CN1997746A - 用于治疗癌症的嵌合腺病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有治疗用途的溶瘤腺病毒。本发明提供了重组嵌合腺病毒以及生产它们的方法。本发明的嵌合腺病毒包含衍生自B至F亚群分类的腺病毒血清型的核酸序列，并显示出提高的治疗指数。

Description

用于治疗癌症的嵌合腺病毒
本申请要求2004年5月26日提交的序列号为60/574,851的美国临时申请的优先权，该申请在此通过引用并入本申请。
发明领域
本发明通常涉及分子生物学领域，更具体地本发明涉及具有治疗应用的溶瘤腺病毒。
背景技术
在美国和其它地区，癌症是死亡的主要原因。根据癌症的类型，典型地采用外科手术、化疗和/或放射进行治疗。这些治疗通常失败，显然需要有新的治疗手段进行单独使用或与传统技术结合使用。
一种方法是使用腺病毒，单独使用或作为能够给肿瘤细胞输送抗-癌治疗蛋白的载体。腺病毒是无包膜二十面体双链DNA病毒，具有大约36千个碱基对的基因组。该病毒基因组的每一末端具有已知的反向末端重复(ITR)短序列，其实病毒复制所必需的。迄今为止检测到的所有人类腺病毒基因组具有相同的总体结构；即，编码特定功能的该基因定位于病毒基因组的相同位置。所述病毒基因组含有5个早期转录单位(E1A、E1B、E2、E3和E4)、2个延迟早期单位(IX和Iva2)和1个被加工产生5个家族的晚期mRNAs(L1-L5)的晚期单位(主要晚期)。由早期基因编码的蛋白质参与复制，而晚期基因编码病毒结构蛋白质。所述病毒基因组的一部分可以用外源DNA容易地进行取代，且重组腺病毒在结构上是稳定的，这些特性使得这些病毒对基因治疗具有潜在用途(参见Jolly，D.(1994)CancerGene Therapy 1：51-64)。
目前，致力于产生临床上有用的腺病毒治疗的研究已聚焦于腺病毒血清型，Ad5。这一人类腺病毒的遗传学被很好地表征，对其进行分子操纵的***也被充分地描述。大量生产方法已经被开发以支持临床应用，可获得一些关于该制剂的临床经验，参见，Jolly，D.(1994)Cancer Gene Therapy，1：51-64。涉及人类腺病毒(Ad)在癌症治疗中的应用的研究已聚焦于开发基于Ad5的腺病毒，该腺病毒在特定的肿瘤细胞类型中有更效价或者优先靶向特定的肿瘤细胞类型；且如果要想使得腺病毒治疗在临床上得到实际应用，则存在产生更有效的溶瘤病毒的需求。
Ad5仅仅是51种目前已知的腺病毒血清型中的一种，基于不同的特性包括红血球凝聚特性其被分类为亚群A至F(参见，Shenk，“Adenoviridae：The Viruses and Their Replication，”Fields Virology，Vol.2，Fourth Edition，Knipe，ea.，Lippincott，Williams & Wilkins，pp.2265-2267(2001))。这些血清型在多个水平上不同，例如在人类和啮齿动物中的病理学、用于附着的细胞受体，但是这些区别在很大程度上被忽略了其可作为开发更有效的溶瘤腺病毒的潜在方法(除纤维蛋白改变(fiber alterations)外，参见Stevenson et al.(1997)J.Virol.71：4782-4790；Krasnykh et al.(1996)J.Virol.70：6839-6846；Wickhamet al.(1997)J.Virol.71：8221-8229；Legrand et al.(2002)Curr.GeneTher.2：323-329；Barnett et al.(2002)Biochim.Biophys.Acta 1-3：1-14；美国专利申请2003/0017138)。
对腺病毒血清型间的差异的利用可以为利用具有增强的选择性和效价的新的腺病毒的更有效的基于腺病毒的疗法提供来源。存在对这种改良的基于腺病毒的治疗的需求。
发明概述
本发明提供了对基于病毒的治疗有用的新的嵌合腺病毒或其变体或衍生物。特别地，本发明提供了具有包含E2B区域的基因组的嵌合腺病毒或其变体或衍生物，
其中所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列；
其中所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此间不相同；以及，
其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数。
在一个实施方式中，所述嵌合腺病毒还包含编码纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的区域，其中编码所述蛋白的核酸均来自相同的腺病毒血清型。在另一个实施方式中，本发明的嵌合腺病毒包含经修饰的E3或E4区域。
在另一个实施方式中，所述嵌合腺病毒在结肠肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、***肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞或造血肿瘤细胞中显示出提高的治疗指数。在一个特别优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒在结肠肿瘤细胞中显示出提高的治疗指数。
在一个优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒的E2B区域包含SEQ ID NO：3。在一个特别优选的实施方式中，所述嵌合腺病毒包含SEQ ID NO：1。
本发明提供了具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒或其变体或衍生物，
其中所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列；
其中所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此不相同；
其中所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数；以及
其中所述嵌合腺病毒已通过缺失选自E1、E2、E3或E4的一或多个编码参与腺病毒复制的蛋白质的腺病毒区域而成为复制缺陷型。
在一个实施方式中，本发明的嵌合腺病毒还包含一种编码治疗性质蛋白质的异源基因，其中所述异源基因在被所述腺病毒感染的细胞中表达。在一个优选的实施方式中，所述治疗性蛋白质选自由细胞因子和趋化因子、抗体、前体药物转化酶和免疫调节蛋白质所组成的组。
本发明提供了将本发明的嵌合腺病毒用于治疗目的的方法。在一个实施方式中，所述嵌合腺病毒可被用以抑制癌细胞的生长。在一个特定的实施方式中，包含SEQ ID NO：1的嵌合腺病毒被用于抑制结肠癌细胞的生长。
在另一个实施方式中，本发明的嵌合腺病毒作为将治疗蛋白输送给细胞的载体是有用的。
本发明提供了用于制备本发明的嵌合腺病毒的方法，其中该方法包括：
h)集合代表腺病毒亚群B至F的腺病毒血清型，从而产生腺病毒混合物；
i)将来自步骤(a)的集合的腺病毒混合物在肿瘤细胞的活跃生长培养物中，以高至足以促进血清型之间发生重组但没有高至产生过早细胞死亡的颗粒/细胞比率进行传代；
j)从步骤(b)收获上清；
k)用在步骤(c)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；
l)在出现任何细胞病变(CPE)的迹象之前，从步骤(d)中收获细胞培养物上清；
m)用在步骤(e)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；和
n)通过空斑纯化从在步骤(f)中收获的上清中分离所述嵌合腺病毒。
附图说明
图1：Ad在TMAE HPLC柱上的保留时间图。A)用以产生原始的起始病毒池的各Ad血清型的保留图。B)分别衍生自HT-29、Panc-1、MDA-231和PC-3细胞系的20代传代池的保留图。
图2：各病毒池的细胞溶解活性。用各自的病毒池以VP/细胞比率为100-0.01感染A)HT-29、B)MDA-231、C)Panc-1和D)PC-3细胞。根据不同的细胞系在感染后的不同天数(如图所标示)进行MTS检测。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/-标准差表示。每一图面描述了一个代表性的试验，且至少在3个独立的时间对全部病毒池的靶肿瘤细胞系进行检测(图例：—●—Ad5、——初始病毒池、—■—衍生自池的特定细胞，20代)。
图3：ColoAd1和Ad5对人肿瘤细胞系的细胞溶解活性。对A)一大组人肿瘤细胞系，和B)一组人结肠癌细胞系进行MTS检测以测定其潜在的效价特异性。根据不同的细胞系在不同天数进行所述MTS检测。每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/-标准差表示(图例：—●—Ad5、——ColoAd1)。
图4：ColoAd1和Ad5对一组指出细胞的细胞溶解活性。用ColoAd1和Ad5以VP/细胞比率为100-0.01感染HS-27、HUVEC和SAEC细胞(分别为原始成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞)。根据不同的细胞在感染后的不同天数进行MTS检测，每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/-标准差表示(图例：—●—Ad5、——ColoAd1)。
图5：ColoAd1、Ad5和ONYX-015对原始正常内皮细胞(HUVEC)和结肠肿瘤细胞系(HT-29)的细胞溶解活性。每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/-标准差表示(图例：—●—Ad5、——ColoAd1、—■—Onyx-015)。
图6：ColoAd1、Ad11p和Ad5对正常上皮细胞系(SAEC)和人结肠癌细胞系(HT-29)的细胞溶解活性。每一图面是重复了至少3次的一个代表性试验。图面中的每一数据点代表一次一式四份的检测，结果以平均值+/-标准差表示(图例：—●—Ad5、——Ad11p、—■—ColoAd1)。
