JPH02261382A - トキソプラズマ由来新規ｄｎａ配列およびそれによってコードされる蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は寄生性原虫であるＴｏｘｏｐｌａｓｍａ　　ｇ
ｏｎｄｔｉ　　（以下、トキソプラズマとする）に対す
る特異抗血清と特異的に反応する抗原蛋白質の遺伝子お
よび当該遺伝子によりコー・ドされるトキソプラズマに
特異的な抗原蛋白質に関する。

〈従来技術とその問題点〉 トキソプラズマ症は原虫であるＴｏｘｏｐｌａｓｍａ　
　ｇｏｎｄｉｌによる感染症である。

この原虫は哨乳類および鳥類などの多くの動物種に広く
分布し、各種の組繊細胞に侵入して増殖する性質を有し
ている。特に中枢神ｉ系細胞や細網内皮系細胞に対して
高い親和性を持ち、滲出性網脈絡膜炎、リンパ部長、あ
るいは脳炎等の各種炎症や発熱などの臨床症状を呈すこ
とが知られている。ヒトでは一般に感染の頻度は高いが
実際に発病にいたる例は比較的稀であるとされていた。

しかしながら、免疫不全症や免疫抑制作用を有する薬剤
を投与された患者、例えば癌や、臓器および骨髄８植患
者では当該原虫による発症は多い、また動物実験におい
て経胎盤的な胎児感染の成立が証明され、ヒトにおいて
も母体の免疫力が低下していたり、子宮内あるいは胎盤
内に原虫が寄生していた場合、あるいは妊婦に対して初
めて当該原虫が感染したような場合は、妊娠異常（死産
、流産）や胎内感染による先天性異常児が出生するとい
う事実が報告されている。

このような状況下、現在多くの医療機関において特に妊
婦を対象としてトキソプラズマに対する感染の有無の検
査が実施されている。その検査法の１つである色素試験
法は、特異性および感度の点で非常に優れており、最も
信頼性の高い方法であるが、多くの手技上の制約を伴う
ため、特殊な研究機関以外での実施は非常に困難である
。従フてこれに代わるべき方法が模索された結果、現在
では間接赤血球凝集反応（ＩＨＡ）や、間接ラテックス
凝集反応（Ｉ　ＬＡ）を応用した検査薬が市販され広く
利用されている。

しかしながら現在のＩＨＡやＩＬＡ検査薬ではその反応
用抗原としてトキソプラズマ原虫そのものや原虫からの
粗抽出物が使用されており、その結果として非特異的反
応による疑陽性や疑陰性率が高く、診断精度が悪いとい
う点が指摘されていた。前述のようにトキソプラズマ感
染は異常児出生の可能性を高めるため、その感染検査の
結果は当該妊婦の妊娠を継続させるか否かの重要な指標
であり、診断精度が悪いということは医療上非常に大ぎ
な問題となる。また、その検査薬の製造工程には必然的
にトキソプラズマ原虫の大量培養が必要となり、工程作
業者への感染の危険も懸念されている０以上の理由によ
って、医療現場からはよりトキソプラズマに対する特異
性が高く、診断精度のよい検査薬の開発が、また製造現
場からはより安全な抗原の産生性が望まれている。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的はトキソプラズマ虫体由来の特異的抗原蛋
白質をコードするＤＮＡ配列および当該ＤＮＡ配列によ
りコードされる特異的抗原蛋白質を提供することにある
。

く課題を解決するための手段〉 こめような現状に鑑み、本発明者らはトキソプラズマ感
染患者血清と特異的に反応するトキソプラズマ抗原の探
索を重ね、トキソプラズマＲＨ株より抽出した全ＲＮＡ
のｉｎ　　ｖｉｔｒＯ翻訳産物中に患者血清と特異的に
反応する分子量約２７，０００ダルトンの抗原蛋白質を
確認した（第５７回　日本寄生虫学会大会　１９８８年
）、さらにこの知見に基づぎ鋭意研究を重ねた結果、本
発明者らはヒト体内において強い抗原性を示すトキソプ
ラズマ虫体由来特異的蛋白質の抗原決定基を有する領域
の遺伝子を阜離し、当該遺伝子の塩基配列を決定し、さ
らにそれに基づくアミノ酸配列を決定することにより本
発明を完成させた。

すなわち、本発明はトキソプラズマ虫体由来の特異抗原
蛋白質をコードすることを特徴とする下記式［Ｉ］で表
される新規ＤＮＡ配列を提供する。

式［■］： ＧＣＴ　ＴＡＣＧＣＴ　ＧＣＣＧＡＡ　ＧＧＣＧＧＣＧ
ＡＧ　ＡＡＣＣＡＧＴＣＧ　　ＡＧＣＧＣＣＧＴＣＴＣ
Ａ　　ＧＡＴ　　ＣＧＧ　　ＧＣＧ　　ＴＣＴ　ＣＴＣ
丁ＴＴ　　ＧＧＴ　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ　　ＡＧＴ　　
ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　Ａ（：Ａ　　ＧＧＧ　　ＣＡＧＧ
ＧＡ　ＴＴＡ　ＧＧ＾＾ＴＣＧＧＡ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　
ＧＴＡ　ＧＡＴ　ＴＴＧＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＧＧ
Ｇ＾＾ＣＡＣＧ　ＴＡＴ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ＾Ｇ
Ａ　ＣＣＣＡＣＡ　ＧＧＣＡＡＣＣＣＧ　ＧＡＣＴＴＧ
　ＣＴＣ＾＾Ｇ＾ＴＣＧＣＣＡＴＴ＾＾＾ＧＣＴ　ＴＣ
Ａ　ＧＡＴ　ＧＧＡ　Ｔｆｌ：Ｇ　ＴＡＧ＾ＧＣＧＡＡ
　ＧＴＣＧＧＣ＾＾Ｔ　　ＧＴＴ　　ＡＡＣＧＴ１７　
　（ｉＡ（ｉ　　ＧＡＧＧＴＧ　　ＡＴＴ　　ＧＡＴ　
ＡＧＴ　　ＡＴＧ　　ＡＡＡ　　ＡＧＣＡＴＧ　　ＣＡ
Ｇ　　ＡＧＧＧＡＣＧＡＧ　ＧＡＣＡＴＴ　ＴＴＣＣＴ
Ｔ　ＣＧＴ　ＧＣＧ　ＴＴＧ＾＾Ｃ＾ＡＡ　ＧＧＣＧＡ
＾＾ＣＡ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＧＡＡＧＣＧ　ＡＴＣＧＡ
ＡＧＡＣＣＴＧ　　ＧＣＴ　　ＣＡＡ　　ＧＣＡ　　Ｇ
ＡＡ　ＧＧＧ　　０７丁　＾＾Ｔ　　ＴＣＧＧＡＧ　　
ＣＡＡ　ＡＣＧ　　ＣＴＧ　　ＣＡＡ　ＣＴＧ　　ＧＡ
Ａ　ＧＡＴ　　ＧＣＡ　　ＧＴＧ＾ＧＣＧＣＧ　　ＧＴ
Ｇ　　ＧＣＧ　　ＴＣＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＴ　　ＣＡ
Ａ　　ＧＡＣＧＡＧＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＴＧ　　Ａ
ＴＣＧＡＩＩ：　　ＧＡＴ　　ＧＴＧ　　ＣＡＧ　　Ｃ
ＡＧ　　ＣＴ丁Ｇ＾＾　ＡＡＧ　　ＧＡＣＡＡＡ　ＣＡ
Ａ　ＣＡＧ　　ＣＴＴ　　ＡＡＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＣ
＾Ｔ丁　ＧＧＧ　　ＴＴＣＧＴＡ　ＡＣＡ　　ＧＧＡ　
　ＧＡＧ　　ＡＧＡ　　ＧＡＧ　　Ｔ＾＾ＴＴＧＧＡＧ
ＧＴＡＧＣＴＴτＧＴＴＧ丁ＧＡＴＣＧ丁＾ＣＣＣＣＡ
ＴＧＴＴＡＣＴＴＣＡ（：ＣＴＧ（：ＴＧＴＣＧＣＡＴ
ＡＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＧ＾＾＾ＴＴＧＣＴＣＧＧ＾Ｔ
ＡＴＣＴＴＩＩ：ＡＴＴＴＧＧ丁ＴＧＣＴＣＧＴＡＴＡ
ＴＣＴＴＣ＾丁ＴＴＧＧＴＴ丁Ｃ＾＾ＴＣＧＡＣＧＧＣ
ＧＴＧＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡ丁Ｇ
ＧＴＴＧＧＴＡＣＣ（：ＧＧＴＧＡＣＧ＾＾ＴＣＧＣＡ
ＧＧＴＴ＾＾丁丁＾ＧＴＧＧ＾＾ＧＡＣＧＣＧＴＧＡ＾
＾＾ＡＡＡ＾＾＾＾＾＾＾＾ＣＣＧＡＡ丁ＴＣまた、式
［Ｉ］で表される配列は、遺伝暗号の縮重に基づき、少
なくとも１つの塩基が他の塩基で置換されたものも含む
、さらに、本発明は、式［Ｉ］のＤＮＡ配列と相補的な
りＮＡ配列をも提供する。また、本発明は、式［１ｒ］
で表されるアミノ酸配列の一部あるいは全部を有するこ
とを特徴とするトキソプラズマに特異的な抗原蛋白質を
提供する。

