PT1856159E - Antigénios recombinantes quiméricos de toxoplasma gondii - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ANTIGÉNIOS RECOMBINANTES QUIMÉRICOS DE TOXOPLASMA GONDII"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A invenção presentemente descrita refere-se ao campo técnico da preparação de meios de diagnóstico que não são directamente aplicados ao corpo de um animal ou ser humano. A invenção proporciona ainda compostos, métodos para a sua preparação, métodos para a sua utilização e composições que os contêm que são adequadas para aplicação a nível industrial no campo farmacêutico e de diagnóstico, particularmente para a detecção e diagnóstico de infecções por Toxoplasma gondii, bem como para o tratamento e prevenção das infecções mencionadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 diagnóstico precoce constitui uma prioridade e um objectivo desejável em todas as áreas do medicamento, particularmente porque permite uma melhoria apreciável da vida do doente e uma economia concomitante da parte dos sistemas de saúde ou da parte dos doentes propriamente ditos. No caso particular da invenção aqui descrita, o diagnóstico precoce destina-se à detecção de infecções potenciais ou existentes por Toxoplasma gondii em mulheres grávidas, principalmente no que se refere à saúde do feto, e em indivíduos infectados, particularmente aqueles com imunidade deficiente. 2 0 Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório que infecta todas as células de mamífero, incluindo as dos indivíduos humanos (McCabe e Remington, N. Engl. J. Med. 1988, 318-313-5). Morfologicamente, o parasita exibe três formas distintas de infecção: taquizoítos (assexuados), bradizoítos (em cistos tecidulares, assexuados) e esporozoítos (em oocitos, reprodução sexuada). A transmissão ocorre tipicamente através da ingestão de carne mal cozinhada, com quistos tecidulares ou vegetais contaminados com oocitos disseminados por gatos. A infecção humana é geralmente assintomática e auto-limitada em hospedeiros imunocompetentes. Em contraste com sujeitos com imunidade deficitária (particularmente aqueles que sofrem de SIDA), a toxoplasmose é uma infecção oportunista grave que pode causar encefalites com resultados muito graves (Luft, B.J., Remington J.S., 1992, Clin. Infect. Dis. 15, 211-22). Além disso, a contracção de uma infecção primária durante a gravidez pode conduzir a abortos espontâneos ou doenças fetais graves em mamíferos.

Para um resumo abrangente do problema da toxoplasmose, recomenda-se a consulta de literatura médica específica. 0 diagnóstico da infecção por T. gondii é definido pelo isolamento do microrganismo no sangue ou fluidos corporais, identificando o parasita em tecidos, detectando sequências de nucleótidos específicas por PCR ou detectando imunoglobulinas anti-Γ. gondii específicas produzidas pelo hospedeiro em resposta à infecção (Beaman et al., 1995 Principies and Practice of Infectious Diseases 4a Ed, Churchill Livingstone Inc., Nova Iorque, 2455-75; Remington 3 JS et al. 1995, Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 140-267).

Os principais desafios para os médicos residem no diagnóstico das infecções por T. gondii em mulheres grávidas e diagnóstico da infecção congénita nos recém-nascidos/bebés. Em ambos os casos, para implementar terapêuticas adequadas em tempo útil e para evitar possíveis lesões do feto e recém-nascidos/bebés é muito importante estabelecer se a infecção parasítica foi contraída pela mulher antes ou depois da concepção. Além disso, é essencial determinar quando ocorreu a transmissão vertical de mãe para feto. Finalmente, para a gestão clínica de recém-nascidos/bebés existe uma urgente falta de um método de diagnóstico sensível que possa discriminar numa fase precoce da vida entre indivíduos infectados e não-infectados, ambos nascidos de mães com toxoplasmose primária na gravidez. A seroconversão durante a gestação e diagnóstico de infecção congénita em neonatos são geralmente executados por meio da tentativa de detecção da presença de várias classes de imunoglobulinas anti-Toxoplasma (IgG, IgM, IgA, avidez das IgG) e comparação com os perfis imunológicos da mão em comparação com o filho.

No entanto, os testes comerciais disponíveis não proporcionam sensibilidade e especificidade suficientes para permitir um diagnóstico correcto da infecção em todos os doentes. Por conseguinte, é desejável a disponibilidade de agentes de diagnóstico específicos, sensíveis e inovadores. 4

Os antigénios de T. gondii são conhecidos e encontram-se disponíveis desde há muito, em primeiro lugar como misturas de antigénios obtidos de várias formas (FR 2,226,468, Mérieux; SU 533376, Veterinary Research Institute; JP 54044016, Nihon Toketsu Kanso), depois como isolados de antigénios puros (EP 0 082 745, Mérieux; EP 0 301 961, INSERM, Pasteur; WO 89/5658, Transgene) e respectiva caracterização tanto como proteínas e genes respectivos (WO 89/08700, U. Leland, Dartmouth Coll.; US4, 877,726, Res. Inst. Paio Alto; W089/12683, INSERM, Pasteur; EP 0 391 319, Mochida Pharm.; IT 1,196,817, CNR; EP 0 431 541, Behringwerke; WO 92/01067, CNRS; WO 92/02624, U. Flinders; WO 92/11366, Innogenetics, Smithkline Beecham; US 5,215,917, Res. Inst. Paio Alto; WO 92/25689, FR 2702491, INSERM, Pasteur; WO 96/02654, bioMeriéux, Transgene; EP 0 710 724 Akzo; EP 0 724 016, bioMeriéux; EP 0 751 147, Behringwerke; US 5, 633, 139, Res. Inst. Paio Alto; WO 97/27300, Innogenetics; US 5,665,542, US 5,686,575, Res. Inst. Paio Alto; WO 99/32633, Heska; JP 11225783, Yano; WO 99/61906, Abbott; WO 99/66043, Smithkline Beecham; JP 2000300278, Yano; WO 00/164243, Virsol) e finalmente o isolamento e caracterização das regiões antigénicas dos produtos genéticos de Toxoplasma (WO 03/080839, Kenton S.r.l.)

Numerosos estudos encontraram várias proteínas antigénicas diferentes de T. gondii e as sequências genéticas destas foram também determinadas.

Entre as proteínas mais interessantes para fins tanto de diagnóstico como terapêuticos, sob a forma de vacinas, devemos citar: as proteínas do micronema (WO 03/080839, Kenton S.r.l. ; Beghetto et al., The Journal of Infectious 5

Diseases, 2005, 191:637-645; Beghetto et al., International Journal for Parasitology, 2003, 33:163-173); os antigénios de superfície SAG1 (ou P30) (WO 89/08700, Stanford

University; WO 89/12683 Pasteur, INSERM; WO 94/17813, WO 96/02654, Transgene, bioMeriéux; EP 0 724 016, WO 99/61906, US 5,962,654, Harning et al., Clinicai and Diagnostic

Laboratory lmmunology, Maio 1996, 355-357) e SAG2 (ou P22) (Parmley et al., 1992, J. Clin. Microbiol. 30, 1127-33);

proteínas dos grânulos densos GRA1 (ou P24) (EP 0 301 961, Pasteur, INSERM; WO 89/05658, Transgene, Cesbron-Delauw, et al., 1989 P.N.A.S. USA 86, 7537-41), GRA2 (ou P28) (WO

93/25689, INSERM, Pasteur; US 5,633,139, US 5,665,542, US 5,686,575, Res. Inst. Paio Alto; Prince et al., Mol. Biochem. Parasitol., 34 3-14), GRA4 (Mevelec et al., Mol. Biochem. Parasitol. 56, 227-38), GRA6 (ou P32) (FR 2,702,491, INSERM, Pasteur; Lecordier al., Mol. Biochem. Parasitol. 70, 85-94), GRA7 (WO 99/61906, Abbott; Jacobs et al., Mol. Biochem. Parasitol. 91, 237-49) e GRA3 (Robben et al. 2002, J. Biol. Chem. 277, 17544-47) : os antigénios roptri ROP1 (ou P66) (US 5, 976,553, U. Leland; EP 0 431 541, Innogenetics) e ROP2 (ou P54) (Sharma et al., J. Immunol., 131, 377-83).

Como descrito nas referências anteriormente mencionadas, os antigénios foram obtidos com técnicas de cADN recombinante em vectores de expressão. Por exemplo, para o antigénio SAG1, a WO 98/08700 utiliza vectores de expressão conhecidos em lambda-gtll fágico. A WO 98/12683 utiliza o mesmo fago e transfere E. coli com um plasmídeo registado ou preparando uma cassete de expressão especial, tal como na WO 96/02654. A EO 0 724 016 obtém mimótopos utilizando bibliotecas de peptídeos de expressão 6 combinatorial. A EP 0 301 961 descreve como obter antigénios de excreção-secreção com pesos moleculares entre 20 kDa e 185 kDa. A WO 89/05658 descreve uma proteína contendo os epítopos da proteína de 24 kDa reconhecida pelos anticorpos produzidos contra os antigénios de excreção-secreção do Toxoplasma, esta proteína é obtida por transfecção de células por meio de vectores de expressão. A WO 03/080839 descreve um método baseado em tecnologia de visualização de fagos para identificação de fragmentos de antigénios de proteínas de T. gondii e respectiva utilização como agentes de diagnóstico e imunogénicos. O antigénio p28 (GRA2) encontra-se descrito na US 5 633 139 e o método de obtenção do mesmo é novamente implementado pela expressão em lambda-gtll fágico. O antigénio P32 (GRA6) encontra-se descrito na patente 2 702 491, o antigénio ROP1 (P66) na patente norte-americana 5 976 553, P35 (ou GRA8) em EP 0 431 541, WO 99/57295 e WO 99/61906 e finalmente P68 na EP 0 431 541.

Yang et al. (Parasitol. Res.r 2004, 92: 58-64) descreve uma proteína quimérica contendo SAG1 e SAG2 e respectiva utilização para desenvolver imunidade contra T. gondii em ratinhos. A patente chinesa 11 94991C revela uma proteína de fusão recombinante contendo dois antigénios toxoplasma (GRA6 e p30) . Nenhum dos dados é apontado como revelando que os testes baseados nesta proteína de fusão recombinante mostram a sensibilidade necessária nas análises à base de IgG e IgM.

Durante os últimos dez anos vários estudos revelaram a utilização de antigénios recombinantes para o diagnóstico 7 serológico da infecção por T. gondii. Mesmo assim, embora promissores, nenhum dos testes à base de antigénios recombinantes apresentava todas as caracteristicas necessárias para substituir o antigénio de taquizoito em análises à base de IgG e IgM, indicando a necessidade de mais trabalho antes de se disponibilizar produtos recombinantes empregando imunoensaio para fins clínicos.

Assim, o principal objectivo dos estudos neste campo consiste em melhorar o desempenho dos imunoensaios ligados a enzimas à base de produtos recombinantes, melhorando assim, por exemplo o diagnóstico precoce da toxoplasmose congénita em recém-nascidos/bebés.

RESUMO DA INVENÇÃO

Constatou-se agora que a combinação de regiões antigénicas de proteínas de Toxoplasma gondii sob a forma de produtos de fusão recombinantes retém as propriedades antigénicas dos fragmentos de antigénio individuais. As proteínas quiméricas correspondentes produzidas deste modo podem ser utilizadas para fins de diagnóstico e terapêuticos. A utilização dos antigénios quiméricos mencionados como agentes de diagnóstico e auxiliares de diagnóstico relacionados que os contêm, por exemplo sob a forma de imunoensaios ligados a enzima ou kits constituem outro objectivo da presente invenção.

Outro objectivo da presente invenção consiste em sequências genéticas codificadoras dos antigénios quiméricos anteriormente mencionados, respectiva utilização 8 como medicamentos, particularmente para a prevenção e terapia da infecção por Toxoplasma gondii, por exemplo como terapia genética. A presente invenção estende-se também às sequências genéticas que hibridam com as sequências dos antigénios quiméricos mencionados em condições de hibridação restringentes.

Outro objectivo da presente invenção consiste na utilização dos antigénios quiméricos como medicamentos, particularmente sob a forma de vacinas que são úteis para a prevenção e cura da infecção. As vacinas de acordo com a presente invenção são adequadas para utilização em seres humanos e outros animais (particularmente porcos, gatos e ovelhas).

Estes e ouros objectivos serão ilustrados pormenorizadamente de seguida por meio de exemplos e figuras.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 principal objectivo da presente invenção consiste, por conseguinte, na apresentação de antigénios quiméricos recombinantes obtidos através da fusão de diferentes regiões antigénicas de produtos genéticos de Toxoplasma gondii e utilização das proteínas recombinantes obtidas para o desenvolvimento

As principais vantagens da presente invenção relativamente a outros tipos de antigénios ou fragmentos de antigénio conhecidos na literatura tal como descrito anteriormente são as seguintes e são evidentes quando estes antigénios são utilizados em imunoensaios de diagnóstico em amostras de soro para detecção da infecção: 9

Relativamente à utilização do antigénio Toxoplasma gondii inteiro, preparado a partir do parasita sob a forma de extracto da célula inteira lisado, os antigénios têm a vantagem de evitar reacções inespecificas devido à presença de outro material não-proteico e proporcionar uma maior facilidade de reprodução. Além disso, alguns antigénios proteicos naturais do parasita são insolúveis e, conseguentemente, estão mal representados nos testes comerciais gue empregam o extracto de célula total lisado T. gondii.

Relativamente à utilização de regiões antigénicas simples ou fragmentos antigénicos simples (como descrito na WO 03/080839), os antigénios quiméricos recombinantes revelam a vantagem de melhorar a sensibilidade dos testes em que são empregues. Por outras palavras, o seu uso diminui ou abole a ocorrência de respostas negativas falsas. A) Relativamente ao uso de uma mistura ou um conjunto de regiões antigénicas (como foi também previsto na WO 03/080839), as vantagens são pelo menos duas. Do ponto de vista da aplicabilidade industrial e produção é muito mais fácil produzir uma única construção manipulada contendo três ou mais regiões antigénicas do que produzir separadamente cada fragmento e posteriormente montá-los segundo um método económico e reproduzível. Em segundo lugar, como já foi mencionado, a utilização dos antigénios recombinantes quiméricos da invenção melhora a sensibilidade dos testes.

Estas e outras vantagens são reveladas na secção de exemplos. 10

Em particular, a presente invenção refere-se a um antigénio recombinante quimérico contendo a fusão de pelo menos três regiões antigénicas diferentes de Toxoplasma gondiir sendo as regiões antigénicas mencionadas epitopos de células B que ligam os anticorpos específicos de Toxoplasma gondii. De preferência, os anticorpos específicos de Toxoplasma gondii são extraídos do soro de indivíduos infectados com Toxoplasma gondii.

Mais particularmente, a presente invenção abrange um antigénio quimérico em que as três regiões antigénicas diferentes possuem uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo constituído por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: : 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 38 , SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, seq : ID NO: 41 e SEQ ID NO: - 42 . As sequências preferi' das no grupo anterior são SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NC >: 1 . 0 e SEQ ID NO: 12 .

Por exemplo o antigénio quimérico da invenção compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30 ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.

Os antigénios quiméricos da presente invenção podem ser modificados utilizando métodos conhecidos. As fusões podem ser directas (o terminal C de uma sequência de aminoácidos está ligado ao terminal N de outra por uma simples ligação covalente) ou podem empregar um domínio ligante flexível, tal como uma região charneira de IgG humana ou ligantes polipeptídeo consistindo em pequenos aminoácidos tal como 11 glicina, serina, treonina ou alanina com vários comprimentos e combinações. Por exemplo, o ligante pode ser uma repetição poliglicina interrompida por serina ou treonina a um intervalo determinado. De preferência, o ligante é constituído por três resíduos glicina e dois resíduos serina, reduzindo a sequência de aminoácidos Ser-Gly-Gly-Gly- Ser (ligante SGGGS).

Além disso, os antigénios quiméricos da invenção podem ser marcados por His-His-His-His-His-His (His6) para permitir uma purificação rápida por cromatografia de afinidade com quelato de metal e/ou por epítopos para os quais os anticorpos estão disponíveis, para permitir uma detecção em western blots, imunoprecipitação ou esgotamento/bloqueio da actividade em imunoensaios.

Outro objectivo da presente invenção consiste numa sequência de nucleótidos codificadora do antigénio quimérico tal como anteriormente definido. De acordo com uma concretização preferida da invenção, esta sequência de nucleótidos inclui pelo menos três sequências de nucleótidos diferentes seleccionadas do grupo constituído por: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11. De acordo com uma forma de realização preferida, esta sequência de nucleótidos inclui a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 27 ou a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 29 ou a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 31. São também incluídos no âmbito da presente invenção as sequências de nucleótidos que hibridam com qualquer sequência anteriormente descrita em condições de hibridação restringentes, bem como o antigénio recombinante quimérico 12 correspondente, codificado por esta sequência de nucleótidos hibridada.

Os antigénios quiméricos da presente invenção podem ser preparados por meio de clonagem e expressão num sistema de expressão procariota ou eucariota, utilizando os vectores de expressão apropriados. Pode ser empregue qualquer método conhecido na técnica.

Por exemplo, as moléculas de ADN codificadoras dos antigénios da invenção estão inseridas em vectores de expressão construídos apropriadamente por meio de técnicas bem conhecidas na técnica (ver Sambrook et al, 1989). Estes vectores constituem outro objecto da presente invenção.

Para ser capaz de expressar a proteína desejada (neste caso os antigénios quiméricos), um vector de expressão deve compreender também sequências de nucleótidos específicas contendo informação reguladora transcricional e traducional associada ao ADN codificador da proteína desejada de forma permitir a expressão e produção genética da proteína. Primeiro, a fim de se transcrever o gene, este deve ser precedido por um promotor reconhecível pela polimerase de ARN, à qual a polimerase se liga, iniciando assim o processo de transcrição. Existe uma variedade destes promotores em uso, os quais funcionam com graus de eficiência diferentes (promotores fortes e fracos).

Para hospedeiros eucariotas, podem ser empregues sequências reguladoras transcricionais e traducionais diferentes, conforme a natureza do hospedeiro. Podem ser derivados de fontes virais, tal como adenovírus, vírus papiloma bovino, vírus símio ou semelhantes, estando os sinais reguladores associados a um gene específico, o qual 13 possui um elevado grau de expressão. Constituem exemplos o promotor TK do virus herpes, o promotor precoce SV4 0, o promotor do gene gal4 de levedura, etc. Podem ser seleccionados os sinais reguladores da iniciação transcricional que permitem a repressão e activação, de forma que a expressão dos genes possa ser modulada. Todos estes hospedeiros constituem mais um objecto da presente invenção.

As moléculas de ácido nucleico que codificam os antigénios quiméricos da invenção podem ser ligadas a uma sequência heteróloga, de forma que a molécula de ácido nucleico combinada codifica uma proteína de fusão. Estas moléculas de ácido nucleico combinadas estão incluídas nas formas de realização da invenção. Por exemplo, podem ser unidas ao ADN codificador de uma proteína que permite a purificação do antigénio quimérico com apenas uma etapa de cromatografia de afinidade. Esta proteína unida/fundida pode ser, por exemplo, glutationa sulfotransferase (GST) para gerar produtos da fusão no terminal carboxilo da proteína GST. As proteínas recombinantes correspondentes, expressas no citoplasma de células E. coli transformadas pode ser purificado por cromatografia de afinidade, utilizando resina de glutationa-sefarose. A molécula de ADN que compreende a sequência de nucleótidos codificadora da molécula quimérica da invenção é inserida em vector(es) com os sinais reguladores de transcrição e tradução ligados de modo operacional, o que é capaz de integrar as sequências genéticas desejadas na célula hospedeira. As células que foram transformadas de modo estável pelo ADN introduzido podem ser seleccionadas introduzindo também um ou mais marcadores que permitem a 14 selecção das células hospedeiras que contêm o vector de expressão. 0 marcador pode ainda conferir fototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência biocida, por exemplo antibióticos ou metais pesados tal como cobre ou semelhantes. 0 gene marcador seleccionável tanto pode ser ligado directamente às sequências genéticas de ADN que vão ser expressas como introduzido na mesma célula por co-transfecção. Podem também ser necessários elementos adicionais para uma síntese óptima de proteínas da invenção.