图7：重组病毒的细胞溶解活性。按照实施例6的记载构建代表4个病毒群体(Adp11、ColoAd1、左端Ad11p/右端ColoAd1(ColoAd1.1)和左端ColoAd1/右端Ad11p(ColoAd1.2))的重组病毒。每一群体在HT29细胞中的溶解活性按照先前的描述进行测定。(图例：—●—Ad5、——Ad11p、—■—ColoAd1、—υ—ColoAd1.1、—▲—ColoAd1.2)。
发明详述
说明书中所提及的所有出版物，包括专利和专利申请，在此通过引用完整地合并入本发明，相当于每一份单独的出版物被特别地和单独地指出通过引用以其整体合并入本发明。
定义
除非特别说明，本申请所使用的全部技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。一般地，本申请所使用的术语和下面描述的试验方法是在本领域中广泛已知和普遍应用的。
本申请所用术语“腺病毒”、“血清型”或“腺病毒血清型”指目前已知的51种人类腺病毒血清型或将来分离的人类腺病毒血清型中的任何一种。参见，例如Strauss，“Adenovirus infections inhumans”，The Adenoviruses，Ginsberg，ea.，Plenum Press，New York，NY，pp.451-596(1984)。这些血清型被分类于A至F亚群中(参见，Shenk，“Adenoviridae：The Viruses and Their Replication”，FieldsVirology，Vol.2，Fourth Edition，Knipe，ea.，Lippincott Williams &Wilkins，pp.2265-2267，2001)，如表1中所示。
                            表1
  亚群    腺病毒血清型
  A    12，18，31
  B    3，7，11，14，16，21，34，35，51
  C    1，2，5，6
  D    8-10，13，15，17，19，20，22-30，32，33，36-39，42-49，50
  E    4
  F    40，41
本申请所用术语“嵌合腺病毒”指一种其核酸序列由至少两种上述的腺病毒血清型所组成的腺病毒。
本申请所用术语“亲本腺病毒血清型”指嵌合腺病毒的大部分基因组是从其衍生的腺病毒血清型。
本申请所用术语“同源重组”指具有同源序列的两个核酸分子在同源的区域发生交换或进行重组。
本申请所用术语“效价”指病毒的裂解潜力，代表了其复制、细胞溶解和扩散的能力。对本发明的目的而言，效价是本发明给定的腺病毒的细胞溶解活性与Ad5在相同的细胞系中的溶解活性的比值，即效价＝AdX的IC50/Ad5的IC50，其中X是被检测的特定腺病毒血清型，且其中Ad5的效价被指定为值为1。
本申请所用术语“溶瘤病毒”指相对于正常细胞，其优先杀死癌细胞的病毒。
本申请所用术语“质量指数”或“治疗窗”指表明给定的腺病毒的溶瘤潜力的数值，并通过所述腺病毒在癌细胞系中的效价除以相同腺病毒在正常(即，非癌症)细胞系中的效价进行测定。
本申请所用术语“经修饰的”指具有与天然发生的核苷酸或氨基酸序列所不同的核苷酸或氨基酸序列的分子，即野生型核苷酸或氨基酸序列。经修饰的分子能够保留野生型分子的功能或活性，即经修饰的腺病毒可以保留其溶瘤活性。修饰包括下面所描述的核苷酸的突变。
本申请所用的与多核苷酸或多肽相关的术语“突变”是指分别与参比多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)，多核苷酸或多肽的一级、二级或三级结构的天然发生的、合成的、重组的、或化学的改变或差异。突变包括如缺失、***或取代这样的改变。
本申请所用术语“缺失”被定义为在多核苷酸或氨基酸序列中的改变，其中分别缺少一或多个多核苷酸或氨基酸残基。
本申请所用术语“***”或“添加”是指与天然发生的多核苷酸或氨基酸序列相比，在多核苷酸或氨基酸序列中发生的分别导致一或多个多核苷酸或氨基酸残基的添加的改变。
本申请所用术语“取代”由一或多个多核苷酸或氨基酸分别被不同的多核苷酸或氨基酸代替产生。
本申请所用术语“腺病毒衍生物”指经修饰的本发明的腺病毒，对该病毒基因组或在该病毒基因组中进行了添加、缺失或取代，所得的腺病毒衍生物展示出较亲本腺病毒更高的效价和/或治疗指数，或在其它方面在治疗上更有用(即较低的免疫原性、提高的清除率)。例如，本发明的腺病毒的衍生物可以在该病毒基因组的其中一个早期基因(包括但不限于该病毒基因组的E1A或E2B区域)中具有缺失。
本申请所用的与多核苷酸或多肽相关的术语“变体”是指分别与参比多核苷酸或多肽相比(例如，与野生型多核苷酸或多肽相比)，可能在一级、二级或三级结构中发生变化的多核苷酸或多肽。例如，所述氨基酸或核酸序列可以含有与参比氨基酸或核酸序列不同的突变或修饰。在一些实施方式中，腺病毒变体可以是不同的同种型或多态。变体可以是应用本领域中已知的方法分离或产生的天然发生的、合成的、重组的或化学修饰的多核苷酸或多肽。在所述变体的多核苷酸序列中的改变可以是沉默型的。也就是说，它们可以不改变该多核苷酸所编码的氨基酸。如果改变被限于这一类型的沉默改变，则变体将编码与参比序列具有相同的氨基酸序列的多肽。或者，在所述变体的多核苷酸序列中的这种改变可以改变参比多核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列，这导致产生下面描述的保守性或非保守性氨基酸改变。这种多核苷酸改变可以在由参比序列编码的多肽中产生氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。可以引入各种密码子取代(例如产生多种限制性位点的沉默改变)以优化其克隆到质粒或病毒中，或在特定的原核或真核***中的表达。
本申请所用术语“腺病毒变体”指其多核苷酸序列与如上面所描述的参比多核苷酸(例如野生型腺病毒)不同的腺病毒。这种差异是有限的，使得亲本和变体的多核苷酸序列在总体上是相似的，且在绝大多数区域是相同的。在本申请中，当进行比较时，第一种核苷酸或氨基酸序列被假定为与第二种序列“相似”，这表示它们具有很小的序列差异(即第一种与第二种序列几乎是相同的)。在本申请中，腺病毒变体与参比腺病毒间存在的多核苷酸序列差异不产生效价和/或治疗指数的差异。
本申请所用术语“保守性”指氨基酸残基被具有相似的化学特性的不同的氨基酸残基取代。保守性氨基酸取代包括用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、或用丝氨酸取代苏氨酸。典型地，***或缺失是在约1-5个氨基酸的范围。
本申请所用术语“非保守性”指用具有不同的化学特性的不同的氨基酸残基取代氨基酸残基。非保守性取代包括但不限于用甘氨酸(G)取代天冬氨酸(D)、用赖氨酸(K)取代天冬酰胺(N)、或用精氨酸(R)取代丙氨酸(A)。
氨基酸的单字母代码包括以下：A＝丙氨酸、R＝精氨酸、N＝天冬酰胺、D＝天冬氨酸、C＝半胱氨酸、Q＝谷氨酰胺、E＝谷氨酸、G＝甘氨酸、H＝组氨酸、I＝异亮氨酸、L＝亮氨酸、K＝赖氨酸、M＝甲硫氨酸、F＝苯丙氨酸、P＝脯氨酸、S＝丝氨酸、T＝苏氨酸、W＝色氨酸、Y＝酪氨酸、V＝缬氨酸。
将认识到多肽常含有除这20种氨基酸(通常被称作20种天然存在的氨基酸)以外的氨基酸，许多氨基酸(包括终止氨基酸)可以通过天然加工(例如糖基化和其它翻译后修饰)或通过本领域中已知的化学修饰技术修饰到给定的多肽中。即使在多肽中天然发生的常见修饰也是众多的，不可能在此穷举；但它们在基础课本和更为详细的专著中、以及在长篇研究文献中有成分的描述，且为本领域技术人员所熟知。在可能存在于本发明的多肽中的已知修饰中，示例性的有：乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、氨基化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、多核苷酸或多肽衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸到蛋白质的添加例如精氨酰化和遍在蛋白化。
这种修饰是本领域技术人员已知的，且在科学文献中已有很详细的描述。例如，几种特别的常见修饰(糖基化、脂质附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化)在绝大多数基础课本中有描述，例如I.E.Creighton，Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，W.H.Freeman and Company，New York，1993。关于这一主题有很多详细的综述，例如由Wold，F.，Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，pp 1-12，1983；Seifter et al.，Meth.Enzymol.182：626-646，1990和Rattan et al.，Protein Synthesis：PosttranslationalModifications and Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62，1992中提供的综述。
如同已知的及上述提及的那样，本领域技术人员能够认识到多肽不总是完全线性的。例如，多肽可以由于遍在蛋白化而分支；通常由于翻译后事件，它们可以是环形的，具有或不具有分支，所述翻译后事件包括天然加工事件和由非天然发生的人工操纵致使的事件。可以通过非翻译天然加工以及通过完全的合成方法合成环形多肽、支链多肽和支链环形多肽。
修饰可以发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。实际上，通过共价修饰封闭多肽的氨基或羧基基团在天然存在的多肽和合成多肽中很普遍，这种修饰也可以存在于本发明的多肽中。例如，在大肠杆菌(E.coli)中制备的多肽的氨基末端残基在进行蛋白水解加工之前几乎总将是N-甲酰甲硫氨酸。
