACGCGATCTTGACGAAGCT 63

MET5-S4F: GAATCTGGTTACTGGCCATTGT 64

MET5-S5F: CTGAAAAATGACACCGACTTGG 65

MET5-S6F: TGGCTTGCTCTGGATCACTT 66

MET5-S7F: CGATGTCGGTTTAGTTGCTATAGTT 67

MET5-S8F: TGGTAATCAACATTTGGTTATCTCT 68

MET5-S1R: GGGCAACCAGTCATTCTCATAA 69

MET5-S2R: CTTCGACACCCATATCATCTACAG 70

MET5-S3R: CAATTTTCCCATATCAGCGA 71

MET5-S4R: CATCATCAACAGCAGCGCCG 72

MET5-S5R: CTGATCGAAGGCAGCCTTGC 73

MET5-S6R: CATATGGCTCTGAATCAATCAATAA 74

MET5-S7R: TTCACAACTTTTTTGACAGAAGAA 75

MET5-S8R: CGTTAGCAATCTCCAAGGTAGGAA 76

MET8

MET8-S1F: GCAGTGACTTCAAAGACGAATACC 77

MET8-S2F: CTGGAGGACGCTGTCGTCAA 78

MET8-S1R: TCATCTCTTACTAGAGCGCCAA 79

MET8-S2R: GGTCCCAGTTCGGATTGATAA 80

Cebador: Secuencia (5' - 3') SEC ID Nº:

MET10

MET10 SEQ1-F: AGTCATCTTCGAGCAAA 81

MET10 SEQ2-F: TCATGATGGTAAGTTTC 82

MET10 SEQ3-F: TCAACGTCAGAGTGCCATT 83

MET10 SEQ4-F: ATCAGTCGTTGAAGATGTC 84

MET10 SEQ5-F: CTGAGATCTCTGATATTGC 85

MET10 SEQ6-F: TGCAGTAGATTTGAAGAGAT 86

MET10 SEQ7-F: CACACACATCGGCGCT 87

MET10 SEQ1-R: CGGAGTCACGACACCAT 88

MET10 SEQ2-R: GGCTGAAACTTGAGATCTC 89

MET10 SEQ3-R: CTTGACGTAACTTTCTACAG 90

MET10 SEQ4-R: TCATAATCAGCAGGCGTAAC 91

MET10 SEQ5-R: CTTCTCTTCAATGGTTCAAT 92

MET10 SEQ6-R: AGTAGGGCCAGACAAGT 93

Los números de acceso de GenBank para estas secuencias son: UCD932 MET10 (EF058164), UCD938 MET10 (EF058165), UCD939 MET10 (EF058166), UCD940 MET10 (EF058167), UCD942 MET10 (EF058168), UCD956 (EF058169), UCD522 MET10 (EF058170), UCD957 MET10 (EF058171), UCD934 MET10 (EF058172), UCD950 MET10 (EF058173), UCD932 SER33 (EF058174), UCD939 SER33 (EF058175), UCD940 SER33 (EF058176),

5 UCD956 SER33 (EF058177), UCD950 SER33 (EF058178), UCD932 HOM6 (EF058179), UCD932 MET1 (EF058180), UCD939 MET1 (EF058181), UCD940 MET1 (EF058182), UCD950 MET1 (EF058183), UCD956 MET1 (EF058184), UCD956 MET5 (EF058185), UCD932 MET5 (EF058186), UCD940 MET5 (EF058187), UCD939 MET5 (EF058188), UCD932 MET8 (EF058189), UCD939 MET8 (EF058190), UCD940 MET8 (EF058191), UCD950 MET8 (EF058192), UCD956 MET8 (EF058193).

10 Manipulaciones genéticas. Las manipulaciones genéticas que incluyen cruces, esporulación y análisis de tétradas se llevaron a cabo usando procedimientos convencionales (Guthrie 1991).

Plásmidos, manipulaciones de ADN y procedimientos de transformación. En este estudio se usaron los

15 plásmidos pAL51 (MET10S288C), pAL52 (MET10UCD932). Los cebadores, PCR-MET10-F/PCR-MET10-R (Tabla 5), que llevan los sitios de restricción BamHI y SacII, se diseñaron para amplificar MET10 de la cepa de levadura UCD932 y ADN cromosómico de S288C (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido pYC130 (Olesen y col. 2000), es un vector centrómero que lleva el marcador de selección G418R, se digirió con BamHI y SacII (New England Biolabs, Ipswich, MA) para permitir la ligación de MET10. Los plásmidos resultantes, pAL51 (MET10S288C), pAL52 (MET10UCD932), se

20 usaron para la transformación. Se crearon deleciones de genes de MET10 usando una técnica basada en PCR, Figura 3 (Baudin 1993). Un casete de deleción que contiene KanMX (colección de deleción de levadura) con nucleótidos protuberantes de regiones no codificantes en cada lado de MET10 se amplificó por PCR usando cebadores, MET10-F-KO/MET10-R-KO, y el fragmento de PCR lineal se transformó en cepas diploides de levadura UCD522, UCD932, UCD939, UCD940 y UCD950. Por recombinación homóloga, una copia de MET10 intacto se

25 sustituyó con el casete de inactivación que genera cepas que lleva una copia de tanto una copia intacta de MET10 como un marcador KanMX. Todas las cepas, excepto MET10 de UCD522/KanMX, se esporularon luego y aquellas homólogas para G418R se usaron para experimentos adicionales. Las deleciones de genes se confirmaron por PCR usando el cebador directo en la dirección 5' y un cebador inverso interno para el marcador de ruptura de KanMX - JKKanRE.

30 Para inactivar la copia intacta restante de MET10 en MET10 de UCD522/KanMX, un casete HphMX se amplificó a partir de pYC140 linealizado con BamHI (Hansen y col. 2003) usando los cebadores MET10-hphMX-F/MET10hphMX-R, y el fragmento de PCR lineal se transformó en ALY29. Se seleccionó una colonia auxotrófica de metionina que mostraba tanto G418R como HphR y la deleción de HphMX se confirmó por PCR usando el cebador directo en la

35 dirección 5' y un cebador inverso interno para el marcador de ruptura de HphMX - HYGROB CHK_R.

