SU533376A1 - Способ получени токсоплазменного антигена - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к области иммунохимии , в частности к способам получени  биологических диагностических препаратов, а именно - антигена дл  серологической диагностики токсоплазмоза.

Известны способы получени  антигенов дл  диагностики токсоплазмоза из инвазионного материала путем экстракции его эфиром н спирт-эфирно-фенольной смесью.

Однако этот способ трудоемок и длителен, при этом антиген, получаемый по известному способу, не дает четких положительных серологических реакций с сыворотками крови спонтанно или экспериментально зараженных токсоплазмой сельскохоз йственных и диких животных.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому изобретению  вл етс  способ, включающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырь , дезинтеграцию клеток токсоплазм ультразвуком и выделение из полученного ультразвукового лизата антигенной фракции изоионным фракционированием .

Однако этот способ также оказалс  неприемлемым дл  получени  антигена из токсоплазм , так как получаемые антигенные препараты про вл ют в серологических реакци х недостаточно выраженную снецифичность:

они дают положительные результаты не только с гомологичными токсоплазменными сыворотками крови, но и с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат здоровых белых мыщей, что указывает на наличие в антигенах балластных веществ, снижающих их активность и специфичность.

Цель изобретени  состоит в разработке экспресс-способа получени  стандартного однородного антигена с высокоактивными и специфическими свойствами, пригодного дл  использовани  в нескольких иммунологических реакци х: в реакции св зывани  комплемента (РСК), реакции непр мой гемагглютинации (РИГА) и реакции  ммунодиффузии в агаровом геле (РП-гель) дл  серологической диагностики токсоплазмоза.

Постановленна  цель достигаетс  тем, что в известном способе, включающем извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырь , дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции изоионным фракционированием , ультразвуковую дезинтеграцию клеток токсоплазм провод т 2-3-х кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изононным фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с последующей очисткой антигенной фракции от

0

неспецифических балластных веществ добавлением к ней а тисыворотки.

Способ получени  антигена заключаетс  в следующем.

Дл  проведени  способа необходимы следующие реактивы и растворы: натрий хлористый (х. ч.), едкий натр (х. ч.), серна  или сол на  кислота (х. ч.), 0,25, 0,5 и 1 н. растворы едкого натра, 0,25, 0,5 « 1 н. растворы серной ИЛИ сол ной кислоты 0,85%-ный раствор хлористого натри  (физиологический раствор).

Получение исходного сырь . Материалом дл  получени  токсоплазменпого антигена служит неритонеальный экссудат белых мыщей, зараженных эталонным щтаммом токсоплазм или одним из вирулентных щтаммов , выделенным от сельскохоз йственных животных. Дл  этого белых мышей весом 16-18 г парти ми по 200-250 голов заражают перитонеальным экссудатом от исходных щтаммных токсоплазменных мыщей. Экссудат дл  заражени  развод т стерильным физиологическим раствором так, чтобы в поле зрепи  микроскопа (увеличение 15X40) были видны 1-3 токсоплазмы. Доза заражени  мыщей- 0,2 мл. На 4-5 день после заражени  мышей наркотизируют эфиром и стерильным шприцом из брюшной нолости извлекают перитонеальный экссудат. Брющную полость каждой мыши дополнительно промывают 0,5 мл физиологического раствора. Собранный материал провер ют на наличие токсоплазм и отсутствие посторонней микрофлоры путем микроскопировани  мазков. После проверки экссудат центрифугируют в стерильных пробирках в течение 30-45 мин при 3-4 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость удал ют. Осадок содержит токсоплазмы и примесь лейкоцитов и гистиоцитов перитонеального экссудата мыщей. Чтобы избавитьс  от этих клеточных балластных компонентов осадок ресуспензируют в 5-10 мл физиологического раствора и затем многократно пропускают через тонкую иглу щприца дл  разрущени  клеточных элементов экссудата. К полученной взвеси добавл ют 10-15 мл физиологического раствора, снова пропускают через иглу шприца и после этого центрифугируют при 2- 3 тыс. об/мин в течение 45-60 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а обработку осадка повтор ют еще 2-3 раза, после чего отмытый осадок токсоплазм пригоден дл  приготовлени  антигена.

Градуированна  дезинтеграци  токсоплазм. Дезинтеграцию осуществл ют в ноле ультразвуковых волн низкочастотного диспергатора (УЗДН) градуированно в три приема: первые две обработки провод т в физиологическом растворе, последнюю - основную - в дистиллированной воде.

