BRPI0808821A2

BRPI0808821A2 - Método para reduzir níveis de h2s em meio de fermentação, vetor de expressão, célula hospedeira, célula de levedura melhorada, cultura de célula de levedura melhorada, método para produzir uma célula de levedura melhorada que produz níveis reduzidos de sulfeto de hidrogênio, e, polinucleotídeo isolado.

Info

Publication number: BRPI0808821A2
Application number: BRPI0808821-7A
Authority: BR
Inventors: Linda F Bisson; Angela Linderholm; Kevin L Dietzel
Original assignee: Univ California
Priority date: 2007-03-16
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2014-08-19
Also published as: MX2009009822A; CN101641442B; CN106222100B; JP5517342B2; HK1138328A1; AU2008229168A1; RU2476590C2; CN106222100A; EP2132318B1; CN101641442A; KR101449972B1; EP2132318A4; PT2132318E; RU2009138248A; WO2008115759A3; JP2010521169A; WO2008115759A2; US8216803B2; BRPI0808821B1; CA2680787A1

Description

I “MÉTODO PARA REDUZIR NÍVEIS DE H2S EM UM MEIO DE FERMENTAÇÃO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, CÉLULA DE LEVEDURA MELHORADA, CULTURA DE CÉLULA DE LEVEDURA MELHORADA, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA 5 CÉLULA DE LEVEDURA MELHORADA QUE PRODUZ NÍVEIS REDUZIDOS DE SULFETO DE HIDROGÊNIO, E, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO”

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. N- 60/918.616, depositado em 16 de março de 2007, e Pedido Provisório U.S. N- 60/959.366, depositado em 12 de julho de 2007, a divulgação inteira de ambos os quais é por meio deste incorporada por referência para todos os propósitos.

DECLARAÇÃO CONCERNENTE AOS DIREITOS ÀS INVENÇÕES FEITAS SOB PESQUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FEDERAL Não aplicável.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A produção de compostos de enxofre voláteis tais como sulfeto de hidrogênio (H2S) durante a fermentação alcoólica é um problema que afeta as industrias cervejeiras e de fabricação de vinho. O sulfeto de hidrogênio (H2S) é um subproduto indesejável do caminho de redução do sulfato (Figura I). O mesmo é formado em Saccharomyces cerevisiae sob condições de fermentação. A produção de H2S pelas cepas de S. cerevisiae varia de 0 μg/L a 290 μg/L, bem acima do limiar de detecção humana de 11 ng/L (Amoore e Hautala 1983). A sua qualidade indesejável se origina do fato de que o mesmo introduz um odor de ovo podre característico dos vinhos e embora o H2S seja um composto volátil e possa ser removido pela aeração, o mesmo tem o potencial para formar mercaptanos e tióis que persistirão no

20

25 vinho devido ao pH baixo (Thoukis 1962). Os próprios mercaptanos e tióis presentes como aromas de cebola ou vegetal enlatado e onde H2S volátil pode ser controlado, a remoção de outros compostos de enxofre indesejados é tecnicamente difícil e despoja o vinho de outros compostos de aroma.

5 A formação de sulfeto de hidrogênio pela Saccharomyces

cerevisiae é um problema bem documentado na indústria de vinho, cerveja e saquê (Acree et al. 1972, Eschenbruch et al. 1978, Giudici e Kunkee 1994, Jiranek et al. 1995, Rauhut e Kurbel 1994, Walker e Simpson 1993). Fatores nutricionais tais como os níveis de nitrogênio, vitaminas e co-fatores (Giudici 10 e Kunkee 1994, Jiranek et al. 1995) e fatores ambientais tais como temperatura, pH, níveis de enxofre elementar (Rauhut e Kurbel 1994), presença de dióxido de enxofre (Stratford e Rose 1985) e níveis de compostos orgânicos contendo enxofre (Acree et al. 1972) foram associados com a produção de compostos de enxofre voláteis em bebidas fermentadas. As 15 diferenças na produção de compostos de enxofre voláteis também foram atribuídos às diferenças no metabolismo das cepas de levedura (Acree et al. 1972, Spiropoulos et al. 2000).

Existem pelo menos seis classes diferentes de comportamento de cepa de levedura com respeito à formação de sulfeto de hidrogênio: 1) 20 níveis elevados sob todas as condições; 2) níveis baixos sob todas as condições; 3) produção elevada abaixo e acima de um nível de limiar de nitrogênio; produção reduzida durante uma ‘janela’ de níveis de nitrogênio com sulfeto aumentando nos níveis de nitrogênio acima ou abaixo desta janela; 4) produção elevada em resposta aos níveis de micronutriente limitante 25 independente do teor de nitrogênio; 5) produção de sulfeto elevada apenas quando limitada tanto pelo nitrogênio quanto micronutrientes; e 6) produção de sulfeto elevada com taxa aumentada de fermentação, que pode estar relacionada com a taxa de fermentação e evolução de dióxido de carbono ou a algum outro fator tal como produção de calor aumentada (Spiropoulos 2000, Jiranek 1995, Giudici 1994, Linderholm 2006).

O método existente para despojar sulfetos de vinho é a refinação em cobre. A adição de cobre pode levar à catálise de mudanças composicionais deletérias assim como aumentar a quantidade de resíduos produzidos pelos estabelecimentos vinícolas que requerem tratamento especial, resultando por fim em custos de produção mais altos para os estabelecimentos vinícolas e custos do vinho mais altos para o consumidor. Além disso, o uso de cobre como um agente de refinação pode levar a níveis de cobre residual altos no vinho. O Trade and Tax Bureau permite um nível de cobre residual de 0,5 mg/L para o vinho (Ver, por exemplo, no sítio da web mundial em regulations.justia.com/view/89060/). Os produtores de vinho que usam cobre para remover sulfeto de hidrogênio do mosto de frutas depois tomam medidas para reduzir níveis de cobre no vinho. Dados os efeitos de saúde adversos associados com a ingestão de cobre excessiva, particularmente distúrbios neurológicos tais como Alzheimer, a World Health Organization tem recomendado restrições dietéticas no consumo deste composto (Ver, o sítio da web mundial em who.int/watersanitationhealth/dwq/chemicals/copper.pdf). A disponibilidade de cepas de levedura comerciais incapazes de produzir sulfeto de hidrogênio ou que produzem níveis reduzidos de sulfeto de hidrogênio eliminará a necessidade quanto aos tratamentos com cobre de vinhos.

Assim, existe uma necessidade na técnica quanto a composições e métodos para reduzir níveis de H2S em bebidas fermentadas. A presente invenção atinge estas e outras necessidades.

SUMÁRIO RESUMIDO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece composições e métodos para

reduzir níveis de H2S em bebidas fermentadas.

Um aspecto da invenção fornece métodos para reduzir ou eliminar os níveis de H2S no produto ou meio de fermentação. Em algumas formas de realização, os métodos compreendem contatar o produto ou meio de fermentação com uma cepa de levedura, célula de levedura ou cultura de levedura que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo METlO modificado que não catalisa a liberação de sulfeto de hidrogênio livre a partir do sulfito (isto é, um polipeptídeo MET10 “inativo em sulfeto”), em 5 que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina. Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 não é treonina. Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO: 1.

Com respeito às formas de realização de um polipeptídeo

MET10 inativo em sulfeto, em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina ou serina. Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 do polipeptídeo MET10 é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, 15 Asn5 Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 3). Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO é Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, He, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Vai, Trp ou Tyr (SEQ ID NO: 5). Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 é selecionado do grupo 20 que consiste de Lys, Arg, His, Gln e Asn (SEQ ID NO: 6). Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 é Lys (SEQ ID NO: 7).

Em algumas formas de realização, o polipeptídeo MET10 ou polinucleotídeo MET10 inativos em sulfeto é uma levedura METl0. Em 25 algumas formas de realização, o polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto compartilha pelo menos cerca de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou identidade de seqüência mais alta com um MET10 da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, em que X na posição 662 é como descrito acima e aqui. Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto compartilha pelo menos cerca de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou identidade de seqüência mais alta com a SEQID NO: 1.

Em algumas formas de realização, a célula de levedura 5 também não expressa um polipeptídeo METlO ativo em sulfeto capaz de converter sulfito em sulfeto. Em algumas formas de realização, o produto de fermentação é vinho, cerveja ou champanhe. Em algumas formas de realização, o meio de fermentação pode ser selecionado do grupo que consiste de um mosto de frutas (por exemplo, um mosto de suco de uva) e um mosto 10 cervejeiro.

Com respeito às formas de realização de célula de leveduras, em algumas formas de realização, a cepa de levedura pode ser uma cepa de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas formas de realização, a cepa de levedura pode ser qualquer cepa comercialmente disponível para o uso com a 15 fabricação de cerveja ou vinho, como aqui descrito. Frequentemente, a cepa precursora ou cepa original é uma produtora de sulfeto de hidrogênio que foi tomada uma não produtora de sulfeto de hidrogênio pela substituição do ácido nucleico que codifica um polipeptídeo MET10 ativo em sulfeto com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto. As cepas 20 de vinho de S. cerevisiae exemplares incluem, sem limitação, Prise de Mousse, Premier Cuvee, French Red, Montachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bb 19 e Bb22. Outras formas de realização de células de levedura são como aqui descritas.

Um outro aspecto da invenção fornece polinucleotídeos

isolados que compreendem uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo MET10 não é treonina. Em algumas formas de realização o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina ou serina (SEQ ID NO: 5). As formas de realização do polipeptídeo METlO inativo em sulfeto codificado pelos polinucleotídeos são como descritos acima e aqui. Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo METlO inativo em 5 sulfeto compartilha pelo menos cerca de 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de seqüência com a SEQID NO: 1. Em algumas formas de realização, o polinucleotídeo isolado compreende a seqüência de ácido nucleico fornecida na SEQ ID NO: 1 ou um complemento desta.

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece cassetes de

expressão e vetores de expressão que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo MET10 que não catalisa a conversão de sulfito em sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo MET10 não é treonina (SEQ ID NO: 3), e em que o polinucleotídeo é operavelmente ligado 15 a uma seqüência de controle da expressão. Outras formas de realização do polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto são como descritas acima e aqui. São fornecidas ainda células hospedeiras que compreendem os vetores de expressão ou cassetes de expressão. As células hospedeiras podem ser células de levedura, por exemplo, células de Saccharomyces cerevisiae. Outras 20 formas de realização das células de levedura são como descritas acima e aqui. Em algumas formas de realização, o cassete de expressão ou vetor de expressão compreendem um promotor que promove a expressão em uma célula de levedura.

Em um aspecto relacionado, a invenção fornece células de 25 levedura melhoradas que não produzem sulfeto de hidrogênio detectável ou produzem níveis baixos de sulfeto de hidrogênio, as células melhoradas compreendendo um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo MET10 que não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo MET10 não é treonina (SEQ ID NO: 3), em que uma célula precursora da célula de levedura melhorada produz sulfeto de hidrogênio. Em algumas formas de realização, o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina ou serina (SEQ ID NO: 5). Outras formas de realização do polipeptídeo METlO inativo em sulfetos e células de levedura são como descritas acima e aqui.

Em um outro aspecto, a invenção fornece cultura melhorada de células de levedura que produzem níveis reduzidos de sulfeto de hidrogênio detectável ou não produzem, a cultura melhorada compreendendo uma população de células de levedura, as células de levedura compreendendo um 10 polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo METlO que não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina (SEQ ID NO: 3), em que a cultura de célula de levedura melhorada não produz nenhum sulfeto de hidrogênio ou reduzido em comparação com uma cultura de células precursoras. Em 15 algumas formas de realização, o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina ou serina (SEQ ID NO: 5). Outras formas de realização do polipeptídeo MET10 inativo em sulfetos e células de levedura são como descritas acima e aqui.

Em um outro aspecto, a invenção fornece métodos de produzir 20 uma célula de levedura melhorada que não produz sulfeto de hidrogênio detectável, o método compreendendo substituir um ácido nucleico endógeno que codifica um polipeptídeo MET10 ativo em sulfeto com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto pela introdução em um precursor da célula de levedura melhorada de um polinucleotídeo exógeno 25 que codifica um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto que não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto não é treonina (SEQ ID NO: 3), em que o precursor da célula de levedura melhorada produz sulfeto de hidrogênio. Em algumas formas de realização, o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina ou serina (SEQ ID NO: 5). Em algumas formas de realização, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo METlO inativo em sulfeto é introduzido recombinantemente. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo METlO 5 inativo em sulfeto é introduzido pelo retro-cruzamento. Outras formas de realização do polipeptídeo METlO inativo em sulfetos e células de levedura são como descritas acima e aqui.

Em um outro aspecto, a invenção fornece produtos de fermentação, por exemplo, vinho, cerveja, champanhe, sem nenhum sulfeto de hidrogênio detectável ou níveis baixos de sulfeto de hidrogênio, ou resíduo destes, em que os produtos de fermentação são produzidos de acordo com os métodos aqui descritos.

Uma outra forma de realização da invenção fornece polinucleotídeos isolados capazes de distinguir entre as seqüências fornecidas 15 na SEQ ID NO: 1 ou um complemento deste e um ácido nucleico que codifica um METlO do tipo selvagem, vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos operavelmente ligados a uma seqüência de controle da expressão, e células hospedeiras (por exemplo, células de Saccharomyces cerevisiae) compreendendo o vetor de expressão.

Uma outra forma de realização da invenção fornece

polinucleotídeos isolados compreendendo uma ou mais substituições (por exemplo, pelo menos duas, três, quatro ou mais substituições) na SEQ ID NO:

1, em que a uma ou mais substituições são selecionadas de: um A -* C na posição 404, um A -> G na posição 514, um A -> G na posição 1278, e um C 25 —» T na posição 1532, um G -> A na posição 1768, e um A -> Cna posição 1985, vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos operavelmente ligados a uma seqüência de controle da expressão, e células hospedeiras (por exemplo, células de Saccharomyces cerevisiae) compreendendo o vetor de expressão. Já em uma outra forma de realização a invenção fornece polinucleotídeos isolados compreendendo uma ou mais substituições (por exemplo, pelo menos duas, três, quatro ou mais substituições) na SEQ ID NO:

2, em que a uma ou mais substituições são selecionadas do grupo que consiste de: um C —» A na posição 404, um G —> A na posição 514, um G —> A na posição 1278, e um T —> C na posição 1532, um A —> G na posição 1768, e um C —y A na posição 1985, , vetores de expressão compreendendo os polinucleotídeos operavelmente ligados a uma seqüência de controle da expressão, e células hospedeiras (por exemplo, células de Saccharomyces cerevisiae) compreendendo o vetor de expressão.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra o caminho da redução de sulfato. A análise de seqüência conduzida para os genes está em negrito, o número de alelos encontrados está em ( ), os alelos encontrados em UCD932 são esboçados com linhas pontilhadas.

As Figuras 2A a 2Z apresentam um alinhamento de seqüência do alelo METlO em várias cepas de Saccharomyces (SEQ ID NOS: 8, 9, 1, 10 a 14, 2, 15 e 16, respectivamente). As mudanças de ácido nucleico que resultam em mudanças de códon são salientadas.

A Figura 3 ilustra uma técnica de exemplar de troca de gene. METlOs = alelo S288C. METlOw = alelo da cepa de vinho.

A Figura 4 ilustra o alinhamento de seqüência de aminoácido do gene METlO em várias cepas de Saccharomyces (S288C = SEQ ID NO: 17; UCD932 = SEQ ID NO: 18; UCD950 = SEQ ID NO: 19). As diferenças de aminoácido entre as cepas diferentes são salientadas.

A Figura 5 ilustra as mudanças de aminoácido que circundam o resíduo 662 na proteína MET10. As seqüências de DNA dos alelos METlO de S288C (SEQ ID NO: 20), UCD932 (SEQ ID NO: 21) e UCD950 (SEQ ID NO: 20) alinhadas próximo ao nucleotídeo 1985 com a mutação chave salientada e em negrito. Os códons (SEQ ID NOS: 22 e 23) e a seqüência de aminoácido correspondente (SEQ ID NO: 24) (salientadas em cinza claro) são mostradas no inserto. As mudanças de um C para um A resulta na mudança correspondente de um resíduo de treonina para uma lisina na posição 662 da proteína.