Os factores relevantes na selecção de um plasmídeo ou vector virai em particular incluem: a facilidade com que as células receptoras que contêm i vector podem ser reconhecidas e seleccionadas dentre as células receptoras que não contêm o vector; o número de cópias do vector que são desejáveis num hospedeiro em particular e a hipótese de ser desejável a capacidade de enviar o vector entre células hospedeiras de espécies diferentes.

Assim que o(s) vector (es) ou sequência de ADN que contém a(s) construção/construções está/estão preparado(s) para a expressão a(s) construção/construções de ADN pode(m) ser introduzida numa célula hospedeira apropriada por qualquer meio de entre uma variedade de meios: Transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, electroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjecção directa, etc.

As células hospedeiras podem ser células procariotas ou eucariotas. Constituem exemplos de hospedeiros eucariotas células de mamífero, tal como células de ser humano, macaco, ratinho e ovário de hamster chinês (CHO). A 15 expressão nestas células hospedeiras proporciona modificações pós-traducionais a moléculas de proteína, incluindo o enrolamento correcto ou glicosilação nos locais correctos. Do mesmo modo, as células de levedura podem executar modificações peptídicas pós-traducionais, incluindo glicosilação. Existem várias estratégias de ADN recombinante que utilizam sequências promotoras fortes e elevado número de cópias de plasmídeos que podem ser utilizadas para a produção das proteínas desejadas na levedura. A levedura reconhece sequências líder em produtos genéticos de mamífero e segrega peptídeos com sequências líder (isto é, pré-peptídeos). Constituem exemplos de hospedeiros procariotas as bactérias, tal como Escherichia coli.

Após a introdução do(s) vector(s), as células hospedeiras são deixadas desenvolver-se num meio selectivo que selecciona quanto ao crescimento de células contendo vector. A expressão da(s) sequência(s) genética(s) clonada(s) tem como resultado a produção das proteínas desejadas. A purificação dos antigénios recombinantes é executada por qualquer um dos métodos conhecidos para este fim, isto é qualquer procedimento convencional envolvendo a extracção, precipitação, cromatografia, electroforese ou semelhante. Um outro procedimento de purificação que pode ser utilizado de preferência para a purificação dos antigénios da invenção é a cromatografia de afinidade utilizando anticorpos monoclonais que ligam a proteína alvo e que são produzidos e imobilizados numa matriz de gel contida na coluna. As preparações impuras contendo a proteína recombinante são passadas através da coluna. Os 16 antigénios ficarão ligados à coluna pelo anticorpo especifico enquanto as impurezas a atravessam. Depois da lavagem, o antigénio é eluido do gel mediante uma alteração no pH ou força iónica.

Outro aspecto da presente invenção consiste no processo consiste no processo para a produção recombinante dk antigénio quimérico tal como descrito anteriormente, compreendendo a cultura da célula hospedeira transformada com o vector que contém a sequência de nucleótidos da invenção e isolamento do produto desejado.

Um outro objecto da presente invenção consiste numa molécula de ADN compreendendo a sequência de ADN codificadora da proteína de fusão anterior, bem como sequências de nucleótidos substancialmente iguais. "sequências de nucleótidos substancialmente iguais" inclui todas as outras sequências de ácidos nucleicos que, em virtude da degenerescência do código genético, codificam igualmente a sequência de aminoácidos indicada.

Outro objecto da presente invenção consiste numa sequência de nucleótidos que híbrida para o complemento da sequência de nucleótidos codificadora do antigénio quimérico da invenção em condições extremamente ou moderadamente restringentes desde que o antigénio obtido mantenha a mesma actividade biológica, isto é a capacidade para ligar os anticorpos contra o parasita. 0 termo "hibridação", tal como presentemente utilizado, refere-se à associação das moléculas de ácido nucleico entre si por ligações de hidrogénio. Tipicamente, uma molécula será fixa a um suporte sólido e a outra ficará livre na solução. Depois, as duas moléculas poderão ser 17 postas em contacto entre si, em condições que favorecem o estabelecimento de ligações de hidrogénio. Os factores que afectam estas ligações incluem: 0 tipo e volume do solvente; temperatura de reacção; tempo de hibridação; agitação; agentes para bloquear a ligação inespecifica da molécula de fase liquida ao suporte sólido (reagente de Denhardt ou BLOTTO); a concentração das moléculas; utilização dos compostos para aumentar a taxa de associação de moléculas (sulfato de dextrano ou polietilenoglicol) e o grau de restringência das condições de lavagem após hibridação.

As condições de restringência são uma função da temperatura utilizada na experiência de hibridação, a molaridade dos catiões monovalentes e a percentagem de formamida na solução de hibridação. Para determinar o grau de restringência envolvido com qualquer conjunto de condições especifico, utiliza-se primeiro a equação de Meinkoth et al. (1984) para determinar a estabilidade dos híbridos de 100% de identidade expressos em temperatura de fusão Tm do híbrido ADN-ADN: Tm = 81,5 °C + 16,6 (LogM) + 0,41 (%GC)-0,61 (% form) - 500/L, em que M significa a molaridade dos catiões monovalentes, %GC é a percentagem dos nucleótidos G e C no ADN, % form é a percentagem de formamida na solução de hibridação e L é o comprimento do híbrido em pares básicos. Por cada 1 °C a menos da Tm em relação ao calculado para um híbrido de 100% de identidade, a quantidade de desemparelhamento permitido aumenta em cerca de 1%. Assim, se a Tm utilizada para qualquer experiência de hibridação específica, às concentrações de sal e formamida, for inferior em 10 °C à Tm calculada para um híbrido de 100% de acordo com a equação de Meinkoth, a 18 hibridaçao irá ocorrer mesmo se houver até cerca de 10% de desemparelhamento.

Tal como presentemente utilizado, condições altamente restringentes são aquelas que toleram até cerca de 15 % de divergência da sequência, enquanto condições moderadamente restringentes são aquelas que toleram até cerca de 20 % de divergência da sequência. Sem constituir limitação, exemplos de condições altamente restringentes (12 a 15 °C abaixo da Tm do híbrido calculada) e moderadamente restringentes (15 a 20 °C abaixo da Tm calculada do

híbrido) utilizam uma solução de lavagem de 2 X SSC (Standard saline citrate) e 0,5% de SDS à temperatura apropriada abaixo da Tm calculada do híbrido. O grau final de restringência das condições deve-se em primeiro lugar às condições de lavagem, particularmente se as condições de hibridação utilizadas forem aquelas que permitem a formação de menos híbridos estáveis conjuntamente com híbridos estáveis. As condições de lavagem a um grau de restringência superior removem assim os híbridos menos estáveis. Uma condição de hibridação comum que pode ser utilizada com as condições de lavagem muito restringentes a moderadamente restringentes descritas anteriormente consiste na hibridação numa solução 6 X SSC (ou 6 X SSPE) , 5 X reagente de Denhardt, 0,5 % de SDS, 100 pg/ml ADN de esperma de salmão desnaturado, fragmentado a uma temperatura aproximadamente de 20 °C a 25 °C abaixo da Tm. Se forem utilizadas amostras mistas será preferível utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC (Ausubel, 1987-1998). 19 0 termo "molécula de ácido nucleico" inclui também análogos de ADN e ARN, tal como os que contêm estruturas principais modificadas.

As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem também moléculas antisense que são parcialmente complementares às moléculas de ácido nucleico codificadoras de antigénios da presente invenção e, por conseguinte, hibridam para as moléculas de ácido nucleico codificadoras (hibridação). Estas moléculas antisense, tal como oligonucleótidos, podem ser concebidas para reconhecer, ligar especificamente e prevenir a transcrição de um ácido nucleico alvo codificador de um polipeptídeo da invenção, tal como é conhecido de alguém com formação ordinária na técnica (ver por exemplo, Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sei., 10,435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); 0'Connor, J. Neurochem 56,560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6,3073 (1979); Cooneyetal., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991).

De acordo com a terminologia utilizada, uma composição contendo um composto [X] é "substancialmente isenta de" impurezas [neste caso, Y] quando pelo menos 85% em peso do total X+Y na composição é X. De preferência, X inclui pelo menos cerca de 90% me cerca de do total de X+Y na composição, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 98% ou mesmo 99% em peso.

Outro aspecto da invenção consiste na utilização de antigénios quiméricos descritos anteriormente como medicamentos. Em particular, um dos principais objectos da invenção consiste na utilização de antigénios quiméricos como ingrediente activo para a preparação de medicamentos 20 destinados à prevenção ou tratamento de infecções por Toxoplasma gondii.

No caso de terapia genética, outro objecto da invenção consiste na utilização das sequências de nucleótidos codificadoras para os antigénios da invenção como medicamentos, em particular para a preparação de medicamentos úteis para o tratamento e prevenção de infecções por Toxoplasma gondii.

As composições farmacêuticas devem compreender preferencialmente uma quantidade com eficácia terapêutica dos antigénios quiméricos da invenção ou a sequência de nucleótidos correspondente. Os antigénios quiméricos da invenção podem actuar assim como vacinas para a prevenção ou o tratamento de infecção por Toxoplasma gondii.

Para a aplicação terapêutica, estando a preparação de medicamentos ou vacinas abrangidos pelo conhecimento geral para consulta adicional recomenda-se de novo ao leitor a literatura de patentes citada na presente descrição e particularmente Beghetto et al., The Journal of Infectious Diseases, 2005, 191:637-645. O termo "quantidade com eficácia terapêutica", tal como presentemente utilizado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou prevenir uma doença alvo ou estado ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer composto, a dose com eficácia terapêutica pode ser estimada inicialmente em testes de cultura celular, por exemplo de células neoplásicas ou em modelos animais, normalmente ratinhos, coelhos, cães ou porcos. 21 0 modelo animal pode ainda ser utilizado para determinar o nivel de concentração apropriado e a via de administração. Esta informação pode ser utilizada para determinar as doses úteis e vias de administração em seres humanos. A quantidade eficaz precisa para seres humanos ira depender da gravidade do estado da doença, estado de saúde em geral do sujeito, idade, peso e sexo do sujeito, dieta, tempo e frequência de administração, combinação de medicamento(s), sensibilidades à reacção e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experiências de rotina e encontra-se dentro do juizo do médico assistente. Em geral, uma dose eficaz oscilará entre 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, de preferência 0,05 mg/kg a 10 mg/kg. As composições podem ser administradas individualmente a um doente ou podem ser administradas em combinação com outros agentes, fármacos ou hormonas.

Uma composição farmacêutica pode ainda conter um veiculo farmaceuticamente aceitável para administração de um agente terapêutico. Estes veículos incluem anticorpos e outros polipeptídeos, genes e outros agentes terapêuticos tal como lipossomas, desde que o veículo em si não induza a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo receptor da composição e que podem ser administrados sem toxicidade indevida.

Os veículos adequados podem ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tal como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas virais inactivas. 22

Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser aqui utilizados, por exemplo, sais de ácidos minerais como cloridratos, bromidatos, fosfatos, sulfatos e semelhantes e sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. Uma discussão minuciosa sobre veículos farmaceuticamente aceitáveis encontra-se disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N. J. 1991).

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis em composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos tais como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes humectantes ou emulsionantes, substâncias tampão do pH e semelhantes, poderão estar presentes nestas composições. Estes veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, suspensões espessas, suspensões e semelhantes, destinados a ingestão pelo doente.

Assim que são formuladas, as composições da invenção podem ser administradas directamente no sujeito. Os sujeitos em tratamento podem ser animais, em particular podem ser tratados seres humanos.

As composições farmacêuticas utilizadas nesta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias, incluindo, sem constituir limitação aplicação oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica ou transcutânea (por exemplo, ver WO 98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal ou rectal. Podem também ser utilizadas 23 pistolas genéticas ou hyposprays para administração das composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, estas composições terapêuticas são preparadas como injectáveis, tanto como soluções liquidas ou suspensões, podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução em ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A administração directa das composições será geralmente conseguida por meio de injecção subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular ou administração no espaço intersticial de um tecido. As composições podem ser administradas numa lesão. 0 tratamento por dosagem poderá ser um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas. 0 método de tratamento de um mamífero afectado por uma infecção com Toxoplasma gondii, compreendendo a administração de uma quantidade com eficácia terapêutica da vacina tal como anteriormente descrito representa um dos aspectos da presente invenção. Um outro objecto da presente invenção consiste na utilização de antigénios quiméricos, como descrito anteriormente, como agentes activos para o diagnóstico de infecções por Toxoplasma gondii, em particular para o diagnóstico do tempo da infecção.

Fazem também parte da presente invenção conjuntos para o diagnóstico da infecção por Toxoplasma gondii, contendo pelo menos um antigénio quimérico de acordo com a presente invenção. Estes conjuntos podem ser úteis para o diagnóstico de uma infecção por Toxoplasma gondii aguda e/ou crónica. 0 antigénio quimérico da presente invenção pode ser empregue virtualmente em qualquer formato de teste que 24 empregue um antigénio conhecido para detectar anticorpos. Uma caracteristica comum de todos estes testes reside no facto de o antigénio ser posto em contacto com o componente do corpo que se suspeita conter os anticorpos em condições que permitam que o antigénio se ligue a qualquer anticorpo destes presentes no componente. Estas condições serão tipicamente temperatura fisiológica, pH e força iónica utilizando um excesso de antigénio. A incubação do antigénio com o espécime é seguida de detecção de complexos imunitários contidos no antigénio. A concepção dos imunoensaios é sujeita a grandes variações e são conhecidos muitos formatos na técnica. Os protocolos podem utilizar, por exemplo, suportes sólidos ou imunoprecipitação. A maioria dos testes envolve a utilização de anticorpos ou polipeptídeos marcados, podendo a marcação ser, por exemplo, enzimática, fluorescente, quimioluminescente, radioactiva ou moléculas corantes. São também conhecidos os testes que amplificam os sinais do complexo imunitário, cujos exemplos são testes que utilizam biotina e avidina e imunoenssaios marcados e mediados com enzimas, tal como ELISA. 0 imunoensaio poderá ter, sem constituir limitação, um formato heterogéneo ou homogéneo e de um tipo padrão ou competitivo. Num formato heterogéneo, o polipeptídeo encontra-se tipicamente ligado a uma matriz sólida ou suporte para facilitar a separação da amostra do polipeptídeo depois da incubação.

Exemplos de suportes sólidos que podem ser utilizados são a nitrocelulose (por exemplo em forma de membrana ou poço de microtitulação), cloreto de polivinilo (por exemplo 25 em folhas ou poços de microtitulação) , látex de poliestireno (por exemplo em microesferas ou placas de microtitulação) fluoreto de polivinilideno (conhecido como Immulon™), papel diazotado, membranas de nylon, microesferas activadas e microesferas de proteína A. Por exemplo, placas de microtitulação Dynatech Immulon™l ou Immulon™2 ou microesferas de poliestireno de 0,25 polegadas (Precision Plastic Bali) podem ser utilizadas no formado heterogéneo. O suporte sólido contendo os polipeptídeos antigénicos é tipicamente lavado após separação da amostra de ensaio e antes da detecção dos anticorpos ligados. Os formatos padrão e competitivo são bem conhecidos na técnica.

Num formato homogéneo, a amostra de ensaio é incubada com a combinação de antigénios na solução. Por exemplo, pode ser em condições que irão precipitar quaisquer complexos antigénio-anticorpo que se formarem. Os formatos padrão e competitivo destes testes são bem conhecidos na técnica.

Num formato padrão, a quantidade de anticorpos que formam o complexo anticorpo-antigénio é vigiada directamente. Esta vigilância é facultada pela determinação de se anticorpos com marcação anti-xenogénica (por exemplo anti-humano) que reconhecem um epítopo em anticorpos anti-Toxoplasma gondii vão ligar-se devido à formação de complexos. Num formato competitivo, a quantidade de anticorpos na amostra é deduzida por vigilância do efeito competitivo da ligação de uma quantidade conhecida de anticorpos marcados (o outro ligando competitivo) no complexo. 26

Os complexos formados, compreendendo o anticorpo anti-Toxoplasma gondii (ou, no caso de testes competitivos, a quantidade de anticorpo competitivo) são detectados por qualquer uma de entre várias técnicas conhecidas, dependendo do formato. Por exemplo, os anticorpos sem marcação no complexo podem ser detectados utilizando um conjugado de Ig antixenogénico complexado com um marcador (por exemplo um marcador enzimático).

Num formato de teste de imunoprecipitação ou aglutinação, a reacção entre os antigénios quiméricos e o anticorpo formam uma rede que precipita da solução ou suspensão e forma uma camada visível ou película de precipitado. Se não estiver presente qualquer anticorpo anti-Toxoplasma gondii no espécime de ensaio, não se forma precipitado visível.

Os antigénios quiméricos da invenção serão tipicamente embalados sob a forma de um conjunto para utilização nestes imunoensaios. 0 conjunto conterá normalmente, em contentores separados, a combinação de antigénios (seja já ligados a uma matriz sólida ou em separado, com reagentes para os ligar à matriz), formulações de controlo de anticorpos (positivo e/ou negativo), anticorpos marcados quando o formato do teste o exige e reagentes geradores de sinal (por exemplo substrato enzimático) se o marcador não gerar um sinal directamente. Normalmente estarão incluídas no conjunto instruções (por exemplo escritas, fita áudio, video, CD-ROM, etc.) para execução do teste.

Os conjuntos de diagnóstico que são objecto da presente invenção são assim conhecidos dos especialistas no campo. A título de exemplo, recomendamos a consulta da literatura de 27 patente citada anteriormente, à qual se poderá acrescentar as US 6,265,176, WO 01/63283 e WO 03/080839 como referências adicionais.

A invenção passa agora a ser ilustrada de forma pormenorizada, mediante exemplos e figuras. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 Mapa plasmídico do vector de expressão bacteriano pGEX-SN. Figura 2. Representação esquemática dos antigénios quiméricos.

As sequências de ADN dos clones Tx-2.a, Tx-1.16, Tx-4.18, Tx-15.11, Tx-1.11 e Tx-ll.b, codificadores respectivamente dos fragmentos proteicos dos genes de Toxoplasma gondii MIC2, MIC3, SAG1, GRA3, GRA7 and M2AP. foram utilizadas para a construção das proteínas de fusão GST-EC2, GST-EC3 e GST-EC4.

Figura 3. Expressão de antigénios quiméricos de Γ. gondii em células de E. coli. Análise SDS-PAGE de proteínas de fusão GST-EC2, GST- EC3 and GST-EC4 purificadas. As proteínas recombinantes foram sujeitas a electroforese (0,003 mg/pista) em gel de acrilamida 12 %. MW, marcadores do peso molecular.

Figura 4. Caracterização bioquímica da análise HPLC dos antigénio quiméricos do GST-EC2 purificado, executada por filtração em gel, utilizando a coluna TSK G4000 SW-XL.

Figura 5. Propriedades antigénicas de fragmentos proteicos individuais dentro dos antigénios quiméricos. A imunorreactividade de fragmentos antigénicos de Tx-2.a, Tx-1.16, Tx-4.18, Tx-15.11, Tx-1.11 e Tx-ll.b e antigénios 28 quiméricos EC2, EC3 e EC4 com amostras de soro de individuos infectados com T. gondii. Os soros foram utilizados como espécimes inteiros (soro) ou após esgotamento de anticorpos específicos contra combinações de fragmentos de antigénio (esgotamento Tx-1.16/Tx-4.18, esgotamento Tx-2:a/Tx-4.18, etc.)·

Figura 6. Imunorreactividade dos antigénios quiméricos com anticorpos IgM específicos do Toxoplasma.

