BRPI0510475B1 - Adenovírus quimérico recombinante, uso do mesmo no tratamento de câncer e métodos de inibição de crescimento de uma célula de câncer, de fornecimento de uma proteína terapêutica a uma célula e para o isolamento do adenovírus - Google Patents

Abstract

adenovírus quimérico recombinante para o uso no tratamento de câncer e métodos de inibição de crescimento de uma célula de câncer, de fornecimento de uma proteína terapêutica a uma célula e para o isolamento do adenovírus. a presente invenção refere-se a adenovírus oconlitícos tendo aplicações terapêuticas. adenovírus quiméricos recombinantes, e métodos para produzi-los são providos. os adenovírus quiméricos da invenção compreendem seqüências de ácidos nucléicos derivadas de sorotipos adenovirais classificados dentro dos subgrupos b até f e demostram um índice terapêutico aumentado.

Description

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. no. de série 60/574.851, depositado em 26 de maio de 2004, que é incorporado aqui por referência.

Campo da Invenção

[0002] A invenção descrita aqui refere-se, em geral, ao campo de biologia molecular, e mais especificamente a adenovirus oncolítico tendo aplicações terapêuticas.

Antecedentes da Invenção

[0003] Câncer é uma causa principal de morte nos Estados Unidos e outros lugares. Dependendo do tipo de câncer, ele é tipicamente tratado com cirurgia, quimioterapia e/ou radiação. Estes tratamentos frequentemente fracassam, e está claro que novas terapias são necessárias, a serem usadas sozinhas ou em combinação com técnicas clássicas.

[0004] Uma abordagem foi o uso de adenovirus, ou sozinho ou como vetores capazes de fornecer proteínas terapêuticas anticâncer a células de tumor. Adenovirus são vírus icosaédricos não-envelopados de DNA de fita dupla com um genoma linear de cerca de 36 quilobases de pares. Cada extremidade do genoma virai tem uma sequência curta conhecida como a repetição terminal invertida (ou ITR), que é exigida para replicação virai. Todos os genomas de adenovirus humano examinados até agora têm a mesma organização geral; isto é, os genes que codificam funções específicas estão localizados na mesma posição no genoma virai. O genoma virai contém cinco unidades de transcrição precoce (E1A, E1B, E2, E3 e E4), duas unidades iniciais atrasadas (IX e Iva2), e uma unidade tardia (mais tardia) que é processado para gerar cinco famílias de mRNAs tardios (L1-L5). Proteínas codificadas pelos genes iniciais estão envolvidas em replicação, enquanto que os genes tardios codificam proteínas estruturais virais. Porções do genoma virai podem ser prontamente substituídas com DNA de origem estranha e adenovirus recombinante estruturalmente estáveis, propriedades que tornam estes vírus potencialmente úteis para a terapia genética (ver, Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64).

[0005] Atualmente, os esforços de pesquisa para produzir terapia adenoviral clinicamente útil focalizou o sorotipo adenoviral, Ad5. A genética deste adenovirus humano é bem caracterizada e sistemas são bem descritos para sua manipulação molecular. Métodos de produção de alta capacidade foram desenvolvidos para suportar aplicações clínicas e alguma experiência clínica com o agente está disponível. Ver, Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64. Pesquisa relacionada com o uso de adenovirus humano (Ad) em tratamento de câncer focalizou o desenvolvimento de adenovirus à base de Ad5 que tem uma potência mais alta em, ou é de preferência direcionado a, tipos de célula de tumor específicos e existe uma necessidade de geração de vírus oncolíticos mais potentes se a terapia adenoviral for encontrar aplicação prática em um conjunto clínico.

[0006] Ad5 é apenas um de 51 sorotipos adenovirais atualmente conhecidos, que são classificados em subgrupos A-F, com base em vários atributos incluindo suas propriedades de hemaglutinação ((Ver, Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication", in Fields Virology, vol. 2, 4aed., Knipe, ea, Lippincott, Williams & Wilkins, pp. 2265-2267 (2001)). Estes sorotipos diferem a uma variedade de níveis, por exemplo, patologia em seres humanos e roedores, receptores de célula usados para ligação, mas estas diferenças foram grandemente ignoradas como meio potencial para desenvolver adenovirus oncolíticos mais potentes (com a exceção de que alterações de fibra, ver Stevenson e outros (1997) J. Virol. 71:4782-4790; Krasnykh e outros (1996) J. Virol 70:6839-6846; Wickham e outros (1997) J. Virol 71:8221-8229; Legrand e outros (2002) Curr. Gene Ther. 2:323-329; Barnett e outros (2002) Biochim. Biophys. Acta 1-3:1-14; o pedido de patente U.S. 2003/0017138).

[0007] Exploração de diferenças entre os sorotipos adenovirais podem prover uma fonte de mais teurapêuticos de base adenoviral eficaz, usando-se novos adenovirus com seletividade e potência aumentadas. Há uma necessidade de tais terapias de base adenovirais aperfeiçoadas.