También se crearon cambios de alelo de MET10 usando una técnica basada en PCR (Figura 3) (Baudin 1993). Los alelos de MET10 se amplificaron a partir de S288C, UCD932, UCD939, UCD940, UCD950 y UCD522 usando cebadores MET10-F-KO/MET10-R-KO. Los fragmentos de PCR lineales amplificados a partir de S288C y UCD932

40 se transformaron luego en las cepas auxotróficas de metionina. Los otros fragmentos se transformaron en cepas individuales para crear las cepas de control correspondientes.

Las cepas que mostraron capacidad para cultivarse sobre placas auxotróficas de metionina se seleccionaron y se esporularon para crear cepas homólogas para MET10 para experimentos adicionales. S. cerevisiae se transformó

45 usando el procedimiento de acetato de litio adaptado de Schiestl y Gietz (1989) y E. coli se transformó usando el procedimiento descrito por Inoue y col. (Inoue y col. 1990). INVaF' de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) se usó para las preparaciones de plásmido. Se usó medio Luria-Bertani (Miller 1972) con ampicilina para la selección para células de E. coli transformadas. Condiciones de fermentación. En los experimentos de fermentación, el medio de zumo de uva sintético “medio de

50 mosto de fruta mínimo” (MMM) (Spiropoulos y col. 2000) se usó con 208 mg de equivalentes de nitrógeno/litro. El nivel de nitrógeno se generó usando 0,2 g de L-arginina/litro y 0,5 g de fosfato de amonio/litro. Las fermentaciones se iniciaron a una densidad de 1,33 x 105 células/ml por inoculación con células de fase estacionaria de un cultivo previamente cultivado en medio iniciador MMM. Las fermentaciones se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 300 ml de medio. Cada matraz se equipó con un tapón de silicona con un tubo de acetato de

5 plomo unido. Los matraces se incubaron a 25ºC con agitación a 120 rpm. Las fermentaciones se monitorizaron durante siete días usando la pérdida de peso como un cálculo estimado de la tímida producción.

Resultados

10 Caracterización de la producción de sulfuro de hidrógeno de las cepas de deleción. Con el fin de evaluar la producción de sulfuro de hidrógeno del conjunto entero de cepas de deleción, todas se sembraron inicialmente sobre agar BiGGY y se evaluó el color de las colonias. Las colonias fueron blancas, tostadas claras, tostadas (color de la cepa parental), marrones claras, marrones o negras. Cuatro colonias fueron blancas, 258 fueron tostadas claras, 4478 fueron tostadas, 59 fueron marrones claras, 28 fueron marrones y una colonia fue negra. Los cuatro

15 delectantes que dan colonias blancas fueron en MET10, MET8, MET5 o MET1. Los inventores también identificaron que HOM2, HOM6 y SER33 posiblemente desempeñaban una función en la supresión de la formación de sulfuro de hidrógeno (Linderholm y col. 2006).

Identificación del gen responsable de la blancura en una cepa nativa. UCD932, una cepa nativa aislada de Italia

20 (Mortimer y col. 1994), es una no productora de H2S blanca sobre agar BiGGY. Para identificar el gen que es responsable de su fenotipo blanco se apareó con cada una de las cepas de deleción blancas. Sólo una cepa fracasó en complementar el fenotipo blanco de UCD932, YFR030W BY4742.

Cuando un vector que lleva la copia natural de MET10, pAL51 (MET10S288C), se transformó en UCD932, produjo una

25 cepa de UCD932 que produjo colonias tostadas, pero no condujeron a una formación de sulfuro (Tabla 7). Esto sugirió que más de un gen, posiblemente en combinación con MET10, es responsable del fenotipo de baja producción de H2S de UCD932. Tabla 7

Propiedades de las fermentaciones de producción de sulfuro de hidrógeno transformadas con MET10

Cepasa: Tasa de fermentación máxima (g/h)bcd H2S total (μg)

Vector de UCD932: 0,437 <1

UCD932pMET10S288C: 0,446 <1

UCD932pMET10UCD932: 0,408 <1

a Vector: pYC130; pMET10S288C: pAL51; pMET10UCD932: pAL52b La tasa de fermentación máxima se calculó a partir de los datos de la tasa de fermentación usando momentos de tiempo correspondientes a la disminución más brusca en el peso. c Los valores representan el promedio de determinaciones independientes de dos duplicados. d Las fermentaciones alcanzaron la sequedad (definida por <0,5% de azúcar restante).

30 Análisis de secuencias de genes en la vía de reducción del sulfato. Se demostró previamente que UCD932 llevaba mutaciones en CYS4 y MET6, codificando ambas enzimas importantes en la vía de reducción del sulfato (Linderholm y col. 2006). Sin embargo, la introducción de alelos naturales a esta referencia no alteró la baja característica productora de H2S. Por tanto, fue interesante identificar qué otras mutaciones podría llevar esta cepa en otros genes en la vía. Varios genes de la vía de reducción del sulfato, MET10, HOM2, HOM6, SER33, MET1,

35 MET5 y MET8 se secuenciaron a partir de UCD932, además de varias otras cepas nativas e industriales que varían en color sobre agar BiGGY y en la producción de H2S en zumo sintético (Spiropoulos y col. 2000) para evaluar la diversidad genética de la vía de reducción del sulfato (un alineamiento de secuencias de MET10 de diversas cepas de Saccharomyces se encuentra en la Figura 2). Las diferencias de aminoácidos de MET10p de se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8 Diferencias de aminoácidos de MET10p

Posiciones de aminoácidos: 135 172 314 475 511 590 662 896

Consenso: T Ninguna P D Ninguna Ninguna T P

Modificacióna (Cepas): N (UCD932) T o N (UCD940) T (UCD522, 932, 940, 938, 942,956) A (S288C, UCD934, 957, 950) AorT (UCD939) P o S (UCD940) A (UCD938, 942) I (UCD934, 950,957) T (S288C, UCD932, 938, 939, 940, 942, 956) T o I (UCD522) K (UCD934, 950, 957) E (S288C, UCD522, 932, 938, 940, 942, 956) Q (UCD939) K (UCD932) S (UCD956)

a Cepas con dos posibilidades de aminoácidos indican que la cepa lleva dos alelos.