Análise Rec-ELISA IgM executada com amostras de soro IgM-positivas (C+) e IgM-negativas (C-) específicas de Toxoplasma (diluição no soro 1:100) por meio de variação da concentração dos antigénios GST-EC2 e GST-EC3 marcado com biotina.

Análise Rec-ELISA IgM executada com diluições em série de amostras de soro IgM-positivas (entre 1:100 a 1:6400) e IgM-negativas (o soro de controlo, diluído 1:100) específicas de Toxoplasma analisadas com GST-EC2 marcado com biotina e a mistura GST-EC2/GST-EC3.

Figura 7. Estabilidade a longo prazo dos antigénios quiméricos

Análise Rec-ELISA IgM executada com os antigénios GST-EC2 e GST-EC3 marcados com biotina, que foram mantidos a +4 °C durante intervalos de tempo diferentes (dias). Os resultados são expressos em proporção das Densidades ópticas medidas com amostras de soro IgM-positivas (OD C+) e IgM-negativas (OD C-) específicas de Toxoplasma.

EXEMPLOS 29 0 quadro 1 seguinte indica, a titulo de exemplo, as sequências de ADN utilizadas na construção dos antigénios quiméricos de Toxoplasma gondii recombinantes:

Quadro 1

Nome Sequência Identificação Classificação

Proteína granulada densa

Proteína granulada densa

Proteína micronémica

Tx- 15.11 (SEQ ID 1 GCTGCCTTGGGAGGCCTTGCGGCGGATC qRA 3

AGCCTGAAAAT CATCAGGCTCTT GCAGAA

CCAGTTACGGGTGTGGGGGAAGCAGGA

GTGTCCCCCGTCAACGAAGCTGGTGAGT

CATACAGTTCTGCAACTTCGGGTGTCCAA

GAAGCTACCGCCCCAGGTGCAGT6CTCC

T GGACGCAAT CGAT GCCGAGT CGGAT AA

GGTGGACAATCAGGCGGAGGGAGGTGA

GC GTATG AAG AAGGTCGAAGAGGAGTTG

TCGTTATTGAGGCGGGAATTATATGATCG

CACAGATCGCCCTGGT

Tx- CAGTTCGCTACCGCGGCCACCGCGTCAG GRA 7

AT GACGAACTGAT GAGT CG AAT CCGAAAT 1.11

TCTGACTTTTTCGATGGTCAAGCACCCGT (SEQ T GACAGTCT CAGACCGACGAACGCCGGT

ID GTCGACTCGAAAGGGACCGAC6ATCACC

TCACCACCAGCAT6GATAAGGCATCTGTA GAGAGTCAGCTTCCGAGAAGA6AGCCAT TGGAGACGGAGCCAGATGAACAAGAAGA AGTTCAT TX_ AGGAGGACTGGATGTCATGCCTTCAGGG mxc 3

AGAACTGCAGCCCTGGTAGATGTATTGAT 1,16 GACGCCTCGCATGAGAATGGCTACACCT

(SEQ GCGAGTGCCCCACAGGGTACTC ACGTGA

^ GGTGACTTCCAAGGCGGAGGAGTCGTGT ID 5)

GTGGAAGGAGT CGAAGT CACGCT GGCTG AGAAATGCGAGAAGGAATTCGGCATCAG CGCGT CATCCT GCAAATGCGAT 30 30 Proteína de superfície

Tx- CCATCGGTCGTCAATAATGTCGCMGGT SAG 1 4 1 g GCTCCTACGGT GCAGAC AGCACT CTTGG_

TCCTGTCAAGTTGTCTGCGGAAGGACCC ( S E Q ACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAG XD 7) ATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAAT CAGTACTGTTCCGGGACGACGCTGACTG GTT GCAAC GAGAAAT CGTT CAAAGATATT TTGCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCA GGGTAACGCTT CGAGT GATAAGGGT GCC ACGCTAACGATCAAGAAGGAAGCATTTCC AGCCGAGT C AAAAAGCGT CATTATT GGAT gcacagggggatcgcctgagaagcatca

CTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCCGGG

SCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCT

Proteína micronémica

Tx-2 . a CCCCAGGATGCCA7TTGCTCGGATTGGT MIC 2

CC GCAT GGAGCCCCT GCAGT GTAT CCTG ( S E Q CGGTGACGGAAGCCAAATCA6GACGCGA ID 9) ACTGAGGTTTCTGCTCCGCAACCTGGAA CACCAACATGTCCGGACTGCCCT GCGCC CAT G G G AAG G ACTTG CGTG G AAC AAGGC GGACTTGAAGAAATCCGT GAATGCAGT G CGGGGGTATGTGCTGTTGACGCTGGATG T GGCGT CTGGGTT 31 31 Proteína micronémica

Τχ— AACGAACCGGTGGCCCTAGCTCAGCTCA M2AP

GCACATTCCT CGAGCT CGTCGAGGT GCC 11 .b

ATGTAACTCTGTTCATGTTCAGGGGGTGA

( S E Q TGACCCCGAATCAAAT GGTCAAAGTGACT

ID 11) GGTGCAGGATGGGATAATGGCGTTCTCG AGTTCTATGT CACGAGGCCAAC GAAG AC AGGCGGGGACACAAGCCGAAGCCATCTT GCGTCG AT CATGTGTTATTCCAAGGACAT T GACGGCGT GCCGTCAGACAAAGCGGGA AAGTGCTTT CT GAAGAACTTTT CTGGTG A AGACTCGTCGGAAATAGACGAAAAAGAA GTATCTCTACCCATCAAGAGCCACAACGA TGCGTTCAT GTTC GTTT GTT CTT CAAATGA TGGATCCGCACTCCA6TGTGATGTTTTCG CCGTT GATAACACCAACTCTAGCGACGG GTGGAAAGTGAATACCGTGGATCTTGGC GTCAGCGTTAGTCCGGATTTGGCATTCG GACTCACTGCAGATGGGGTCAAGGTGAA GAAGTTGTACGCAAGCAGCGGCCTGACA GCGATCAACGACGACCCTTCCTTGGGGT GCAAGGCTCCTCCCCATTCTCCGCCGGC CGGAGAGGAACCGAGTTTGCCGT CGCCT GAAAACAGCGGGTCTGCAACACCAGCGG AAGAAAGT CCGT CT GAGT CT G AATCT A sequência Tx-15.11 constitui um fragmento do gene GRA3 (Bermudes et al., Mol. Biochem. Parasitol., 1994, 68:247-257). O clone mencionado possui a sequência de aminoácidos AALGGLAADQPENHQALAEPVTGVGEAGVSPVNEAGESYSSATSGVQEATA PGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGE- RMKKVEEELSLLRRELYDRTDRPG (SEQ ID 2) e a respectiva utilização em antigénios quiméricos está abrangida pela presente invenção. A sequência Tx-1,11 constitui um fragmento do gene GRA37 (Bonhomme et al., J. Histochem. Cytochem., 1998, 46:1411-1421). O clone mencionado possui a sequência de aminoácidos 32 ATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTDDHLTTSMDK -ASVESQLPRREPLETEPDEQE- EVHF (SEQ ID 4) e a respectiva utilização em antigénios quiméricos estão abrangidas pela presente invenção. A sequência Tx-1.16 constitui um fragmento do gene MIC3 (Garcia-Réguet et al., Cellular Microbiol., 2000, 2:353- 364). O clone mencionado possui a sequência de aminoácidos RRTGCHAFRENCSPGRCIDDASHENGYTCECPTGYSREVTSKAEESCVEGVEVTL AEKCEKEFGISASSCKCD(SEQ ID 6) e a respectiva utilização em antigénios quiméricos estão abrangidas pela presente invenção. A sequência Tx-4.18 constitui um fragmento do gene GRA37 SAG1 (Burg et al., J. Immunol., 1988, 141: 3584-

3591; . O clone mencionado possui a sequência de aminoácidos P S VVNNVARC S Y GAD S T L GP VKL S AE GPTTMTLVCG- KDGVKVPQDNNQYCS GTTLTGCNEKSFKDILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGC TGGSPE- KHHCTVKLEFAGAAGSAKSA (SEQ ID 8) e a respectiva utilização em antigénios quiméricos está abrangida pela presente invenção. A sequência Tx-2 constitui um fragmento do gene MIC2 (Wan et al, Mol. Biochem.Parasitol., 1997, 84: 203-214;. 0 clone mencionado possui a sequência de aminoácidos PQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRT CVEQGGLEEIRECSAGVCAVD- AGCGVWV (SEQ ID 10) e a respectiva utilização em antigénios quiméricos está abrangida pela presente invenção. A sequência Tx-ll.b constitui um fragmento distinto do gene MIC2 (Rabenau et al., Mol. Microbiol., 2001, 41:537- 547). O clone mencionado possui a sequência de aminoácidos 33

NEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYV TRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDI- DGVP SDKAGKCFLKNF SGED S SEIDEKE

VSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDL- GVSVS PDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPE NSGSATPAEESPSESES (SEQ ID 12) e a respectiva utilização em antigénios quiméricos está abrangida pela presente invenção.

Construção de antigénios quiméricos 0 produto da proteína EC2 é uma molécula quimérica contendo as sequências de ADN Tx-2.a, Tx-1.16 e Tx-4.18. A SEQ ID 9 foi utilizada para amplificação do ADN do clone Tx-2.a, utilizando os oligonucleótidos K551 (5'- GGACTAGTCG- GCTCCCCCAGGATGCC-3' ) e K553 (5'- CATCCAGTCCTGCTACCGCCACCAGACCAGACGCCACATCC AGC-3'). 0 oligonucleótido K553 contém a sequência codificadora do

ligante SGGGS, que junta as sequências Tx-2.a e Tx-1.16. A condição PCR era 30" a 94 °C, 30" a 50 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. A SEQ ID 5 foi utilizada para amplificação do ADN do clone Tx-l,16.a, utilizando os oligonucleótidos K552 (5'- GTGGCGTCTGGTCT- GGTGGCGGTAGCAG GACTGGATGTCATGCC-3') e K555 (5'-TGACGACCGAGCTAC CGCCACCAGAGTTATCG- CATTTGCAGGATG-3'). O oligonucleótido K555 contém a sequência codificadora do

ligante SGGGS, que junta as sequências Tx-1.16 and Tx-4.18. A condição PCR era 30" a 94 °C, 30" a 50 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. A SEQ ID 7 foi utilizada para

amplificação do ADN do clone Tx-4.18, utilizando os oligonucleótidos K554 (5'-ATGCGA- TAACTCTGGTGGCGG

TAGCTCGGTCGTCAATAATGTCGC-3' ) e K556 (5'-CCGCGGCC GCTAGCCGATTTT- GCTGACCCTG-3'). A condição PCR era 30" a 94 34 °C, 30" a 50 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. Os produtos da PCR foram purificados com o "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) . 25 ng de produtos da amplificação do ADN da SEQ ID 9 e SEQ ID 5 foram misturados e utilizados como modelos na reacção PCR, utilizando os oligonucleótidos K551 e K555. A condição PCR era 30" a 94 °C, 30" a 50 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. 25 ng da amplificação de ADN resultante foram purificados com "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) e depois misturados com 25 ng de produto da amplificação do ADN da SEQ ID 4. Finalmente a mistura de ADN foi utilizada como modelo da amplificação de ADN utilizando os oligonucleótidos K551 e K556, segundo a condição PCR 30" a 94 °C, 30" a 50 °C e 90" a 72 °C durante 20 ciclos. O produto da proteína EC3 é uma molécula quimérica contendo as sequências de ADN Tx-15.11.a, Tx-1.11 e Tx-11.b. A SEQ ID 1 foi utilizada para amplificação do ADN do clone Tx-15.11, utilizando os oligonucleótidos K563 (5'— GGACTAGTCGGCTGG CTGCCTTGGGAGGCCTTG-3' ) e K565 (5'-GCCGCGGTAGCACTACCG CCACCA- GACAAACCAGGGCGATCTGTG-3'). O oligonucleótido K565 contém a sequência codificadora do ligante SGGGS, que junta as sequências Tx-15.11 and Tx-1.11. O protocolo PCR era 30" a 94 °C, 30" a 48 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. A SEQ ID 3 foi utilizada para amplificação do ADN do clone Tx-1.11, utilizando os oligonucleótidos K564 (5' — GCCCT- GGTTTGTCTGGTGGCGGTAG TGCTACCGCGGCCACCGCG-3') e K567 (5'-CCGGTTCGTTACTACCG CCACCA- GAGAAATGAACTTCTTCTTGTTC-3'). O oligonucleótido K567 contém a sequência codificadora do ligante SGGGS, que junta as sequências Tx-1.11 and Tx-ll.b. 35 0 protocolo PCR era 30" a 94 °C, 30" a 48 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. A SEQ ID 11 foi utilizada para amplificação do ADN do clone Tx-ll.b, utilizando os oligonucleótidos K566 (5' — GAAGT- TCATTTCTCTGGTGGCG GTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAG-3') e K568 (5'-CCGCGGCCGC AGATTCAGACT- CAGACGGAC-3'). O protocolo PCR era 30" a 94 °C, 30" a 48 °C e 60" a 72 °C durante 20 ciclos. Os produtos da PCR foram purificados com o "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) . 25 ng de produtos da amplificação do ADN da SEQ ID 1 e SEQ ID 3 foram misturados e utilizados como modelos na reacção PCR, utilizando os oligonucleótidos K563 e K567. O protocolo PCR era 30" a 94 °C, 30" a 45 °C e 60" a 72 °C durante 30 ciclos. 25 ng da amplificação de ADN resultante foram purificados e depois misturados com 2 5 ng de produto da amplificação do ADN da SEQ ID 11. Finalmente a mistura de ADN foi utilizada como modelo da amplificação de ADN utilizando os oligonucleótidos K563 and K568, segundo a condição PCR 30" a 94 °C, 30" a 45 °C e 180" a 72 °C durante 30 ciclos. O produto da proteina EC4 é uma molécula quimérica contendo as sequências de ADN Tx-2.a, Tx-1.16 e Tx-ll.b. A SEQ ID 9 foi utilizada como modelo de amplificação do ADN do clone Tx-2.a, utilizando os oligonucleótidos K551 e K553. A SEQ ID 5 foi utilizada como modelo de amplificação do ADN do clone Tx-1.16, utilizando os oligonucleótidos K552 e K572 (5'- CGTTACTACCGCCACCAGAGTTATCGCATTTGCAGGATGA-3'). O oligonucleótido K572 contém a sequência codificadora do ligante SGGGS, que junta as sequências Tx-1.16 and Tx-ll.b. 36 A SEQ ID 11 foi utilizada como modelo de amplificação do ADN do clone Tx-ll.b, utilizando os oligonucleótidos K571 (5'-TAACTCT- GGTGGCGGTAGT AACGAACCGGTGGCCCTAGC-3') e K568 .

Os produtos da PCR foram purificados com o "Qiagen Purification Kit" (Qiagen, CA, EUA) . 25 ng de produtos da amplificação do ADN da SEQ ID 9 e SEQ ID 5 foram misturados e utilizados como modelos na reacção PCR, utilizando os oligonucleótidos K551 e K572. 25 ng da amplificação de ADN resultante foram purificados e depois misturados com 25 ng de produto da amplificação do ADN da SEQ ID 11. Finalmente, a mistura de ADN foi utilizada como modelo da amplificação de ADN, utilizando oligonucleótidos K551 e K568. As condições de PCR para a construção de EC4 foram iguais às utilizadas para as construções EC2 e EC3. 0 quadro 2 seguinte indica, a titulo de exemplo, as sequências de ADN dos antigénios quiméricos EC2, EC3 e EC4: 37

Quadro 2

Nome Sequência EC2 SEQ ID ACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCCATTTGCTCGGATTGGTC 27 CGCATGGAGCCCCTGCAGTGTATCCTGCGGTGACGGAAGC CAAATCAGGACGCGAACT GAGGTtTCT GCT CCGCAACCT GG AACACCAACATGTCCGGACTGCCCTGCGCCCATGGGAAGGA CTT GCGT GGAACAAGGCGGACTTGAAGAAAT CCGTGAAT GC AGTGCGGGGGTATGTGCTGTTGACGCTGGATGTGGCGTCT GGT CT GGT GGCGGTAGCAGGACT GGAT GT CAT GCCTT CAG ggagaactgcagccctggtagatgtattgatgacgcctcgc ATGAGAATGGCTACACCTGCGAGTGCCCCACAGGGTACTCA CGTGAGGTGACTTCCAAGGCGGAGGAGTCGTGTGTGGAAG GAGTCGAAGT CACGCTGGCT GAGAAAT GCG AG AAG GAATT C GGCATCAGCGCGTCATCCTGCAAATGCGATAACTCTGGTGG CGGTAGCTCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTACG GT G CAG AC AGC ACT CTT GGTCCT GT CAAGTT GT CTGCGGAA GGACCCACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGT CAAAGTTCCT CAAGAC AACAAT CAGTACTGTT CCGGGACGA CGCT GACT GGTT GCAACGAGAAAT CGTT CAAAGATATTTT GC CAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGT GATAAGGGTGCCACGCTAACGAT CAAGAAGGAAGCATTT CC AGCCGAGT CAAAAAGCGTCATTATT GGAT GCACAGGGGGAT CGCCT GAGAAGCATCACT GTACCGT GAAACT GGAGTTTGCC GGGGCT GCAGGGTCAGCAAAAT CGGCTAGCGGCCGC 38 EC3 SEQ ID 29

ACTAGTCGGCT GGCT GCCTT GGGAGGCCTTGCGGAT CAGC eTGAAAATeATCAGGGTGTTGGAGAAGGAGTTACGGGTGTG GGGGAAGCAGGAGTGTCCCCCGTCAACGAAGCTGGTGAGT C ATACAGTT CT GC AACTT CGGGT GT CCAAGAAGCTACCGCC CCAGGTGCAGTGCTCCTGGACGCAATCGATGCCGAGTCGG ATAAGGT GGAC AAT CAGGCGGAGGG AGGT GAGCGTAT G AA GAAGGT CGAAGAGGAGTT GTCGTTATT GAGGCGGGAATTAT AT GAT CGC AC AG AT CGCCCT GGTTT GT CT GGT GGCGGTAGT GCTACCGCGGCCACCGCGT CAGAT GACGAACT GATGAGTC GAAT CCGAAATT CT G ACTTTTT CGAT GGT CAAGCACCCGTT G ACAGTCTCAGACCGACGAACGCCGGTGTCGACTCGAAAGG GACCGACGATCACCTCACCACCAGCATGGATAAGGCATCTG TAGAGAGTCAGCTTCCGAGAAGAGAGCCATTGGAGACGGAG CCAGAT GAAC AAGAAGAAGTT CATTT CTCT GGTGGCGGTAG TAACGAACCGGTGGCÇCTAGCTCAGCTCAGCACATTCCTCG AGCT CGTCG AGGT GCC AT GTAACT CT GTT C AT GTT C AGGGG GT GAT GACCCCGAATCAAATGGT CAAAGTGACTGGT GCAGG ATGGGATAATGGCGTTCTCGAGTTCTATGTCACGAGGCCAA CGAAGACAGGCGGGGACACAAGCCGAAGCCATCTTGCGTC GAT CAT GT GTTATT CCAAGGACATT GACGGCGTGCCGT CAG ACAAAGCGGGAAAGT GCTTT CT GAAGAACTTTT CT GGT GAAG ACTCGTCGGAAATAGACGAAAAAGAAGTATCTCTACCCATCA AGAGCC ACAACGAT GCGTT CAT GTT CGTTT GTT CTT CAAAT G AT GGATCCGCACT CCAGT GT GAT GTTTT CGCCCTT GATAACA CCAACT CTAGCGACGGGT GGAAAGT GAATACCGT GGAT CTT GGCGTCAGCGTTAGTCCGGATTTGGCATTCGGACTCACTGC AGAT GGGGT CAAGGT GAAGAAGTT GTACGCAAGCAGCGGC CTGACAGCGATCAACGACGACCCTTCCTTGGGGTGCAAGGC TCCTCCCCATTCTCCGCCGGCCGGAGAGGAACCGAGTTTGC CGTCGCCT GAAAACAGCGGGT CT GCAACACCAGCGGAAGA AAGT CC GTCT GAGTCT GAAT CT GCGGCCGCGG 39