式［ＩＩ］： Ａｆａ　　Ｔｙｒ　　Ａｆａ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇ１ｎ５ｅ
ｒ　Ｓｅｒ　Ａｆａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａ
ｒｇ　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　ＬｅｕＰｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　ＧｉｎＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＬａｕＧｌｕ　Ｍｅ
ｔ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ
　Ｖａｌ　Ｇｌｕ＾ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｎ　Ｐｒｏ＾ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＩＩｓ　
Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　
Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＴｙｒＳａｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｇｌ
ｙ　Ａｓｎ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　Ｇｌ
ｕＶａｌ　　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ
　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ＾「ｇ＾ｓｐ　ＧＪｕ　Ａｓ
ｐ　ＩＩｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ
　ＡｓｎＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＩＩｓ　Ｇｌｕ＾ｓｐ　Ｖａｌ
　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　
Ａｓｎ　５ｅｒＧｌｕ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ＶａｔＳｅｒ＾
ＩＢ　Ｖａｌ　Ａｆａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｉ
ｎ　Ａｓｐ　ＧｌｕＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＧｌ
ｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ
　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌ
ｅｕτｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ＾ｒｇ　Ｇｌｕ当該蛋白質
は、遺伝子組換え技術によって産生されることが望まし
いが、ペプチド合成技術によっても生産可能である。

以下、本発明の詳細な説明する。

トキソプラズマ虫体の大量調製は、強毒株の一種である
ＲＨ株をマウス腹腔内に投与し、増殖させることにより
実施できる。腹水とともに回収した虫体は、生理食塩水
でよく洗浄し、遠心分離することにより単離し、液体窒
素を用いて凍結保存する。

虫体からのｍＲＮＡの抽出は、−数的なグアニジンチオ
シアネート法や、熱フェノール法とオリゴｄＴセルロー
スを用いたカラム法やバッチ法を組み合わせることで実
施することができる。

まず、凍結した虫体と液体窒素で氷粒化した４Ｍグアニ
ジンチオシアネート溶液を混合し、凍結状態のまま充分
に粉砕する。粉末を加熱後、加熱したフェノール溶液を
加えてよく混合する。水層を回収し、フェノール−クロ
ロホルム抽出を行い、ブロテイナーゼ処理をする。再び
フェノール−クロロホルム抽出を行い、その後、エタノ
ール沈澱法により全ＲＮＡを得る。

次に、得られた全ＲＮＡにオリゴｄＴセルロースカラム
クロマトグラフィーを実施することにより、ポリ（Ａ）
”　ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を分画する。

ｃ　ＤＮＡの合成は、回収したｍＲＮＡを鋳型として一
般的な遺伝子組換え技術分野の手法によって実施できる
。

例えば、オリゴｄ　Ｔ　＋ｚ−＋ｅをブライマーとして
ｄＮＴＰｓ（ＮはＡ％Ｇ％ＣおよびＴを表す）存在下で
逆転写酵素を作用させ、ＲＮＡ−ＤＮＡの２本鎖を合成
した後、ＲＮａｓｅＨを作用させ、さらにＤＮＡポリメ
ラーゼＩを作用させることによりＤＮＡ−ＤＮＡの２末
娘ｃＤＮＡを合成する。

このｃＤＮＡは、その塩基配列がコードする蛋白質を発
現し得るようなファージベクターに組み込まれることが
望ましい。

例えば、合成されたｃＤＮＡにフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ
）酵素を作用させ、２末娘ｃＤＮＡの末端を平滑化した
後、ゲル濾過を行い、ｃＤＮＡを精製する。これに、Ｅ
ｃｏＲＩアダプター　ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよ
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを作用させ、ＥｃｏＲ
Ｉアダプターを付加する。これを、ファージベクターで
あるλｇ　ｔ　１．１のＥｃｏＲ■アームに導入した後
、ｉｎ　　ｖｔｔｒｏパッケージングを行い、租換えフ
ァージを得る０以上の操作は、市販の試薬キットを用い
ても実施することができる。

目的とする抗原蛋白質をコードするｃＤＮＡを有する組
換え体を検出するには、組換えファージを大腸菌Ｙ１０
９０に感染させ、寒天培地上でプラークを形成させ、ｃ
ＤＮＡライブラリーを作製し、各プラーク産生物をニト
ロセルロースフィルターに吸着させ、そのフィルターを
トキソプラズマ感染患者の血清を用いてスクリーニング
すればよい。

免疫複合体の検出はペルオキシダーゼ標識抗ヒト■ｇＧ
抗体、過酸化水素水（Ｈ２０２）および発色基質である
４−クロロ−１−ナフトール溶液を用いた免疫学的手法
により実施できる。

得られた陽性クローンからトキソプラズマ全ＲＮＡのｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏ翻訳産物中の分子量約２７，０００ダ
ルトンの蛋白質をコードするクローンを選別するために
はエピトープセレクション法［生化学　５９＠　　７号
　４５７頁１９８７年］を実施し、患者血清より当該ク
ローンの特異抗体を得、それを用いて再度トキソプラズ
マ全ＲＮＡのｉｎ　　ｖｉｔｒｏ翻訳産物のスクリーニ
ングを実施すればよい。