发生在多肽中的修饰通常与该多肽是如何产生的有关。例如，对于通过在宿主中表达克隆基因所制备的多肽，大部分修饰的特性和程度将取决于宿主细胞翻译后修饰能力和存在于该多肽氨基酸序列中的修饰信号。例如，如众所周知的那样，糖基化通常不发生在细菌宿主如大肠杆菌中。因此，当需要糖基化时，应当在糖基化宿主(glycosylating host)，通常为真核细胞中表达多肽。昆虫细胞通常发生与哺乳动物细胞相同的翻译后糖基化，由此，昆虫细胞表达***已被发展用以有效表达天然的糖基化等模式的哺乳动物蛋白质。
本领域技术人员将认识到，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在于给定多肽中的几个位点。同样，给定的多肽可以含有多种类型的修饰。
在本申请中，采用了以下术语对两条或多条多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系进行描述：“参比序列”，“比较窗”，“序列相同性”，“序列相同性百分比”，“实质上的相同性”，“相似性”以及“同源性”。“参比序列”是用作进行序列比较基础的规定序列，参比序列可以是较大序列的子集，例如，作为序列表中给定的全长cDNA或基因序列的片段或可包含完整的cDNA或基因序列。一般地，参比序列的长度为至少18个核苷酸或6个氨基酸，常为至少24个核苷酸或8个氨基酸长，且通常为至少48个核苷酸或16个氨基酸长。因为两条多核苷酸或氨基酸序列各自可以(1)包含在两个分子之间类似的序列(即，完整的多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，以及(2)可进一步包含与两条多核苷酸或氨基酸序列相去甚远的序列，典型地通过在“比较窗”上比较两个分子的序列进行两个(或多个)分子间的序列比较以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。在本申请中，“比较窗”是指概念上至少18个连续核苷酸位置或6个氨基酸的片段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以与至少18个连续核苷酸或6个氨基酸序列的参比序列进行比较，且其中在所述比较窗中的所述多核苷酸序列部分与参比序列(其不含有添加或缺失)相比可以包含20％或更少的添加、缺失、取代等(即，缺口)，从而对所述两条序列进行最佳比对。比较窗例如通过采用Smithand Waterman，Adv.Appl. Math.2：482(1981)的局部同源性算法，，通过采用Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，，通过采用Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.) 85：2444(1988)对相似性方法的研究，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0(Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA、Informatix公司的VectorNTI、Geneworks或MacVector软件包)的计算机处理，或通过检查可以进行为了对比较窗进行比对的序列最佳比对，并选择通过各种方法产生的最佳比对(即，获得比较窗上的最高同源性百分比)。
在本申请中，术语“序列相同性”是指在所述比较窗上，两条多核苷酸或氨基酸序列是一致的(即，在核苷酸-核苷酸或残基-残基基础上)。术语“序列相同性百分比”是通过比较在所述比较窗上的两条最佳比对序列，确定在两条序列上出现相同核酸碱基(例如，A、T、C，G，U或I)或残基位置的数目，从而获得匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以在所述比较窗口(即，窗口大小)中的总位置数目，并将所述结果乘以100从而得到序列相同性百分比。在本申请中使用的术语“实质上的相同性”表明多核苷酸或氨基酸序列的特征，当在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上与参比序列相比较时，更常见的是在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的比较窗口上进行比较时，其中所述多核苷酸或氨基酸包含与参比序列具有至少85％的序列相同性的序列，优选至少90-95％的序列相同性，更常见为至少99％的序列相同性，比较窗口其中序列相同性百分比是通过在比较窗口上比较所述参比序列和可以包括总共20％或更少的参比序列的缺失或添加的序列进行计算得到的。参比序列可以是较大序列的一个子集。术语“相似性”，当用于对描述多肽时，可通过比较一条多肽与另一条多肽的氨基酸序列和保守氨基酸取代进行确定。术语“同源性”，当用于描述多核苷酸时，是指两条多核苷酸或其指定的序列，当进行最佳比对和比较时，是一致的，同时，在所述核苷酸的至少70％中(通常为约75％-99％，以及更优选地至少为约98-99％)具有适当的核苷酸***或缺失。
在本申请中，“同源性”，当用于描述多核苷酸时，是指两条多核苷酸或其指定的序列，当进行最佳比对和比较时，是一致的，同时，在所述核苷酸的至少70％中(通常为约75％-99％，以及更优选地至少为约98-99％)具有适当的核苷酸***或缺失。
在本申请中，“聚合酶链反应”或“PCR”是指这样的程序，其中特异性的DNA片段根据US 4,683,195中的描述进行扩增。一般地，来自于感兴趣多肽片段的末端的序列信息或超越需求的信息都是可获得的，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物是相互相对的，并且与待扩增模板的相对链的序列一致或类似。所述两条引物的5’末端核苷酸与扩增材料的末端相一致。PCR可用以从总基因组DNA、从总细胞RNA转录得到的cDNA、质粒序列等中扩增特异性的DNA序列(通常参见Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，51：263，1987；Erlich，ed.，PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)。
在本申请中，“严格性”通常发生在约Tm(熔化温度)-5℃(比探针的Tm低5℃)至约低于Tm 20℃-25℃的范围。如本领域所属技术人员所理解的那样，严格杂交可用来鉴定或检测相同的多核苷酸序列或者用来鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。在本申请中，术语“严格条件”是指仅在序列问相同性至少为95％和优选至少97％的情况下发生的杂交。
在本申请中，“杂交”应该包括“通过碱基配对将多核苷酸链与互补链结合到一起的任何方法”(Coombs，J.，Dictionary ofBiotechnology，Stockton Press，New York，N.Y.，1994)。
在本申请中，术语“治疗有效剂量”或“有效量”是指能够改善疾病症状或状况的腺病毒的量。当肿瘤或转移生长减慢或停止，或者发现肿瘤或转移在尺寸上有所减小时的剂量被认为是治疗癌症或其转移的治疗有效剂量，从而导致了患者寿命的延长。
本发明的腺病毒
本发明提供了嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其基因组中所述嵌合腺病毒的E2B区域的核苷酸序列包含衍生自至少两种腺病毒血清型的核酸序列，每种血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E和F，且彼此不相同。本发明的嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数。
嵌合腺病毒的分离
可以对称为“生物选择”的技术进行修饰来生产本发明的嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其中通过在受控条件性利用遗传选择产生具有所需特性例如增强的致瘤性或细胞类型特异性的腺病毒(Yanet al.(2003)J.Virol.77：2640-2650)。
在本发明中，在肿瘤细胞的分会合培养物上，以高至充以促进在血清型之间发生重组，而不高至导致过早细胞死亡的颗粒/细胞比率集合不同血清型的腺病毒混合物并进行传代，优选为至少两代。优选颗粒/细胞比率为约500颗粒/细胞，并可由本领域所属技术人员容易地测定。在本申请中，细胞的“分会合培养物”是指单层或悬浮培养物，其中所述细胞生长活跃。对于以单层进行生长的细胞而言，其实例可以是可供细胞生长的区域的约50-80％都被细胞所覆盖的培养物。优选生长区域的约75％被细胞所覆盖。
在一个优选实施方式中，所述腺病毒混合物包括腺病毒亚群B、C、D、E和F代表的腺病毒血清型。组A腺病毒未包括在所述混合物中，因为它们与啮齿类中的肿瘤形成相关。优选地，可用于所述生物选择方法中的肿瘤细胞系包括但不限于那些衍生自乳腺、结肠、胰腺、肺和***的细胞系。一些可用于对腺病毒混合物的“生物选择性”传代的实体肿瘤细胞系包括但不限于MDA231、HT29、PAN-1和PC-3细胞。造血细胞系包括但不限于Raji和DaudiB-淋巴细胞、K562红系原始细胞(erythroblastoid cells)、U937髓性细胞和HSB2 T-淋巴细胞。
在这些初始代次产生的腺病毒可用于以允许仅由一种腺病毒感染细胞的足够低的颗粒/细胞比率感染静止期肿瘤细胞。在这样的条件下传代直至20代之后，在可见的细胞病理效应(CPE，参见FieldsVirology，Vol.2，Fourth Edition，Knipe，ea.，Lippincott Williams &Wilkins，pp.135-136)之前，从最后一代收获上清从而增加高效价病毒的选择。可采用本领域所属技术人员公知的技术对所收获的上清进行浓缩。一种优选的用于在单层培养物中获得静止期细胞(即，其中活跃细胞生长停止)的方法允许所述培养物在会合之后再生长3天，其中会合意味着可供细胞生长的整个可用区域都被占据了(被细胞所覆盖)。类似地，悬浮培养物可以生长至以没有活跃细胞生长为特征的密度。