EC4 SEQ ID 31 ACTAGTCGGCTCCCCCAGGATGCCATTTGCTCGGATTGGTC CGCATGGAGCCCCTGCAGT GTAT CCT GCGGT GACGGAAGC CAAATCAGGACGCGAACTGAGGTTTCTGCTCCGCAACCTGG AACACCAACAT GTCCGGACT GCCCCGCGCCCATGGGAAGG ACTTGCGTGGAACAAGGCGGACTTGAAGAAATCCGTGAATG CAGTGCGGGGGTATGTGCTGTTGACGCTGGATGTGGCGTCT GGTCTGGTGGCGGTAGCAGGACTGGATGTCATGCCTTCAG GGAGAACTGCCGCCCTGGTAGAT GTATT GATGACGCCTCGC ATGAGAATGGCTACACCTGCGAGTGCCCCACATGGTACTCA CGT GAGGT GACTT CCAAGGCGGAGGAGTCGT GTGTGGAAG GAGTCGAAGTCACGCTGGCTGAGAAATGCGAGAAGGAATTC GGCAT CAGCGCGT CCT CCT GCAAAT GCGATAACTCTGGT GG CGGTAGTAACGAACCGGTGGCCCTAGCTCAGCTCAGCACAT T CCT C GAGCT CGT CGAGGT GCCATGTAACTCT GTTC ATGTT C AGGGGGTGATGACCCCGAATCAAATGGTCAAAGTGACTGGT GCAGGATGGGATAATGGCGTTCTCGAGTTCTATGTCACGAG GCCAACGAAGACAGGCGGGGACACAAGCCGAAGCCACCTT GCGT CGAT CAT GT GTTATT CCAAGGACATTGACGGCGTGCC GT CAGACAAAGCGGGAAAGTGCTTTTTGAAGAACTTTT CTGG T GAAGACT CGTCGGAAATAGACGAAAAAGAAGTATCTCTACC CAT C AAG AGC C AC AACG AT GCGTT CATGTT CGTTT GTTCTT C AAAT G AT GGAT CCGCACT CCAGT GT GAT GTTTT CGCCCTTGA TAACACCAACT CTAGCGACGGGT GGAAAGTGAATACCGT GG AT CTT GACGT CAGCGTTAGT CCGGATTT GGCATTCGGACTCA CT GCAG AT GGGGT CAAGGT GAAGAAGTT GTACGCAAGCAGC GGCCT G ACAGCGAT CAACGACGACCCTT CCTT GGGGTGCAA GGCTCCTCCCCATTCTCCGCCGGCCGGAGAGGAACCGAGT TTGC CGT CGCCT GAAAACAGCGGGT CTGCAACACCAGCGGA AGAAAGT CCGTCT GAGT CT GAATCTGCGGCCGCGG A proteína quimérica EC2 possui a sequência de aminoácidos

TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTEVSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQ

GGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHAFRENCSPGRCIDDASHENGYTCECP

TGYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGISASSCKCDNSGGGSSVVNNVARCSYG 40

ADSTLGPVKLSAEGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKDILPKLTE NPWQGNAS SDKGATLTIKKEAF PAESKSVIIGCTGGSPEKHHCTVKLEFAGAAGSAKSASGR (SEQ ID 28) e respectiva utilização como antigénio recombinante contendo múltiplos fragmentos de proteína de Toxoplasma gondii estão abrangidas pela presente invenção. A proteína guimérica EC3 possui a seguência de aminoácidos TSRLAALGGLADQPENHQALAEPVTGVGEAGVS-PVNEAGESYSSATSGVQEATAPGAVLLDAIDAESDKVDNQAEGGERMKKVEEELSLLRR ELYDRTDRPGLSGGGSATAATASDDELMSRIRNSDFFDGQAPVDSLRPTNAGVDSKGTD DHLTTSMDKASVESQLPRREPLETEPDEQEEVHFSGGGSNEPVALAQLSTFLELVEVPC NSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGVLEFYVTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGV PSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEVSLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNT NSSDGWKVNTVDLGVSVSPDLAFGLTADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSP PAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSESES AAA (SEQ ID 30) e respectiva utilização como antigénio recombinante contendo múltiplos fragmentos de proteína de Toxoplasma gondii estão abrangidas pela presente invenção. A proteína quimérica EC4 possui a sequência de aminoácidos TSRLPQDAICSDWSAWSPCSVSCGDGSQIRTRTE-VSAPQPGTPTCPDCPAPMGRTCVEQGGLEEIRECSAGVCAVDAGCGVWSGGGSRTGCHA FRENCRPGRCIDDASHENGYTCECPTWYSREVTSKAEESCVEGVEVTLAEKCEKEFGIS ASSCKCDNSGGGSNEPVALAQLSTFLELVEVPCNSVHVQGVMTPNQMVKVTGAGWDNGV LEFYVTRPTKTGGDTSRSHLASIMCYSKDIDGVPSDKAGKCFLKNFSGEDSSEIDEKEV SLPIKSHNDAFMFVCSSNDGSALQCDVFALDNTNSSDGWKVNTVDLDVSVSPDLAFGLT ADGVKVKKLYASSGLTAINDDPSLGCKAPPHSPPAGEEPSLPSPENSGSATPAEESPSE SESAAA (SEQ ID 32) e respectiva utilização como antigénio recombinante contendo múltiplos fragmentos de proteína de Toxoplasma gondii estão abrangidas pela presente invenção. 41

Construção de vectores de ADN que orientam a expressão de antigénios quiméricos como produtos da fusão com GST no citoplasma de células de E. coli.

Fragmentos de ADN codificadores das proteínas quiméricas EC2, EC3 e EC4 foram clonados como produtos da fusão com a proteína glutationa sulfotransferase (GST) e expressos como proteínas solúveis no citoplasma de células bacterianas com o objectivo de determinar a sua especificidade e selectividade. As sequências de ADN de EC2, EC3 e EC4 (SEQ ID 27, 29 e 31, respectivamente) foram digeridas com as enzimas de restrição Spel e Notl. 0 ADN digerido foi clonado para o vector pGEX-SN (Minenkova et al., International Journal of Câncer, 2003, 106:534-44), previamente digerido com as endonucleases Spel e Notl para gerar produtos da fusão no terminal carboxilo da proteína GST. Os plasmídeos resultantes foram utilizados para transformar células E. coli competentes segundo os protocolos padrão (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

Caracterização bioquímica dos antigénios quiméricos recombinantes.

As proteínas recombinantes GST-EC2, GST-EC3 e GST-EC4 foram expressas no citoplasma de células E. coli transformadas e purificadas por cromatografia de afinidade, utilizando resina de glutationa-sefarose (Amersham Pharmacia Biotech, Suécia), segundo as instruções do fabricante. A pureza da proteína e concentração foram estimadas por análise SAS-PAGE (electroforese em dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida) e análise de 42

Bradford respectivamente. Os produtos recombinantes purificados por afinidade foram dializados contra PBS, diluídos a uma concentração de 1 mg/ml com PBS e guardados a 20 °C até serem utilizados. O rendimento dos produtos purificados foi de 8 mg/litro de cultura bacteriana, 5 mg/litro e 4 mg/litro para os antigénios quiméricos GST-EC2, GST-EC3 e GST-EC4 respectivamente. As proteínas recombinantes foram depois sujeitas a cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC). Com este objectivo foi executada uma filtração em gel, utilizando uma coluna HPLC TSK G4000 SW-XL, injectando 30 μΐ de cada amostra (concentração de proteína 2 mg/ml) na coluna com um caudal de 1 ml/min (fase móvel: KH2PO4 0,05 M; NaCl 0,3 M pH 7,0). Os resultados da análise HPLC demonstraram que os antigénios quiméricos GST EC2, GST EC3 e GST-EC4 foram purificados como produtos homogéneos em formas diméricas (ver figura 4, na qual se mostra a análise HPLC de GST-EC2 como exemplo) com um peso molecular respectivo de 110,4, 152,6 e 130 kDa (Da, Dalton). Os agregados proteicos de elevado peso molecular estavam ausentes em todas as preparações de proteína purificadas.

Imunorreactividade dos antigénios recombinantes quiméricos com anticorpos IgG de soros de indivíduos infectados com T. gondii: IgG Rec-ELISA A realização de ELISA dos produtos de fusão GST foi realizada com o revestimento de placas multipoço Maxuisorp (Nunc) com fragmentos de antigénios simples ou proteínas quiméricas a uma concentração de 5 mg/ml em tampão de revestimento (50 mM NaHC03, pH 9,6). Após incubação de um dia para outro a 4 °C, as placas foram incubadas durante 1 h a 37 °C com tampão de bloqueio (5 % de leite desnatado, 43 0,05 % de Tween 20 em PBS) e seguidamente incubadas durante 1 h a 37 °C com soro de indivíduos seropositivos e seronegativos T. gondii, diluídos 1:200 em solução de bloqueio. As placas foram extensivamente lavadas com 0,05 % Tween 20 em PBS e adicionou-se depois a cada poço peroxidase de rábano-silvestre anti-IgG humano-anticorpos conjugados (1 mg/ml; Sigma-Aldrich, EUA), diluído 1:10000 em solução de bloqueio. Finalmente, a incubação das placas com o substrato cromogénico tetrametilbenzidina (TMB; Sigma-Aldrich, EUA) revelou a actividade enzimática. Os resultados foram registados como a diferença entre a absorvância (densidade óptica, OD) a 450 e 620 nm, detectados por um leitor ELISA automático (Labsystem Multiskan, Finlândia). Por cada amostra de soro a análise foi realizada em triplicado e foram calculados os valores médios. O quadro 3 seguinte revela a reactividade IgG dos fragmentos antigénicos simples e os antigénios quiméricos EC2, EC3 e EC4, expressos como proteínas de fusão GST, utilizando soros de 36 seres humanos (TI a T36) seropositivos T- gondii e 27 seres humanos (NI a N27) seronegativos T- gondii. São apresentados os níveis específicos de IgG específico do Toxoplasma, calculados em Unidades Internacionais (IU), utilizando um teste comercial (VIDAS system, bioMeriéux, Marcy-1'Etoile, França). Por cada produto da fusão GST, o valor limite foi determinado como sendo a média mais duas vezes o desvio padrão das leituras de absorvância obtidos a partir de soros negativos para IgG Toxoplasma. Tipo normal, OD<limite; tipo negrito, OD>limite. O valor numérico indicado em cada célula foi calculado como sendo a proporção do OD de ensaio para o 44 limite do antigénio correspondente (nd, não determinado). Os valores maiores que 1 indicam uma resposta positiva. 0 quadro 3 mostra claramente alguns dos soros que têm resultado positivo como sendo negativos quando são utilizados fragmentos antigénicos simples, enquanto mostram ser positivos quando são utilizados os antigénios quiméricos da presente invenção. Atenção, os valores numéricos das concentrações IgG obtidos com o teste padrão não podem ser comparados com os outros porque foram calculados com referência à Norma Internacional, que não pode ser utilizada para os outros testes.

Quadro 3

Amostr niveis no (IU/ml a IgG Proteínas de fusão GST recombinantes soro Tx- 15.11 Tx- 1.11 Tx- 1.16 Tax-4.18 Tx-2. a Tx-11 .b EC2 EC3 EC4 TI >300 7,4 3,5 9, 8 3,7 18,3 12,5 11,0 10,0 7,6 T2 188 8,7 7,4 2,4 5,1 18,8 4,4 26, 0 23,5 20, 0 T3 265 7,4 2,8 4, 6 2,8 8,4 5, 6 20,4 17, 9 34, 0 T 4 4090 23,3 27,8 22,4 29, 7 25, 1 27,4 33, 6 43,3 40,5 T 5 >300 12,4 9,7 25,7 2, 9 nd nd 30, 6 34,4 19,5 T 6 35 1,2 0,8 1,0 1,3 0, 9 1,4 1,4 5,7 1,7 T7 58 1,0 1,3 0 . 6 2,3 1,2 1.0 4,6 5, 1 1,2 T8 101 2,5 0.9 2,5 2,8 11,2 2, 9 17,0 4,8 30, 9 T 9 88 16,2 5, 9 2,4 2,7 6, 8 6,7 9, 4 27,4 29, 9 TIO 188 1,7 1,2 4,4 3,1 1,7 1,3 4,4 3, 6 3,3 Til 530 28, 9 12,7 12,1 31,4 32,1 31,2 32,1 42, 6 41,5 T12 89 0, 9 nd 4,8 nd 1,2 0,5 1,7 2,4 2,1 T13 1095 8, 6 2,3 3,4 5, 9 nd nd 31,7 23,4 20,3 T14 248 12, 6 4,3 2,1 0.9 nd nd 7,4 14, 6 9,2 45 Τ15 155 17,5 1,0 2,8 3,4 nd nd 6,7 20,1 13, 0 ΤΙ 6 427 4,5 3, 9 5, 0 2,7 nd nd 17,4 37, 9 18, 9 Τ17 236 12,1 4,8 6,1 3,7 nd nd 22,0 33, 9 12,7 ΤΙ 8 46 2,1 2,0 2, 6 2,2 nd nd 1, 9 5,4 1,4 ΤΙ 9 247 2,3 2,5 3, 6 0,5 nd nd 3,7 3, 9 2,3 Τ20 100 nd nd nd nd 7,5 1,4 13, 1 5,2 14, 6 Τ21 27 2, 6 0, 6 4,1 1,0 nd nd 3,1 4,8 5,5 Τ22 >300 28, 6 5,1 4, 6 19, 9 nd nd 14,5 14,8 7,4 Τ23 92 1,7 1,1 1,3 0,8 0,7 0.8 6, 9 4,5 6,4

Serum IgG leveis s amp1e (IU/ml) Recombinant GST-fusion proteins Tx- 15.11 Tx-1.11 Tx- 1.16 Tax-4.18 Tx-2 . a Tx-11 .b EC2 EC3 EC4 T24 68 0,5 2,1 2,0 2, 6 1,3 1,3 2,5 6, 6 1,4 T25 63 2,4 2,4 5,5 6, 8 8,8 7,7 13, 8 16,6 32, 9 T26 299 12,1 10,0 6,5 4, 6 nd nd 10,0 13,5 6,0 T27 108 3,4 4,0 5,7 3, 0 nd nd 4,8 6,2 3,1 T28 68 1,7 2,7 3,3 2,1 2.0 2,3 6,4 6, 9 7,7 T29 >300 1,0 1,1 2,8 1,2 4,0 6,3 9,1 13,7 23, 5 T30 114 1,8 2,8 19, 3 3, 8 3, 9 2,0 13.0 13,3 13, 6 T31 35 3,2 1,2 3,5 0, 9 1,5 1,0 3, 6 6,3 5,7 T32 300 4,8 16, 0 17,3 20, 9 nd nd 31, 6 33, 1 8,4 T33 123 5, 6 2, 6 3,3 4,5 20,4 2,8 25, 8 21,0 36, 6 T34 60 nd nd nd nd 6,2 4,2 9,1 7,7 9,3 T35 155 0,7 2,4 0,5 2,3 1,8 1,1 7,3 10,4 9,5 T36 45 0,3 1, 6 1,1 0,8 1,2 0, 9 3,2 3.2 3,1 46 NI 0,4 0,4 0,7 0,7 0.5 0,3 0,4 0,7 0,5 N2 0,7 0,5 0,5 0,4 nd nd 0,4 0,5 0,4 N3 nd nd nd nd nd nd 0.9 0,5 0,6 N4 nd nd nd nd nd nd 0,4 0,5 0,7 N5 nd nd nd nd 0,5 0,7 0,4 0,5 0,5 N 6 nd nd nd nd nd nd 0,4 0,5 0,5 N7 0,4 0,4 0, 6 0,7 nd nd 1,0 0,5 0,7 N8 0,4 0,5 0,5 0,5 nd nd 0,4 0,5 0,6 N9 0,4 0, 6 0,7 0,5 nd nd 0,4 0,5 0,4 NI 0 nd nd nd nd nd nd 0,3 0,5 0,4 NI 1 nd nd nd nd nd nd 0,4 0,5 0,5 N12 nd nd nd nd nd nd 0,5 0,7 0,8 NI 3 nd nd nd nd nd nd 0,4 0,7 0.3 NI 4 0,7 0,5 0,5 0,5 0.9 0,7 0,5 0,5 0,5 NI 5 0,4 0 . 6 0,4 1,0 0.5 0,8 0,4 0,5 0.4 NI 6 0,8 0,2 0,5 0, 6 0,5 0,4 0,5 0,7 0,5 NI 7 0,8 0,5 0, 9 0,4 0 . 6 0,7 0,4 0,5 0,6 NI 8 0.3 0,4 0,7 0,5 0, 6 0, 6 0,4 0, 6 0,9 NI 9 0,4 0,5 0,5 0,8 nd nd 0,5 0,8 0,8 N2 0 0, 6 0, 6 0.4 0, 6 0,7 0,5 0,8 0,7 1,0 N21 0,7 0,7 0 . 6 0,5 0,5 0,4 0,4 0,7 0,6 N22 0.4 0,5 0,7 0,5 0,5 0,7 0,4 0, 6 0.3

Serum IgG leveis s amp1e (IU/ml) Recombinant GST-fusion proteins Tx- 15.11 Tx-1.11 Tx- 1.16 Tax-4.18 Tx-2 . a Tx-11 .b EC2 EC3 EC4 N23 0,5 0,5 0,7 0,5 nd nd 0,4 0, 6 0,5 47 N24 nd nd nd nd 0,5 0,5 O > ΟΊ 0,7 0,7 N25 nd nd nd nd O 00 0,5 ° > co 0, 6 0,5 N2 6 nd nd nd nd 0,5 0 . 6 0,4 0 . 6 0,4 N27 nd nd nd nd 0,4 0, 6 ° > co' O \—1 0,4 0 quadro 4 seguinte resume os resultados dos testes ELISA baseados nas proteínas recombinantes, empregando amostras de soro de seres humanos seropositivos e seronegativos T. gondii. Em cada coluna são indicados o número e percentagens correspondentes de soros reactivos.

No quadro 4 é evidente que a sensibilidade do teste (ver a 2a coluna referente á ocorrência de falsos negativos) melhorou com a utilização dos antigénios quiméricos da invenção. Este aperfeiçoamento é evidente relativamente tanto à utilização de fragmentos de antigénio simples como utilização de um conjunto ou misturas (Mix-Tx-1.16/Tx-4.18/TX-2.a, Mix-Tx-1.16/Tx-4.18/TX-2.a, Mix-Tx-1.16/Tx-2.a/Tx=ll.b) dos diferentes fragmentos de antigénio simples.

