CN105759030B - 一种检测弓形虫抗体的胶体金试纸条 - Google Patents

一种检测弓形虫抗体的胶体金试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测弓形虫抗体的胶体金试纸条。本发明提供了一种检测弓形虫的胶体金试纸条。本发明提供的胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有金标蛋白的金标垫、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫；本发明的实验证明，本发明制备一种胶体金试纸条，可同时检测出动物体内弓形虫的血清抗体，便于对动物的原虫感染进行鉴别诊断，节约成本，操作简便，适用于检测猪、犬、猫等动物。

Description

一种检测弓形虫抗体的胶体金试纸条
技术领域
本发明属血清学检测领域，涉及一种检测弓形虫抗体的胶体金试纸条。
背景技术
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由专性胞内寄生原虫龚地弓形虫(Toxoplasmagondii，简称弓形虫)引起的，是一种全世界范围内流行的人畜共患疾病。弓形虫可以感染多种动物和人，其感染的发生、症状以及致病性与弓形虫基因型、感染量和宿主的遗传背景及免疫状态密切相关。大多数宿主感染弓形虫通常表现出相对较轻的症状，但若机体免疫力低下，则导致严重疾病甚至引起死亡。弓形虫病的另一危害是引起妊娠动物流产、死胎等繁殖障碍。
对弓形虫的感染和发病的诊断方法包括病原学、血清学、分子生物学和免疫病理学等。病原学诊断包括组织涂片检查、动物接种等。分子生物学诊断方法如PCR。免疫学(包括血清学)诊断方法主要有补体结合试验(CFT)、凝集试验(AT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、间接血凝试验(IHA)、免疫胶体金技术(ICT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等。胶体金免疫层析技术是一种新型的免疫学快速诊断技术，具有敏感、特异、便捷等特点，便于现场检测，在多种病原的感染和残留检测等方面都得到了广泛应用。已有用弓形虫SAG2的重组蛋白研制出胶体金免疫层析试纸条(TgGICA)，以LAT和ELISA方法分别作为参照，结果显示TgGICA的敏感性和特异性为100％、97.2％和94.5％、95.8％，与两种参照方法的符合率分别为95.5％和96.1％(Huang等)。
综上所述，发明一种操作简便、受环境因素影响小、需要样品量少、特异性与敏感性强的胶体金试纸条对检测多种动物的弓形虫感染具有重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测弓形虫的胶体金试纸条。
本发明提供的胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有金标蛋白的金标垫、含有检测线T和质控线C的检测垫和吸水垫；
所述检测线T由TgGRA1蛋白溶液形成；
所述TgGRA1蛋白为如下a或b或c：
a)序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将a)或b)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
上述胶体金试纸条中，所述检测垫可由硝酸纤维素膜制成。
上述胶体金试纸条中，所述TgGRA1蛋白溶液中TgGRA1蛋白的浓度为2mg/ml。
上述胶体金试纸条中，所述金标蛋白为胶体金标记的SPA蛋白。
上述胶体金试纸条中，所述质控线C由IgG蛋白或IgG蛋白溶液形成；
所述IgG蛋白具体为猪IgG蛋白；
所述猪IgG蛋白溶液的浓度尤其具体为1mg/ml。
本发明另一个目的是提供一种制备上述的胶体金试纸条的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)制备包被有金标蛋白的金标垫和含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；
所述包被有金标蛋白的金标垫按照如下方法制备：将胶体金溶液和SPA蛋白混匀，反应，得到金标蛋白；再将所述金标蛋白加到玻璃纤维素膜上，得到包被有金标蛋白的金标垫；
所述含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜为将权利要求1-4中任一中的所述TgGRA1蛋白溶液和所述IgG蛋白溶液分别包被在硝酸纤维素膜上，形成含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；
