JP5517342B2 - 発酵飲料中のh2sレベルを低減するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2007年3月16日付けで出願された米国特許仮出願第60/918,616号、および2007年7月12日付けで出願された米国特許仮出願第60/959,366号の恩典を主張するものであり、この両出願の開示全体が全ての目的で参照により本明細書に組み入れられる。
該当なし。
アルコール発酵中の硫化水素(H2S)のような揮発性硫黄化合物の産生は、醸造業およびワイン醸造業に影響を及ぼす問題である。硫化水素(H2S)は、硫酸還元経路の望ましくない副産物である(図1)。それは発酵条件下のサッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)において形成される。S.セレビシェ株によるH2Sの産生は、ヒトの検知閾値11 ng/Lを優に上回って、0 ug/Lから290 ug/Lに及ぶ(Amoore and Hautala 1983)。その望ましくない品質は、硫化水素がワインに特有の腐卵臭をもたらすという事実に端を発しており、H2Sは揮発性化合物であって、通気により除去されうるものの、低pHのためワインにしつこく残りうるメルカプタンおよびチオールを生ずる可能性がある(Thoukis 1962)。メルカプタンおよびチオールは、玉ねぎおよび缶詰野菜の香りとして存在しており、揮発性H2Sは管理されうるが、他の望ましくない硫黄化合物の除去は技術的に困難であり、ワインから他の風味化合物を取り去ってしまう。
である。いくつかの態様において、MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸残基は
である。いくつかの態様において、662位のアミノ酸残基はLys、Arg、His、Gln、およびAsnからなる群より選択される(SEQ ID NO:6)。いくつかの態様において、662位のアミノ酸残基はLysである(SEQ ID NO:7)。
[請求項1001]
亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ酵母細胞と発酵培地とを接触させる段階を含む、発酵培地中のH 2 Sレベルを低減するための方法であって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がトレオニンではない、方法。
[請求項1002]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがトレオニンではない、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項1001記載の方法。
[請求項1004]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1001記載の方法。
[請求項1005]
検出可能なレベルのH 2 Sを有さない発酵産物が産生される方法であって、該発酵産物がワイン、ビール、およびシャンパンからなる群より選択される、請求項1001記載の方法。
[請求項1006]
酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項1001記載の方法。
[請求項1007]
酵母細胞が、プリーズ・ド・ムース(Prise de Mousse)、プルミエ・キュヴェ(Premier Cuvee)、フレンチ・レッド(French Red)、モンラッシェ(Montachet)、ラレマンK1(Lallemand K1)、ボルドー(Bordeaux)、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19、およびBb22からなる群より選択されるワイン酵母株である、請求項1006記載の方法。
[請求項1008]
発酵培地が、マストおよび麦汁からなる群より選択される、請求項1001記載の方法。
[請求項1009]
発酵培地がブドウ果汁マストである、請求項1001記載の方法。
[請求項1010]
亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターであって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がトレオニンではなく、かつ該ポリヌクレオチドが発現制御配列に機能的に連結された、発現ベクター。
[請求項1011]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがトレオニンではない、請求項1010記載の発現ベクター。
[請求項1012]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項1010記載の発現ベクター。
[請求項1013]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1010記載の発現ベクター。
[請求項1014]
請求項1010記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[請求項1015]
酵母細胞である、請求項1014記載の宿主細胞。
[請求項1016]
サッカロマイセス・セレビシェ細胞である、請求項1014記載の宿主細胞。
[請求項1017]
亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、硫化水素を産生しない改良された酵母細胞であって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がトレオニンではなく、該改良された酵母細胞の親細胞が硫化水素を産生する、改良された酵母細胞。
[請求項1018]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがトレオニンではない、請求項1017記載の酵母細胞。
[請求項1019]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項1017記載の酵母細胞。
[請求項1020]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1017記載の酵母細胞。
[請求項1021]
サッカロマイセス・セレビシェ細胞である、請求項1017記載の酵母細胞。
