PT1749098E - Adenovírus quimérico para utilização no tratamento do cancro - Google Patents

Adenovírus quimérico para utilização no tratamento do cancro Download PDF

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Terry Hermiston
Paul Harden
Irene Kuhn
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Bayer Schering Pharma Ag
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Description

1
DESCRIÇÃO
"ADENOVÍRUS QUIMÉRICO PARA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DO CANCRO"
DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presentemente descrita refere-se, de modo geral, ao campo da biologia molecular e, mais especificamente, a adenovirus oncoliticos com aplicações terapêuticas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é a causa principal de morte nos Estados Unidos e em qualquer outro país. Dependendo do tipo de cancro, este é, normalmente, tratado por meio de cirurgia, quimioterapêutica e/ou radiação. Estes tratamentos falham com alguma frequência e é evidente que são necessárias novas terapêuticas, a ser utilizadas isoladamente ou em combinação com técnicas clássicas.
Uma abordagem tem sido a utilização de adenovirus, ou isoladamente ou como vectores com capacidade de transportar proteínas terapêuticas anti-cancro contra as células tumorais. Os adenovirus são vírus de ADN de cadeia dupla sem envelope icosaédrico com um genoma linear de aproximadamente 36 pares de quilobase. Cada extremidade do genoma virai possui uma sequência curta conhecida como Repetição Terminal Invertida (Inverted terminal repeat -ITR), a qual é necessária para efeitos de replicação virai. Todos os genomas de adenovirus humanos examinados até à data possuem a mesma organização geral; isto é, os genes que codificam funções específicas encontram-se localizados 2 na mesma posição no genoma virai. 0 genoma virai contém cinco unidades de transcrição precoce (EIA, ElB, E2, E3, e E4), duas unidades precoces atrasadas (IX e Iva2), e uma unidade tardia (tardia principal) que é processada para gerar cinco familias de mARNs tardios (L1-L5) . As proteínas codificadas pelos genes precoces estão envolvidas na replicação, enquanto os genes tardios codificam proteínas estruturais virais. As porções do genoma virai podem rapidamente ser substituídas com ADN de origem exógena e os adenovírus recombinantes apresentam-se como estruturalmente estáveis, características que tornam estes adenovírus úteis para terapêutica genética {vide Jolly, D. (1994) Câncer Gene Therapy 1; 51-64).
Actualmente, os esforços de investigação para produzir uma terapêutica adenoviral clinicamente útil têm sido centrados no serotipo adenoviral, Ad5. A genética deste adenovírus humano encontra-se bem caracterizada e os sistemas encontram-se bem descritos no que se refere à sua manipulação molecular. Têm vindo a ser desenvolvidos métodos de produção de elevada capacidade para suportar as aplicações clínicas e algumas experiências clínicas com o agente encontram-se já disponíveis. Vide, Jolly, D. (1994) Câncer Gene Therapy, 1:51-64. A investigação relacionada com a utilização do adenovírus humano (Ad) no tratamento do cancro tem-se focado no desenvolvimento de adenovírus com base em Ad5, os quais possuem uma potência maior na, ou tem preferencialmente como alvo seleccionado tipos de células tumorais específicas e existe assim uma necessidade de gerar vírus oncolíticos mais potentes se o objectivo da terapia adenoviral é encontrar uma aplicação prática numa prática clínica. 3
Ad5 é apenas um dos 51 serotipos adenovirais actualmente conhecidos, os quais são classificados em subgrupos A-F, baseados em vários atributos, incluindo as suas caracteristicas de hemaglutinação {vide, Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)). Estes serotipos diferem a uma variedade de níveis, isto é, patologia em humanos e roedores, receptores celulares utilizados para ligações, mas estas diferenças têm sido grandemente ignoradas como meios potenciais para desenvolver adenovírus oncoliticos mais potentes (com a excepção das alterações de fibra, vide Stevenson et al: (1997) J. Virol. 71:4782- 4790; Krasnykh et al. (1996) J.
Virol. 70:6839-6846; Wickham et al. (1997) J. Virol. 71:8221-8229; Legrand et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:323-329; Barnett et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1- 3:1- 14; Pedido de Patente norte-americana 2003/0017138). A exploração de diferenças entre serotipos adenovirais pode facultar uma fonte de terapêuticas com base em adenovírus mais eficazes, utilizando novos adenovírus com uma selectividade e potência cada vez maior. Existe uma grande necessidade de terapias baseadas em adenovírus melhoradas.
RESUMO DA INVENÇÃO
A presente invenção apresenta novos adenovírus quiméricos úteis para terapias baseadas em vírus. Em particular, a presente invenção apresenta adenovírus quiméricos que com um genoma que inclui uma região E2B em que a região E2B referida inclui uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um primeiro serotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos derivada de 4 um segundo serotipo adenoviral; em que o primeiro e segundo estereotiops adenovirais são, cada um, seleccionados a partir de subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos uns dos outros; e em que o referido adenovírus quimérico é oncolitico e apresenta um indice terapêutico melhorado para uma célula tumoral.
Numa realização, o adenovírus quimérico inclui ainda regiões que codificam proteínas da fibra, do hexão e do pentão, em que os ácidos nucleicos que codificam estas proteínas pertencem todos ao mesmo serotipo adenoviral. Numa outra realização, o adenovírus quimérico da presente invenção inclui uma região E3 ou E4 modificada.
Numa outra realização, o adenovírus quimérico demonstra um índice terapêutico melhorado numa célula tumoral do cólon, mama, pâncreas, pulmão, próstata, ovário ou hemopoiética, numa realização particularmente preferida, o adenovírus quimérico apresenta um índice terapêutico melhorado em células tumorais do cólon.
Numa realização preferida, a região E2B do adenovírus quimérico inclui a SEQ ID NO: 3. Numa realização particularmente preferida, o adenovírus quimérico inclui a SEQ ID NO: 1.
A presente invenção apresenta um adenovírus quimérico recombinante ou uma variante ou derivado do mesmo com um genoma que incluir uma região E2B em que a região E2B referida inclui uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um primeiro serotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um segundo serotipo adenoviral; 5 em que o primeiro e segundo serotipos adenovirais referidos são, cada um, seleccionados a partir de subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos uns dos outros em que o referido adenovirus quimérico é oncolitico e apresenta um índice terapêutico melhorado para uma célula tumoral; e em que o referido adenovirus quimérico foi tornado deficiente em termos de replicação através da delecção de uma ou mais regiões adenovirais codificadoras de proteínas envolvidas na replicação adenoviral seleccionadas a partir do grupo que consiste em El, E2, E3 ou E4.
Numa realização, o adenovirus quimérico da presente invenção inclui ainda um gene heterólogo que codifica uma proteína terapêutica, em que o gene heterólogo referido é expresso dentro de uma célula infectada com o referido adenovirus. Numa realização preferida, a proteína terapêutica é seleccionada a partir do grupo que consiste em citocinas e quimioquinas, anticorpos, enzimas conversoras de pró-fármacos e proteínas imuno-reguladoras. A presente invenção apresenta a utilização de adenovirus quiméricos da invenção para efeitos terapêuticos. Numa realização, o adenovirus quimérico pode ser utilizado para inibir o crescimento das células cancerosas, numa realização particular, um adenovirus quimérico que inclui a SEQ ID NO: 1 é útil para inibir o crescimento de células cancerosas no cólon.
Numa outra realização, os adenovirus da presente invenção são úteis como vectores para transportar as proteínas terapêuticas para as células. 6 A presente invenção apresenta um método para produção de adenovírus quiméricos da invenção, em que o método inclui a) Agrupar os serotipos adenovirais que representam subgrupos adenovirais B-F, deste modo criando uma mistura adenoviral; b) passar a mistura adenoviral agrupada da fase (a) por uma cultura em crescimento activo de células tumorais a uma proporção de partícula para célula suficientemente alta para encorajar à recombinação entre os serotipos, mas não tão elevada que produza a morte prematura da célula c) recolher o sobrenadante da fase (b); d) infectar uma cultura quiescente de células tumorais com o sobrenadante recolhido na fase (c) ; e) recolher o sobrenadante da cultura celular da fase (d) antes da existência de qualquer sinal de CPE; f) infectar uma cultura quiescente de células tumorais com o sobrenadante recolhido na fase (e) ; e g) isolar o adenovírus quimérico a partir do sobrenadante recolhido na fase (f) por purificação em placa,
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Perfis de tempo de retenção de Ad numa coluna TMAE HPLC. A) Perfis de retenção para os esterotipos de Ad individuais que foram utilizados para gerar o agrupamento virai de partida original. B) Perfis de retenção dos agrupamentos da passagem 20 derivados das linhagens celulares HT-29, Panc-1, MDA-231, e PC-3, respectivamente
Figura 2. Actividade citolítica dos agrupamentos individuais de vírus. As células A) HT-29, B) MDA-231, C) 7
Panc-1 e D) PC-3 foram infectadas com os respectivos agrupamentos virais a proporções VP por células de 100 a 0,01. Os ensaios MTS foram realizados em diferentes dias após a infecção (como indicado) dependendo da linhagem celular. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio realizado em quadruplicado e os resultados são expressos como os meios +/- SD. O painel descreve uma experiência representativa e todos os agrupamentos virais foram analisados, pelo menos, três vezes independentes na linhagem celular do tumor alvo (Legenda da figura: —·— Ad5; —agrupamento virai inicial; —agrupamento derivado de célula especifica, passagem 20).
Figura 3. Actividade citolitica de ColoAdl e Ad5 nas linhagens celulares de tumor humano. Foi realizado um ensaio MTS em A) um painel amplo de linhas celulares de tumor humano e B) num painel de linhagens celulares de cancro do cólon para determinar a sua potencial especificidade de potência. O ensaio MTS foi realizado em diferentes dias dependendo da linhagem celular. Cada painel representa uma experiência representativa que foi repetida, pelo menos, três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio realizado em quadruplicado e os resultados são expressos como os meios +/- SD (Legenda da Figura: —·— Ad5; —ColoAdl) .
Figura 4. Actividade citolitica de ColoAdl e Ad5 num painel de células normais. Células hs-27, HUVEC e SAEC (fibroblasto primário, células endoteliais e epiteliais, respectivamente) foram infectadas com ColoAdl e Ad5 em proporções VP por célula de 100 a 0,01. O ensaio MTS foi realizado em diferentes dias após infecção dependendo da célula e cada painel representa uma experiência representativa que foi repetida, pelo menos, três vezes. 8
Cada ponto de dados no painel representa um ensaio realizado em quadriplicado e os resultados são expressos como os meios +/- SD (Legenda da Figura: —·— Ad5; — ColoAdl).
Figura 5. Actividade citolitica de ColoAdl, Ad5 e ONYX-015 em células endoteliais normais primárias (HUVEC) e uma linhagem celular de tumor do cólon (HT-29) Cada painel representa uma experiência representativa que foi repetida, pelo menos, três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio realizado em quadriplicado e os resultados são expressos como os meios +/- SD (Legenda da Figura: —·— Ad5; —ColoAdl; —Onyx-015) .
Figura 6. Actividade citolitica de ColoAdl, Adllp e Ad5 em linhas de células epiteliais normais (SAEC) e uma linhagem celular de cancro do cólon humano (HT-29). Cada painel representa uma experiência representativa que foi repetida, pelo menos, três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio realizado em quadriplicado e os resultados são expressos como os meios +/- SD (Legenda da Figura: —·— Ad5; —0— Adllp;
ColoAdl) .