可以通过在阴离子交换柱上测定所收获病毒池的保留时间来进行检测含有生物选择的腺病毒池的浓缩上清的血清型分布情况，其中不同的腺病毒血清型已知具有特征性的保留时间(Blanche et al.(2000)Gene Therapy 7：1055-1062)；参见实施例3，图1A和图1B。可以通过稀释和空斑纯化或本领域公知的其它技术从浓缩的上清中分离到本发明的腺病毒，并进行生长以用于进一步表征。本领域公知的技术还可以用以测定分离到嵌合腺病毒的序列(参见实施例5)。
本发明嵌合腺病毒的一个例子是嵌合腺病毒ColoAd1，其是使用HT29结肠细胞在生物选择过程中分离出来的。ColoAd1具有SEQID NO：1的核酸序列。ColoAd1核苷酸序列的大部分都与Ad11血清型的核酸序列(SEQ ID NO：2)相一致(Stone et al.(2003)Virology309：152-165；Mei et al.(2003)J.Gen.Virology 84：2061-2071)。与Ad11相比，ColoAd1核苷酸序列中有两处缺失，一处是在基因组的E3转录单位区域内2444个碱基对长度的缺失(SEQ ID NO：2的27979-30423碱基对)，另一处缺失要小一些，是在E4orf4基因内的25个碱基对长度的缺失(SEQ ID NO：2的33164-33189碱基对)。ColoAd1的E2B转录单位区域(SEQ ID NO：3)，其编码腺病毒蛋白DNA聚合酶和末端蛋白，位于SEQ ID NO：1的5067和10354碱基对之间，是Ad11和Ad3血清型之间的同源重组区域。在ColoAd1的这一区域内，与Ad11的序列(SEQ ID NO：1)相比，有198个碱基对发生了改变。这些改变导致了与Ad3的E2B区域(SEQ ID NO：8)部分的序列同源的ColoAd1的E2B区域的核苷酸范围更加伸展，并具有ColoAd1和Ad3之间414bp长度的同源性的最长伸展范围。与未修饰的Ad11腺病毒相比，ColoAd1的E2B区域(SEQ ID NO：3)具有比ColoAd1腺病毒更强的效价(参见实施例6、图7)。在其它实施方式中，本发明的嵌合腺病毒可包含来自超过两种腺病毒血清型的核酸序列。
可以通过从与初始传代的腺病毒池相同组织得到的肿瘤细胞中细胞溶解能力的测定，对本发明的嵌合腺病毒或其变体或衍生物在特定的肿瘤类型中的选择性进行评估。例如，在HT-29细胞和从包括DLD-1、LS174T、LS1034、SW403、HCT116、SW48和Colo320DM的其它结肠衍生肿瘤细胞系中对最初从HT-29结肠肿瘤细胞系传代的腺病毒池得到的嵌合腺病毒ColoAd1(SEQ ID NO：1)进行重新检测(参见图3B)。任何可获得结肠肿瘤细胞系对这样的评估都具有相等的作用。可以在包括但不限于***细胞系(例如，DU145和PC-3细胞系)、胰腺细胞系(例如，Panc-1细胞系)、乳腺肿瘤细胞系(例如，MDA231细胞系)和卵巢细胞系(例如，OVCAR-3细胞系)的适当肿瘤细胞中，对从来自在其它肿瘤细胞类型上选择的腺病毒池的分离的腺病毒克隆进行类似的检测。其它可获得的肿瘤细胞系对本发明腺病毒的分离和鉴定具有相同的作用。
与从中得到了本发明嵌合腺病毒的腺病毒血清型相比，本发明的嵌合腺病毒具有提高的治疗指数(参见图6，其比较了嵌合腺病毒ColoAd1和Ad11p的细胞溶解活性)。
本发明还包括使用本领域所属技术人员公知的重组技术构建的嵌合腺病毒。这样的嵌合腺病毒包含一核苷酸序列区域，该区域衍生自通过重组技术整合入另一腺病毒血清型的基因组中的腺病毒血清型。所整合的序列赋予这样的性质，例如，对亲本腺病毒血清型的肿瘤特异性或增强的效价。例如，可以将ColoAd1的E2B区域(SEQ ID NO：3)整合到Ad35或Ad9的基因组中。
腺病毒衍生物
本发明还包括本发明的嵌合腺病毒，其被修饰以提供其它治疗上有用的嵌合腺病毒。所述修饰包括但不限于以下描述的情况。
一种修饰是作为在编码E1B-55K蛋白的腺病毒基因中发生突变的结果，产生了实质上缺乏结合p53能力的本发明的嵌合腺病毒的衍生物。这些病毒通常包括E1B-55K区域的部分或全部缺失(参见US 5,677,178)。US 6,080,578中描述了在负责结合p53的E1B-55K蛋白的区域具有缺失的Ad5突变体。本发明的嵌合腺病毒的其它优选修饰是在E1A区域的突变，如US 5,801,029和US 5,972,706中所述。这些类型的修饰提供了对肿瘤细胞具有更高选择性的本发明嵌合腺病毒。
本发明包括的其它修饰实例是由于组织特异性启动子的控制下的病毒复制排列而表现出更高程度组织特异性的嵌合腺病毒，如US5,998,205中所述。也可将本发明嵌合腺病毒的复制置于如美国专利申请09/714,409中所述的E2F应答元件的控制之下。这样的修饰提供了基于存在E2F的病毒复制控制机制，导致了增强的肿瘤组织特异性，并且与通过组织特异性启动子实现的控制不同。在这两种实施方式中，所述组织特异性启动子和E2F应答元件可操纵地连接于对所述腺病毒复制至关重要的腺病毒基因。
本发明的其它修饰有本发明嵌合腺病毒(例如ColoAd1)作为生产新的复制-缺陷型腺病毒载体的骨架的利用。如Lai et al.((2002)DNA Cell Bio.21：895-913)中所述，复制缺陷型腺病毒载体可用以输送和表达治疗基因。本申请提供了第一代(其中E1和E3区域缺失)和第二代(其中还缺失了E4区域)衍生自本发明嵌合腺病毒的腺病毒载体。可以使用本领域技术人员熟知的技术容易地制备这些载体(参见Imperiale and Kochanek(2004)Curr.Top.Microbiol.Immunol.273：335-357；Vogels et al.(2003)J.Virol.77：8263-8271)。
本发明包括的另一修饰是***用作追踪病毒感染的效力的异源基因标记物或报道物。这类修饰的一种实施方式是胸苷激酶(TK)基因的***。使用放射性标记的TK反应的底物，在感染细胞内TK的表达可用来追踪在病毒感染后细胞内残留病毒的水平(Sangro et al.(2002)Mol.Imaging Biol.4：27-33)。
构建修饰嵌合腺病毒的方法是本领域内所公知的。参见Mittal，S.K.(1993)Virus Res.28：67-90以及Hermiston，T.et al.(1999)Methodsin Molecular Medicine：Adenovirus Methods and Protocols，W.S.M.Wold，ed，Humana Press。将标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成、以及微生物培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转化)。一般地，根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化步骤。一般地，根据本说明书全文所提及的本领域的常规方法和各种常规参考文献来实施这些技术和程序(通常可参见，Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd.edition(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.)。本申请所用术语和以下描述的分析化学、有机合成化学以及药物配制的实验室程序是本领域技术人员所公知和常规使用的。
治疗潜力的确定
可以通过检测其在从作为治疗靶的的感兴趣组织得到的肿瘤细胞中的细胞溶解潜力来评估本发明嵌合腺病毒或其变体或衍生物的治疗效用。可用于检测这些腺病毒的肿瘤细胞系包括但不限于结肠细胞系(包括但不限于DLD-1、HCT116、HT29、LS1034和SW48细胞系)、***细胞系(包括但不限于DU145和PC-3细胞系)、胰腺细胞系(包括但不限于Panc-1细胞系)、乳腺肿瘤细胞系(包括但不限于MDA231细胞系)以及卵巢细胞系(包括但不限于OVCAR-3细胞系)。造血细胞系包括Raji和Daudi B-淋巴细胞、K562红系原始细胞、U937髓性细胞和HSB2 T-淋巴细胞。其它可获得的任何肿瘤细胞系都可以用来对本发明腺病毒治疗瘤形成的使用进行评估和鉴定。
可以在代表性的肿瘤细胞系中对本发明腺病毒的细胞溶解活性进行测定，并将所得数据转化成对效价的度量，由于腺病毒属于亚群C，优选Ad5，可将其用作标准(即，假定效价为1)。测定细胞溶解活性的优选方法是MTS检测(参见实施例4，图2)。
可通过比较给定腺病毒在肿瘤细胞系中的效价和相同腺病毒在非癌细胞系中的效价计算出本发明腺病毒在特定的肿瘤细胞系中的治疗指数。优选的非癌细胞系是来源于上皮的SAEC细胞，以及来源于内皮的HUVEC细胞(参见图4)。这两种细胞类型分别代表了来自器官和脉管***的正常细胞，根据对腺病毒进行输送的方式，可以得到这两种细胞类型，并且是在腺病毒治疗中具有代表性的可能的毒性位点。然而，本发明的实施并不仅局限于这些细胞的使用，也可以使用其它非癌细胞系(例如，B细胞、T细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞)。
还可以将本发明嵌合腺病毒在拥有肿瘤细胞移植物的裸鼠中降低肿瘤发生或肿瘤细胞负担的能力，与在拥有相同肿瘤细胞负担的未处理小鼠中的对应能力进行比较，从而评估出本发明嵌合腺病毒影响靶肿瘤细胞生长(即，癌症)的能力(参见实施例7)。
还可以使用原代人类肿瘤外植体对本发明腺病毒进行评估(Lamet al.(2003)Cancer Gene Therapy；Grill et al.(2003)Mol.Therapy6：609-614)，其提供了使用肿瘤异种移植物研究不能正常提供的存在于肿瘤中的检测环境。
治疗应用
本发明提供了将本发明的嵌合腺病毒用于抑制肿瘤细胞生长的应用，以及将衍生自这些嵌合腺病毒的腺病毒载体用于输送在肿瘤或其它疾病状态的治疗中有用的治疗性蛋白质的应用。
药物组合物及施用