[請求項1022]
プリーズ・ド・ムース、プルミエ・キュヴェ、フレンチ・レッド、モンラッシェ、ラレマンK1、ボルドー、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19、およびBb22からなる群より選択されるワイン酵母株である、請求項1021記載の酵母細胞。
[請求項1023]
亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含んだ酵母細胞の集団を含む、低減したレベルの硫化水素を産生する改良された酵母細胞培養物であって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がトレオニンではなく、該改良された酵母細胞培養物が、親細胞の培養物と比較して低減した硫化水素を産生する、改良された酵母細胞培養物。
[請求項1024]
検出可能なレベルの硫化水素を産生しない、請求項1023記載の酵母細胞培養物。
[請求項1025]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがトレオニンではない、請求項1023記載の酵母細胞培養物。
[請求項1026]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項1023記載の酵母細胞培養物。
[請求項1027]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1023記載の酵母細胞培養物。
[請求項1028]
酵母細胞の集団がサッカロマイセス・セレビシェ細胞を含む、請求項1023記載の酵母細胞培養物。
[請求項1029]
酵母細胞の集団が、プリーズ・ド・ムース、プルミエ・キュヴェ、フレンチ・レッド、モンラッシェ、ラレマンK1、ボルドー、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19、およびBb22からなる群より選択されるワイン酵母株由来である、請求項1023記載の酵母細胞培養物。
[請求項1030]
亜硫酸の硫化物への変換を触媒しない硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを酵母細胞の親細胞に導入することにより、硫化物活性のMET10ポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを、硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと置き換える段階を含む、低減したレベルの硫化水素を産生する改良された酵母細胞を産生する方法であって、該硫化物不活性のMET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がトレオニンではなく、該改良された酵母細胞の親細胞が硫化水素を産生する、方法。
[請求項1031]
硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが組換えにより導入される、請求項1030記載の方法。
[請求項1032]
硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが戻し交雑により導入される、請求項1030記載の方法。
[請求項1033]
改良された酵母細胞が検出可能なレベルの硫化水素を産生しない、請求項1030記載の方法。
[請求項1034]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがトレオニンではない、請求項1030記載の方法。
[請求項1035]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:3のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項1030記載の方法。
[請求項1036]
ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1を含む、請求項1030記載の方法。
[請求項1037]
SEQ ID NO:1に示される配列またはその相補体と野生型MET10をコードする核酸とを識別できる、単離ポリヌクレオチド。
[請求項1038]
発現制御配列に機能的に連結された請求項1037記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[請求項1039]
請求項1038記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
[請求項1040]
サッカロマイセス・セレビシェ細胞である、請求項1039記載の宿主細胞。
表1は天然のおよび工業用の酵母株のリストを示す。
I. 導入
本発明は発酵飲料中のH2Sレベルを低減するための組成物および方法を提供する。本発明は、一つには、トレオニン以外である662位のアミノ酸残基を有するMET10ポリペプチドが亜硫酸の遊離または放出硫化水素への変換を触媒しないという発見に基づいている。これは、MET10遺伝子における1985位の一ヌクレオチド変化によりMET10タンパク質の触媒ドメインにおけるトレオニンからリジンへの662位のアミノ酸の変化がもたらされる、酵母株UCD932でのMET10対立遺伝子からの硫化物不活性のMET10ポリペプチドの発現によって例証される。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において当業者が通常理解するのと同じ意味を一般に有する。一般的に、本明細書において用いられる専門用語ならびに以下に記述される細胞培養、分子遺伝学、有機化学・核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当技術分野において周知とされ通常利用されるものである。核酸およびペプチド合成には標準的な技術が用いられる。一般的に、酵素反応および精製段階は製造者の仕様書にしたがって行われる。その技術および手順は、当技術分野における従来の方法、および本書の全体にわたって示される各種一般的な参考文献(一般的に、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008)を参照のこと)にしたがって一般に行われる。本明細書において用いられる専門用語ならびに以下に記述される分析化学および有機合成における実験室手順は、当技術分野において周知とされ通常利用されるものである。化学合成および化学分析には標準的な技術、またはその変法が用いられる。