El análisis de secuencias de MET10 (un componente de la enzima sulfito reductasa) demostró que no se conserva entre cepas de levadura (Tabla 9). Se encontraron seis alelos, diferentes de los de S288C, en las diez cepas que se secuenciaron. Se agruparon aproximadamente por color sobre BiGGY y la producción de H2S. UCD934, UCD957 y UCD950, productores de H2S tostados, llevaron el alelo idéntico. UCD938 y UCD942, no productores de H2S tostados, llevaron el mismo alelo. UCD522 y UCD940, productores de H2S marrones, fueron heterocigóticos, pero ambos alelos fueron idénticos a aquellos encontrados en otras cepas. UCD932 y UCD956, no productores de H2S blancos, y UCD939, un productor de H2S tostado, llevaron cada uno alelos diferentes.

Tabla 9 Propiedades de las fermentaciones de producción de sulfuro de hidrógeno con diferentes MET10

Cepas: Alelo Tasa de fermentación máxima (g/h)abc H2S total (μg)

UCD932: MET10S288C 0,37 <1

MET10UCD932: 0,34 <1

MET10UCD950: 0,41 <1

BY4742: MET10UCD950 0,26 <1

UCD950: MET10S288C 0,42 32

MET10UCD932: 0,40 <1

MET10UCD950: 0,41 29

UCD939: MET10S288C 0,46 <1

MET10UCD932: no viable

MET10UCD939: 0,35 41

UCD940: MET10S288C 0,40 54

MET10UCD932: 0,42 <1

MET10UCU940: 0,42 49

a La tasa de fermentación máxima se calculó a partir de los datos de la tasa de fermentación usando momentos de tiempo correspondientes a la disminución más brusca en el peso.b Los valores representan el promedio de determinaciones independientes de dos duplicados. c Las fermentaciones alcanzaron la sequedad (definida por <0,5% de azúcar restante).

10 Se mostró que los otros genes en la vía de reducción del sulfato estaban más conservados. No hubo diferencias en el aminoácido o secuencia de ADN en HOM2 (codifica beta semi-aldehído deshidrogenasa aspártica), una diferencia de aminoácidos en HOM6 (codifica homoserina deshidrogenasa) en UCD932, una diferencia de aminoácidos en SER33 (codifica 3-fosfoglicerato deshidrogenasa) entre S288C y todas las otras cepas de vino y varias diferencias de aminoácidos en MET1, MET5 y MET8 (todos los componentes de la enzima sulfito reductasa)).

15 Cambio de alelos de MET10. La diversidad genética de los alelos de MET10 y la evidente correlación con la producción de H2S y el color de la colonia soportó la hipótesis de que genes en la vía de reducción del sulfato pueden ser responsables del fenotipo de H2S en cepas de vino, ya que el color sobre agar BiGGY guarda aproximadamente una relación con la producción de H2S mediante la detección de actividad de sulfito reductasa. Por

20 tanto, se evaluó el efecto de MET10 sobre la producción de H2S en cepas productoras de H2S. Los alelos de MET10 de cepas de levadura productoras de H2S se sustituyeron con el alelo de MET10UCD932 (Figura 3). Los genes MET10 nativos en UCD950, UCD940, UCD939, UCD522 y UCD932 se delecionaron con un casete KanMX o HphMX y luego los casetes KanMX o HphMX se sustituyeron con un alelo de MET10 de UCD932, S288C o sus propios alelos como control. Todas las cepas que llevan MET10UCD932 fermentaron a la misma tasa que las cepas parentales y de

25 control, pero se volvieron no productoras de H2S y fueron de color más claro sobre BiGGY. Las cepas que llevan un alelo de tanto S288C como su propio alelo mantuvieron su fenotipo productor de H2S (Tabla 9).

Las cepas UCD939 que llevan el alelo de MET10UCD932 no fueron restauradas a protótrofos de metionina, a diferencia de las otras cepas aisladas de vino y comerciales. Esto puede explicarse por la presencia de otras 30 mutaciones que lleva esta cepa en la vía de reducción del sulfato. UCD939 tiene dos mutaciones en los genes que codifican otras subunidades en la enzima sulfito reductasa. La adición de una tercera mutación puede reducir drásticamente la actividad de la enzima sulfito reductasa, de manera que hay una diminución del sulfuro disponible para incorporarse en aminoácidos que contienen azufre, tales como metionina o cisteína. Por tanto, la cepa no puede cultivarse en placas sin metionina. También puede haber efectos de la acumulación de productos intermedios

35 tóxicos aguas arriba de la sulfito reductasa debido a que la represión de la vía del sulfato ha sido aliviada por la ausencia de aminoácidos que contienen azufre tales como S-adenosilmetionina. Sin embargo, la cepa fue viable cuando el alelo de MET10S288C se sustituyó con su propio alelo, el color de la cepa sobre BiGGY cambió de tostado a blanco y su producción de H2S se redujo significativamente.