Figura 7. Actividade Citolitica de Virus Recombinantes Virus recombinantes que representam quatro populações virais (Adpll, ColoAdl, Adllp na extremidade esquerda/CotoAdl na extremidade direita (ColoAdl.1) e ColoAdl na extremidade esquerda /Adllp na extremidade direita (ColoAdl.2)) foram construídas como descrito no Exemplo 6. A actividade citolitica de cada população em células HT29 foi determinada como anteriormente descrito. (Legenda da Figura: 9 —·— Ad5; —Adllp; —ColoAdl; —D— ColoAdl,1; — A—ColoAdl, 2) .
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
Excepto quando definido em contrário, todos os termos técnicos e cientificos utilizados têm um significado igual ao pressuposto por alguém com formação ordinária na técnica da presente invenção. Normalmente, a nomenclatura presentemente utilizada e os procedimentos laboratoriais descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e comummente empregues na técnica.
Tal como presentemente utilizado, o termo "adenovírus", "serotipo" ou "serotipo adenoviral" refere-se a qualquer dos 51 serotipos adenovirais humanos actualmente conhecidos ou isolados no futuro. Vide, por exemplo, Strauss, "Adenovírus Infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, pp. 451-596 (1984) . Estes serotipos são classificados nos subgrupos A-F (vide, Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their
Replication," in Fields Virology, Vol.2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001), Tal como mostrado no Quadro 1.
Quadro 1
Subgrupo Serotipo Adenoviral A 12, 18, 31 B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 51 C 1, 2, 5, 6 10 D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22- 30, 32, 33, 36-39, 42-49, 50 e 4 F 40, 41
Tal como presentemente utilizado, "adenovírus quimérico" refere-se a um adenovirus cuja sequência de ácidos nucleicos consiste em sequências de ácidos nucleicos de, pelo menos, dois dos serotipos adenovirais acima descritos.
Tal como presentemente utilizado, "serotipo adenoviral progenitor" refere-se a um serotipo adenoviral que representa o serotipo a partir do qual deriva a maior parte do genoma do adenovirus quimérico.
Tal como presentemente utilizado, o termo "recombinação homóloga" refere-se a duas moléculas de ácido nucleico, sendo que cada uma possui sequências homólogas, onde as duas moléculas de ácido nucleico se cruzam ou se submetem a recombinação na região de homologia.
Tal como presentemente utilizado, o termo "potência" refere-se ao potencial lítico do vírus e representa a sua capacidade para replicar, lisar e alastrar. Para os efeitos da presente invenção, potência é um valor que estabelece a comparação da actividade citolitica de um determinado adenovírus da invenção com a de Ad5 na mesma linhagem celular, isto é, potência = IC50 de AdX/IC50 de Ad5, em que X é o serotipo adenoviral particular que é examinado e em que à potência de Ad5 é atribuído um valor de 1. 11
Tal como presentemente utilizado, o termo "vírus oncolítico" refere-se a um vírus que mata preferencialmente células cancerosas comparativamente às células normais.
Tal como presentemente utilizado, o termo "índice terapêutico" ou "janela terapêutica" refere—se a um número que indica o potencial oncolítico de um determinado vírus e é determinado ao se dividir a potência do adenovírus numa linhagem celular cancerosa pela potência do mesmo adenovírus numa linhagem celular normal (isto é, não-cancerosa) .
Tal como presentemente utilizado, o termo "modificado" refere-se a uma molécula com uma sequência de nucleótidos ou sequência de aminoácidos que difere de uma sequência que ocorre naturalmente, por exemplo, sequência de nucleótidos ou sequência de aminoácidos do tipo selvagem. Uma molécula modificada pode reter a função ou actividade de uma molécula do tipo selvagem, isto é, um adenovírus modificado pode reter a sua actividade oncolítica. As modificações incluem mutações para os ácidos nucleicos como abaixo descrito.
Tal como presentemente utilizado, o termo "mutação" com referência a um polinucleótido ou polipeptídeo, refere-se a uma mudança sintética, recombinante ou química de ocorrência natural ou diferença relativamente à estrutura primária, secundária ou terciária de um polinucleótido ou polipeptídeo, comparativamente a um polinucleótido ou polipeptídeo de referência, respectivamente (por exemplo, quando comparado com um polinucleótido ou polipeptídeo do tipo selvagem). As mutações incluem estas mudanças como, por exemplo, delecções, inserções ou substituições. 12
Os polinucleótidos e polipeptídeos onde se verificam estas mutações podem ser isolados ou gerados utilizando métodos bem conhecidos na técnica.
Tal como presentemente utilizado, o termo "delecção" é definido como uma mudança tanto nas sequências de polinucleótidos como de aminoácidos nas quais um ou mais residuos polinucleótidos ou de aminoácidos, respectivamente, se encontram ausentes.
Tal como presentemente utilizado, "inserção" ou "adição" significam aquela mudança numa sequência de polinucleótido ou de aminoácido, a qual resultou na adição de um ou mais residuos de polinucleótidos ou de aminoácidos, respectivamente, quando comparando com a sequência de polinucleótidos ou de aminoácidos que ocorre de modo natural.
Tal como presentemente utilizado, o termo "substituição" resulta da substituição de um ou mais polinucleótidos ou aminoácidos por diferentes, respectivamente.
Tal como presentemente utilizado, o termo "derivado adenoviral" refere-se a um adenovirus da presente invenção que foi modificado de modo a que uma adição, delecção ou substituição tenha sido feita para ou no genoma virai, de modo a que o derivado adenoviral resultante exiba uma potência e/ou indice terapêutico maior do que o do adenovirus progenitor, ou, de uma outra forma, é terapeuticamente mais útil (isto é, menos imunogénica, perfil de clearance melhorado). Por exemplo, um derivado de um adenovirus da presente invenção pode ter uma delecção num dos genes precoces do genoma virai, incluindo, mas não se limitando, à região ElA ou E2B do genoma virai. 13
Tal como presentemente utilizado, o termo "variante" com referência a um polinucleótido ou polipeptideo, refere-a um polinucleótido ou polipeptideo que pode variar numa estrutura primária, secundária ou terciária, comparativamente a um polinucleótido ou polipeptideo de referência, respectivamente (por exemplo, quando comparado com um polinucleótido ou polipeptideo do tipo selvagem). Por exemplo, a sequência de aminoácidos ou de ácido nucleico pode conter uma mutação ou modificação que difira de uma sequência de aminoácidos ou de ácidos nucleicos de referência. Em algumas realizações, uma variante adenoviral pode ser uma isoforma ou polimorfismo diferente. As variantes podem ser polinucleótidos ou polipeptideos sintéticos, recombinantes que ocorrem naturalmente ou quimicamente modificados isolados ou gerados por meio de métodos bem conhecidos na técnica. As mutações na sequência de polinucleótidos da variante podem ser silenciosas. Isto é, estas não podem alterar os aminoácidos codificados pelo polinucleótido. Onde as alterações se limitam a mutações silenciosas deste tipo, uma variante irá codificar, como a referência, um polipeptideo com mesma sequência de aminoácido. Alternativamente, estas mudanças na sequência de polinucleótidos da variante podem alterar a sequência de aminoácido de um polipeptideo codificado pelo polinucleótido de referência, resultando em mutações de aminoácidos conservadoras ou não conservadoras, tal como abaixo descrito. Estas mutações de polinucleótidos podem resultar em substituições, adições, delecções, fusões e truncagens de aminoácidos, no polipeptideo codificado pela sequência de referência. Várias substituições de codões, tais como mutações silenciosas que produzem vários locais de restrição, podem ser introduzidas para optimizar a 14 clonagem num vector plasmídeo ou virai ou expressão num determinado sistema procariota ou eucariota.
Tal como presentemente utilizado, o termo "variante adenoviral " refere-se a um adenovirus, cuja sequência de polinucleótidos difere de um polinucleótido de referência, por exemplo, um adenovirus do tipo selvagem, tal como acima descrito. As diferenças são limitadas de modo a que as sequências de polinucleótidos do progenitor e da variante sejam, de modo global, semelhantes, na maioria das regiões, e idênticas. Tal como presentemente utilizado, diz-se que uma primeira sequência de nucleótidos ou de aminoácidos é "semelhante" a uma segunda sequência, quando se estabelece uma comparação entre as duas sequências e se verifica que ambas têm poucas diferenças a nivel de sequência (isto é, a primeira sequência e a segunda sequência são extremamente idênticas). Tal como presentemente utilizado, as diferenças da sequência de polinucleótidos presentes entre a variante adenoviral e o adenovirus de referência não originam uma diferença na potência e/ou indice terapêutico.
Tal como presentemente utilizado, o termo "conservador" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente com características químicas semelhantes. Substituições de aminoácidos conservadoras incluem a substituição de uma leucina por um isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato, ou uma treonina por uma serina. As inserções ou delecções encontram-se tipicamente na ordem de aproximadamente a a 5 aminoácidos.
Tal como presentemente utilizado, o termo "não conservador" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente com características químicas diferentes. Substituições não 15 conservadoras incluem, mas não se limitam a, ácido aspártico (D), substituído por glicina (G); aspargina (N), substituída por lisina (K); ou alamina (A) substituída por arginina (R).
Os códigos de uma única letra para os resíduos de aminoácidos incluem os seguintes: A = alanina, R = arginina, N = asparagina, D = ácido aspártico, C cisteína, 0 = glutamina, E = ácido glutâmico, G = glicina, H = histidina, I = isoleucina, L = leucina, K = lisina, M = metionina, F = fenilalanina, P = prolina, S = serina, T = treonina, W = triptofano, Y = tirosina, V = valina.
Será apreciado que os polipeptídeos contêm frequentemente aminoácidos que não os 20 aminoácidos comummente referidos como os 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente e que, muitos aminoácidos podem ser modificados num determinado polipeptídeo seja por processos naturais, tais como glicosilação e outras modificações pós-traducionais, seja por técnicas de modificação química, as quais são bem conhecidas na técnica. Até mesmo as modificações comuns que ocorrem naturalmente nos polipeptídeos são demasiado numerosas para se indicarem aqui de forma exaustiva, mas, no entanto, encontram-se bem descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em literatura de investigação volumosa, e são bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Entre as modificações conhecidas, as quais podem estar presentes nos polipeptídeos da presente invenção, encontram-se, indicando apenas algumas a título ilustrativo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, junção covalente de flavina, junção covalente de uma fracção heme, junção covalente de um derivado de polinucleótido ou polipeptídeo, junção covalente 16 fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfureto, demetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicação, glicosilação, formação de âncoras GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada pela transferência de ARN de aminoácidos para proteínas, tais como arginilação e ubiquitinação.
Estas modificações são bem conhecidas pelos especialistas na técnica e têm sido descritas em grande detalhe na literatura científica. Algumas modificações particularmente comuns, glicosilação, junção lípida, sulfação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação, por exemplo, são descritas nos textos mais básicos, tais como, por exemplo, I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., W.H. Freeman and Company, New York, 1993. Existem, disponíveis, muitas revisões detalhadas sobre este tema, por exemplo, as facultadas por Wold, F., em Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12,1983; Seifter et al., Meth. Enzymol 182:626-646,1990 e Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sei. 663: 48-62, 1992.