すなわち、陽性クローンの産生ずる蛋白質に患者血清を
反応させ、その蛋白質に特異的な抗体を回収する。各々
の陽性クローンから得られた各々の抗体をトキソプラズ
マ全ＲＮＡの１ｎｖｉｔｒｏ翻訳産物と個別に反応させ
、免疫沈降反応を行う、この反応で沈降した蛋白質を電
気泳動法により分析し、分子量約２７，０００ダルトン
の蛋白質の存在の有無を確認する。このようにして、分
子量約２７，０００ダルトンの蛋白質のみを認識する抗
体とのみ結合し得る蛋白質を産生ずるクローンを選別ｔ
６゜選別されたクローンのＤＮＡ配列は、マクサム−ギ
ルバート法［メソッズ　イン　エンザイそロジ−６５巻
　パート１４９７頁　１９８０年］でも解読できるが、
好ましくはｄｄＮＴＰを用いたチェーンターミネーショ
ン法［サイエンス　２１４巻　１２０５頁　１９８１年
］を用いて決定する。

例えば、選別したクローンのインサートｃＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ消化して取り出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下、
プラスミドｐＴｚ１８Ｒ（ＥｃｏＲＩ消化し、脱リン酸
化したもの）へサブクローニングする。その組換えプラ
スミドを大腸菌ＪＭＩＯＩコンピテントセルに感染させ
、Ｘ−ｇａｌ存在下の寒天培地上で白色コロニーを形成
した形質転換体から組換えプラスミドを精製する。

さらにこの後、塩基配列の決定を容易にするためにイン
サートｃＤＮＡを適当な制限酵素で消化して、より短い
断片としてサブクローニングしてもよい。

すなわち、インサートｃＤＮＡを、例えばＨｉｎｄｌｌ
ｌ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩあるいはＡｃ　ｃ　Ｉｆ等で
消化した後、プラスミドｐＴｚ　１８Ｕ、ｐＴＺ１９Ｕ
あルイはｐＵｃ１１９等の対応するサイトへクローニン
グする。塩基配列の決定のためのインサートｃＤＮＡの
長さの調整は、この他、Ｂａ１３１ヌクレアーゼを用い
てデイレージ目ンミエータントを作製する方法であって
もよい。

これらの組換えプラスミドを用い、５ｅｑｕｅｎａｓｅ
”を用いたジデオキシチェーンターミネーション法によ
り、塩基配列を決定する。

決定されたＤＮＡ配列は下賜式［Ｉ］である。

式［■］： ＧＣＴ　　ＴＡＣＧＣＴ　　ＧＣＣＧＡＡ　ＧＧＣＧＧ
ＣＧＡＣ＾＾ＣＣＡＧＴＣＧ　　ＡＧＯＧＣＣＧＴＩＩ
：　　ＴＣＡ　　ＧＡＴ　　ＣＧＧ　　Ｇ［：Ｇ　　Ｔ
ＣＴ　　ＣＴＣＴＴＴ　　ＧＧＴ　　ＴＴＧ　　ＣＴＧ
　　ＡＧＴ　　ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　ＡＣＡ　　ＧＧＧ
　　ＣＡＧＧＧＡ　　ＴＴＡ　　ＧＣＡ　ＡＴＣＧＧＡ
　　ＧＡＡ　ＴＣＴ　　ＧＴＡ　　ＧＡＴ　　ＴＴＧＧ
ＡＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＧ　　ＧＧＧ　　＾＾ＣＡＣＧ
　　ＴＡＴ　　ＣＧＴ　　ＧＴＧ　　ＧＡＧ＾ＧＡ　　
ＣＣＣＡＣＡ　　ＧＧＣ＾＾ＣＣＣＧ　　ＧＡＣ丁子Ｇ
　　ＣＴＣＡＡＧ＾丁ＣＧＣＣＡＴＴ　　＾＾＾　ＧＣ
Ｔ　　ＴＣＡ　　ＧＡＴ　ＧＧＡ　　Ｔｆｌ：Ｇ　　Ｔ
ＡＣ＾ＧＣＧＡＡ　ＧＴＣＧＧＣ＾＾Ｔ　　ＧＴＴ　　
＾＾ＣＧＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＡＧＧＴＧ　　ＡＴＴ　
　ＧＡＴ　　ＡＧＴ　ＡＴＣＡＡＡ　ＡＣＣＡＴＧ　　
ＣＡＧ　　ＡＧＧＧＡＣＧＡＧ　　ＧＡＣＡＴＴ　　Ｔ
ＴＣＣＴＴ　　ＣＧＴ　　ＧＣＧ　　ＴＴＧ　　ＡＡＣ
＾＾＾　ＧＧＣＧＡＡ　　ＡＣＡ　　ＧＴＡ　　ＧＡＧ
　　ＧＡＡ　ＧＣＧ　　ＡＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＧ　　
ＧＣＴ　　ＣＡＡ　Ｇ［：Ａ　　ＧＡＡ　　ＧＧＧ　　
ＣＴＴ　　＾＾Ｔ　　ＴＣＧＧＡＧ　　ＣＡＡ　　ＡＣ
ＣＣＴＧ　　ＣＡＡ　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　ＧＡＴ　　Ｇ
ＣＡ　　ＧＴＧＡＧＣＧＣＧ　　ＧＴＧ　　ＧＣＧ　　
ＴＣＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＴ　　ＣＡＡ　ＧＡＧ　　Ｇ
ＡＧ＾ＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＴＧ　　ＡＴＣＧＡＣＧＡ
Ｔ　　ＧＴＧ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　　ＣＴＴＧ＾＾　
ＡＡＧ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＣＡＡ　　ＣＡＧ　　ＣＴ
Ｔ　　ＡＡＧ　　ＧＡＴ　　ＧＡＣ＾ＴＴ　　ＧＧＧ　
　ＴＴＣＧＴＡ　ＡＣＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＧ　　ＡＧ
Ａ　　ＧＡＧ　　Ｔ＾＾ＴＴＧＧＡＧＧＴＡＧＣＴＴＴ
ＧＴＴＧＴＧＡＴＣ：ＧＴＡＣ（：ＣＣＡＴＧＴＴＡＣ
ＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＧ
ＧＧＧＧ＾＾ＡＴＴＧＣＴＣＧＧＡ　　５９９ＴＡＴＣ
ＴＴＣＡＴ丁ＴＧＧ丁ＴＧＣＴＣＧ丁＾丁＾ＴＧＴＴＣ
ＡＴＴＴＧＧＴＴτＣ６２８＾＾ＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴ
ＧＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴ丁ＧＡ丁ＧＧ丁
ＴＧ　　８Ｂ７６丁ＡＣ（：ＣＧＧ丁ＧＡＣＧ＾＾ＴＣ
ＧＣＡＧＧＴＴ＾＾ＴＴＡＧＴＧＧＡＡＧＡＣＧ　　７
０８ＣＧＴＧ＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾＾ＣＣＧＡ
ＡＴＴＣ７３３本発明のＤＮＡ配列は、式［Ｉ］で表さ
れるＤＮＡ配列の一部であってもよいし、全部であって
もよい、また、式［！］で示されるＤＮＡ配列を一部に
含むものであってもよい。