本发明还涉及被配制成用于治疗性施用给患者的包含本发明的嵌合腺病毒(包括其变体和衍生物)的药物组合物。对于治疗性用途，将含有药理学有效剂量的腺病毒的灭菌组合物施用给人类患者或非人患病动物用于治疗例如肿瘤病症。通常，所述组合物将包含于水性悬浮液中的约1011个或更多的腺病毒颗粒。常常将药学上可接受的载体或赋形剂用于这种灭菌组合物中。可以使用多种水性溶液，例如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％-甘氨酸等。这些溶液是无菌的，并通常除所需要的腺病毒载体外不含有其它微粒物质。根据需要，该组合物可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等(例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等)。可以包括增强腺病毒感染细胞赋形剂(参见US 6,392,069)。
本发明的腺病毒也可以通过脂质体或免疫脂质体运输而被输送到肿瘤细胞，这种运输可以基于肿瘤细胞群呈递的细胞表面特性(例如结合免疫脂质体中的免疫球蛋白的细胞表明蛋白的存在)而选择性地靶向肿瘤细胞。典型地，含有病毒体的水性悬浮液被包膜在脂质体或免疫脂质体中。例如，可以提供常规方法(US 5,043,164、US4,957,735、US 4,925,661、Connor and Huang，(1985)J.Cell Biol.101：581、Lasic D.D.(1992)Nature 355：279、Novel Drug Delivery(eds.Prescott and Nimmo，Wiley，New York-，1989)、Reddy et al.(1992)J.Immunol.148：1585)将腺病毒病毒体的悬浮液包膜在胶囊中形成免疫脂质体。可以将包含特异性结合呈递于个体的癌细胞上癌细胞抗原(例如CALLA、CEA)的免疫脂质体用于靶向那些细胞的病毒体(Fisher(2001)Gene Therapy 8：341-348)。
为进一步提高本发明的腺病毒的功效，可以对它们进行修饰以呈现对特定的癌细胞类型嗜性增强。例如，如PCT/US98/04964中所示，可以将腺病毒的外包膜上的蛋白质进行修饰以具有化学制剂，优选多肽，其与肿瘤细胞上存在的受体的结合程度高于正常细胞(也参见，US 5,770,442和US 5,712,136)。所述多肽可以是抗体，优选单链抗体。
腺病毒治疗
本发明的腺病毒或其药物组合物可以被施用用于***疾病或癌症。在治疗应用中，将组合物以足以治愈或至少部分阻断病症及其并发症的量施用给已被特定的肿瘤疾病侵袭的患者。足以达到这一目的的量被定义为“治疗有效剂量”或“有效剂量”。有效地用于这一用途的量取决于病症的严重性、患者的总体状况和施用途径。
例如，但不作为限制，患有实体瘤或血液***肿瘤疾病(例如胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌或乳腺癌、白血病或多发性骨髓瘤)的人类患者或非人哺乳动物可以通过施用治疗有效剂量的本发明的适当的腺病毒(即对某一组织类型显示出提高的治疗指数的那种腺病毒)。例如，优选的用于治疗结肠癌的嵌合腺病毒将是腺病毒ColoAd1(SEQ ID NO：1)。可以通过各种途径将感染性腺病毒颗粒的悬浮液运输到肿瘤组织，包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下和局部。可以通过灌注(例如灌注到腹膜腔中用于治疗卵巢癌，灌注到门静脉中用于治疗肝癌或从其它非肝初级瘤到肝脏的转移)或其它适当的途径施用含有约103-1012个或更多的病毒颗粒的腺病毒悬浮液，所述其它适当的途径包括直接注射到肿瘤块中(例如乳腺肿瘤)、灌肠(例如结肠癌)或导管(例如膀胱癌)。其它施用途径也可以适用于其它来源的癌症，即以喷雾吸入(例如，用于肺部输送以治疗于支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌或喉癌)或直接施用于肿瘤位点(例如，支气管癌、鼻咽癌、喉癌、***)。
利用本发明的腺病毒的腺病毒治疗可以与其它抗肿瘤方案(例如传统的用于治疗特定癌症的化学疗法或x-射线治疗)联合使用。治疗可以是同时的或相继的。一种优选的化疗剂是顺铂，优选的剂量可以由实践者基于待治疗的癌症的特性和其它在施用顺铂时常规考虑的因素进行选择。优选地，可以以50-120mg/m2的剂量在3-6小时的期间静脉内施用顺铂。更优选地，以80mg/m2的剂量在4小时的期间静脉内施用顺铂。另一种优选的化疗剂是5-氟尿嘧啶，其通常是与顺铂联合施用。5-氟尿嘧啶的优选剂量为每天800-1200mg/m2，连续5天。
利用本发明的腺病毒作为腺病毒载体的腺病毒治疗也可以与其它已知在基于病毒的治疗中有用的基因联合使用，参见US5,648,478。在这种情况下，所述嵌合腺病毒进一步包含掺入所述病毒的基因组中的编码治疗性蛋白质的异源基因，使得该异源基因在被感染的细胞内表达。本申请所使用得治疗性蛋白质指一种当其在给定的细胞中表达时被预期将提供一定的治疗效果的蛋白质。
在一个实施方式中，所述异源基因是前体药物激活基因，例如胞嘧啶脱氨酶(CD)(参见，US 5,631,236、US 5,358,866和US5,677,178)。在另一个实施方式中，所述异源基因是一种已知的细胞死亡的诱导物，例如凋亡素(apoptin)或腺病毒死亡蛋白(ADP)、或一种融合蛋白例如基因融合膜糖蛋白(fusogenic membraneglycoprotein)(Danen-Van Oorschot et al.(1997)Proc.Nat.Acad.Sci.94：5843-5847；Tollefson et al.(1996)J.Virol.70：2296-2306；Fu et al.(2003)Mol.Therapy 7：48-754，2003；Ahmed et al.(2003)Gene Therapy10：1663-1671；Galanis et al.(2001)Human Gene Therapy 12(7)：811-821)。
异源基因或其片段的其它例子包括编码免疫调节蛋白(例如细胞因子或趋化因子)的那些基因。例子包括白介素2(US 4,738,927或US 5,641,665)、白介素7(US 4,965,195或US 5,328,988)和白介素12(US 5,457,038)、肿瘤坏死因子α(US 4,677,063或US5,773,582)、干扰素γ(US 4,727,138或US 4,762,791)或GM CSF(US5,393,870或US 5,391,485，Mackensen et al.(1997)Cytokine GrowthFactor Rev.8：119-128)。其它免疫调节蛋白还包括巨噬细胞炎性蛋白包括MIP-3。也可以使用单核细胞趋化蛋白(MCP-3α)，一种优选的异源基因的实例是一种嵌合基因，其由编码跨细胞膜的蛋白质(例如VP22或TAT)的基因与编码优先对癌细胞而非正常细胞具有毒性的蛋白质的基因相融合而成。
本发明的嵌合腺病毒也可以被用作载体输送编码治疗上有用的RNA分子，即siRNA的基因(Dorsett and Tuschl(2004)Nature RevDrug Disc 3：318-329)。
在一些情况下，可以将基因(尽管这些基因对肿瘤本身不具有直接的影响)掺入本发明的嵌合腺病毒中以进一步增强该溶瘤病毒根除肿瘤的能力，所述基因包括编码破坏MHC I型抗原呈递分子(Hewittet al.(2003)Immunology 110：163-169)，阻断补体，抑制IFN和IFN-诱导机制、趋化因子和细胞因子、基于NK细胞的杀伤(Orange et al.，(2002)Nature Immunol.3：1006-1012；Mireille et al.(2002)Immunogenetics 54：527-542；Alcami(2003)Nature Rev.Immunol.3：36-50)，下调免疫应答(e.g.IL-10，TGF-Beta，Khong and Restifo(2002)Nature Immunol.3：999-1005；2002)和能够破坏细胞外基质并加强病毒在肿瘤中的扩散的金属蛋白酶(Bosman and Stamenkovic(2003)J.Pathol.2000：423-428；Visse and Nagase(2003)CirculationRes.92：827-839)的基因。
试剂盒
本发明还涉及包含一或多个容器的药物包装和试剂盒，所述容器中装有上述本发明的组合物的的一或多种成分。这种容器可伴有管理药品或生物制品的制造、使用和销售的政府机构规定格式的告示，其反映获得了管理这种产品的制造、使用和销售的机构的正式批准可将其用于人。
本发明通过以下实施例被进一步描述，这些实施例示例性地说明了本发明的特定实施方式，及其各种用途。这些举例说明本发明的某些特定方面的实例不应当被描述成对本发明所公开的范围的限制。
除非特别指出，本发明的实施是利用细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA操纵、免疫学科学的常规技术进行，这些技术是本领域技术人员所熟知的。这样的技术在文献中有详细的解释，参见，例如Cell Biology：a Laboratory Handbook：J.Celis(Ed).Academic Press.N.Y.(1996)；Graham，F.L.and Prevec，L.Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines.In：Vaccines：New Approaches to Immunological Problems.R.W.Ellis(ed)Butterworth.Pp 363-390；Grahan and Prevec Manipulation of adenovirusvectors.In：Methods in Molecular Biology，Vol.7：Gene Transfer andExpression Techniques.E.J.Murray and J.M.Walker(eds)HumanaPress Inc.，Clifton，N.J.pp 109-128，1991；Sambrook et al.(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press；Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1995)，ShortProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons。