Será apreciado, assim como é bem conhecido e tal como acima indicado, que os polipeptídeos não são sempre completamente lineares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser ramificados como um resultado de ubiquitinação e podem ser circulares, com ou sem ramificações, normalmente como um resultado de eventos pós-traducionais, incluindo eventos 17 de processamento natural e eventos ocorridos por manipulação humana, os quais não ocorrem naturalmente. Os polipeptideos circulares, ramificados e circulares ramificados podem ser sintetizados por processos naturais não-traducionais e também por métodos completamente sintéticos.
As modificações podem ocorrer em qualquer lugar do polipeptídeo, incluindo a estrutura peptídica, as cadeias simples de aminoácidos e os terminais amino ou carboxilo. De facto, o bloqueio do grupo amino ou carboxilo num polipeptídeo, ou ambos, por uma modificação covalente, é comum em polipeptideos que ocorrem naturalmente e sintéticos, sendo que estas modificações podem também encontrar-se presentes em polipeptideos da presente invenção. Por exemplo, o resíduo de terminal amino dos polipeptideos produzido em E.coli, antes do processamento proteolítico, irá quase invariavelmente ser N-formilmetionina.
As modificações que ocorrem num polipeptídeo irão frequentemente ser uma função de como o mesmo é produzido. Para os polipeptideos produzidos por expressarem um gene clonado num hospedeiro, por exemplo, a natureza e dimensão das modificações serão, em grande parte, determinadas pela capacidade de modificação pós-traducional da célula hospedeira e os sinais de modificação presentes na sequência de aminoácidos do polipeptídeo. Por exemplo, tal como é bem conhecido, a glicosilação não ocorre em bactérias hospedeiras, tais como E. coli. Consequentemente, quando se pretende a glicosilação, um polipeptídeo deverá expressar um hospedeiro glicosilante, normalmente uma célula eucariota, as células de insectos realizam frequentemente os mesmos glicosilados pós-traducionais como 18 as células de um mamífero e, por este motivo, os sistemas de expressão de células de insectos têm sido desenvolvidas para expressar de modo eficaz as proteínas mamíferas que possuem padrões nativos de glicosilação, inter alia. Considerações semelhantes aplicam-se a outras modificações.
Será apreciado que o mesmo tipo de modificação possa estar presente para o mesmo ou diferente grau em diversos locais num determinado polipeptídeo. Igualmente, um determinado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações.
Tal como presentemente utilizado, os termos que se seguem são utilizados para descrever as relações de sequência entre duas ou mais sequências de polinucleótidos ou aminoácidos. "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência", "identidade substancial", "similaridade" e "homólogo". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida utilizada como uma base para uma comparação de sequência pode se o subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de um cADN de integral ou sequência genética apresentada numa listagem de sequências ou pode incluir um cADN ou sequência genética completa. Normalmente, uma sequência de referência é, pelo menos, 18 nucleótidos ou 6 aminoácidos em comprimento, frequentemente pelo menos 24 nucleótidos ou 8 aminoácidos em comprimento e frequentemente pelo menos 48 nucleótidos e 16 aminoácidos. Considerando que duas sequências de polinucleótidos ou de aminoácidos podem, cada uma, (1) incluir uma sequência (isto é, uma porção da sequência de nucleótidos ou de aminoácidos completa) que seja semelhante entre as duas moléculas, e (2) possa ainda incluir uma sequência que seja divergente entre as duas sequências de 19 polinucleótidos ou de aminoácidos, comparações de sequência entre duas (ou mais) moléculas são tipicamente realizadas por sequências de comparação das duas moléculas sobre uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequências. Uma "janela de comparação", tal como presentemente utilizada, refere-se a um segmento conceptual de, pelo menos, 18 posições de nucleótidos contíguos ou 6 aminoácidos, em que uma sequência de nucleótidos ou de aminoácidos pode ser comparada com uma sequência de referência de, pelo menos, 18 sequências de nucleótidos ou 6 aminoácidos contíguos e, em que a porção da sequência de polinucleótidos na janela de comparação pode incluir adições, delecções, substituições e semelhantes (isto é, gaps) de 20 por cento ou menos comparativamente à sequência de referência (a qual não inclui adições ou delecções) para um alinhamento ideal das duas sequências. O alinhamento ideal de sequências para efeitos de alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido, por exemplo, pela homologia do algoritmo local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo alinhamento homólogo do algoritmo de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela procura de método de similaridade de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no fíisconsin Genetics Software Package, release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, wis.), VectorNTl da informatix, Geneworks, ou Mac Vector software packages), ou por inspecção e é seleccionado o melhor alinhamento (isto é, resultando na percentagem mais elevada de homologia sobre a janela de comparação) gerada pelos vários métodos. 20
Tal como presentemente utilizado, o termo "identidade de sequência" significa que duas sequências de polinucleótidos ou aminoácidos são idênticas (isto é, numa base nucleótido-a-nucleótido ou residuo-a-residuo) sobre a janela de comparação. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculado por comparação das duas sequências idealmente alinhadas sobre a janela de comparação, determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U, ou I) ou resíduo ocorre em ambas as sequências para se obter o número de posições adaptadas, dividindo o número de posições adaptadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho da janela), e multiplicando o resultado por 100 para se obter a percentagem de identidade de sequência. Os termos "identidade substancial", tal como presentemente utilizado, designa uma característica de uma sequência de polinucleótido ou aminoácido, em que o polinucleótido ou aminoácido inclui uma sequência que tem, pelo menos, uma identidade de sequência de 85%, preferencialmente, mais usualmente de, pelo menos, uma identidade de sequência de 90 a 95%, mais normalmente, pelo menos, uma identidade de sequência de 99% comparativamente a uma sequência de referência sobre uma janela de comparação de, pelo menos, 18 posições de nucleótidos (6 aminoácidos), frequentemente sobre uma janela de, pelo menos, 24-48 posições de nucleótidos (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade de sequência é calculada ao se comparar a sequência de referência com a sequência que pode incluir delecções ou adições que totalizam 20 por cento ou menos da sequência de referência 21
Sobre a janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subgrupo de uma sequência maior. 0 termo "similaridade", quando utilizado para descrever um polipeptideo, é determinado ao se comparar a sequência de aminoácido com os substitutos de aminoácido conservador de um polipeptideo para a sequência de um segundo polipeptideo. 0 termo "homologo", quando utilizado para descrever um polinucleótido, indica que dois polinucleótidos, ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhadas e comparadas, são idênticas, com inserções ou delecções de nucleótidos apropriadas em, pelo menos, 70% dos nucleótidos, normalmente de aproximadamente 75% a 99% e mais preferencialmente, pelo menos, aproximadamente 98 a 99% dos nucleótidos.
Tal como presentemente utilizado, o termo "homologo", quando utilizado para descrever um polinucleótido, indica que dois polinucleótidos, ou sequências designadas dos mesmos, quando idealmente alinhadas e comparadas, são idênticas, com inserções ou delecções de nucleótidos apropriadas em, pelo menos, 70% dos nucleótidos, normalmente de aproximadamente 75% a 99% e mais preferencialmente, pelo menos, aproximadamente 98 a 99% dos nucleótidos.
Tal como presentemente utilizado, "reacção em cadeia da polimerase" ou "PGR" refere-se a um procedimento em que elementos específicos de ADN são amplificados como descrito na patente norte-americana No. 4,683,195. Normalmente, a informação de sequência das extremidades do fragmento do polipetideo de interesse ou mais além necessita de estar disponível, de modo a que os iniciadores oligonucleótidos possam ser desenhados; estes iniciadores irão apontar um para o outro e serão idênticos ou semelhantes em sequência 22 a cadeias opostas do modelo a ser amplificado. Os nucleótidos 5' terminais dos dois iniciadores irão coincidir com as extremidades do material amplificado. Pode ser empregue PCR para amplificar sequências de ADN especificas de ADN genómico total, o cADN transcrito a partir de ARN celular total, sequências plasmidicas, etc. (vide em geral Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NI, 1989) .
Tal como presentemente utilizado, "rigor" ocorre tipicamente numa escala entre cerca de Tm (temperatura de fusão) - 5o C (5o abaixo da Tm da sonda) até cerca de 20° C a 25° C abaixo da Tm. Os peritos na técnica subentenderão que pode ser utilizada uma hibridação rigorosa para identificar ou detectar sequências de polinucleótidos idênticas ou para identificar ou detectar sequências de polinucleótidos similares ou relacionadas. Tal como presentemente utilizado, o termo "condições de rigor" significa que a hibridação irá ocorrer apenas se houver uma identidade de pelo menos 95% e de preferência pelo menos 97% entre as sequências.
Tal como presentemente utilizado, "hibridação" incluirá "qualquer processo por meio do qual uma cadeia de polinucleótidos se une a uma cadeia complementar através de emparelhamento de bases" (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nova Iorque, N.I., 1994).
Tal como presentemente utilizado, o termo "dose com eficácia terapêutica" ou "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de adenovírus que melhora os sintomas ou condições de uma doença. Uma dose é considerada dose com eficácia terapêutica no tratamento do cancro ou respectivas metástases quando o tumor ou excrescência metástica é 23 retardada ou travada ou se constata a redução do tamanho do tumor ou metástase de forma a conduzir a um prolongamento da esperança de vida do sujeito.
Adenovirus da invenção A presente invenção apresenta adenovirus quiméricos com um genoma em que a sequência de nucleótidos da região EB2 do adenovirus quimérico compreende sequências de ácidos nucleicos derivadas de pelo menos dois serotipos adenovirais, serotipos esses que são cada um seleccionado dos subgrupos adenovirais B, C, D, E e F e são distintos entre si. Um adenovirus quimérico da invenção é oncolitico e apresenta um índice terapêutico melhorado para uma célula tumoral.
Isolamento de Adenovirus Quiméricos
Os adenovirus quiméricos da invenção podem ser produzidos utilizando uma modificação de uma técnica designada "bio-selecção", na qual um adenovirus com propriedades desejadas, tal como maior oncogenicidade ou especificidade para um tipo de célula, é gerado através da utilização de selecção genética sob condições controladas (Yan et al. (2003) J. Virol. 77:2640-2650).
Na presente invenção, reúne-se uma mistura de adenovirus de vários serotipos que é passada, de preferência pelo menos duas vezes, numa cultura subconfluente de células tumorais a uma proporção de partícula para célula suficientemente elevada para encorajar a recombinação entre serotipos, porém não tão elevada que provoque morte celular prematura. Uma proporção de partícula para célula preferida é de, aproximadamente, 500 partículas por célula e é facilmente determinada por um perito na técnica. Tal como presentemente utilizado, uma 24 "cultura subconfluente" de células refere-se a uma monocamada ou cultura suspensa na qual as células se encontram em crescimento activo. Para células que crescem em monocamada, poderia ser apontada como exemplo uma cultura em que aproximadamente 50% a 80% da área disponível para crescimento celular se encontra coberta de células. É preferida uma cultura em que aproximadamente 75% da área de crescimento se encontra coberta de células.
Numa forma de realização preferida, a mistura adenoviral inclui serotipos adenovirais representativos dos subgrupos adenovirais B, C, D, E e F. Os adenovírus do grupo A não estão incluídos na mistura uma vez que estão associados à formação de tumores em roedores. As linhas celulares tumorais preferidas, úteis no processo de bio--selecção incluem, sem constituir limitação, as que são derivadas de tumores da mama, cólon, pâncreas, pulmão e próstata. Alguns exemplos de linhas celulares de tumores sólidos úteis para a passagem "bio-selectiva" da mistura adenoviral incluem, sem constituir limitação, células MDA231, HT29, PAN-1 e PC-3. As linhas celulares hematopoiéticas incluem, sem constituir limitação, as células B linfóides de linhagens Raji e Daudi, células eritroblastóides K562, células mielóides U937 e células linfóides T HSB2.