2)将所述包被有金标蛋白的金标垫、样品垫、所述含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到所述胶体金试纸条。
上述方法中，所述胶体金溶液和所述SPA蛋白的加入配比为1ml:7μg；
所述胶体金溶液中的胶体金粒径为20nm。
上述TgGRA1蛋白或所述TgGRA1蛋白溶液或上述的胶体金试纸条在制备检测或辅助检测弓形虫产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述TgGRA1蛋白或所述TgGRA1蛋白溶液或上述的胶体金试纸条在制备检测或辅助检测待测样本或待测动物或待测人是否感染弓形虫产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述产品为试剂盒。
所述动物为哺乳动物，所述哺乳动物具体为猪、犬或猫。
本发明的实验证明，本发明制备一种胶体金试纸条，可同时检测出动物体内弓形虫的血清抗体，便于对动物的原虫感染进行鉴别诊断，节约成本，操作简便，适用于检测猪、犬、猫等动物。本发明操作简便、受环境因素影响小、需要样品量少。是一种能够同时检测多种动物弓形虫血清抗体的、特异性与敏感性强的胶体金试纸条。
附图说明
图1为TgGRA1的纯化蛋白。
图2为试纸条组装示意图。
图3为试纸条检测的判定标准。
图4为试纸条交叉反应的检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
E.coli Transetta(DE3)菌株、2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix等：购自北京全式金生物技术有限公司。
SPA：葡萄球菌A蛋白，10mg装，购自ProSpec公司。
样品垫(血清专用垫)、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫等，购自上海杰一生物技术有限公司。
下面结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1、TgGRA1蛋白制备
1、TgGRA1基因的克隆
设计引物扩增TgGRA1基因，引物如下表1所示。引物两端含酶切位点，用小写表示，引物5＇端增加保护碱基，3＇端为TgGRA1基因序列。
表1为用于扩增TgGRA1基因的引物
以弓形虫RH株的cDNA为模板，用TgGRA1基因的上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到495bp PCR产物，为TgGRA1基因，经过测序，TgGRA1基因的核苷酸序列为序列表中序列1，TgGRA1基因编码的蛋白TgGRA1，蛋白TgGRA1的氨基酸序列为序列表中序列2；
上述反应体系如下表2：
表2为反应体系
PCR反应条件：94℃预变性10min，进行31轮循环，循环包括94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。
取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，观察电泳条带。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收与目的片段大小相符条带，-20℃保存。
2、TgGRA1蛋白的制备
1)、pET-28a-TgGRA1质粒的构建
质粒pET-28a-TgGRA1为将序列表中序列1所示的TgGRA1基因***pET-28a载体的BamHI和XholI酶切位点间得到的载体，与pET-28a载体上的his标签融合表达带有标签TgGRA1(TgGRA1的N端和C端均连接6个His标签)；
2)、重组菌的制备
将质粒pET-28a-TgGRA1转入感受态Transetta(DE3)中，得到重组菌Transetta(DE3)/pET-28a-TgGRA1。
3)蛋白表达
将重组菌Transetta(DE3)/pET-28a-TgGRA1冰浴30min，42℃热激1min，冰浴3-5min，加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃摇菌40min-1h，取100-200μl菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日挑取单个菌落，加入含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养至对数生长期(OD600值约为0.6-0.8)，加入IPTG，使其终浓度为0.8mM。继续培养4-6h后，得到菌液。
