MXPA06013570A - Adenovirus quimericos para usarse en el tratamiento del cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con adenovirus oncoliticos que tienen aplicaciones terapeuticas. Se proporcionan adenovirus quimericos recombinantes y metodos para producirlos. Los adenovirus quimericos de la invencion comprenden secuencias de acido nucleico derivadas de serotipos adenovirales clasificados dentro de los subgrupos B hasta F y demuestran indice terapeutico mejorado.

Description

ADENOVIRUS QUIMÉRICOS PARA USARSE EN EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita aqui se relaciona, de manera general con el campo de la biología molecular y de manera más especifica con adenovirus oncoliticos que tienen aplicaciones terapéuticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es la causa principal de muerte en los Estados Unidos y otras partes. Dependiendo del tipo de cáncer, este es tratado típicamente con cirugía, quimioterapia, y/o radiación. Esos tratamientos con frecuencia fallan, y está claro que son necesarias nuevas terapias, para usarse solas o en combinación con técnicas clásicas. Un método ha sido el uso de adenovirus, ya sea solos o como vectores capaces de liberar proteínas terapéuticas anticáncer a células tumorales. Los adenovirus son virus de ADN de doble hebra icosaédricos, sin envoltura con un genoma lineal de aproximadamente 36 pares de kilobases. Cada extremo del genoma viral tiene una secuencia corta conocida como una repetición terminal invertida (o ITR) , la cual se requiere para la replicación viral. Todos los genomas de adenovirus humanos examinados a la fecha tienen la misma organización general; es decir, que los genes que codifican para funciones específicas se localizan en la misma posición en el genoma viral. El genoma viral contiene cinco unidades de transcripción temprana (E1A, E1B, E2, E3, y E4), dos unidades tempranas retrasadas (IX y Iva2), una unidad tardia (tardía mayor) que es procesada para generar cinco familias de ARNm tardíos (L1-L5) . Las proteínas codificadas por los genes tempranos están implicadas en la replicación, mientras que los genes tardíos codifican para proteínas estructurales virales. Porciones del genoma viral pueden ser sustituidas fácilmente con ADN de origen externo y los adenovirus recombinantes son estructuralmente estables, propiedades que los hacen virus potencialmente útiles para terapia genética (véase Jolly, D. (1994) Cáncer Gene Therapy 1:51-64). Actualmente, los esfuerzos de investigación para producir terapia adenoviral clínicamente útil se han enfocado sobre el serotipo adenoviral, Ad5. La genética de este adenovirus humano es también caracterizada y los sistemas también descritos para su manipulación molecular. Han sido desarrollados métodos con una alta capacidad de producción para apoyar aplicaciones clínicas, y ya está disponible alguna experiencia médica con el agente. Véase Jolly, D. (1994) Cáncer Gene Therapy 1:51-64. La investigación relacionada con el uso de los adenovirus humanos (Ad) en el tratamiento del cáncer es enfocado sobre el desarrollo de adenovirus basados en Ad5 que tienen una alta potencia en, o están dirigidos preferiblemente a, tipos de células tumorales especificas y existe la necesidad de generación de virus oncoliticos más potentes si la terapia adenoviral no encuentra aplicación práctica en el escenario clínico. El Ad5 es solo uno de los 51 serotipos adenovirales conocidos actualmente, los cuales se clasifican en los subgrupos A-F, sobre la base de varios atributos, incluyendo sus propiedades de hemaglutinación ((véase, Shenk, "Adenoviridae : The Viruses and Their Replication, " in Fields Virology, Vol. 2, Cuarta Edición, Knipe, ea., Lippincott, Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)). Esos serotipos difieren en una variedad de niveles, por ejemplo patología en humanos y roedores, receptores celulares usados para la unión, pero esas diferencias han sido ignoradas por mucho tiempo como medios potenciales para desarrollar adenovirus oncolíticos más potentes (con la excepción de alteraciones de fibras, véase Stevenson et al: (1997) J. Virol . 71:4782-4790; Krasnykh et al. (1996) J. Virol . 70:6839-6846; Wickham et al. (1997) J. Virol . 71:8221-8229; Legrand et al. (2002) Curr . Gene Ther. 2:323-329; Barnett et al. (2002) Biochim. Biophys Acta 1-3:1-14; Solicitud de Patente Estadounidense 2003/0017138).

La explotación de las diferencias entre los serotipos adenovirales puede proporcionar una fuente de agentes terapéuticos basados en adenovirus más efectivos, usando los adenovirus novedosos con mayor selectividad y potencia. Existe la necesidad de esas terapias basadas en adenovirus, mejoradas.

LA INVENCIÓN La presente invención proporciona adenovirus quiméricos novedosos, o variantes o derivados de los mismos, útiles para la terapia basada en virus. En particular, la invención proporciona adenovirus quiméricos, o variantes o derivados de los mismos, que tienen un genoma que comprende una región E2B donde la región E2B comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de un primer serotipo adenoviral y una secuencia de ácido nucleico derivada de un segundo serotipo adenoviral; donde el primer y segundo serotipos adenovirales son seleccionados cada uno de los subgrupos adenovirales B, C, D, E o F y son distintas entre si; y donde el adenovirus quimérico es oncolitico y demuestra un mejor índice terapéutico para una célula tumoral. En una modalidad, el adenovirus quimérico comprende además regiones que codifican para proteínas de fibras, hexonas y pentonas, donde los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas son todos del mismo serotipo adenoviral. En otra modalidad, los adenovirus quiméricos de la invención comprenden una región E3 o E4 modificada. En otra modalidad, el adenovirus quimérico demuestra un mejor Índice terapéutico en células tumorales de colon, mama, páncreas, pulmón, próstata, ovario o hematopoyéticas . En una modalidad particularmente preferida, el adenovirus quimérico presenta un mejor Índice terapéutico en células tumorales de colon. En una modalidad preferida, la región E2B del adenovirus quimérico comprende la SEQ ID NO: 3. En una modalidad particularmente preferida, el adenovirus quimérico comprende la SEQ ID NO: 1. La presente invención proporciona un adenovirus quimérico recombinante, o una variante o derivado del mismo, que tiene un genoma que comprende una región E2B donde la región E2B comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de un primer serotipo adenoviral y un segundo ácido nucleico derivado de un segundo serotipo adenoviral; donde el primer y segundo serotipos adenovirales son seleccionados cada uno de los subgrupos adenovirales B, C, D, E o F y son distintos entre sí; donde el adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un mejor índice terapéutico para una célula tumoral; y donde el adenovirus quimérico se ha vuelto deficiente en la replicación a través de la supresión de una o más regiones adenovirales que codifican para proteínas implicadas en la replicación adenoviral seleccionada del grupo que consiste de El, E2, E3 o E4. En una modalidad, el adenovirus quimérico de la invención comprende además un gen heterólogo que codifica para una proteina terapéutica, donde el gen heterólogo es expresado dentro de una célula infectada con el adenovirus. En una modalidad preferida, la proteina terapéutica es seleccionada del grupo que consiste de citocinas y quimocinas, anticuerpos, enzimas que convierten profármacos, y proteínas inmunorreguladoras . La presente invención proporciona métodos para usar los adenovirus quiméricos de la invención para propósitos terapéuticos. En una modalidad, los adenovirus quiméricos pueden ser usados para inhibir el crecimiento de células cancerosas. En una modalidad particular, un adenovirus quimérico que comprende la SEQ ID NO: 1 es útil para inhibir el crecimiento de células de cáncer de colon. En otra modalidad, los adenovirus de la invención son útiles como vectores para proporcionar proteínas terapéuticas a las células. La presente invención proporciona un método para la producción de adenovirus quiméricos de la invención, donde el método comprende a) reunir los serotipos adenovirales que representen a los subgrupos adenovirales B-F, creando por lo tanto una mezcla adenoviral; b) pasar la mezcla adenoviral reunida del paso (a) sobre un cultivo de células tumorales que crezcan activamente a una relación de partícula por célula suficientemente alta para alertar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta para producir muerte celular prematura; c) cosechar el sobrenadante del paso (b) ; d) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en el paso (c) ; e) cosechar el sobrenadante del cultivo celular del paso (d) antes de cualquier signo de CPE; f) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en el paso (e) ; y g) aislar el adenovirus quimérico del sobrenadante cosechado en el paso (f) por purificación de la placa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A y IB. Perfiles de tiempo de retención de Ad sobre una columna de CLAP TMAE. 1A) Perfiles de retención para los serotipos de Ad individuales que fueron usados para generar el conjunto viral inicial original. IB) Perfiles de Retención del paso de 20 grupos derivados de las lineas celulares HT-29, Panc-1, MDA-231, y PC-3, respectivamente . Figuras 2A-2D. Actividad citolitica de grupos de virus individuales. 2A) HT-29, 2B) MDA-231, 2C) Panc-1 y 2D) las células PC-3 fueron infectadas con sus conjuntos virales respectivos a relaciones de VP por célula de 100 a 0.01. Los ensayos de MTS se efectuaron en días diferentes después de la infección (como lo indicado) dependiendo de la linea celular. Cada dato punteado en el panel representa un ensayo efectuado por cuadruplicado y los resultados se expresaron como las medias +/- DE. El panel describe un experimento representativo y todos los conjuntos virales fueron ensayados al menos tres veces independientes sobre la linea celular tumoral objetivo (Leyenda de las Figuras: -•- Ad5; -D- conjunto viral inicial; -W- conjunto derivado de células especificas, pase 20) . Figuras 3A y 3B. Actividad Citolitica de ColoAdl y Ad5 sobre líneas de células tumorales humanas. Se efectuó un ensayo de MTS sobre 3A) un panel amplio de líneas de células tumorales humanas y 3B) sobre un panel de líneas celulares de cáncer de colon humano para determinar su especificidad de potencia potencial. Se efectúo un ensayo MTS en diferentes días dependiendo de la linea celular. Cada panel es un experimento representativo que ha sido repetido al menos tres veces. Cada dato puntual en el panel representa un ensayo adecuado por cuadruplicado y los resultados se expresaron como los medios +/- DE (Leyenda de las Figuras: -•- Ad5; -D- ColoAdl) .