Os adenovírus produzidos durante estas passagens iniciais são utilizados para infectar células tumorais quiescentes a uma proporção de partícula para célula suficientemente baixa para permitir a infecção de uma célula por não mais de um adenovírus. Ao fim de, no máximo, 20 passagens nestas condições, o sobrenadante da última passagem é recolhido antes do efeito citopático visível (CPE, vide Fields Virology, Vol.2, 4a Edição, Knipe, ea., 25
Lippincott Williams & Wilkins, pp. 135-136) para aumentar a selecção de virus altamente potentes. 0 sobrenadante recolhido pode ser concentrado por meio de técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. Um método preferido para alcançar as células quiescentes, isto é, aquelas em que o crescimento celular activo parou, numa cultura em monocamada consiste em permitir o crescimento da cultura durante 3 dias após atingir a confluência, significando "confluência" que a totalidade da área disponível para o crescimento celular está ocupada (coberta com células). De modo similar, as culturas em suspensão podem ser desenvolvidas até atingirem densidades caracterizadas pela ausência de crescimento celular activo. 0 perfil de serotipo do sobrenadante que contém o conjunto adenoviral bio-seleccionado, pode ser examinado mediante medição dos tempos de retenção do conjunto virai recolhido numa coluna de permuta aniónica, em que se sabe que os diferentes serotipos adenovirais possuem tempos de retenção caracteristicos (Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062); vide Exemplo 3, figuras IA e 1B. Os adenovirus da invenção podem ser isolados do sobrenadante concentrado mediante diluição e purificação em placa ou outras técnicas bem conhecidas na técnica e cresceram para caracterização mais aprofundada. As técnicas são bem conhecidas na técnica são utilizadas para determinar a sequência dos adenovirus quiméricos isolados (ver exemplo 5) .
Um exemplo de um adenovirus quimérico da invenção é o adenovirus quimérico ColoAdl, o qual foi isolado utilizando células do cólon HT29 no processo de bio-selecção. ColoAdl possui a sequência de ácidos nucleicos da SEQ id N°: 1. A maioria da sequência de nucleótidos do ColoAdl é idêntica à 26 sequência de nucleótidos do serotipo Adll (SEQ ID NO: 2) (Stone et al. (2003) Virology 309:152- 165; Mei et al. (2003) J. Gen. Virology 84:2061-2071). Existem duas delecções na sequência de nucleótidos ColoAdl em comparação com Adll, um de 2444 pares de bases de comprimento na região da unidade de transcrição E3 do genoma (pares de bases 27979 a 30423 da SEQ ID NO: 2) e uma segunda delecção menor, de 25 pares de bases de comprimento (pares de bases 33164 a 33189 da SEQ ID NO: 2) no gene E4 ou f4. A região da unidade de transcrição E2B (SEQ ID NO: 3) de ColoAdl, que codifica a polimerase do ADN das proteínas adenovirais e proteína terminal, encontra-se localizada entre os pares de bases 5067 e 10354 da SEQ ID NO: 1 e consiste numa área de recombinação homóloga entre os serotipos Adll e Ad3. Nesta região de ColoAdl existem 198 alterações de pares de bases em comparação com a sequência Adll (SEQ ID NO: 1). As alterações são o resultado de troços de nucleótidos na região E2B de ColoAdl que são homólogas da sequência numa porção da região E2B de Ad3 (SEQ ID NO: 8), possuindo o troço mais comprido de homologia entre ColoAdl e Ad3 414 bp de comprimento. A região E2B de ColoAdl (SEQ ID NO: 3) confere uma potência maior ao adenovírus ColoAdl em comparação com os adenovírus Adll sem modificação (vide exemplo 6; fig. 7). Noutras formas de realização, um adenovírus quimérico da invenção pode compreender sequências de ácidos nucleicos de mais de dois serotipos adenovirais.
Um adenovírus quimérico da invenção pode ser avaliado quanto à sua selectividade num tipo de tumor específico mediante exame do seu potencial lítico num painel de células tumorais derivadas do mesmo tecido, o qual foi inicialmente passado pelo agrupamento adenoviral. Por 27 exemplo, o adenovírus ColoAdl (SEQ ID NO: 1), que foi derivado inicialmente de um agrupamento adenoviral passado em linhas celulares de tumor do cólon HT-29, foi reexaminado tanto em células HT-29 e num painel de outras linhas celulares de tumor derivadas do cólon, incluindo DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48 e Colo320DM (vide figura 3B) . Quaisquer linhas celulares de tumor do cólon são igualmente úteis para esta avaliação. Os clones adenovirais isolados dos agrupamentos adenovirais seleccionados noutros tipos de células tumorais podem ser testados de modo similar num painel de células tumorais adequado, incluindo, mas sem constituir limitação, linhas celulares da próstata (por exemplo, linhas celulares DU145 e PC-3); linhas celulares do pâncreas (por exemplo, as linhas celulares MDA231) e linhas celulares dos ovários (por exemplo linhagem de células OVCAR-3). Outras linhas celulares tumorais existentes são igualmente úteis no isolamento e identificação de adenovírus da invenção.
Os adenovírus quiméricos da invenção possuem um índice terapêutico aumentado em comparação com os serotipos adenovirais dos quais foram derivados, (vide figura 6, que compara a actividade citolítica do adenovírus quimérico ColoAdl com ADllp). A invenção engloba também adenovírus quiméricos que são construídos utilizando técnicas recombinantes bem conhecidas dos peritos na técnica. Estes adenovírus quiméricos compreendem uma região de sequência de nucleótidos derivada de um serotipo adenoviral que está incorporado mediante técnicas recombinantes no genoma de um segundo serotipo adenoviral. A sequência incorporada confere uma propriedade, por exemplo especificidade tumoral ou potência intensificada, ao serotipo adenoviral 28 progenitor. Por exemplo, a região E2B de ColoAdl (SEQ ID NO: 3) pode ser incorporada no genoma de Ad35 ou Ad9.
Derivados Adenovirais A invenção engloba também e descreve um adenovirus quimérico da invenção que é modificado para proporcionar outros adenovirus quiméricos úteis do ponto de vista terapêutico. As modificações incluem, sem constituir limitação, as seguidamente descritas.
Uma modificação descrita consiste na produção de derivados do adenovirus quimérico com uma substancial falta de capacidade para ligar p53 em resultado de uma mutação no gene adenoviral que codifica a proteína E1B-55K. Estes vírus possuem parte ou a totalidade da região E1B-55K eliminada {vide, patente norte-americana n° 5,677,178) A patente norte-americana n° 6,080,578 descreve, entre outros aspectos, mutantes Ad5 que possuem delecções na região da proteína E1B-55K, que é responsável pela ligação p53. Outras modificações dos adenovirus quiméricos consistem em mutações na região EIA, como descrito nas patentes norte-americanas n°. 5,801,029 e 5,972,706. Estes tipos de modificações proporcionam derivados dos adenovirus quiméricos da invenção com maior selectividade para células tumorais.
Um exemplo de uma modificação abrangida pela invenção consiste num adenovirus quimérico que exibe um maior grau de especificidade tecidular devido à colocação de replicação virai sob o controlo de um promotor específico de um tecido, como descrito na patente norte-americana n° 5,998,205. A replicação de um adenovirus quimérico da invenção pode ainda ser colocada sob o controlo de um elemento de resposta E2F, como descrito no pedido de patente norte-americana n° 09/714,409. Esta modificação 29 proporciona um mecanismo de controlo da replicação virai baseado na presença de E2F, que resulta numa maior especificidade para tecido tumoral e é distinto do controlo realizado por um promotor especifico do tecido. Nestas duas realizações, o promotor especifico do tecido e o elemento de resposta E2F encontram-se ligados operacionalmente a um gene adenoviral que é essencial para a replicação do adenovirus.
Outra modificação abrangida pela invenção consiste no uso de um adenovirus quimérico da invenção, por exemplo, ColoAdl, como estrutura básica para a produção de novos vectores adenovirais deficientes em termos de replicação. Como descrito em Lai et al. ((2002) DNA Cell Bio. 21:895-913), os vectores adenovirais que são deficientes em termos de replicação podem ser utilizados para produzir e expressar genes terapêuticos. São presentemente apresentados, ambos os vectores de primeira geração (nos quais as regiões El e E3 se encontram eliminadas) e de segunda geração (nos quais a região E4 se encontra adicionalmente eliminada), derivados dos adenovirus quiméricos da invenção. Estes vectores são facilmente produzidos utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica (vide Imperiale e Kochanek (2004) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 273:335-357; Vogels et al. (2003) J. Virol. 77:8263-8271).
Uma outra modificação abrangida pela invenção consiste na inserção de um gene heterólogo, útil como marcador ou relator para registo da eficiência da infecção virai. Uma realização deste tipo de modificação consiste na inserção do gene da timidina quinase (thymidine kinase - TK) . A expressão de TK em células infectadas pode ser utilizada para detecção do nível de vírus que fica nas células após 30 infecção virai, utilizando substratos com radiomarcaçao na reacção TK (Sangro et al (2002) Mol imaging Biol 4:27-33).
Os métodos para a reconstrução dos adenovirus quiméricos modificados são geralmente conhecidos na técnica. Vide, Mittal, S. K. (1993) Vírus Res. 28:67-90 e Hermiston, T. et al. .(1999) Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press. São empregues técnicas padrão para os métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de polinucleótidos e cultura e transformação microbiana (por exemplo electroporação, lipofecção). Em geral, as reacções enzimáticas e fases de purificação são executadas de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e procedimentos são geralmente executados de acordo com métodos convencionais na técnica e várias referências gerais [vide em geral, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I.) que são apresentada ao longo deste documento. A nomenclatura presentemente utilizada e os procedimentos laboratoriais na química analítica, química de síntese orgânica e formulação farmacêutica seguidamente descritos são bem conhecidos e vulgarmente empregues na técnica.
Determinação do Potencial Terapêutico
Os adenovirus quiméricos da invenção podem ser avaliados quanto à sua utilizada mediante exame do seu potencial lítico em células tumorais derivadas de tecidos de interesse como alvos terapêuticos. As linhas celulares úteis para testes destes adenovirus incluem, sem constituir limitação, linhas celulares do cólon, incluindo, sem constituir limitação, linhas celulares DLD-1, HCT116, HT29, LS1034 e SW48; linhas celulares da próstata, incluindo sem 31 constituir limitação, as linhas celulares DU145 e PC-3; linhas celulares pancreáticas, incluindo sem constituir limitação, as linhas celulares Panc-1; linhas celulares de tumores da mama, incluindo sem constituir limitação, as linhas celulares MDA231 e linhas celulares de ovário, incluindo sem constituir limitação a linhagem de células OVCAR-3. As linhas celulares hematopoiéticas incluem, sem constituir limitação, as células B linfóides de linhagens Raji e Daudi, células eritroblastóides K562, células mielóides U937 e células linfóides T HSB2. Pode ser utilizada qualquer outra linhagem de células que esteja disponível para a avaliação e identificação de adenovírus da invenção, destinados a utilização no tratamento da neoplasia. A actividade citolitica dos adenovirus da invenção pode ser determinada em linhas celulares tumorais representativas e os dados podem ser convertidos numa medição da potência, utilizando-se como padrão um adenovirus pertencente ao subgrupo C, de preferência Ad5 (isto é, dada uma potência de 1) . Um método preferido de determinação da actividade citolitica consiste numa análise MTS (vide exemplo 4, figura 2). 0 índice terapêutico de um adenovírus da invenção numa linhagem de células específica pode ser calculado por meio de comparação da potência do dado adenovírus numa linhagem de células de tumor com a potência do mesmo adenovírus numa linhagem de células não-cancerosas. As linhas celulares preferidas são as células SAEC, de origem epitelial, e as células HUVEC, de origem endotelial {vide, figura 4) . Estes dois tipos de células representam células normais das quais são derivados órgãos e vasculatura, respectivamente e são representativas de locais prováveis de toxicidade durante a 32 terapêutica adenoviral, conforme o modo de aplicação do adenovirus. No entanto, a prática da invenção não se encontra limitada à utilização destas células e podem igualmente ser empregues outras linhas celulares não-cancerosas (por exemplo, células B, células T, macrófagos, monócitos, fibroblastos).