に存在している。図8を参照されたい。
内にトレオニンを持たない、すなわち、式中においてXがTではない。いくつかの態様において、硫化物不活性のMET10ポリペプチドは、アミノ酸の662位にトレオニンまたはセリン残基を持たない。いくつかの態様において、硫化物不活性のMET10ポリペプチドは、662位に
を有する(SEQ ID NO:3)。いくつかの態様において、硫化物不活性のMET10ポリペプチドにおける662位のアミノ酸残基はヒドロキシル基を持たない、例えば、Thr、Ser、またはTyrではない(SEQ ID NO:33)。いくつかの態様において、硫化物不活性のMET10ポリペプチドにおける662位のアミノ酸残基は大きいまたはかさ高いアミノ酸、例えば、
である。いくつかの態様において、硫化物不活性のMET10ポリペプチドにおける662位のアミノ酸残基は塩基性アミノ酸または正に荷電したアミノ酸、例えば、Lys、Arg、His、Gln、またはAsnである(SEQ ID NO:6)。いくつかの態様において、662位のアミノ酸残基はLysである(SEQ ID NO:7)。
(1) アラニン(A)、グリシン(G);
(2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4) アルギニン(R)、リジン(K);
(5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
(6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
(7) セリン(S)、トレオニン(T); および
(8) システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。
A. 一般的な組換えDNA法
本発明は、組換えおよび古典的遺伝学の分野における日常的技術に依る。一般的に、以下に記述される組換えDNA技術における専門用語および実験室手順は、当技術分野において周知とされ通常利用されるものである。クローニング、DNAおよびRNAの単離、増幅、および精製には標準的な技術が用いられる。一般的に、DNAリガーゼ、DNAポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを伴う酵素反応は、製造者の仕様書にしたがって行われる。本発明で用いる一般的な方法を開示している基礎テキストは、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-2008); およびKriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)を含む。
一般に、MET10をコードする核酸配列および関連する核酸配列相同体は、cDNAおよびゲノムDNAライブラリからクローニングされるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーによる増幅技術を用いて単離される。例えば、MET10配列は、典型的には、配列がSEQ ID NO:1に由来しうる核酸プローブ、またはその部分配列とハイブリダイズすることによって核酸(ゲノムまたはcDNA)ライブラリから単離される。MET10 RNAおよびcDNAは任意の酵母株から単離することができる。
硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするcDNAのような、クローニングした遺伝子の高レベル発現を得るために、典型的には、転写を指令する強力なプロモーター、転写/翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸の場合であれば、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含んだ発現ベクターの中に、硫化物不活性のMET10の核酸配列をサブクローニングする。適当な細菌プロモーターは当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.に記述されている。硫化物不活性のMET10タンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス種(Bacillus sp.)、およびサルモネラ(Salmonella)において利用可能である(Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当技術分野において周知であり、同様に市販されている。
本発明は、本明細書において記述されるように、硫化水素を産生しないかまたは低レベルの硫化水素を産生し、かつ外因性の硫化物不活性のMET10ポリペプチドを発現する宿主細胞も提供する。662位のアミノ酸がトレオニンまたはセリンではない、硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを、当技術分野において公知の方法によって、例えば、組換えまたは遺伝的交雑法を用いて親宿主細胞に導入する。いくつかの態様において、宿主細胞はまた、硫化物活性のMET10ポリペプチドを発現しない。すなわち、活性MET10ポリペプチドのコード配列がノックアウトされており、硫化物不活性のMET10ポリペプチドのコード配列と置き換えられているからである。
天然MET10タンパク質または組換えMET10タンパク質のどちらも機能的アッセイ法で用いるために精製することができる。天然MET10タンパク質は、例えば、酵母およびMET10相同体のその他任意の供給源から精製される。組換えMET10は任意の適当な発現系から精製される。
本発明の一つの態様において、特定の酵母株がH2S産生株であるかどうかを判定する方法を提供する。本発明の方法によれば、酵母株のMET10対立遺伝子を分析し、本明細書において開示されるMET10対立遺伝子と比較して、酵母株がH2Sの高産生株、低産生株、または非産生株であるかどうかを判定する。特定のMET10対立遺伝子の有無の判定は一般に、分析される(例えば、サッカロマイセス属の)酵母から得られる核酸サンプルを分析することにより行われる。多くの場合、核酸サンプルはゲノムDNAを含む。RNAサンプルをMET10対立遺伝子の存在について分析することも可能である。