Figura 4. Actividad citolítica de ColoAdl y Ad5 sobre un panel de células normales. Las células HS-27, HUVEC y SAEC (fibroblastos primarios, células endoteliales, y células epiteliales, respectivamente) fueron infectadas con ColoAdl y Ad5 a relaciones VP por células de 100 a 0.01. El ensayo MTS se efectuó en diferentes dias después de la infección dependiendo de la célula y cada panel es un experimento representativo que ha sido repetido al menos tres veces. Cada dato puntual en un panel representa un ensayo efectuado por cuadruplicado y los resultados se expresaron como las medias +/- DE (Leyenda de las Figuras: -•- Ad5; -D- ColoAdl) . Figuras 5A y 5B. Actividad citolítica de ColoAdl, Ad5 y ONYX-015 sobre células endoteliales primarias normales (HUVEC) y linea celular de tumor de colon (HT-29) . Cada panel es un experimento representativo que ha sido repetido al menos tres veces. Cada dato puntual en el panel representa un ensayo efectuado por cuadriplicado y los resultados se expresaron como las medias +/- DE (Leyenda de las Figuras: -•- Ad5; -D- ColoAdl; -U- Onyx-015) . Figuras 6A y 6B. Actividad citolitica de ColoAdl, Adllp y Ad5 sobre una linea celular epitelial normal (SAEC) y una linea celular de cáncer de colon humano (HT-29) . Cada panel es un experimento representativo que ha sido repetido al menos tres veces. Cada dato puntual en un panel representa un ensayo efectuado por cuadruplicado y los resultados se expresaron como las medias +/- DE (Leyenda de las Figuras: -•- Ad5; -D- Adllp; -B- ColoAdl) . Figura 7. Actividad citolitica de Virus Recombinantes. Los virus recombinantes que representan cuatro poblaciones virales (Adpll, ColoAdl, Adllp del extremo izquierdo/ColoAdl del extremo derecho (ColoAdl.1) y ColoAdl del extremo izquierdo/Adllp extremo derecho (ColoAdl.2) fueron construidos como se describe en el Ejemplo 6. La actividad citolitica de cada población en las células HT29 fue determinada como se describió anteriormente. (Leyenda de la Figura: -•- Ad5; -D- Adllp; - U- ColoAdl; - -ColoAdl .1; -A- ColoAdl.2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, incluyendo las patentes y solicitudes de patente, mencionadas en esta especificación se incorporan aqui como referencia en el mismo grado como si cada publicación individual fuese indicada especifica e individualmente incorporada como referencia en su totalidad. Definiciones A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aqui que tienen el mismo significado como es comprendido comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece ésta invención. De manera general, la nomenclatura usada aqui y los procedimientos de laboratorio descritos más adelante son aquéllos bien conocidos y comúnmente empleados en la técnica. Como se usa aqui, el término "adenovirus", "serotipo" o "serotipo adenoviral" se refiere a cualquiera de los 51 serotipos adenovirales humanos actualmente conocidos, o aislados en el futuro. Véase, por ejemplo, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY., pp. 451-596 (1984). Esos serotipos se clasifican en los subgrupos A-F (Véase, Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication", in Fields Virology, Vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001), como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 Tabla 1 (continuación) 40, 41 Como se usa aqui, "adenovirus quimérico" se refiere a un adenovirus cuya secuencia de ácido nucleico está comprendida de las secuencias de ácido nucleico de al menos dos de los serotipos adenovirales descritos anteriormente . Como se usa aqui, "serotipo adenoviral padre" se refiere al serotipo adenoviral que representa el serotipo del cual se deriva la mayoría del genoma de los adenovirus quiméricos . Como se usa aqui, el término "recombinación homologa" se refiere a dos moléculas de ácido nucleico, cada una de las cuales tiene secuencias homologas, donde las dos moléculas de ácido nucleico se cruzan o experimentan recombinación en la región de homología. Como se usa aqui, el término "potencia" se refiere al potencial Utico de un virus y representa su capacidad para replicarse, Usarse y propagarse. Para los propósitos de la presente invención, la potencia es un valor que compara la actividad citolítica de un adenovirus dado de la invención con la Ad5 en la misma linea celular, es decir potencia = CI50 de AdX/CIso de Ad5, donde X es el serotipo adenoviral particular que está siendo examinado y donde la potencia del Ad5 se le dio un valor de 1. Como se usa aqui, el término "virus oncolitico" se refiere a un virus que preferiblemente mata células cancerígenas en comparación con células normales. Como se usa aqui, el término "Índice terapéutico" ó "ventana terapéutica" se refiere a un número que indica el potencial oncolitico de un adenovirus dado y es determinado dividiendo la potencia del adenovirus en una línea de células de cáncer por la potencia del mismo adenovirus en una linea celular normal (es decir no cancerosas) . Como se usa aqui, el término "modificado" se refiere a una molécula con una secuencia de nucleótidos o aminoácidos que difiere de una natural, por ejemplo una secuencia de nucleótidos o aminoácidos de tipo silvestre. Una molécula modificada puede retener la función o actividad de una molécula del tipo silvestre, es decir que un adenovirus modificado puede retener su actividad oncolitica. Las modificaciones incluyen mutaciones de los ácidos nucleicos descritos más adelante. Como se usa aqui, la "mutación" con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un cambio o diferencia natural, sintética, recombinante o química a la estructura primaria, secundaria o terciaria de un polinucleótido o polipéptido, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, en comparación con un polinucleótido o polipéptido del tipo silvestre) . Las mutaciones incluyen cambios como, por ejemplo, supresiones, inserciones, o sustituciones. Los polinucleótidos y polipéptidos que tienen esas mutaciones pueden ser aislados o generados usando métodos bien conocidos en la técnica. Como se usa aqui, la "supresión" se define como un cambio en cualesquier secuencias polinucleotídica o de aminoácidos en el cual uno o más polinucleótidos o aminoácidos residuales, respectivamente, están ausentes. Como se usa aqui, "inserción" o "adición" es aquel cambio en una secuencia polinucleotídica o de aminoácidos que ha dado como resultado la adición de uno o más polinucleótidos o aminoácidos residuales, respectivamente, en comparación con la secuencia polinucleotidica o de aminoácidos natural. Como se usa aqui, "sustitución" resulta del reemplazo de uno o más polinucleótidos o aminoácidos por diferentes polinucleótidos o aminoácidos respectivamente. Como se usa aqui, el término "derivado adenoviral" se refiere a un adenovirus de la invención que ha sido modificado de modo que se haya hecho una adición, supresión o sustitución a o en el genoma viral, de modo que el derivado adenoviral resultante exhiba una potencia y/o Índice terapéutico mayor que el del adenovirus padre, o de alguna otra manera sea más terapéuticamente útil (es decir, menos inmunogénico, con mejor perfil de eliminación) . Por ejemplo, un derivado de un adenovirus de la invención puede tener una supresión en uno de los genes iniciales del genoma viral, incluyendo, pero sin limitarse a la región E1A o E2B del genoma viral. Como se usa aqui, el término "variante" con referencia a un polinucleótido o polipéptido, se refiere a un polinucleótido o polipéptido que puede variar en la estructura primaria, secundaria o terciaria, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de referencia, respectivamente (por ejemplo, en comparación con un polinucleótido o polipéptido de tipo silvestre) . Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico puede contener una mutación o modificación que difiera de la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico de referencia. En algunas modalidades, la variante adenoviral puede ser un isoformo diferente o polimorfismo. Las variantes pueden ser polinucleótidos o polipéptidos naturales, sintéticos, recombinantes o modificados químicamente, aislados o generados usando métodos bien conocidos en la técnica. Los cambios en la secuencia polinucleotidica de la variante pueden ser silenciosos. Es decir, que pueden no alterar a los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Donde las alteraciones se limiten a cambios silenciosos de este tipo, una variante codificará un polipéptido con alguna secuencia de aminoácidos como la referencia. De manera alternativa, esos cambios en la secuencia polinucleotidica de la variante pueden alterar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia, dando como resultado cambios de aminoácidos conservativos y no conservativos, como se describe más adelante. Esos cambios polinucleotídicos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncaciones de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Pueden ser introducidas varias sustituciones de codon, como los cambios silenciosos que producen varios sitios de restricción, para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o de expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular. Como se usa aqui, una "variante adenoviral" se refiere a un adenovirus cuya secuencia polinucleotidica difiere de un polinucleótido de referencia, por ejemplo un adenovirus de tipo silvestre, como se describió anteriormente. Las diferencias están limitadas de modo que las secuencias polinucleotídicas del padre y la variante son similares en todo y, en la mayoría de las regiones idénticas. Como se usa aquí, se dice que una primera secuencia nucleotidica o de aminoácidos es "similar" a una segunda secuencia cuando una comparación de las dos secuencias muestre que tienen pocas diferencias en la secuencia (es decir, que la primera y segunda secuencias son casi idénticas) . Como se usa aqui, las diferencias de la secuencia polinucleotidica que están presentes entre la variante adenoviral y el adenovirus de referencia no dan como resultado una diferencia en la potencia y/o Índice terapéutico. Como se usa aqui, el término "conservativa" se refiere a la sustitución de un aminoácido residual por un aminoácido diferente que tiene propiedades químicas similares. La sustitución de aminoácidos conservativa incluye el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina. Las inserciones o supresiones están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 hasta 5 aminoácidos. Como se usa aqui, el término "no conservativa" se refiere a sustituir un aminoácido residual por un aminoácido residual diferente que tiene propiedades químicas diferentes. Las sustituciones no conservativas incluyen, pero no se limitan al ácido aspártico (D) siendo reemplazado con glicina (G) ; asparagina (N) siendo reemplazada con lisina (K) ; o alanina (A) siendo reemplazada con arginina (R) .