Os adenovirus da invenção podem ainda ser avaliados quanto à sua capacidade de seleccionar como alvo crescimento celular neoplásico (isto é cancro) através da capacidade destas para reduzir a tumorigénese ou carga de células neoplásicas em ratinhos nude com um transplante de células neoplásicas, em comparação com ratinhos sem tratamento com uma carga de células neoplásicas equivalente (vide exemplo 7). A avaliação dos adenovirus da invenção pode ainda ser efectuada utilizando explantes de tumores humanos primários (Lam et al. (2003) Câncer Gene Therapy; Grill et al. (2003) Mot. Therapy 6:609- 614), os quais proporcionam condições de ensaio presentes em tumores que não podem normalmente ser produzidas utilizando os estudos com xenoenxertos de tumores.
Utilidade Terapêutica A presente invenção proporciona a utilização de adenovirus quiméricos da invenção para a inibição do desenvolvimento de células tumorais, bem como a utilização de vectores adenovirais derivados destes adenovirus quiméricos para transportar proteínas terapêuticas úteis no tratamento de neoplasias e outros estados patológicos.
Composições farmacêuticas e Administração A presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que compreendem os adenovirus quiméricos da 33 invenção formulados para administração terapêutica a um doente. Para uso terapêutico, é administrada uma composição estéril contendo uma dose farmaceuticamente eficaz de adenovírus a um doente humano ou doente veterinário não--humano para tratamento, por exemplo de uma condição neoplásica. Em geral, a composição incluirá cerca de 1011 ou mais partículas de adenovírus numa suspensão aquosa. É frequentemente empregue um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável em composições estéreis destas. Pode ser empregue uma variedade de soluções aquosas, por exemplo água, água tamponada, soro fisiológico a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e normalmente livres de matéria particulada que não o vector adenoviral desejado. As composições podem conter substâncias adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, como necessário para aproximar às condições fisiológicas, tais como ajuste do pH e agentes tampão, agentes de ajuste da toxicidade e semelhantes, por exemplo acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. Podem ser incluindos excipientes que intensifiquem a infecção das células pelos adenovírus (vide patente norte-americana no. 6,392,069)
Os adenovírus da invenção podem ainda ser administrados em células neoplásicas por meio de administração com lipossomas ou imunolipossomas. Uma administração assim pode orientada selectivamente para células neoplásicas com base numa propriedade da superfície celular presente na população de células neoplásicas (por exemplo, a presença de uma proteína da superfície celular que liga uma imunoglobulina num imunolipossoma). Tipicamente, uma suspensão aquosa contendo os viriões é encapsulada em lipossomas ou imunolipossomas. Por exemplo, uma suspensão 34 de viriões adenovírus pode ser encapsulada em micélios para formar imunolipossomas por meio de métodos convencionais (patente norte-americana no. 5.043.164, patente norte-americana n°. 4, 957,735, patente norte-americana n°, 4,925,661; (1992) Nature 355; 279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott and Nimmo, Wiley, Nova Iorque, 1989); Reddy et al. (1992) J. Immunol. 148:1585). Os imunolipossomas que compreendem um anticorpo que liga especificamente a um antigénio de célula cancerosa (por exemplo CALLA, CEA) presente em células cancerosas do indivíduo podem ser utilizados para definir aquelas células como alvos dos viriões (Fisher (2001) Gene Therapy 8:341-348).
Para aumentar ainda mais a eficácia dos adenovírus da invenção, estes podem ser modificados para exibir um tropismo acentuado relativamente a tipos de células tumorais específicas. Por exemplo, como se mostra na PCT/US98/04964, uma proteína na camada exterior de um adenovírus pode ser modificada para exibir um agente químico, de preferência um polipeptídeo que liga a um receptor nas células tumorais em maior escala do que nas células normais. (vide também, patente norte-americana 5, 770, 442 e 5,712,136). O polipeptídeo pode ser um anticorpo e de preferência é um anticorpo de cadeia simples.
Terapêutica Adenoviral
Os adenovírus da invenção, ou respectivas composições farmacêuticas, podem ser administrados para tratamento terapêutico de doença neoplásica ou cancro. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um doente já afectado por uma doença neoplásica específica, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente a condição e respectivas complicações. Uma 35 quantidade adequada para se obter tais efeitos é definida como "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz". Quantidades eficazes para esta utilização irão depender da gravidade da condição, estado geral da saúde do doente e via de administração.
Por exemplo, mas sem constituir limitação, um doente humano ou mamífero não-humano com uma doença neoplásica sólida ou hematológica (por exemplo carcinoma pancreático, do cólon, ovário, pulmão ou mama, leucemia ou mieloma múltiplo) pode ser tratado por meio de administração de uma dose com eficácia terapêutica de um adenovírus apropriado da invenção, isto é um com comprovada melhoria do índice terapêutico para esse tipo de tecido. Por exemplo, um adenovírus quimérico preferido para o tratamento do cancro do cólon seria o adenovírus ColoAdl (SEQ ID NO: 1) . Suspensões de partículas infecciosas de adenovírus podem ser aplicadas em tecido neoplásico através de várias vias, incluindo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica e tópica. Uma suspensão de adenovírus contendo cerca e 103 a 1012 ou mais partículas de viriões por ml pode ser administrada por meio de perfusão (por exemplo, na cavidade peritoneal para tratamento do cancro dos ovários, na veia porta para o tratamento de hepatocarcinoma ou metástases hepáticas de outros tumores primários não-hepáticos) ou outra via adequada, incluindo injecção directa numa massa tumoral (por exemplo tumor da mama), clister (por exemplo, cancro do cólon) ou cateter (por exemplo, cancro da bexiga) . Outras vias de administração poderão ser adequadas para carcinomas de outras origens, isto é, inalação como nebulização (por exemplo administração pulmonar para tratamento de carcinoma broncogénico, carcinoma pulmonar das células pequenas, 36 carcinoma pulmonar das células não-pequenas, adenocarcinoma do pulmão ou cancro da laringe) ou aplicação directa a um local de tumor (por exemplo carcinoma broncogénico, carcinoma nasofaringico, carcinoma da laringe, carcinoma do pescoço). A terapêutica adenoviral com adenovirus da presente invenção pode ser combinada com outros protocolos antineoplásicos, tais como quimioterapêutica convencional ou terapêutica por raios-X para o tratamento de um tipo especifico de cancro. 0 tratamento pode ser simultâneo ou sequencial. Um agente quimioterapêutico preferido consiste na cisplatina e a dose pode ser escolhida pelo médico com base na natureza do cancro em tratamento e outros factores tidos em conta por rotina no caso da administração da cisplatina. De preferência, a cisplatina será administrada por via intravenosa, numa dose de 50 a 120 mg/m2 ao longo 3 a 6 horas. De preferência, será administrada por via intravenosa, numa dose de 80 mg/m2 ao longo 4 horas. Um segundo agente quimioterapêutico preferido é 5-fluorouracilo, que é frequentemente administrado em combinação com cisplatina. A dose preferida de 5-fluorouracilo situa-se entre 800 e 1.200 mg/m2 por dia, durante 5 dias consecutivos. A terapêutica adenoviral, com os adenovirus da presente invenção como vectores adenovirais pode também ser combinada com outros genes reconhecidamente úteis em terapêutica à base de virus. Vide patente norte-americana 5,648,478. Nestes casos, o adenovirus quimérico compreende ainda um gene heterólogo que codifica uma proteína terapêutica incorporada no genoma virai, de forma que o gene heterólogo seja expresso no interior da célula infectada. Uma proteína terapêutica, tal como presentemente 37 utilizada, refere-se a uma proteina que se espera que proporcione alguma vantagem terapêutica quando expressa numa dada célula.
Numa forma de realização, o gene heterólogo é um gene activador pró-fármaco, tal como uma citosina desaminase (CD) {vide, patentes norte-americanas n°s 5,631,236; 5,358,866 e 5,677,178). Noutras formas de realização, o gene heterólogo é um indutor conhecido da morte celular, por exemplo apoptina ou proteina da morte adenoviral (adenoviral death protein - ADP) ou uma proteina de fusão, por exemplo glicoproteina de membrana fusogénica (Danen-Van Oorschot et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sei. 94:5843-5847;
Tollefson et al.(1996) J. Virol 70:2296- 2306; Fu et al. (2003) Mol. Therapy 7: 48-754,2003; Ahmed et al. (2003)
Gene Therapy 10:1663- 1671; Galanis et al. (2001) Human
Gene Therapy 12(7): 811-821).
Outros exemplos de genes heterólogos ou respectivos fragmentos incluem os que codificam proteínas imunomoduladoras, tais como as citoquinas ou quimioquinas. Os exemplos incluem interleuquina 2, Patente norte-americana n°s. 4,738,927 ou 5,641,665; interleuquina 7, Patente norte-americana n°s. 4,965,195 ou 5,328,988; e interleuquina 12, Patente norte-americana n° 5,457,038; factor alfa da necrose do tumor, Patente norte-americana n°s. 4,677,063 ou 5,773,582; gama-interferão, Patente norte-americana n°s. 4,727,138 ou 4,762,791; ou GM CSF, Patente norte-americana n°s. 5,393,870 ou 5,391,485, Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8:119-128) . Proteínas imunomoduladoras adicionais incluem ainda proteínas inflamatórias de macrófagos, incluindo MIP-3. Pode também ser utilizada a proteína quimiotática monocitária (MCP-3 alfa); uma forma de realização preferida 38 de um geen heterólogo consiste num gene quimérico constituído pode um gene que codifica uma proteína que atravessa as membranas celulares, por exemplo, VP22 ou ΤΆΤ, fundida a um gene que codifica uma proteína que é preferencialmente tóxica para o cancro mas não para células normais.
Os adenovírus quiméricos da invenção podem ainda ser utilizados como vectores para proporcionar genes codificadores de moléculas de ARN terapeuticamente úteis, isto é siRNA (Dorsett e Tuschl (2004) Nature Rev Drug Disc 3:318-329).