40 UCD522, una cepa de vino comercial que ha sido caracterizada como aneuploide (Bakalinsky y Snow 1990), un desequilibrio del número de cromosomas que conduce a muerte celular tras la esporulación. Por tanto, ambos alelos necesitaron deteriorarse individualmente (Figura 3), a diferencia de la inactivación de un alelo, luego esporulación de la cepa para conseguir una inactivación homóloga como se hizo con las otras cepas. Un alelo de MET10 se transformó en las cepas inactivadas y luego se esporuló para conseguir dos cepas que fueron G418R/hphNT1R y dos

cepas que llevaron el alelo de MET10. Cada cepa se usó en los experimentos para observar si había cualquier falta de coherencia debido a las manipulaciones genéticas (Tabla 10). Las cepas se fermentaron a completitud y se comportaron como era de esperar en términos de producción de H2S. Cada una de las cepas que lleva el marcador resistente a fármaco fueron auxótrofas para metionina y no produjeron H2S. Las cepas que llevan tanto el alelo de MET10S288C como MET10UCD522 produjeron H2S y la cepa que lleva MET10UCD932 no produjo H2S.

Tabla 10 Propiedades de fermentaciones de producción de sulfuro de hidrógeno de la cepa heteróloga UCD522

Cepasa: Alelo Tasa de fermentación máxima (g/h)bcd H2S total (μg)

UCD522-1A: met10l::KanMX4 0,35 <1

UCD522-1B: MET10s288C 0,35 16

UCD522-1C: MET10S288C 0,42 33

UCD522-1D: met10fd::KanMX4 0,24 <1

UCD522-1A: MET10UCD522 0,43 26

UCD522-1B: met10f::hphNT1 0,24 <1

UCD522-1C: met10f::hphNT1 0,34 <1

UCD522-1D: MET10UCD522 0,38 4

UCD522-1 A: MET10UCD932 0,36 <1

UCD522-1B: MET10UCD932 0,37 <1

UCD522-1C: met10f::KanMX4 0,36 <1

UCD522-1D: met10f::KanMX4 0,22 <1

a A,B,C,D - designan las diferentes esporas. b La tasa de fermentación máxima se calculó a partir de los datos de la tasa de fermentación usando momentos de tiempo correspondientes a la disminución más brusca en el peso. c Los valores representan el promedio de determinaciones independientes de dos duplicados. d Las fermentaciones alcanzaron la sequedad (definida por <0,5% de azúcar restante).

Los inventores también sustituyeron el casete KanMX en YFR030W BY4742 y UCD932 con el alelo de MET10 de UCD950 y ambas son tostadas sobre agar BiGGY, pero ninguna es productora de H2S. Los cruces entre BY4742 o 10 UCD932 y UCD950 indicaron que hay al menos cuatro a cinco alelos que segregan para la producción de H2S.

Discusión

Una de las posibilidades de las diferencias que se producen naturalmente observadas en la producción de sulfuro en

15 S. cerevisiae es la aparición de alteraciones genéticas de la expresión o actividad de enzimas en la vía de reducción del sulfato. La vía de reducción del sulfato muestra una compleja regulación (Mountain y col. 1991) y un aumento en una actividad enzimática puede estar amortiguada por cambios en la actividad de otras proteínas dentro de la vía.

La investigación previa en el laboratorio de los inventores identificó, en una UCD932 no productora de H2S nativa,

20 varios alelos dentro de la vía de reducción del sulfato. Sin embargo, los inventores demostraron que aquellos alelos particulares solos no son responsables del fenotipo de H2S (Linderholm y col. 2006). En el cribado de los inventores de la colección de deleción de supresores de la formación de H2S, los inventores identificaron varios otros genes en la vía de reducción del sulfato en esa función, HOM2, HOM6, SER33, MET1, MET5, MET8 y MET10 (Linderholm y col. 2006). Cuando aquellos genes se secuenciaron en UCD932 y otras cepas de levadura nativas e industriales que

25 varían en la producción de H2S, se reveló que UCD932 llevaba diferentes alelos en cinco de los nueve genes, que incluyen CYS4 y MET6 (Linderholm y col. 2006). Hubo muchos alelos de MET10 encontrados dentro de la colección de cepas que se secuenció.

En este estudio se demostró que MET10 desempeña una función importante en la formación, aunque solo no es

30 responsable del fenotipo de no formación de H2S en UCD932; altera espectacularmente el fenotipo de H2S en otras cepas productoras de H2S. En los experimentos anteriormente descritos, MET10UCD932 cambió satisfactoriamente alelos nativos en tres cepas productoras de H2S y esto las cambió a no productoras de H2S. Estos resultados tienen muchas implicaciones positivas para la industria del vino debido a la capacidad para construir cepas comerciales con producción de azufre reducida en cualquier contexto genético transfiriendo los alelos apropiados o para predecir la

35 característica de producción de H2S para cualquier cepa de Saccharomyces cerevisiae. Ambas técnicas serían bastante simples y útiles para los enólogos.

Los experimentos para cambiar MET10UCD932 en UCD939 fueron insatisfactorios; MET10UCD932 de UCD939 no fue viable sobre placas deficientes en metionina. Sin embargo, puede explicarse por otras mutaciones que lleva en la vía 40 de reducción del sulfato. UCD939 lleva dos mutaciones en los genes que codifican otras subunidades en la enzima sulfito reductasa y, aunque no era una auxótrofa para metionina, la adición de una tercera mutación puede reducir drásticamente la actividad de forma que se convierte en auxótrofa para metionina debido a que las enzimas en la

dirección 3' no pueden reforzar suficientemente su actividad para compensarlo. La regulación de la reducción de sulfato por aminoácidos que contienen azufre también puede fracasar debido a que la cepa ya no puede producir metionina y los productos intermedios tóxicos pueden acumularse por encima de las enzimas sulfito reductasa y también hacer la cepa inviable.