いくつかの態様において、MET10対立遺伝子をコードする核酸を増幅するためにPCRを使用する。適用可能な技術の一般的概説はPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds. (1990))およびPCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Erlich, ed. (1992))のなかで見出すことができる。さらに、増幅技術は米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号に記述されている。
増幅産物は、例えば、制限断片長多型(RFLP)分析; 変性ゲル電気泳動(例えば、Erlich, ed., PCR TECHNOLOGY, PRINCIPLES AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION, W. H. Freeman and Co, New York, 1992, Chapter 7を参照のこと)、直接的な配列決定およびHPLCに基づく分析を含め、当技術分野において公知の任意の手段を用いて検出することができる。適当な配列決定法は、例えば、ダイデオキシ配列決定に基づく方法およびマキサム・ギルバート配列決定法を含む(例えば、Sambrook and Russell、前記を参照のこと)。例えば、適当なHPLCに基づく分析は、例えばPremstaller and Oefner, LC-GC Europe 1-9 (July 2002); Bennet et al., BMC Genetics 2: 17 (2001); Schrimi et al., Biotechniques 28(4):740 (2000); およびNairz et al., PNAS USA 99(16): 10575-10580 (2002)に記載の変性HPLC分析(dHPLC); ならびに、例えばOberacher et al.; Hum. Mutat. 21(1):86 (2003)に記載のイオン対逆相HPLC-エレクトロスプレイイオン化質量分析(ICEMS)を含む。MET10対立遺伝子中の一塩基変化を特徴付けるための他の方法は、例えば、一塩基伸長(例えば、Kobayashi et al, Mol. Cell. Probes, 9: 175-182, 1995を参照のこと); 例えば、Orita et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86, 2766-2770 (1989)に記載の一本鎖高次構造多型分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(ASO) (例えば、Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991; Saiki et al., Nature 324, 163-166, 1986; EP 235,726; およびWO 89/11548); ならびに、例えば、WO 93/22456; 米国特許第5,137,806号; 同第5,595,890号; 同第5,639,611号; および米国特許第4,851,331号に記載の配列特異的増幅法またはプライマー伸長法; 米国特許第5,210,015号; 同第5,487,972号; および同第5,804,375号; ならびにHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280に記載の5'-ヌクレアーゼアッセイ法を含む。
本明細書において記述されるMET10核酸配列を含む酵母株を用いて、発酵飲料(例えば、ワインおよびビール)中のH2Sレベルを低減することができる。
MET10およびその相同体は、H2S低産生株である酵母株のさらに特異的かつ高感度の同定に有用な手段である。例えば、MET10核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、例えばMET10プローブおよびプライマー(例えば、表5に記載の)、MET10核酸(例えば、図2に記載の)を用いて、H2S低産生株である酵母株を同定する。
以下の実施例は、特許請求される本発明を例証するために提示されるが、限定するために提示されるものではない。
H2Sが形成される機序および経路をよりよく理解するため、および将来の防止または管理戦略を開発するため、4,827種の変異体から構成される酵母欠失株のセットのスクリーニングを行って、H2S産生に影響を及ぼす遺伝子を同定した。コロニー色 vs 実際のH2S産生の偏向の基準を定義するために、ワイン発酵の天然分離株のコレクション(Mortimer 1994)をスクリーニングした。さらに、親株が非H2S産生株である酵母ヌル変異体のコレクションを、突然変異時にH2S形成の上昇をもたらした遺伝子についてスクリーニングした。これらの突然変異体のH2S形成に及ぼす相加的作用の可能性も評価した。
酵母株および培養条件
本研究に用いられ、結果が提示される酵母株を表1に記載する。酵母株を2%グルコースの入った酵母抽出物・ペプトン・デキストロース培地(YPD)にて維持し増殖した(Sherman et al. 1974)。ジェネティシン(G418, 0.2 mg/ml)の入った、その培地(YPD)を、G418Rマーカーを保有する欠失株の維持に用いた。
交雑、胞子形成、および四分子分析を含む遺伝子操作は、標準的な手順(Gunthrie 1991)を用いて行った。KanMX破壊マーカーJKKanREに対して上流のフォワードプライマーおよび内部のリバースプライマーを用いたPCRにより、遺伝子欠失を確認した。増幅条件は次の通りであった: 30サイクル×2分間94℃、45秒間92℃、30秒間56℃、1分間72℃、および7分間72℃で最後の伸長。プライマー配列は表5に記載されている。
欠失セット(Open Biosystems, Huntsville, AL)および天然分離株のコレクションをBiGGY寒天、つまりビスマスグルコースグリシン酵母寒天(Nickerson 1953)上にてスクリーニングした。また、それらを最初に123 mgの窒素当量/リットルで、合成ブドウ果汁培地「最少マスト培地(Minimal Must Media)」(MMM) (Spiropoulos et al. 2000)中にてスクリーニングした。この窒素レベルは0.2 gのL-アルギニン/リットルおよび0.5 gのリン酸アンモニウム/リットルを用いて得られた。