Los códigos de una sola letra para los aminoácidos residuales incluyen los siguientes: A= alanina, R= arginina, N= asparagina, D= ácido aspártico, C= cisteina, Q= glutamina, E= Acido glutámico G= glicina, H= histidina, 1= isoleucina, L= leucina, K= lisina, M= metionina, F= fenilalanina, P= prolina, S= serina, T= treonina, W= triptófano, Y= tirosina, V= valina. Se apreciará que los polipéptidos con frecuencia contienen aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos comúnmente referidos como los 20 aminoácidos naturales, y que muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden ser modificados en el polipéptido dado, ya sea por procesos naturales como la glicosilación y otras modificaciones postraslacionales, o por técnicas de modificación química las cuales son bien conocidas en la técnica. Aún las modificaciones comunes que ocurren naturalmente en los polipéptidos son demasiado numerosas para listarlas exhaustivamente, pero ellas son bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en la literatura de investigación voluminosa, y son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención se encuentran, por nombrar unas cuantas ilustrativas, la acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una porción heme, unión covalente de un polinucleótido o un derivado polinucleotidico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclización, formación de enlace disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolitico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas como la arginilación y ubiquitinación. Esas modificaciones son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y han sido descritas con mayor detalle en la literatura científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión de lipido, sulfación, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, son descritas en la mayoría de los textos básicos, por ejemplo, I.E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties , 2da Ed. , W.H. Freeman and Company, New York, 1993. Están disponibles muchas revisiones detalladas sobre este aspecto, como, por ejemplo, aquellas proporcionadas por Wold, F., en Post transla tional Covalen t Modifi ca tion of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et al., Meth Enzymol . 182:626-646, 1990 y Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann . N.Y. Acad. Sci. 663 : 48-62, 1992. Se apreciará, como es bien sabido y como se hace notar aqui, que los polipéptidos no siempre son totalmente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, generalmente como un resultado de los eventos postraslacionales, incluyendo eventos de procesamiento natural y eventos llevados a cabo por manipulación humana, la cual no ocurre de manera natural. Los polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados pueden ser sintetizados por procesos naturales no traslacionales y métodos totalmente sintéticos, también. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar en un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptidico, la cadena lateral de aminoácidos y el amino o carboxilo terminales. En efecto, el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido o ambos, por una modificación covalente, es común que ocurra naturalmente y los polipéptidos sintéticos de esas modificaciones puedan estar presentes en los polipéptidos de la presente invención, también. Por ejemplo, el residuo aminoterminal de los polipéptidos producidos en E. coli , antes del procesamiento proteolitico, casi invariablemente será N-formilmetionina . Las modificaciones que ocurren en un polipéptido con frecuencia serán función de cómo sea producido. Para polipéptidos producidos expresando un gen clonado en un anfitrión, por ejemplo la naturaleza y grado de la modificación en gran medida será determinada por la capacidad de modificación postraslacional de la célula anfitriona y las señales de modificación presentes en la secuencia polipeptidica y de aminoácidos. Por ejemplo, como es bien sabido, la glicosilación con frecuencia no ocurre en anfitriones bacterianos como E. coli . En consecuencia, cuando se desee la glicosilación, un polipéptido deberá ser expresado en un anfitrión glicosilante, generalmente una célula eucariótica. Las células de insecto con frecuencia llevan a cabo las mismas glicosilaciones postraslacionales que las células de mamífero y, por esta razón, han sido desarrollados sistemas de expresión de células de insecto para expresar eficientemente proteínas de mamífero que tengan patrones nativos de glicosilación, ín ter alia . Consideraciones similares se aplican a otras modificaciones. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o un grado variable en varios sitios en un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones . Como se usa aqui, los siguientes términos son usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o secuencias de aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", "identidad sustancial", "similitud", y "homólogo". Una "secuencia de referencia" se define como la secuencia usada como base para una comparación de secuencia; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc o secuencia de gen de longitud completa dada en un listado de secuencia o puede comprender un -ADNc o secuencia genética completa. Generalmente, la secuencia de referencia es de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos de longitud, con frecuencia al menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos de longitud, y con frecuencia al menos 48 nucleótidos o 10 aminoácidos de longitud. Puesto que dos secuencias polinucleotidicas o de aminoácidos pueden (1) comprender cada uno una secuencia (es decir, una porción de la secuencia polinucleotídica o de aminoácidos completa) que es similar entre las dos moléculas, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre dos secuencias polinucleotidicas o de aminoácidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) moléculas se efectúan típicamente comparando las secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa aquí, se refiere a un segmento conceptual de al menos 18 posiciones nucleotidicas o 6 aminoácidos contiguos, donde una secuencia polinucleotidica o una secuencia de aminoácidos puede ser comparada con una secuencia de referencia de secuencias de al menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos contiguos y donde la porción de la secuencia polinucleotidica en la ventana de comparación puede comprender adiciones, supresiones, sustituciones y similares (es decir huecos) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede ser conducido, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, Adv. Appl . Ma th . 2:482 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443 (1970), por la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Na ti . Acad. Sci (U.S.A.) 85:2444 (1988), por implementaciones computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), y los paquetes de programas VectorNTI de informatix, Geneworks o MacVector) , o por inspección y la mejor alineación (es decir, la que de cómo resultado el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generada por varios métodos es seleccionada. Como se usa aquí, el término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias polinucleotidicas o de aminoácidos son idénticas (es decir, sobre una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de la identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales ocurren bases de ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o residuos idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se usan aquí denotan una característica del polinucleótido o secuencia de aminoácidos, donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, de manera más usual 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 18 posiciones nucleotidicas (6 aminoácidos), frecuentemente sobre una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos) , donde el porcentaje de identidad de secuencia es calculado comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones las cuales totalizan 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande. El término "similitud", cuando se usa para describir un polipéptido, es determinado comparando la secuencia de aminoácidos y los sustitutos de los aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. El término "homólogo" cuando se usa para describir un polinucleótido, indica que dos polinucleótidos o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean óptimamente y se comparan, son idénticos, con inserciones o supresiones nucleotidicas apropiadas, en al menos el 70% de los nucleótidos, usualmente de alrededor de 75% hasta 99%, y de manera más preferible al menos aproximadamente 98 a 99% de los nucleótidos.

Como se usa aqui, "homólogo", cuando se usa para describir un polinucleótido, indica que dos polinucleótidos o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean óptimamente y se comparan, son idénticos, con inserciones o supresiones nucleotidicas apropiadas, en al menos el 70% de los nucleótidos, usualmente de alrededor de 75% hasta 99%, y de manera más preferible al menos aproximadamente 98 a 99% de los nucleótidos. Como se usa aqui, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento donde piezas especificas de ADN son amplificadas como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,683,195. Generalmente, la información de la secuencia de los extremos del fragmento del polipéptido de interés o más allá necesita estar disponible, de modo que los cebadores oligonucleotidicos pueden ser designados; esos cebadores apuntarán uno hacia el otro, y serán idénticos o similares en secuencia a las hebras opuestas del patrón a ser amplificado. Los nucleótidos terminales 5' de los dos cebadores coincidirán con los extremos de material amplificado. El PCR puede ser usado para amplificar secuencias de ADN del ADN genómico total, ADNc transcrito del ARN celular total, secuencias plasmídicas, etc. (Véase de manera general Mullís et al., Cold Spring Harbor Symp . Quan t . Biol . 51:263; 1987; Erlich, Ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989) . Como se usa aqui, la "rigurosidad" típicamente ocurre en el intervalo de aproximadamente Tm (temperatura de fusión) -5°C (5° por debajo de la Tm de la sonda) hasta aproximadamente 20°C hasta por 25°C por debajo de la Tm. Como será comprendido por aquellos expertos en la técnica, puede ser usada una hibridación rigurosa para identificar o detectar secuencias polinucleotidicas idénticas o para identificar o detectar secuencias polinucleotidicas similares o relacionadas. Como se usa aquí, el término "condiciones rigurosas" significa la hibridación que ocurra únicamente si existe al menos 95% y de manera preferible al menos 97% de identidad entre las secuencias. Como se usa aqui, "hibridación", incluirá "cualquier proceso mediante el cual la hebra polinucleotidica se una con una hebra complementaria a través de un apareamiento de bases" (Coombs, J. , Di ctionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994). Como se usa aqui, el término "dosis terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de adenovirus que alivia los síntomas o condiciones de una enfermedad. Una dosis se considera una dosis terapéuticamente efectiva en el tratamiento del cáncer o su metástasis cuando el crecimiento del tumor metastásico se hace más lento o se detiene, o el tumor o la metástasis experimentan una contracción en el tamaño, para conducir a una extensión del periodo de vida del sujeto.