5 UCD522 se caracterizó como una cepa aneuploide (Bakalinsky y Snow 1990). Cuando el gen MET10 se secuenció en UCD522, se observó que UCD522 es una cepa heterocigótica, lleva dos alelos de MET10. Puede haber algún tipo de asociación entre los componentes que condujeron a la incapacidad para manipularlo genéticamente como las otras cepas. Es posible que se forme algún tipo de complejo entre los alelos de MET10 o proteínas que codifica que

10 no permita que se secrete apropiadamente durante la esporulación si sólo uno de los alelos se deleciona. Sin embargo, cuando cada alelo es sustituido individualmente, la cepa puede esporular apropiadamente. MET10UCD932 de UCD522 esporuló para dar dos cepas que fueron G418R/hphNT1R y auxótrofas para metionina y dos cepas que fueron sensibles a fármacos y llevaron el alelo de MET10. Cada cepa fermentó hasta completitud y su característica de H2S fue como era de esperar.

15 Ejemplo 3: Caracterización adicional del alelo de MET10p de UCD 932

Como se demuestra en los ejemplos anteriormente, el alelo de MET10 presente en la cepa de levadura UCD932 puede convertir una cepa productora de alto sulfuro de hidrógeno (H2S) en una cepa que no produce H2S detectable. 20 Esto se mostró claramente con las cepas de alta producción UCD522 y UCD950, que produjeron H2S no detectable cuando llevan el alelo de MET10 de UCD932. La capacidad para convertir una cepa en una baja productora de H2S tiene implicaciones en cualquier industria que usa levadura que incluye las industrias del vino, cerveceras y de etanol como combustible. Además de presentar un problema para el producto final añadiendo un fuerte olor a huevo podrido, el CO2 creado en la fermentación es frecuentemente un subproducto útil, tanto para ser vendido como el

25 propio gas como para usarse como un gas motor para el movimiento del producto (fabricación de cerveza). Por tanto, la prevención de que el gas huela a huevos podridos tiene claros beneficios.

El trabajo previo determinó que los alelos de MET10 de UCD932 y UCD950 se diferencian en seis nucleótidos, cinco de cuyos cambios producen cambios en la secuencia de proteínas primaria (véase la Figura 2). Para caracterizar

30 adicionalmente el alelo de MET10 de UCD932, los alelos nativos de MET10 se clonaron en el vector lanzadera pUG6. Se usó la técnica de mutagénesis por PCR Quick Change para hacer cambios de un único nucleótido (véase, por ejemplo, Cormack, B. y Castano, I. (2002) Introduction of Point Mutations into Cloned Genes. Methods in Enzymology (350) 199-218). En reacciones separadas, la técnica se usó para convertir una diferencia de nucleótido en el nucleótido similar del otro alelo. Por ejemplo, MET10 de UCD932 tiene una adenina en la posición 404,

35 mientras que UCD950 tiene una citosina. Se encontró que el cambio de la citosina de UCD950 en la posición 1985 por una adenina era necesario y suficiente para la pérdida de producción de sulfuro en la referencia de UCD950 (Tabla 11). La conversión de la adenina en el alelo de UCD932 a la citosina de 950 eliminó la capacidad de la proteína UCD932 para eliminar la producción de sulfuro (Tabla 11). Por tanto, el cambio único de la treonina en la posición 662 a un residuo de lisina produce la creación de una proteína Met 10 modificada que conduce a liberación

40 reducida de sulfuro.

Tabla 11 Producción de H2S por diferentes alelos de MET10

Alelo de MET10: Nucleótido en 1985 Referencia de cepa ¿Produce H2S?

UCD932: Adenina UCD522 No

UCD932: Adenina UCD932 No

UCD932: Adenina UCD940 No

UCD932: Adenina UCD950 No

UCD950: Citosina UCD522 Sí

UCD950: Citosina UCD932 No*

UCD950: Citosina UCD940 Sí

UCD950: Citosina UCD950 Sí

UCD932 1985 A-C: Citosina UCD522 Sí

UCD932 1985 A-C: Citosina UCD932 No*

UCD932 1985 A-C: Citosina UCD940 Sí

UCD932 1985 A-C: Citosina UCD950 Sí

UCD950 1985 C-A: Adenina UCD522 No

UCD950 1985 C-A: Adenina UCD932 No

UCD950 1985 C-A: Adenina UCD940 No

UCD950 1985 C-A: Adenina UCD950 No

* La referencia de cepa 932 tiene otros determinantes de la producción de H2S y no produce H2S bajo ninguna condición probada.

Ejemplo 4: Diferencias alélicas en la posición 1985 del gen MET10 determinan la producción de sulfuro de hidrógeno por Saccharomyces cerevisiae

El alelo de MET10 de la cepa UCD932 conduce a la incapacidad para producir sulfuro de hidrógeno (H2S) cuando se usa en una estrategia de sustitución de alelos para sustituir el alelo nativo en cepas aisladas comerciales y nativas de levadura de vino. Se encontró que este alelo contenía varios cambios de pares de bases que conducían a diferencias en las secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Estos cambios de aminoácido se han evaluado para determinar cuál(es) impacta(n) sobre la capacidad para producir H2S.

Para identificar la mutación exacta o combinación de mutaciones responsables de estas espectaculares diferencias en la producción de H2S, los inventores clonaron los alelos de MET10 de UCD932 y UCD950 y convirtieron sistemáticamente cada diferencia de una única base en la base del alelo opuesto usando mutagénesis dirigida a sitio. Los alelos resultantes fueron idénticos al alelo parental, con la excepción del cambio de una única base cambiada. Entonces, los alelos modificados se insertaron de nuevo en ambas cepas y se usó agar BiGGY como indicador de un cambio en la reducción de sulfito y probablemente la producción de H2S. Un cambio de una única base en la posición 1985 se identificó por este cribado como la mutación responsable del cambio en el color de la colonia. Estas cepas se examinaron para la producción de H2S por duplicado durante fermentaciones a pequeña escala en zumo de vino sintético. Se inocularon 10 ml de medio de vino sintético con las cepas respectivas y el H2S se detectó usando columnas de acetato de plomo después de cuatro días de fermentación. El alelo de MET10 de UCD950 sin cambiar y el alelo de UCD932 con la mutación para el alelo de UCD950 en la posición 1985 (932 MET10 1985 A-C) produjo la producción de H2S, mientras que el alelo sin cambiar MET10 de UCD932 y el alelo de UCD950 con el cambio a UCD932 en la posición 1985 (950 MET10 1985C-A) produjo producción de H2S no detectable. Estos resultados indican que el cambio de una única base en la posición 1985 es un determinante clave de la diferencia en la producción de H2S de estos alelos. Entonces, estos resultados fueron reforzados examinando la producción de H2S cuando los alelos de un único mutante se ubicaron en dos cepas UCD522 y UCD940comerciales de alta producción de H2S. Ambas de estas cepas produjeron H2S con el alelo 932 MET10 1985A-C, pero no se detectó H2S con el alelo 950 MET10 1985C-A. Los resultados se resumen en la Tabla 11, anteriormente.