A Figura 6 ilustra a localização do resíduo de aminoácido 662 com respeito aos domínios funcionais conhecidos e prognosticados da proteína METl0. Um mapa dos motivos e domínios conhecidos da proteína MET10 é representado. A posição da base alterada na posição 662 é marcada 10 pela seta preta. A mutação reside dentro do domínio da sulfito redutase da proteína. Os dados da world wide web em //db.yeastgenome.org/cgibin/protein/domainPage.pl?dbid=S000001926.

A Figura 7 ilustra as características estruturais do domínio da sulfito redutase e ilustra o impacto da mudança do resíduo de treonina por 15 uma lisina nas características estruturais da proteína. Os modelos de fita estrutural da proteína METlO com base no prognóstico da homologia estrutural são representados. Apenas o domínio da sulfito redutase prognosticado de lisina 633 para tirosina 1035 é mostrado com a região em tomo do resíduo 662 ampliada no inserto. A estrutura prognosticada para 20 UCD932 (Figura A) salienta a lisina no resíduo 662 enquanto que a estrutura prognosticada para UCD950 (Figura B) salienta a Treonina no resíduo 662.

A Figura 8 ilustra um alinhamento de uma subsequência da proteína METlO de algumas espécies de levedura industrialmente relevantes (UCD 932 MetlO = SEQ ID NO: 25; S288c MetlO = SEQ ID NO: 26; S. 25 cerevisiae (carlsbergensis) = SEQ ID NO: 27; Kluyveromyces lactis = SEQ ID NO: 28; Yarowwia lipolitica = SEQ ID NO: 29; Schizosaccharomyces pombe = SEQ ID NO: 30) cujas seqüências na região catalítica da sulfito redutase são conhecidas. Os resíduos de aminoácido conservados por todas as espécies alinhadas estão em negrito. Os resíduos de aminoácido conservados na maioria das espécies relatadas estão sombreados. A treonina na posição 662 ou dentro do motivo (N/K)(R/K)R(V/L)TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(I/Y)EFD(IyL) (SEQ ID NO: 31) é conservada no polipeptídeo METlO ativo por todas as espécies de levedura alinhadas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS TABELAS

A Tabela 1 apresenta uma lista de cepas de levedura nativas e

industriais.

A Tabela 2 apresenta composição para um meio Triplo M (MMM) modificado.

A Tabela 3 apresenta resultados da análise de isolados de

levedura nativos cultivados em placas BiGGY e MMM.

A Tabela 4 apresenta cepas de levedura adicionais.

A Tabela 5 apresenta seqüências para iniciadores de PCR para amplificar, inter alia, METl 0.

A Tabela 6 apresenta seqüências para sequenciar iniciadores

inter alia, para MET10.

A Tabela 7 apresenta resultados que resumem a produção de H2S a partir das cepas de levedura transformadas com MET10.

A Tabela 8 apresenta diferenças de aminoácido nos alelos

METl 0.

A Tabela 9 apresenta resultados que resumem a produção de H2S pelas cepas de levedura adicionais transformadas com METl 0.

A Tabela 10 apresenta resultados que resumem a produção de H2S pelas cepas de levedura transformadas com MET10.

A Tabela 11 apresenta resultados que resumem a produção de

H2S pelas cepas de levedura transformadas com alelos MET10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO !.Introdução

A presente invenção fornece composições e métodos para reduzir níveis de H2S em bebidas fermentadas. A invenção está fundamentada em parte na descoberta de que um polipeptídeo METlO com um resíduo de aminoácido na posição 662 que seja outro que não uma treonina não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto de hidrogênio livre ou liberado. Isto é 5 exemplificado pela expressão de um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto do alelo METlO na cepa de levedura UCD932 em que uma única mudança de nucleotídeo na posição 1985 no gene METlO resulta em uma mudança de aminoácido na posição 662 da treonina para lisina no domínio catalítico da proteína MET10.

II.Defmicões

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados no geral têm os mesmos significados como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade na técnica à qual esta invenção pertence. No geral, a nomenclatura aqui usada e os procedimentos 15 de laboratório na cultura de célula, genéticas moleculares, química orgânica e química do ácido nucleico e hibridização descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e habitualmente utilizados na técnica. As técnicas padrão são usadas para a síntese de ácido nucleico e peptídeo. No geral, as reações enzimáticas e etapas de purificação são realizadas de acordo com as 20 especificações do fabricante. As técnicas e procedimentos são no geral realizadas de acordo com métodos convencionais na técnica e várias referências gerais (ver no geral, Sambrook e Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & 25 Sons 1987-2008)), que são fornecidas por todo este documento. A nomenclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório em química analítica, e a síntese orgânica descrita abaixo são aquelas bem conhecidas e habitualmente utilizadas na técnica. As técnicas padrão, ou suas modificações, são usadas para a síntese química e análises químicas. “Meios de fermentação” ou “meio de fermentação” como aqui usados referem-se a uma mistura não fermentada antes da adição de levedura. Os meios de fermentação incluem, por exemplo, mostos de uvas e mostos cervejeiros. Os meios de fermentação podem compreender ainda uma fonte de 5 açúcar adicional (por exemplo, mel, açúcar de cana, açúcar de beterraba, açúcar de milho, frutose, sacarose ou glicose); ácido (por exemplo, ácido cítrico, ácido málico, ácido tartárico e misturas destes) e nutrientes de levedura (por exemplo, fosfato de diamônio ou uma outra fonte de nitrogênio, vitaminas e outros).

Um “mosto de frutas” como aqui usado refere-se a uma

mistura não fermentada de suco de fruta, fragmentos de pendúculo, cascas de fruta, sementes e/ou polpa produzidos amassando-se a fruta. Qualquer fruta contendo açúcar fermentável tal como, por exemplo, uvas, maçãs, cerejas, pêssegos, nectarinas, ameixas, damascos, pêras, caquis, abacaxis, mangas, 15 kiwis, morangos, framboesas, arandos, fruto do sabugueiro, amora silvestre, amoras, figos e nêsperas pode ser usada. As frutas podem estar secas, fervidas, escaldadas ou de outro modo processadas antes de amassar. Um mosto de frutas pode compreender duas ou mais frutas.

“Mosto cervejeiro” como aqui usado refere-se a um líquido 20 não fermentado produzido amassando-se grãos e/ou cascas de grão. Quaisquer grãos contendo açúcar fermentável tais como, por exemplo, cevada, trigo, centeio, cevada, arroz, milho e aveias podem ser usados. Os grãos podem estar tostados, floculados ou de outro modo processado antes de amassar. Um mosto cervejeiro pode ser produzido a partir de uma mistura compreendendo 25 dois ou mais grãos.

“MetlO” e “MET 10” como aqui usados referem-se a uma subunidade a da sulfito redutase assimiladora de Saccharomyces. Funcionalmente, um polipeptídeo METlO catalisa a conversão de sulfito em sulfeto. Estruturalmente, polipeptídeos MET10, particularmente polipeptídeos de levedura METl0, foram caracterizados. Os polipeptídeos METlO contêm um domínio catalítico da sulfito redutase conservado na porção de terminal C, assim como os domínios de ligação FAD e NAD. A porção central do polipeptídeo contêm um domínio da piruvato-ferredoxina oxidorredutase. Nos 5 polipeptídeos METlO ativos em sulfeto, que são capazes de catalisar a conversão de sulfito para sulfeto de hidrogênio livre ou liberado, o resíduo de aminoácido na posição 662 foi conservado e é usualmente uma treonina ou algumas vezes uma serina, particularmente em levedura. Os domínios de polipeptídeo METlO identificados são representados na Figura 6.

Como aqui usados, “MET10” refere-se a ácidos nucleicos e

variantes polimórficas de polipeptídeo, alelos, mutantes e homólogos interespécies que: (1) têm uma seqüência de aminoácido que tem mais do que cerca de 80 % de identidade de seqüência de aminoácido, por exemplo, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % ou maior 15 identidade de seqüência de aminoácido, preferivelmente em uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais aminoácidos ou no seu tamanho natural, a uma seqüência de aminoácido de referência codificada por um ácido nucleico MET10 (para uma seqüência de ácido nucleico de levedura METl 0, ver, por exemplo, a SEQ ID NO: 1, Figura 2 e os números 20 de acesso no GenBank exemplificados abaixo); (2) liga-se aos anticorpos, por exemplo, anticorpos policlonais, incitados contra um imunógeno compreendendo uma seqüência de aminoácido de um polipeptídeo MET10 (por exemplo, codificado pela SEQ ID NO: 1) e variantes conservativamente modificadas desta; (3) especificamente hibridiza sob condições de 25 hibridização severa a um filamento de anti-sentido que corresponde a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína MET10 e variantes conservativamente modificadas desta; (4) têm uma seqüência de ácido nucleico que tem mais do que cerca de 95 %, preferivelmente mais do que cerca de 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou identidade de seqüência de nucleotídeo mais alta, preferivelmente em uma região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos ou no seu tamanho natural, a uma seqüência de ácido nucleico MET10 de referência. Os ácidos nucleicos e proteínas da invenção incluem tanto moléculas que ocorrem naturalmente 5 quanto recombinantes. Em algumas formas de realização, os polipeptídeos MET10 e polinucleotídeos MET10 são de levedura.

As seqüências de aminoácido e ácido nucleico MET10 exemplificadas são apresentadas nos Acessos do Genbank Nss EF058164, EF058165, EF058166, EF058167, EF058168, EF058169, EF058170, EF058171, EF058172, EF058173.

Como aqui usado, um polipeptídeo “MET10 ativo em sulfeto” é capaz de catalisar a conversão de sulfito para sulfeto de hidrogênio. Em levedura, um polipeptídeo MET10 ativo em sulfeto pode ter um resíduo de serina ou treonina na posição de aminoácido 662. Nas cepas de levedura, o aminoácido na posição 15 662 na S. cerevisiae é conservado como uma treonina ou uma serina e reside no seguinte motivo na região catalítica da sulfito redutase: (N/K)(R/K)R(V/L) TP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(UV)EFD(I/L) (SEQ ID NO: 31). Ver a, Figura 8.

Como aqui usado, um polipeptídeo “MET 10 inativo em 20 sulfeto” não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto de hidrogênio livre ou liberado. Em levedura, um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto não terá uma treonina na posição de aminoácido 662 ou dentro do motivo (N/K)(R/K)R(V/L)XP(A/D/E)(D/N/E)Y(D/N)R(Y/N)IFH(UV) EFD(LiL) (SEQ ID NO: 32), isto é, em que X não é T. Em algumas formas de 25 realização, um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto não terá um resíduo de treonina ou um de serina na posição de aminoácido 662. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto terá um Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Vai, Trp ou Tyr na posição 662 (SEQ ID NO: 3). Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 em um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto não tem um grupo hidroxila, por exemplo, não é Thr, Ser ou Tyr (SEQ ID NO: 33). Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 em um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto é um 5 aminoácido grande ou volumoso, por exemplo, Lys, Arg, His, Gin, Asn, Glu, Asp, Ile, Leu, Vai, Phe, Tyr ou Trp (SEQ ID NO: 34). Em algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 em um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto é um aminoácido básico ou positivamente carregado, por exemplo, Lys, Arg, His, Gln ou Asn (SEQ ID NO: 6). Em 10 algumas formas de realização, o resíduo de aminoácido na posição 662 é Lys (SEQ ID NO: 7).

Como aqui usado, uma seqüência de ácido nucleico ou seqüência de aminoácido METlO “exógena” é introduzida em uma célula precursora de levedura ou cepa precursora de levedura pela ação do ser 15 humano. A introdução na célula de levedura da seqüência de ácido nucleico exógena ou seqüência de aminoácido exógena pode ser por quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindo métodos recombinantes ou métodos de cruzamento de levedura clássicos (por exemplo, retro-cruzamento).

Os termos “ácido nucleico” e “polinucleotídeo” são usados 20 intercambiavelmente aqui para se referir aos desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros destes na forma de filamento único ou duplo. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de cadeia principal modificada, que são sintéticos, que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente, que têm 25 propriedades de ligação similares como o ácido nucleico de referência e que são metabolizados em uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Os exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirais, 2-O-metil ribonucleotídeos, peptídeo-ácido nucleicos (PNAs). A menos que de outro modo indicado, uma seqüência de ácido nucleico particular também abrange variantes deste conservativamente modificados (por exemplo, substituições de códon degeneradas) e seqüências complementares, assim como a seqüência explicitamente indicada.

5 Especificamente, as substituições de códon degeneradas podem ser obtidas pela geração de seqüências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com resíduos de base mista e/ou desóxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91- 10 98 (1994)). O termo ácido nucleico é usado intercambiavelmente com gene, cDNA, mRNA, oligonucleotídeo e polinucleotídeo.

Um ácido nucleico “capaz de distinguir” como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo(s) que (1) especificamente hibridiza sob condições de hibridização severas a um filamento de anti-sentido 15 correspondente a uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína METlO e variantes destas conservativamente modificadas; ou (2) tem uma seqüência de ácido nucleico que tem mais do que cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, preferivelmente mais do que cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade de seqüência de nucleotídeo mais alta, preferivelmente em uma 20 região de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 500, 1000 ou mais nucleotídeos, a um ácido nucleico METl 0.

A frase “condições de hibridização severa” referem-se a condições sob as quais uma sonda hibridizará à sua subsequência alvo, tipicamente em uma mistura complexa de ácido nucleico, mas não a outras 25 seqüências. As condições severas são dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As seqüências mais longas hibridizam especificamente em temperaturas mais altas. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology —Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993). No geral, as condições severas são selecionadas para serem de cerca de 5 a 10° C mais baixas do que o ponto de fusão térmica I para a seqüência específica em uma concentração iônica definida, pH. A Tm é a temperatura (sob concentração iônica definida, pH e concentração de nucleico) na qual 50 % das sondas complementam ao alvo para hibridizar à seqüência alvo no equilíbrio (visto que as seqüências alvo estão presentes em excesso, na Tm, 50 % das sondas são ocupadas no equilíbrio). As condições severas serão aquelas em que a concentração salina é menor do que cerca de 1,0 M de íon sódio, tipicamente de cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon sódio (ou outros sais) no pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30° C para as sondas curtas (por exemplo, de 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos cerca de 60° C para as sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos). As condições de severidade também podem ser obtidas com a adição de agentes de desestabilização tais como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é pelo menos duas vezes o fundo, opcionalmente 10 vezes a hibridização de fundo. As condições de hibridização severa exemplares podem ser como segue: 50 % de formamida, 5x SSC e 1 % de SDS, incubando a 42° C, ou, 5x SSC, 1 % de SDS, incubando a 65° C, com lavagem em 0,2x SSC e 0,1 % de SDS a 65° C.

Os ácidos nucleicos que não hibridizam entre si sob condições severas são ainda substancialmente idênticas se os polipeptídeos que eles codificam são substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criado usando a degenerescência de códon 25 máxima permitida pelo código genético. Em tais casos, os ácidos nucleicos tipicamente hibridizam sob condições de hibridização moderadamente severa. As “condições de hibridização moderadamente severa” exemplar incluem uma hibridização em um tampão de 40 % de formamida, I M de NaCl, 1 % de SDS a 37° C e uma lavagem em IX SSC a 45° C. Uma hibridização positiva é pelo menos duas vezes o fundo. Aqueles de habilidade comum facilmente reconhecerão que a hibridização alternativa e as condições de lavagem podem ser utilizadas para fornecer condições de severidade similar.

Os termos “isolado”, “purificado”, ou “biologicamente puro” refere-se ao material que é substancial ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham como encontrado no seu estado nativo. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando as técnicas da química analítica tais como a eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Em particular, um ácido nucleico METlO isolado é separado das matrizes de leitura aberta que flanqueiam o gene METlO e codificam proteínas outras que não METl0. O termo “purificado” denota que um ácido nucleico ou proteína dá origem essencialmente a uma faixa em um gel eletroforético. Particularmente, o mesmo significa que o ácido nucleico ou proteína são pelo menos 85 % puros, mais preferivelmente pelo menos 95 % puros e o mais preferivelmente pelo menos 99 % puros.