Quadro 4

Proteína de fusãoSoro de sujeitosSoro de indivíduos sem GST infectados gondii com T.infecçao por T Tx-15.11 28/34 (82, 4%) 0/15 Tx-1.11 29/33 (87, 9%) 0/15 Tx-1.16 31/34 (91, 2%) 0/15 Tx-4.18 27/33 (81, 8%) 0/15 Tx-2.a 21/23 (91, 3%) 0/14 Tx-11.b 18/23 (78, 3%) 0/14 48

Mix-Tx-1.16/Tx- 35/36 (97,2) 0/27 4.18/TX-2.a Quimera EC2 36/36 (100%) 0/27 Mix-Tx-15.il/Tx- 35/36 (97,2%) 0/27 1.11/Tx-ll.b Quimera EC3 36/36 (100%) 0/27 Mix-Tx-1.16/Tx- 34/36 (94,4%) 0/27 2.a/Tx-11.b Quimera EC4 36/36 (100%) 0/27

Imunorreactividade de domínios antigénicos simples dentro dos antigénios recombinantes quiméricos- com anticorpos IgG de soro de indivíduos infectados com Γ. gondii. Para verificar se os antigénios quiméricos retêm a imunorreactividade dos fragmentos de antigénio simples utilizados para a construção dos mesmos, os soros humanos que reagiram especificamente em testes ELISA com fragmentos de antigénio simples foram absorvidos com diferentes combinações de antigénios simples e depois foram testados com proteínas quiméricas. Com este objectivo, combinações diferentes dos fragmentos de antigénio expressos como produtos da fusão GST foram revestidos em placas multipoço Maxisorb (Nunc) a uma concentração de 10 pg/ml em tampão de revestimento (50 mM de NaHC03, pH 9, 6) e incubados de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram extensivamente lavadas e posteriormente incubadas durante 30 min a 37 °C com amostras de soro (20 ml/poço) em solução de bloqueio (5 % de leite desnatado, 0,05 % de Tween 20 em PBS). Os soros sem anticorpos específico do fragmento foram recuperados de cada poço, adicionados a um novo poço, incubados durante 30 49 min e o mesmo procedimento foi repetido mais 6 vezes. As amostras que foram esgotadas dos anticorpos específicos contra fragmentos de antigénio simples ou múltiplos foram finalmente analisadas com testes ELISA nos antigénios quiméricos. Com este objectivo, os antigénios quiméricos EC2, EC3 and EC4, enquanto produtos de fusão GST foram revestidos de um dia para o outro a 4 °C, em placas multipoço Maxisorb, a uma concentração de 5 mg/ml. As placas revestidas foram bloqueadas e posteriormente incubadas durante 1 h a 37 °C com soro humano sem anticorpos diluído 1:100 em solução de bloqueio. As placas foram extensivamente lavadas e adicionou-se depois a cada poço fosfatase alcalina IgG anti-humano-conjugado de anticorpos (Sigma- Aldrich, EUA), diluída a 1:7500 em solução de bloqueio. Finalmente, o substrato cromogénico fosfato de p-nitrofenilo (Sigma-Aldrich, EUA) revelou a actividade enzimática. Os resultados foram registados como a diferença entre a absorvância a 405 e 620 nm, detectada com leitor ELISA automático (Labsystem Multiskan, Finlândia) . Por cada amostra, a análise foi efectuada em duplicado e foram calculados os valores médios.

Modificação bioquímica dos antigénios quiméricos EC2 e EC3

Para analisar a imunorreactividade dos antigénios quiméricos EC2 e EC3 com anticorpos IgM anti-Toxoplasma em soros de doentes, as proteínas recombinantes foram modificadas quimicamente pode biotinilação. Com este objectivo, os GST-EC2 e GST-EC3 purificados, diluídos a uma concentração de 1 mg/ml em PBS foram incubados na presença de um excesso molar quíntuplo de sulfossuccinimidil-6-(biotinamido)hexanoato (Sulfo-NHS-LC-Biotin da Pierce, EUA) 50 durante 3 horas em gelo. As proteínas foram então dializadas de um dia para o outro contra PBS para remover o excesso de reagentes de biotina por reagir e hidrolizados. Os níveis de incorporação de biotina em antigénios quiméricos foram determinados utilizando o "EZ Biotin Quantitation Kit" (Pierce, EUA), resultando em 1,4 biotina/molécula para GST-EC2 e 1,3 biotina/molécula para GST-EC3. Os produtos marcados com biotina foram finalmente diluídos a uma concentração de 0,5 mg/ml e guardados a 20 °C até serem utilizados.

Imunorreactividade do EC2 e EC3 marcados com biotina com anticorpos IgM específicos do Toxoplasma. IgG Rec-ELISA

Para investigar a imunorreactividade dos antigénios recombinantes com imunoglobulinas M específicas do Toxoplasma, foi empregue um imunoensaio duplo, tipo sandwich (IgM Rec-ELISA). Placas Maxisorb (Nunc, EUA) foram revestidas com anticorpos IgM anti-humano (Sigma-Aldrich, EUA) a uma concentração de 10 mg/ml em tampão de revestimento (50 mM de NaHC03, pH 9, 6) . As placas foram bloqueadas com albumina de soro de bovino a 3 % em PBS (solução de bloqueio) durante 1 h a 37 °C e seguidamente foram incubadas durante 1 h a 37 °C com amostras de soro em solução de bloqueio. As placas foram lavadas e depois incubadas durante 2 h à temperatura ambiente com as proteínas de fusão GST marcadas com biotina, diluídas em solução de bloqueio. Depois de terem sido extensivamente lavadas, as placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com peroxidase de rábano silvestre conjugada com estreptavidina (Pierce, EUA) a uma concentração de 1 pg/ml em solução de bloqueio. Finalmente, a actividade enzimática foi revelada por meio de incubação 51 das placas durante 30 min. à temperatura ambiente com o substrato tetrametilbenzidina (TMB; Sigma-Aldrich, EUA). Os resultados foram registados como a diferença entre a absorvância a 450 e 620 nm, detectada com leitor ELISA automático (Labsystem Multiskan, Finlândia). Para cada amostra, a análise foi efectuada em duplicado e foram calculados os valores médios.

Estabilidade térmica dos antigénios quiméricos marcados com biotina. A fim de determinar a estabilidade térmica de GST-EC2 e GST-EC3 marcados com biotina, os produtos recombinantes foram diluídos a uma concentração de 5 pg/ml no tampão comercial "Stabilzyme" (SurModics, EUA) e guardados a +4 °C até serem utilizados. Com intervalos de tempo diferentes (até 80 dias) avaliou-se a imunorreactividade das proteínas recombinantes no teste IgM Rec-ELISA e foram comparados os resultados obtidos durante a análise dos produtos correspondentes, mantidos congelados a 20 °C. Executou-se o IgM Rec-ELISA como anteriormente descrito, utilizando os antigénios GST-EC2 e GST- EC3 marcados com biotina, a uma concentração final de 500 ng/ml em solução de bloqueio (3% de BSA em PBS) e soros humanos diluídos 1:100 em solução de bloqueio. Por cada amostra, a análise foi efectuada em duplicado e foram calculados os valores médios. Os ID50, calculados como dia limite quando foi medido 50% de imunorreactividade IgM específica do toxoplasma, foram de 189 dias e 97 dias para GST-EC2 e GST-EC3 respectivamente. Estas constatações indicam claramente que os antigénios quiméricos da invenção são estáveis em soluções diluídas durante muito tempo, o que constitui um requisito 52 fundamental para a utilidade comercial de um produto recombinante.

Avaliação ampliada de IgG Rec-ELISA

Os antigénios quiméricos GST-EC2 e GST-EC3 marcados com biotina foram testados com anticorpos IgM em soros de individuos infectados por T. gondii e os resultados dos IgM Re—ELISA foram comparados com os obtidos com testes comerciais empregando antigénio de Toxoplasma célula inteira lisado (VIDAS system from bioMeriéux, França; ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS da DiaSorin, Itália). Com este fim, foram analisadas amostras de soro de mulheres afectadas por toxoplasmose primária durante a gestação e encaminhadas para seguimento pós-natal no Centro de Infecção Perinatal da Região de Campania, Itália. Os testes IgG e IgM bioMeriéux VIDAS Toxo foram utilizados para seleccionar três grupos de amostras de soro para a avaliação do desempenho de IgM Rec-ELISA Toxoplasma. 0 grupo A (n = 22) era constituído por amostras negativas quanto a IgM especifico de T. gondii e anticorpos, segundo medições dos testes IgM e IgG VIDAS Toxo. 0 grupo B (n = 18) era constituído por amostras com um perfil serológico consistente com uma infecção crónica (presença de anticorpos IgG específicos de T. gondii e ausência de IgM específico de Γ. gondii segundo medições dos testes IgM e IgG VIDAS Toxo, respectivamente) . 0 grupo C (n = 50) era constituído por amostras com um perfil serológico consistente com uma infecção aguda (presença de anticorpos IgM e IgG específicos de Γ. gondii segundo medições dos testes IgM e IgG VIDAS Toxo). IgM Rec-ELISA foi realizado como anteriormente descrito e por cada amostra de soro a análise foi realizada em duplicado e foram calculados os 53 valores médios. 0 quadro 5 seguinte revela a reactividade IgM dos antigénios quiméricos GST-EC2 e GST-EC3 marcados com biotina, em comparação com os resultados obtidos com testes comerciais (VIDAS e ETI-TOXO-K), utilizando soros do grupo A (AI a A22) , grupo B (BI a B18) e grupo C (Cl a C50) . Os niveis de IgG específicos do Toxoplasma, calculados em Unidades Internacionais (IU) são também indicados. Por cada produto da fusão GST marcado com biotina, o valor limite foi determinado como sendo a média mais duas vezes o desvio padrão das leituras de absorvância obtidos a partir de soros negativos para IgM específico de T. gondii (grupos A e B, n = 40) . Os valores limite para VIDAS IgM, ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS, GST-EC2 e GST-EC3 foram 0,650, 0,500, 0,343 e 0,378 respectivamente. Os valores a negrito indicam uma resposta positiva.

Quadro 5

Soro Toxo-IgG (Ul/ml) VIDAS IgM ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS IgG Rec-ELISA GST-EC2 GST-EC3 Al 0 0,05 0,397 0,268 0,256 A2 4 0,22 0,317 0,263 0,270 A3 0 0,18 0,252 0,264 0,237 A4 0 0,05 0,375 0,324 0,241 A5 2 0,17 0,272 0,298 0,222 A6 0 0,03 0,288 0,270 0,234 A7 0 0,19 0,210 0,215 0,379 A8 0 0,10 0,108 0,203 0,296 A9 0 0,06 0,324 0,314 0,291 AIO 0 0,09 0,339 0,325 0,286 All 0 0,05 0,193 0,223 0,271 A12 2 0,08 0,134 0,268 0,378 54 AI 3 4 0,12 0,115 0,309 0,335 Ά14 0 0,23 0,115 0,221 0,286 A15 0 0,06 0,230 0,281 0,374 AI 6 2 0,08 0,132 0,317 0,269 AI 7 1 0,18 0,123 0,277 0,281 AI 8 0 0,35 0,097 0,316 0,279 AI 9 0 0,28 0,346 0,274 0,272 A20 0 0,09 0,054 0,259 0,132 A21 0 0,61 0,206 0,24 0,312 A22 0 0,06 0,127 0,238 0,233 BI 24 0,06 0,239 0,255 0,189 B2 10 0,09 0,076 0,283 0,304 B3 44 0,14 0,124 0,265 0,261 B4 44 0,28 0,195 0,298 0,216 B5 25 0,1 0,131 0,273 0,185 B6 57 0,12 0,164 0,296 0,293 B7 12 0,22 0,185 0,257 0,194 B8 58 0,12 0,148 0,255 0,248 B9 56 0,4 0,174 0,232 0,268 B10 19 0,09 0,068 0,290 0,194 Bll 56 0,16 0,136 0,179 0,221 B12 45 0,12 0,139 0,235 0,181 B13 87 0,12 0,096 0,207 0,218 B14 27 0,15 0,144 0,196 0,174 B15 33 0,46 0,242 0,285 0,378 B16 13 0,04 0,064 0,161 0,177 B17 67 0,13 0,111 0,177 0,213 B18 53 0,27 0,170 0,238 0,165 Cl 28 5,37 1,04 0,350 0,548 55

Soro Toxo-IgG (Ul/ml) VIDAS IgM ETI-TOXOK-M Reverse-PLUS IgG Rec-ELISA GST-EC2 GST-EC3 C2 255 3, 86 1,49 0,546 0,498 C3 78 3, 01 1,38 0,471 0,867 C4 1358 2,28 1,17 0, 464 0,453 C5 178 2,31 1,27 0,598 0,406 C6 155 2,00 0,97 0, 993 0,720 C7 109 3,20 1,76 0, 794 0, 642 C8 99 3,16 1,78 0,572 0,389 C9 103 2,28 1,34 1, 056 1,222 CIO 85 2,22 1,44 0, 930 0,704 Cll 70 1, 01 0,79 0, 416 0,376 C12 26 1,34 0, 93 0,392 0,461 C13 36 1,22 0,86 0,532 0,499 C14 156 0, 99 0,58 0,534 0,833 C15 204 0, 93 0, 90 0, 810 0,710 C16 133 1,13 0,85 0, 465 0,322 C17 183 1,14 0,82 0,320 0,327 C18 242 0, 90 0,71 0, 497 0,500 C19 80 1, 00 0,79 0, 444 0,706 C20 258 1,40 0,88 2,678 0,484 C21 278 1, 69 1,06 0, 703 0,509 C22 246 1,25 0,76 1, 094 0,780 C23 59 1,23 0,71 0, 495 1,499 C24 38 0,78 0,87 0,584 0,455 C25 130 0, 76 0, 92 0,562 0,545 C26 262 0, 84 0, 65 0, 649 0,551 C27 168 0, 96 0,85 1, 439 0, 938 C28 126 0,78 o 00 o 2,475 1,160 C29 197 1,38 0, 61 0,544 0,358 C30 127 0, 86 0,52 0, 847 0,531 56 C31 72 1,28 0,93 1, 756 0,891 C32 130 0, 77 0,71 0,505 0,381 C33 439 1,00 0,66 0,834 0,464 C34 83 0, 66 1,32 1,162 0, 989 C35 178 0,89 0,87 0, 694 0,487 C36 560 0,86 0,69 0,817 0, 628 C37 223 0, 96 0,73 0,531 0,819 C38 242 0, 98 0,41 0,379 0,318 C39 118 1,16 0,84 0, 420 0,380 C40 232 1,39 1,01 0, 490 0,467 C41 213 1,03 1,05 0,750 0,822 C42 243 1,06 0,97 0,534 0,502 C43 154 0, 75 0,73 0, 455 0,337 C44 35 1, 90 1,51 0,383 1,008 C45 667 0,85 1,01 0,366 0,285 C46 275 0, 95 0,99 0,411 0,544 C47 157 1, 93 1,36 0,382 0,464 C48 1037 1,08 0,51 0,385 0,301 C49 92 1,31 0,68 0,537 0,427 C50 255 0,69 0,69 0,354 0,801 0 quadro 6 seguinte revela as características do desempenho dos testes comerciais (VIDAS IgM e ETI- TOXOK-M Reverse PLUS), quando comparados com os resultados obtidos com os antigénios quiméricos EC2 e EC3 marcados com biotina (IgM Rec-ELISA) . No quadro 6 é evidente que os valores preditivos tanto da especificidade como positivos dos testes (ver 3a coluna referente à ocorrência de positivos falsos) atingiram o máximo (100 %) com a utilização dos antigénios quiméricos da invenção. Relativamente à 57 sensibilidade e concordância, tanto o teste comercial ETI-TOXOK-M com antigénio de Toxoplasma da célula completa lisado como IgM Rec-ELISA com o antigénio quimérico EC2 revelam caracteristicas de desempenho idênticas, com ambos os valores muito próximo dos 100 %.

Quadro 6

Teste deSensibilid Especifici Concordânc ppv* NPV* diagnóstico ade (%) dade (%) ia (%) (%) (%) VIDAS IgM 100 100 100 100 100 ETI-TOXOK-M 98,0 100 98, 9 100 97, 6 EC2-IgM Rec-98,0 100 98, 9 100 97, 6 ELISA EC3-IgM Rec-84,0 100 91, 1 100 83, 3 ELISA * PPV, valor preditivo positivo; * NPV, valor preditivo negativo

Finalmente, foi investigada a imunorreactividade dos antigénios GST-EC2 e GST-EC3 marcados com biotina perante os anticorpos IgM em soros de bebés com toxoplasmose congénita. Num estudo retrospectivo, analisou-se os soros de 30 bebés de mães com infecção por T. gondii primária durante a gravidez. Vinte bebés tinham toxoplasmose congénita e dez não estavam infectados, como ficou demonstrado pela persistência ou desaparecimento de anticorpos IgG específicos do Toxoplasma após os 12 meses de idade, respectivamente. No conjunto de doentes infectados, a idade gestacional à altura da infecção 58 materna coincidia com o segundo trimestre em 6 mães e com o terceiro trimestre em 14 das mães. 30 amostras de soro de bebés infectados e sem infecção foram analisadas com IgM Rec-ELISA e foram comparados os resultados obtidos com os testes comerciais empregando o antigénio Toxoplasma de célula completa (ELFA-IgM e ETI-TOXOK-M Reverse PLUS). Os niveis específicos de IgG anti-Toxoplasma oscilaram entre 28 e 1147 IU/ml para soros de bebés infectados e entre 19 e 170 IU/ml para soros de sujeitos sem infecção. Por cada produto da fusão GST, o valor limite foi determinado como sendo a média mais duas vezes o desvio padrão das leituras de absorvância obtidos a partir de soros de bebés sem infecção. No quadro 7 encontram-se resumidos os resultados dos IgM Rec-ELISAs com soros individuais de bebés infectados. Globalmente, o número de soros reactivos ao IgM oscilou entre 70 % (14/20) a 50 % (10/20) utilizando os antigénios GST-EC2 e GST-EC3, respectivamente. Em contraste, apenas 7 em 20 bebés infectados (35 %) teve resultados positivos quando foram empregues os testes ELFA-IgM ou ETI-TOXOK-M. Entre os bebés infectados, nenhum dos soros reconheceu os antigénios GST-EC2 e GST-EC3 no IgM Rec-ELISA ou teve resultado positivo com os testes comerciais.