Adenovirus de la Invención La presente invención proporciona adenovirus quiméricos, o variantes o derivados de los mismos, que tienen un genoma en el cual la secuencia nucleotidica de la región E2B del adenovirus quimérico comprende secuencias de ácido nucleico derivado de al menos dos serotipos adenovirales, serotipos cada uno de los cuales son seleccionados de los subgrupos adenovirales B, C, D, E y F y son distintos entre sí. Un adenovirus quimérico de la invención es oncolitico y demuestra un mejor Índice terapéutico para una célula tumoral.

Aislamiento de los Adenovirus Quiméricos Los adenovirus quiméricos de la invención, o variantes o derivados de los mismos pueden ser producidos usando la modificación de una técnica conocida como "bioselección", en la cual un adenovirus con las propiedades deseadas, como mayor oncogenicidad o especificidad del tipo de célula, es generado a través del uso de selección genética bajo condiciones controladas (Yan et al. (2003) J. Virol . 77:2640-2650). En la presente invención, se reúne una mezcla de adenovirus de diferentes serotipos y se hace pasar, preferiblemente al menos dos veces, sobre un cultivo subconfluente de células tumorales a una relación de partícula por célula suficientemente alta para alentar la recombinación entre serotipos pero no tan alta como para producir muerte celular prematura. Una relación de partícula por célula preferida es de aproximadamente 500 partículas por célula, y es determinada fácilmente por un experto en la técnica. Como se usa aqui, un "cultivo subconfluente de células" se refiere a un cultivo de monocapa o suspensión en el cual las células crecen activamente. Para que las células crezcan como una monocapa, un ejemplo seria un cultivo donde aproximadamente el 50% al 80% del área disponible para el crecimiento celular esté cubierta con células. El preferido es un cultivo donde aproximadamente el 75% del área de crecimiento está cubierta con células. En una modalidad preferida, la mezcla adenoviral es una que incluye serotipos adenovirales representativos de los subgrupos adenovirales B, C, D, E y F. Los adenovirus del grupo A no están incluidos en la mezcla puesto que están asociados con formación de tumores en roedores. Las lineas de células tumorales preferidas útiles en el proceso de bioselección incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de mama, colon, páncreas, pulmón y próstata. Algunos ejemplos de lineas celulares de tumores sólidos usadas para el pase "bioselectivo" de la mezcla adenoviral incluyen, pero no se limitan a, células MDA231, HT29, PAN-1, y PC-3. Las líneas de células hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a, las células linfoides B de Raji y Daudi, células eritroblastoides K562, células mieloides U937, y células linfoides T HSB2. Los adenovirus producidos durante esos pases iniciales son usados para infectar células tumorales inactivas a una relación de partícula a célula suficientemente baja para permitir la infección de una célula por no más de un adenovirus. Después de hasta 20 pases bajo esas condiciones, el sobrenadante del último pase es cosechado antes de un efecto citopático visible (CPE, véase Fields Virology, Vol, 2 Cuarta Edición, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, pp. 135-136) para incrementar la selección de virus altamente potentes. El sobrenadante cosechado puede ser concentrado por técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. El método preferido para aislar células inactivas, es uno en el cual el crecimiento celular activo se ha detenido, en un cultivo monocapa para permitir que el cultivo crezca durante 3 días después de la confluencia, donde la confluencia significa que toda el área disponible para el crecimiento celular está ocupada (cubierta con células). De manera similar, los cultivos en suspensión pueden hacerse crecer a densidades caracterizadas por la ausencia del crecimiento de células activas. El perfil del serotipo del sobrenadante concentrado, que contiene el conjunto adenoviral bioseleccionado, puede ser examinado midiendo los tiempos de retención del conjunto viral cosechado sobre la columna de intercambio aniónico, donde se sabe que los diferentes serotipos adenovirales tienen tiempos de retención característicos (Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062); véase el ejemplo 3, Figuras 1A y B. Los adenovirus de la invención pueden ser aislados del sobrenadante concentrado por dilución y purificación de placa, u otras técnicas bien conocidas en la técnica, y haciendo crecer para una caracterización adicional. Las técnicas bien conocidas en la técnica son usadas para determinar la secuencia de los adenovirus quiméricos aislados (véase el Ejemplo 5) . Un ejemplo de un adenovirus quimérico de la invención es el adenovirus quimérico ColoAdl, el cual fue aislado usando células de colon HT29 en el proceso de bioselección. El ColoAdl tiene la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1. La mayoría de la secuencia nucleotidica del ColoAdl es idéntica a la secuencia nucleotidica del serotipo Adll (SEQ ID NO: 2) (Stone et al. (2003) Virology 309:152-165; Mei et al. (2003) J. Gen .

Virology 84:2061-2071). Existen dos supresiones en la secuencia nucleotidica del ColoAdl en comparación con Adll, uno de 2444 pares de bases de longitud dentro de la región de la unidad de transcripción E3 del genoma (pares de bases 27979 a 30423 de la SEQ ID NO: 2) y una segunda supresión más pequeña, 25 pares de bases de longitud (pares de bases de 33164 a 33189 de la SEQ ID NO: 2), dentro del gen E4orf4. La región de la unidad de transcripción E2B (SEQ ID NO: 3) de ColoAdl, que codifica para la ADN polimerasa de proteínas adenovirales y la proteina terminal, se localiza entre los pares de bases 5067 y 10354 de la SEQ ID NO: 1, y es un área de recombinación homologa entre los serotipos Adll y Ad3. Dentro de esta región de la ColoAdl, existen 198 pares de bases, en comparación con la secuencia de Adll, (SEQ ID NO: 1) . Los cambios dan como resultado extensiones de nucleótidos dentro de la región E2B del ColoAdl que son homologas a la secuencia dentro de una porción de la región E2B del Ad3 (SEQ ID NO: 8), con la extensión más larga de homología entre el ColoAdl y Ad3 siendo de 414 pb de longitud. La región E2B del Coloadl (SEQ ID NO: 3) confiere mayor potencia al adenovirus ColoAdl en comparación con el adenovirus Adll no modificado (véase el Ejemplo 6; Figura 7) . En otras modalidades, un adenovirus quimérico de la invención puede comprender secuencias de ácido nucleico además de dos serotipos adenovirales.

Un adenovirus quimérico de la invención, o una variante o derivado del mismo, puede ser evaluado por su selectividad en un tipo de tumor especifico examinando su potencial Utico en un panel de células tumorales derivadas del mismo tejido el cual inicialmente se pasó del conjunto adenoviral. Por ejemplo, el adenovirus quimérico ColoAdl (SEQ ID NO: 1), el cual fue derivado inicialmente de un conducto adenoviral pasado sobre líneas celulares de tumor del colon HT-29, fue examinado tanto en células HT-29 como en un panel de otras lineas de células tumorales derivadas del colon, incluyendo DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48, y Colo320DM (véase la Figura 3B) . Cualesquier lineas de células tumorales de colon disponibles serian igualmente útiles para esa evaluación. Las clonas adenovirales aisladas de los conjuntos adenovirales seleccionados sobre otros tipos de células tumorales pueden ser igualmente probadas en un panel de células tumorales adecuadas, incluyendo pero sin limitarse a, lineas de células de próstata (por ejemplo lineas celulares DU145 y PC-3) ; lineas de células pancreáticas (por ejemplo la linea celular Panc-1) ; lineas de células tumorales de mama (por ejemplo la linea celular MDA231) y lineas de células de ovario (por ejemplo la linea celular OVCAR-3) . Otras lineas de células tumorales disponibles son igualmente útiles para aislar e identificar adenovirus de la invención.

Los adenovirus quiméricos de la invención tienen un mejor Índice terapéutico en comparación con los serotipos adenovirales de los cuales se derivaron. (Véase la Figura 6, la cual compara la actividad citolitica del adenovirus quimérico ColoAdl con Adllp) . La invención también abarca los adenovirus quiméricos que son construidos usando técnicas recombinantes bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Esos adenovirus quiméricos comprenden una región de la secuencia nucleotídica derivada de un serotipo adenoviral que es incorporado por técnicas recombinantes en el genoma de un segundo serotipo adenoviral. La secuencia incorporada confiere una propiedad, por ejemplo especificidad tumoral o mejor potencia, al serotipo adenoviral padre. Por ejemplo, la región E2B del ColoAdl (SEQ ID NO: 3) puede ser incorporado en el genoma del Ad35 o Ad9.