本発明のＤＮＡ配列は、前述のようにｍＲＮＡを鋳型に
合成してもよいし、有機化学的に合成してもよい。

一般に、遺伝子組換え技術分野では、遺伝暗号の縮重に
従い、遺伝子から産生される蛋白質のアミノ酸配列を変
えることなく、その遺伝子のＤＮＡの少なくとも一つの
塩基を他の塩基に置換することができる。従って、本発
明のＤＮＡ配列は、また、遺伝暗号の縮重に基づく置換
によって変化された塩基配列を含有することも可能であ
る。この場合、置換により得られたＤＮＡ配列から演絆
されるアミノ酸配列は、後に式［！■］で示すアミノ酸
配列と一致する。

本発明では、式ＣＩ］のＤＮＡ配列と相補的なりＮＡ配
列を提供することも可能であり、この場合、相補的ＤＮ
Ａ配列は式［１］のＤＮＡ配列全体と相補的なものであ
ってもよいし、−部と相補的なものであってもよい。ま
た、相補的ＤＮＡ配列を一部に含むものであってもよい
、また、式［］のＤＮＡとそれに相補的なりＮＡは、互
いに相補的に結合して２本鎖ＤＮＡを形成していてもよ
いし、相補的な１本１ｉＤＮＡでもよい。

式［Ｉ］で示されるＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸
配列は、式［ＩＩ　］で示される。

式［ＩＩ］： ％式％ 本発明のトキソプラズマ特異的蛋白質は、式［ＩＩ　］
で表されるアミノ酸配列の一部であってもよいし、全部
であってもよいし、式［ＩＩ　］のアミノ酸配列を一部
に含むものであってもよい。

自然の変異により、または人工的変異により、その本来
の機能を変化させることなく、ＤＮＡの構造およびそれ
から演鐸されるポリペプチドの構造の一部を変異せしめ
ることが可能である。従って、本発明のトキソプラズマ
特異的蛋白質は、前述のすべてのアミノ酸配列の相同変
異体に相当する構造を有する配列を含有することも可能
である。

本発明のＤＮＡ配列を複製可能な発現ベクターに連結し
て複製可能な組換え体ＤＮＡとし、それを用いて微生物
または細胞を形質転換させて形質転換体を形成せしめ、
この形質転換体を当該微生物または細胞の親細胞から選
別し、この形質転換体を培養して、当該形質転換体に当
該ＤＮＡ配列を発現させて、トキソプラズマ特異的蛋白
質を産生せしめ、この蛋白質を培養した形質転換体ある
いはその培養液から単離することによってトキソプラズ
マ由来の他の蛋白質を実質的に含有しないトキソプラズ
マ特異的蛋白質を得ることができる。

このように、組換え宿主細胞によフて得られるトキソプ
ラズマ特異的蛋白質は、大量製造が可能であり、トキソ
プラズマ由来の他の蛋白質を実質的に含有しないので、
特異的な抗体を作製することができる。

〈実施例〉 以下に、実施例をもって本発明をより具体的に説明する
が、本発明はなんらそれらに限定されるものではない。

また、略号等は、特に記載しない限り当該分野で一散的
に用いられているものである。

（実施例１）トキソプラズマの大量調製Ｔｏｘｏｐｌａ
ｓｍａ　　ｇｏｎｄｉｉ（以下トキソプラズマとする）
虫体の大量調製は、通常の継代方法でマウスに虫体を感
染させ、腹腔より回収する方法で行った。すなわち、ト
キソプラズマ強毒株の一種であるＲＨ株（音束大学医学
部　寄生史学教室　亀井喜世子助教授より分与）をマウ
ス腹腔内に投与した。４日毎にマウスの腹水を採取し、
生理食塩水で１／１０〜１／２０に希釈して別のマウス
の腹腔内へ投与し、ＲＨ株を順次継代増殖させた。この
ようにして、ｄｄＹマウス７０匹にＲＨ株を感染させた
。感染４日日にマウスを脱血層殺し、腹腔内を生理食塩
本釣３ｍｌを用いて洗浄し、その洗浄液を回収した。こ
の操作を２〜３回繰り返した。その洗浄液を１，２００
ｘｇで８分間遠心し、沈澱を０．５〜１ｍｌの生理食塩
水に懸濁した。さらに１，２００ｘｇで３分間遠心した
後、上清を除去し、残渣を液体窒素中で凍結した。

（実施例２）トキソプラズマ虫体からのｍＲＮＡの抽出 １）全ＲＮＡの抽出 グアニジン−熱フェノール法に従い、以下の通り実施し
た。トキソプラズマ虫体６００ｍｇに、液体窒素中へ滴
下して氷粒とした４Ｍグアニジンチオシアネート溶液（
５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，６）、１０ｍＭ　　Ｅ
　Ｄ　ＴＡ。

２％ザルコシルおよび１％β−メルカプトエタノール含
有）４．０ｍｌを加え、凍結状態のまま、フリーザーミ
ル（タイプ６７００．スペックス社）を用いて充分に粉
砕した。粉末を試験管に移し、６０℃で加熱し、粘稠な
溶液とした後、１８Ｇ注射針を゛つけた注射筒を用いて
１０回吸引排出を繰り返すことによってＤＮＡを切断し
、粘性を消失させた。

次に、６０℃に加熱したフェノール溶液２．５ｍｌを加
えてよく混合し、ざらに０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（
ｐＨ５，２，１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，４）およ
び１ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有）１．２ｍｌ、クロロホルム
２．５ｍｌを添加し、６０℃で１５分間、激しく混合し
た。４℃、１４．ＯＯＯＸｇで５分間遠心した後、水層
を回収した。フェノール−クロロホルム（１：１）抽出
を１回、クロロホルム抽出を２回実施した。エタノール
沈澱の後、０．１Ｍトリス−塩酸Ｕ衝溶液（ｐＨ７，４
，５０ｍＭ　　ＮａＣ１，１０ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび
０．２％ＳＤＳ含有）に溶解し、終濃度２００μｇ　／
　ｍ　１になるようプロテイナーゼＫを添加し、３７℃
で６０分間、インキユベートした。

反応後、６０℃に加熱し、フェノール抽出およびクロロ
ホルム抽出を各々２回実施した。エタノール沈澱により
ＲＮＡを回収し、滅菌蒸留水３００μｍに溶解した０以
上の操作により抽出されたＲＮＡは、３ｍｇであった。

２）ｍＲＮＡの抽出 全ＲＮＡからのポリ（Ａ）　　ＲＮＡの抽出は、市販の
ポリ（Ａ）　　ｍＲＮＡアイソレージ鱈ンキット（フナ
コシ社）を使用し、添付の指示書に従い、以下の通り実
施した。オリゴ６丁セルロースを０．５Ｍ　　ＮａＣ１
含有平衡化溶液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，６）
、１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＳＤＳ含有）に
浸して膨潤させ、０．２ｍｌ容量のカラムを作製した。

カラムは、０．１％ジエチルピロカルボネートおよびオ
ートクレーブ処理された蒸留水（ＤＥＰＣ蒸留水）０．
ＩＭ　　ＮａＯＨｍ液（５ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有）、再
びＤＥＰＣ蒸留水および０．５Ｍ　　ＮａＣ１含有平衡
化溶液で順に洗浄した。りで抽出した全ＲＮＡ　１　ｍ
ｇをＤＥＰＣ蒸留水に溶解し、２００μｌとし、６５℃
で５分間加熱し、熱変性させた。水中で冷却し、２倍濃
度の平衡化溶液２００μｍを添加した。