O termo “heterólogo” quando usado com referência às porções de um ácido nucleico indica que o ácido nucleico compreende duas ou mais 20 subsequências que são divergentes um do outro, que pode surgir naturalmente na população por intermédio da mutação espontânea ou rearranjo genômico ou pode ser artificialmente introduzido. Por exemplo, o ácido nucleico é de modo típico recombinantemente produzido, tendo duas ou mais seqüências de genes não relacionados dispostos para compor um novo ácido nucleico 25 funcional, por exemplo, um promotor de uma fonte e uma região codificadora de uma outra fonte. Similarmente, uma proteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou mais subsequências que são divergentes ou não encontradas na mesma relação entre si na natureza (por exemplo, uma proteína de fusão). Um “vetor de expressão” é uma construção de ácido nucleico, recombinante ou sinteticamente gerada, com uma série de elementos de ácido nucleico especificados que permite a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira. O vetor de expressão pode ser parte de 5 um plasmídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico a ser transcrito operavelmente ligado a um promotor.

Os termos “polipeptídeo,” “peptídeo” e “proteína” são usados intercambiavelmente aqui para se referir a um polímero de resíduos de 10 aminoácido. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente, assim como aos polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente e polímero de aminoácido que não ocorrem naturalmente.

O termo “aminoácido” refere-se aos aminoácidos que ocorrem

naturalmente e sintéticos, assim como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam em uma maneira similar aos aminoácidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são 20 mais tarde modificados, por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato e O-fosfoserina. Os análogos de aminoácido referem-se aos compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorrem naturalmente, isto é, qualquer carbono que esteja ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, 25 norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais de peptídeo modificadas, mas retêm a mesma estrutura química básica como um aminoácido que ocorrem naturalmente. Os miméticos de aminoácido referemse aos compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona em uma maneira similar a um aminoácido que ocorre naturalmente.

Os aminoácidos podem ser aqui aludidos pelos seus símbolos de três letras habitualmente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotídeos, do mesmo modo, podem ser aludidos pelos seus códigos de letra única habitualmente aceitos.

“Variantes conservativamente modificadas” aplica-se tanto à seqüência de aminoácido quanto à de ácido nucleico. Com respeito às 10 seqüências de ácido nucleico particulares, variantes conservativamente modificadas referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam seqüências de aminoácido idênticas ou essencialmente idênticas ou onde o ácido nucleico não codifica uma seqüência de aminoácido, às seqüências essencialmente idênticas. Por causa da degenerescência do código genético, um grande 15 número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer proteína dada. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais 20 variações de ácido nucleico são “variações silenciosas,” que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada seqüência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Uma pessoa de habilidade reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é ordinariamente o 25 único códon para metionina e TGG, que é ordinariamente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo é implícita em cada seqüência descrita.

Como para as seqüências de aminoácido, uma pessoa de habilidade reconhecerá que as substituições, deleções ou adições individuais a uma seqüência de ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou proteína que altera, adiciona ou deleta um aminoácido único ou uma porcentagem pequena de aminoácidos na seqüência codificada é uma “variante conservativamente 5 modificada” onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são além do mais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da 10 invenção.

Os seguintes oito grupos cada um contém aminoácidos que são substituições conservativas entre si:

1) Alanina (A), Glicina (G);

r r

2) Acido aspártico (D), Acido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); e

8) Cisteina (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton,

Proteins (1984)).

Os termos “idêntico” ou “identidade” percentual, no contexto de dois ou mais seqüências de ácidos nucleicos ou de polipeptídeo, referem-se a duas ou mais seqüências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma 25 porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos (isto é, 60 % de identidade, preferivelmente 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade em uma região especificada de uma região da SEQID NO: 1), quando comparada e alinhada para correspondência máxima em uma janela de comparação ou região designada como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de seqüência ou pelo alinhamento manual e inspeção visual. Tais seqüências são depois ditas serem “substancialmente idênticas.” Esta definição também refere-se ao cumprimento de uma seqüência de teste. Preferivelmente, a identidade existe 5 em uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento ou mais preferivelmente em uma região que tenha de 50 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento.

Para a comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüência de referência, com a qual seqüências de teste são comparadas. Quando do uso de um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e referência são introduzidas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário e os parâmetros de programa de algoritmo de seqüência são designados. Os parâmetros de programa padrão podem ser usados ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de seqüência depois calcula as identidades de seqüência percentuais para as seqüências de teste em relação à seqüência de referência, com base nos parâmetros de programa. Para a comparação de seqüência de ácidos nucleicos e proteínas ao ácidos nucleicos e proteínas MET10, os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 e os parâmetros padrão debatidos abaixo são usados.

Uma “janela de comparação”, como aqui usado, inclui referência a um segmento de qualquer uma das várias posições contíguas selecionado do grupo que consiste de 20 a 600, usualmente de cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente de cerca de 100 a cerca de 150 em que uma 25 seqüência pode ser comparada com uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências são otimamente alinhadas. Os métodos de alinhamento das seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pela pesquisa quanto ao método de similaridade método de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), pelas implementações 5 computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou pelo alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. suplemento 1995).

Um exemplo preferido de algoritmo que é adequado para

determinar a identidade de seqüência percentual e a similaridade de seqüência são os algoritmo BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são usados, com os 15 parâmetros aqui descritos, para determinar a identidade de seqüência percentual para os ácidos nucleicos e proteínas da invenção. O software para realizar as análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (Ver, o site da web mundial em ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de 20 seqüência de contagem alta (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência dúvida, que se emparelhem ou satisfaçam algumas contagens T de limiares de valor positivo quando alinhados com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência de base de dados. T é aludido como o limiar de contagem de palavras da vizinhança (Altschul et al., 25 supra). Estes acertos de palavra da vizinhança inicial atuam como sementes para iniciar a pesquisa para encontrar HSPs mais longos que as contenham. Os acertos de palavra são prolongados em ambas as direções ao longo de cada seqüência para até o ponto em que a contagem de alinhamento acumulativo possa ser aumentada. As contagens cumulativas são calculadas usando, para as seqüências de nucleotídeo, os parâmetros M (contagem de recompensa para um par de resíduos emparelhados; sempre > 0) e N (contagem de penalidade para resíduos desemparelhados; sempre < 0). Para as seqüências de aminoácido, uma matriz de contagem é usada para calcular a contagem 5 cumulativa. Os acertos de extensão da palavra em cada direção são paralisados quando: a contagem de alinhamento cumulativo diminui pela quantidade X a partir do seu valor máximo obtido; a contagem cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou o final de cada seqüência é atingido. Os parâmetros 10 de algoritmo BLAST W, T e X determina a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para as seqüências de nucleotídeo) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para as seqüências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrões um 15 comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10 e alinhamentos de matriz de contagem BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915 (1989)) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os filamentos.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da 20 similaridade entre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento entre dois nucleotídeos ou seqüências de aminoácido 25 ocorreria ao acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma seqüência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste ao ácido nucleico de referência é menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01 e o mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001. Uma indicação de que duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reativo cruzado com os anticorpos incitados contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Assim, um polipeptídeo é de modo típico substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, onde os dois peptídeos diferem apenas pelas substituições conservativas. Uma outra indicação de que duas seqüências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos hibridizam entre si sob condições severas, como descrito abaixo. Já uma outra indicação de que duas seqüências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que os mesmos iniciadores podem ser usados para amplificar a seqüência.

A frase “seletivamente (ou especificamente) hibridiza a” refere-se à ligação, duplexação ou hibridização de uma molécula apenas a uma seqüência de nucleotídeo particular sob condições de hibridização severas quando esta seqüência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, DNA ou RNA celulares totais ou de biblioteca).

Por “célula hospedeira” é intencionada uma célula que contém um vetor de expressão e sustenta a replicação ou expressão do vetor de expressão. As células hospedeiras, por exemplo, podem ser células procarióticas tais como E. coli ou células eucarióticas tais como levedura.

III. Ácidos nucleicos que codificam METlO

A.Métodos de DNA Recombinante Geral

Esta invenção conta com técnicas de rotina no campo da genética recombinante e clássica. No geral, a nomenclatura e os procedimentos de laboratório na tecnologia de DNA recombinante descrita abaixo são aqueles bem conhecidos e habitualmente utilizados na técnica. Técnicas padrão são usadas para clonagem, isolação, amplificação e purificação de DNA e RNA. No geral as reações enzimáticas que envolvem a 5 Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008); e Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990).

Para os ácidos nucleicos, os tamanhos são dados em quilobases (kb) ou pares de base (bp). Estes são estimativas derivadas da 10 eletroforese em gel de agarose ou acrilamida, a partir dos ácidos nucleicos sequenciados ou de seqüências de DNA publicadas. Para as proteínas, os tamanhos são dados em quilodaltons (kDa) ou números de resíduo de aminoácido. Os tamanhos das proteínas são estimados da eletroforese em gel, a partir de proteínas sequenciadas, de seqüências de aminoácido derivadas ou 15 de seqüências de proteína publicadas.

Os oligonucleotídeos que não são comercialmente disponíveis podem ser quimicamente sintetizados de acordo com o método do triéster de fosforamidita de fase sólida primeiro descrito por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22: 1859-1862 (1981), usando um sintetizador 20 automatizado, como descrito em Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). A purificação de oligonucleotídeos é pela eletroforese em gel de acrilamida nativa ou pela HPLC de troca de ânion como descrito em Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).

A seqüência dos genes clonados e oligonucleotídeos sintéticos pode ser verificada depois da clonagem usando, por exemplo, o método de

B. Métodos de clonagem para a isolação de seqüências codificam METlO

que No geral, as seqüências de ácido nucleico que codificam METlO e homólogos de seqüência de ácido nucleico relacionados são clonadas a partir de bibliotecas de cDNA e DNA genômico ou isoladas usando técnicas de amplificação com iniciadores de oligonucleotídeo. Por 5 exemplo, as seqüências METlO são tipicamente isoladas a partir de bibliotecas de ácido nucleico (genômico ou cDNA) pela hibridização com uma sonda de ácido nucleico, a seqüência da qual pode ser derivada da SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta. O RNA e cDNA de METlO podem ser isolados a partir de qualquer cepa de levedura. [0079]As variantes 10 polimórficas, alelos e homólogos interespécies de METlO que são substancialmente idênticos a METIO podem ser isolados usando sondas de ácido nucleico e oligonucleotídeos de METlO sob condições de hibridização severas, triando-se bibliotecas. Alternativamente, as bibliotecas de expressão podem ser usadas para clonar variantes polimórficas, alelos e homólogos 15 interespécies de METl 0, pela detecção de homólogos expressados imunologicamente com antissoros ou anticorpos purificados fabricados contra o domínio de núcleo de MET10 que também reconhece e seletivamente se liga ao homólogo METl0.

Para fabricar uma biblioteca de cDNA, o mRNA de MET10 20 pode ser purificado a partir de qualquer cepa de levedura. O mRNA é depois feito em cDNA usando a transcriptase reversa, ligada em um vetor recombinante e transfectado em um hospedeiro recombinante para a propagação, triagem e clonagem. Os métodos para fabricar e triar bibliotecas de cDNA são bem conhecidos (ver, por exemplo, Gubler & Hotiman, Gene 25 25: 263-269 (1983); Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra).

Para uma biblioteca genômica, o DNA é extraído do tecido e mecanicamente cisalhado ou enzimaticamente digerido para produzir fragmentos de cerca de 1 a 8 kb. Os fragmentos são depois separados pela centrifugação de gradiente dos tamanhos não desejados e são construídos em vetores lambda de bacteriófago. Estes vetores e fago são acondicionados in vitro. Os fagos recombinantes são analisados pela hibridização de placa como descrito em Benton & Davis, Science 196: 180-182 (1977). A hibridização de colônia é realizada como no geral descrito em Grunstein et al., PNAS USA., 5 72:3961-3965(1975).

Um método alternativo de isolar ácido nucleicos de METlO e seus homólogos combina o uso de iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos e amplificação de um padrão de RNA ou DNA (ver as Patentes U.S. 4.683.195 e 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et 10 al., eds, 1990)). Métodos tais como a reação da cadeia da polimerase (PCR) e a reação da cadeia da ligase (LCR) podem ser usados para amplificar seqüências de ácido nucleico de METlO diretamente de mRNA, de cDNA, de bibliotecas genômicas ou bibliotecas de cDNA. Oligonucleotídeos degenerados podem ser planejados para amplificar homólogos de METlO 15 usando as seqüências aqui fornecidas. Os sítios de endonuclease de restrição podem ser incorporados nos iniciadores. A reação da cadeia da polimerase ou outros métodos de amplificação in vitro também podem ser úteis, por exemplo, para clonar as seqüências de ácido nucleico que codificam as proteínas a serem expressadas, para fabricar ácido nucleicos para o uso como 20 sondas para detectar a presença de mRNA que codifica METlO em amostras fisiológicas, para o sequenciamento de ácido nucleico ou para outros propósitos. Os genes amplificados pela reação da PCR podem ser purificados a partir dos géis de agarose e clonados em um vetor apropriado.

As técnicas de amplificação usando iniciadores xambém 25 podem ser usadas para amplificar e isolar DNA ou RNA de METl 0. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam MET10 ou fragmentos destes podem ser obtidos pela amplificação de uma biblioteca de cDNA de levedura ou transcrito reverso a partir do RNA de levedura usando pares de iniciadores de ácido nucleico isolados tendo as seqüências: apresentadas na Tabela 5. Estes iniciadores podem ser usados, por exemplo, para amplificar a seqüência de tamanho natural ou uma sonda de um a vários milhares de nucleotídeos, que é depois usada para triar uma biblioteca de cDNA quanto a METlO de tamanho natural.

A expressão de gene de METlO também pode ser analisada

pelas técnicas conhecidas no ramo, por exemplo, transcrição reversa e amplificação de mRNA, isolação de RNA total ou poli A+ RNA, northem blotting, ponto manchas, hibridização in situ, proteção de RNase, sondagem de séries de microchip de DNA e outras.

Oligonucleotídeos sintéticos podem ser usados para construir

genes METlO recombinantes para o uso como sondas ou para a expressão de proteína. Este método é realizado usando uma série de oligonucleotídeos que se sobrepõem usualmente de 40 a 120 pares de base no comprimento, representando tanto o filamento de sentido quanto o de não sentido do gene. 15 Estes fragmentos de DNA são depois recozidos, ligados e clonados. Alternativamente, as técnicas de amplificação podem ser usadas com iniciadores precisos para amplificar uma subsequência específica do gene MET10. A subsequência específica é depois ligada em um vetor de expressão. Quimeras de MET10 podem ser feitas, que combinam, por exemplo, uma 20 porção de MET10 com uma porção de um MET10 heterólogo para criar um MET10 quimérico, funcional.

O gene que codifica um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto é tipicamente clonado em vetores intermediários antes da transformação em células procarióticas ou eucarióticas para a replicação e/ou 25 expressão. Estes vetores intermediários são tipicamente vetores procarióticos, por exemplo, vetores plasmídicos ou transportadores. Os ácidos nucleicos isolados que codificam proteínas MET10 inativas em sulfeto compreendem uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma proteína MET10 inativa em sulfeto e subsequências, homólogos interespécies, alelos e variantes polimórficas desta. Em algumas formas de realização, o ácido nucleico que codifica uma proteína METlO inativa em sulfeto isolado é a SEQ ID NO: 1 ou um complemento desta.

C. Expressão de um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto 5 Para se obter expressão de alto nível de um gene clonado, tal

como aqueles cDNAs que codificam um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto, subclona-se tipicamente uma seqüência de ácido nucleico de um METlO inativo em sulfeto em um vetor de expressão que contenha um promotor forte para direcionar a transcrição, um terminador de transcrição/tradução e se para um ácido nucleico que codifica uma proteína, um sítio de ligação de ribossoma para o início da tradução. Os promotores bacterianos adequados são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al. e Ausubel et al. Os sistemas de expressão bacteriana para expressar a proteína METlO inativa em sulfeto estão disponíveis, por exemplo, em E. coli, Bacillus sp. e Salmonella (Paiva et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302: 543-545 (1983). Kits para tais sistemas de expressão são comercialmente disponíveis. Os sistemas de expressão eucarióticos para as células de mamífero, levedura e células de inseto são vem conhecidos na técnica e também são comercialmente disponível.