Derivados Adenovirales La invención también abarca un adenovirus quimérico de la invención que es modificado para proporcionar otros adenovirus quiméricos terapéuticamente útiles. Las modificaciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas más adelante. Una modificación es la producción de derivados del adenovirus quimérico de la invención que carece sustancialmente de la capacidad para unirse a p53, como resultado de una mutación en el gen adenoviral que codifica para la proteina E1B-55K. Esos virus generalmente tienen alguna, o toda la región E1B-55K suprimida. (Véase la Patente Estadounidense No. 5,677,178). La Patente Estadounidense No. 6,080,578 describe, entre otras cosas, mutantes de Ad5 que tienen supresiones en la región de la proteína E1B-55K que es responsable de la unión a p53. Otra modificación preferida a los adenovirus quiméricos de la presente invención son mutaciones en la región ElA, como se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,801,029 y 5,972,706. Esos tipos de modificaciones proporcionan derivados de los adenovirus quiméricos de la invención con mayor selectividad por células tumorales. Otro ejemplo de una modificación abarcada por la invención es un adenovirus quimérico que exhibe un mejor grado de especificidad tisular debido a la colocación de la replicación viral bajo el control de un promotor especifico del tejido como se describe en la Patente Estadounidense No. 5,998,205. La replicación de un adenovirus quimérico de la invención puede ser colocada bajo el control de un elemento que responda a E2F como se describe en la solicitud de Patente Estadounidense No. 09/714,409. Esta modificación proporciona un mecanismo de control de replicación viral basado en la presencia de E2F, que da como resultado una mejor especificidad del tejido tumoral, y es distinto del control realizado por el promotor especifico del tejido. En ambas de esas modalidades, el promotor especifico del tejido y el elemento que responde a E2F son ligados operativamente a un gen adenoviral que es esencial para la replicación del adenovirus. Otra modificación abarcada por la invención, es el uso de un adenovirus quimérico de la invención por ejemplo el ColoAdl, como el esqueleto para la producción de vectores adenovirales deficientes en la replicación, novedosos. Como se describe en Lai et al. (2002) DNA Cell Bio . 21:895-913), los vectores adenovirales que son deficientes en la replicación pueden ser usados para proporcionar y expresar genes terapéuticos. Tanto en la primera generación (en la cual las regiones El y E3 están suprimidas) como en la segunda generación (en la cual la región E4 está adicionalmente suprimida) los vectores adenovirales derivados de los adenovirus quiméricos de la invención son proporcionados aqui. Esos vectores son producidos fácilmente usando técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (véase Imperiale and Kochanek (2004) Curr. Top . Microbiol . Im unol . 273:335-357; Vogels et al . (2003) J. Virol . 11 :8263-8271) . Una modificación adicional abarcada por la invención es la inserción de un gen heterólogo, útil como un marcador o reportero para seguir la eficiencia de la infección viral. Una modalidad de este tipo de modificación es la inserción del gen de timidina cinasa (TK) . La expresión de TK dentro de células infectadas puede ser usada para seguir el nivel de virus restante en las células después de la infección viral, usando sustratos marcados radioactivamente de la reacción de TK (Sangro et al. (2002) Mol . I aging Biol . 4:27-33). Los métodos para la construcción de los adenovirus quiméricos modificados son generalmente conocidos en la técnica. Véase, Mittal, S.K. (1993) Virus Res . 28:67-90 y Hermiston, T. et al. (1999) Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed. Humana Press. Se usan técnicas estándar para métodos de ácido nucleico recombinante, síntesis polinucleotídica y cultivo y transformación microbiana (por ejemplo electroporación, lipofección) . Generalmente, las reacciones enzimáticas y los pasos de purificación se efectúan de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos son efectuados generalmente de acuerdo a métodos convencionales en la técnica y varias referencias generales (véase, de manera general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da. Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) las cuales son proporcionadas a través de este documento. La nomenclatura usada aqui y los procedimientos de laboratorio en química analítica, química sintética orgánica y formulación farmacéutica descritas más adelante son aquellas bien conocidas y comúnmente empleadas en la técnica.

Determinación del Potencial Terapéutico Los adenovirus quiméricos de la invención o variantes o derivados de los mismos, pueden ser evaluados por su utilidad terapéutica examinando su potencial Utico en células tumorales derivadas de tejidos de interés como blancos terapéuticos. Las lineas celulares tumorales útiles para probar esos adenovirus incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares de colon, incluyendo pero sin limitarse a las lineas celulares DLD-1, HCT116, HT29, LS1034 y SW48; lineas celulares de próstata, incluyendo pero sin limitarse a las lineas celulares DU145 y PC-3; lineas de células pancreáticas, incluyendo pero sin limitarse a la linea celular Panc-1; lineas de células tumorales de mama, incluyendo pero sin limitarse a la línea celular MDA231 y líneas celulares de ovario, incluyendo pero sin limitarse a, la linea celular OVCAR-3. Las lineas de células hematopoyéticas incluyen, pero no se limitan a, células B linfoides de Raji y Daudi, células eritroblastoides K562, células mieloides U937 y células linfoides T HSB2.

Cualesquier otras lineas de células tumorales que estén disponibles pueden ser usadas para evaluar e identificar los adenovirus de la invención para usarse en el tratamiento de neoplasia. La actividad citolitica de los adenovirus de la invención puede ser determinada en lineas de células tumorales representativas y los datos convertidos a una medición de potencia, con un adenovirus perteneciente al subgrupo C, preferiblemente el Ad5, siendo usado como estándar (es decir dándole una potencia de 1) . Un método preferido para determinar la actividad citolitica es un ensayo de MTS (véase el Ejemplo 4, Figura 2) . El Índice terapéutico de un adenovirus de la invención en una linea de célula tumoral particular puede ser calculado por comparación de la potencia del adenovirus dado en una linea celular tumoral con la potencia del mismo adenovirus en una línea celular no cancerosa. Las líneas celulares no cancerosas preferidas son las células SAEC, las cuales son de origen epitelial, y las células HUVEC las cuales son de origen endotelial (véase la Figura 4). Esos dos tipos celulares representan células normales de las cuales los órganos y vasculatura respectivamente, se derivan y son representativos de sitios probables de toxicidad durante la terapia adenoviral, dependiendo del modo de liberación del adenovirus. Sin embargo, la práctica de la invención no se limita al uso de esas células, y también pueden ser usadas otras lineas celulares no cancerosas (por ejemplo células B, células T, macrófagos, monocitos, fibroblastos) . Los adenovirus quiméricos de la invención pueden ser evaluados adicionalmente por su capacidad para dirigir el crecimiento de células neoplásicas (es decir cáncer) o la capacidad para reducir la tumorigénesis o carga de células neoplásicas en ratones desnudos que alojen un transplante de células neoplásicas, en comparación con ratones no tratados que alojen una carga celular neoplásica equivalente (véase el Ejemplo 7). La evaluación de los adenovirus de la invención también puede ser efectuada usando explantes de tumores humanos primarios (Lam et al. (2003) Cáncer Gene Therapy; Grill et al. (2003) Mol . Therapy 6:609-614), los cuales proporcionan condiciones de prueba presentes en tumores que no pueden ser producidos normalmente usando estudios de xenoinjerto tumoral.

Utilidad Terapéutica La presente invención proporciona el uso de adenovirus quiméricos de la invención para la inhibición del crecimiento de células tumorales, asi como para el uso de vectores adenovirales derivados de esos adenovirus quiméricos para proporcionar propiedades terapéuticas útiles en el tratamiento de la neoplasia y otras condiciones de enfermedad.

Composiciones Farmacéuticas y Administración La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas las cuales comprenden los adenovirus quiméricos de la invención, incluyendo variantes y derivados de los mismos, formuladas para administrarse terapéuticamente a un paciente. Para uso terapéutico, se administra una composición estéril que contiene una dosis farmacológicamente efectiva de adenovirus a un paciente humano o paciente no humano veterinario para el tratamiento, - por ejemplo, de una condición neoplásica. Generalmente, la composición comprenderá aproximadamente 1011 o más partículas de adenovirus en una suspensión acuosa. Un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable es con frecuencia empleado en esas composiciones estériles. Puede usarse una variedad de soluciones acuosas, por ejemplo agua, agua amortiguada, solución salina al 0.4%, glicina al 0.3% y similares. Esas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia particulada diferente al vector adenoviral deseado. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas como agentes para ajustar y amortiguar el pH, agentes para ajustar la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. Pueden ser incluidos excipientes que mejoren la infección de las células por el adenovirus (véase la Patente Estadounidense No. 6,392,069). Los adenovirus de la invención también pueden ser proporcionados a las células neoplásicas por liberación de liposomas o inmunoliposoma; esa liberación puede ser dirigida selectivamente a células neoplásicas sobre la base de una propiedad de la superficie celular presente sobre la población de células neoplásicas (por ejemplo, la presencia de una proteina de la superficie celular que se una a una inmunoglobulina en un inmunoliposoma) . Típicamente, una suspensión acuosa que contiene los viriones se encapsula en liposomas o inmunoliposomas. Por ejemplo, la suspensión de viriones de adenovirus puede ser encapsulada en núcelos para formar inmunoliposomas por métodos convencionales (Patente Estadounidense No. 5,043,164, Patente Estadounidense No. 4,957,735, Patente Estadounidense No. 4,925,661; Connor and Huang, (1985) J. Cell Biol . 101:581; Lasic D.D. (1992) Na ture 355:279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott and Nimmo, Wiley, New York-, 1989); Reddy et al. (1992) J. Immunol . 148:1585). Los inmunoliposomas que contienen un anticuerpo que se une específicamente a un antigeno de célula cancerosa (por ejemplo, CALLA, CEA) presente sobre las células cancerosas del individuo puede ser usado para dirigir los viriones a aquellas células (Fisher (2001) Gene Therapy 8:341-348). Para incrementar aún más la eficacia de los adenovirus de la invención, ellos pueden ser modificados para exhibir un mejor tropismo para tipos de células tumorales particular. Por ejemplo, como se muestra en la PCT/US98/04964, una proteina sobre la cubierta exterior de un adenovirus puede ser modificada para presentar un agente químico, preferiblemente un polipéptido, que se una a un receptor presente sobre células tumorales en un mayor grado que las células normales. (Véanse también las Patentes Estadounidenses Nos. 5,770,442 y 5,712,136). El polipéptido puede ser un anticuerpo y preferiblemente un anticuerpo de una sola cadena.