实施例
方法
将标准技术用于重组核酸方法、多核苷酸合成、以及微生物培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。一般地，根据厂商说明书进行酶促反应和纯化步骤。一般地，根据本说明书全文所提及的本领域的常规方法和各种综合参考书(通常，参见Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd.edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)进行各项技术和方法。本申请中所使用的术语和实验室方法分析化学、有机合成化学、药物配制和输送、和患者的治疗。用于构建腺病毒突变体的方法在本领域中是广泛已知的(参见Mittal，S.K.，Virus Res.，1993，vol：28，pages67-90和Hermiston，T.et al.，Methods in Molecular Medicine：Adenovirus Methods and Protocols，W.S.M.Wold，ed，Humana Press，1999)。此外，腺病毒5基因组被登记为Genbank 10登录号#M73260，且该病毒可获自美国典型微生物菌种保藏中心，罗克维尔，马里兰，美国，保藏号VR-5。
病毒和细胞系
除HUVEC(Vec Technologies，Rensselaer，NY)和SAEC(Clonetics，Walkersville，MD)外，Ad血清型Ad3(GB毒株)、Ad4(RI-67毒株)、Ad5(Adenoid 75毒株)、Ad9(Hicks毒株)、Ad11p(Slobitski毒株)、Ad16(Ch.79毒株)和全部细胞系均购自ATCC：MDA231-mt1(Deb Zajchowski博士自快速生长的MDA231细胞皮下异种移植物分离的衍生物)和Panc1-sct(由Sandra Biroc博士从自快速生长的Panc1细胞皮下异种移植物衍生)。Ad40由St.LouisUniversity的William S.M.Wold博士惠赠。
实施例1：病毒纯化和定量
将病毒母液在293细胞上进行增殖，在CsCl梯度上进行纯化(Hawkins et al.，2001)。用于定量病毒颗粒的方法是基于Shabram et al.(1997)Human Gene Therapy 8：453-465，除用阴粒子交换剂TMAEFractogel代替Resource Q外。简言之，用Fractogel EMD TMAE-650(S)(目录号#116887-7 EM Science，Gibbstown，NJ 08027)装满1.25ml的柱。在Agilent HP 1100 HPLC上，利用以下条件进行HPLC分离：缓冲液A＝50mM HEPES、pH 7.5；缓冲液B＝于缓冲液A中的1.0 M NaCl；流速＝1ml/分。在缓冲液A中进行柱平衡不少于30分钟后，约109-1011个样品病毒颗粒负载到柱上10-100μl体积中，继以4柱体积的缓冲液A。然后应用超过16柱体积的线性梯度，并在100％缓冲液B中结束。
在A260和A280nm处监测柱洗脱物，计算峰区域，测定260nm与280nm的比率。病毒峰被鉴定为A260/A280比率接近1.33的那些峰。每一样品系列包括一个标准病毒。标准的每毫升的病毒颗粒数已利用Lehmberg et al.(1999)J.Chrom.B，732：411-423的方法进行确定。在使用的病毒浓度范围内，每一样品的A260nm峰区域直接对应于所述样品中的病毒颗粒数。每一测试样品中的每毫升病毒颗粒数通过已知的标准中的每毫升病毒颗粒数乘以该样品与标准的A260nm病毒峰区域的比率进行计算。
每一样品梯度后，用2柱体积的0.5 N NaOH继以2柱体积的100％缓冲液A、3柱体积的100％缓冲液B，和随后4柱体积的100％缓冲液A洗涤柱使柱再生。
实施例2：生物选择
集合代表腺病毒B至F亚群的病毒血清型，并在靶肿瘤细胞系的分会合培养物上以高颗粒/细胞比率进行2轮传代，使得血清型之间发生重组。然后，将来自第2轮高病毒颗粒/细胞感染、分会合培养物的上清(1.0、0.1、0.01、0.001ml)用于感染一组靶肿瘤细胞系PC-3、HT-29、Panc-1和MDA-231的过会合(over-confluent)T-75组织培养皿。为了获得过会合，以允许细胞系在接种后24-40小时之间达到会合的接种率接种每一细胞系，允许所述细胞在接种之后感染之前生长总共72小时。进行该步骤以使所述细胞的会合率最大化，以模拟在人实体瘤中的生长条件。
以10倍连续稀释液自第一皿中收获细胞培养物上清，这些稀释液在感染后第3或4天没有显示出任何CPE的迹象(对于HT-29和PC-3，以此修饰10-20代以收获第二皿，即收获100倍的稀释液，其中在感染3天可以检测到CPE)。将每一收获物用作起始材料用于病毒的选择性传代。重复这一过程直至病毒池达到20代生物选择带。
应用标准方法(Tollefson，A.，Hermiston，T.W.，and Wold，W.S.M.；“Preparation and Titration of CsCl-banded Adenovirus Stock”inAdenovirus Methods and Protocols，Humana Press，1999，pp 1-10，W.S.M.Wold，Ed)在A549细胞上通过2轮空斑纯化从各生物选择池分离各种病毒。简言之，在标准空斑检测中，将收获自各靶肿瘤系上的第20代的上清的稀释液用以感染A549细胞。收获分隔良好的空斑，将相同的空斑检测方法用于从这些收获物产生第2轮的独立空斑。来自第2轮空斑纯化的分隔良好的空斑被认为是纯的，利用这些纯化的空斑制备感染培养物，通过如上述的MTS检测对这些培养物上清的溶瘤效价进行测定。
实施例3：血清型表征
采用与Shabram et al.(1997)Human Gene Therapy 8：453：465中的描述相类似的方法对包含所述病毒池或分离的ColoAd1腺病毒的亲本腺病毒血清型进行鉴定，除如实施例1中所描述的那样用阴粒子交换剂TMAE Fractogel(EM Industries，Gibbstown，NJ)代替ResourceQ外(参见，图1)。
在梯度过程中，腺病毒类型5在大约60％缓冲液B时洗脱。其它血清型(3、4、9、11p、16、35和40)分别在与Blanche et al.(2000)Gene Therapy 7：1055-1062所公开的在Q Sepharose XL上的保留时间相一致的特征性保留时间被洗脱。
实施例4：细胞溶解检测
利用修饰的MTT检测(Shen et al.，2001)对病毒的裂解能力进行测定。简言之，由于MTS被细胞转化为水性的、可溶的甲月替缩短了时间并避免了使用与MTT检测有关的挥发性有机溶剂，因此用MTS检测(Promega，CellTiter 96Aqueous Non-Radioactive CellProliferation Assay)取代了MTT检测。
为了进行所述检测，以每种肿瘤细胞系能在24小时内产生会合单层的规定密度接种细胞。在暴露给测试病毒前，允许这些密度接种的细胞再生长2天。采用病毒的3倍连续稀释一式四份地进行肿瘤和原代正常细胞的感染，自颗粒/细胞的比率为100始，颗粒/细胞的比率为0.005止。于37℃温育被感染的细胞，在为各原代细胞或肿瘤细胞系指定的时间点进行MTS检测。将未感染细胞用作阴性对照，并在给定的检测中将其设定为100％的存活率。
实施例5：DNA测序
Ad11p(SEQ ID NO：2)和ColoAd1(SEQ ID NO：1)基因组DNA的DNA测序按照如下进行。简言之，用限制性核酸内切酶Sau3A1部分消化来自ColoAd1和Ad11p的纯化的腺病毒DNA，然后鸟枪法克隆到质粒载体pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)中。增殖阳性克隆，并利用引物M13R和KS(Stratagene，La Jolla，CA)进行测序。利用Sequenchertm(Gene Codes Corp.，Ann Arbor，Michigan)对各序列反应进行修饰、编辑和组装。用传统的寡核苷酸引物对覆盖的缺口进行扩增，并测序。脱离腺病毒DNA对病毒基因组的末端进行直接测序。总之，以3X+coverage对每一基因组测序，以2Xcoverage对431个碱基测序。
为了测定ColoAd1 E2B区域的起点，设计了两个引物对，一对针对E2B pTP基因(9115bp，5’GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3’(SEQ ID NO：4)和(9350bp，5’GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3’(SEQ ID NO：5)，一对针对DNA聚合酶基因(7520bp，5’CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3’(SEQ ID NO：6)和7982bp，5’GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3’(SEQ ID NO：7))，并用于来自各血清型(Ad3、4、5、9、11p、16和40)的PCR分离物DNA片段，所述片段利用Advantage 2 PCR试剂盒(Clonetics，Walkersville，MD；Cat#K1910-Y)并在来自MJ Research(Watertown，MA)的PTC-200 thermocycler上进行电泳获得。随后，利用染色终止测序在ABI 3100遗传分析仪上，将这些片段与Ad3的DNA序列一起测序。