Este estudio demuestra que un cambio de un único par de bases en la posición 1985 en el alelo de MET10 dicta la producción de sulfuro de hidrógeno. La diferencia de nucleótidos en 1985 cambia el aminoácido codificado, por tanto, cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos de alrededor que cambia el aminoácido codificado probablemente también eliminará la producción de H2S. La treonina presente en los alelos de alta producción puede actuar de punto regulador que cambia el flujo de la vía ya que los residuos de aminoácidos que contienen un grupo fosfato pueden regularse por fosforilación. Se predice que el residuo de aminoácido 662 está dentro del dominio catalítico de sulfito reductasa (Figura 6). El análisis de la estructura putativa de la proteína con este cambio (Figura 7) indica que la estructura global de la proteína está sin alterar, pero el área local del sitio activo que rodea este cambio de residuo está afectado. Por tanto, este cambio sólo modifica ligeramente la estructura de la proteína.

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bisson, Linda F. Linderholm, Angela Dietzel, Kevin L. The Regents of the University of California

<120> Composiciones y procedimientos para reducir niveles de H2S en bebidas fermentadas

<130> 023070-177920PC

<140> WO aún no asignado

<141> Aún no asignado

<150> US 60/918.616

<151>

<150> US 60/959.366

<151>

<160> 93

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1

<211> 3108

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD932

<400> 1

<210> 2

<211> 3108

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD950

<400> 2

<210> 3

<211> 1035

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia conseso de subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura inactiva por sulfuro (Met 10, MET10)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (135)

<223> Xaa = Thr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (172)

<223> Xaa = Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (511)

<223> Xaa = Thr o He

<220>

<221> MOD_RES

<222> (590)

<223> Xaa = Glu o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (662)

<223>

<400> 3

<210> 4

<211> 1035 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura 10 inactiva por sulfuro modificada (Met 10, MET10) basada en la secuencia de la cepa UCD932

<220>

<221> MOD_RES

<222> (662) 15 <223>

<400> 4

<210> 5

<211> 1035 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura 10 inactiva por sulfuro (Met 10, MET10)

<220> <221> MOD_RES

<222> (135)

<223> Xaa = Thr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (172)

<223> Xaa = Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (511)

<223> Xaa = Thr o He

<220>

<221> MOD_RES

<222> (590)

<223> Xaa = Glu o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (662)

<223>

<400> 5

<210> 6

<211> 1035 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> MOD_RES

<222>: (135) 15 <223> Xaa = Thr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222>: (172) 20 <223> Xaa = Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (511)

<223> Xaa = Thr o Ile

5 <220>

<221> MOD_RES

<222> (590)

<223> Xaa = Glu o Lys

10 <220>

<221> MOD_RES

<222> (662)

<223> Xaa = Lys, Arg, His, Gin o Asn

15 <400> 6

<210> 7

<211> 1035

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura inactiva por sulfuro (Met 10, MET10)

<220>

<221> MOD_RES

<222> (135)

<223> Xaa = Thr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (172)

<223> Xaa = Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (511)

<223> Xaa = Thr o Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (590)

<223> Xaa = Glu o Lys

<400> 7

<210> 8

<211> 3108 5 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa S288c 10

<400> 8 <210> 9

<211> 3108 5 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD522 10

<400> 9

<210> 10

<211> 3108

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD934

<400> 10 <210> 11

<211> 3108

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae 5

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD938 <210> 12

<211> 3108 5 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD939 10

<400> 12

<210> 13

<211> 3108

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD940

<400> 13 <210> 14

<211> 3108

<212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae 5

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD942 <210> 15

<211> 3108 5 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD956 10

<400> 15 <210> 16

<211> 3108 5 <212> ADN

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD957 10

<400> 16

<210> 17

<211> 1035

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa S288c

<400> 17

<210> 18

<211> 1035 5 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD932 10

<400> 18

<210> 19

<211> 1035 5 <212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<220>

<223> subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de cepa UCD950 10

<400> 19

<210> 20

<211> 50 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de ADN que rodea el resto 662 de la subunidad alfa 10 de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelos de la cepa S288c y UCD950

<400> 20 ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt gttacgcctg ctgattatga 50

15 <210> 21 <211> 50

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de ADN que rodea el resto 662 de la subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelo de la cepa UCD932

<400> 21 ttcgtcgtga aagttaaaga aaatagacgt gttaagcctg ctgattatga 50

<210> 22

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de ADN que rodea el resto 662 de la subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelos de la cepa S288c y UCD950

<400> 22 aatagacgtg ttacgcctgc tgattat 27

<210> 23

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<400> 23 aatagacgtg ttaagcctgc tgattat 27

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de aminoácidos que rodea el resto 662 de la subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10), alelos de las cepas S288c, UCD932 y UCD950

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)

<223> Xaa = Thr o Lys

<400> 24

<210> 25

<211> 50

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subsecuencia de región catalítica de subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10) de la cepa UCD932 de Saccharomyces cerevisiae

<400> 25 <210> 26

<211> 50 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subsecuencia de región catalítica de subunidad alfa de sulfito 10 reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10) de la cepa S288c de Saccharomyces cerevisiae