Terapia Adenoviral Los adenovirus de la invención, o composiciones farmacéuticas de los mismos, pueden ser administrados para el tratamiento terapéutico de una enfermedad neoplásica o cáncer. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas en un paciente ya afectado por la enfermedad neoplásica particular, en una cantidad suficiente para curar o al menos contrarrestar parcialmente la condición y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como una "dosis terapéuticamente efectiva" o "dosis eficaz". Las cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad de la condición, el estado general del paciente, y la ruta de administración. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, un paciente humano o mamífero no humano que tenga una enfermedad neoplásica sólida o hematológica (por ejemplo, carcinoma pancreático, de colon, de ovario, pulmón o mama, leucemia o mieloma múltiple) puede ser tratado administrando una dosis terapéuticamente efectiva de un adenovirus apropiado de la invención, es decir uno que haya mostrado tener un mejor Índice terapéutico para ese tipo de tejido. Por ejemplo, un adenovirus quimérico preferido para el tratamiento del cáncer de colon seria el adenovirus ColoAdl (SEQ ID NO:l). Las suspensiones de partículas de adenovirus infecciosas pueden ser liberadas al tejido neoplásico por varias rutas, incluyendo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica y tópica. Una suspensión de adenovirus que contiene de aproximadamente 103 a 1012 o más partículas de virión por mi, puede ser administrada por infusión (por ejemplo, en la cavidad peritoneal para tratar el cáncer de ovario, en la vena porta para tratar el hepatocarcinoma o metástasis hepática de otros tumores primarios no hepáticos) u otra ruta adecuada, incluyendo la inyección directa en la masa tumoral (por ejemplo, un tumor en la mama), enema (por ejemplo, cáncer de colon), o catéter (por ejemplo, cáncer de vejiga). Otras rutas de administración pueden ser adecuadas para carcinomas de otros orígenes, es decir inhalación como una niebla (por ejemplo, para la liberación pulmonar para tratar el carcinoma broncogénico, carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma pulmonar o cáncer de laringe) o aplicación directa a un sitio tumoral (por ejemplo, carcinoma broncogénico, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma laríngeo, carcinoma cervical) . La terapia adenoviral usando los adenovirus de la presente invención puede ser combinada con otros protocolos antineoplásicos, como la quimioterapia convencional o terapia con rayos x para tratar un cáncer particular. El tratamiento puede ser concurrente o secuencial. Un agente quimioterapéutico preferido es el cisplatino, y la dosis preferida puede ser elegida por el practicante sobre la base de la naturaleza del cáncer a ser tratado, y otros factores considerados de manera rutinaria en la administración de cisplatino. Preferiblemente el cisplatino será administrado intravenosamente en una dosis de 50-120 mg/m2 durante 3-6 horas. De manera más preferible se administra intravenosamente a una dosis de 80 mg/m2 durante 4 horas. Un segundo agente quimioterapéuticamente preferido es el 5-fluorouracilo, el cual con frecuencia es administrado en combinación con el cisplatino. La dosis preferida de 5-fluorouracilo es de 800-1200 mg/m2 por dia durante 5 días consecutivos. La terapia adenoviral usando los adenovirus de la presente invención como vectores adenovirales también puede ser combinada con otros genes que se sabe son útiles en la terapia basada en virus. Véase la Patente Estadounidense No. 5,648,478. En esos casos, el adenovirus quimérico comprende además un gen heterólogo que codifica para una proteina terapéutica, incorporado dentro del genoma viral, de modo que el gen heterólogo sea expresado dentro de una célula infectada. Una proteina terapéutica, como se usa aquí, se refiere a una proteina que se esperarla proporcione algún beneficio terapéutico cuando se exprese en una célula dada. En una modalidad, el gen heterólogo es un gen activador de un profármaco, como la citosina desaminasa (CD) (Véanse, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,631,236; ,358,866; y 5,677,178). En otras modalidades, el gen heterólogo es un inductor conocido de muerte celular, por ejemplo apoptina o proteina de muerte adenoviral (ADP) , o una proteina de fusión, por ejemplo, glicoproteína de membrana fusogénica (Danen-Van Oorschot et al. (1997) Proc . Na t . Acad. Sci . 94:5843-5847; Tollefson et al. (1996) J. Virol 70:2296-2306; Fu et al. (2003) Mol . Therapy 7:48-754,2003; Ahmed et al. (2003) Gene Therapy 10:1663-1671; Galanis et al. (2001) Human Gene Therapy 12 (7 ): 811-821) . Los ejemplos adicionales de genes heterólogos, o fragmentos de los mismos, incluyen aquellos que codifican para proteínas inmunomoduladoras, como citocinas o quimiocinas. Los ejemplos incluyen a la interleucina 2, Patentes Estadounidenses Nos. 4,738,927 ó 5,641,665; interleucina 7, Patentes Estadounidenses Nos. 4,965,195 ó 5,328,988; e interleucina 12, Patente Estadounidense No. 5,457,038; factor de la necrosis tumoral alfa, Patentes Estadounidenses Nos. 4,677,063 ó 5,773,582; interferón gamma, Patentes Estadounidenses 4,727,138 ó 4,762,791; o GM CSF, Patentes Estadounidenses Nos. 5,393,870 ó 5,391,485, Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Fa ctor Rev. 8:119-128). Las proteínas inmunomoduladoras adicionales incluyen además proteínas inflamatorias de macrófago, incluyendo la MIP-3. La proteina quimiotáctica de monocito (MCP-3 alfa) también puede ser usada; una modalidad preferida de un gen heterólogo es un gen quimérico que consiste en un gen que codifique para una proteina que atraviesa membranas celulares, por ejemplo, VP22 o TAT, fusionada a un gen que codifica para una proteína que es preferiblemente tóxica a células cancerosas pero no normales. Los adenovirus quiméricos de la invención también pueden ser usados como vectores para proporcionar genes que codifiquen para moléculas de ARN terapéuticamente útiles, es decir, ARNsi (Dorsett and Tuschi (2004) Na ture Rev Drug Disc 3:318-329) . En algunos casos, pueden ser incorporados genes en un adenovirus quimérico de la invención para mejorar aún más la capacidad del virus oncolitico para erradicar el tumor, aunque no tenga ningún efecto directo sobre el tumor en si - esos incluyen genes que codifican para proteínas que comprenden la presentación MHC de la clase I (Hewitt et al. (2003) Immunology 110:163-169), complemento del bloque, inhibición de IFNs y mecanismos inducidos por IFN, quimiocinas y citocinas, muerte basada en las células NK (Orange et al., (2002) Na ture Immunol . 3:1006-1012; Mireille et al. (2002) Iiwnunoge.neties 54:527-524; Alcami (2003) Na ture Rev. Immunol . 3:36-50; down regúlate the immune response (e.g. IL-10, TGF-Beta, Khong and Restifo (2002) Na ture Immunol . 3:999-1005; 2002) y metaloproteasas las cuales pueden degradar la matriz extracelular y buscan la propagación del virus dentro del tumor (Bosman and Stamenkovic (2003) J. Pa thol . 2000:423-428; Visse and Nagase (2003) Circula tion Res . 92:827-839).

Equipos La invención se relaciona además con paquetes y equipos farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente. Asociada con esos recipientes puede estar una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la elaboración, uso o venta de fármacos o productos biológicos, que reflejen la aprobación por la agencia de la elaboración, uso o venta del producto de la administración en humanos. La presente invención se describe mejor por los siguientes ejemplos, los cuales son ilustrativos de modalidades especificas de la invención, y varios usos de la misma. Esos ejemplos, los cuales ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no implican limitaciones o circunscriben el alcance de la invención revelada. A menos que se indique otra cosa, la práctica de la presente invención emplea técnicas convencionales de cultivo celular, biología molecular, microbiología, manipulación de ADN recombinante, ciencia inmunológica, las cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Esas técnicas son ejemplificadas completamente en la literatura. Véase, por ejemplo Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Celis (Ed) . Academia Press. N.Y. (1996); Graham, F.L. and Preveo, L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. In: Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth. Pp 363-390; Grahan and Prevec Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pp 109-128, 1991; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), and Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

EJEMPLOS Métodos Se usaron técnicas estándar para los métodos del ácido nucleico recombinante, síntesis polinucleotídica y cultivo y transformación microbial (por ejemplo, electroporación, lipofección) . De manera general, las reacciones enzimáticas y pasos de purificación son efectuados de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las técnicas y procedimientos se efectuaron de manera general de acuerdo a métodos convencionales en la técnica y varias referencias generales (véase, de manera general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Edition (1989) cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) las cuales se proporcionan a través de éste documento. La nomenclatura usada aqui y en los procedimientos de laboratorio en química analítica, química de síntesis orgánica y formulaciones y de liberación farmacéutica, y tratamiento de los pacientes. Los métodos para la construcción de mutantes adenovirales son generalmente conocidos en la técnica. Véase Mittal, S. K., Virus Res., 1993., vol: 28, páginas 67-90; y Hermiston, T. et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed. Humana Press, 1999. Además el genoma adenovirus 5 está registrado como Genbank 10 con el número de acceso #M73260, y el virus está disponible en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, E.U. bajo el número de acceso VR-5.

Virus y Lineas Celulares Los serotipos Ad de Ad3 (cepa GB) , Ad4 (cepa RI-67), Ad5 (cepa Adenoide 75), Ad9 (cepa de Hicks) , Adllp (cepa de Slobitski), Adl6 (cepa Ch. 79) y todas las lineas celulares, con excepción de las siguientes fueron compradas de ATCC: MDA231-mtl (un derivado aislado por el Dr. Deb Zajchowski de un xenoinjerto de células MDA231 fue implantado, subcutáneo que crece rápidamente) y Pancl-sct (derivado por la Dra. Sandra Biroc de un xenoinjerto de células Panel implantado, subcutáneo que crece rápidamente) , HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, N.Y.) y SAEC (Clonetics, Walkersville, MD) . El Ad40 fue donado amablemente por el Dr. Williams S.M. Wold en la Universidad de St. Louis.