この溶液をカラムにかけ、０．５Ｍ ＮａＣ１含有平衡化溶液２．５ｍｌおよび０．１Ｍ　　
ＮａＣ１含有平衡化溶液１ｍｌで洗浄し、ＮａＣ１不含
の溶出溶液（ｐＨ７，５，１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＯＳ含有）０．６ｍ
ｌで溶出操作を行った。溶出フラクションに再度６５℃
、５分間の加熱処理をし、再度同様のカラムクロマトグ
ラフィーを実施した。各フラクションから２μｍずつを
採取して０．８％アガロースゲル電気泳動を行うことに
より、ポリ（Ａ）”ＲＮＡ含有画分を決定し、その両分
をプールした。ポリ（Ａ）　　ＲＮＡ含有画分は、全量
約４５０μｌでありた。この画分に３Ｍ酢酸ナトリウム
４０μｍを添加した後にエタノール沈澱を行い、−８０
℃で１５分間放置後、１４，０００Ｘｇで１０分間遠心
し、ポリ（Ａ）”ＲＮＡを回収した。全ＲＮＡ　１　ｍ
ｇより、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡ　１５μｇが回収された
。

（実施例３）ｃＤＮＡライブラリーの構築実施例２で得
られたポリ（Ａ）”　ＲＮＡを用いて、そのｃ　ＤＮＡ
をｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア社　コード２７−
９２６０−ＯＩ）を使用して合成した。方法は添付の指
示書に従フた。すなわち、実施例２で油出したポリ（Ａ
）”　ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）５ｕｌｉをＤＥＰＣ蒸留水
に溶解して２０μ！とし、６５℃で１０分間加熱後、水
中で冷却した。添付の第１反応溶液（トリス−塩酸、ｄ
ＮＴＰ　（ＮはＡ％Ｇ１ＣおよびＴ）゛、オリゴｄＴブ
ライマーおよび千ロ二−マウス白血病ウィルス逆転写酵
素含有）１１μｍに添付のＤＴＴ溶液１μｌおよび［”
Ｐ］ｄＣＴＰ　　１μＣｔを加え、３７℃で６０分間反
応させ、１本ｆＪＲｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを合成した。

これに、第２反応溶液（ｄＮＴＰ、Ｅ。

ｃｏｌｔ　　ＲＮａｓａＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩ
含有）６８μｍと［”Ｐ］ｄＣＴＰ５０μＣ１を添加し
、１２℃で６０分間、さらに２２℃で６０分間インキエ
ベートした。ここに、添付のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）
酵素溶液１μｍを加え、３７℃で３０分間反応させた。

放射活性の取り込みより、合成されたｃｌ）ＮＡ量を算
出した結果、総量１．６μｇであった。

反応後、フェノール−゛クロロホルム溶液１００μｌを
添加し、反応を停止すると同時に抽出操作を行った。上
部水層をスパンカラム（セファクリルＳ−２００が充填
されている）にかけ、６６ｍＭトリス−塩酸Ｍｉ街溶液
（ｐＨ７，６，１ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２．１５ｍＭ　　ＤＴＴおよび０．２ｍｇ／ｍ１Ｂ
ＳＡ含有）で溶出し、溶出液をそのままＥｃｏＲＩアダ
プターの付加に使用した。

溶出液に添付のＥｃｏＲＩアダプター溶液５μｍ、ＡＴ
Ｐ溶液１μおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ溶液３μｌを添加
し、１２℃で一晩反応させた。６５℃で１０分間加熱し
て酵素を失活させた後、氷冷した３次に、ＡＴＰ溶液１
０μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ溶液１μｍを添
加して攪拌し、３７℃で３０分間反応させた。

フェノール−クロロホルム溶液１００μｌを加えて抽出
後、上部水層を回収し、再度スパンカラムにかけ、最終
的に２５０ｎｇのＥｃｏＲＩ末端を持つｃＤＮＡが回収
された。この溶出液をエタノール沈澱し、ｔｏｎｇ／μ
ｍの水溶液とした。

ｃＤＮＡのベクターへの導入は、市販のＤＮＡライゲー
ジ日ンキンキット酒造株式会社コード８０２１）を使用
し、添付の指示書に従って行った。すなわち、ｃＤＮＡ
溶液１μｍ（ｃＤＮＡ　　１０ｎｇ）を１００ｍＭトリ
ス−塩酸（ｐＨ７，８）、５ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｚ３
００ｍＭ　　ＮａＣ１となるように調製し、ここに、フ
ァージλｇｔｌｌのＥｃｏＲＩアーム（脱リン酸化した
もの）２５０ｎｇを加えた。

この溶液４．０μｌと添付のＢ溶液４．０μｌを混合し
、２６℃で１０分間反応させた。

こうして得られた組換えファージＤＮＡを、市販のギガ
バックプラスキット（ストラタジーン社）を用いてｉｎ
　　ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。すなわち、組
換えファージＤＮＡ０．１μｇをパッケージング溶液に
添加し、静かに混合し、室温で２時間インキュベートし
た。５００ｔｔ１の希釈液と２０μｍのクロロホルムを
加え、４℃にて保存した。

（実施例４）抗体によるλｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリ
ーの免疫学的スクリー ニング １）ファージプラークの形成 ５０μｇ　／　ｍ　１アンピシリンおよび０．２％マル
トース含有ＬＢ培地（ｐＨ７，５，１０ｇ／ｌバクトド
リプトン、５ｇ／ｌパクトーイーストエキストラクトお
よび１０ｇ／ＩＮａＣＩ）で−晩培養した大腸菌Ｙｌ　
０９０培養液０．２ｍｌと実施例３で調製したファージ
組換え体０．１ｍｌ　（５〜１０ｘｌＯ’　ｐ。

ｆ、ｕ）を混合した。３７℃で１５分間インキエベート
し、ファージを大腸菌に感染させた０次に、０．６５％
アガロース含有ＬＢ培地２．５ｍｌを添加し、ＬＢ寒天
培地に重層した。さらに４２℃で４時間インキュベート
した。１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（ｌ　ＰＴＧ）を染み込ませたニトロセルロー
スフィルターをプレートに重ね、３７℃で２時間インキ
ュベートして、形成したファージプラークをフィルター
に移し取った。