<400> 26

<210> 27

<211> 50

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 20

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subsecuencia de región catalítica de subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10) de Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis)

25 <400> 27

<210> 28 30 <211> 50

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subsecuencia de región catalítica de subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10) de Kluyveromyces lactis

<400> 28

10 <210> 29

<211> 50

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subsecuencia de región catalítica de subunidad alfa de sulfito reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10) de Yarowwia lipolytica

<400> 29 20

<210> 30

<211> 50 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: subsecuencia de región catalítica de subunidad alfa de sulfito 30 reductasa asimiladora de levadura (Met 10, MET10) de Schizosaccharomyces pombe

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo de levadura conservado en región catalítica de sulfito reductasa activa por sulfito

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)

<223> Xaa = Asn o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)

<223> Xaa = Arg o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)

<223> Xaa = Val o Leu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)

<223> Xaa = Ala, Asp o Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)

<223> Xaa = Asp, Asn o Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)

<223> Xaa = Tyr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)

<223> Xaa= Ile o Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)

<223> Xaa = Ile o Leu

<400> 31

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)

<223> Xaa = Asn o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)

<223> Xaa = Arg o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)

<223> Xaa = Val o Leu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)

<223>

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)

<223> Xaa = Ala, Asp o Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)

<223> Xaa = Asp, Asn o Glu

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)

<223> Xaa = Tyr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)

<223> Xaa= Ile o Val

<220>

<221> MOD_RES

<222> (20)

<223> Xaa = Ile o Leu

<400> 32

<210> 33

<211> 1035

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> MOD_RES

<222> (135)

<223> Xaa = Thr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (172)

<223> Xaa = Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (511)

<223> Xaa = Thr o Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (590)

<223> Xaa = Glu o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (662)

<223>

<400> 33

<210> 34

<211> 1035

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> MOD_RES

<222> (135)

<223> Xaa = Thr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (172)

<223> Xaa = Ala o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (511)

<223> Xaa = Thr o Ile

<220>

<221> MOD_RES

<222> (590)

<223> Xaa = Glu o Lys

<220>

<221> MOD_RES

<222> (662)

<223>

<400> 34

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR HOM2-F

<400> 35 cacttaagta cacatacaaa 20

<210> 36

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR HOM2-R

<400> 36 gggtcagcga gagaatt 17

<210> 37

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR HOM6-F

<400> 37 cctggtggta aagttggg 18

<210> 38

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR HOM6-R

<400> 38 gattgtagaa gattgagtag 20

<210> 39

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR SER33-F

<400> 39 ggaatctccc aggtttaat 19

<210> 40

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR SER33-R

<400> 40 gggcaatcaa aggctat 17

<210> 41

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET1-F

<400> 41 cgctaataaa ctcgctacaa aag 23

<210> 42

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET1-R

<400> 42 cgtccttttt gctcaatatc c 21

<210> 43

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET5-F

<400> 43 gctgcaagca gttatataaa gtg 23

<210> 44

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET5-R

<400> 44 aaaaccgaac tagccgaag 19

<210> 45

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET8-F

<400> 45 aaaatcgcta caaagtccg 19

<210> 46

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET8-R

<400> 46 gcattgttgt tcgttctcc 19

<210> 47

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR PCR-MET10-F

<400> 47 cggatcccca atcaccataa cactt 25

<210> 48

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR PCR-MET10-R

<400> 48 gccgcggtag ggtcttcagg acgag 25

<210> 49

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET10-F-KO

<400> 49 caaatagttt cgtttagatg g 21

<210> 50

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET10-R-KO

<400> 50 gtataatgtg atggttagtt 20

<210> 51

<211> 58

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET10-hphMX-F

<400> 51 actgtgttta tcacttatgg gtctttagaa tccgaattgt attttgatgg ccgcacgg 58

<210> 52

<211> 63

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de PCR MET10-hphMX-R

<400> 52

<210> 53

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de confirmación de PCR JKKanRE

<400> 53 gggcgacagt cacatcat 18

<210> 54

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de confirmación de PCR HYGROB CHK_R

<400> 54 tgacggtgtc gtccatcac 19

<210> 55

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET1-S1F

<400> 55 tggggagagt tctggtatgc aag 23

<210> 56

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial < 220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET1-S2F