将菌液8000rpm 4℃离心20min，收集菌体沉淀。加入40ml PBS重悬菌体沉淀进行超声裂解，工作2s，间歇4s，裂解10min。然后12000rpm 4℃离心20min，分别收集上清和沉淀，取样进行SDS-PAGE电泳。
重组菌Transetta(DE3)/pET-28a-TgGRA1的菌液上清中含有30KD的带有标签TgGRA1蛋白，即带有标签TgGRA1蛋白主要存在于上清中。
4)纯化
将重组菌Transetta(DE3)/pET-28a-TgGRA1的菌液上清用镍亲和层析进行纯化。纯化步骤如下：
A.让层析柱中的20％乙醇自然流出。
B.用超纯水冲洗Ni柱，一般是把层析柱加满，冲洗两遍。
C.待柱中液体剩下约1ml左右时，加入离子缓冲液，即50mM硫酸镍，作用30min以上。(50mM硫酸镍配制：称量硫酸镍2.6285g，加入超纯水至200ml，混匀后0.22μm滤器除菌，4℃保存。)
D.加入结合缓冲液，增强层析柱的吸附性，作用30min后让其从下端自然流出。(结合缓冲液配制：称量氯化钠5.844g，TRIS Base 0.4844g，咪唑0.06808g，加入超纯水至200ml，混匀后用氢氧化钠调节pH值为7.9，0.22μm滤器除菌。4℃保存。)
E.加入已处理好的蛋白液，使其缓慢流出，控制流速为5-6滴/分钟，为保证吸附效果，重复上样2-3次。收集过柱后的液体留样，进行SDS-PAGE检测，判断蛋白液是否与层析柱结合。
F.加入漂洗缓冲液洗去未结合的杂蛋白。(漂洗缓冲液配制：称量氯化钠5.844g，TRIS Base 0.4844g，咪唑0.27232g，加入超纯水至200ml，混匀后用氢氧化钠调节pH值为7.9，0.22μm滤器除菌。4℃保存。)
G.加入洗脱缓冲液，作用30min后使其缓慢流出，收集蛋白液，并用考马斯亮蓝G250进行检测。取142.5μl的考马斯亮蓝溶液G250加入到排管中，吸取流下的蛋白液7.5μl，与其混匀，观察颜色的变化。若颜色变蓝，说明液体中含有蛋白，颜色越深，说明蛋白浓度越大。收集与考马斯亮蓝G250反应变蓝的液体。(洗脱缓冲液配制：称量氯化钠5.844g，TRISBase 0.4844g，咪唑3.44g，加入超纯水至200ml，混匀后用氢氧化钠调节pH值为7.9，0.22μm滤器除菌。4℃保存。)
H.收集完的蛋白装入已处理好的透析袋中，在PB缓冲液中进行透析，每隔一段时间更换透析液，透析12h以上。透析完的蛋白液12000rpm 4℃离心10min后，取样进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，并测定其浓度，分装后-80℃保存备用。
I.使用后的层析柱中加入剥离缓冲液，打开下口使其自然流下，洗掉填料上的Ni。(剥离缓冲液配制：称量氯化钠1.461g，TRIS Base 0.1211g，EDTA 1.4612g，咪唑0.06808g，加入超纯水至50ml，混匀后用氢氧化钠调节pH值为7.9，0.22μm滤器除菌，4℃保存。)
J.待层析柱内填料变白后，加入20％乙醇冲洗层析柱，4℃保存。
结果如图1所示，1：TgGRA1蛋白；M：蛋白Marker，可以看出，得到30KD的带有标签TgGRA1蛋白。
实施例2、胶体金试纸的制备
1、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜的制备
1)、包被抗原的制备
TgGRA1蛋白溶液为将上述实施例1制备的带有标签TgGRA1蛋白溶于PB(PB配制：称量磷酸氢二钠5.37g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，加入超纯水至1000ml，混匀后备用。)中，且带有标签TgGRA1蛋白浓度为2mg/ml，即为TgGRA1抗原。
猪IgG蛋白溶液为将上述的猪IgG蛋白(购自中科迈晨(北京)科技有限公司,目录号:SP7-10)溶于PB中，且猪IgG蛋白浓度为1mg/ml，即为猪IgG抗原。
2)、包被
在硝酸纤维素膜Millipore180上分别包被检测线(T线)和一条质控线(C线)；T线包被TgGRA1抗原，用于检测弓形虫；C线包被猪IgG抗原(购自中科迈晨(北京)科技有限公司,目录号:SP7-10)，作为质控线；得到包被抗原的硝酸纤维素膜。
将包被抗原的硝酸纤维素膜置于37℃温箱，2h，室温密封保存备用。
2、金标垫的制备
1)胶体金溶液
利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，步骤如下：
A.在制备胶体金之前，清理实验台及地面等，减少灰尘的影响；
B.用超纯水冲洗量筒及锥形瓶(内含搅拌子)等；用量筒称量100ml超纯水加入到锥形瓶中，加完后及时用封口膜封上量筒口，用锡纸封上锥形瓶，避免灰尘的进入；