O promotor usado para direcionar a expressão de um ácido nucleico heterólogo depende da aplicação particular. O promotor é preferivelmente posicionado em tomo da mesma distância do sítio de início de transcrição heterólogo visto que tal é do sítio de início de transcrição no se 25 ambiente natural. Como é conhecido na técnica, entretanto, alguma variação nesta distância pode ser acomodada sem a perda da função de promotor.

Além do promotor, o vetor de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contenha todos os elementos adicionais requeridos para a expressão do ácido nucleico que codifica METlO inativo em sulfeto em células hospedeiras. Um cassete de expressão típico contém assim um promotor operavelmente ligado à seqüência de ácido nucleico que codifica um MET10 inativo em sulfeto e sinais requeridos para a poliadenilação eficiente do transcrito, sítios de 5 ligação de ribossoma e terminação de tradução. Os elementos adicionais do cassete podem incluir realçadores e, se DNA genômico é usado como o gene estrutural, introns com doadores de junção funcionais e sítios aceitadores.

Além de uma seqüência de promotor, o cassete de expressão também deve conter uma região de terminação de transcrição a jusante do gene estrutural para fornecer a terminação eficiente. A região de terminação pode ser obtida a partir do mesmo gene como a seqüência promotora ou pode ser obtida a partir de genes diferentes.

O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética na célula não é particularmente crítico. Qualquer um dos 15 vetores convencionais usados para a expressão em células eucarióticas ou procarióticas pode ser usado. Vetores de expressão bacteriana padrão incluem plasmídeos tais como pBR322 com base em plasmídeos, pSKF, pET23D e sistemas fusão de expressão tais como GST e LacZ. Os rótulos de epítopo também podem ser adicionados às proteínas recombinantes para fornecer 20 métodos convenientes de isolação, por exemplo, c-myc.

Os vetores de expressão contendo elementos reguladores de vírus eucarióticos são tipicamente usados em vetores de expressão eucarióticos, por exemplo, vetores SV40, vetores do vírus do papiloma e vetores derivados do vírus Epstein-Barr. Outros vetores eucarióticos 25 exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTOlO/AM+, pMAMneo-5, baculovírus pDSVE e qualquer outro vetor que permita a expressão de proteínas sob a direção do promotor inicial SV40, promotor posterior SV40, promotor de metalotioneína, promotor do vírus do tumor mamário de murino, promotor do vírus do sarcoma de Rous, promotor da poliedrina ou outros promotores mostrados eficazes quanto a expressão em células eucarióticas.

Alguns sistemas de expressão têm marcadores que fornecem amplificação de gene tais como timidina quinase, higromicina B fosfotransferase e diidrofoliato redutase.

Os elementos que são tipicamente incluídos em vetores de

expressão também incluem um réplicon que funciona na E. coli, um gene que codifica a resistência a antibiótico para permitir a seleção de bactérias que abrigam plasmídeos recombinantes e sítios de restrição únicos em regiões não essenciais do plasmídeo para permitir a inserção de seqüências eucarióticas. O 10 gene de resistência a antibiótico particular escolhido não é crítico, qualquer um dos muitos genes de resistência conhecidos na técnica são adequados. As seqüências procarióticas são preferivelmente escolhidas tal que elas não interfiram com a replicação do DNA nas células eucarióticas, se necessário.

D. Células Hospedeiras e Métodos de Sua Produção A invenção também fornece células hospedeiras que não

produzem nenhum sulfeto de hidrogênio ou níveis baixos de sulfeto de hidrogênio e expressam um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto exógeno, como aqui descrito. Um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 20 não é uma treonina ou uma serina, é introduzido na célula hospedeira precursora pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando métodos recombinantes ou de cruzamento genético. Em algumas formas de realização, as células hospedeiras também não expressam um polipeptídeo METlO ativo em sulfeto, isto é, porque a seqüência codificadora para o 25 polipeptídeo MET10 ativo foi silenciada e substituída com a seqüência codificadora para um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto.

As células hospedeiras que produzem níveis baixos ou diminuídos ou reduzidos de sulfeto de hidrogênio produzem 50 % ou menos de H2S em comparação com a cepa precursora antes da introdução do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo METlO inativo em sulfeto. Em algumas formas de realização, as células hospedeiras que produzem níveis baixos ou diminuídos de sulfeto de hidrogênio produzem 40 %, 30 %, 25 %, 20 % ou menos H2S em comparação com a cepa precursora antes da introdução do 5 ácido nucleico que codifica o polipeptídeo METlO inativo em sulfeto.

As células hospedeiras, por exemplo, podem ser eucarióticas ou procarióticas. As células hospedeiras podem ser células bacterianas, mamíferas, de levedura ou de inseto. Em algumas formas de realização a célula hospedeira é uma célula de levedura, por exemplo, uma célula da 10 levedura S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarowwia lipolitica ou Schizosaccharomyces pombe. As células de levedura usadas na produção de bebidas fermentadas, por exemplo, vinho, porto, madeira, cerveja, champanhe, etc. (por exemplo, “levedura de vinho,” “levedura de cerveja,” “levedura de champanhe,” etc.) encontram uso para a introdução de um ácido 15 nucleico que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto exógeno. As célula de cepas de levedura para o uso na fabricação de bebidas fermentadas e que são candidatas para a inativação de METlO (isto é, elas são produtoras de sulfeto de hidrogênio), são comercialmente disponíveis de numerosas fontes, incluindo sem limitação, Lallemand (Lalvin) (Petaluma, 20 CA; na web em lallemandwine.us/products/yeastchart.php) Red Star (na web em www.redstaryeast.net/), White Labs (Boulder, CO; na web em whitelabs.com/yeastsearch.html), Wyeast (Odell, OR; na web em wyeastlab.com), Kitzinger’s, J. Laffort, Vierka5 Gervin, SB Active, Unican, Siebel Inst. e Fermentis (na web em fermentis.com/FO/EN/OO-Home/lO25 lOhome.asp). Ver, por exemplo, a web mundial em winemaking.jackkeller.net/strains.asp para uma lista representativa de cepas de levedura de vinho e champanhe e em byo.com/referenceguide/ yeaststrains/ para uma lista representativa de cepas de levedura de cerveja.

Em algumas formas de realização, a cepa de célula de levedura é uma cepa de S. cerevisiae. Em algumas formas de realização, a cepa de célula de levedura S. cerevisiae é uma levedura de vinho, por exemplo, selecionado de Prise de Mousse, Premier Cuvee, French Red, Montachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, 5 Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22. Ver, por exemplo, Patente U.S. N° 6.140.108, a divulgação inteira da qual é por meio deste aqui incorporada por referência para todos os propósitos. As cepas de levedura adicionais que são candidatas para a inativação de MET10, isto é, para a introdução de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto, são listados 10 nas Tabelas 1, 3 e 4.

Os métodos de transfecção padrão são usados para produzir linhagens de célula bacteriana, mamífera, de levedura ou de inseto que expressam quantidades grandes de uma proteína MET10 inativa em sulfeto, que são depois purificadas usando técnicas padrão (ver, por exemplo, Colley 15 et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). A transformação de células eucarióticas e procarióticas são realizadas de acordo com técnicas padrão (ver, por exemplo, Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); ClarkCurtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds, 20 1983).

Qualquer um dos procedimentos bem conhecidos para introduzir seqüências de nucleotídeo estranhas em células hospedeiras pode ser usado. Estes incluem o uso de transfecção com fosfato de cálcio, polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, lipossomas, microinjeção, 25 vetores plasmáticos, vetores virais e qualquer um dos outros métodos bem conhecidos para introduzir DNA genômico clonado, cDNA, DNA sintético ou outro material genético estranho em uma célula hospedeira (ver, por exemplo, Sambrook et al., supra). É apenas necessário que o procedimento de engenharia genética particular usado seja capaz de introduzir com êxito pelo menos um gene na célula hospedeira capaz de expressar METlO inativo em sulfeto. As células hospedeiras melhoradas para não produzir nenhum sulfeto de hidrogênio (isto é, produtores de H2S nulos), no geral também terão a METlO ativa silenciada, substituída ou mutada. Por exemplo, o ácido 5 nucleico que codifica uma METlO ative em sulfeto na cepa precursora pode ser mutado no códon (posições de ácido nucleico de 1984 a 1986) que codifica o aminoácido na posição 662 de modo que este códon não codifique uma treonina (ou uma serina). As técnicas de recombinação homóloga também encontram uso na substituição de um ácido nucleico que codifica um 10 polipeptídeo METlO ativo em sulfeto com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto, como aqui descrito. Ver, por exemplo, a Figura 3 e Baudin, et al., Nucleic Acids Res (1993) 21(14): 3329.

Depois que o vetor de expressão é introduzido nas células, as células transfectadas são cultivadas sob condições que favoreçam a expressão de METlO inativo em sulfeto, que é recuperada da cultura usando as técnicas padrão identificadas abaixo.

Um ácido nucleico de MET10 exógeno que codifica a enzima inativa também pode ser transferida em novos fundos genéticos usando as 20 tecnologias genéticas de levedura clássicas de isolação de esporo, o acasalamento de esporos do tipo de acasalamento oposto e isolação das cepas diplóides resultantes. Diversas rodadas de cruzamentos genéticos pode ser usado para isolar o novo alelo de MET10 em um fundo de cepa diferente. As ferramentas recombinantes não precisam ser usadas para a criação das cepas 25 modificadas. Os métodos exemplificados para introduzir um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto em uma célula hospedeira de levedura usando as tecnologias genéticas de levedura clássicas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N- 6.140.108.

E. Purificação da Proteína METlO A proteína METlO que ocorre naturalmente ou recombinante pode ser purificada para o uso em ensaios funcionais. As proteínas METlO que ocorrem naturalmente são purificadas, por exemplo, a partir de levedura e qualquer outra fonte de um homólogo de METl 0. METlO recombinante é 5 purificado a partir de qualquer sistema de expressão adequado.

METlO pode ser purificado até pureza substancial pelas técnicas padrão, incluindo precipitação seletiva com substâncias tais como sulfato de amônio; cromatografia em coluna, métodos de imunopurificação e outros (ver, por exemplo, Scopes, Protein Purification: Principies and Practice 10 (1982); Patente U.S. N- 4.673.641; Ausubel et al., supra; e Sambrook et al., supra).

Vários procedimentos podem ser utilizados quando a proteína METlO recombinante está sendo purificada. Por exemplo, proteínas tendo propriedades de adesão molecular estabelecida podem ser reversivelmente 15 fundidas a METl 0. Com o ligando apropriado, METlO pode ser seletivamente absorvido a uma coluna de purificação e depois liberada da coluna em uma forma relativamente pura. A proteína fundida é depois removida pela atividade enzimática. Finalmente, METlO pode ser purificado usando colunas de imunoafinidade.

IV. Determinação se uma Cepa de Levedura Produzirá H?S pela Detecção de Seqüência de Ácido Nucleico METlQ

Em uma forma de realização da invenção, métodos de determinar se uma cepa de levedura particular é uma produtora H2S produzida são fornecida. De acordo com os métodos da invenção, o alelo METlO da 25 cepa de levedura é analisado e comparado com os alelos METlO aqui divulgados para determinar se a cepa de levedura é uma produtora alta, baixa ou não produtora de H2S. Determinação da presença ou ausência de um alelo METlO particular é no geral realizada analisando-se uma amostra de ácido nucleico que é obtida a partir de uma levedura (por exemplo, do gênero Saccharomyces) a ser analisada. Frequentemente, a amostra de ácido nucleico compreende DNA genômico. Também é possível analisar amostras de RNA quanto a presença de alelos METl0.

As técnicas de detecção para avaliar ácidos nucleicos quanto a presença de uma mudança de base única envolve procedimentos bem conhecidos no campo da genética molecular. Além disso, muitos dos métodos envolvem a amplificação de ácidos nucleicos. Orientação ampla para a realização dos métodos é fornecida na técnica. As referências exemplares incluem manuais tais como PCR Technology: PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (ed. H. A. Erlich, Livreman Press, NY, N.Y., 1992); PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, 1994-2008, Wiley Interscience, incluindo as atualizações suplementares até Abril de 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a Ed, 2001).

Os métodos para detectar as mudanças de base única bem conhecidos na técnica frequentemente acarretam um de diversos protocolos gerais: hibridização usando oligonucleotídeos específicos de seqüência, 20 extensão de iniciador, ligação específica de seqüência, técnicas de sequenciamento ou separação eletroforética, por exemplo, polimorfismo conformacional de filamento único (SSCP) e análise de heteroduplex. Os ensaios exemplares incluem ensaios de 5’ nuclease, incorporação de terminador de corante direto padrão, ensaios de oligonucleotídeo específico 25 de alelo de sinal molecular, ensaios de extensão com base única e contagem de SNP pelas seqüências de pirofosfato em tempo real. A análise de seqüências amplificadas pode ser realizada usando várias tecnologias tais como microchips, ensaios de polarização de fluorescência e espectrometria de massa de ionização de dessorção auxiliada por matriz (MALDI). Além destas metodologias frequentemente usadas para a análise de amostras de ácido nucleico para detectar mudanças de base única, qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para detectar a presença das mutações METlO aqui descritas.

5 Embora os métodos tipicamente utilizam etapas de PCR,

outros protocolos de amplificação também podem ser usados. Os métodos de amplificação adequados incluem a reação da cadeia da ligase (ver, por exemplo, Wu & Wallace, Genomics 4: 560-569, 1988); ensaio de deslocamento de filamento (ver, por exemplo, Walker et al., Proc. Natl. Acad. 10 Sei. USA 89: 392-396, 1992; Pat. U.S. Ns 5.455.166); e diversos sistemas de amplificação com base na transcrição, incluindo os métodos descritos nas Pat. U.S. N— 5.437.990, 5.409.818 e 5.399.491; o sistema de amplificação de transcrição (TAS) (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 1173-1177, 1989); e a replicação de seqüência auto-sustentada (3 SR) (Guatelli et al., 15 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 1874-1878, 1990; WO 92/08800). Alternativamente, métodos que amplificam a sonda a níveis detectáveis podem ser usados, tais como a amplificação de Qp-replicase (Kramer & Lizardi, Nature 339: 401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35: 1826- 1831, 1989). Uma revisão de métodos de amplificação conhecidos é 20 fornecida, por exemplo, por Abramson e Myers em Current Opinion in Biotechnology 4: 41-47, 1993.

Em algumas formas de realização, o alelo METlO é detectado usando iniciadores e/ou sondas de oligonucleotídeo. Os oligonucleotídeos podem ser preparados por qualquer método adequado, incluindo a síntese 25 química. Oligonucleotídeos podem ser sintetizados usando reagentes e instrumentos comercialmente disponíveis. Alternativamente, eles podem ser adquiridos através de fontes comerciais. Os métodos de sintetizar oligonucleotídeos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981; e o método de suporte sólido da Pat. U.S. N° 4.458.066).

A. Identificação pela PCR de Alelos METlO

Em algumas formas de realização, a PCR é usada para 5 amplificar ácidos nucleicos que codificam alelos MET10. Uma vista geral da tecnologia aplicável pode ser encontrada em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds. (1990)) e PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed. (1992)). Além disso, a tecnologia de amplificação é descrita nas Patentes U.S. N° 10 4.683.195 e 4.683.202.