<400> 56 cagatggtta tctcagataa tggag 25

<210> 57

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET1-S3F

<400> 57 tttcttcaaa gatcacggat atatt 25

<210> 58

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET1-S1R

<400> 58 gctatatcac gttgagtagc gg 22

<210> 59

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET1-S2R

<400> 59 ggtactacac cctctgtgac agtt 24

<210> 60

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET1-S3R

<400> 60 ctcagttttt ggcattgcca 20

<210> 61

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S1F

<400> 61 cctaataaac ttccattggt gatta 25

<210> 62

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S2F

<400> 62 ccgttttaca gggtgtctct aaga 24

<210> 63

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S3F

<400> 63 gacgcgatct tgacgaagct 20

<210> 64

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S4F

<400> 64 gaatctggtt actggccatt gt 22

<210> 65

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S5F

<400> 65 ctgaaaaatg acaccgactt gg 22

<210> 66

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S6F

<400> 66 tggcttgctc tggatcactt 20

<210> 67

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S7F

<400> 67 cgatgtcggt ttagttgcta tagtt 25

<210> 68

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S8F

<400> 68 tggtaatcaa catttggtta tctct 25

<210> 69

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S1R

<400> 69 gggcaaccag tcattctcat aa 22

<210> 70

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S2R

<400> 70 cttcgacacc catatcatct acag 24

<210> 71

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S3R

<400> 71 caattttccc atatcagcga 20

<210> 72

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S4R

<400> 72 catcatcaac agcagcgccg 20

<210> 73

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S5R

<400> 73 ctgatcgaag gcagccttgc 20

<210> 74

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S6R

<400> 74 catatggctc tgaatcaatc aataa 25

<210> 75

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S7R

<400> 75 ttcacaactt ttttgacaga agaa 24

<210> 76

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET5-S8R

<400> 76 cgttagcaat ctccaaggta ggaa 24

<210> 77

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET8-S1F

<400> 77 gcagtgactt caaagacgaa tacc 24

<210> 78

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET8-S2F

<400> 78 ctggaggacg ctgtcgtcaa 20

<210> 79

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET8-S1R

<400> 79 tcatctctta ctagagcgcc aa 22

<210> 80

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET8-S2R

<400> 80 ggtcccagtt cggattgata a 21

<210> 81

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ1 -F

<400> 81 agtcatcttc gagcaaa 17

<210> 82

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ2-F

<400> 82 tcatgatggt aagtttc 17

<210> 83

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ3-F

<400> 83 tcaacgtcag agtgccatt 19

<210> 84

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ4-F

<400> 84 atcagtcgtt gaagatgtc 19

<210> 85

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ5-F

<400> 85 ctgagatctc tgatattgc 19

<210> 86

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ6-F

<400> 86 tgcagtagat ttgaagagat 20

<210> 87

<211> 16

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ7-F

<400> 87 cacacacatc ggcgct 16

<210> 88

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ1 -R

<400> 88 cggagtcacg acaccat 17

<210> 89

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ2-R

<400> 89 ggctgaaact tgagatctc 19

<210> 90

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ3-R

<400> 90 cttgacgtaa ctttctacag 20

<210> 91

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ4-R

<400> 91 tcataatcag caggcgtaac 20

<210> 92

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ5-R

<400> 92 cttctcttca atggttcaat 20

<210> 93

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

5 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador de secuenciación de MET MET10-SEQ6-R

<400> 93

agtagggcca gacaagt 17 10

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento para reducir niveles de H2S en un medio de fermentación, procedimiento que comprende poner en contacto el medio de fermentación con una célula de levadura que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5).
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

a) se produce una bebida fermentada, en el que la bebida fermentada está seleccionada opcionalmente de vino, cerveza, champán, oporto y madeira; b) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; c) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; d) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; e) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; f) se produce un producto de fermentación que tiene niveles no detectables de H2S; g) la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae; h) el medio de fermentación está seleccionado del grupo que consiste en: un mosto de fruta y un mosto de grano; o i) el medio de fermentación es un mosto de fruta de zumo de uva.
3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la célula de levadura es una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.
4.

Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), y en el que el polinucleótido está operativamente ligado a una secuencia de control de la expresión.
5.

El vector de expresión de la reivindicación 4, en el que el polinucleótido:

a) codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; b) codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; c) codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; o d) comparte al menos 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº:

1.
6.

Una célula huésped que comprende un vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5.
7.

La célula huésped de la reivindicación 6, en el que la célula es una célula de levadura o es una célula de Saccharomyces cerevisiae.
8.

Un medio de fermentación que comprende una célula de levadura mejorada que no produce sulfuro de hidrógeno que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), en el que una célula parental de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno.
9.

El medio de fermentación que comprende una célula de levadura de la reivindicación 8, en el que:

a) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; b) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; c) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; d) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; e) la célula de levadura es una célula de Saccharomyces cerevisiae; o f) la célula de levadura es una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126,

Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.
10.

Un medio de fermentación que comprende un cultivo de células de levadura mejoradas que produce niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno que comprende una población de células de levadura, comprendiendo las células de levadura un polinucleótido exógeno que codifica un polipéptido MET10 que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), en el que el cultivo de células de levadura mejoradas produce sulfuro de hidrógeno reducido en comparación con un cultivo de células parentales.
11.

El medio de fermentación que comprende un cultivo de células de levadura de la reivindicación 10, en el que:

a) el cultivo no produce niveles detectables de sulfuro de hidrógeno; b) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; c) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; d) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; e) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; f) la población de células de levadura comprende células de Saccharomyces cerevisiae; o g) la población de células de levadura es de una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.
12.

Un procedimiento de producción de una célula de levadura mejorada que produce niveles reducidos de sulfuro de hidrógeno, procedimiento que comprende sustituir un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido MET10 activo para sulfuro con un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro introduciendo en un padre de la célula de levadura un polinucleótido que codifica un polipéptido MET10 inactivo para sulfuro que no cataliza la conversión de sulfito en sulfuro, en el que el aminoácido en la posición 662 del polipéptido MET10 inactivo para sulfuro es Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Val, Trp o Tyr (SEC ID Nº: 5), en el que el padre de la célula de levadura mejorada produce sulfuro de hidrógeno.
13.

El procedimiento de la reivindicación 12, en el que:

a) el polinucleótido que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se introduce recombinantemente; b) el polinucleótido que codifica el polipéptido MET10 inactivo para sulfuro se introduce por retrocruzamiento; c) la célula de levadura mejorada no produce niveles detectables de sulfuro de hidrógeno; d) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 34, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Val, Phe, Tyr o Trp; e) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 6, en el que X en la posición 662 es Lys, Arg, His, Gln o Asn; f) el polinucleótido codifica un polipéptido MET10 de SEC ID Nº: 7, en el que X en la posición 662 es lisina; g) el polinucleótido comparte al menos el 95% de identidad de secuencias con una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1; h) la célula de levadura mejorada comprende células de Saccharomyces cerevisiae; o i) la célula de levadura mejorada es de una cepa de levadura de vino seleccionada del grupo que consiste en: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montrachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Ba126, Ba137, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb19 y Bb22.

Figura 4

Apilamiento: Comparación de secuencias de aminoácidos de la proteína MET10 en las cepas S288C, UCD932 y 5 UCD950.

MSF: 1036 Tipo: P Comprobación: 6465 ..

Nombre: S288C Longitud: 1036 Comprobación: 9124 Peso: 0 10 Nombre: UCD932 Longitud: 1036 Comprobación: 8702 Peso: 0

Nombre: UCD950 Longitud: 1036 Comprobación: 8639 Peso: 0