В стекл нный сосуд с вод ным охлаждением внос т 1-2 г отмытых токсоплазм, заливают 50-100 мл физиологического раствора и создают в контактной среде ультразвуковые колебани  частотой 22-35 кгц и акустической мощностью 20-50 вт/см в течение 5-10 мин. Взвесь частично разрушенных токсоплазм центрифугируют при В-10 тыс.

об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат I) сливают, а к осадку добавл ют 50-100 мл физиологического раствора и обработку токсоплазм повтор ют также при частоте 22-35 кгц, но мощности 50-75 вт/см

и уже в течение 30-40 мин. Взвесь разрущенных токсоплазм центрифугируют нри 8- 10 тыс. об/мин 15 мин. Надосадочную жидкость (лизат II), представл ющую собой солерастворимую нротоплазматическую часть

токсоплазм, отдел ют от осадка оболочек токсоплазм , который промывают в дистиллированной воде 2-3-х кратным центрифугированием при вышеуказанном режиме. Отмытый осадок ресуспензируют в 20-30 мл дистиллированной воды, среду усредн ют 0,25-0,5 н. раствором едкой щелочи в пределах рН 8,0- 8,2, перенос т в сосуд дл  озвучивани  и обрабатывают ультразвуком частотой 22- 35 КГЦ, мощностью 40-60 вт/см 5-10 мин.

Небольшое количество нерастворившегос  осадка отдел ют от жидкой части центрифугированием .

Полученна  надосадочна  жидкость - водный раствор оболочек токсоплазм (лизат

III)- вл етс  материалом дл  получени  специфического токсоплазменного антигена.

Ультразвуковое изоионпое фокусирование и выделение специфической антигенной фракции. Фракционирование ультразвукового лизата III начинают с фокусировани  балластных фракций , которые могут содержатьс  в лизате при недостаточно полной предварительной очистке токсоплазм и недостаточно- тщательном градуированном разделении токсоплазм ультразвуком на лизат III и неспецифические протоплазматические лизаты I и II. Дл  этого лизат III перенос т в химический стакан на 50-100 мл и подвергают 2-3-минутному воздействию ультразвуковой частотой 22-35 кгц и мощностью 50-75 вт/см (без применени  охлаждающей системы), что приводит к быстрому прогреванию обрабатываемой среды до оптимальной дл  последующего фракционировани  температуры 35-40°С. Электрометрическим титрованием с помощью рН-метра и 0,5-1,0 н. раствора едкого натра лизат III подщелачивают до рН 10,5-11,5, в пределах которых фокусируетс  в виде мелких хлопьев небольшое количество осадка - антигенна  фракци  «А. Дл  полноты осаждени  стакан с лизатом III дополнительно выдерживают в термостате при 37°С 20- 30 мин. Сформировавшийс  осадок отдел ют

15-20-минутным центрифугированием при 8-10 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость (лизат IV) снова прогревают ультразвуком до оптимальной температуры 35-40°С, медленной нейтрализацией 0,5-1,0 н. раствором серной кислоты

довод т рН среды до 9,0-9,5 и фокусируют антигенную фракцию :В:. Лизат IV выдерживают в термостате 20-30 мин, а затем центрифугируют. Из надосадочной жидкости (лизат V) аналогичным образом при рН 6,8- 7,2 осаждают третий осадок - антигенную фракцию «С и получают основной, очищеииый лизат VI, из которого ультразвуковым фракционированием выдел ют ири рН 3,5-5,5 специфическую антигенную фракцию «/). После центрифугировани  специфическую фракцию «D с помощью ультразвука раствор ют в 20-30 мл дистиллированной воды при рН 8,0-8,2 и провод т последующую ее очистку.

Иммунохимическа  очистка специфической антигенной фракции «/) проводитс  с помощью антисыворотки на нативный перитонеальный экссудат белых мыщей (на балластные вещества). Ее получают путем иммунизации кроликов иативиым перитонеальным экссудатом здоровых белых мышей. Мыщам интраиеритоиеально ввод т по 0,2 мл насыщенного раствора хлористого натри . Через 30 мин насыщенный раствор ввод т повторно в дозе 0,4-0,5 мл. По истечении одного часа от момента первого введени  насыщенного раствора мышей наркотизируют, вскрывают и затем из брюшной полости извлекают шприцем экссудат. Собранный материал центрифугируют при 3 тыс. об/мии в течение 30 мин. Полученный материал ввод т 4 раза кроликам в возрастающих дозах с интервалом в 2-3 недели между первой и второй инъекци ми и в одну неделю между последующими (I цикл иммунизации). При первой инъекции материал ввод т в смеси с дополнителем Фрейнда под кожу боковой поверхности туловища кролика. Остальные 2-3 инъекции материала производ т внутримышечно без дополнител  Фрейнда. Реиммунизацию (И цикл иммунизации) провод т через 30-40 дней с момента последнего введени  материала. Она состоит из одной или двух инъекций материала без дополнител  в мышцу бедра с интервалом 4-5 дней между введени ми. На 7, 14 и 21 дни после последнего введени  материала у животных берут кровь и провер ют титр сыворотки в РСК или РП в агаровом геле. Полный цикл иммунизации 4-5 мес цев, иосле чего антисыворотка готова дл  очистки специфической фракции «D.