A PCR permite a reprodução e amplificação resultante de um ácido nucleico alvo, por exemplo, um ácido nucleico que codifica MET10. Em resumo, um ácido nucleico alvo, por exemplo o DNA a partir de uma amostra compreendendo as cepas de levedura de interesse, é combinado com 15 um iniciador de sentido e de anti-sentido, dNTPs, DNA polimerase e outros componentes de reação. (Ver, Innis et al., supra) O iniciador de sentido pode recozer ao filamento de anti-sentido de uma seqüência de DNA de interesse. O iniciador de anti-sentido pode recozer ao filamento de sentido da seqüência de DNA, a jusante da localização onde o iniciador de sentido recoze ao alvo 20 de DNA. Na primeira rodada de amplificação, a DNA polimerase estende-se aos iniciadores de anti-sentido e de sentido que são recozidos ao ácido nucleico alvo. Os primeiros filamentos são sintetizados como filamentos longos de comprimento indiscriminado. Na segunda rodada de amplificação, os iniciadores de anti-sentido e sentido recozem ao ácido nucleico alvo 25 precursor e às seqüências complementares nos filamentos longos. A DNA polimerase depois prolonga os iniciadores recozidos para formar filamentos de comprimento distinto que são complementares entre si. As rodadas subsequentes servem para amplificar predominantemente as moléculas de DNA do comprimento distinto. No geral, a PCR e outros métodos de amplificação usam iniciadores que recozem a cada extremidade do DNA de interesse. Por exemplo, ácidos nucleicos que codificam alelos METlO ou fragmentos destes podem ser amplificados usando pares de iniciador de ácido nucleico isolados tendo as seqüências apresentadas na Tabela 5.

B. Detecção de produtos amplificados

Os produtos amplificados podem ser detectados usando quaisquer meios conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, a análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP); eletroforese 10 em gel desnaturante (ver, por exemplo, Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY, PRtNCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION, W. H. Livreman e Co, Nova Iorque, 1992, Capítulo 7), sequenciamento direto e análise com base em HPLC. Os métodos de seqüência adequados incluem por exemplo, métodos com base em sequenciamento de didesóxi e seqüência de 15 Maxam e Gilbert (ver, por exemplo, Sambrook e Russell, supra). As análises com base em HPLC adequadas incluem, por exemplo, HPLC desnaturante (dHPLC) como descrito por exemplo, em Premstaller e Oefner, LC-GC Europe 1-9 (Julho de 2002); Bennet et al., BMC Genetics 2: 17 (2001); Schrimi et al., Biotechniques 28(4): 740 (2000); e Nairz et al., PNAS USA 20 99(16): 10575-10580 (2002); e HPLC de fase reversa de par de íonespectrometria de massa de ionização por eletropulverização (ICEMS) como descrito por exemplo, em Oberacher et al.; Hum. Mutat. 21(1): 86 (2003). Outros métodos para caracterizar mudanças de base única em alelos METlO incluem, por exemplo, extensões de base única (ver, por exemplo, Kobayashi 25 et al, Mol. Cell. Probes, 9: 175-182, 1995); análise de polimorfismo de conformação de filamento único, como descrito, por exemplo, em Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 86, 2766-2770 (1989), hibridização de oligonucleotídeo específico de alelo (ASO) (por exemplo, Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48: 70-382, 1991; Saiki et al., Nature 324, 163-166, 1986; EP 235.726; e WO 89/11548); e métodos de amplificação específica de seqüência ou extensão de iniciador como descrito, por exemplo, na WO 93/22456; Pat. U.S. N— 5.137.806, 5.595.890, 5.639.611; e Pat. U.S. Ns 4.851.331; ensaios de 5’nuclease, como descritos nas Pat. U.S. N- 5.210.015, 5.487.972, e 5.804.375;

e Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 7276-7280.

V. Métodos para reduzir níveis de H?S em bebidas fermentadas

As cepas de levedura compreendendo as seqüências de ácido nucleico METlO aqui descritas podem ser usadas para reduzir níveis de H2S em bebidas fermentadas (por exemplo, vinho e cerveja).

De acordo com os métodos da invenção, as células de levedura

transformadas com uma seqüência de ácido nucleico exógena que codifica um polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto, como aqui descrito, são contatadas com um meio de fermentação (por exemplo, um mosto de frutas ou um mosto cervejeiro) e a mistura é incubada por uma quantidade adequada de tempo 15 (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias) em um primeiro vaso de fermentação adequado (por exemplo, um tanque, barril, cântaro de barro, jarro, balde ou recipiente de polietileno) em uma temperatura adequada (por exemplo, de cerca de 70 a 75°F (21 a 24°C)) para a fermentação proceder. O líquido pode ser depois transferido a um segundo vaso de 20 fermentação. O segundo vaso pode ser selado ou não e os conteúdos são incubados por uma quantidade adequada de tempo (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas) em uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de 60 a 65°F (15 a 18°C)) para a fermentação anaeróbica e o envelhecimento proceder. O líquido é depois transferido para um terceiro vaso para trasfegar 25 (isto é, clarificar). O terceiro vaso é selado e o sedimento é deixado sedimentar por uma quantidade adequada de tempo (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semana). O trasfegar pode ser repetido uma, duas, três ou mais vezes ante de engarrafar a bebida fermentada. O alelo METlO nativo pode ser substituído usando as tecnologias de DNA recombinante ou cruzado através de estratégias de cruzamento clássicas. O alelo UCD932 METlO confere uma cor de colônia branca no ágar BiGGY, possibilitando que este alelo seja seguido em cruzamentos genéticos e seja facilmente triado durante a produção para demonstrar a implantação bem sucedida da cepa.

5 Quando o vinho está claro e toda a fermentação e

envelhecimento pré-garrafa parou, sifonar para dentro de garrafas de vinho e arrolhar as garrafas com firmeza. Deixar as garrafas arrolhadas em pé por 3 a dias e depois armazená-las deitadas a 55 graus Fahrenheit (12° C) por seis meses (vinho branco) a um ano (vinho tinto) antes da amostragem. Se não superou as expectativas, permitir o envelhecimento por mais um ano ou mais.

A levedura pode ser transformada usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, por exemplo, o método DNA/PEG carregador Liac/SS descrito por Gietz e Woods Methods in Enzymology 350: 87-96 (2002); Agatep et al., Technical Tips Online Transformation of 15 Saccharomyces eerevisiae pelo protocolo do acetato de lítio/DNA carregador de filamento único/polietileno glicol (LiAc/ss-DNA/PEG) (1998); e o método de híbrido duplo de levedura descrito em Gietz et al., Mol Cell Biochem 172: 67-79 (1997). Métodos para preparar células de levedura que são competentes para a transformação são apresentadas, por exemplo, em Dohmen et al. (1991) 20 Yeast 7: 691-692.

VI. Kits

METlO e seus homólogos são ferramentas úteis para identificação mais específica e sensível de cepas de levedura que são baixos produtores de H2S. Por exemplo, os ácidos nucleicos que especificamente 25 hibridizam aos ácidos nucleicos METl0, tais como sondas e iniciadores METlO (por exemplo, como apresentados na Tabela 5), ácidos nucleicos METlO (por exemplo como apresentados na Figura 2), são usados para identificar cepas de levedura que são baixos produtores de H2S.

A invenção também fornece kits e soluções para detectar os alelos METlO aqui descritos. Por exemplo, a invenção fornece kits que incluem um ou mais vasos de reação que têm alíquotas de alguns ou todos dos componentes de reação da invenção neles. As alíquotas podem estar na forma líquida ou seca. Os vasos de reação podem incluir cartuchos de processamento de amostra ou outros vasos que possibilitem a retenção, processamento e/ou amplificação de amostras no mesmo vaso. Tais kits possibilitam a detecção ligeira de produtos de amplificação da invenção em dispositivos de amplificação padrão ou portáveis. Os kits também podem incluir instruções escritas para o uso do kit para amplificar e controlar a amplificação de uma amostra alvo.

Os kits podem incluir, por exemplo, reagentes de amplificação compreendendo iniciadores suficientes para amplificar pelo menos um alelo METlO e pelo menos uma sonda para amplificar e detectar a seqüência de polinucleotídeo. Além disso, o kit pode incluir nucleotídeos (por exemplo, A,

C, G e T), uma DNA polimerase e tampões apropriados, sais e outros reagentes para facilitar as reações de amplificação.

Em algumas formas de realização, os kits compreendem vasos tais como cartuchos de processamento de amostra úteis para a amplificação rápida de uma amostra como descrito em Belgrader, et al., Biosensors and Bioelectronics 14: 849-852 (2000); Belgrader, et al., Science, 284: 449-450 (1999); e Northrup, M. A., et al. “A New Generation of PCR Instruments and Nucleic Acid Concentration Systems” em PCR PROTOCOLS (Sninsky, J. J. et al (eds.)) Academic, San Diego, Capítulo 8 (1998)).

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não para limitar a invenção reivindicada.

Exemplo 1: Identificação de Genes Oue Afetam a Produção de H?S

Para melhor entender os mecanismos e caminhos através dos quais o H2S é formado e para desenvolver estratégias de prevenção ou controle futuras, uma triagem do conjunto de cepas de deleção de levedura, compreendido de 4.827 mutantes, foi realizada para identificar genes que afetassem a produção de H2S. Uma coleção de isolados nativos das fermentações de vinho (Mortimer 1994) foi triada de modo a definir a base 5 das tendências de cor de colônia versus produção de H2S real. Além disso, uma coleção de mutantes nulos em levedura cuja cepa precursora é uma não produtora de H2S foi triada quanto aos genes que quando mutados resultaram na formação de H2S elevado. Os efeitos aditivos possíveis sobre a formação de H2S destas mutações foram também avaliadas.

Materiais e Métodos

Cepas de levedura e as condições de cultura. As cepas de levedura usadas para este estudo e cujos resultados são apresentados são listados na Tabela I. As cepas de levedura foram mantidas e cultivadas em meio de peptona dextrose em extrato de levedura com 2 % de glicose (YPD) 15 (Sherman et al. 1974). O mesmo meio (YPD) com geneticina (G418, 0,2 mg/ml) foi usado para a manutenção das cepas de deleção que carregam o

marcador G418R.

Tabela I. Cepas de Levedura Nativas e Industriais Cepas Genótipos Conhecidos ou Descrições Referência ou Fonte UCD522 [solados industriais UCD UCD713 Isolados industriais UCD UC D819 [solados industriais UCD UCD932 (Ba2) [solados nativos UCD UCD933 [solados nativos UCD UCD934 (Ba25) isolados nativos UCD UCD935 [solados nativos UCD UCD936 Isolados nativos UCD UCD937 [solados nativos UCD UCD938 (Ba86) [solados nativos UCD UCD939 (Ba99) Isolados nativos UCD UCD940 (Balll) Isolados nativos UCD UCD941 Isolados nativos UCD UCD942 (Ba 126) Isolados nativos UCD UCD943 solados nativos UCD UCD944 solados nativos UCD UCD945 solados nativos UCD UCD946 solados nativos UCD UCD947 solados nativos UCD UCD948 solados nativos UCD UCD949 solados nativos UCD UCD950 (Bal96) [solados nativos UCD UCD951 [solados nativos UCD UCD952 [solados nativos UCD UCD953 [solados nativos UCD UCD954 Isolados nativos UCD UCD955 Isolados nativos UCD UCD956 (Ba224) Isolados nativos UCD UCD957 (Ba229) Isolados nativos UCD UCD958 Isolados nativos UCD ELR303W BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3 AOmet 17:: G418 Open Biosystems YGR155W BY4742 MATahis3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0cys4::G418 Open Biosystems YHL03IC BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0gosl::G418 Open Biosystems YER060W-ABY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3 A0fcy22:: G418 Open Biosystems YGR138C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0tpo2::G418 Open Biosystems YDRl 5 8W BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0hom2::G418 Open Biosystems YJR139C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3 AOhom6::G418 Open Biosystems YNL315C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3 AOatpl 1: :G418 Open Biosystems YIL074C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0ser33::G418 Open Biosystems YNL03 IC BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0hht2::G418 Open Biosystems YBR095C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0rxt2::G418 Open Biosystems ILR384C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0iki3::G418 Open Biosystems YPL035C BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0ypl03 5c: :G418 Open Biosystems YDL047W BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3A0sit4::G418 Open Biosystems YBL046W BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3 A0psy4:: G418 Open Biosystems YGL029W BY4742 MATa his3Al leu2A0 lys2A0 ura3 AOcgrl ::G418 Open Biosystems DNA e Manipulações Genéticas. As manipulações genéticas

incluindo cruzamentos, esporulação e análise tétrade foram realizadas usando procedimentos padrão (Gunthrie 1991). As deleções de gene foram confirmadas pela PCR usando o iniciador avançado a montante e um iniciador 5 interno reverso para o marcador de rompimento KanMX - JKKanRE. As condições de amplificação foram como segue: 30 ciclos de 94° C por 2 min., 92° C por 45 s, 56° C por 30 s, 72° C por 1 min e uma extensão final a 72° C por 7 min. As seqüências iniciadoras estão listadas na Tabela 5.

Triagem de conjunto de deleção e cepas nativas. O conjunto de 10 deleção (Open Biosystems, Huntsville, AL) e a coleção de isolados nativos foram triadas em ágar BiGGY, um ágar de levedura de bismuto glicose glicina (Nickerson 1953). Estes também foram triados em meio de suco de uva sintético “Meio de Mosto de Frutas Mínimo” (MMM) (Spiropoulos et al. 2000) inicialmente com 123 mg de equivalentes de nitrogênio/litro. O nível de 15 nitrogênio foi gerado usando 0,2 g de L-arginina/litro e 0,5 g de fosfato de amônio/litro. Análise da formação de sulfeto de hidrogênio. A produção de sulfeto de hidrogênio foi avaliada usando o método do acetato de chumbo (Spiropoulos et al. 2000; Giudici, P. e R. E. Kunkee, 1994). A formação de sulfeto de hidrogênio foi inicialmente detectada usando tiras de papel (papel 5 de filtro Whatman de 2 x 10 cm, 3 mm) que foram previamente tratadas com 50 μΐ de solução a 5 % de acetato de chumbo e deixadas secar na temperatura ambiente. As tiras de acetato de chumbo foram dobradas na metade e inseridas em tubos de cultura de 50 ml com a tampa do tubo de cultura prendendo cada extremidade da tira, encerrando a porção intermediária da tira 10 de acetato de chumbo no ambiente gasoso acima do meio líquido. A formação de sulfeto de hidrogênio foi qualitativamente medida pelo grau de enegrecimento da tira de acetato de chumbo. Esta triagem foi conduzida por Carrie Findleton como parte da sua dissertação de tese de MS.

Todos os positivos foram confirmados usando um método 15 mais sensível e semi-quantitativo. Uma tira de papel de filtro Whatman (1,5 x 8,0 cm, 3 mm) foi enrolada e colocada em uma pipeta plástica sem bulbo de 1 ml e tratada com 25 μΐ de uma solução a 3 % de acetato de chumbo. O papel foi deixado secar na temperatura ambiente e a coluna plástica de acetato de chumbo foi depois ligada ao tubo de cultura de 50 ml com uma tampa de 20 silicona. A formação de sulfeto de hidrogênio foi medida em mm de escurecimento sobre o papel.

Em experimentos subsequentes, para quantificar a produção de H2S, colunas de acetato de chumbo empacotadas foram usadas, em que cada mm de enegrecimento na coluna indicou 4 μg/L de H2S. as colunas de acetato de chumbo foram adquiridas da Figasa International Inc. (Seoul, Coréia).

Condições de fermentação. Para identificar as cepas de levedura e as condições nutricionais que causam impacto sobre a formação de sulfeto de hidrogênio, culturas de levedura foram cultivadas em 5 ml de Meio Triplo M modificado em 50 ml de tubos de cultura a 25° C sobre placas agitadoras a 120 rpm. O meio de suco de uvas sintético “Meio de Mosto de Frutas Mínimo” (MMM) (Giudici et al. 1993) foi usado e modificado a partir da receita original para produzir sete composições de nitrogênio e micronutrientes diferentes. Adições de arginina, fosfato de amônio e ácidos de 5 casamino foram manipuladas para ajustar a concentração de nitrogênio e as adições de YNB (Base de Nitrogênio Levedura sem Aminoácidos e Sulfato de Amônio) foram ajustadas para controlar as concentrações de nutriente e vitamina. As modificações de Triplo M são ilustradas na Tabela 2.