用分离的Ad3 DNA和重叠引物对Ad3的E2B区域进行测序。
用Vector NTI程序(Informatix)对序列信息进行分析。
实施例6：重组病毒的构建
Ad11p(SEQ ID NO：2)和ColoAd1(SEQ ID NO：1)的基因组DNA纯化自CsCl梯度结合的病毒颗粒。用PacI消化基因组DNA，在病毒基因组中PacI仅切割两种基因组各一次。在ColoAd1核苷酸序列(SEQ ID NO：1)上，Pac1切割发生在第18141个碱基；在Ad11核苷酸序列(SEQ ID NO：2)上，Pac1切割发生在第18140个碱基。等量混合消化的DNA，并于16℃在T4 DNA连接酶的存在下进行连接过夜。用Invitrogen，Carlsbad，CA(Cat#K2780-01)的CaPO4转染试剂盒将这一连接混合物转染到A549细胞中。挑选分离的空斑，通过限制性酶消化和PCR分析进行筛选以区分4个病毒群体(Ad11p、ColoAd1、左端Ad11p/右端ColoAd1(ColoAd1.1)和左端ColoAd1/右端Ad11p(ColoAd1.2))。
如实施例3中所述，在几个细胞系中(包括HT29和HUVEC细胞系)测定每一群体的病毒裂解能力。结果表明效价从最低到最高为Ad11p、ColoAd1.2、ColoAd1.1、ColoAd1(参见图7所示的在HT29细胞中的结果)。
同样构建的还有嵌合腺病毒pCJ144和pCJ146，其含有全长的ColoAd1基因组，该基因组中已经分别重建了野生型Ad11p E3和E4区域。通过同源重组将这些修饰导入BJ5 183 E.Coli(Chartier et al.(1996)J.Virol.70：4805-4810)。与ColoAd1或ColoAd1.2相比较，这两种嵌合腺病毒在HT29和HUVEC细胞中都显示出降低的裂解能力。
实施例7：腺病毒的体内效能
在经典的人癌移植物裸鼠试验中，用5×106个细胞皮下注射鼠的后侧。当肿瘤的大小达到100-200μl时，用介质(PBS)或用2×1010个颗粒的病毒连续注射5天(总共1×1011个颗粒)。相对于PBS对照组合其它的对照病毒(Ad5、ONYX-015)，将观察到肿瘤大小的缩小。
实施例8：ColoAd1在原代人组织移植物上的选择性
将来自结肠肿瘤的组织样品以及在手术过程中摘除的邻近的正常组织放置于培养基中，并用相同数目的ColoAd1或Ad5感染。感染后24小时收集培养物上清，并测定产生的病毒颗粒的数目。与Ad5相比，ColoAd1在肿瘤组织上产生更多的病毒颗粒/每一输入颗粒，但其在正常组织上产生较少的病毒颗粒/每一输入颗粒。
序列表
<110>舍林股份公司
<120>用于治疗癌症的嵌合腺病毒
<130>53183AUSM1
<150>US 60/574,851
<151>2004-05-26
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>32325
<212>DNA
<213>Adenovirus
<400>1
ctatctatat aatatacctt atagatggaa tggtgccaat atgtaaatga ggtgatttta      60
aaaagtgtgg atcgtgtggt gattggctgt ggggttaacg gctaaaaggg gcggtgcgac     120
cgtgggaaaa tgacgttttg tgggggtgga gtttttttgc aagttgtcgc gggaaatgtg     180
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atttacagta agtgtgttta agttaaaatt taaaggaata tgctgttttt cacatgtata  1200
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tctcctgatt ctactacctc acctcctgag attcaagcac ctgttcctgt ggacgtgcgc  1320
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taaaaatatg ttaactgttc actggttttt attgcttttt gggcggggac tcaggtatat  1560
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ggccattttg gaagacctta ggaagactag gcaactgtta gagaacgctt cggacggagt  1680
ctccggtttt tggagattct ggttcgctag tgaattagct agggtagttt ttaggataaa  1740
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aaccccaggt agaactgctg ctgctgtggc ttttcttact tttatattag ataaatggat  1920
cccgcagact catttcagca ggggatacgt tttggatttc atagccacag cattgtggag  1980
aacatggaag gttcgcaaga tgaggacaat cttaggttac tggccagtgc agcctttggg  2040
tgtagcggga atcctgaggc atccaccggt catgccagcg gttctggagg aggaacagca  2100
agaggacaac ccgagagccg gcctggaccc tccagtggag gaggcggagt agctgacttg  2160
tctcctgaac tgcaacgggt gcttactgga tctacgtcca ctggacggga taggggcgtt  2220
aagagggaga gggcatctag tggtactgat gctagatctg agttggcttt aagtttaatg  2280
agtcgcagac gtcctgaaac catttggtgg catgaggttc agaaagaggg aagggatgaa  2340
gtttctgtat tgcaggagaa atattcactg gaacaggtga aaacatgttg gttggagcct  2400
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cagtataaga ttactagacg gattaatatc cggaatgctt gttacatatc tggaaatggg  2520
gctgaggtgg taatagatac tcaagacaag gcagttatta gatgctgcat gatggatatg  2580
tggcctgggg tagtcggtat ggaagcagta acttttgtaa atgttaagtt taggggagat  2640
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tttggtttca acaatacctg tgtagatgcc tggggacagg ttagtgtacg gggatgtagt  2760
ttctatgcgt gttggattgc cacagctggc agaaccaaga gtcaattgtc tctgaagaaa  2820
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cattgtaata tgctggctac tgtgcatatt gtttcccatc aacgcaaaaa atggcctgtt    3060
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tttttatttc atttttcgcg cacggtatgc cctagaccac cgatctctat cattgagaac    4020
tcggtggatt ttttccagga tcctatagag gtgggattga atgtttagat acatgggcat    4080
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ctgttctgac tttggaaagt tcgtcttcgc aaccccgctc gggcggaatc gggaccgttc    27060
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tacatattgg caccattcca tctataaggt atattatata gatag                    32325
<210>2
<211>34794
<212>DNA
<213>Adenovirus
<400>2
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aggttgtcag tttctaagaa cgaggaggat ttgatattga cagtgccggt tgagatgcct    6060
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agcccccacg ggatctctcg cgcgcatgac cacctgggcg aggttgagct ccacgtggcg    2880
ggtgaagacc gcatagttgc ataggcgctg gaaaaggtag ttgagtgtgg tggcgatgtg    2940
ctcggtgacg aagaaataca tgatccatcg tctcagcggc atctcgctga catcgcccag    3000