Em conclusão, estes resultados demonstram que a utilização dos antigénios quiméricos recombinantes é eficaz na distinção de indivíduos infectados por T. gondii dos sem infecção, apresentando o desempenho equiparável ou mesmo melhor no que respeita à utilização do antigénio taquizoito de célula completa e podem proporcionar a base para imunoensaios comerciais padronizados para o sorodiagnóstico da toxoplasmose. 59

Quadro 7 Reactividade IgM específica de Toxoplasma de amostras de soro de 30 bebés nascidos de mães com infecção primária por T. gondii adquirida durante a gravidez a

Doente Tempo desde Início Níveis b IgG ELFA- IgMETI- ToxoM IgG limiar Rec-ELISA d no. nascimen (IU/ml) Limiar c Limiar c GST-EC2 GST-EC3 to (sem) TI 1 B 169 6,41 2,66 2,479 0,542 T2 2 B 988 0, 73 0,15 0,360 0,270 T3 2 Sub 300 0,09 0,13 0,212 0,209 T 4 3 Sub 57 0, 05 0,23 0,206 0,211 T5 3 Sub 124 0,13 1,62 0,641 1,103 T 6 4 Sub 218 0,04 0,09 0,452 0,269 T7 4 S 157 2,61 1, 62 1,522 0,225 T8 4 S 172 3, 98 1,50 1,804 0,353 T9 5 S 1147 0,07 0,10 0,519 0,206 T10 5 B 47 0, 11 0,12 0,272 0,276 Til 6 Sub 28 0, 10 0,18 2,617 0,731 T12 6 Sub 136 0, 07 0,11 0,314 0,216 T13 7 S 209 0,88 0,47 0,683 0,217 T14 8 Sub 43 0, 06 0,07 0,196 0,213 T15 8 B 160 0,82 0,08 0,206 0,219 TI 6 8 B 64 0, 02 0,40 0,231 0,228 T17 8 Sub 145 0,31 0,57 0,985 0,314 TI 8 9 Sub 300 6,37 1,30 0,548 0,315 TI 9 12 Sub 196 0, 05 0,17 0,463 0,268 T20 12 Sub 75 0, 05 0,07 0,237 0,222 NI 5 90 0,38 0,06 0,237 0,218 N2 5 170 0, 06 0,07 0,204 0,200 N3 5 66 0,23 0,09 0,238 0,235 60 N4 3 44 0, 07 0,12 0,176 0,209 N5 9 41 0,05 0,05 0,209 0,193 N6 5 66 0,07 0,06 0,194 0,196 N7 8 13 O o 0,06 0,193 0,201 N8 9 13 0,14 0,06 0,208 0,231 N9 6 19 0,28 0,07 0,184 0,215 NI 0 5 20 0,13 0,05 0,189 0,240

Notas do quadro 7 a Amostras de soro de crianças infectadas (TI a T20) ou sem infecção (NI a N10) por T. gondii foram analisadas com IgM Rec-ELISAs com antigénios GST-EC2 e GST-EC3 ou com testes comerciais (ELFA-IgM e ETI-TOXO-M). b Gravidade da forma de apresentação clinica: S. grave ; B. benigna; Sub. Subclinica. c valores limite para testes ELFA-IgM e ETI-TOXO-M foram 0,65 e 0,41 tal como indicado pelos fabricantes respectivamente. Negrito, valores > limite. d valores limite para IgM Rec-ELISA utilizando antigénios GST-EC2 e GST-EC3 foram 0,25 e 0,26, respectivamente. Negrito, valores > limite. LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Kenton s.r.l. <120> Antigénios recombinantes quiméricos de Toxoplasma gondii

<130> 501-EP 61 <160> 42

<170> Patenteln versão 3,1 <210> 1 <211>297 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (297) <4 0 0> 1 gct gcc ttg gga ggc ctt gcg gcg gat cag cct gaa aat cat cag gct 48 Ala Ala Leu Gly Gly Leu Ala Ala Asp Gin Pro Glu Asn Hi s Gin Ala 1 5 10 15 ctt gca gaa cca gtt acg ggt gtg ggg gaa gca gga gtg tcc ccc gtc 96 Leu Ala Glu Pro vai Thr Gly val Gly Glu Ala Gly val Ser Pro val 20 25 30 aac gaa gct ggt gag tca tac agt tct gca act tcg ggt gtc caa gaa 144 Asn Glu Ala Gly Glu ser Tyr Ser Ser Ala Thr ser Gly val Gin Glu 35 40 45 gçt acc gçe cca ggt gca gtg ctc ctg gac gca ate gat gcc gag tcg 192 Ala Thr Al a Pro Gly Ala Val Leu Leu Asp Ala ile Asp Ala Glu Ser 50 55 60 gat aag 9*9 gac aat cag gcg gag gga ggt gag cgt atg aag aag gtc 240 Asp Lys Vai Asp Asn Gin Ala Glu Gly Gly Glu Arg Met uys Lys val 65 70 75 80 gaa gag gag ttg tcg tta ttg agg cgg gaa tta tat gat cgc aca gat 288 Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Arg Arg Glu Leu Tyr Asp Arg Thr A5P 85 90 95 cgc cct got 297

Arg Pro Gly <210>2 <211> 99 62

<212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400>

Ala Ala Leu Gly Gly Leu Ala Ala Asp Gin Pro Glu Asn His Gin Ala 1 5 10 15 Leu Ala Glu ΡΓ0 val Thr Gly Val Gly Glu Ala Gly val Ser Pro Val 20 25 30 Asn Glu Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Ser Ala Thr Ser Gly val Gin Glu 35 40 45 Ala Thr Ala Pro Gly Ala val Leu Leu Asp Ala 11 e Asp Ala Glu Ser 50 55 60 Asp Lys val Asp Asn Gin Ala Glu Gly Gly Glu Arg Met Lys Lys Val 65 70 75 80 Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Arg Arg Glu Leu Tyr ASP Arg Thr ASP 85 90 95

Arg Pro Gly

<210>3 <211> 231 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (231) <400> 3 48 63 gct acc gcg gcc acc gcg tca gat gac gaa ctg atg agt cga ate cga Ala Thr Ala Ala Thr Ala ser Asp Asp Glu Leu Met Ser Arg lie Arg 48 63 1 5 10 15 aat tet gac ttt ttc gat ggt caa gça ccc gtt gac agt ctc aga ccg Asn Ser Asp Phe Phe Asp Gly Gin Ala Pro Val Asp Ser Leu Arg Pro 20 25 30 a cg aac gçc ggt gtç gac teg aaa ggg acc gac gat cac ctc acc acc Thr Asn Ala Gly Vai ASp Ser Lys GTy Thr Asp Asp His Leu Thr Thr 35 40 45 age atg gat aag gea tet gta gag agt cag ctt ccg aga aga gag cca Ser Met Asp Lys Ala ser val Glu ser Gin Leu Pro Arg Arg Glu Pro 50 55 60 ttg gag acg gag cca gat gaa caa gaa gaa gtt cat ttc Leu Glu Thr Glu Pro Asp Glu Gin Glu Glu Val His phe 65 70 75 96 144 192 231

<210>4 <211> 77 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400>4

Ala Thr Ala Ala Thr Ala ser Asp Asp Glu Leu Met ser Arg lie Ara 1 5 10 15

Asn Ser Asp Phe Phe Asp Gly Gin Ala Pro Vai Asp Ser Leu Arg pro 20 25 30

Thr Asn Ala Gly vai Asp ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr 35 40 45

Ser Met Asp Lys Ala ser vai Glu Ser Gin Leu Pro Arg Arg Glu pro 50 55 60

Leu Glu Thr Glu Pro Asp 65 70

Glu Gin Glu Glu Vai His Phe 75 64

<210>5 <211> 219 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <22 0>

<221> CDS <222> (1)..(219) <400>5 agg agg act gga tgt cat gee ttc agg gag aac tgc age cct ggt aga 48 Arg Arg Thr Gly cys His Ala Phe Arg Glu Asn cys Ser Pro Gly Arg 1 5 10 15 tgt att gat gac gee teg cat gag aat ggc tac acc tgc gag tgc ccc 96 Cys ile Asp Asp Ala ser His Glu Asn Gly Tyr Thr cys Glu cys Pro 20 25 30 aca ggg tac tea cgt gag gtg act tcc aag gcg gag gag teg tgt gtg 144 Thr Gly Tyr ser Arg Glu vai Thr ser Lys Ala Glu Glu Ser cys vai 35 40 45 gaa gga gtc gaa gtc acg ctg gçt gaa aaa tgc gag aag gaa ttc ggc 192 Glu Gly Vai Glu vai Thr Leu Ala Glu Lys cys Glu Lys Glu Phe Gly 50 55 60 ate age gcg tea tec tgc aaa tgc gat 219 ile ser Ala Ser ser Cys Lys cys Asp 65 70

<210>6 <211> 73 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii < 4 Ο Ο > 6 65

Arg Arg Thr Gly cys Hi s Ala Phe Arg Glu Asn Cys ser Pro Gly Arg 1 5 10 15 cys ile Asp Asp Ala ser Hi s Gl u Asn Gly Tyr Thr cys Glu Cys pro 20 25 30 Thr Gly Tyr ser Arg Glu vai Thr Ser Lys Ala Glu Glu Ser cys vai 35 40 45 Glu Gly Vai Glu vai Thr Leu Ala GlU Lys cys GlU Lys Glu Phe Gly 50 55 60 lie Ser Al a ser Ser Cys Lys cys Asp 65 70

<210>7 <211>393 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <22 0> <221> CDS <222> (1) . . (393) 7 66 <4 Ο 0> cca pro 1 tcg Ser gtc vai gtc vai aat Asn 5 aat Asn gtc val gea agg tgc Ala Arg Cys 10 tcc Ser tac Tyr ggt Gly gea Ala gac Asp 15 age Ser 48 act T-hr- ctt -Leu- ggt -Gl-y- cet -Pfe- 20 -va-1- aag -tys- ttg -beu- tet -ser- gcg -Ala 25 gaa -Glu gga -Gly ccc Pro act Thr aca Thr 30 atg Met acc Thr 96 etc gtg Leu VaT tgc cys 35 ggg Gly aaa Lys gat Asp gga Gly gtc Val 40 aaa Lys gtí val cct Pro caa Gin gac Asp 45 aac Asn aat Asn cag Gin 144 tac tgt ryr cys 50 tcc ser g?g Gly acg Thr acg Thr ctg Leu 55 act Thr ggt Gly tgc cys aac Asn gag Glu 60 aaa Lys tcg Ser ttc phe aaa Lys 192 gat Asp 65 att ile ttg Leu "cca pro aaa Lys tta Leu 70 act Thr aaa Glu aac Asn ccg pro tgg Trp 75 cag Gin ggt Gly aac Asn gct Ãla tcg ser 80 240 agt Ser gat Asp aag Lys ggt Gly gee Ala 85 acg Thr cta Leu acg Thr ate ile aag Lys 90 aag Lys gaa Glu gea Ala ttt Phe cca pro 95 gee Ala 288 gag Glu tea Ser aaa Lys age ser 100 gtc vai att Xle att He gga Gly tgc aca Cys Thr 105 ggg Gly gga Gly tcg Ser cct Pro 110 gag Glu aag Lys 336 cat HÍ 5 cac HÍS tgt cys 115 acc Thr gtg vai aaa Lys ctg Leu gag Glu 120 ttt Phe gee Ala ggg Gly gct Ala gea Ala 125 ggg Gly tea Ser gea Ala 384 aaa tcg gct 393

Lys ser Ala 130

<210>8 <211>131 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400>8 67 pro Ser vai Vai Asn Asn Vai Ala Arg cys Ser Tyr Gly Ala Asp Ser 15 10 15

Thr Leu Gly Pro vai Lys Leu Ser Ala Glu Gly Pro Thr Thr Met Thr 20 25 30

Leu Vai cys Gly Lys Asp Gly Val Lys val Pro Gin AfP Asn Asn Gin 35 40 45 Tyr cys ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly cys Asn Glu Lys Ser Phe Lys 50 55 60 Asp Ile Leu Pro Lys Leu Thr Glu Asn pro Trp Gin Gly Asn Ala ser 65 70 75 80 Ser Asp Lys Gly Ala Thr Leu Thr Ile Lys Lys Glu Ala Phe Pro Ala 85 90 95 Glu Ser Lys Ser 100 Vai Ile ile Gly cys 105 Thr Gly Gly ser Pro 110 Glu Lys His His Cys Thr Vai Lys Leu Glu Phe Ala Gly Ala Ala Gly ser Ala 115 120 125

Lys ser Ala 130

<210>9 <211> 237 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <22 0> <221> CDS <222> (1)..(237) <400> 9 68 ccc cag gat gcc att tgc tcg gat tgg tcc gea tgg age ccc tgc agt 48 ΡΓΟ Gin Asp Ala Ile cys ser Asp Trp ser Ala Trp Ser Pro cys Ser 1 5 10 15 gta tcc tgc ggt gac gga age caa ate agg acg cga act gag gtí tet 96 Val Ser cys Gly Asp Gly ser Gin Ile Arg Thr Arg Thr Glu val Ser 20 25 30 gct ccg caa cct gga aca cca aca tgt ccg gac tgc cct gcg ccc atg 144 Ala Pro Gin Pro Gly Thr Pro Thr cys Pro Asp Cys pro Ala Pro Met 35 40 45 99a agg act tgc gtg gaa caa ggc 99a ctt gaa gaa ate cgt gaa tgc 192 Gly Arg Thr Cys Val Glu Gin Gly Gly Leu Glu Glu ile Arg Glu cys 50 55 60 agt gcg ggg gta tgt gct gtt gac gçt gga tgt ggc gtc tgg gtt 237 Ser Ala Gly Val Cys Ala val ASP Ala Gly Cys Gly Val Trp val 65 70 75 <210> 10 <211> 79 <212> PRT <2l3> Toxoplasma gondii <400> 10 pro -Gln Asp-AlV-i7l-e-Gys-ser--Asp-T-rp*ser-A:l'a-TTp ser Pro-eys ser 15 10 15 val Ser cys Gly Asp Gly ser Gin ile Arg Thr Arg Thr Glu vai ser 20 25 30

Ala Pro Gin Pro Gly Thr Pro Thr Cys Pro Asp Cys Pro Ala Pro Met 35 40 45

Gly Arg Thr Cys Val Glu Gin Gly Gly Leu Glu Glu Ile Arg Glu cys 50 55 60 cer Ala Gly val cys Ala val Asp Ala Gly cys Gly Val Trp val 65 70 75 69 <210> 11 <211> 678 <212> ADN <213> Toxoplasma gondii <22 0> <221> CDS <222> (D · · (678) <400> 11 aac gaa ccg gtg gcc cta gct cag ctc age aca ttc ctc ggg ctc gtc Asn Glu pro Val Ala Leu Ala Gin Leu Ser Thr Phe Leu Glu Leu val 1 5 10 15 gag gtg cca tgt aac tct gtt cat gtt cag 999 gtg atg acc ccg aat Glu Vai ΡΓΟ cys Asn Ser val Hl 5 Val Gin Gly val Met Thr Pro Asn 20 25 30 caa atg gtc aaa gtg act ggt gca gga tgg gat aat 99c gtt ctc ggg Gl n Met vai Lys val Thr Gly Ala Gly Trp Asp Asn Gly val Leu Glu 35 40 45 144 70 ttc tat gtc acg agg cca acg aag aca Phe Tyr 50 vai Thr Arg pro Thr 55 Lys Thr cat ctt gcg tcg ate atg tgt tat tcc HÍS Leu Ala Ser Ile Met Cys Tyr ser 65 70 tca gac aaa gcg gga aag tgc ttt ctg ser Asp Lys Ala Gly 85 Lys Cys Phe Leu tcg tcg gaa ata gac gaa aaa gaa gta Ser Ser Glu lie Asp Glu Lys Glu val 100 105 aac gat gcg ttc atg ttc gtt tgt tct Asn Asp Ala Phe Met Phe Vai Cys Ser 115 120 cag tgt gat gtt ttc gee ctt gat aac Gin Cys Asp Vai Phe Ala Leu Asp Asn 130 135 -aaa- gtg aat acc gtg gat ctt ggc gtc Lys VaT Asn Thr val Asp Leu Gly val 145 150 ttc gga ctc act gça gat ggg gtc aag Phe Gly Leu Thr Ala Asp Gly vai Lys 165 age ggc ctg aca gcg ate aac gac gac Ser Gly Leu Thr Ala ile Asn Asp ASp 180 185 cct ccc cat tct ceg ceg gee gga gag Pro pro His ser pro Pro Ala Gly Glu 195 200 gaa aac age ggg tct gea aca cca gcg Glu Asn Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ala 210 215 ggc Gly ggg Gly gac ASP aca Thr age Ser cga Arg age ser 192 60 aag gac att gac ggc gtg ccg 240 Lys Asp ile Asp Gly val Pro 75 80 aag aac ttt tct ggt gaa gac 288 Lys Asn Phe Ser Gly Glu Asp 90 95 tct cta ccc ate aag age cac 336 ser Leu Pro ile Lys ser HÍS 110 tca aat gat gga tcc gea ctc 384 Ser Asn Asp Gly Ser Ala Leu 125 acc aac tct age gac ggg tgg 432 Thr Asn ser 140 ser ASp Gly Trp age gtt agt ceg gat ttg gça 480 Ser val Ser Pro Asp Leu Ala 155 160 gtg aag aag ttg tac gça age 528 val Lys Lys Leu Tyr Ala Ser 170 175 cct tcc ttg ggg tgc aag gct 576 Pro Ser Leu Gly Cys Lys Ala 190 gaa ceg agt ttg ceg tcg cct 624 Glu Pro ser Leu Pro Ser Pro 205 gaa gaa agt ceg tct gag tct 672 Glu Glu Ser Pro Ser Glu ser 220 678 gaa tct Glu Ser 225

<210> 12 <211>226 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <4 0 0> 12 71

Asn Glu Pro Vai Ala Leu Ala Gin Leu Ser Thr Phe Leu Glu Leu vai 15 10 15

Glu vai Pro Cys Asn Ser vai His Vai Gin Gly vai Met Thr pro Asn 20 25 30

Gin Met vai Lys vai Thr Gly Ala Gly Trp Asp Asn Gly Vai Leu Glu 35 40 45

Phe Tyr vai Thr Arg pro Thr Lys Thr Gly Gly Asp Thr ser Arg ser 50 55 60

His Leu Ala Ser lie Met cys Tyr Ser Lys Asp lie Asp Gly vai pro 65 70 75 80 —ser—Asp-Lys-ATa~GTy_Lys~cys"Phe"Leu LVs Asn Phe' ser Gly Glu Asp 85 90 95

Ser Ser Glu lie Asp Glu Lys Glu vai Ser Leu Pro lie Lys Ser His 100 105 110

Asn Asp Ala Phe Met Phe vai Cys Ser Ser Asn Asp Gly Ser Ala Leu 115 120 125

Gin Cys Asp vai Phe Ala Leu Asp Asn Thr Asn ser Ser Asp Gly Trp . 130 135 140

Lys vai Asn Thr vai Asp Leu Gly vai ser vai Ser Pro Asp Leu Ala 145 150 155 160

Phe Gly Leu Thr Ala Asp Gly vai Lys vai Lys Lys Leu Tyr Ala Ser 165 170 175 ser Gly Leu Thr Ala ile Asn Asp Asp Pro ser Leu Gly Cys Lys Ala 180 185 190

Pro Pro His ser Pro Pro Ala Gly Glu Glu Pro Ser Leu Pro Ser Pro 195 200 205

Glu Asn Ser Gly ser Ala Thr pro Ala Glu Glu Ser Pro Ser Glu Ser 210 215 220

Glu ser 225 72 <210> 13 <211> 26 <212> ADN <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador K551 <400> 13 ggactagtcg gctcccccag gatgcc 26 <210> 14 <211> 44 <212> ADN <213> <220> Sequência artificial <223> Iniciador K553 <400> 14 catccagtcc tgctaccgcc accagaccag acgccacatc cagc 44 <210> 15 <211> 44 <212> ADN <213> <22 0> Sequência artificial <223> Iniciador K552 73 <400> 15 gtggcgtctg gtctggtggc ggtagcagga ctggatgtca tgcc 44 <210> 16 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador K555 <400> 16 tgacgaccga gctaccgcca ccagagttat cgcatttgca <210> 17 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <210> 19 <211> 33 <212> ADN <22 3> Iniciador K554 <400> 17 atgcgataac tctggtggcg gtagctcggt cgtcaataat gtcgc 45 74 <210> 18 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artifi ciai <220> <223> Iniciador 556 <400> 18 ccgcggccgc tagccgattt tgctgaccct g 31 <213> Sequência artifi ciai <22 0> <223> Iniciador K563 <400> 19 ggactagtcg gctggctgcc ttgggaggcc ttg <210> 20 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artifi ciai <22 0> <223> Iniciador K565 <4 0 0> 20 gccgcggtag cactaccgcc accagacaaa ccagggcgat ctgtg 45 75 <210> 21 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador K564 <400> 21 gccctggttt gtctggtggc ggtagtgcta ccgcggccac <210> 22 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador K567 <400> 22 ccggttcgtt actaccgcca ccagagaaat gaacttcttc 1 <210> 23 <211> 46 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador K5 6 6 44 46 76 <400> 23 gaagttcatt tctctggtgg cggtagtaac gaaccggtgg ccctag <210> 24 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> Iniciador K568 <400> 24 ccgcggccgc agattcagac tcagacggac 30 <210> 25 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <22 3> Iniciador K572 <400> 25 cgttactacc gccaccagag ttatcgcatt tgcaggatga 40 <210> 26 <211> 39