Tabela 2 Composição de Meio Triplo M Modificado Variedade MMM Arginina Fosfato de Acidos de YNB (g/litro) amônio casamino (g/litro) (g/litro) (g/litro) 433 g de equivalentes de nitrogênio/litro 0,8 1 2 1,7 123 g de equivalentes de nitrogênio/litro 0,2 0,1 2 1,7 123 g de equivalentes de nitrogênio/litro e 1/5 YNB 0,2 0,1 2 0,34 65 g de equivalentes de nitrogênio/litro, nenhum ácido de casamino 0,2 0,03 0 1,7 65 g de equivalentes de nitrogênio/litro 0,107 0,015 1 1,7 65 g de equivalentes de nitrogênio/litro e 1/2 YNB 0,107 0,015 1 0,85 65 g de equivalentes de nitrogênio/litro e 1/3 YNB 0,107 0,015 1 0,567 Inóculos de levedura foram obtidos de colônias de levedura

plaqueadas. Este procedimento pode ter resultado em alguma variação no número de célula na inoculação, mas foi necessário devido ao grande número de cepas de levedura envolvidas no processo de triagem preliminar. A formação de sulfeto de hidrogênio foi avaliada depois de quatro dias pelo grau de enegrecimento da tira de acetato de chumbo. As cepas que não cresceram 15 em quatro dias foram repetidas para garantir que não houvesse nenhuma outra variável que resultasse na ausência de crescimento.

Para as cepas selecionadas de interesse, a formação de sulfeto de hidrogênio foi quantificada usando colunas de acetato de chumbo. Para este propósito, as fermentações foram conduzidas em frascos Erlenmeyer de 20 500 ml, contendo 300 ml de MMM, com uma coluna de acetato de chumbo presa no topo do frasco em uma rolha de borracha. Para este propósito, 123 mg/l de nitrogênio MMM foi usado para imitar mais acuradamente as condições do suco de uvas com nitrogênio baixo. As fermentações foram iniciadas a uma densidade de 1,33 x IO5 células/ml pela inoculação com células da fase estacionária de uma cultura pré-cultivada em Meio Triplo M da mesma composição. As fermentações realizadas em triplicata, incubadas a 25°C e 120 rpm e monitoradas durante sete dias pela perda de peso e escurecimento na coluna de acetato de chumbo.

Triagem do conjunto de deleção e isolados nativos em ágar BiGGY. Para avaliar a produção de H2S das cepas de deleção e isolados nativos estes foram inicialmente todos plaqueados em ágar BiGGY e a cor das colônias avaliadas. As cores da colônia foram branca, castanha clara, castanha 10 (cor da cepa precursora do conjunto de deleção), marrom claro, marrom ou preta (Linderholm et al. 2006). A partir do conjunto de deleção, quatro colônias foram brancas, 258 foram castanhas claras, 4478 foram castanhas, 59 foram marrom claras, 28 foram marrons e uma colônia foi preta variando na cor de colônia de clara para escura.

Triagem de isolados nativos e comerciais em suco sintético.

Trinta isolados nativos foram triados em suco sintético MMM com 123 mg/l de nitrogênio para avaliar a produção de H2S versus a cor da colônia. As não produtoras de H2S (isto é, UCD932, UCD713, UCD819, UCD938, UCD942, UCD954 e UCD956) tiveram cores de colônia variando de branca a marrom 20 clara. As cepas produtoras de H2S variaram de castanho claras (3) a castanhas (10) a marrom claras (5) a marrom (5). As colônias mais escuras (marrom) variaram de 2 a 6 mm de H2S e estão na faixa intermediária de produção. As três produtoras mais altas (acima de 10 mm) são castanhas claras, castanhas e marrom claras em BiGGY. Os isolados nativos em BiGGY e em MMM são 25 mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. Isolados nativos em BiGGY e em MMM Cepa Cor da colônia H2S (mm) UCD522 Castanha 4 UCD713 Castanha 0 UCD819 Castanha 0 UCD932 Branca 0 UCD933 Marrom 3 UCD934 Castanha 5,5 UCD935 Castanha 10,5 UCD936 Marrom 2 UCD937 Castanha clara Traço UCD93 8 Castanha 0 UCD939 Castanha clara 14,5 UCD940 Marrom 6 UCD941 Marrom 2 UCD942 Castanha clara 0 UCD943 Marrom clara 3,5 UCD944 Marrom clara Traço UCD945 Castanha 8 UCD946 Castanha 2 UCD947 Castanha 1,75 UCD948 Castanha 2,5 UCD949 Castanha clara Traço UCD950 Marrom clara 19 UCD951 Castanha 5,5 UCD952 Castanha 8 UCD953 Marrom clara Traço UCD954 Marrom clara 0 UCD955 Marrom 4 UCD956 Branca 0 UCD957 Castanha 9 UCD958 Marrom clara 1 Exemplo 2: Identificação de mutações no alelo METlO de UCD932

Como apresentado no Exemplo 1 acima, UCD932 foi identificada como uma cepa de levedura que produz sulfeto de hidrogênio de pouco a indetectável sob uma variedade de condições ambientais. Esta cepa também produz colônias brancas em ágar BiGGY, associada com a atividade de sulfito redutase baixa. Uma triagem do conjunto de deleção de cepas para S. cerevisiae produziu quatro mutações possíveis resultando em colônias brancas, todas codificando componentes da sulfito redutase. Os cruzamentos genéticos revelaram que o fenótipo de BiGGY de colônia branca em UCD932 foi devido a uma alteração do gene METl0. A cepa de deleção de METlO foi um auxótrofo de metionina mas UCD932 não é um auxótrofo de metionina, indicando que a atividade da sulfito redutase é ainda retida pela célula. Para definir a base genética desta capacidade de produção de sulfeto baixa, o MET10 e vários outros genes no caminho da redução de sulfato, identificados como possivelmente desempenhando um papel na supressão de H2S em S. cerevisiae, (Linderholm et al. 2006) foram sequenciados. Isto permitiria a identificação de alelos que poderiam ser substituídos nas cepas de vinho que produzem H2S para eliminar as características de sulfeto indesejáveis. Materiais e Métodos

Cepas de levedura e condições de cultura. As cepas de 5 levedura usadas para este estudo são listadas na Tabela 4. As cepas de levedura foram mantidas e cultivadas em meio de peptona dextrose extrato de levedura com 2 % de glicose (YPD) (Sherman et al. 1974). O mesmo meio (YPD) com geneticina (G418, 0,2 mg/ml) ou higromicina (Hph, 0,3 mg/ml) foi usado para a manutenção das cepas de deleção que carregam o marcador 10 G41 8r ou HphMX. O meio mínimo (YNB) foi fabricado com 0,67 % de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e suplementada com ácidos de casamino como recomendado (Sherman). Meios de desligamento de -met

seletivos foram fabricados de modo similar ao YNB sem a metionina.

Tabela 4 Cepas de Levedura Adicionais Cepas Genótipos conhecidos ou descrições Referência ou Fonte UCD932 (Ba2) Isolados nativos UCD UCD934 (Ba25) Isolados nativos UCD UCD938 (Ba86) Isolados nativos UCD UCD939 (Ba99) Isolados nativos UCD UCD940 (Balll) Isolados nativos UCD UCD942 (Bal26) Isolados nativos UCD UCD950 (Bal96) Isolados nativos UCD UCD956 (Ba224) Isolados nativos UCD UCD957 (Ba229) Isolados nativos UCD UCD522 Isolados industriais UCD YKR069W BY4742 MATa. his3Al leu2AO lys2AO ura3AOmet 1::G418 Open Biosystems YJR137C BY4742 MATa. his3Al leu2AO lys2AO ura3AOmet5::G418 Open Biosystems YBR213W BY4742 MATa. his3Al leu2AO lys2AO ura3AOmet8::G418 Open Biosystems YFR030W BY4742 MATa. his3Al leu2AO lys2AO ura3AOmetlO::G418 Open Biosystems ALY38 UCD932 METl Os2s8c Este estudo ALY39 UCD932MET IOucuyj2 Este estudo ALY95 UCD932MET10UUJy5U Este estudo ALY72 BY4742 METIOucd95u Este estudo ALY40 UCD9 5 OMETI Os2s8c Este estudo ALY41 UCD950MET1 Oucuw2 Este estudo ALY126 UCD950 METlOucuyiu Este estudo ALY127 UCD939 MET/0 ucuwy Este estudo ALY128 UCD939 METlOv88c Este estudo ALY130 UCD940MET10S2S!!C Este estudo ALY129 UCD940 METlOucuy4u Este estudo ALY13 1 UCD940 METlOucuy32 Este estudo ALY132-1A UCD522 MET10:: KanMX4 Este estudo ALY133-1B UCD522 METlOs288c Este estudo ALY134-1C UCD522 METlOii2ssc Este estudo ALY135-1D UCD522 METlO:: KanMX4 Este estudo ALYl 36-IA UCD522MET10ÜU>^ Este estudo ALY137-1B UCD522 MET10:: hphNTl Este estudo ALY138-1C UCD522 METlO:: hphNTl Este estudo ALYl 39-ID UCD522MET1 Oucusi2 Este estudo ALYl 40-IA UCD522 METlOucuyj2 Este estudo ALY141-1B UCD522MET1 Oucuyj2 Este estudo ALY142-IC UCD522 MET10:: KanMX4 Este estudo ALY143-1D UCD522 MET10:: KanMX4 Este estudo Triagem do conjunto de deleção. O conjunto de deleção de

levedura (Open Biosystems, Huntsville, AL) foi triado em ágar BiGGY, um ágar de levedura bismuto glicose glicina (Nickerson 1953), suplementado com ácidos de casamino (Sherman 1974). Cada cepa foi plaqueada em ágar 5 BiGGY e incubada a 30° C por 48 horas. As colônias resultantes foram avaliadas quanto a cor.

Análise de seqüência. A análise de seqüência de METl 0, HOM2, HOM6, SER33, METI, MET5 e MET8 foi realizada em 169 cepas nativas e industriais de levedura. O DNA cromossômico foi extraído das 10 pelotas de célula usando o protocolo de esmagar e espremer (Hoffman e Winston 1987) e a amplificação dos genes foi realizada usando High Fidelity Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA) e os iniciadores PCR-MET10- F/PCR-MET10-R para METl0, HOM2-F/HOM2-R para HOM2, HOM6- F/HOM6-R para HOM6, SER33-F/SER33-R para SER33, MET1-F/MET1-R 15 para METI, MET5-F/MET5-R para MET5 e MET8-F/MET9-R para MET8 (Tabela 5). As condições de amplificação foram como seguem: 30 ciclos de 94° C por 1 min., 94° C por 30 s, 50° C por 30 s, 68° C por 4 min. e uma extensão final a 68° C por 7 min.

Tabela 5. Iniciadores de PCR

Iniciador Seqüência (5’-> 3’) SEQ ID NO: HOM2 HOM2-F CACTT AAGT ACACAT ACAAA 35 HOM2-R GGGTCAGCGAGAGAATT 36 HOM6 HOM6-F CCT GGT GGTAAAGTT GGG 37 HOM6-R GATT GT AG AAG ATT GAGT AG 38 SER33 SER33-F GGAATCTCCCAGGTTTAAT 39 SER33-R GGGCAATCAAAGGCTAT 40 METl MET I-F CGCTAATAAACTCGCTACAAAAG 41 METl-R CGTCCTTTTTGCTCAATATCC 42 MET5 MET5-F GCT GC AAGC AGTT AT AT AAAGTG 43 MET5-R AAAACCGAACTAGCCGAAG 44 MET8 MET8-F AAAATCGCTACAAAGTCCG 45 MET8-R GCATTGTTGTTCGTTCTCC 46 Iniciadores METlO PCR-METIO-F CGGATCCCCAATCACCATAACACTT 47 PCR-METIO-R pCCGCGGTAGGGTCTTCAGGACGAG 48 METlO-F-KO CAAATAGTTTCGTTTAGATGG 49 METlO-R-KO GTATAATGTGATGGTTAGTT 50 MET10-hphMX-F ACTGTGTTTATCACTTATGGGTCTTTAGAATCCGA 51 ATTGTATTTTGATGGCCGCACGG METl 0-hphMX-R AACAATTCAAAAATGTCAGCATATGTATAATACT 52 CCACATAATCGACAGCAGTATAGCGACCA Iniciadores de Confirmação JKKanRE GGGCGACAGTCACATCAT 53 HYGROB CHK R TGACGGTGTCGTCCATCAC 54 Todos os sequenciamentos foi realizados no College of

Biological Sciences Sequencing Facility na University of Califórnia, Davis usando-se um analisador genético de eletroforese capilar ABI 3730 e a química de sequenciamento de ciclo ABI BigDye Terminator versão 3.1 5 (Foster City, CA), os iniciadores usados estão listados na Tabela 6. Os dados de seqüência foram editados e analisados com o Editor de Alinhamento de Seqüência BioEdit (versão 5.0.9; Nucleic Acids Symp. Ser. 41: 95-98).

Tabela 6 Iniciadores de Sequenciamento de MET

Iniciador Seqüência (5’ -> 3’) SEQ ID NO: METl METl-SlF TGGGGAGAGTTCTGGTATGCAAG 55 MET1-S2F CAGAT GGTT ATCTC AGAT AAT GGAG 56 MET1-S3F TttcttcAAAGATCACGGATATATT 57 METl-SlR GCTATATCACGTTGAGTAGCGG 58 MET1-S2R GGTACTACACCCTCTGTGACAGTT 59 MET1-S3R CTCAGTTTTTGGCATTGCCA 60 MET5 MET5-S1F CCTAATAAACTT CC ATTGGT GATT A 61 MET5-S2F CCGTTTTAC AGGGT GTCTCT AAGA 62 MET5-S3F GACGCGATCTTGACGAAGCT 63 MET5-S4F GAATCTGGTTACTGGCCATTGT 64 MET5-S5F CT GAAAAAT G ACACCG ACTTGG 65 MET5-S6F TGGCTTGCTCTGGATCACTT 66 MET5-S7F CGATGTCGGTTTAGTTGCTATAGTT 67 MET5-S8F TGGTAATCAACATTTGGTTATCTCT 68 MET5-S1R GGGCAACCAGTCATTCTCATAA 69 MET5-S2R CTTCGACACCCATATCATCTACAG 70 MET5-S3R CAATTTTCCCATATCAGCGA 71 MET5-S4R CATCATCAACAGCAGCGCCG 72 MET5-S5R CTGATCGAAGGCAGCCTTGC 73 MET5-S6R CATATGGCTCTGAATCAATCAATAA 74 MET5 -S 7R TTCACAACTTTTTTGACAGAAGAA 75 MET5-S8R CGTTAGCAATCTCCAAGGTAGGAA 76 MET8 MET8-S1F GCAGT GACTTCAAAGACGAAT ACC 77 MET8-S2F CTGGAGGACGCTGTCGTCAA 78 MET8-S1R TCATCTCTTACTAGAGCGCCAA 79 MET8-S2R GGTCCCAGTTCGGATTGAT AA 80 MET10 MET10 SEQl-F AGTCATCTTCGAGCAAA 81 MET10 SEQ2-F TCATGATGGTAAGTTTC 82 MET10 SEQ3-F TCAACGTCAGAGTGCCATT 83 MET10 SEQ4-F ATCAGTCGTTGAAGATGTC 84 MET10 SEQ5-F CTGAGATCTCTGATATTGC 85 MET10 SEQ6-F TGCAGTAGATTTGAAGAGAT 86 MET10 SEQ7-F CACACACATCGGCGCT 87 MET10 SEQl-R CGGAGTCACGACACCAT 88 MET10 SEQ2-R GGCTGAAACTTGAGATCTC 89 MET10 SEQ3-R CTTGACGTAACTTTCTACAG 90 MET10 SEQ4-R TCATAATCAGCAGGCGTAAC 91 MET10 SEQ5-R CTTCTCTTCAATGGTTCAAT 92 MET10 SEQ6-R AGTAGGGCCAGACAAGT 93 Os números de Acesso no GenBank para estas seqüências são:

UCD932 METlO (EF058164), UCD938 METlO (EF058165), UCD939 METlO (EF058166), UCD940 METlO (EF058167), UCD942 METlO (EF058168), UCD956 (EF058169), UCD522 MET10 (EF058170), UCD957 5 MET10 (EF058171), UCD934 MET10 (EF058172), UCD950 MET10 (EF058173), UCD932 SER33 (EF058174), UCD939 SER33 (EF058175), UCD940 SER33 (EF058176), UCD956 SER33 (EF058177), UCD950 SER33 (EF058178), UCD932 HOM6 (EF058179), UCD932 METl (EF058180), UCD939 METl (EF058181), UCD940 METl (EF058182), UCD950 METl 10 (EF058183), UCD956 METl (EF058184), UCD956 MET5 (EF058185), UCD932 MET5 (EF058186), UCD940 MET5 (EF058187), UCD939 MET5 (EF058188), UCD932 MET8 (EF058189), UCD939 MET8 (EF058190), UCD940 MET8 (EF058191), UCD950 MET8 (EF058192), UCD956 MET8 (EF058193).