Nalguns casos, os genes podem ser incorporados num adenovírus quimérico da invenção para intensificar ainda mais a capacidade do vírus oncolítico para irradicar o tumor embora sem um impacto directo no tumor propriamente dito - estes incluem genes codificadores de proteínas que compreentem apresentação MHC classe I (Hewitt et al. (2003) Immunology 110: 163-169), complemento do bloco, inibem mecanismos induzidos por IFNs e IFN, quimioquinas e citoquinas, morte baseada em células NK (Orange et al., (2002) Mature Immunol 3: 1006-1012; Mireille et al. (2002) immunogenetics 54:527-542; Alcami (2003) Nature Rev. Immunol. 3: 36-50; subregulam a resposta imunitária (por exemplo, IL-10, TGF-Beta, Khong e Restifo (2002) Nature Immunol. 3: 999-1005; 2002) e metaloproteases que podem fragmentar a matriz extracelular e intensificar a disseminação do vírus no tumor (Bosman e Stamenkovic (2003) J. Pathol. 2000: 423-428; Visse e Nagase (2003) Circulation Res. 92: 827- 839).
Conjuntos A invenção refere-se ainda a embalagens e conjuntos farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes com um 39 ou mais dos ingredientes das composições da invenção referidas anteriormente. Associado a este recipiente (s) pode encontrar-se um aviso no formato recomendado por uma agência governamental reguladora do fabrico, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso esse que reflecte a aprovação pela a agência de fabrico, utilização ou venda do produto para administração em seres humanos. A presente invenção é ainda descrita por meio dos exemplos seguintes, os quais constituem ilustrações de realizações especificas da invenção e vários usos desta. Estas exemplificações, ilustradoras de certos aspectos específicos da invenção, não reflectem as limitações ou circunscrevem o âmbito da invenção divulgada.
Excepto no caso de indicação em contrário, a prática da presente invenção emprega técnicas convencionais de cultura celular, biologia molecular, biologia microbiologia, manipulação de ADN recombinante e imunologia que são abrangidos pela técnica. Estas técnicas são explicadas na íntegra na literatura. Vide, por exemplo, Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Cells (Ed).Academic Press. N.Y. (1996); Graham, F.L. e Prevec, L. Adenovírus-based expression vectors and recombinant vaccines. Em: Vaccines: New Approaches to immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth. Pp 363-390; Grahan e Prevec Manipulation of adenovírus vectors. Em: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray e J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, NJ. pp 109-128,1991; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), e Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons. 40
EXEMPLOS Métodos São empregues técnicas padrão para os métodos de ácido nucleico recombinante, síntese de polinucleótidos e cultura e transformação microbiana (por exemplo electroporação, lipofecção). Em geral, as reacções enzimáticas e fases de purificação são executadas de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e procedimentos são geralmente executados de acordo com métodos convencionais na técnica e várias referências gerais (vide em geral, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.l.) que são apresentada ao longo deste documento. A nomenclatura presentemente utilizada e os procedimentos laboratoriais na química analítica, química de síntese orgânica e formulação farmacêutica e administração e tratamento de doentes. Os métodos para a construção dos mutantes adenovirais são geralmente conhecidos na técnica. Vide, Mittal, S. K., Vírus Res., 1993, vol: 28, páginas 67-90; e Hermiston, T. et al, Methods in Molecular Medicine: Adenovírus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press, 1999. Além disso, o genoma do adenovírus 5 encontra-se registado com o número de acesso #M73260 do Genbank 10 e o vírus encontra-se disponível junto da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA, sob o número de acesso VR-5. Vírus e Linhas celulares
Os serotipos Ad Ad3 (estirpe GB), Ad4 (estirpe Ri-67) Ad5 (estirpe adenoide 75), Ad9 (estirpe de Hicks), Adllp (estirpe Slobitski), Adl6 (estirpe Ch. 79) e todas as linhas celulares, com excepção das seguintes, foram adquiridos junto da ATCC: MDA231-mtl (um derivado isolado 41 pelo Dr. Deb Zajchowski a partir de um xenoenxerto implantado subcutaneamente de rápido crescimento de células MDA231) e Pancl-sct (derivado pela Dra. Sandra Biroc de um xenoenxerto implantado subcutaneamente de rápido crescimento de células Panei), HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, NY) e SAEC (Clonetics, Walkersville, MD). Ad40 foi uma oferta generosa da parte do Dr. William S.M. Wold da Universidade de St. Louis.
Exemplo 1 - Purificação e Quantificação Virai
Propagaram-se estirpes virais em 293 células e purificaram-se em gradientes de CsCl (Hawkins et al., 2001). O método utilizado para quantificar as partículas virais baseia-se no método de Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453-465, com excepção de se utilizar o permutador iónico TMAE Fractogel em vez do Resource Q. Em resumo, uma coluna de 1,25 ml foi carregada com Fractogel EMD TMAE-650 (S) (n°. catálogo 116887-7 EM Science, Gibbstown, NJ 08027). Foi efectuada separação HPLC numa coluna Agilent HP 1100 HPLC com as seguintes condições: Tampão A = 50 mM de HEPES, pH 7,5; tampão B = 1,0 M de NaCL em tampão A; caudal de 1 ml por minuto. Depois de equilibrada a coluna durante um período inferior a 30 minutos com tampão A, carregaram-se aproximadamente 109-1011 partículas virais da amostra na coluna numa coluna de 10 a 100 ul, seguido de 4 volumes da coluna de tampão A. Aplicou-se um gradiente linear estendendo-se ao longo de 16 volumes da coluna e terminando em 100% de tampão B.
O efluente da coluna foi monitorizado a A260 e A280 nm, calculadas as áreas de pico e determinou-se uma taxa de 260 a 280 nm. Os picos virais foram identificados como sendo os picos com uma proporção de A260/A280 próxima de 1,33. Foi incluído um vírus padrão com cada série de amostras. O 42 número de partículas virais por ml do padrão foi determinado utilizando o usando método de Lehmberg et al. (1999) J. Chrom. B, 732:411-423). No intervalo de concentração virai utilizado, A área de pico A260 nm de cada amostra é directamente proporcional ao número de partículas virais na amostra. 0 número de partículas virais por ml em cada amostra de ensaio foi calculado multiplicando o número conhecido de partículas virais por ml no padrão pela proporção da área de pico virai A260 nm da amostra para a área de pico virai A260 nm do padrão. A coluna foi regenerada depois de cada gradiente da amostra mediante lavagem com dois volumes da coluna de NaOH 0,5 N, seguido de dois volumes da coluna de 100% de tampão A, 3 volumes da coluna de 100% de tampão B e depois 4 volumes da coluna de 100% de tampão A.
Exemplo 2 - Bio-selecção
Os serotipos virais representando os subgrupos Ads B-F foram reunidos e passados em culturas sub-confluentes das linhas celulares tumorais alvo a uma elevada proporção de partícula-para-célula em dois ciclos para promover a ocorrência de recombinação entre os serotipos. O sobrenadante (1,0, 0,1, 0,01, 0,001 ml) do segundo ciclo das culturas subconfluentes com elevado grau de infecção de partículas virais-para-célula foi depois utilizado para infectar uma série de balões de cultura de tecido T-75 superconfluentes com as linhas celulares tumorais alvo PC-3, HT-29, Panc-1 e MDA-231. Para atingir a superconfluência, cada linhagem de células foi semeada em proporções de divisão que permitiram que cada linhagem de células atingisse a confluência entre 24 e 40 horas pós-sementeira e as células foram deixadas desenvolver-se durante um total de 72 horas pós-sementeira, antes da 43 infecção. Esta operação foi efectuada para maximizar a confluência das células para simular as condições de crescimento em tumores sólidos humanos. 0 sobrenadante da cultura celular foi recolhido do primeiro balão na série de 10 vezes de diluição que não revelou qualquer sinal de CPE ao dia 3 ou 4 pós-infecção (no caso de HT-29 e PC-3, esta foi modificada para passagens 10 a 20 para colher do segundo balão, isto é colheita 100 vezes abaixo da diluição em que CPE era detectável ao dia 3 pós-infecção). Cada colheita serviu de material de partida para a passagem sucessiva do vírus. Este processo foi repetido até o grupo virai atingir 20 passagens bio-selectivas.
Os vírus individuais de cada agrupamento bio--seleccionado foram isolados em dois ciclos de purificação em placa em células A549 utilizando métodos padrão (Tollefson, A., Hermiston, T.W., e Wold, W.S.M.; "Preparation and Titration of CsCi-banded Adenovírus Stock" in Adenovírus Methods and Protocols. Humana Press, 1999, pp 1-10, W.S.M. Wold, Ed) . Em resumo, foram utilizadas diluições do sobrenadante recolhido da 20a passagem em cada linhagem de células tumorais alvo para infectar células A549 numa análise em placa padrão, foram colhidas placas com poço individualizados e foi utilizado o mesmo método de análise da placa para gerar um segundo ciclo de placas individuais destas colheitas. As placas com poços isolados do segundo ciclo de purificação em placa foram consideradas puras, as culturas infectadas foram preparadas utilizando estas placas purificadas e a potência oncolítica destes sobrenadantes da cultura foi determinada por análise MTS como descrito.
Exemplo 3 - Caracterização do serotipo 44
Os serotipos adenovirais progenitores compreendendo os agrupamentos virais ou o adenovirus ColoAdl isolado foram identificados utilizando cromatografia de permuta aniónica idêntica à descrita por Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453:465, apenas com excepção de se ter utilizado o permutador aniónico TMAE Fractogel media (EM industries, Gibbstown, NJ) em vez do Resource Q, como descrito no exemplo 1 (consultar figura 1) . 0 adenovirus de tipo 5 eluiu a aproximadamente 60% de tampão B durante o gradiente. Os outros serotipos (3, 4, 9, 11 p, 16, 35 e 40) eluiu cada um num tempo de retenção caracteristico, consistente com os tempos de retenção em G Sepharose XL, publicado por Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055- 1062.
Exemplo 4 - Análise citolitica A capacidade litica virai foi medida recorrendo a uma modificação da análise MTT (Shen et al., 2001). Resumidamente, a análise MTS (Promega, CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) foi utilizado em vez da análise MTT, uma vez que a conversão de MTS por células em formazan aquoso, solúvel reduz o tempo e elimina a utilização de um solvente orgânico volátil associado à análise MTT.
Para realizar esta análise foram semeadas células a uma densidade definida para cada linhagem de células tumoral que gerou uma monocamada confluente no espaço de 24 horas. Estas células densamente semeadas foram deixadas desenvolver-se durante mais dois dias antes da exposição ao(s) virus de ensaio. Foram executadas as infecções das células de tumor e primárias normais em quadruplicado, com diluições triplas em séries dos virus, com inicio a uma proporção de partícula para célula de 100 e terminando a 45 uma proporção de partícula para célula de 0,005. As células infectadas foram incubadas a 37° C e foi realizada a análise MTS nos momentos indicados para as células individuais primárias ou linhas celulares tumorais. Células com simulação de infecção serviram de controlos negativos e estabeleceram um ponto de sobrevivência de 100% para esta análise.
Exemplo 5 - Sequenciação de ADN A sequenciação de ADN dos ADNs genómicos de Adllp (SEQ ID NO: 2) e ColoAdl (SEQ ID NO: 1) foi realizada da seguinte forma. Em resumo, ADN de adenovírus purificado de ColoAdl e Adllp foi parcialmente digerido com a endonuclease de restrição Sau3Al e clonou-se de forma aliatória no vector plasmídico pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) . Foram propagados clones positivos e foram sequenciados utilizando os iniciadores M13R e KS (Stratagene, La Jolla, CA) . As reacções de sequência individuais foram cortadas, editadas e montadas com Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan). As lacunas na cobertura foram amplificadas com iniciadores oligonucleótidos adaptados e foram sequenciadas. As extremidades dos genomas virais foram sequenciadas directamente do ADN adenoviral. Ao todo, cada genoma foi senquenciado com uma cobertura 3X+ e 431 bases com cobertura 2X.