C.用超纯水清洗1ml枪头，重复2-3次，用清洗过的枪头吸取1ml 1％(质量比体积)氯金酸，加入到锥形瓶中，锡纸封口，磁力搅拌器上加热并搅拌，得到0.01％氯金酸溶液；
D.在100ml的0.01％氯金酸溶液沸腾后，迅速加入2ml的1％(质量比体积)柠檬酸三钠水溶液，继续加热10min，期间观察其颜色变化；E.室温冷却后，用超纯水定容至100ml，得到胶体金溶液；观察溶液中是否存在颗粒物等。4℃保存。
2)金标蛋白
制备步骤如下：
A.用量筒量取20ml上述1)制备的胶体金溶液倒入锥形瓶中，在磁力搅拌器上中速搅拌，锥形瓶用锡纸封口；
B.用超纯水冲洗过的枪头吸取一定量的K2CO3加入到锥形瓶中，调节胶体金溶液的pH值至5.9-6.2；
C.将浓度为1mg/ml的SPA蛋白12000rpm离心10min，弃沉降。通过最适标记蛋白量(每毫升已调节好pH值的胶体金溶液中加入7.0μg SPA)计算出20ml胶体金标记所需的SPA蛋白，逐滴加入到锥形瓶中，继续搅拌10min；
D.加入一定量的10％BSA水溶液，使BSA终浓度为1％，再加入一定量的10％PEG20000溶液，使PEG20000终浓度为0.05％，继续搅拌15min，得到胶体金标记SPA溶液。
BSA和PEG20000两者的作用是封闭胶体金颗粒上的未结合位点，减少非特异性吸附，并起到稳定胶体金的作用；
E.上述D制备的胶体金标记SPA溶液4℃平衡2h以上；
F.将上述E处理后的胶体金标记SPA溶液置于干净的离心管中，4℃10000rpm离心50min。小心弃去上清，留下管底可流动的暗红色沉淀，转移到新的离心管中，加入等量的金标蛋白稀释液(0.01M PB(PB配制：称量磷酸氢二钠5.37g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，加入超纯水至1000ml，混匀后备用。)+10％(质量体积比)蔗糖+0.25％(质量体积比)BSA+0.1％(质量体积比)PEG20000+0.2％体积百分含量Tween-20)，4℃保存备用，得到稀释后胶体金标记SPA溶液。
3)金标垫的制备
将上述2)制备的稀释后胶体金标记SPA溶液均匀地滴加玻璃纤维素膜Ahlstrom8964上，37℃烤箱中2h，锡纸包好后干燥器内保存备用，得到金标垫(包被有金标蛋白的金标垫)。
3、胶体金试纸条的组装
试纸条按照层析方向依次由样品垫(血清专用垫)、上述2制备的金标垫、上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫(H5076)组成。结构示意图见图2。
组装步骤如下：将样品垫和吸水垫裁剪成2.5cm宽，金标垫0.6cm宽。(1)在底板上粘贴上述1制备的包被抗原的硝酸纤维素膜；(2)粘贴上述2制备的金标垫，将金标垫的2-3mm覆盖在硝酸纤维素膜上；(3)粘贴样品垫，将样品垫的2-3mm覆盖在金标垫上；(4)粘贴吸水垫，将吸水垫的4-5mm覆盖在硝酸纤维素膜上；(5)用衔接胶带固定每层的衔接部分；(6)将组装好的底板裁剪成4mm宽的试纸条，密封保存备用，得到胶体金试纸条。
4、胶体金试纸条的检测方法
检测方法：取20倍稀释后的血清样品100μl滴加于上述3制备的胶体金试纸条的样品垫上，15min内判定结果。
根据T线、C线的显色情况判断是否感染弓形虫。
结果判定方法见图3：A.有C线、T线，说明弓形虫感染阳性；B.有C线，无T线，说明弓形虫感染阴性；C.无C线，无论有无T线，说明试纸条失效，需重新检测。
实施例3、试纸条的检测效果
1、特异性与敏感性
采用上述实施例2制备的胶体金试纸条(GICA)和间接免疫荧光试验(IFAT)两种方法检测相同的兔、犬、猫血清，比较这两种方法结果的符合率，计算试纸条基于IFAT的特异性和敏感性。
1)胶体金试纸条检测
将分别取20倍稀释后的兔、犬、猫血清样品100μl滴加于上述3制备的胶体金试纸条的样品垫上，15min内判定结果。根据图3的判定方法判断是否感染弓形虫。
2)IFAT方法的操作步骤如下：
A.将新鲜释放的弓形虫收集起来，用适量的PBS悬起，滴加于带有吸附孔的载玻片上。待吸附一定时间后，在每孔中滴加预冷的甲醇固定虫体，4℃或-20℃保存。整个实验过程中载玻片均要放置在湿盒内。
B.每个吸附孔滴加3％BSA-PBS 50μl，37℃封闭1h。
C.取1μl待检血清加入到99μl的3％BSA-PBS中，即1:100稀释，混匀，滴加到吸附孔中，37℃孵育1h。同时设置重复组和阴阳性对照组。
D.滴加PBS于吸附孔上，作用3min，期间可轻轻晃动载玻片，随后去除PBS。重复洗涤3-5次。
E.取相应的FITC标记二抗1μl加入到99μl的3％BSA-PBS中，即1:100稀释，混匀，滴加到吸附孔中，37℃孵育1h。从此步骤开始，需保持避光。
E.洗涤步骤同D。