硫化水素の産生は酢酸鉛法(Spiropoulos et al. 2000; Giudici, P., and R. E. Kunkee, 1994)を用いて評価した。5%酢酸鉛溶液50 μLで予め処理し、室温で乾燥させておいた紙片(2×10 cm, 3 mm Whatmanろ紙)を用いて硫化水素の形成を最初に検出した。酢酸鉛紙を半分に折り、50 mLの培養試験管に挿入し、培養試験管の蓋で紙の両端を固定して、酢酸鉛紙の中央部を液体培地上の気体環境の中に入れた。硫化水素の形成を酢酸鉛紙の黒化度によって定性的に測定した。このスクリーニングはCarrie Findletonにより、そのMS学位論文の一環として行われた。
酵母株および硫化水素の形成において影響を及ぼす栄養条件を特定するため、酵母培養物を50 mLの培養試験管に入れた改変トリプルM培地5 mL中25℃にて、振盪機台に載せて120 rpmで増殖させた。合成ブドウ果汁培地「最少マスト培地」(MMM) (Giudici et al. 1993)を使用し、元の配合から改変して、7種の異なる窒素および微量栄養素の組成を作出した。アルギニン、リン酸アンモニウム、およびカザミノ酸の添加を操作して窒素濃度を調整し、YNB (アミノ酸および硫酸アンモニウム不含の酵母窒素ベース; Yeast Nitrogen Base without Amino Acids and Ammonium Sulfate)の添加を調整して栄養素およびビタミンの濃度を制御した。トリプルMの改変を表2に例示する。
欠失株および天然分離株のH2S産生を評価するため、それらを最初に全て、BiGGY寒天上にプレーティングし、コロニーの色を評価した。コロニー色は白色、淡黄褐色、黄褐色(欠失セットの親株の色)、淡褐色、褐色、または黒色であった(Linderholm et al. 2006)。欠失セットからは、4個のコロニーが白色であり、258個が淡黄褐色であり、4478個が黄褐色であり、59個が淡褐色であり、28個が褐色であり、1個のコロニーが黒色であり、コロニー色が明るいものから暗いものまでさまざまであった。
30個の天然分離株を123 mg/Lの窒素入り合成ジュースMMM中でスクリーニングして、H2S産生 vs コロニー色を評価した。非H2S産生株(すなわち、UCD932、UCD713、UCD819、UCD938、UCD942、UCD954、およびUCD956)は、白色〜淡褐色に及ぶコロニー色を有していた。H2Sを産生する株は淡黄褐色(3)〜黄褐色(10)〜淡褐色(5)〜褐色(5)に及んだ。最も暗い色のコロニー(褐色)はH2S 2〜6 mmに及び、中間産生域にある。3個の最高産生株(10 mmを超える)はBiGGY上で淡黄褐色、黄褐色、および淡褐色である。BiGGY上のおよびMMM中の天然分離株を表3に示す。
上記の実施例1に記載されるように、UCD932は、種々の環境条件の下で少量〜検出不能の硫化水素を産生する酵母株と同定された。この株はまた、低い亜硫酸レダクターゼ活性に関連して、BiGGY寒天上で白色のコロニーを生じる。S.セレビシェ株の欠失セットのスクリーニングは、白色のコロニーを生じる4つの有力な突然変異をもたらしたが、これらは全て亜硫酸レダクターゼの構成要素をコードしていた。遺伝的交雑から、UCD932における白色コロニーのBiGGY表現型はMET10遺伝子の変化によるものだということが明らかになった。MET10欠失株はメチオニン要求株であったが、UCD932はメチオニン要求株でないことから、細胞は亜硫酸レダクターゼ活性を依然として保持していることが示唆された。この低い硫化物産生能の遺伝的基礎を明らかにするため、S.セレビシェにおけるH2Sの抑制に関与している可能性があると同定された、MET10遺伝子および硫酸還元経路のその他いくつかの遺伝子を配列決定した(Linderholm et al. 2006)。これによって、望ましくない硫化物特性を取り除くためにH2S産生ワイン株において置き換え可能な対立遺伝子の同定が可能になるであろう。
酵母株および培養条件
本研究に用いられた酵母株を表4に記載する。酵母株を2%グルコースの入った酵母抽出物・ペプトン・デキストロース培地(YPD)にて維持し増殖した(Sherman et al. 1974)。ジェネティシン(G418, 0.2 mg/ml)またはハイグロマイシン(Hph, 0.3 mg/ml)の入った、その培地(YPD)を、G418RまたはHphMXマーカーを保有する欠失株の維持に用いた。最少培地(YNB)をアミノ酸不含の0.67%酵母窒素ベースで作出し、推奨(Sherman)されるようにカザミノ酸で補完した。選択的met脱落培地をメチオニン不含のYNBと同じように作出した。
酵母欠失セット(Open Biosystems, Huntsville, AL)を、カザミノ酸で補完した(Sherman 1974) BiGGY寒天、つまりビスマスグルコースグリシン酵母寒天(Nickerson 1953)上にてスクリーニングした。各株をBiGGY寒天上にプレーティングし、48時間30℃でインキュベートした。得られたコロニーを色について評価した。
MET10、HOM2、HOM6、SER33、MET1、MET5、およびMET8の配列分析を169の天然および工業用酵母株で行った。スマッシュ・アンド・グラブ(smash and grab)プロトコル(Hoffman and Winston 1987)を用いて染色体DNAを細胞ペレットから抽出し、High Fidelity Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA)、ならびにMET10の場合にはプライマーPCR-MET10-F/PCR-MET10-R、HOM2の場合にはプライマーHOM2-F/HOM2-R、HOM6の場合にはプライマーHOM6-F/HOM6-R、SER33の場合にはプライマーSER33-F/SER33-R、MET1の場合にはプライマーMET1-F/MET1-R、MET5の場合にはプライマーMET5-F/MET5-R、およびMET8の場合にはプライマーMET8-F/MET9-R (表5)を用いて遺伝子の増幅を行った。増幅条件は次の通りであった: 30サイクル×1分間94℃、30秒間94℃、30秒間50℃、4分間68℃、および7分間68℃で最後の伸長。