Manipulações Genéticas. As manipulações genéticas incluindo cruzamentos, esporulação e análise de tétrade foram realizados usando procedimentos padrão (Guthrie 1991).

Plasmídeos, manipulações de DNA e métodos de transformação. Os plasmídeos pAL51 (METlOs288c), pAL52 (MET10 ijCD932) foram usados neste estudo. Os iniciadores, PCR-MET10-F/PCRMETlO-R (Tabela 5), que carregam os sítios de restrição BamHI e SacII foram designados para amplificar o DNA cromossômico de METlO das cepas de levedura UCD932 e S288C (Invitrogen, Carlsbad, CA). O plasmídeo pYC130 (Olesen et al. 2000), é um vetor centromérico que carrega o marcador selecionável G418R foi digerido com BamHI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, MA) para permitir quanto a ligação de METl 0. Os plasmídeos resultantes, pAL51 (METlOs288c), pAL52 (METIOucd932) foram usados para a transformação. As deleções de gene de MET10 foram criadas usando uma técnica com base na PCR, Figura 3 (Baudin 1993). Um cassete de deleção contendo KanMX (Yeast Delection Collection) com projeções na região não codificadora em ambos os lados de METlO foi amplificado pela PCR usando iniciadores, METÍO-F-KO/METIO-R-KO e o fragmento de PCR linear foi transformado em células diplóides de levedura UCD522, UCD932, UCD939, UCD940 e UCD950. Pela recombinação homóloga uma cópia do METlO intacto foi substituída com o cassete silenciado gerando cepas que carregam uma cópia tanto de uma cópia intacta de MET10 quanto um marcador KanMX. Todas as cepas, exceto UCD522 MET10/ KanMX, foram depois esporuladas e aqueles homólogos para G418R foram usados para outros experimentos. As deleções de gene foram confirmadas pela PCR usando o iniciador avançado a montante e um iniciador reverso interno para o marcador de rompimento KanMX - JKKanRE.

Para silenciar a cópia intacta remanescente de MET10 em UCD522 METIO/KanMX, um cassete HphMX foi amplificado a partir de pYC140 linearizado com BamHI (Hansen et al. 2003) usando iniciadores METIO-hphMX-F/METIO-hphMX-R e o fragmento de PCR linear foi transformado em ALY29. Uma colônia auxotrófica em metionina que demonstra tanto G418R quanto HphR foi selecionada e a deleção de HphMX confirmada pela PCR usando o iniciador avançado a montante e um iniciador 5 reverso interno para o marcador de rompimento HphMX - HYGROB CHKR.

Trocas de alelo de METlO também foram criadas usando uma técnica com base na PCR (Figura 3) (Baudin 1993). Alelos de METlO foram amplificados a partir de S288C, UCD932, UCD939, UCD940, UCD950 e UCD522 usando iniciadores METIO-F-KO/METIO-R-KO. Os fragmentos de 10 PCR lineares amplificados a partir de S288C e UCD932 foram depois transformados nas cepas auxotróficas em metionina. Os outros fragmentos foram transformados em cepas individuais para criar as cepas de controle correspondentes.

As cepas que demonstram a capacidade para crescer em placas 15 auxotróficas em metionina foram selecionadas e esporuladas para criar cepas homólogas para METlO para outros experimentos. S. cerevisiae foi transformada usando o método do acetato de lítio adaptado do Schiestl e Gietz (1989) e E. coli foi transformada usando o método descrito por Inoue et al. (Inoue et al. 1990). E. coli INVaF’ (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usada para 20 preparações plasmídica. Meio de Luria-Bertani (Miller 1972) com ampicilina foi usado para a seleção quanto as células de E. coli transformada.

Condições de Fermentação. Nos experimentos de fermentação, o meio de suco de uvas sintético “Meio de Mosto de Frutas Mínimo” (MMM) (Spiropoulos et al. 2000) foi usado com 208 mg de 25 equivalentes de nitrogênio/litro. O nível de nitrogênio foi gerado usando 0,2 g de L-arginina/litro e 0,5 g de fosfato de amônio/litro. As fermentações foram iniciadas a uma densidade de 1,33 x IO5 células/ml pela inoculação com células da fase estacionária a partir de uma cultura pré-cultivada em meio iniciador MMM. As fermentações foram conduzidas em frascos Erlenmeyer de 500 ml contendo 300 ml de meio. Cada frasco foi abastecido com uma rolha de silicona com um tubo de acetato de chumbo acoplado. Os frascos foram incubados a 25° C com agitação a 120 rpm. As fermentações foram monitoradas por sete dias usando a perda de peso como uma estimativa da 5 produção de CO2.

Resultados

Caracterização da produção de sulfeto de hidrogênio das cepas de deleção. De modo a avaliar a produção de sulfeto de hidrogênio do conjunto inteiro de cepas de deleção estas foram inicialmente todas 10 plaqueadas em ágar BiGGY e a cor das colônias avaliada. As colônias foram brancas, castanha claras, castanhas (cor da cepa precursora), marrom claras, marrons ou pretas. Quatro colônias foram brancas, 258 foram castanha claras, 4478 foram castanhas, 59 foram marrom claras, 28 foram marrons e uma colônia foi preta. As quatro deletantes que produzem colônias brancas foram 15 em METl0, MET8, MET5 ou METI. Foram também identificados HOM2, HOM6 e SER33 como possivelmente desempenhando um papel na supressão da formação de sulfeto de hidrogênio (Linderholm et al. 2006).

A identificação do gene responsável para a brancura em uma cepa nativa. UCD932, uma cepa nativa isolada da Itália (Mortimer et al. 20 1994) é uma não produtora de H2S branca em ágar BiGGY. Para identificar o gene que é responsável pelo seu fenótipo branco, a mesma foi acasalada com cada uma das cepas de deleção brancas. Apenas uma cepa falhou em complementar o fenótipo branco de UCD932, YFR030W BY4742.

Quando um vetor que carrega a cópia do tipo selvagem de 25 MET10, pAL51 (METlOs288c), foi transformado em UCD932, o mesmo resultou em uma cepa de UCD932 para produzir colônias castanhas mas não levaram à formação de sulfeto (Tabela 7). Isto sugeriu que mais do que um gene, possivelmente em combinação com MET10, é responsável pelo fenótipo de produção de H2S baixa de UCD932. Tabela 7 Propriedades de Fermentações de Produção de Sulfeto de

Hidrogênio Transformadas com METlO

Cepasa Taxa de Fermentação Máxima (g/h)bcd H2S Total (μ^) Vetor UCD932 0,437 < 1 UCD932pMETl Osiiiiic 0,446 < 1 UCD932pMET IOucuwi 0,408 < 1 aVetor: pYC130; pMETIO c: pAL51; pMETlOucijy32: pAL52

b A taxa de fermentação máxima foi calculada a partir dos dados da taxa de fermentação usando-se pontos de tempo que correspondem ao declive mais íngreme no peso. c Valores representam a média de determinações independentes de duas réplicas. d As fermentações atingiram a secura (definido por < 0,5 % de açúcar remanescente).

A análise de seqüência de genes no caminho da redução de

sulfato. Foi demonstrado anteriormente que UCD932 carrega mutações em CYS4 e MET6, ambos codificando enzimas importantes no caminho da redução de sulfato (Linderholm et al. 2006). Entretanto, a introdução de alelos do tipo selvagem para este fundo não alterou a característica de produzir H2S baixo. Foi portanto interessante identificar quais outras mutações nesta cepa carregariam em outros genes no caminho. Diversos genes do caminho da redução de sulfato, MET10, HOM2, HOM6, SER33, METI, MET5 e MET8 foram sequenciados de UCD932 assim como de várias outras cepas nativas e industriais que variam em cor no ágar BiGGY e na produção de H2S em suco sintético (Spiropoulos et al. 2000) para avaliar a diversidade genética do caminho da redução de sulfato (um alinhamento de seqüência de METlO de várias cepas de Saccharomyces é encontrada na Figura 2). As diferenças de aminoácido de METlOp é mostrada na Tabela 8. Ta jela 8 Diferenças de Aminoácido de METlOp Posições de 135 172 314 475 511 590 662 896 Aminoácido Consenso T Nenhum P D Nenhum Nenhum T P Modificação3 N T PouS A I K K S (Cepas) (UCD932) (UCD522. (UCD940) (UCD938. (UCD934. (UCD934. (UCD932) (UCD956) TouN 932. 940. 942) 950. 957) 950. 957) (UCD940) 938.942. T E 956) (S288C. (S288C. A UCD932 UCD522 (S288C. 989. 939 932. 938 UCD934. 940. 942. 940. 942. 957.950) 956) 956) A ou T T ou I Q (UCD939) (UCD522) (UCD939) a Cepas com duas possibilidades de aminoácido indicam que a cepa carrega dois alelos. A análise de seqüência de METlO (um componente da enzima sulfito redutase) demonstrou que ela não é conservada entre as cepas de levedura (Tabela 9). Seis alelos, diferentes daquele de S288C, foram encontrados nas dez cepas que foram sequenciados. Eles foram livremente 5 agrupados pela cor em BiGGY e produção de H2S. UCD934, UCD957 e UCD950, produtores de H2S castanho, carregaram o alelo idêntico. UCD938 e UCD942, não produtores de H2S castanho carregaram o mesmo alelo. UCD522 e UCD940, produtores de H2S marrom, foram heterozigotos mas ambos os alelos foram idênticos para aqueles encontrados em outras cepas.

UCD932 e UCD956, não produtores de H2S branco e UCD939, um produtor

de H2S castanho, cada um carregou alelos diferentes.

Tabela 9 Propriedades de Fermentações que Produzem Sulfeto de Hidrogênio com METlO Diferentes Cepas Alelo Taxa de Fermentação Máxima (g/h)abc H2S Tota1 ^g) UCD932 MET1Os28iic 0,37 <1 MET10 0,34 <1 METlO UUJyMJ 0,41 <1 BY4742 METlO u<JDyiU 0,26 <1 UCD950 MET1Os2ssc 0,42 32 MET10 ucuyi2 0,40 <1 MET10 ucuyiu 0,41 29 UCD939 METlOs2ssc 0,46 <1 MET10 UCL)yjZ não viável MET10 UUJyJy 0,35 41 UCD940 MET1Os2ssc 0,40 54 MET10 ucuy^ 0,42 <1 METlOucuy4u 0,42 49 a A taxa de fermentação máxima foi calculada a partir da taxa de fermentação usando-se pontos de tempo que correspondem à inclinação mais íngreme em peso bValores representam a média de determinações independentes de duas réplicas. c As fermentações atingiram a secura (definido por < 0,5 % de açúcar remanescente). Os outros genes no caminho da redução de sulfato foram

mostrados ser mais conservados. Não houve nenhuma diferença na seqüência de aminoácido ou DNA em HOM2 (codifica a aspártico beta semi-aldeído 15 desidrogenase), uma diferença de aminoácido em HOM6 (codifica a homosserina desidrogenase) em UCD932, uma diferença de aminoácido in SER33 (codifica a 3-fosfoglicerato desidrogenase) entre S288C e todas as outras cepas de vinho e diversas diferenças de aminoácido em METI, MET5 e MET8 (todos os componentes da enzima sulfito redutase)). Troca de alelos METl0. A diversidade genética de alelos METlO e a correlação evidente com a produção de H2S e a cor da colônia sustentou a hipótese de que os genes no caminho da redução de sulfato pode ser responsável pelo fenótipo de H2S em cepas de vinho, visto que a cor no 5 ágar BiGGY está vagamente correlacionada com a produção de H2S através da detecção da atividade de sulfito redutase. O efeito de METlO na produção de H2S nas cepas que produzem H2S foi portanto avaliada. Os alelos METlO de cepas de levedura que produzem H2S foram substituídos com o alelo met10ucd932 ^pigura 3) 0s genes JVfET10 nativos em UCD950, UCD940, 10 UCD939, UCD522 e UCD932 foram deletados com um cassete KanMX ou HphMX e depois os cassetes KanMX ou HphMX foram substituídos com um alelo METlO de UCD932, S288C ou seus próprios alelos como um controle. Todas as cepas que carregam a METlOuc932 fermentada na mesma taxa como as cepas precursora e de controle mas tomaram-se não produtoras de H2S e 15 foram mais claras na cor no ágar BiGGY. As cepas que carregam um alelo de S288C ou seu próprio alelo manteve o seu fenótipo de produzir H2S (Tabela

9).

As cepas UCD939 que carregam o alelo METIOucd932 não foram restauradas para os protótrofos de metionina, ao contrário dos outros 20 isolados de vinho e comerciais. Isto pode ser explicado pela presença de outras mutações que esta cepa carrega no caminho da redução de sulfato. UCD939 tem duas mutações nos genes que codificam outras subunidades na enzima de sulfito redutase. A adição de uma terceira mutação pode diminuir a atividade da enzima de sulfito redutase drasticamente de modo que haja 25 sulfeto diminuído disponível para ser incorporado nos aminoácidos contendo enxofre, tais como metionina ou cisteína. Assim a cepa não pode crescer nas placas sem metionina. Também pode haver efeitos do acúmulo de intermediários tóxicos a montante da sulfito redutase porque a repressão do caminho de sulfato foi aliviada pela ausência de aminoácidos contendo enxofre tais como S-adenosil metionina. Entretanto a cepa foi viável quando o alelo METlOs288c foi substituído no lugar do seu próprio alelo, a cor da cepa no BiGGY mudou de castanha para branca e a sua produção de H2S foi significantemente reduzida.

UCD522, uma cepa de vinho comercial que foi caracterizada como um aneuplóide (Bakalinsky e Snow 1990) um desequilíbrio do número de cromossoma levando à morte da célula na esporulação. Portanto ambos os alelos necessitam ser individualmente rompidos (Figura 3) como oposto ao silenciamento de um alelo depois da esporulação da cepa para obter um silenciado homólogo como foi feito com as outras cepas. O alelo METlO foi transformado nas cepas silenciadas e depois o mesmo foi esporulado para se obter duas cepas que foram G418R/hphNTlR e duas cepas que carregaram o alelo METl 0. Cada cepa foi usada nos experimentos para observar se houve alguma inconsistência devido às manipulações genéticas (Tabela 10). As cepas fermentadas até a conclusão e comportaram-se como esperado em termos de produção de H2S. Cada uma das cepas que carregam o marcador resistente a medicamento foram auxótrofos de metionina e não produzem H2S. As cepas que carregam o alelo METlOs288c ou METIOucd522produziram

H2S e a cepa que carrega o MET IOucd932 não produz H2S.

Tabela 10 Propriedades das Fermentações Que Produzem Sulfeto de Hidrogênio da Cepa Heteróloga UCD522 Cepasa Alelo Taxa de Fermentação H2S Total ^g) Máxima (g/h)bcd UCD522-ÍA meti 0Δ: :KanMX4 0,35 <1 UCD522-1B MET1 Osnac 0,35 16 UCD522-1C MET1Os2siic 0,42 33 UCD522-m meti 0Δ: :KanMX4 0,24 <1 UCD522-1A MET1Oucu5"2 0,43 26 UCD522-1B Hiet1OAiihphNT1 0,24 <1 UCD522-1C metiOA:: hphNT! 0,34 <1 UCD522-ÍD MET1Ou 22 0,38 4 UCD522-ÍA MET1Oucuy32 0,36 <1 UCD522-1B MET1Oucuw2 0,37 <1 UCD522-ÍC meti 0Δ: :KanMX4 0,36 <1 UCD522-!D metlOA::KanMX4 0,22 <1 aA,B,C,D- designam os esporos diferentes. bA taxa de fermentação máxima foi calculada a partir dos dados de taxa de fermentação usando-se pontos de tempo que correspondem à inclinação mais íngreme em peso. Os valores representam a média de determinações independentes de duas réplicas. dAs fermentações atingiram a secura (definido por <0,5 % de açúcar remanescente). Foi também substituído o cassete KanMX em YFR030W BY4742 e UCD932 com o alelo METlO de UCD950 e ambos são castanhas no ágar BiGGY mas nenhuma das duas são produtoras de H2S. Cruzamentos entre BY4742 ou UCD932 e UCD950 indicaram que existem pelo menos quatro a cinco alelos que segregam quanto a produção de H2S.