Специфическую антигенную фракцию «D провер ют на чистоту преципитацией с антисывороткой на нативный перитонеальный экссудат белых мыщей (на балластные вещества ). К пробиркам с прогрессивно уменьшающимс  количеством антигенной фракции (0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мл) добавл ют по 0,5 мл цельной или разведенной (в зависимости от титра) антисыворотки на балластные вендества. Смесь в иробнрках тщательио перемешивают и инкубируют при 37°С в течеиие 1,5-2 час, а затем помещают иа 18-24 час в холодильник при 4°С. Контрол ми служат

антисыворотка и антигеина  фракци  с физиологически .м раствором. Реакци  иа балласт считаетс  положительной, если в одной или нескольких проб1 рках отмечаетс  преципитат (осадок). Если прецииитат отсутствует во всех иробирках (отрицательна  реакци ), то антигенную фракцию сразу же используют в качестве специфического токсоплазменного антигена. В случае поло}кительной реакции (наличи  преципитата) по пробирке с макси .мальным количеством преципитата высчитывают необходимое количество антисыворотки дл  осаждени  балласта и добавл ют ее ко всему объему антигенной фракции. Смесь также инкубируют 1,5-2 час в термостате и выдерживают 18-24 час в холодильнике. Образовавшийс  преципитат отдел ют центрифугированием в течеиие 20-30 мин при 8- 10 тыс. об/мин. Из надосадочной жидкости ультразвуковым изоионным фокусированием при рН 3,5-5,5 выдел ют очищенную специфическую антигенную фракцию.

Приготовление и стандартизаци  т о к с о и л а 3 м е н и о г о антигена. Осадок очищенной от балласта антигенной фракции «D иромывают в дистиллированной воде 2-3-х кратным ультразвуковым растворением при 0,8-8,2 и переосаждением при рИ 3,5-5,5. Отмытый осадок раствор ют в 20-30 у.л дистиллированной воды при рН 8,0-8,2. Этот раствор антигенной фракции  вл етс  специфическим токсоилазменным антигеном .

Стандартизацию антигена провод т по серологической активности титрацией с гиперимунными токсоплазменными сыворотками, Оитимальный рабочий титр антигеиа в РСК и РИГА 1 :20-- 1 :160, а дл  РП в агаровом геле - исходное разведение. Чувствительность токсоплазменного антигена по обнаружению специфических тoкcoплaз :eнныx антител в сыворотке крови гипериммунных, экспериментально зараженных и спонтанно больных животных характеризуетс  в РСК в разведении сыворотки 1 : 5 - i : 640 и в РИГ.4 1 ; 40 - 1 : 2560, а в РП в агаровом геле - одной линией преципитации.

Дл  стабилизации антиген лиофилизируют в рабочем титре с средой. В высушенном виде, в ампулах, он представл ет собой мелкоиористую таблетку белого цвета, легко раствор ющуюс  в дистиллированной воде и физиологическом растворе. Срок годности лиофилизированного антигена 2-3 года .

Приготовлеиный по описанному способу токсоплазменный антиген испытан ко.миссионFO , апробирован в ВГИКИ и в И1ироком производственном опыте и показал высокую специфичность при серолог ческой диагиостике токсоплазмоза.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  токсоплазменного антигена дл  серологической диагностики, вклю7 чающий извлечение и отмывку токсоплазм от клеточных элементов исходного сырь , дезинтеграцию токсоплазм обработкой ультразвуком и выделение антигенной фракции «зоионным фракционированием, отличающийс 5 тем, что, с целью повыщени  специфической активности антигена, ультразвуковую дезинтеграцию клеток токсоплазм провод т 2-38 кратно с отделением лизата оболочек токсоплазм и выделением из него антигенной фракции изоионинм фракционированием при дополнительном воздействии на лизат ультразвуком с последующей очисткой антигенной фракции от неспецифических балластных не ществ добавлением к ней антисыворотки.