<212> ADN 77 <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador K571 <400> 26 taactctggt ggcggtagta acgaaccggt ggccctagc 39 act agt cgg ctc ccc cag gat gcc att tgc tcg gat tgg tcc gca tgg Thr Ser Arg Leu pro Gin Asp Ala Ile cys Ser Asp Trp Ser Ala Trp <210> 27 <211> 894 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> EC2 <22 0> <221> CDS <222> (D · · (894) <223> <4 0 0> 27 48 96 78 96 78 χ 5 10 15 age ccc tgc agt gta tcc tgc ggt gac gga age caa ate agg acg cga Ser pro cys ser 20 vai Ser cys Gly Asp 25 Gly Ser Gin Ile Arg 30 Thr Arg act gag gtt tet gçt ccg caa cct gga aca cca aca tgt ccg gac tgc Thr Glu vai ser Ala Pro Gin Pro Gly Thr Pro Thr cys Pro Asp cys 35 40 45 cct gcg ccc atg gga agg act tgc gtg gaa caa ggc gga ctt gaa gaa Pro Ala Pro Met Gly Arg Thr Cys val Glu Gin Gly Gly Leu Glu Glu 50 55 60 ate cgt gaa tgc agt gcg ggg gta tgt gct gtt gac gçt gga tgt ggc He Arg Glu Cys Ser Ala Gly vai cys Ala val Asp Ala Gly Cys Gly 65 70 75 80 gtc tgg tet ggt ggc ggt age agg act gga tgt cat gçc ttc agg gag Vai Trp Ser Gly Gly 85 Gly ser Arg Thr Gly 90 cys His Ala Phe Arg 95 Glu aac tgc age cct ggt aga tgt att gat gac gçc teg cat gag aat ggc Asn cys Ser Pro Gly Arg cys Ile Asp Asp Ala ser Hi 5 Glu Asn Gly 100 105 110 tac acc tgc gag tgc ccc aca 9gg tac tea cgt gag gtg act tcc aag Tyr Thr cys Glu Cys Pro Thr Gly Tyr Ser Arg Glu val Thr Ser Lys 115 120 125 gcg gag gag teg tgt gtg gaa gga Qtç gaa gtc acg ctg gçt gag aaa Ala Glu Glu ser Cys Vai Glu Gly val Glu val Thr Leu Ala Glu Lys 130 135 140 tgc gag aag gaa ttc ggc ate age gcg tea tcc tgc aaa tgc gat aac cys Glu Lys Glu phe Gly Ile Ser Ala Ser Ser Cys Lys Cys Asp Asn 145 150 155 160 tet ggt ggc ggt age teg gtc gtc aat aat gtc gea agg tgc tcc tac ser Gly Gly Gly Ser Ser vai vai Asn Asn val Ala Arg cys ser Tyr 165 170 175 ggt gea gac age act ctt ggt cct gtt aag ttg tet gcg gaa gga ccc Gly Ala Asp ser Thr Leu Gly Pro Val Lys Leu ser Ala Glu Gly Pro 180 185 190 act aca atg acc etc gtg tgc ggg aaa gat gga gtç aaa gtt cct caa Thr Thr Met Thr Leu vai cys Gly Lys Asp Gly Val Lys val Pro Gin 195 200 205 gac Asp aac Asn aat Asn cag Gin tac Tyr tgt cys tcc ser ggg Gly a cg Thr acg Thr ctg Leu act Thr ggt Gly tgc cys aac Asn gag Glu 210 215 220 aaa teg ttc aaa gat att ttg cca aaa tta act gag aac ccg tgg cag Lys ser Phe Lys Asp rle Leu Pro Lys Leu thr Glu Asn Pro Trp Gin 225 230 235 240 ggt aac gct teg agt gat aag ggt gee acg cta acg ate aag aag gaa Gly Asn Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ala Thr Leu Thr ile Lys Lys Glu 245 250 255 gea ttt cca gee gag tea aaa age gtc att att gga tgc aca ggg gga Ala Phe Pro Ala Glu Ser Lys Ser val ile Ile Gly Cys Thr Gly Gly 260 265 270 teg cct gag aag cat cac tgt acc gtg aaa ctg gag ttt gee ggg gct 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 79

Ser Pro Glu Lys His His cys Thr Vai Lys Leu Glu Phe Ala Gly Ala 275 280 285 894 gca gqg tca gca aaa tcg gct age gqc ege Ala Gly ser Ala Lys Ser Ala Ser Gly Arg 290 295

<210> 28 <211> 298 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> EC2 <400> 28 80

Thr ser Arg Leu Pro Gin Asp Ala lie Cys Ser Asp Trp Ser Ala Trp 15 10 15

Ser Pro Cys Ser Vai ser cys Gly Asp Gly ser Gin lie Arg Thr Arg 20 25 30

Thr Glu Vai Ser Ala Pro Gin Pro Gly Thr Pro Thr Cys Pro Asp Cys 35 40 45

Pro Ala Pro Met Gly Arg Thr Cys vai Glu Gin Gly Gly Leu Glu Glu 50 55 60 lie Arg Glu cys ser Ala Gly vai Cys Ala vai Asp Ala Gly Cys Gly 65 70 75 80 vai Trp ser Gly Gly Gly ser Arg Thr Gly cys His Ala Phe Arg Glu 85 90 95

Asn cys ser Pro Gly Arg Cys lie Asp Asp Ala Ser His Glu Asn Gly 100 105 HO

Tyr Thr Cys Glu Cys Pro Thr Gly Tyr Ser Arg Glu vai Thr ser Lys 115 120 125

Ala Glu Glu ser cys vai Glu Gly Vai Glu vai Thr Leu Ala Glu Lys 130 135 140

Cys Glu Lys Glu Phe Gly ile Ser Ala ser ser Cys Lys Cys Asp Asn 145 150 155 160

Ser Gly Gly Gly ser ser vai vai Asn Asn vai Ala Arg Cys Ser Tyr 165 170 175 81

Gly Ala ASp ser 180 Thr Leu Gly Pro Thr Thr Met Thr Leu Vai cys Gly 195 200 Asp Asn Asn Gin Tyr cys ser Gly 210 215 Lys ser Phe Lys Asp ile Leu Pro 225 230 Gly Asn Ala Ser Ser 245 ASp Lys Gly Ala Phe pro Ala Glu Ser Lys ser 260 ser ΡΓΟ Gl u Lys Hi S Hi S cys Thr 275 280 Ala Gly Ser Ala Lys ser Ala ser 290 295

Vai Lys Leu Ser Ala Glu Gly pro 185 190 Lys Asp Gly val Lys 205 val pro Gin Thr Thr Leu Thr Gly Cys Asn Glu 220 Lys Leu Thr Gl u Asn Pro Trp Gin 235 — - 240 Al a Thr Leu Thr ile Lys Lys Glu 250 255 val ile ile Gly cys Thr Gly Gly 265 270 val Lys Leu Gl u Phe Ala Gly Ala 285 Gly Arg

<210> 29 <211> 1258 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> EC3 <220> <221> CDS <222> (1) . . (1257) <400> 29 82 act agt cgg ctg gct gcc ttg gga g gc ctt gcg gat cag cct gaa aat 48 Thr Ser Arg Leu Ala Ala Leu Gly Gly Leu Ala Asp Gin Pro Glu Asn 1 5 10 15 cat cag gçt ctt gca gaa cca gtt acg ggt gtg ggg gaa gca gga gtg 96 HÍ S Gin Ala Leu Ala Gl u Pro Val Thr Gly Val Gly Glu Ala Gly Val 20 25 30 tcc ccc gtc aac gaa gct ggt gag tca tac agt tct gca act tcg ggt 144 ser Pro Vai Α5Π Glu Ala Gly GlU Ser Tyr Ser ser Ala Thr Ser Gly 83 35 ' 40 45 gtc caa gaa gct acc gcc cca ggt gca gtg ctc ctg gac gca ate gat 192 Val Gin Glu Ala Thr Ala Pro Gly Ala Val Leu Leu Asp Ala ile ASp 50 55 60 gcc gag tcg gat aag gta gac aat cag gcg gag gga ggt gag cgt atg 240 Ala Glu ser Asp Lys val Asp Asn Gin Ala Glu Gly Gly Glu Arg Met 65 70 75 80 aag aag gtc gaa gag gag ttg tcg tta ttg agg cgg gaa tta tat gat 288 Lys Lys vai Glu Glu Glu Leu Ser Leu Leu Arg Arg Glu Leu Tyr Asp 85 90 95 cgc aca gat cgc cct ggt ttg tct ggt ggc ggt agt ggt acc gcg gçc 336 Arg Thr Asp Arg Pro Gly Leu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Thr Ala Ala 100 105 110 acc gcg tca gat gac gaa ctg atg agt cga ate cga aat tct gac ttt 384 Thr Ala ser 115 Asp Asp Glu Leu Met 120 Ser Arg ile Arg Asn 125 ser ASp phe ttc gat ggt caa gca ccc gtt gac agt ctc aga ccg acg aac gcc ggt 432 Phe ASp Gly Gin Ala pro val Asp ser Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly 130 135 140 gtc gac tcg aaa ggg acc gac gat cac ctc acc acc age atg gat aag 480 Oal Asp Ser Lys Gly Thr Asp Asp HÍS Leu Thr Thr Ser Met ASp Lys 145 150 155 160 gca tct gta gag agt cag ctt ccg aga aga gag cca ttg gag acg gag 528 Ala Ser vai Glu ser Gin Leu Pro Arg Arg Glu Pro Leu Glu Thr Glu 165 170 175 cca gat gaa caa gaa gaa gtt cat ttc tct ggt ggc ggt agt aac gaa 576 Pro Asp Glu Gin Glu Glu val His Phe ser Gly Gly Gly Ser Asn Glu 180 185 190 ccg gtg gcc cta gct cag ctc age aca ttc ctc gag ctc gtc gag gtg 624 Pro vai Ala Leu Ala Gin Leu ser Thr Phe Leu Glu Leu Val Glu vai 195 200 205 cca tgt aac tct gtt cat gtt cag ggg gtg atg acc ccg aat caa atg 672 Pro cys Asn ser val His val Gin Gly val Met Thr pro Asn Gin Met 210 215 220 gíc Vai aaa Lys gtg Val act Thr ggt Gly gca Ala gga Gly tgg Trp gat Asp aat Asn ggc Gly gtt val ctc Leu gag Glu ttc Phe tat Tyr 720 225 230 235 240 gtc acg agg cca acg aag aca ggc ggg gac aca age cga age cat ctt 768 vai Thr Arg Pro Thr Lys Thr Gly Gly Asp Thr Ser Arg Ser His Leu 245 250 255 gcg tcg ate atg tgt tat tcc aag gac att gac ggc gtg ccg tca gac 816 Ala Ser ile Met cys Tyr ser Lys Asp Ile Asp Gly val Pro ser Asp 260 265 270 aaa gcg gga aag tgc ttt ctg aag aac ttt tct ggt gaa gac tcg tcg 864 Lys Ala Gly Lys cys Phe Leu Lys Asn Phe Ser Gly Glu A5p Ser Ser 275 280 285 gaa ata gac gaa aaa gaa gta tct cta ccc ate aag age cac aac gat 912 Glu lie Asp Glu Lys Glu val Ser Leu Pro Ile Lys Ser HiS Asn Asp 290 295 300 gcg ttc atg ttc gtt tgt tct tca aat gat gga tcc gca ctc cag tgt 960 84

Ala Phe Met Phe Vai cys Ser Ser Asn Asp Gly Ser Ala Leu Gin Cys 305 310 315 320 gat gtt ttc gcc ctt gat aac acc aac tct age gac gag tgg aaa gtg 1008

Asp vai Phe Ala Leu Asp Asn Thr Asn ser ser Asp Gly Trp Lys vai 325 330 335 aat acc gtg gat ctt ggc gtc age gtt agt ccg gat ttg gea ttc gga 1056

Asn Thr vai Asp Leu Gly vai ser vai ser Pro Asp Leu Ala phe Gly 340 345 350 ctc act gea gat gqg gtc aag gtg aag aag ttg tac gea age age gac 1104

Leu Thr Ala Asp Gly vai Lys Vai Lys Lys Leu Tyr Ala ser Ser Gly 355 360 365 ctg aca gcg ate aac gac gac cet tcc ttg gqg tgc aag gct cct cec 1152

Leu Thr Ala ile Asn Asp Asp pro Ser Leu Gly Cys Lys Ala Pro Pro 370 375 380 cat tct ccg ccg gcc gga gag gaa ccg agt ttg ccg teg cct gaa aac 1200

His Ser Pro Pro Ala Gly Glu Glu Pro ser Leu pro Ser Pro Glu Asn 385 390 395 400 age gag tct gea aca cca gcg gaa gaa agt ccg tct gag tct gaa tct 1248

Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ala Glu Glu ser Pro Ser Glu Ser Glu Ser 405 _ -·- 410 - ------ 415 gcg gcc gcg g 1258

Ala Ala Ala

<210> 30 <211> 419 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> EC3 <400> 30 85

Thr Ser Arg Leu Ala Ala Leu Gly Gly Leu Ala Asp Gin Pro Glu Asn 15 10 15

His Gin Ala Leu Ala Glu Pro Vai Thr Gly Vai Gly Glu Ala Gly vai 20 25 30

Ser Pro vai Asn Glu Ala Gly Glu Ser Tyr Ser Ser Ala Thr Ser Gly 35 40 45

Val Gin Glu Ala Thr Ala Pro Gly Ala vai Leu Leu Asp Ala lie Asp 50 55 60

Ala Glu ser Asp Lys val Asp Asn Gin Ala Glu Gly Gly Glu Arg Met 65 70 75 80 86

Lys Lys Vai Glu Glu Glu Leu ser Leu Leu Arg Arg Glu Leu Tyr λ r ASp 85 90 95 Arg Thr ASp Arg 100 Pro Gly Leu Ser Gly 105 Gly Gly ser Ala Thr 110 Ala Ala Thr Ala Ser ASP Asp Glu Leu Met Ser Arg lie Arg Asn Ser ASp Phe 115 120 125 Phe ASP Gly. Gin Ala Pro vai ASp Ser Leu Arg Pro Thr Asn Ala Gly - 130. -- — - - 135 140 Vai Asp ser Lys Gly Thr Asp Asp His Leu Thr Thr ser Met Asp Lys 145- 150 155 160 Ala Ser vai Glu Ser Gin Leu Pro Arg Arg Glu pro Leu Glu Thr Glu 165 170 175 Pro Asp Glu Gin Glu Glu Vai Hi 5 Phe Ser Gly Gly Gly Ser Asn Glu 180 185 190 Pro vai Ala Leu Ala Gin Leu Ser Thr Phe Leu Glu Leu vai Glu val 195 200 205 Pro cys Asn ser vai His vai Gin Gly vai Met Thr pro Asn Gin Met 210 215 220 vai Lys vai Thr Gly Ala Gly Trp Asp Asn Gly vai Leu Glu Phe Tyr 225 230 235 240 vai Thr Arg Pro Thr Lys Thr Gly Gly Asp Thr ser Arg Ser His Leu 245 250 255 Ala ser ile Met cys Tyr Ser Lys Asp He Asp Gly vai Pro Ser Asp 260 265 270 Lys Ala Gly Lys cys Phe Leu Lys Asn phe Ser Gly Glu Asp Ser Ser 275 280 285 Glu Xle Asp Glu Lys Glu vai Ser Leu pro He Lys ser His Asn ASp 290 295 300 Ala Phe Met Phe vai cys ser Ser Asn Asp Gly ser Ala Leu Gin Cys 305 310 315 320 Asp vai Phe Ala Leu Asp Asn Thr Asn ser ser ASP Gly Trp Lys vai 325 330 335

Asn Thr Vai Asp Leu Gly vai ser vai Ser Pro Asp Leu Ala Phe Gly 87 340 345 350

Leu Thr Ala Asp Gly vai Lys Vai Lys Lys Leu Tyr Ala ser ser Gly 355 360 365 —Leu_T-hr_A-1a~l1e-Asn-Asp Asp-P-ro—Ser-Leu G-l-y-cys Lys—Ala Pro Pro 370 375 380

His ser Pro Pro Ala Gly Glu Glu Pro Ser Leu Pro ser Pro Glu Asn 385 390 395 400

Ser Gly Ser-Ala Thr Pro Ala~Glu Glu "Ser Pro Ser Glu ser Glu Ser 405 410 415

Ala Ala Ala

<210> 31 <211> 1183 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> EC4 <22 0>

<221> CDS <222> (1) . . (1182) <400> 31 48 88 act agt cgg ctc ccc cag gat gcc

Thr Ser Arg Leu Pro Gin Asp Ala 1 5 age ccc tgc agt gta tcc tgc ggt

Ser Pro cys ser vai Ser cys Gly 20 act gag gtt tet gct ccg caa cct

Thr Glu Vai ser Ala Pro Gin Pro 35 40 ccc gcg ccc atg gga agg act tgc Pro Ala Pro Met Gly Arg Thr Cys 50 55

att tgc teg gat tgg tcc gea tgg ile Cys Ser Asp Trp Ser Ala Trp 10 15 gac gga age caa ate agg acg cga

Asp Gly Ser Gin Ile Arg Thr Arg 25 30 gga aca cca aca tgt ccg gac tgc

Gly Thr Pro Thr cys Pro Asp cys gtg gaa caa gac gga ctt gaa gaa

Vai Glu Gin Gly Gly Leu Glu Glu 60 tgt gct gtt gac gct gaa tgt gac

Cys Ala Vai Asp Ala Gly Cys Gly 75 80 96 144 192 240 89 gtc vai tgg tct Trp ser ggt Gly ggc Gly 85 ggt Gly age Ser agg Arg act Thr gga Gly 90 tgt Cys cat His gee Ala ttc Phe agg Arg 95 gag GlU 288 aac Asn tgc cgc Cys Arg cct Pro 100 ggt Gly aga Arg tgt Cys att ile gat ASp 105 gac Asp gee Ala teg Ser cat His gag Glu 110 aat Asn ggc Gly 336 tac Tyr acc tgc Thr Cys 115 gag Glu tgc cys ccc Pro aca Thr tgg Trp 120 tac Tyr tea Ser cgt Arg gag Glu gtg Val 125 act Thr tcc Ser aag Lys 384 gcg Ala gag gag Glu Glu 130 teg ser tgt Cys gaa Glu 135 gga Giy gtc Val gaa Glu gtc Val acg Thr 140 ctg Leu gct Ala gag Glu aaa Lys 432 tgc cys 145 gag aag Glu Lys gaa Glu ttc Phe ggc Gly 150 ate Ile age ser gcg Ala tcc Ser tcc Ser 155 tgc cys aaa Lys tgc Cys gat Asp aac Asn 160 480 tct ser ggt ggc Gly Gly ggt Gly agt ser 165 aac ASO gaa Glu ccg Pro gtg Val ggc Ala 170 cta Leu gct Ala cag Gin ctc Leu age Ser 175 aca Thr 528 ttc Rhe ctc gag Leu Gl u- ctc -Leu 180 gtc val gag -Glu gtg val cca Pro tgt cys 185 aac Asn tct Ser gtt Val cat His gtt val 190 cag Gin ggg Gly 576 gtg vai atg acc Met Thr 195 ccg Pro aat Asn caa Gin atg Met gtc val 200 aaa Lys gtg val act Thr ggt Gly gea Ala 205 gga Gly tgg Trp gat Asp 624 aat Asn ggc gtt Gly vai 210 ctc Leu gag Glu ttc Phe tat Tyr 215 gtc Val acg Thr agg Arg cca Pro acg Thr 220 aag Lys aca Thr ggc Gly ggg Gly 672 gac Asp 225 aca age Thr Ser cga Arg age ser cac His 230 ctt Leu gcg Ala teg ser ate Ile atg Met 235 tgt cys tat Tyr tcc Ser aag Lys gac ASp 240 720 att He gac ggc Asp Gly gtg val ccg pro 245 tea Ser gac Asp aaa Lys gcg Ala gga Gly 250 aag Lys tgc cys ttt Phe ttg Leu aag & aac Asn 768 ttt Phe tct ggt Ser Gly gaa Glu 260 gac ASP teg Ser teg Ser gaa Glu ata ile 265 gac Asp gaa Glu aaa Lys gaa Glu gta val 270 tct Ser cta Leu 816 ccc ΡΓΟ ate aag Ile Lys 275 age Ser cac H1S aac Asn gat Asp gcg Ala 280 ttc Phe atg Met ttc Phe gt? val tgt cys 285 tct Ser tea Ser aat Asn 864 gat Asp gga tec gea Gly Ser Ala 290 ctc Leu cag Gin tgt cys 295 gat Asp gtt val ttc Phe gee Ala ctt Leu 300 gat Asp aac Asn acc Thr aac Asn 912 tct Ser 305 age gac Ser Asp ggg Gly tgg Trp aaa Lys 310 gtg val aat Asn acc Thr gtg Val gat Asp 315 ctt Leu gac Asp gtc val age Ser gtt val 320 960 agt ser ccg gat Pro Asp ttg Leu gea Ala 325 ttc Phe gga Gly ctc Leu act Thr gea Ala 330 gat Asp ggg Gly gtc val aag Lys gtg val 335 aag Lys 1008 aag Lys ttg tac Leu Tyr gea Ala 340 age ser age Ser ggc Gly ctg Leu aca Thr 345 gcg Ala ate Ile aac Asn gac Asp gac ASp 350 cct Pro tcc ser 1056 90 ttg Leu 999 Gly tgc cys 355 aag Lys gct Ala cct Pro ccc Pro cat HÍS 360 tct Ser ccg Pro ccg gee pro Ala gga Gly 365 gag Glu gaa Glu ccg Pro 1104 agt ser ttg Leu 37.0 ccg pro tcg Ser cct Pro gaa Glu aac Asn 3Z5- age Ser ggg Gly tct ser gea Ala a ca Thr 380 cca Pro gcg Ala gaa Glu gaa Glu 1152 agt Ser 385 ccg Pro tct ser 9ag Glu tct Ser gaa Glu 390 tct Ser gcg Ala gee Ala gcg Al a 9 1183