F.在每个吸附孔上滴加抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，可用指甲油进行封片。在荧光显微镜下观察显色情况，判定结果。
上述两种方法的结果如下：
分别用GICA和IFAT检测119份兔血清，结果见下表3。
表3为GICA和IFAT检测119份兔血清
上述+为弓形虫阳性，－为弓形虫阴性。
将表3中数据按照弓形虫感染情况进行统计，结果如下表4，可以看出，检测弓形虫时胶体金试纸条基于IFAT的特异性和敏感性分别为98.92％(92/93)和92.31％(24/26)，总符合率为97.48％。
分别用GICA和IFAT检测103份犬血清，结果见下表4。
表4为GICA和IFAT检测103份犬血清
检测弓形虫时胶体金试纸条基于IFAT的特异性和敏感性分别为97.37％(74/76)和85.19％(23/27)，总符合率为94.17％。
分别用GICA和IFAT两种方法检测106份猫血清，结果见下表5。
表5为GICA和IFAT检测106份猫血清
检测弓形虫时胶体金试纸条基于IFAT的特异性和敏感性分别为91.43％(64/70)和88.89％(32/36)，总符合率为90.57％。
2、交叉反应性
分别取100μl 20倍稀释后的兔新孢子虫阳性血清(已经鉴定过)、兔弓形虫阳性血清、兔阴性血清滴加于实施例2制备的胶体金试纸条上，15min内观察结果。检测兔新孢子虫阳性血清和兔弓形虫阴性血清时只有C线显色，T线不显色，检测兔弓形虫阳性血清时C线和T线均显色，反应良好，见图4(1为兔新孢子虫阳性血清；2兔弓形虫阳性血清；3.兔弓形虫阴性血清。)。说明该试纸条不存在交叉反应性，可以有效地鉴别弓形虫。
3、重复性
随机抽取5批不同批次的上述实施例2制备的胶体金试纸条检测兔、犬、猫弓形虫阳性和阴性血清，每个样品用同一批次中的试纸条检测3次，由下表6可知每种重复结果一致，说明该试纸条重复性良好。
表6为重复性检测
1：“+”表示显色结果正确；“－”表示显色结果错误。

Claims (9)

1.一种检测弓形虫的胶体金试纸条，包括底板和放置在其上的样品垫、包被有金标蛋白的金标垫、含有检测线T和质控线C的检测垫和吸水垫；
所述检测线T由TgGRA1蛋白溶液形成；
所述TgGRA1蛋白为如下a或b：
a)序列表中序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于：
所述TgGRA1蛋白溶液中TgGRA1蛋白的浓度为2mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的胶体金试纸条，其特征在于：
所述金标蛋白为胶体金标记的SPA蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的胶体金试纸条，其特征在于：
所述质控线C由IgG蛋白或IgG蛋白溶液形成；
所述IgG蛋白具体为猪IgG蛋白；
所述猪IgG蛋白溶液的浓度尤其具体为1mg/ml。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述的胶体金试纸条的方法，包括如下步骤：
1)制备包被有金标蛋白的金标垫和含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜；
所述包被有金标蛋白的金标垫按照如下方法制备：将胶体金溶液和SPA蛋白混匀，反应，得到金标蛋白；再将所述金标蛋白加到玻璃纤维素膜上，得到包被有金标蛋白的金标垫；
所述含有检测线T和质控线C的检测垫为将权利要求1-4中任一中的所述TgGRA1蛋白溶液和权利要求4中的所述IgG蛋白溶液分别包被在硝酸纤维素膜上，形成含有检测线T和质控线C的检测垫；
2)将所述包被有金标蛋白的金标垫、样品垫、所述含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜和吸水垫组装到底板上，得到所述胶体金试纸条。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述胶体金溶液和所述SPA蛋白的加入配比为1ml:7μg；
所述胶体金溶液中的胶体金粒径为20nm。
7.权利要求1-4中任一中的所述TgGRA1蛋白或所述TgGRA1蛋白溶液或权利要求1-4中任一所述的胶体金试纸条在制备检测或辅助检测弓形虫产品中的应用。
8.权利要求1-4中任一中的所述TgGRA1蛋白或所述TgGRA1蛋白溶液或权利要求1-4中任一所述的胶体金试纸条在制备检测或辅助检测待测样本或待测动物或待测人是否感染弓形虫产品中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
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