交雑、胞子形成、および四分子分析を含む遺伝子操作は、標準的な手順(Guthrie 1991)を用いて行った。
プラスミドpAL51 (MET10S288C)、pAL52 (MET10UCD932)を本研究において使用した。酵母株UCD932およびS288Cの染色体DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA)からMET10を増幅するために、制限部位BamHIおよびSacIIを保有するプライマーPCR-MET10-F/PCR-MET10-R (表5)を設計した。プラスミドpYC130 (Olesen et al. 2000)は、選択可能なマーカーG418Rを保有するセントロメアベクターであり、これをBamHIおよびSacII (New England Biolabs, Ipswich, MA)で消化してMET10の連結を可能にした。得られたプラスミドpAL51 (MET10S288C)、pAL52 (MET10UCD932)を形質転換に用いた。MET10の遺伝子欠失はPCRに基づく技術、図3 (Baudin 1993)を用いて作出した。MET10両側の非コード領域の突出部を有する、KanMXを含んだ欠失カセット(酵母欠失コレクション)を、プライマーMET10-F-KO/MET10-R-KOを用いてPCR増幅し、この直鎖状のPCR断片を酵母2倍体株UCD522、UCD932、UCD939、UCD940、およびUCD950に形質転換した。相同組換えにより、インタクトなMET10の一方のコピーをノックアウトカセットと置き換えて、MET10のインタクトなコピーとKanMXマーカーの両方のコピーを保有する株を作出した。次いでUCD522MET10/KanMXを除く、株の全てを胞子形成させ、G418Rが相同のものをさらなる実験に用いた。KanMX破壊マーカーJKKanREに対して上流のフォワードプライマーおよび内部のリバースプライマーを用いたPCRにより、遺伝子欠失を確認した。
発酵実験では、合成ブドウ果汁培地「最少マスト培地」(MMM) (Spiropoulos et al. 2000)を208 mgの窒素当量/リットルで用いた。この窒素レベルは0.2 gのL-アルギニン/リットルおよび0.5 gのリン酸アンモニウム/リットルを用いて得られた。MMM開始培地中で予め増殖された培養物由来の定常期細胞の播種により、細胞1.33×105個/mlの密度で発酵を開始した。培地300 mLを含有する500 mLのエルレンマイヤフラスコ中で発酵を行った。各フラスコにシリコンストッパを取り付け、酢酸鉛試験管を装着した。フラスコを120 rpmで振盪しながら25℃でインキュベートした。CO2産生の推定値として重量の損失を用い、発酵を7日間モニターした。
欠失株の硫化水素産生の特徴付け
欠失株の全セットの硫化水素産生を評価するため、それらを最初に全て、BiGGY寒天上にプレーティングし、コロニーの色を評価した。コロニーは白色、淡黄褐色、黄褐色(親株の色)、淡褐色、褐色、または黒色であった。4個のコロニーが白色であり、258個が淡黄褐色であり、4478個が黄褐色であり、59個が淡褐色であり、28個が褐色であり、1個のコロニーが黒色であった。白色のコロニーを生じた4つの欠失体はMET10、MET8、MET5、またはMET1におけるものであった。本発明者らはまた、HOM2、HOM6、およびSER33を、硫化水素の形成の抑制に関与している可能性があると同定した(Linderholm et al. 2006)。
Italyから分離された天然株UCD932 (Mortimer et al. 1994)は、BiGGY寒天上で白色の非H2S産生株である。白色表現型に関与する遺伝子を同定するため、それを白色欠失株の各々と接合した。一つの株YFR030W BY4742だけがUCD932の白色表現型を補完することができなかった。
a ベクター: pYC130; pMET10S228C: pAL51; pMET10UCD932: pAL52
b 最大発酵速度は、重量の最急降下に対応する時点を用いることにより発酵速度データから計算された。
c 値は独立した2回反復測定の平均を表す。
d 発酵物が乾燥状態(残存する糖類が<0.5%により定義される)に達した。
UCD932はCYS4およびMET6において突然変異を保有し、これらはともに硫酸還元経路における重要な酵素をコードしていることが以前に実証された(Linderholm et al. 2006)。しかしながら、この背景に対して野生型の対立遺伝子を導入しても、低いH2S産生特性は変わらなかった。それゆえ、その経路における他の遺伝子においてこの株が保有しうる他の突然変異が何かを同定することは興味深かった。硫酸還元経路由来のいくつかの遺伝子MET10、HOM2、HOM6、SER33、MET1、MET5、およびMET8をUCD932から、ならびにBiGGY寒天上での色が異なるおよび合成ジュース(Spiropoulos et al. 2000)中でのH2S産生が異なるいくつかの他の天然および工業用の株から配列決定して、硫酸還元経路の遺伝的多様性を評価した(種々のサッカロマイセス株由来のMET10の配列アライメントは図2にある)。MET10pアミノ酸の相違を表8に示す。
a 最大発酵速度は、重量の最急降下に対応する時点を用いることにより発酵速度データから計算された。
b 値は独立した2回反復測定の平均を表す。
c 発酵物が乾燥状態(残存する糖類が<0.5%により定義される)に達した。
亜硫酸レダクターゼ活性の検出によるH2Sの産生とBiGGY寒天上の色は大まかに関連付けられるので、MET10対立遺伝子の遺伝的多様性ならびにH2S産生およびコロニー色との明白な相関性から、硫酸還元経路における遺伝子はワイン株のH2S表現型に関与する可能性があるという仮説が支持された。そのため、H2S産生株におけるH2S産生に及ぼすMET10の効果を評価した。H2Sを産生する酵母株のMET10対立遺伝子を対立遺伝子MET10UCD932と置き換えた(図3)。UCD950、UCD940、UCD939、UCD522、およびUCD932における天然のMET10遺伝子をKanMXまたはHphMXカセットで欠失し、次いでKanMXまたはHphMXカセットをUCD932、S288C由来のMET10対立遺伝子または対照としてそれら独自の対立遺伝子と置き換えた。MET10UCD932を保有する株は全て親株および対照株と同じ速度で発酵したが、非H2S産生株となり、BiGGY寒天上での色がいっそう明るかった。S288C由来の対立遺伝子またはそれら独自の対立遺伝子を保有する株は、そのH2S産生表現型を維持していた(表9)。