Ejemplo 1-Purificación y Cuantificación Viral Los patrones virales se propagaron sobre células 293 y se purificó sobre gradientes de CsCl (Hawkins et al., 2001). El método usado para cuantificar partículas virales se basó en el de Shabram et al (1997) Human Gene Therapy 8:453-465, con la excepción de que se usó Fractogel TMAE como intercambiador aniónico en lugar de Resource Q. De manera breve, se empaquetó una columna de 1.25 mi con Fractogel EMD TMAE-650 (S) (catálogos # 116887-7 EM Science, Gibbstown, NJ08027) . La separación por CLAP se efectuó en un Agilent HP 1100 CLAP usando las siguientes condiciones: Amortiguador A = HEPES 50 Mm, pH 7.5; Amortiguador B = NaCl de 1.0 M en Amortiguador A; velocidad de flujo de 1 mi por minuto. Después de equilibrar la columna durante no menos de 30 minutos en el Amortiguador A, se cargaron aproximadamente 109-10n partículas virales de muestras sobre la columna de 10-100 µl, seguido por 4 volúmenes de columna de Amortiguador A. Se aplicó un gradiente lineal que se extiende sobre 16 volúmenes de columna y finaliza en Amortiguador B al 100%. El efluente de la columna fue verificado a A260 y A280 nm, se calcularon las áreas de los picos, y se determinó la relación de 260 a 280 nm. Los picos virales fueron identificados como aquellos picos que tienen una relación de A260/A280 cercana a 1.33. Se incluyó un estándar de virus con cada serie de muestras. El número de partículas virales por mi de estándar ha sido determinado usando un método de Lehmberg et al. (1999) J. Chrom . B, 732:411-423). En el intervalo de concentración viral usado, el área del pico A260 nm de cada muestra es directamente proporcional al número de partículas virales en la muestra. El número de partículas virales por mi en cada muestra de prueba fue calculado multiplicando por el número conocido de partículas virales por mi en el estándar por la relación del área del pico viral A260 nm de la muestra al área del pico viral A260 nm del estándar. La columna fue regenerada después de cada gradiente de muestras, lavando con dos volúmenes de columna de NaOH 0.5 N seguidos por dos volúmenes de columna de Amortiguador A al 100%, 3 volúmenes de columna de Amortiguador B al 100% y entonces 4 volúmenes de columna de Amortiguador A al 100%.

Ejemplo 2-Bioselección Los serotipos virales que representan los subgrupos de Ads B-F fueron reunidos y se hicieron pasar sobre cultivos subconfluentes de las líneas celulares tumorales blanco a la relación de partícula por célula alta para dos rondas para invitar a que ocurra la recombinación entre los serotipos. El sobrenadante (1.0, 0.1 0.01, 0.001 mi) de la segunda ronda de la infección de partícula viral por célula alta, cultivos subconfluentes, fue usado entonces para infectar una serie de frascos de cultivo tisular T-75 sobre confluentes de líneas de células tumorales blancos PC-3, HT-29, Panc-1 y MDA-231. Para lograr la sobre confluencia, cada línea celular fue sembrada a relaciones de separación que permitieron que la linea celular alcanzara la confluencia entre 24 y 40 horas después del sembrado, y las células se dejaron crecer durante un total de 72 horas después del sembrado antes de la infección. Esto maximizó la confluencia de las células para imitar las condiciones de crecimiento en tumores sólidos humanos. El sobrenadante del cultivo celular fue cosechado del primer matraz en la serie de dilución de 10 veces que no mostró ningún signo de CPE a los días 3 ó 4 después de la infección (en el caso de la HT-29 y PC-3, esto fue modificado para las fases 10-20 para la cosecha del segundo matraz, es decir que fueron detectables cosechas 100 veces por debajo de la dilución con CPE al dia 3 después de la infección. Cada cosecha sirvió como el material inicial para el pase sucesivo del virus. Este proceso se repitió hasta que el conjunto viral alcanzó 20 pases bioselectivos . Los virus individuales de cada conjunto bioseleccionado fueron aislados por dos rondas de purificación en placa sobre células A549 usando métodos estándar (Tollefson, A., Hermiston, T.W., y Wold, W.S.M.; "Preparation and Titration of CsCl-banded Adenovirus Stock" in Adenovirus Methods and Protocols, Humana Press, 1999, pp 1-10, W.S.M. Wold, Ed) . De manera breve, las diluciones del sobrenadante cosechado del 20vo pase sobre cada linea tumoral blanco fueron usados para infectar células A549 en un ensayo de placa estándar. Se cosecharon placas o pozos individualizados, y se usó el mismo método de ensayo de placa para generar la segunda ronda de placas individuales de esas cosechas. Las placas aisladas de pozo de la segunda ronda de purificación de placa fueron consideradas puras, los cultivos infectados fueron preparados usando esas placas purificadas, y la potencia oncolitica de esos sobrenadantes de cultivo se determinó por el ensayo MTS como se describió.

Ejemplo 3- Caracterización del Serotipo Los serotipos adenovirales padres que comprenden los conjuntos virales o los adenovirus ColoAdl aislados fueron identificados usando cromatografía de intercambio aniónico de manera similar a lo descrito en Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453:465, con la excepción de que se usó medio TMAE Fractogel como intercambiador aniónico (EM Industries, Gibbstown, NJ) en lugar de Resource Q. , como se describe en el Ejemplo 1 (véase la Figura 1) . El adenovirus del tipo 5 se eluyó en el amortiguador B de aproximadamente 60% durante el gradiente. Los otros serotipos (3, 4, 9, llp, 16, 35 y 40) se eluyeron cada uno a un tiempo de retención característico consistente con los tiempos de retención sobre Q Sepharose XL publicados por Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062.

Ejemplo 4 - Ensayo Citolítico La capacidad litica viral fue medida usando una modificación del ensayo MTT (Shen et al., 2001). De manera breve, se usó el ensayo MTS (Promega, CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) en lugar del ensayo MTT puesto que la conversión de MTS por las células en formazan acuosa, soluble reduce el tiempo y elimina el uso de un solvente orgánico volátil asociado con el ensayo MTT. Para efectuar el ensayo, las células fueron sembradas a una densidad definida por cada linea de célula tumoral que generó una monocapa confluente dentro de 24 hr. Esas células sembradas densamente se dejaron crecer durante dos días adicionales antes de exponerse a los virus de prueba. Las infecciones de ambas células tumorales y normales primarias se llevaron a cabo por cuadruplicado con diluciones de tres veces, en serie de los virus partiendo de una relación de partícula por célula de 100 y finalizando en una relación de partícula por célula de 0.005. Las células infectadas fueron incubadas a 37°C y el ensayo MTS fue efectuado a los tiempos puntuales indicados por las células primarias o lineas celulares tumorales individuales. Las células infectadas con Mock sirvieron como controles negativos y establecieron el punto de sobrevivencia del 100% para el ensayo dado.

Ejemplo 5 - Secuenciamiento del ADN El secuenciamiento de los ADN genómicos de Adllp (SEQ ID NO: 2) y ColoAdl (SEQ ID NO: 1) se efectuó como sigue. De manera breve, el ADN del adenovirus purificado de ColoAdl y Adllp fue digerido parcialmente con la endonucleasa de restricción Sau3Al y clonado por disparo en el vector plasmidico pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) . Las clonas positivas fueron propagadas y secuenciadas usando el cebador M13R y KS (Stratagene, La Jolla, CA) . Las reacciones de secuenciamiento individuales fueron cortadas, editadas y montadas usando el SequencherMR (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan). Los espacios en la cobertura fueron amplificados con los cebadores oligonucleotídicos de costumbre y secuenciados. Los extremos de los genomas virales fueron secuenciados directamente del ADN adenoviral. En todo momento, cada genoma fue secuenciado a 3X+ la cobertura y 431 bases a una cobertura 2X. Para determinar el origen de la región E2B del ColoAdl, se generaron dos conjuntos de cebadores, uno en el gen pTP de E2B (9115pb, 5' GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3' (SEQ ID NO: 4) y 9350 pb, 5' GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3 ' (SEQ ID NO: 5)) y uno para el gen de la ADN polimerasa (7520 pb 5'CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3' (SEQ ID NO: 6) y 7982 pb, 5'GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3' (SEQ ID NO: 7) y se usó PCR para aislar fragmentos de ADN de los diferentes serotipos (Ad3, 4, 5, 9, llp, 16 y 40) usando reactivos del equipo Advantage 2 PCR (Clonetics, Walkersville, MD; Cat#K1910-Y) y ensayando sobre un termociclador PTC-200 de MJ Research (Watertown, MA) . Esos fragmentos fueron secuenciados posteriormente junto con la secuencia de ADN del Ad3 usando secuenciamiento terminador con tinte sobre un analizador genético ABI 3100. La región E2B del Ad3 fue secuenciada usando el ADN de Ad3 aislado y superponiendo los cebadores. La información de la secuencia fue analizada usando el programa Vector NTI (Informatix) .

