JP4887367B2 - アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子及びその用途 - Google Patents
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Description
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(d)配列番号:2のアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(e)配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(f)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(g)配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(i)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号:1の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
(3)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(4)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)DNAである、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6)以下の(j)〜(m)からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
(j) 上記(5)に記載のポリヌクレオチド(DNA)の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド;
(k)上記(5)に記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド;
(l) 上記(5)に記載のポリヌクレオチド(DNA)の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド;及び
(m)上記(5)に記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。
(7)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(8a)以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記(8)に記載のベクター:
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター
(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(1)〜(5)に記載のポリヌクレオチド;及び
(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナル。
(9)上記(6)に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
(11)上記(8)に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が増強された上記(10)に記載の酵母。
(12)上記(9)に記載のベクターを導入することによって、または、上記(5)に記載のポリヌクレオチド(DNA)に係る遺伝子を破壊することによって、上記(5)に記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現が抑制された酵母。
(13)上記(7)に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が向上した上記(11)に記載の酵母。
(15)醸造する酒類が麦芽飲料である上記(14)に記載の酒類の製造方法。
(16)醸造する酒類がワインである上記(14)に記載の酒類の製造方法。
(17)上記(14)〜(16)のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(18)配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
(18a)上記(18)に記載の方法によって、エステル生成能が高いあるいは低い酵母を選別する方法。
(18b)上記(18a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(20)被検酵母を培養して、上記(7)に記載のタンパク質を定量または配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
(20a)被検酵母を培養して、上記(7)に記載のタンパク質のアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記アルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有する被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
(21)基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、または低発現している被検酵母を選択する、上記(20)に記載の酵母の選択方法。
(22)基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における上記(7)に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記(7)に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記(20)に記載の酵母の選択方法。即ち、複数の酵母を培養して各酵母における上記(7)に記載のタンパク質を定量し、その中で該タンパク質の産生量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、上記(20)に記載の酵母の選択方法。
(23)上記(10)〜(13)に記載の酵母および上記(20)〜(22)に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類の製造のための発酵を行い、エステル生成能を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
まず、本発明は、(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド(;及び(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよい。
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号:2のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質である。
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)又は上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;(y)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA);及び(z)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。本発明においては、後述する酒類(例えば、ビール)の醸造において、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、後述する酒類(例えば、ビール)の醸造において、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子(DNA)を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド(DNA)の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照)。
上述した本発明のベクターを製造対象となる酒類の醸造に適した酵母に導入し、その酵母を用いることによって所望の酒類でかつエステル含量が増加し、香味を増した酒類を製造することができる。また、下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母も同様に用いることができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、発泡酒などのビールテイストドリンク、ワイン、ウイスキー、清酒などが挙げられる。なお、本発明においては、必要に応じて、ターゲットとなる遺伝子の発現が抑制された醸造用酵母を用いることによって、所望の酒類でエステル含量を低減させた酒類を製造することもできる。すなわち、上述した本発明のベクターを導入した酵母、上述した本発明のポリヌクレオチド(DNA)の発現が抑制された酵母または下記の本発明の酵母の評価方法によって選択された酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節(増加又は低減)することによって、所望の酒類で、かつエステル含量が調節(増加又は低減)された酒類を製造することができる。