Para determinar a origem da região ColoAdl E2B, dois conjuntos de iniciadores foram gerados, um no gene E2B pTP (bp9115, 5'GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3' (SEQ ID NO: 4) e bp 9350, 5' GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGTT (SEQ ID NO: 5)) e um no gene polimerase de ADN (bp 7520 5'CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3' (SEQ ID NO: 6) e bp 7982, 5'GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3' (SEQ ID NO: 7) e utilizado 46 para se isolar por PCR fragmentos de ADN dos vários serotipos (Ad3,4,5,9,llp,16 e 40) utilizando reagentes do Advantage 2 PCR kit (Clonetics, Walkersvilie, MD; N° Cat K1910-Y) e passado num termociclador da MJ Research (Watertown, MA). Estes fragmentos foram posteriormente sequenciados em conjunto com a sequência de ADN e Ad3, utilizando a sequenciação com terminador corante num analisador genético ABI 3100. A região E2B de Ad3 foi sequenciada utilizando ADN de Ad3 isolado e iniciadores sobrepostos. A informação da sequência foi analisada com o programa Vector NTI (Informatix).
Exemplo 6 - Construção de virus Recombinantes ADNs genómicos de Adllp (SEQ ID NO: 2) e ColoAdl (SEQ ID NO: 1) foram purificados a partir partículas de vírus em bada com gradiente de CsCl. Os ADNs genómicos foram digeridos com Pacl, o qual corta cada um apenas uma vez no genoma virai. O corte Pacl ocorre na base 18141 na sequência de nucleótidos ColoAdl (SEQ ID NO: 1) e na base 18140 na sequência de nucleótidos Adll (SEQ ID NO: 2) . Os ADNs digeridos foram misturados em quantidades iguais e ligados na presença de ligase T4 ADN a 16° C de um dia para o outro. Esta mistura de ligação foi transfectada para células A549, utilizando o conjunto de transfecção CaP04 da Invitrogen, Carlsbad, CA (N° Cat K2780-01). Foram recolhidas placas isoladas e foram examinadas por digestão com enzima de restrição e análise PCR para distinguir as quatro populações virais (Adllp, ColoAdl, Adllp extremidade esquerda/ColoAdl extremidade direita (ColoAdl.1) e ColoAdl extremidade esquerda/Adllp extremidade direita (ColoAdl.2)). 47 A capacidade lítica virai de cada população foi determinada em várias linhas celulares, incluindo HT29 e HUVEC, como descrito no exemplo 3. Os resultados demonstraram a ordem da potência do menos potente para o mais potente Adllp, ColoAdl.2, ColoAdl.l, ColoAdl (consultar os resultados em células HT29 na figura 7).
Foram também construídos adenovírus quiméricos pCJl44 e pCJl46 que contêm o genoma ColoAdl integral, no qual foi restaurada a região Adllp E3 e E4 de tipo selvagem, respectivamente. Estas modificações foram introduzidas por recombinação homóloga em BJ5183 E. Coli (Chartier et al. (1996) J. Virol. 70:4805-4810). Os dois adenovírus quiméricos demonstraram reduzida capacidade lítica em células HT2 9 e HUVEC em comparação com ColoAdl ou ColoAdl.2.
Exemplo 7 - Eficácia In Vivo do Adenovírus
Numa experiência típica de xenoenxerto de tumor humano em ratinhos nude, os animais foram injectados subcutaneamente com 5 χ 106 células no flanco traseiro. Quando os tumores atingiram 100-200 ul de tamanho, são injectados com veículo (PBS) ou com vírus a 2 χ 1010 partículas durante cinco dias consecutivos (1 χ 1011 partículas no total). Seria de notar uma redução do tamanho do tumor relativamente ao controlo com PBS e vírus de controlo adicionais (Ad5, ONYX-015).
Exemplo 8 - Selectividade ColoAdl em Explantes de
Tecido Humano Primários
Os espécimes de tecido de tumores colo-rectais e tecidos normais adjacentes removidos durante cirurgia foram colocados em meio de cultura e infectados com números iguais de vírus ColoAdl ou Ad5. Os sobrenadantes da cultura 48 foram recolhidos 24 horas após a infecção e determinou-se o número de partículas de vírus produzidas. ColoAdl produziu mais partículas de vírus por partícula inicial do que Ad5 em tecido tumoral, tendo produzido menos partículas por partícula inicial do que Ad5 em tecido normal.
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Harden, Paul
Hermiston, Terry Kuhn, Irene <120> Adenovírus Quimérico Para Utilização No Tratamento Do Cancro <130 53183AWOM1 <150> US 60/574,851 <151> 2004-05-26 <160> 8 <170> Patenteln versão 3.2 <210> 1 <211> 32325
<212> ADN <213> Adenovírus <400> 1 49 ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta 60 aaaagtgtgg atcgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaaaggg gcggtgcgac 120 cgtgggaaaa tgacgttttg tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtg 180 acgcataaaa aggctttttt ctcacggaac tacttagttt tcccacggta tttaacagga 240 aatgaggtag ttttgaccgg atgcaagtga aaattgttga ttttcgcgcg aaaactgaat 300 gaggaagtgt ttttctgaat aatgtggtat ttatggcagg gtggagtatt tgttcagggc 360 caggtagact ttgacccatt acgtggaggt ttcgattacc gtgtttttta cctgaatttc 420 cgcgtaccgt gtcaaagtct tctgttttta cgtaggtgtc agctgatcgc tagggtattt 480 atacctcagg gtttgtgtca agaggccact cttgagtgcc agcgagaaga gttttctcct 540 ctgcgccggc agtttaataa taaaaaaatg agagatttgc gatttctgcc tcaggaaata 600 atctctgctg agactggaaa tgaaatattg gagcttgtgg tgcacgccct gatgggagac 660 gatccggagc cacctgtgca gctttttgag cctcctacgc ttcaggaact gtatgattta 720 gaggtagagg gatcggagga ttctaatgag gaagctgtaa atggcttttt taccgattct 780 atgcttttag ctgctaatga agggttagaa ttagatccgc 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ttctccgttt tgcacgcaga gtctaaccag atgtgttcgg ggtgatgaaa tttgggtccg tctagcaaga cgttctgcca agctacgact atcaaaatcc gactgaccag ataggcgcgg aagaaaatgc ggcgaggtct tcctgcggcg cggcatgaag 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5287
<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 88 <223> iniciador <4 0 0> 4 gggagtttcg cgcggacacg g <210 > 5 <211 > 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <4 0 0> 5 gcgccgccgc cgcggagagg t < 210 > 6 <211 > 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <4 0 0> 6 cgagagccca ttcgtgcagg tgag <210 > 7 <211 > 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 89 <223> iniciador <400> 7 gçtgcgacta ctgcggccgt ctgt <210> 8 <211> 4195 <212> ADN <213> Adenovirus <400> 8 tcataagact ctcgtccatc tggtcagaaa acacaatctt cttgttgtcc agcttggtgg 60 caaatgatcc atagagggca ttggatagaa gcttggcgat ggagcgcatg gtttggttct 120 tttccttgtc cgcgcgctcc ttggcggtga tgttaagctg gacgtactcg cgcgccacac 180 atttccattc aggaaagatg gttgtcagtt catccggaac tattctgatt cgccatcccc 240 tattgtgcag ggttatcaga tccacactgg tggccacctc gcctcggagg ggctcattgg 300 tccagcagag tcgacctcct tttcttgaac agaaaggggg gagggggtct agcatgaact 360 90 catcaggggg gtccgcatct atggtaaata ttcccggtag caaatctttg tcaaaatagc 420 tgatggtggc gggatcatcc aaggtcatct gccattctcg aactgccagc gcgcgctcat 480 aggggttaag aggggtgccc cagggcatgg ggtgggtgag cgcggaggca tacatgccac 540 agatatcgta gacatagagg ggctcttcga ggatgccgat gtaagtggga taacatcgcc 600 cccctctgat gcttgctcgc acatagtcat agagttcatg tgagggggca agaagacccg 660 ggcccagatt ggtgcggttg ggtttttccg ccctgtaaac gatctggcga aagatggcat 720 gggaattgga agagatagta ggtctctgga atatgttaaa atgggcatga ggtaagccta 780 cagagtccct tatgaagtgg gcatatgact cttgcagctt ggctaccagc tcggcggtga 840 tgagtacatc cagggcacag tagtcgagag tttcctggat gatgtcataa cgcggttggc 900 ttttcttttc ccacagctcg cggttgagaa ggtattcttc gtgatccttc cagtactctt 960 cgaggggaaa cccgtctttt tctgcacggt aagagcccaa catgtagaac tgattgactg 1020 ccttgtaggg acagcatccc ttctccactg ggagagagta tgcttgggct gcattgcgca 1080 gcgaggtatg agtgagggca aaagtgtccc tgaccatgac tttgaggaat tgatacttga 1140 agtcgatgtc atcacaggcc ccctgttccc agagttggaa gtccacccgc ttcttgtagg 1200 cggggttggg caaagcgaaa gtaacatcat tgaagaggat cttgccggcc ctgggcatga 1260 aatttcgggt gattttgaaa ggctgaggaa cctctgctcg gttattgata acctgagcgg 1320 ccaagacgat ctcatcaaag ccattgatgt tgtgccccac tatgtacagt tctaagaatc 1380 gaggggtgcc cctgacatga ggcagcttct tgagttcttc aaaagtgaga tctgtagggt 1440 cagtgagagc atagtgttcg agggcccatt cgtgcacgtg agggttcgct ttaaggaagg 1500 aggaccagag gtccactgcc agtgctgttt gtaactggtc ccggtactga cgaaaatgct 1560 gtccgactgc catcttrtct ggggtgacgc aatagaaggt ttgggggtcc tgccgccagc 1620 gatcccactt gagttttatg gcgaggtcat aggcgatgtt gacgagccgc tggtctccag 1680 agagtttcat gaccagcatg aaggggatta gctgcttgcc aaaggacccc atccaggtgt 1740 aggtttccac atcgtaggtg agaaagagcc tttctgtgcg aggatgagag ccaatcggga 1800 agaactggat ctcctgccac cagttggagg aatggctgtt gatgtgatgg aagtagaact 1860 ccctgcgacg cgccgagcat tcatgcttgt gcttgtacag acggccgcag tactcgcagc 1920 gattcacggg atgcacctta tgaatgagtt gtacctgact tcctttgacg agaaatttca 1980 gtggaaaatt gaggcctggc gcttgtacct cgcgctttac tatgttgtct gcatcggcat 2040 gaccatcttc tgtctcgatg gtggtcatgc tgacgagccc tcgcgggagg caagtccaga 2100 cctcggcgcg gcaggggcgg agctcgagga cgagagcgcg caggccggag ctgtccaggg 2160 tcctgagacg ctgcggagtc aggttagtag gcagtgtcag gagattaact tgcatgatct 2220 tttggagggc gtgagggagg ttcagatagt acttgatctc aacgggtccg ttggtggaga 2280 91 tgtcgatggc ttgcagggtt ccgtgtccct tgggcgctac caccgtgccc ttgtttttca 2340 ttttggacgg cggtggctct gttgcttctt gcatgtttag aagcggtgtc gagggcgcgc 2400 accgggcggc aggggcggct cgggacccgg cggcatggct ggcagtggta cgtcggcgcc 2460 gcgcgcgggt aggttctggt actgcgccct gagaagactc gcatgcgcga cgacgcggcg 2520 gttgacatcc tggatctgac gcctctgggt gaaagctacc ggccccgtga gcttgaacct 2580 gaaagagagt tcaacagaat caatctcggt atcgttgacg gcggcttgcc taaggatttc 2640 ttgcacgtcg ccagagttgt cctggtaggc gatctcggcc atgaactgct cgatctcttc 2700 ctcttgaaga tctccgcggc ccgctctctc gacggtggcc gcgaggtcgt tggagatgcg 2760 cccaatgagt tgagagaatg cattcatgcc cgcctcgttc cagacgcggc tgtagaccac 2820 agcccccacg ggatctctcg cgcgcatgac cacctgggcg aggttgagct ccacgtggcg 2880 ggtgaagacc gcatagttgc ataggcgctg gaaaaggtag «gagtgtgg