得られたプラーク数は３Ｘ１０’個であつた。

２）抗体によるスクリーニング １）で得たニトロセルロースフィルターを、ＴＢＳ溶液
（ｐＨ７，５，５０ｍＭトリス−塩酸および１５０ｍＭ
　　ＮａＣ１含有）を用いて室温で５分間洗浄した後、
ＴＢＳ溶液（０，５％スキムミルク含有）で室温で１時
間インキュベートした０次に、フィルターを抗体溶液（
ＴＢＳ溶液、０．５％スキムミルク、１０％Ｙ１０９０
ライゼートおよび終濃度１００倍希釈トキソプラズマ感
染症患者抗血清）に浸し、室温で一晩インキユベートし
た。フィルターを、１００ｍＭリン酸！１衝溶液（ｐＨ
７，０，０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有）を用い、室温
で５分間、３回洗浄した。さらにＴＢＳ溶液で同様に１
０分間洗浄した。２次抗体としてペルオキシダーゼ標識
抗ヒトＩｇＧ抗体（医学生物学研究所）の１０００倍希
釈液（ＴＢＳ溶液、２．５％ゼラチン含有）を加え、室
温で１時間インキュベートした。フィルターを、１００
ｍＭリン酸Ｍ衝溶液（ｐＨ−７，０，０，０５％”ｒｗ
ｅｅｎｚｏ含有）を用い、室温で５分間の洗浄を３回行
い、さらにＴＢＳ溶液を用いて室温で１０分間洗浄した
６発色基質として、３ｍｇ／ｍｌ　　４−クロロ−１−
ナフトール含有メタノール溶液に、５倍量のＴＢＳ溶液
および１／４００容量の３０％過酸化水素水（Ｈ２０ｘ
　）を加えた溶液を調製し、この溶液でフィルターをス
クリーニングした０以上の操作を繰り返し、陽性クロー
ンを同定した。その結果、２６個の陽性クローンが得ら
れた。

（実施例５）目的クローンの選別 目的クローンの選択は、エピトープセレクション法［生
化学　５９巻　７号　４５７頁１９８７年］に従い、以
下の通り実施した。

まず、次の４種類の溶液を調製した。すなわち、■スキ
ムミルク溶液＝０．５％ＣＷ／Ｖ）スキムミルク、２０
ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）および１００ｍＭ　　
ＮａＣ１■溶出液１　：　５ｍＭグリシン、０．１５Ｍ
　　ＮａＣ１およびｏ、ｉｍｇ／ｍｌ　　ＢＳＡ　　■
ＩＭトリスー塩酸溶液　■洗浄液：０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ　　２０およびスキムミルク溶液。

実施例４で同定された２６個の陽性クローンのうちの８
個のクローンをそれぞれ掻き取り、３Ｍ培地（５０ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ７，５）、５゜８ｇ／Ｉ　　ＮａＣ
１，２ｇ／ＩＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ３０および０．１
ｇ／ｌゼラチン含有）１ｍｌに懸濁し、ファージを拡散
させた。大腸菌Ｙ１０９０の３Ｍ培地での一夜培養液０
．２ｍｌにファージ懸濁液１μｌを混合し、プレートに
まき、４２℃で４時間インキュベートした。この上にＩ
　ＰＴＧを染み込ませたニトロセルロースフィルターを
重ね、２時間インキュベートした。フィルターを剥がし
、スキムミルク溶液に浸して室温にて１時間振蕩した。

次に、トキソプラズマ感染症患者抗血清５００μｌをス
キムミルク溶液（０，０２％アジ化ナトリウム含有）２
５ｍｌで希釈し、この溶液にフィルターを浸し、−晩イ
ンキユベートした。洗浄液５ｍｌで１０分間、３回洗浄
した。フィルターに結合した抗体は、溶出液２ｍｌ中で
１分間の振蕩操作を２回、さらに同溶液１ｍｌ中で１分
間の振蕩操作を行うことによって溶出した。溶出液は、
迅速に氷中へ移し、１Ｍトリス−塩酸溶液０．３ｍｌを
加えて中和した。その後、２５％スキムミルクを１００
μｌ加え、さらに１０％アジ化ナトリウム溶液１０μｍ
を加えて抗体溶液とした０以上の操作を８つのクローン
に対してそれぞれ行つた。

以上の操作で得た８種の抗体溶液を用い、実施例２に従
って得た全ＲＮＡのｉｎ　　ｖｉｔｒＯ翻訳産物をスク
リーニングした。１ｎｖｆｔｒｏ翻訳操作は、全ＲＮＡ
２μｇを用い、市販のウサギ網状赤血球ライゼート無細
胞系（１０μＣｉ［”Ｓｌメチオニン存在下）（アマジ
ャム社）を使用し、添付の指示書に従って実施した。こ
の翻訳産物１０μｍと、８種の抗体溶液１００μｌを各
々混合し、４℃で１６６時間インキュベートた。その後
、４０％（Ｖ／Ｖ）スタフィロコッカス　アウレウスＣ
ｏｗａ　ｎ　１株を５μｍ加え、３０分間室温でインキ
ュベート後、１０．ＯＯＯｘｇで２分間遠心し、上溝を
除去し、沈澱物を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液（ｐＨ
７，６，１５０ｍＭＮａＣ１，５ｍＭ　　ＥＤＴＡおよ
び０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓ含有）で４回洗浄した。

その後、１５０ｍＭｔ−リスー塩酸ｉ衝溶液（ｐＨ６，
８，４％ＳＤＳ、１０％β−メルカプトエタノール、２
０％グリセロールおよび０．０２％ブロモフェノールブ
ルー含有）に懸濁し、１００℃で８分間インキュベート
後、１０、ＯＯＯｘｇで２分間遠心し、上清をドデシル
硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離後、オートラジオグラフィ
ーにより分析した。８種のサンプルの中から、５ＤＳ−
ＰＡＧＥで分子量約２７．０００ダルトンのバンドを示
すものを確認し、これに対応するクローンを決定した。

（実施例６）目的クローンのサブクローニング実施例５
で同定されたファージプラーク（λＴｇ　１８）を培地
とともにパスツールとベットで吸い取り、５Ｍ培地１ｍ
ｌに懸濁し、ファージ懸濁液とした。このファージ懸濁
液２００μｍを大腸菌Ｙｌ　０８８のＬＢ培地での一夜
培養液に混合し、３７℃で６時間インキュベートした。

クロロホルムＯ，１ｍｌを加え、３７℃で１０分間振落
し、６．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心して上溝を採取した
。

終濃度５０μｇ　／　ｍ　１となるようにＤＮａｓｅＩ
、ＲＮａｓｅＡを加え、３７℃で３０分間保温した後、
２０％ポリエチレングリコール溶液（２，５Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１含有）を０．６容量加え、４℃で一晩放置した。６
，０ＯＯｒ、ｐ。

ｍ、で１５分間遠心し、沈澱を１０ｍＭトリス−塩酸！
Ｉ街溶液（ｐＨ７５５，５ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％
　ＳＤＳ含有）に懸濁し、３７℃で２０分間保温した。

常法通り、フェノール抽出、フェノール−クロロホルム
抽出、およびエタノール沈澱を行うことにより、ファー
ジＤＮＡを分離した。

沈澱は、エタノールで洗浄し、乾燥後、ＴＥ浴溶液１０
ｍＭ）−リスー塩酸！Ｒ街溶液（ｐＨ７，５）、１ｍＭ
　　ＥＤＴＡ含有）２００μｍに溶解し、終濃度２Ｍと
なるように酢酸アンモニウムを加え、エタノール沈澱を
繰り返し、最終的に沈澱を終濃度２００μｇ　／　ｍ　
１となるようＴＥ浴溶液溶解した。この溶液５μｍに１
０車位／μｍのＥｃｏＲＩ　　１μｍおよびＥｃ。

Ｒ１用ＩＩ衝液ｌＯμｍを加えて１６μｍとし、３７℃
で２０分間インキュベートし、ｃＤＮＡを切断した。ざ
らに、９０％エタノール（０，１Ｍ　　ＮａＣ１含有）
３２μｌを加え、−８０℃で１０分間放置し、エタノー
ル沈澱を行い、乾固させた。