本発明は、配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01/040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
特開2004-283169号公報に記載の比較データベースを用いて検索した結果、ビール酵母に特有の新規アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、nonScATF2を見出した(配列番号:1)。得られた塩基配列情報を基に、それぞれ全長遺伝子を増幅するためのプライマーnonScATF2#for(配列番号:3)/nonScATF2#rv(配列番号:4)を設計し、ゲノム解読株サッカロマイセス パストリアヌス バイヘンステファン34/70株(「W34/70株」と略記することがある。)の染色体DNAを鋳型としたPCRによってnonScATF2の全長遺伝子を含むDNA断片(約1.6kb)を取得した。
ビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株を用いてビール試醸を行い、発酵中のビール酵母菌体から抽出したmRNAをビール酵母DNAマイクロアレイで検出した。
麦汁容量 70L
麦汁溶存酸素濃度 8.6ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 12.8×106cells/mL
実施例1に記載のnonScATF2/pCR2.1-TOPOを制限酵素SacIおよびNotI消化し、タンパク質コード領域全長を含むDNA断片を調製した。この断片を制限酵素SacIおよびNotI処理したpYCGPYNotに連結させ、nonScATF2高発現ベクターnonScATF2/pYCGPYNotを構築した。pYCGPYNotはYCp型の酵母発現ベクターであり、導入された遺伝子はピルビン酸キナーゼ遺伝子PYK1のプロモーターによって高発現される。酵母での選択マーカーとしてジェネチシン耐性遺伝子G418rを、また大腸菌での選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子Amprを含んでいる。
親株ならびに実施例3で得られたnonScATF2高発現株を用いた発酵試験を、以下の条件で行った。
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 9.5ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 5g/L
表1より、発酵終了時における酢酸エチルの生成量は、親株の33.0ppmに対してnonScATF2高発現株では37.0ppmであった。酢酸イソアミル生成量は、親株の2.9ppmに対してnonSc ATF2高発現株では3.8ppmであった。これらの結果より、nonSc ATF2高発現によって酢酸エチル及び酢酸イソアミル生成量が12-31%増加することが明らかとなった。
文献 (Goldstein et al., yeast. 15 1541 (1999)) の方法にしたがい、薬剤耐性マーカーを含むプラスミド(pFA6a (G418r), pAG25 (nat1),pAG32 (hph)) をテンプレートとしたPCRによって遺伝子破壊用断片を作製する。PCR用のプライマーとして、nonScATF2#delta#for(配列番号5)、nonScATF2#delta #rv(配列番号6)を用いる。
上述の方法で作製した遺伝子破壊用断片でビール酵母サッカロマイセス パストリアヌスW34/70株、もしくはW34/70より分離した胞子クローン株(W34/70-2)を形質転換する。形質転換は特開平07-303475に記載された方法で行い、ジェネチシン(Geneticin)300mg/Lあるいはノーセオスリシン(Nourseothricin) 50mg/LあるいはハイグロマイシンB(Hygromycin B) 200mg/Lを含むYPD平板培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース、2%寒天)で形質転換体を選択する。
親株ならびに実施例5で得られたnonScATF2破壊株を用いた発酵試験を、以下の条件で行う。
麦汁容量 1L
麦汁溶存酸素濃度 10ppm
発酵温度 15℃
酵母投入量 5g/L
Claims (20)
- 以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
(a)配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(c)配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜6個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(d) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して97%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 以下の(g)〜(h)からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(g)配列番号:2のアミノ酸配列又は配列番号:2のアミノ酸配列において、1〜2個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加したアミノ酸配列からなり、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;及び
(h) 配列番号:2のアミノ酸配列に対して99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつアルコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 - 配列番号:1の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項7に記載のベクターが導入された酵母。
- 請求項7に記載のベクターを導入することによって、エステル生成能が増強された請求項8に記載の酵母。
- 請求項5に記載のポリヌクレオチド(DNA)に係る遺伝子を破壊することによって、請求項5に記載のポリヌクレオチド(DNA)の発現が抑制された酵母。
- 請求項6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによってエステル生成能が向上した請求項9に記載の酵母。
- 請求項8〜11のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
- 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項12に記載の酒類の製造方法。
- 醸造する酒類がワインである請求項12に記載の酒類の製造方法。
- 配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーまたはプローブを用いて、被検酵母のエステル生成能について評価する方法。
- 被検酵母を培養し、配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母のエステル生成能を評価する方法。
- 被検酵母を培養して、請求項6に記載のタンパク質を定量または配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の発現量を測定し、目的とするエステル生成能に応じた前記タンパク質量または前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して配列番号:1の塩基配列を有するアルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子の各酵母における発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現、あるいは低発現している被検酵母を選択する、請求項17に記載の酵母の選択方法。
- 基準酵母および被検酵母を培養して各酵母における請求項6に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い、あるいは少ない被検酵母を選択する、請求項17に記載の酵母の選択方法。
- 請求項8〜11に記載の酵母および請求項17〜19に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、エステル生成量を調節することを特徴とする、酒類の製造方法。
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