Debate

Uma das possibilidades para as diferenças que surgem naturalmente observadas na produção de sulfeto em S. cerevisiae é a ocorrência de alterações genéticas da expressão ou atividade de enzimas no 10 caminho da redução de sulfato. O caminho da redução de sulfato demonstra a regulagem complexa (Mountain et al. 1991) e um aumento em uma atividade enzimática pode ser tamponado pelas mudanças na atividade de outras proteínas dentro do caminho.

Pesquisa anterior em nosso laboratório identificou, em um não produtor de H2S nativo UCD932, diversos alelos dentro do caminho da redução de sulfato. Entretanto, foi demonstrado que aqueles alelos particulares sozinhos não são responsáveis pelo fenótipo de H2S (Linderholm et al. 2006). Em nossa triagem da coleção de deleção quanto aos supressores da formação de H2S, foi identificado diversos outros genes no caminho da redução de sulfato neste papel, HOM2, HOM6, SER33, METI, MET5, MET8 e MET10 (Linderholm et al. 2006). Quando estes genes foram sequenciados em UCD932 e outras cepas de levedura nativas e industriais que variam na produção de H2S, foi revelado que UCD932 carregou alelos diferentes em cinco dos nove genes, incluindo CYS4 e MET6 (Linderholm et al. 2006). Houve muitos alelos de MET10 encontrados dentro da coleção de cepas que foi sequenciada.

Neste estudo foi demonstrado que MET10 desempenha um papel importante na formação de H2S, embora ele sozinho não seja responsável pelo fenótipo de não formação de H2S em UCD932; ele dramaticamente altera o fenótipo de H2S em outras cepas que produzem H2S. Nos experimentos descritos acima, METIOucd932 foi trocado com êxito pelos alelos nativos em três cepas que produzem H2S e isto mudou os mesmos em não produtores de H2S. Estes resultados têm muitas implicações positivas 5 para a indústria do vinho por causa da capacidade para construir cepas comerciais com produção de enxofre reduzida em qualquer fundo genético pela transferência dos alelos apropriados ou para prognosticar as características de produção de H2S para qualquer cepa de Saccharomyces eerevisiae. Ambas as técnicas podem ser muito simples e úteis para os 10 fabricantes de vinho.

Os experimentos para trocar em METIOucd932 em UCD939 foram infrutíferas; METIOucd932 de UCD939 não foi viável nas placas deficientes em metionina. Entretanto isto pode ser explicado por outras mutações que a mesma carrega no caminho da redução de sulfato. A UCD939 15 carrega duas mutações nos genes que codificam outras subunidades na enzima sulfito redutase e embora a mesma não fosse um auxótrofo de metionina, a adição de uma terceira mutação pode diminuir a atividade drasticamente de modo que a mesma se tome um auxótrofo de metionina porque as enzimas a jusante não podem reforçar a sua atividade o suficiente para compensar. A 20 regulagem da redução de sulfato pelos aminoácidos contendo enxofre também pode não funcionar adequadamente porque a cepa não pode mais produzir metionina e os intermediários tóxicos podem se acumular acima das enzimas da sulfito redutase e também tomar a cepa inviável.

A UCD522 foi caracterizada como uma cepa aneuplóide 25 (Bakalinsky e Snow 1990). Quando o gene METlO foi sequenciado na UCD522 foi observado que UCD522 é uma cepa heterozigota, a mesma carrega dois alelos de MET10. Pode haver algum tipo de associação entre os componentes que levaram à incapacidade para manipulá-la geneticamente como as outras cepas. É possível que algum tipo de formas complexas entre os alelos METlO ou proteínas que o mesmo codifica que não permite que o mesmo segregue apropriadamente durante a esporulação se apenas um dos alelos é deletado. Entretanto, quando cada alelo é individualmente substituído, a cepa pode esporular apropriadamente. A METIOucd932 de UCD522 foi 5 esporulada para dar duas cepas que foram G418R/hphNTlR e auxótrofos de metionina e duas cepas que foram sensíveis a medicamento e carregaram o alelo METl0. Cada cepa fermentada até a conclusão e a sua característica de H2S foi como esperada.

Exemplo 3: Caracterização adicional do alelo METlOp de UCD932 Como demonstrado nos Exemplos acima, o alelo MET10

presente na cepa de levedura UCD932 é capaz de converter uma cepa que produz sulfeto de hidrogênio (H2S) alto em uma cepa que não produz nenhum H2S detectável. Isto foi claramente mostrado com as cepas que produzem alto UCD522 e UCD950, que não produziram nenhum H2S detectável quando 15 carregaram o alelo MET10 de UCD932. A capacidade para converter uma cepa para uma produtora de H2S baixo tem implicações em qualquer indústria que usa levedura incluindo as indústrias de vinho, cerveja e etanol combustível. Além de apresentar um problema para o produto final pela adição de um forte cheiro de ovo podre, o CO2 criado na fermentação é 20 frequentemente um subproduto útil, a ser vendido como o próprio gás ou para ser usado como um gás motor para a movimentação do produto (fabrico de bebida fermentada). Portanto prevenir que o gás tenha cheiro de ovo podre tem benefícios evidentes.

O trabalho anterior determinou que os alelos MET10 de 25 UCD932 e UCD950 diferem em seis nucleotídeos, cinco destas mudanças resulta em mudanças na seqüência de proteína primária (ver, Figura 2). Para caracterizar ainda mais o alelo MET10 de UCD932, os alelos nativos de MET10 foram clonados no vetor transportador pUG6. A técnica de mutagênese Quick Change PCR foi usada para fabricar mudanças de nucleotídeo único (ver, por exemplo, Cormack, B. e Castano, I. (2002) Introduction of Point Mutations into Cloned Genes. Methods in Enzymology (350) 199-218). Em reações separadas, a técnica foi usada para converter uma diferença de nucleotídeo no nucleotídeo similar do outro alelo. Por exemplo, 5 METlO de UCD932 tem uma adenina na posição 404 enquanto UCD950 tem uma citosina. A mudança da citosina de UCD950 na posição 1985 por uma adenina foi verificado ser necessária e suficiente para a perda da produção de sulfeto no fundo de UCD950. (Tabela 11) A conversão da adenina no alelo UCD932 para a citosina de 950 eliminou a capacidade da proteína UCD932 10 para eliminar a produção de sulfeto (Tabela 11). Portanto a única mudança da treonina na posição 662 para um resíduo de lisina resulta na criação de uma

proteína MetlO modificada que leva à liberação de sulfeto reduzida.

Tabela 11 Produção de H2S pelos Alelos MET1O Diferentes AleloMET1O Nucleotídeo em 1985 Fundo de Cepa Produz H2S? UCD932 Adenina UCD522 Não UCD932 Adenina UCD932 Não UCD932 Adenina UCD940 Não UCD932 Adenina UCD950 Não UCD950 Citosina UCD522 Sim UCD950 Citosina UCD932 Não* UCD950 Citosina UCD940 Sim UCD950 Citosina UCD950 Sim UCD932 1985 A-C Citosina UCD522 Sim UCD932 Í985 A-C Citosina UCD932 Não* UCD932 1985 A-C Citosina UCD940 Sim UCD932 1985 A-C Citosina UCD950 Sim UCD950 Í985 C-A Adenina UCD522 Não UCD950 Í985 C-UM Adenina UCD932 Não UCD950 Í985 C-UM Adenina UCD940 Não UCD950 !985 C-UM Adenina UCD950 Não *0 fundo da cepa 932 tem outros determinantes da produção de H2S e não produz H2S sob nenhuma das condições de teste. Exemplo 4: Diferenças alélicas na posição 1985 do gene METlO determina a produção de sulfeto de hidrogênio pela Saccharomvces cerevisiae O alelo METlO da cepa UCD932 leva à incapacidade para

produzir sulfeto de hidrogênio (H2S) quando usado em uma estratégia de substituição de alelo para substituir o alelo nativo em isolados comerciais e nativos de levedura de vinho. Este alelo foi verificado conter diversas mudanças de par de base levando às diferenças na seqüência de aminoácido da proteína codificada. Estas mudanças de aminoácido foram avaliadas para determinar que aquele(s) impacta(m) a capacidade para produzir H2S.

Para identificar a mutação exata ou combinação de mutações 5 responsáveis por estas diferenças dramáticas na produção de H2S, foram clonados os alelos METlO de UCD932 e UCD950 e sistematicamente convertemos cada diferença de base única para a base do alelo oposto usando a Mutagênese Direcionada ao Sítio. Os alelos resultantes foram idênticos ao alelo precursor com a exceção da mudança de base de troca única. Os alelos 10 modificados foram depois inseridos de volta em ambas as cepas e ágar BiGGY foi usado como um indicador de uma mudança na redução de sulfito e provavelmente produção de H2S. Uma mudança de base única na posição 1985 foi identificada por esta triagem como a mutação responsável para a mudança na cor da colônia. Estas cepas foram examinadas pela produção de 15 H2S em duplicata durante fermentações em pequena escala em suco de vinho sintético. 10 ml de meio de vinho sintético foram inoculados com as respectivas cepas e H2S foi detectado pelo uso de colunas de acetato de chumbo depois de quatro dias de fermentação. O alelo METlO de UCD950 inalterado e o alelo UCD932 com a mutação para o alelo UCD950 na posição 20 1985 (932 MET10 !985 A-C) resultou na produção de H2S enquanto que o alelo MET10 de UCD932 inalterado e o alelo UCD950 com a mudança para UCD932 na posição 1985 (950 MET10 1985C-A) não resultou em nenhuma produção de H2S detectável. Estes resultados indicam que a mudança de base única na posição 1.985 é um determinante chave da diferença na produção de 25 H2S destes alelos. Estes resultados foram depois reforçados pela examinação da produção de H2S quando os alelos mutantes únicos foram colocados em duas cepas comerciais que produzem H2S alto, UCD522 e UCD940. Ambas destas cepas produziram H2S com o alelo 932 MET10 1985A-C mas nenhum H2S foi detectado com o alelo 950 MET10 1985C-A. Os resultados estão resumidos na Tabela 11, acima.

Este estudo demonstra que uma mudança de par de base única na posição 1985 no alelo METlO dita a produção de sulfeto de hidrogênio. A diferença de nucleotídeo em 1985 muda o aminoácido codificado, assim qualquer mudança na seqüência de nucleotídeo circundante que muda o aminoácido codificado provavelmente também eliminará a produção de H2S. A treonina presente nos alelos que produzem alto pode atuar como ponto regulador que muda o fluxo do caminho visto que os resíduos de aminoácido contendo um grupo fosfato podem ser regulados por intermédio da fosforilação. O resíduo de aminoácido 662 é prognosticado estar dentro do domínio catalítico da sulfito redutase (Figura 6). A análise da estrutura putativa da proteína com esta mudança (Figura 7) indica que a estrutura global da proteína é inalterada, mas a área local do sítio ativo que circunda esta mudança de resíduo é afetada. Assim esta mudança modifica a estrutura da proteína apenas levemente.

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E entendido que os exemplos e formas de realização aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou 20 mudanças à luz destes serão sugeridas pelas pessoas habilitadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e competência deste pedido e escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, números de acesso, patentes e pedidos de patente aqui citados são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos.

Claims

1. Método para reduzir níveis de H2S em um meio de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o meio de fermentação com uma célula de levedura que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo METlO que não catalisa a conversão de sulfito em sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 não é treonina.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 é lisina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compartilha pelo menos 95 % de identidade de seqüência com um seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um produto de fermentação não tendo nenhum nível detectável de H2S é produzido, em que o produto de fermentação é selecionado do grupo que consiste de: vinho, cerveja e champanhe.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura é uma cepa de levedura de vinho selecionada do grupo que consiste de: Prise de Mousse, Premier Cuveé, French Red, Montachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação é selecionado do grupo que consiste de: um mosto de frutas e um mosto cervejeiro.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de fermentação é um mosto de suco de uva.

10. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo METlO que não catalisa a conversão de sulfito em sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina, e em que o polinucleotídeo é operavelmente ligado a uma seqüência de controle da expressão.

11. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo MET10 da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 não é treonina.

12. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 é lisina.

13. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compartilha pelo menos 95 % de identidade de seqüência com uma seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1.

14. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão como definido na reivindicação 10.

15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de levedura.

16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

17. Célula de levedura melhorada, caracterizada pelo fato de que não produz sulfeto de hidrogênio, compreendendo um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo MET10 que não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO não é treonina, em que uma célula precursora da célula de levedura melhorada produz sulfeto de hidrogênio.

18. Célula de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQID NO: 3, em que X na posição 662 não é treonina.

19. Célula de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQID NO: 3, em que X na posição 662 é lisina.

20. Célula de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compartilha pelo menos 95 % de identidade de seqüência com uma seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1.

21. Célula de levedura de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.

22. Célula de levedura de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a célula de levedura é uma cepa de levedura de vinho selecionada do grupo que consiste de: Prise de Mousse, Premier Cuvee, French Red, Montachet, Lallemand Kl, Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22.

23. Cultura de célula de levedura melhorada, caracterizada pelo fato de que produz níveis reduzidos de sulfeto de hidrogênio, compreendendo uma população de células de levedura, as células de levedura compreendendo um polinucleotídeo exógeno que codifica um polipeptídeo MET10 que não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo MET10 não é treonina, em que a cultura de célula de levedura melhorada produz sulfeto de hidrogênio reduzido em comparação com uma cultura de células precursoras.

24. Cultura de célula de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a cultura não produz níveis detectáveis de sulfeto de hidrogênio.

25. Cultura de célula de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 não é treonina.

26. Cultura de célula de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 é lisina.

27. Cultura de célula de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo compartilha pelo menos 95 % de identidade de seqüência com uma seqüência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1.

28. Cultura de célula de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a população de células de levedura compreende células de Saccharomyces cerevisiae.

29. Cultura de célula de levedura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a população de células de levedura são de uma cepa de levedura de vinho selecionada do grupo que consiste de: Prise de Mousse, Premier Cuvee, French Red, Montachet, Lallemand Kls Bordeaux, UCD522, UCD940, Ba25, Bal26, Bal37, Ba220, Bb23, Bb25, Ba30, Bb32, Bbl9 e Bb22.

30. Método para produzir uma célula de levedura melhorada que produz níveis reduzidos de sulfeto de hidrogênio, caracterizado pelo fato de que compreende substituir um polinucleotídeo endógeno que codifica um polipeptídeo METlO ativo em sulfeto com um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto pela introdução em um precursor da célula de levedura de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo METlO inativo em sulfeto que não catalisa a conversão de sulfito para sulfeto, em que o aminoácido na posição 662 do polipeptídeo METlO inativo em sulfeto não é treonina, em que o precursor da célula de levedura melhorada produz sulfeto de hidrogênio.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo METlO inativo em sulfeto é recombinantemente introduzido.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo MET10 inativo em sulfeto é introduzido pelo retro-cruzamento.

33. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a célula de levedura melhorada não produz níveis detectáveis de sulfeto de hidrogênio.

34. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo METlO da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 não é treonina.

35. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo MET10 da SEQ ID NO: 3, em que X na posição 662 é lisina.

36. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende a SEQ ID NO: 1.

37. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de ser capaz de distinguir entre as seqüências fornecidas na SEQ ID NO: 1 ou um complemento das mesmas e um ácido nucleico que codifica um METlO do tipo selvagem.

38. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 37 operavelmente ligado a uma seqüência de controle da expressão.

39. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de expressão como definido na reivindicação 38.

40. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de Saccharomyces cerevisiae.