cgcttccaag cgctccatgg cctcgtagaa gtccacggca aagttaaaaa actgggagtt    3060
acgcgcggac acggtcaact cctcttccag aagacggata agttcggcga tggtggtgcg    3120
cacctcgcgc tcgaaagccc ctgggatttc ttcctcaatc tcttcttctt ccactaacat    3180
ctcttcctct tcaggtgggg ctgcaggagg agggggaacg cggcgacgcc ggcggcgcac    3240
gggcagacgg tcgatgaatc tttcaatgac ctctccgcgg cggcggcgca tggtctcggt    3300
gacggcacga ccgttctccc tgggtctcag agtgaagacg cctccgcgca tctccctgaa    3360
gtggtgactg ggaggctctc cgttgggcag ggacaccgcg ctgattatgc attttatcaa    3420
ttgccccgta ggtactccgc gcaaggacct gatcgtctca agatccacgg gatctgaaaa    3480
cctttcgacg aaagcgtcta accagtcgca atcgcaaggt aggctgagca ctgtttcttg    3540
cgggcggggg cggctagacg ctcggtcggg gttctctctt tcttctcctt cctcctcttg    3600
ggagggtgag acgatgctgc tggtgatgaa attaaaatag gcagttttga gacggcggat    3660
ggtggcgagg agcaccaggt ctttgggtcc ggcttgttgg atacgcaggc gatgagccat    3720
tccccaagca ttatcctgac atctggccag atctttatag tagtcttgca tgagtcgttc    3780
cacgggcact tcttcttcgc ccgctctgcc atgcatgcga gtgatcccga acccgcgcat    3840
gggctggaca agtgccaggt ccgctacaac cctttcggcg aggatggctt gctgcacctg    3900
ggtgagggtg gcttggaagt cgtcaaagtc cacgaagcgg tggtaggccc cggtgttgat    3960
tgtgtaggag cagttggcca tgactgacca gttgactgtc tggtgcccag ggcgcacgag    4020
ctcggtgtac ttgaggcgcg agtatgcgcg ggtgtcaaag atgtaatcgt tgcaggtgcg    4080
caccaggtac tggtagccaa tgagaaagtg tggcggtggc tggcggtaca ggggccatcg    4140
ctctgtagcc ggggctccgg gggcgaggtc ttccagcatg aggcggtggt agccg         4195

Claims (27)

1.一种具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其中
所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列；
所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此不相同；以及，
所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数。
2.权利要求1的腺病毒，其还包含编码纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的区域，其中编码所述腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的核酸来自相同的腺病毒血清型。
3.权利要求1的腺病毒，其还包含经修饰的E3区域。
4.权利要求1的腺病毒，其还包含经修饰的E4区域。
5.权利要求1的腺病毒，其中所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、***肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞或造血肿瘤细胞。
6.权利要求5的腺病毒，其中所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞。
7.权利要求1的腺病毒，其中所述腺病毒的E2B区域的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3或其一部分。
8.权利要求1的腺病毒，其中所述腺病毒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
9.一种具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其中
所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列；
所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此不相同；
所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数；以及
所述嵌合腺病毒已通过缺失选自E1、E2、E3或E4的一或多个编码参与腺病毒复制的蛋白质的腺病毒区域而成为复制缺陷型。
10.权利要求9的复制缺陷型腺病毒，其中E1和E3区域被缺失。
11.权利要求10的复制缺陷型腺病毒，进一步包含E4区域的缺失。
12.权利要求1或9的腺病毒，进一步包含异源基因，其中所述异源基因在由所述腺病毒感染的细胞内表达。
13.权利要求12的腺病毒，其中所述异源基因是胸苷激酶。
14.权利要求12的腺病毒，其中所述异源基因编码选自以下一组的治疗性蛋白质：细胞因子和趋化因子、抗体、前体药物转化酶和免疫调节蛋白。
15.一种抑制癌细胞生长的方法，包括用权利要求1的腺病毒感染所述癌细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述癌细胞是结肠癌细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述腺病毒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
18.一种将治疗性蛋白质输送给细胞的方法，包括用权利要求14的腺病毒感染所述细胞。
19.一种用于分离权利要求1的腺病毒的方法，其中所述方法包括：
a)集合代表腺病毒亚群B至F的腺病毒血清型，从而产生腺病毒混合物；
b)将来自步骤(a)的集合的腺病毒混合物在肿瘤细胞的活跃生长培养物中，以高至足以促进血清型之间发生重组但没有高至产生过早细胞死亡的颗粒/细胞比率进行传代；
c)从步骤(b)收获上清；
d)用在步骤(c)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；
e)在出现任何CPE的迹象之前，从步骤(d)中收获细胞培养物上清；
f)用步骤(e)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；和
g)通过空斑纯化从在步骤(f)中收获的上清中分离权利要求1的病毒。
20.权利要求19的方法，其中在收获步骤(c)中的上清之前进行步骤(b)两遍。
21.权利要求19的方法，其中在步骤(g)之前重复步骤(e)和(f)20遍。
22.权利要求19的方法，其中在步骤(g)之后进行第二轮空斑纯化。
23.权利要求19的方法，其中所述肿瘤细胞是结肠肿瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、肺肿瘤细胞、***肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞或造血肿瘤细胞。
24.一种具有包含E2B区域的基因组的重组嵌合腺病毒或其变体或衍生物，其中
所述E2B区域包含衍生自第一种腺病毒血清型的核酸序列和衍生自第二种腺病毒血清型的核酸序列；
所述第一种和第二种腺病毒血清型分别选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，且彼此不相同；以及
所述嵌合腺病毒是溶瘤的，并对肿瘤细胞显示出提高的治疗指数；
该重组嵌合腺病毒通过以下方法产生：
a)集合代表腺病毒亚群B至F的腺病毒血清型，从而产生腺病毒混合物；
b)将来自步骤(a)的集合的腺病毒混合物在肿瘤细胞的活跃生长培养物中，以高至足以促进血清型之间发生重组但没有高至产生过早细胞死亡的颗粒/细胞比率进行传代；
c)从步骤(b)收获上清；
d)用在步骤(c)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；
e)在出现任何CPE的迹象之前，从步骤(d)中收获细胞培养物上清；
f)用步骤(e)中收获的上清感染肿瘤细胞的静止培养物；和
g)通过空斑纯化从在步骤(f)中收获的上清中分离所述嵌合腺病毒。
25.权利要求24的方法，其中在收获步骤(c)中的上清之前进行步骤(b)两遍。
26.权利要求24的方法，其中在步骤(g)之前重复步骤(e)和(f)20遍。
27.权利要求24的方法，其中在步骤(g)之后进行第二轮空斑纯化。
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