次に、このＤＮＡＩμｇ（インサートｃＤＮＡで５０ｎ
ｇ）を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式会社
）を使用してプラスミドｐＴＺ１８Ｒにサブクローニン
グした。すなわち、上記ＤＮＡに滅菌蒸留水１μｍとＥ
ｃｏＲＩで消化し脱リン酸化したプラスミドベクターｐ
Ｔ２１８Ｒ０，５μ！　（５０ｎｇ含有）を加え、混合
し、５分間室温で放置し、さらによく混合した。このＤ
ＮＡ溶液に、０．４Ｍトリス−塩酸＆Ｉ衝温溶液ｐＨ７
，５，２０ｍＭＭｇＣＩ２含有）０．５μｍ、キット付
随のＡ溶液１６μｍを加え、よく混合し、そこに同じく
Ｂ溶液２μｌを加え、１６℃で３０分間インキュベート
した。

次　に　　常法（モレキュラークローニング２５０頁　
コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−社　１９８２
年）に従って調製された大腸菌ＪＭＩＯＩコンピテント
セル１００μｌに、先の組換えプラスミド溶液３μｌを
添加した。水中で、混合し、４４℃で１分間加温し、再
び水中で１〜２分間放置した。ＬＢ培地１００μｍ、１
００ｍＭ　　ＩＰＴＧ　　２０μｍおよび１％Ｘ−ｇａ
１４０μｌを加えた後、アンピシリンプレートに播種し
、３７℃で一晩培養した。

得られた白色コロニーをＬＢ培地３ｍｌに植え、３７℃
で一畳夜振蕩培養した。１，０００ｘｇで１分間遠心し
、ベレットをグルコース−リゾチーム溶液（５０ｍＭグ
ルコース、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２５ｍＭ）リス−塩
酸（ｐＨ８，０）および４　ｍ　ｇ　／　ｍ　１リゾチ
ーム含有）１００μｌに懸濁し、室温で５分間放置した
。

アルカリ溶液（０，２Ｎ　　ＮａＯＨおよび１％ＳＯＳ
含有）２００μｌを加え、穏やかに混ぜ、水中に５分装
置いた。５Ｍ酢酸カリウム溶液１５０μｍを加えてよく
混合し、水中に５分間おき、その後、４℃、１２，０Ｏ
Ｏｒ、ｐ。

ｍ、で５分間遠心した。上清をフェノール−クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱し、乾燥させた。

これをＴＥ溶液５０μｌに溶解し、１ｍｇ／ｍｌ　　　
　　　ＲＮａｓｅＡ　　　（ＤＮａｓｅ　　　　　　）
　　　リ　　−　　）０．５μｍに加え、３７℃で１時
間インキュベートし、さらに１／３容量の２０％ポリエ
チレングリコール−２，５Ｍ　　ＮａＣ１溶液を加え、
０℃で１時間放置した。１２．０ＯＯｒ。

ｐ、ｍ、で１０分間遠心し、沈澱をエタノール洗浄し、
乾燥させ、５０μｌのＴＥ浴溶液溶解した。

尚、ここで得られた組換えプラスミドを含有する大腸菌
は、平成１年２月２３日に、徴工研菌寄第１０５６５号
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０５６５）、識別表示Ｅ、ｃｏｌ
ｔ　　ＪＭｌｏｌ　　（ｐＴＺ１８Ｒ，ｐＴｇ１８）と
して寄託されている。

（実施例７）インサートｃＤＮＡのサブクローニング 塩基配列の決定に用いるのに適当な長さのｃＤＮＡ断片
を得るために、実施例６で得られたプラスミドｃＤＮＡ
インサートを、更に以下のようにサブクローニングした
。

１）ｃＤＮＡインサートの消化 実施例６で得られた精製プラスミドｔ　ｏｕｇをＥｃｏ
ＲＩで消化し、生成した約７５０ｂ。

ｐ、のフラグメントを、０．７％のアガロース電気泳動
法によって単離した０次いで、そのフラグメント各々０
．２μｇを用い、表１に示したｌｉ＋ｌＪ限酵素によフ
て更に消化した。５％のポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により、各々の検体が完全に消化されたことを確認
後、６０℃、１５分間の加熱処理により、反応を停止さ
せた。

表　　　　１ 群 制限酵素 １　　　　　　　　　Ｈｉ　　ｎ　　ｄ　　ｌｌＩ２　
　　　　　　　　　ＥｃｏＲＶ ３　　　　　　　　　　Ａ　　ｃ　　ｃ　　ＩＩ４　　
　　　ＥｃｏＲＶ＋Ｈ１ｎｄｍ ５　　　　　Ｋ　　ｐ　　ｎ　　Ｉ　　＋　　Ｈｉ　　
ｎ　　ｄ　　ｌｌｌ２）ベクターの調製 ｐ丁ＺＩＢＵ％ｐＴＺ１９ＵおよびｐＵＣ１１９を表２
に示した制限酵素により消化し、１）で得たフラグメン
トのクローニング用ベクターとした。すなわち、各々の
プラスミド約１μｇを表２の組合せのＩ（Ｊ限酵素で消
化後、６０℃、１５分間の加熱処理により、反応を停止
させた０次いで、常法通り、エタノール沈殿法によりＤ
ＮＡを回収、乾固し、２０μｌのＴＥ溶液に溶解させた
。

表 群 ベクター 制限酵素 ＡｐＴＺ１８ＵＥｃｏＲＩ＋Ｈ１ｎｄｌ■Ｂ　　　　　
ｐＴＺ１９Ｕ　　　　ＥｃｏＲＩ　　＋　　　ＨＩｎｄ
［ＩｆＣｐＴＺ１８Ｕ　　　　ＥｃｏＲＩ　　＋　　　
　ＳｍａＩＤ　　　　　ｐＴＺｌｌｌｌｌ　　　　　Ｋ
ｐｎｌ　　＋　　　ＨｌｎｃｌｌＥ　　　　　ｐＵｃ１
１９　　　　　ＳｍａＩ　　＋　　　ＥｃｏＲＩＦ　　
　　　ｐＵｃ１１９　　　　ＨｌｎｄＩＩＩ　　＋　　
　ＨｌｎｃｌｌＧ　　　　　ｐＵｃ１１９　　　　Ｈｌ
ｎｄｌＤ　　＋　　　　にｐｎＩＨｐＵｃ１１９　　　
　Ｈｌｎｄｌｌｌ　　＋　　　ＥｃｏＲＩ３）ライゲー
ジ目ンおよびトランスフォーメーション １）で得た消化反応終了液各々２μｌ（約２０ｎｇＤＮ
Ａ）と２）で得たベクター溶解液２μｌ（約１００ｎｇ
１００ｎを表３に示した組合せによって混合し、ライゲ
ーションキット（宝酒造社）付随のＡ液１２μｍおよび
Ｂ液３μｍを添加し、１６℃で３０分間インキュベート
した１反応終了後、各々の反応液の１／２量（９μｌ）
を大腸菌ＪＭＩＯＩ株のコンピテントセル懸濁液１００
μｌに加え、氷上で１５分間インキュベートし、直ちに
４００μｍのＬＢ培地を添加し、１／１０量をＸ−ｇａ
ｌおよびＩ　ＰＴＧとともに１００μｇ／ｍｌのアンピ
シリン含有ＬＢｊｌ天培地上に播種した。３７℃にて一
晩培養した後、得られた白色コロニーを実施例６と同様
に処理し、そのコロニーの持つプラスミドを阜ｍ精製し
た。そのプラスミドが、塩基配列決定に用いるのに適当
な長さの目的とするｃＤＮＡインサートを持つか否かは
、制限酵素処理によって切り出されたインサートの長さ
によって確認した。