Ejemplo 6 - Construcción de virus recombinantes Los ADN genómicos de Adllp (SEQ ID NO: 2) y ColoAdl (SEQ ID NO: 1) fueron purificados de partículas de virus en forma de banda en gradiente de CsCl. Los ADN genómicos fueron digeridos con Pací la cual corta cada uno únicamente una vez dentro del genoma viral. El corte de Pací ocurre en la base 18141 sobre la secuencia nucleotidica del ColoAdl (SEQ ID NO: 1) y en la base 18140 en la secuencia nucleotidica del Adll (SEQ ID NO: 2). Los ADN digeridos fueron mezclados en cantidades iguales y ligados en presencia de ADN ligasa T4 a 16°C durante la noche. Esta mezcla de ligación fue transfectada en células A549 usando el equipo de transfección de CaP04 de Invitrogen, Carlsbad, CA (Cat#K2780-01) . Las placas aisladas fueron retiradas y tamizadas por digestión con enzima de restricción y análisis de PCR para distinguir las cuatro poblaciones virales (Adllp, ColoAdl, Adll del extremo izquierdo/ColoAdl del extremo derecho (ColoAdl.1) y ColoAdl del extremo izquierdo/Adllp del extremo derecho (ColoAdl.2) ) . La capacidad litica viral de cada población fue determinada en varias líneas celulares, incluyendo las lineas celulares HT29 y HUVEC, como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados demostraron el orden de potencia, del menos potente al más potente, como Adllp, ColoAdl.2, ColoAdl.1, ColoAdl (véase la Figura 7 para los resultados en las células HT29) .

También se construyeron los adenovirus quiméricos pCJ144 y pCJ146, los cuales contienen el genoma de ColoAdl de longitud completa en el cual la región E3 y E4 de Adllp de tipo silvestre, respectivamente, han sido reestablecidas . Esas modificaciones fueron introducidas por recombinación homologa en E. Coli BJ5183 (Chartier et al. (1996) J. Virol. 70:4805-4810). Ambos de esos adenovirus quiméricos demuestran capacidad lítica reducida en células HT29 y HUVEC en comparación con ColoAdl o ColoAdl.2.

Ejemplo 7 - Eficacia In Vivo del Adenovirus En un experimento con ratones desnudos con xenoinjerto tumoral humano típico, los animales son inyectados con 5 x 106 células subcutáneamente en el flanco trasero del ratón. Cuando los tumores alcanzan 100-200 ul de tamaño, son inyectados con vehículo (PBS) o con virus a 2 x 1010 partículas durante 5 días consecutivos (1 x 1011 partículas en total) . Una reducción en el tamaño del tumor seria notada en relación al control con PBS y virus de control adicionales (Ad5, ONYX-015) .

Ejemplo 8 - Selectividad de ColoAdl sobre Explantes de Tejido Humano Primario Se colocaron especímenes de tejido de tumores colorrectales y tejidos normales adyacentes removibles durante una cirugía en medios de cultivo y se infectaron con números iguales de virus ColoAdl o Ad5. Los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados a las 24 horas después de la infección y se determinó el número de partículas virales producidas. El ColoAdl produjo más partículas virales por partícula alimentada que el Ad5 sobre el tejido tumoral, aunque produjo menos partículas por partícula alimentada que Ad5 sobre el tejido normal.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES 1. Adenovirus quimérico recombinante, o una variante o derivado del mismo, que tiene un genoma que comprende una región E2B; donde la región E2B comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de un primer serotipo adenoviral y una secuencia de ácido nucleico derivada de un segundo serotipo adenoviral; donde el primer y segundo serotipos son cada uno seleccionado de los subgrupos adenovirales B, C, D, E o F y son distintos entre sí; y donde el adenovirus quimérico es oncolitico y demuestra un mejor índice terapéutico para una célula tumoral.
2. 2. Adenovirus según la reivindicación 1, que comprende además regiones que codifican para las proteínas de fibra, hexonas, y pentonas, donde el ácido nucleico que codifica para las proteínas de fibra, hexonas y pentonas de los adenovirus desde el mismo serotipo adenoviral.
3. 3. Adenovirus según la reivindicación 1, que comprende además una región E3 modificada.
4. 4. Adenovirus según la reivindicación 1, que comprende además una región E4 modificada.
5. 5. Adenovirus según la reivindicación 1, donde la célula tumoral es una célula tumoral de colon, mama, páncreas, pulmón, próstata, ovario o hematopoyética.
6. 6. Adenovirus según la reivindicación 5, donde la célula tumoral es una célula tumoral de colon.
7. 7. Adenovirus según la reivindicación 1, donde la secuencia nucleotidica de la región E2B del adenovirus comprende la SEQ ID NO: 3 o una porción de la misma.
8. 8. Adenovirus según la reivindicación 1, donde la secuencia nucleotídica del adenovirus comprende la SEQ ID NO: 1.
9. 9. Adenovirus quimérico recombinante, o una variante o derivado del mismo, que tiene un genoma que comprende una región E2B; donde la región E2B comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de un primer serotipo adenoviral y una secuencia de ácido nucleico derivada de un segundo serotipo adenoviral; donde el primer y segundo serotipos adenovirales son seleccionados cada uno de los subgrupos adenovirales B, C, D, E o F y son distintos entre si; donde el adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un mejor índice terapéutico para una célula tumoral; y donde el adenovirus quimérico se ha vuelto deficiente en la replicación a través de una o más regiones adenovirales que codifican para proteínas implicadas en la replicación adenoviral seleccionada del grupo que consiste de El, E2, E3 o E4.
10. 10. Adenovirus deficiente en la replicación según la reivindicación 9, donde las regiones El y E3 han sido suprimidas .
11. 11. Adenovirus deficiente en la replicación según la reivindicación 10, que comprende además una supresión de la región E4.
12. 12. Adenovirus según la reivindicación 1 o la reivindicación 9, que comprende además un gen heterólogo, donde el gen heterólogo es expresado dentro de una célula infectada con el adenovirus.
13. 13. Adenovirus según la reivindicación 12, donde el gen heterólogo es timidina cinasa.
14. 14. Adenovirus según la reivindicación 12, donde el gen heterólogo codifica para una proteina terapéutica seleccionada del grupo que consiste de citocinas y quimiocinas, anticuerpos, enzimas que convierten profármacos y proteínas inmunorreguladoras .
15. 15. Método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que comprende infectar la célula cancerosa con el adenovirus de la reivindicación 1.
16. 16. Método según la reivindicación 15, donde la célula cancerosa es una célula de cáncer de colon.
17. 17. Método según la reivindicación 16, donde la secuencia nucleotídica del adenovirus comprende la SEQ ID NO:l.
18. 18. Método para proporcionar una proteina terapéutica a una célula, que comprende infectar la célula con el adenovirus según la reivindicación 14.
19. 19. Método para aislar el adenovirus según la reivindicación 1, donde el método comprende: a) reunir los serotipos adenovirales que representan los subgrupos adenovirales B-F, creando por lo tanto una mezcla adenoviral; b) pasar la mezcla adenoviral reunida del paso (a) sobre un cultivo de células tumorales que crecen activamente en una partícula por célula suficientemente alta para evitar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta para producir muerte celular prematura; c) cosechar el sobrenadante del paso (b) ; d) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en el paso (c) ; e) cosechar el sobrenadante del cultivo celular del paso (d) antes de cualquier signo de CPE; f) infectar el cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en el paso (e) ; y g) aislar el virus según la reivindicación 1 del sobrenadante cosechado en el paso (f) por purificación en placa.
20. 20. Método según la reivindicación 19, donde el paso (b) se efectúa dos veces antes de cosechar el sobrenadante en el paso (c) .
21. 21. Método según la reivindicación 19, donde los pasos (e) y (f) son repetidos hasta 20 veces antes del paso (g) .
22. 22. Método según la reivindicación 19, donde la segunda ronda de purificación de placa se efectúa después del paso (g) .
23. 23. Método según la reivindicación 19, donde la célula tumoral es una célula tumoral de colon, mama, páncreas, pulmón, próstata, ovario o hematopoyética.
24. 24. Adenovirus quimérico recombinante, o variante o derivado del mismo, que tiene un genoma que comprende una región E2B: donde la región E2B comprende una secuencia de ácido nucleico derivada de un primer serotipo adenoviral y una secuencia de ácido nucleico derivada de un segundo serotipo adenoviral; donde el primer y segundo serotipos adenovirales son seleccionados cada uno de los subgrupos adenovirales B, C, D, E o F y son distintos entre si; y donde el adenovirus quimérico es oncolítico y demuestra un mejor índice terapéutico para una célula tumoral; producido por el método de a) reunir los serotipos adenovirales que representan los subgrupos adenovirales B-F, creando por lo tanto una mezcla adenoviral; b) pasar la mezcla adenoviral reunida del paso (a) sobre un cultivo de células tumorales que crecen activamente en una partícula por célula suficientemente alta para evitar la recombinación entre los serotipos, pero no tan alta para producir muerte celular prematura; c) cosechar el sobrenadante del paso (b) ; d) infectar un cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en el paso (c) ; e) cosechar el sobrenadante del cultivo celular del paso (d) antes de cualquier signo de CPE; f) infectar el cultivo inactivo de células tumorales con el sobrenadante cosechado en el paso (e) ; y g) aislar el adenovirus quimérico del sobrenadante cosechado en el paso (f) por purificación en placa.
25. 25. Método según la reivindicación 24, donde el paso (b) se efectúa dos veces antes de cosechar el sobrenadante en el paso (c) .
26. 26. Método según la reivindicación 24, donde los pasos (e) y (f) son repetidos hasta 20 veces antes del paso (g) .
27. 27. Método según la reivindicación 24, donde la segunda ronda de purificación de placa se efectúa después del paso (g) .