a A、B、C、D-異なる胞子を示す。
b 最大発酵速度は、重量の最急降下に対応する時点を用いることにより発酵速度データから計算された。
c 値は独立した2回反復測定の平均を表す。
d 発酵物が乾燥状態(残存する糖類が<0.5%により定義される)に達した。
S.セレビシェでの硫化物産生において見出された天然に生じる相違の可能性の一つは、硫酸還元経路における酵素の発現または活性の遺伝的変化の発生である。硫酸還元経路は複合調節を示し(Mountain et al. 1991)、一つの酵素活性の増大は経路内の他のタンパク質の活性の変化によって緩和されうる。
上記の実施例において実証されるように、酵母株UCD932に存在するMET10対立遺伝子は、硫化水素(H2S)高産生株を、検出可能なH2Sを産生しない株に変換することができる。これは、UCD932由来のMET10対立遺伝子を保有する場合に検出可能なH2Sを産生しなかった高産生株のUCD522およびUCD950において明確に示された。株をH2S低産生株に変換できることはワイン、醸造および燃料エタノールの産業を含め、酵母を使用する任意の産業において意味がある。強烈な腐卵臭を付加することによって最終産物に問題を起こすことのほか、発酵において作出されたCO2は、それ自体がガスとして販売されるか、または産物の移動(醸造)用のモーターガスとして使用されるかのいずれかに有用な副産物であることが多い。それゆえ、ガスが腐った卵の匂いのしないようにすることには、明らかな利点がある。
株UCD932のMET10対立遺伝子は、商業用および天然のワイン酵母分離株における天然の対立遺伝子を置換するための対立遺伝子置換戦略において用いられる場合に硫化水素(H2S)の産生不能を引き起こす。この対立遺伝子は、コードタンパク質のアミノ酸配列の相違を引き起こすいくつかの塩基対変化を含有することが分かった。これらのアミノ酸変化を評価して、どれがH2Sの産生能に影響を及ぼすかを決定した。
Claims (43)
- 亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ酵母細胞と発酵培地とを接触させる段階を含む、発酵培地中のH2Sレベルを低減するための方法であって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、またはTyr (SEQ ID NO:5)であり、該接触させる段階がメチオニンの添加を含まない、方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:34のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、Asn、Glu、Asp、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、またはTrpである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:6のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、またはAsnである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:7のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項1記載の方法。
- 検出可能なレベルのH2Sを有さない発酵産物が産生される、請求項1記載の方法。
- 発酵産物が飲料である、請求項6記載の方法。
- 発酵産物がワイン、ビール、シャンパン、ポルトおよびマディラからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
- 酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である、請求項1記載の方法。
- 酵母細胞が、プリーズ・ド・ムース(Prise de Mousse)、プルミエ・キュヴェ(Premier Cuvee)、フレンチ・レッド(French Red)、モンラッシェ(Montrachet)、ラレマンK1(Lallemand K1)、ボルドー(Bordeaux)、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19、およびBb22からなる群より選択されるワイン酵母株である、請求項9記載の方法。
- 発酵培地が飲料である、請求項1記載の方法。
- 発酵培地が、果汁、マストおよび麦汁からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- 発酵培地がブドウ果汁マストである、請求項12記載の方法。
- 亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、硫化水素を産生せず、かつメチオニン要求性ではない、改良された酵母細胞であって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、またはTyr (SEQ ID NO:5)であり、該改良された酵母細胞の親細胞が硫化水素を産生する、発酵培地中または発酵産物中のH 2 Sレベルを低減するための改良された酵母細胞。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:34のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、Asn、Glu、Asp、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、またはTrpである、請求項14記載の酵母細胞。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:6のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、またはAsnである、請求項14記載の酵母細胞。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:7のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項14記載の酵母細胞。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項14記載の酵母細胞。