tggcgatgtg 2940 ctcggtgacg aagaaataca tgatccatcg tctcagcggc atctcgctga catcgcccag 3000 cgcttccaag cgctccatgg cctcgtagaa gtccacggca aagttaaaaa actgggagtt 3060 acgcgcggac acggtcaact cctcttccag aagacggata agttcggcga tggtggtgcg 3X20 cacctcgcgc tcgaaagccc ctgggatttc ttcctcaatc tcttcttctt ccactaacat 3180 ctcttcctct tcaggtgggg ctgcaggagg agggggaacg cggcgacgcc ggcggcgcac 3240 gggcagacgg tcgatgaatc tttcaatgac ctctccgcgg cggcggcgca tggtctcggt 3300 gacggcacga ccgttctccc tgggtctcag agtgaagacg cctccgcgca tctccctgaa 3360 gtggtgactg ggaggctctc cgttgggcag ggacaccgcg ctgattatgc attttatcaa 3420 ttgccccgta ggtactccgc gcaaggacct gatcgtctca agatccacgg gatctgaaaa 3480 cctttcgacg aaagcgtcta accagtcgca atcgcaaggt aggctgagca ctgtttcttg 3540 cgggcggggg cggctagacg ctcggtcggg gttctctctt tcttctcctt cctcctcttg 3600 ggagggtgag acgatgctgc tggtgatgaa attaaaatag gcagttttga gacggcggat 3660 ggtggcgagg agcaccaggt ctttgggtcc ggcttgttgg atacgcaggc gatgagccat 3720 tccccaagca ttatcctgac atctggccag atctttatag tagtcttgca tgagtcgttc 3780 cacgggcact tcttcttcgc ccgctctgcc atgcatgcga gtgatcccga acccgcgcat 3840 gggctggaca agtgccaggt ccgctacaac cctttcggcg aggatggctt gctgcacctg 3900 ggtgagggtg gcttggaagt cgtcaaagtc cacgaagcgg tggtaggccc cggtgttgat 3960 tgtgtaggag cagttggcca tgactgacca gttgacrgtc tggtgcccag ggcgcacgag 4020 ctcggtgtac ttgaggcgcg agtatgcgcg ggtgtcaaag atgtaatcgt tgcaggtgcg 4080 caccaggtac tggtagccaa tgagaaagtg tggcggtggc tggcggtaca ggggccatcg 4140 ctctgtagcc ggggcrccgg gggcgaggtc ttccagcatg aggcggtggt agccg 4195

Claims (25)

1/9 REIVINDICAÇÕES 1. Adenovírus quimérico recombinante com um genoma que inclui uma região E2B, em que a região E2B referida inclui uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um primeiro serotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um segundo serotipo adenoviral; em que o primeiro e segundo serotipos adenovirais referidos são, cada um, seleccionados a partir de subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos uns dos outros e em que o referido adenovírus quimérico é oncolítico e apresenta um índice terapêutico melhorado para uma célula tumoral.
2. Adenovírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir ainda regiões que codificam proteínas da fibra, do hexão e do pentão, em que os ácidos nucleicos que codificam estas proteínas pertencem todos ao mesmo serotipo adenoviral.
3. Adenovírus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por incluir uma região E3 modificada ou incluir ainda uma região E4 modificada.
4. Adenovírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a célula tumoral referida ser uma célula tumoral do cólon, mama, pâncreas, pulmão, próstata, ovário ou hemopoiética.
5. Adenovírus de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a célula tumoral ser uma célula tumoral do cólon.
6. Adenovírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a sequência de 2/9 nucleótidos da região E2B do referido adenovirus incluir a SEQ ID NO:3.
7. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a sequência de nucleótidos do referido adenovirus incluir a SEQ ID NO: 1.
8. Adenovirus quimérico recombinante com um genoma que inclui uma região E2B, em que a região E2B referida inclui uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um primeiro serotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um segundo serotipo adenoviral e em que o primeiro e segundo serotipos adenovirais referidos são, cada um, seleccionados a partir de subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos uns dos outros e em que o referido adenovirus quimérico é oncolítico e apresenta um indice terapêutico melhorado para uma célula tumoral; e em que o referido adenovirus quimérico foi tornado deficiente em termos de replicação através da delecção de uma ou mais regiões adenovirais codificadoras de proteínas envolvidas na replicação adenoviral seleccionadas a partir do grupo que consiste em El, E2, E3 ou E4.
9. Adenovirus deficiente em termos de replicação de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por as regiões El e E3 terem sido eliminadas.
10. Adenovirus deficiente em termos de replicação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por incluir ainda as delecções da região E4.
11. Adenovirus quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por incluir 3/9 ainda um gene heterólogo, gene heterólogo esse que é expresso dentro de uma célula infectada com o referido adenovirus.
12. Adenovirus de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por gene heterólogo ser uma timidina quinase.
13. Adenovirus de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o referido gene heterólogo codificar uma proteina terapêutica seleccionada a partir do grupo que consiste em citocinas e quimioquinas, anticorpos, enzimas conversoras de pró-fármacos e proteínas imuno--reguladoras.
14. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para utilização em terapêutica.
15. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por se destinar ao tratamento de doença neoplásica ou cancro ou para a inibição do crescimento de uma célula cancerosa.
16. Método de inibição do crescimento de uma célula cancerosa, compreendendo a infecção da referida célula cancerosa in vitro com o adenovirus de qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
17. Adenovirus de acordo com a reivindicação 15 ou método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida célula cancerosa ser uma célula cancerosa do cólon.
18. Adenovirus ou método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a sequência de nucleótidos do referido adenovirus incluir a SEQ ID NO: 1.
19. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para utilização na aplicação de uma proteina terapêutica numa célula. 4/9
20. Método de isolamento do adenovírus de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por o referido método incluir a) agrupar os serotipos adenovirais que representam subgrupos adenovirais B-F, deste modo criando uma mistura adenoviral; b) passar a mistura adenoviral agrupada da fase (a) por uma cultura em crescimento activo de células tumorais numa proporção de particula para célula suficientemente alta para encorajar à recombinação entre os serotipos, mas não tão elevada que produza a morte prematura da célula C) recolher o sobrenadante da fase (b); d) infectar uma cultura quiescente de células tumorais com o sobrenadante recolhido na fase (c) ; e) recolher o sobrenadante da cultura celular da fase (d) antes da existência de qualquer sinal de CPE; f) infectar uma cultura quiescente de células tumorais com o sobrenadante recolhido na fase (e) ; e g) isolar o vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 a partir do sobrenadante recolhido na fase (f) por purificação de placa.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se executar duas vezes a fase (b) antes de recolher o sobrenadante na fase (c).
22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por as fases (e) e (f) serem repetidas até 20 vezes antes da fase (g). 5/9
23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por se executar um segundo ciclo de purificação em placa na sequência da fase (g).
24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a célula tumoral ser uma célula tumoral do cólon, mama, pâncreas, pulmão, próstata, ovário ou hemopoiética.
25. Adenovirus quimérico recombinante com um genoma que inclui uma região E2B, em que a região E2B referida inclui uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um primeiro serotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucleicos derivada de um segundo serotipo adenoviral; em que o primeiro e segundo serotipos adenovirais referidos são, cada um, seleccionados a partir de subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos uns dos outros e em que o referido adenovirus quimérico é oncolítico e apresenta um indice terapêutico melhorado para uma célula tumoral; produzido pelo método de qualquer uma das reivindicações 20 a 24. 6/9 SSSsSS\\VV\\y^\yy*NW^ UíliÇfO de pãíÍKÍ i:# M -4 i J& Jf ? .... íl Wv ::·: 4: § S -SS.V íí: f 1 1 ¥ S: <!? \ 1 S ** ;P í >SS:. ΪΪ λ :$&>: ¥:;: 1 *1 % Φ S :·: w- S -è: :> ! i A&ofvéncra 7/9 m •H5· 1 v. ,.y:;'|; l $ ‘Ό X;., F m v | v v F II :&ou :·!· $; 1.1 ç 1 *3 Φεζϋΰ \.:· >33 c: C3 <sí m !v .;s! o-:£L: Mi *0m ··...> !7 íií φmM m; mp:5 yv.·. ί·ί· :* V :v í 0$ :·: 0, .¾ M . S. .O . :¾ >: ;:i .,£i .'A*·.· ' m. Λ&- O O /-\. •0 "V- X y :: p ^T| 1 ? 1 ::Í^T> v '> χ·ά m í :: .· :x :< TA m Q> 1 fF ® V â> :$ *1: X: ív. $**s íS:^: xnsS^SSs&s Λ?*;* s»tv |p| , ,x F^SSSsSSsssSSsSxw^ 8/9 nW * "?4' ··&$&* **> .xxx·.·, Ç£ ÇSi μ* < igf· :«>' s^\·.·..·.·^.·.·.·.· ^XVX-X-i^vX -¾ Sí, ΐΏ \ iO m M:1 :ΐ·“\.·ί: ¥VX&'VX à Ξ3 -v ; Xv: x-':' £ -T :¥ x*· <··*··< & -x •:Q. * Λ: X .. ,·χ x-mJL««ss;sss\\^^^ ft *»W :¾ $ & :$ .£; :¥ Lu- m m. Ό' *£> }. :j: . #'f; . '•vMr. ¥O'1:;' oxxX .X' #. £ :í: •^:xí¥ s? ^s> í ¥¥ . :.v< :·>!?: *^í «fc· :¥ : -ΆΧ· ~ S ÍSSS * 1 $ ^.SN^N * :·: $: •c;·· χχ$£' «í M: Xs¥S^*S*Sx¥x:xssvXn |: ' $ % coíilfdo <N- i-x zsÍTl f ---'-•'•:·:·:·:·:·:·:·>/:Χ>>>:·:·:·:·:·:·;'Χ;^χ·Λ·>·>^χ%Ν·>>>·.\. | -* ^ «í μ > vp· S-f:-:-;v l¥ & —·> $ .·** .-¾ __ ,...>··' V '*·&& μ * >:·$£ S -.í-. ¥:¥: :¥ :¥ $: Λ**>· w-X" -:5· »»:·; xs-^ss· x és·· w% ^.x .-:-· ·:· ·% X X 'w' “Λ “5> O | y ^í>5f: í 8: gsl Jfi :Çj)· !·' i 1 «sSsxxx :: μ * $>> :¥ ;S; 8; /¾ X: * ·> :v •rxxxxxxxxxxxxxxxxxxx· í :v :¥· ;^s v $ 'A,· $3 c: M CL dOj >S*: ·>··:·»£·> m ,m í.0 § m | #κ*;: tZj X -.3. w¥«· O 1
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