表　　　　３ ベクター群　　ｃＤＮＡインサート群 （実施例８）塩基配列決定用−末鎖Ｄ　Ｎ　Ａの調製 実施例７でｃＤＮＡインサートを持つことが確認された
白色コロニーを、各々５ｍｌの５０μｇ　／　ｍ　１ア
ンピシリン含有２ＸＴＹ培地（１８ｇ／ｌトリプトン、
１００　ｇ／ｌイーストエキストラクトおよび５ｇ／Ｉ
　　ＮａＣ１含有）に植え込み、３７℃で一晩振蕩培養
した。

このうちの１ｍｌをさらに５０ｍ１の新鮮な同培地（１
００μｇ　／　ｍ　１アンピシリン含有）に植え込み、
３７℃で３０分間振振蕩養した。この培養液に、ヘルパ
ーファージとしてＭ１３ＫＯ７をｍ、　ｏ、　　ｉ　、
　　（ａ＋ｕｌｔｌｐＨｃｉｔｙ　ｏｆｌｎｆｅｃｔｌ
ｏｎ　）約２０となるように添加し、さらに３７℃で３
０分間培養した。カナマイシンを終濃度７０μｇ　／　
ｍ　１となるように添加した後、−晩培養を続けた。培
養終了後、４℃、１４．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、　　　１５
分間の遠心分離により上溝を回収し、その上清を同条件
で再度遠心し、菌体を完全に沈殿させ、上溝を回収した
・その上清に・終濃度４％となるようにポリエチレング
リコールおよび同じ（０，７Ｍとなるように酢酸アンモ
ニウムを各々添加し、ゆるやかに攪拌した後、氷上に３
０分間静置した。４℃、１４，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、　　
　１５分間の遠心分離によってファージを沈殿させ、Ｔ
Ｅ溶液０．７ｍｌに溶解し、フェノール−クロロホルム
抽出によって一本鎖ＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿に
より一木１ｉＤＮＡを回収した。

（実施例９）ｃＤＮＡ塩基配列の決定 実施例８で得たｃＤＮＡについて、５ｅｑｕｅｎａｓｅ
”（ユナイテッド　ステープ　バイオケミカル　コーボ
レーシＢン社）を用いたジデオキシチェーンターミネー
シ８ン法に従い、塩基配列を決定した。シーフェンスの
ストラテジは′！Ｊ２図に示した。

まず譬調製されたＤＮＡについて、各々ＤＮＡ約１μｇ
を滅菌純水７μｍに溶解し、Ｍ１３ブライマー１μｍ　
（０，５μｍｏｌ含有）、ＴＥ溶液（１００ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２および２５０ｍＭ　　ＮａＣ１含有）２μｍを
添加し、６５℃で１０分間、４２℃で１０分間、さらに
室温で１０分間インキエベートし、アニール化反応を行
った。

次に、各３μＭ　　ｄＮＴＰ（ＮはＡ％ＧおよびＴ）２
．０μｌを用意し、先のアニール化溶液に加え、さらに
、１．５車位／μｌ　　５ｅｑｕｅｎａｓｅ”　　２μ
ｍ、０．ＩＭＤＴＴ１μ１１４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　［
”Ｐｌ　ｄＣＴＰ　０６５μｍ（５μｃｉ）を添加し、
３７℃で５分間インキエベートした。予め別に準備して
おいた各８μＭ　　ｄｄＮＴＰ溶液（ＮはＡｌＧ、Ｃお
よびＴ）にインキュベート終了後の放射ラベル混合液３
．５μ】を添加し、３７℃で５分間インキエベートした
。停止溶液（９５％脱イオン化ホルムアミド、２５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％ブロモフェノールブルーおよび０．
１％キシレンシアツール）４μＩを加えて反応を停止さ
せ、さらに、８０℃で２分間加熱処理した。水中で急冷
し、サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ
、オートラジオグラフィーを行うことにより、塩基配列
を決定した。その結果と塩基配列がコードするアミノ酸
配列を第１図に示した。今回クローニングされた部位は
、３′側のポリ（Ａ）ティルを含む７３３ベースの領域
で内部に５２２ベースのオーブンリーディングフレーム
を持つことが確認された。

〈発明の効果〉 本発明は、トキソプラズマに特異的な抗原蛋白買をコー
ドするＤＮＡ配列を提供する。さらに、それに基づくト
キソプラズマ特異抗原蛋白買のアミノ酸配列を提供する
。

本発明によれば、遺伝子工学的にトキソプラズマ特異抗
原を製造することが可能となり、それは実質的にトキソ
プラズマ虫体由来の他の蛋白買を含有しない、したがっ
て、従来は粗抗原を用いざるを得なかったトキソプラズ
マ感染検置薬に、高純度の特異抗原を使用することが可
能となり、検査精度の格段の向上が期待される。また、
その特異抗原の製造を遺伝子工学的手法により可能とす
るため、工程作業者へのトキソプラズマ感染の危険性も
完全に回避される。

さらに、本発明のトキソプラズマ特異抗原のアミノ酸配
列あるいはＤＮＡ配列に基づき、それと特異的に結合し
つる単クローン性抗体やＤＮＡあるいはＲＮＡ断片を作
製することが可能となり、これは、感染、患者の組織中
あるいは血中からより直接的にトキソプラズマを検出す
るための免疫学的診断薬や遺伝子診断薬の開発に非常に
有用となる。

の解析方向を示す図である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉに特異的な
   蛋白質をコードする下記式［ I ］で表されるＤＮＡ配
   列の一部あるいは全部を有することを特徴とする新規Ｄ
   ＮＡ配列。 式［ I ］： 【遺伝子配列があります】
2. （２）遺伝暗号の縮重に基づき、少なくとも１個の塩基
   が他の塩基で置換されている請求項１記載の新規ＤＮＡ
   配列。
3. （３）請求項１または２に記載のＤＮＡ配列と相補的な
   ＤＮＡ配列。
4. （４）抗Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ抗血清と
   特異的に反応する分子量が２５，０００ダルトンないし
   ３０，０００ダルトンであることを特徴とするＴｏｘｏ
   ｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉに特異的な蛋白質。
5. （５）下記式［II］で表されるアミノ酸配列の一部ある
   いは全部を有することを特徴とするＴｏｘｏｐｌａｓｍ
   ａ　ｇｏｎｄｉｉに特異的な蛋白質。 式［II］： 【アミノ酸配列があります】
6. （６）遺伝子組換え宿主細胞によって産生 されることを特徴とする請求項５記載の Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉに特異的な蛋白質
   。
7. （７）前記遺伝子組換え宿主細胞が、請求項１または２
   に記載のＤＮＡ配列を有することを特徴とする請求項６
   記載のＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉに特異的な蛋
   白質。