- サッカロマイセス・セレビシェ細胞である、請求項14記載の酵母細胞。
- プリーズ・ド・ムース、プルミエ・キュヴェ、フレンチ・レッド、モンラッシェ、ラレマンK1、ボルドー、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19、およびBb22からなる群より選択されるワイン酵母株である、請求項19記載の酵母細胞。
- 亜硫酸の硫化物への変換を触媒しないMET10ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、かつメチオニン要求性ではない、酵母細胞の集団を含む、低減したレベルの硫化水素を産生する改良された酵母細胞培養物であって、該MET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、またはTyr (SEQ ID NO:5)であり、該改良された酵母細胞培養物が、親細胞の培養物と比較して低減した硫化水素を産生する、発酵培地中または発酵産物中のH 2 Sレベルを低減するための改良された酵母細胞培養物。
- 検出可能なレベルの硫化水素を産生しない、請求項21の酵母細胞培養物。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:34のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、Asn、Glu、Asp、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、またはTrpである、請求項21記載の酵母細胞培養物。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:6のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、またはAsnである、請求項21記載の酵母細胞培養物。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:7のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項21記載の酵母細胞培養物。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1の核酸配列と少なくとも95%の配列同一性を共有する、請求項21記載の酵母細胞培養物。
- 酵母細胞の集団がサッカロマイセス・セレビシェ細胞を含む、請求項21記載の酵母細胞培養物。
- 酵母細胞の集団が、プリーズ・ド・ムース、プルミエ・キュヴェ、フレンチ・レッド、モンラッシェ、ラレマンK1、ボルドー、UCD522、UCD940、Ba25、Ba126、Ba137、Ba220、Bb23、Bb25、Ba30、Bb32、Bb19、およびBb22からなる群より選択されるワイン酵母株由来である、請求項21記載の酵母細胞培養物。
- 請求項14記載の酵母細胞または請求項21記載の酵母細胞培養物を含む、発酵培地。
- 飲料である、請求項29記載の発酵培地。
- 果汁、マスト、麦汁からなる群より選択される、請求項30記載の発酵培地。
- ブドウ果汁マストである、請求項31記載の発酵培地。
- 請求項14記載の酵母細胞または請求項21記載の酵母細胞培養物を含む、発酵産物。
- 飲料である、請求項33記載の発酵産物。
- ワイン、ビール、シャンパン、ポルトおよびマディラからなる群より選択される、請求項34記載の発酵産物。
- 亜硫酸の硫化物への変換を触媒しない硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを酵母細胞の親細胞に導入することにより、硫化物活性のMET10ポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドを、硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと置き換える段階を含む、低減したレベルの硫化水素を産生し、かつメチオニン要求性ではない、発酵培地中または発酵産物中のH 2 Sレベルを低減するための改良された酵母細胞を産生する方法であって、該硫化物不活性のMET10ポリペプチドの662位のアミノ酸がAla、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Val、Trp、またはTyr (SEQ ID NO:5)であり、該改良された酵母細胞の親細胞が硫化水素を産生する、方法。
- 硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが組換えにより導入される、請求項36記載の方法。
- 硫化物不活性のMET10ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが戻し交雑により導入される、請求項36記載の方法。
- 改良された酵母細胞が検出可能なレベルの硫化水素を産生しない、請求項36記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:34のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、Asn、Glu、Asp、Ile、Leu、Val、Phe、Tyr、またはTrpである、請求項36記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:6のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがLys、Arg、His、Gln、またはAsnである、請求項36記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:7のMET10ポリペプチドをコードし、662位のXがリジンである、請求項36記載の方法。
- ポリヌクレオチドがSEQ ID NO:1を含む、請求項36記載の方法。
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