<210> 32 <211> 394 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> EC4 <400> 32 91

Thr ser Arg Leu Pro Gin Asp Ala He cys ser Asp Trp Ser Ala Trp 15 lu ser Pro cys ser vai ser Cys Gly «P Gly ser Gin 11 e Arg Thr Arg 20

Thr Glu vai ser Ala Pro Gin Pro Gly Thr Pro Thr cys Pro Asp cys

Pro Ala Pro Met Gly Arg Thr cys Vai Glu Gin Gly Gly Leu Glu Glu 50 55 60 ile Arg Glu cys ser Ala Gly vai Cys Ala vai Asp Ala Gly cys Gly 65 70 75 80 vai Trp ser Glv Gly Gly Ser Arg Thr Gly Cys His Ala Phe Arg Glu 85 90 95

Asn cys Ara Pro Gly Arg cys ile Asp Asp Ala Ser His Glu Asn Gly 100 105 110

Tvr Thr cys Glu Cys Pro Thr Trp Tyr Ser Arg Glu Vai Thr ser Lys y 115 120 125

Ala Glu Glu ser cys vai Glu Gly vai Glu vai Thr Leu Ala Glu Lys 130 135 140 cys Glu Lys Glu Phe Gly ile Ser Ala Ser ser cys Lys Cys Asp Asn 92 150 155 160 ser Gly Gly Gly Ser 165 Asn Glu pro Val Ala 170 Leu Ala Gin Leu Ser 175 Thr Phe Leu GlU Leu val Glu Val Pro cys Asn Ser val His val Gin Gly 180 185 190 vai Met Thr Pro Asn Gin Met val Lys val Thr Gly Ala Gly Trp Asp 195 200 205 Asn Gly vai Leu Glu Phe Tyr Val Thr Arg Pro Thr Lys Thr Gly Gly 210 215 220 Asp Thr ser Arg Ser Hi s Leu Ala ser Ile Met cys Tyr ser Lys Asp 225 230 235 240 lie Asp Gly val Pro Ser ASp Lys Ala Gly Lys Cys Phe Leu Lys Asn . _ 245 — 250 255 Phe Ser Gly Glu Asp Ser ser Glu ile Asp Glu Lys Glu val ser Leu 260 265 270 ΡΓΟ Ile Lys Ser His Asn Asp Ala Phe Met Phe val cys Ser Ser Asn 275 280 285 ASp Gly ser Ala Leu Gin cys ASp val phe Ala Leu Asp Asn Thr Asn 290 295 300 ser ser Asp Gly Trp Lys val Asn Thr val ASP Leu ASP Val Ser Val 305 310 315 320 Ser pro ASp Leu Ala 325 Phe Gly Leu Thr Ala 330 ASp Gly val Lys val 335 Lys Lys Leu Tyr Ala ser Ser Gly Leu Thr Ala Ile Asn Asp ASP Pro Ser 340 345 350 Leu Gly cys Lys Ala pro ΡΓΟ His Ser Pro Pro Ala Gly Glu Glu Pro 355 360 365 Ser Leu pro Ser Pro Glu Asn Ser Gly Ser Ala Thr Pro Ala Glu Glu 370 375 380 Ser pro ser Glu Ser Glu ser Ala Ala Ala 385 390 93

<210> 33 <211> 115 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii

Ser Gly Gly Thr Gly Gin Gly Leu Gly lie Gly Glu ser val ASp Leu 1 5 10 15 Glu Met Met Gly 20 Asn Thr Tyr Arg Val 25 Glu Arg pro Thr Gly 30 Asn Pro ASP Leu Leu Lys lie Ala lie Lys Ala Ser ASp Gly Ser Tyr Ser Glu 35 40 45 vai Gly Asn vai Asn Vai Glu Glu val lie ASp Thr Met Lys Ser Met 50 55 60 Gin Arg A5p Gl u Asp ile Phe Leu Arg Ala Leu Asn Lys Gly Glu Thr 65 70 75 80 Vai Glu Glu Ala lie Glu ASp val Ala Gin Ala Glu Gly Leu Asn ser 85 90 95 Glu Gin Thr Leu Gin Leu Glu Asp Ala val Ser Ala val Ala Ser Trp 100 105 110

Gin Asp Glu 115 <210> 34 <211> 53 <212> PRT <400> 33 <213> Toxoplasma gondii <400> 34 94

Tyr Ser ser Pro Arg ile val val Leu Ile Arg Tyr cys Phe Phe ser 1 5 10 15 Thr Tyr Arg Leu Thr Met Phe Ala val Lys His cys Leu Leu Trp Ala 20 25 30 vai Gly Ala Leu vai Asn val ser val Arg Ala Ala Glu Phe ser Gly 35 40 45 Trp Asn Gin Gly pro 50 <210> 35 <211> 35 . <212> PRT <400> 35 <210> 36 <211> 90 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <4 0 0> 36 <210> 37 <211> 149 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <4 0 0> 37 <213> Toxoplasma gondii 95

Glu Asn Pro vai Arg Pro Pro Pro Pro Gly Phe His Pro Ser vai Ile 15 10 15 pro Asn Pro Pro Tyr Pro Leu Gly Thr Pro Ala Gly Met Pro Gin Pro 20 25 30

Glu val Pro 35

Ala Pro Thr Gin ser Glu Met Lys 1 5

Glu Phe Gin Glu Glu Ile Lys Glu 10 15

Gly val Glu Glu Thr Lys His Glu 20

Asp Asp Pro Glu Met Thr Arg Leu 25 30

Met Val Thr Glu Lys Gin Glu Ser 35 40

Lys Asn Phe Ser Lys Met Ala Lys 45

Ser Gin ser Phe ser Thr Arg ile 50 55

Glu Glu Leu Gly Gly Ser Ile Ser 60

Phe Leu Thr Glu Thr Gly val Thr 65 70

Met ile Glu Leu Pro Lys Thr val 75 80

Leu His 90

Ser Glu His Asp Met Asp Gin Leu 85 96

Vai Met Ala Ser Asp Pro Pro 1 5

Asp Lys Lys. ser Thr Ala Ala 20

Phe Thr Leu Lys Cys Pro Lys 35

Ala Tyr ser Pro Asn Arg Gin 50 55

Cys Thr ser Lys Ala Vai Thr 65 70

Asp Ser Trp Trp Thr Gly Asp 85

Lys Leu Thr vai Pro ile Glu 100

Trp Gly cys Ile Lys Gly Asp 115

Thr Val Gin Ala Arg Ala Ser 130 135

Tyr Gly Ala Asp Ser 145 <210> 38 <211> 98 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 38

Leu Val Ala Asn Gin Trp Thr Cys pro 10 15 val Ile Leu Thr pro Thr Glu Asn His 25 30 Thr Ala Leu Thr Glu Pro Pro Thr Leu 40 45 ile cys Pro Ala Gly Thr Thr Ser ser 60 Leu ser ser Leu Ile Pro Glu Ala Glu 75 80 Ser Ala Ser Leu Asp Thr Ala Gly Ile 90 95 Lys Phe Pro val Thr Thr Gin Thr Phe 105 110 Asp Ala Gin Ser cys Met val Thr val 120 125 ser Trp Asn Asn val Ala Arg cys ser 140 97

Gly Leu ser Gin Arg Vai pro Glu Leu Pro Glu Vai Glu Pro Phe Asp 15 10 15

Glu vai Gly Thr Gly Ala Arg Arg ser Gly ser lie Ala Thr Leu Leu 20 25 30

Pro Gin Asp Ala vai Leu Tyr Glu Asn ser Glu Asp vai Ala vai Pro 35 40 45

Ser Asp ser Ala Ser Thr pro ser Tyr phe His vai Glu Ser Pro ser 50 55 60

Ala Ser Vai Glu Ala Ala Thr Gly Ala Vai Gly Glu Vai Vai Pro Asp 65 70 75 80

Cys Glu Glu Gin Gin Glu Gin Gly Asp Thr Thr Leu ser Asp His Asp 85 90 95

Phe His

<210> 39 <211> 135 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 39 98

Leu Asn Pro Ile Asp Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Leu Thr Ala Asn 1 5 10 15 Glu Met Met Glu ASp He Thr Trp Arg pro Arg val Asp val Glu phe 20 25 30 ASp ser Lys Lys Lys Glu Met ile ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu 35 40 45 Gl n Lys Asp ASp Vai Thr Ile Glu val Asp Asn Gly Ala Ile val Ile 50 55 60 Lys Gly Gl u Lys Thr Ser Lys Glu Ala Glu Lys val Asp ASP Gly Lys 65 70 75 80 Thr Lys Asn Ile Leu Thr Glu Arg Val Ser Gly Tyr Phe Ala Arg Arg 85 90 95 Phe Gin Leu Pro ser Asn Tyr Lys Pro ASP Gly Ile Ser Ala Ala Met 100 105 110 Asp Asn Gly Vai Leu Arg vai Thr Ile Lys Val Glu ASp Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Lys Gl n Gin Ile Ser val 130 135

<210> 40 <211> 144 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 40 99

Pro 1 Cys Pro Ile Asn 5 Ala Thr cys Gly Gin 10 Phe Glu GlU Trp ser 15 Thr cys Ser Val Ser 20 Cys Gly Gly Gly Leu 25 Lys Thr Arg Ser Arg 30 Asn pro Trp Asn Glu 35 Asp Gin Gin His Gly 40 Gly Leu ser cys Glu 45 Gin Gin His Pro Gly Gly Arg Thr Glu Thr vai Thr Cys Asn Pro Gin Ala Cys pro 50 55 60 Vai 65 Asp Glu Arg pro Gly 70 Glu Trp Ala Glu Trp 75 Gly Glu cys ser val 80 Thr Cys Gly Asp Gly 85 Vai Arg Glu Arg Arg 90 Arg Gly Lys Ser Leu 95 val Gl u Ala Lys Phe 100 Gly Gly Arg Thr Ile 105 ASP Gin Gin Asn Glu 110 Ala Leu Pro Glu Asp 115 Leu Lys lie Lys Asn 120 val Glu Tyr Glu Pro 125 Cys Ser Tyr pro Ala 130 Cys Gly Ala Ser cys 135 Thr Tyr val Trp ser 140 ASp Trp Asn Lys

<210> 41 <211> 194 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 41

Leu Ara Gly Tyr Arg Phe Gly vai Trp Lys Lys Gly Arg cys Leu Asp 15 10 15

Tyr Thr Glu Leu Thr Asp Thr vai ile Glu Arg vai Glu ser Lys Ala 100 20 25 30 Gin Cys Trp Vai Lys Thr Phe Glu Asn Asp Gly Vai Ala Ser Asp Gin 35 40 45 -Pro Hi s Thr -Tyr- _Pro Leu Thr ser Gin Ala- -Ser Trp Asn Asp Trp Trp 50 55 60 Pro Leu Hi s Gln ser Asp Gin Pro HlS ser Gly Gly Vai Gly Arg Asn 65 70 75 80 -Tyr Gly Phe Tyr Tyr vai Asp Thr Thr Gly Glu Gly Lys cys Ala Leu 85 90 95 ser ASp Gl n vai Pro Asp cys Leu Vai ser ASp Ser Ala Ala Vai ser 100 105 110 Tyr Thr Ala Ala Gly ser Leu Ser Glu Glu Thr Pro Asn Phe lie lie - -- 115 - — 120 125 Pro Ser Asn Pro Ser vai Thr Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ala Leu Gin 130 135 140 cys Thr Ala Asp Lys Phe Pro Asp Ser phe Gly Ala cys Asp Vai Gin 145 150 155 160 Ala Cys Lys Arg Gin Lys Thr ser cys vai Gly Gly Gin Ile Gin Ser 165 170 175 Thr ser vai Asp Cys Thr Ala Asp Glu Gin Asn Glu Cys Gly Ser Asn 180 185 190

Thr Ala

<210> 42 <211> 169 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 42 101

Ser Ala Asri Vai Thr Ser ser Glu Pro Ala Lys Leu Asp Leu Ser Cys 15 10 15

Ala Hi5 ser Asp Asn Lys Gly Ser Arg Ala Pro Thr lie Gly Glu Pro 20 25 30

Vai Pro Asp vai ser Leu Glu Gin cys Ala Ala Gin Cys Lys Ala vai 35 40 45

Asp Gly Cys Thr His Phe Thr Tyr Asn Asp Asp Ser Lys Met Cys His 50 55 60 val Lys Glu Gly Lys Pro Asp Leu Tyr Asp Leu Thr Gly Gly Lys Thr 65 70 75 80

Ala Pro Arg Ser cys Asp Arg ser Cys Phe Glu Gin His val ser Tyr 85 90 95

Glu Glv Ala Pro Asp Val Met Thr Ala Met val Thr Ser Gin Ser Ala 100 105 110

Asp cys Gin Ala Ala cys Ala Ala Asp Pro ser cys Glu lie Phe Thr 115 120 125

Tyr Asn Glu His Asp Gin Lys Cys Thr Phe Lys Gly Arg Gly Phe Ser 130 135 140

Ala Phe Lys Glu Arg Gly val Leu Gly Val Thr Ser Gly Pro Lys Gin 145 150 155 160

Phe Cys Asp Glu Gly Gly Lys Leu Thr 102

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição:

FR 2226468 SU 533376 JP54044016 B

EP 0082745 A EP 0301961 A WO 895658 A WO 8908700 A US 4877726 A WO 8912683 A EP 0391319 A IT 1196817 EP 0431541 A WO 9201067 A WO 9202624 A WO 9211366 A

US 5215917 A 103

WO FR 9225689 2702491 A WO 9602654 A EP 0710724 A EP 0724016 A EP 0751147 A US 5633139 A WO 9727300 A US 5665542 A US 5686575 A WO 9932633 A JP11225783 B WO 9961906 A WO 9966043 A JP 2000300278 B WO 00164243 A WO 03080839 A WO 9417813 A US 5962654 A WO 8905658 A WO 9325689 A US 5976553 A WO 9808700 A

WO 9812683 A 104

WO 9957295 A CN 1194991 C WO 9820734 A US 6265176 B WO 0163283 A

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Lisboa 145/06/2010

Claims (27)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Antigénio recombinante quimérico contendo a fusão de pelo menos três regiões antigénicas diferentes de Toxoplasma gondii, em que as três regiões antigénicas diferente possuem uma sequência de aminoácidos seleccionada a partir do grupo constituído por: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12.

2. Antigénio quimérico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28.

3. Antigénio quimérico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30.

4. Antigénio quimérico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32 .

5. Sequência de nucleótidos que codifica o antigénio quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.

6. Sequência de nucleótidos de acordo com a reivindicação 5, compreendendo pelo menos três sequências nucleotídicas diferentes seleccionadas a partir do grupo constituído por: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11. 2

7. Sequência de nucleótidos de acordo com as reivindicações 5 ou 6, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.

8. Sequência de nucleótidos de acordo com as reivindicações 5 ou 6, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29.

9. Sequência de nucleótidos de acordo com as reivindicações 5 ou 6, compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 31.

10. Sequência de nucleótidos que híbrida com qualquer sequência de acordo com as reivindicações 5 a 9 em condições restringentes de hibridação.

11. Antigénio recombinante quimérico codificado pela sequência de nucleótidos da reivindicação 10.

12. Sequência de nucleótidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10 que é uma sequência de ADN.

13. Vector compreendendo a sequência de ADN da reivindicação 12.

14. Célula hospedeira transformada com o vector da reivindicação 13. 3

15. Processo para a produção do antigénio quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11, compreendendo a cultura da célula hospedeira da reivindicação 14 e isolamento do produto desejado.

16. Utilização de antigénios quiméricos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11 como agentes activos para o diagnóstico in vitro de infecções por Toxoplasma gondii.

17. Utilização de acordo com a reivindicação 16 para o diagnóstico de toxoplasmose congénita em bebés.

18. Utilização de acordo com a reivindicação 16 para o diagnóstico do tempo de infecção.

19. Kits para o diagnóstico da infecção por Toxoplasma gondii contendo pelo menos um antigénio quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11.

20. Kits para o diagnóstico da infecção aguda e/ou crónica por Toxoplasma gondii, contendo pelo menos um antigénio quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11.

21. Antigénios quiméricos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11 para utilização como medicamentos. 4

22. Utilização de antigénios quiméricos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11 como ingredientes activos para a preparação de medicamentos destinados à prevenção ou tratamento de infecções por Toxoplasma gondii.

23. Sequência de nucleótidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10 destinada à utilização como medicamento.

24. Utilização da sequência de nucleótidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10 para a preparação de medicamentos úteis para o tratamento ou prevenção de infecções por Toxoplasma gondii.

25. Composição farmacêutica, particularmente sob a forma de uma vacina contendo pelo menos um antigénio quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 11.

26. Composição farmacêutica, particularmente sob a forma de uma vacina contendo pelo menos uma sequência de nucleótidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10.

27. Composição de acordo com a reivindicação 25 ou 26, adequada para uso humano e/ou veterinário. Lisboa, 145/06/2010 1/4 Figura 1 Bam Hl___pGEX-SN__EcoRI GGATCC TT ACT AGT TTT AGT AGC GGC CG C GGG AAT T

Glutathione S-transferase Glutationa S-transferase 2/4 Figura 2 Fragmentos de genes de T. gondii Agentes quiméricos MIC2í MIC3 SAGla GRA3 GRA7 M2AP

íiâJ MlC2a

EC2

EC4 MIC 3 M2AP

3/4 Figura 3 KDa 119- 87- 46-

31- 4/4 Figura 4

soro Reactividade EC2 □ Tx-2.a αΤχ-1.]6nTx-4.18 EC2

Esgotamento Tx-1.16/Tx-ll.b

Esgotamento Tx-2.a/Tx-ll.b Reactividade EC4 □ Tx-2.a oTx-l.l<j OTx-ll.t EC4

Esgotamento Tx-2.a/Tx-1.16