Sumário da Invenção

[0008] A presente invenção provê novos adenovirus quiméricos, ou suas variantes ou derivados, úteis para terapia de base virai. Em particular, a invenção provê adenovirus quiméricos, ou suas variantes ou derivados, tendo um genoma compreendendo uma região E2B em que a dita região E2B compreende uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um primeiro sorotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um segundo sorotipo adenoviral; em que os ditos primeiro e segundo sorotipos são, cada um, selecionados dos subgrupos adenovirais, B, C, D, E, ou F e são distintos entre si; e em que o dito adenovirus quimérico é oncolítico e demonstra um índice terapêutico aumentado para uma célula de tumor.

[0009] Em uma concretização, o adenovirus quimérico ulteriormente compreende regiões que codificam proteínas de penton, hexon e fibra, em que os ácidos nucléicos que codificam as ditas proteínas são todos do mesmo sorotipo adenoviral. Em uma concretização, o adenovirus quimérico da invenção compreende uma região de E3 ou E4 modificada.

[0010] Em uma outra concretização, o adenovirus quimérico demonstra um índice terapêutico aumentado em uma célula de cólon, de mama, de pâncreas, de pulmão, de próstata, ovariana ou hematopoiética. Em uma concretização particularmente preferida, o adenovirus quimérico exibe um índice terapêutico aumentado em células de tumor de cólon.

[0011] Em uma concretização preferida, a região E2B do adenovirus quimérico compreende SEQ. ID NO: 3. Em uma concretização particularmente preferida, o adenovirus quimérico compreende SEQ. ID NO: 1.

[0012] A presente invenção provê um adenovirus quimérico recombinante, ou uma variante ou derivado do mesmo, tendo um genoma compreendendo uma região E2B: em que a dita região E2B compreende sequências de ácidos nucléicos derivadas de um primeiro sorotipo adenoviral e um segundo ácido nucléico derivado de um segundo sorotipo adenoviral; em que os ditos primeiro e segundo sorotipos adenovirais são, cada um, selecionados dos subgrupos adenovirais B, C, D, E ou F e são distintos entre si; em que o dito adenovirus quimérico é oncolítico e demonstra um índice terapêutico aumentado para uma célula de tumor; e em que o dito adenovirus quimérico foi tornado deficiente de replicação através da deleção de uma ou mais regiões adenovirais que codificam proteínas envolvidas em replicação adenoviral selecionadas do grupo que consiste em E1, E2, E3 ou E4.

[0013] Em uma concretização, o adenovirus quimérico da invenção ulteriormente compreende um gene heterólogo que codifica a proteína terapêutica, em que o dito gene heterólogo é expresso dentro de uma célula infectada com o dito adenovirus. Em uma concretização preferida, a proteína terapêutica é selecionada do grupo que consiste em citocinas e quimiocinas, anticorpos, enzimas conversoras de pró- fármaco e proteínas imunorreguladoras.

[0014] A presente invenção provê métodos para o uso do adenovirus quimérico da invenção para as finalidade terapêuticas. Em uma concretização, os adenovirus quiméricos podem ser usados para inibir o crescimento de células de câncer. Em uma concretização particular, um adenovirus quimérico compreendendo SEQ. ID NO: 1 é útil para inibir o crescimento de células de câncer de cólon.

[0015] Em uma outra concretização, os adenovirus da invenção são úteis como vetores para fornecer proteínas terapêuticas a células.

[0016] A presente invenção provê um método para a produção dos adenovirus quiméricos da invenção, em que o método compreende a) combinação de sorotipos adenovirais que representam subgrupos B-F adenovirais, desse modo criando uma mistura adenoviral; b) passagem da mistura adenoviral combinada da etapa (a) em uma cultura de desenvolvimento ativa de células de tumor a uma partícula por alta razão de célula suficiente para estimular recombinação entre sorotipos, mas não assim tão alta como para produzir morte de célula prematura; c) coleta do sobrenadante da etapa (b) d) infecção da cultura quiescente de células de tumor com o sobrenadante coletado na etapa (c); e) coleta do sobrenadante de cultura de célula da etapa (d) antes de qualquer sinal de CPE; f) infecção de uma cultura quiescente de células de tumor com o sobrenadante coletado na etapa (e); e g) isolamento do adenovirus quimérico do sobrenadante coletado na etapa (f) por purificação de placa

Breve Descrição dos Desenhos

[0017] A figura 1 perfis de tempo de retenção Ad em uma coluna de HPLC TMAE. A) perfis de retenção para os sorotipos de Ad individuais que foram usados para gerar a combinação virai de partida de origem. B) perfis de retenção das combinações de passagem 20 derivadas de linhagem celular HT-19, Panc-1, MDA-231 e PC-3, respectivamente.

[0018] A figura 2. Atividade citolítica das combinações virais individuais. A) células de HT-29, B) MDA-231, C) Panc-1 e D) PC-3 foram infectadas com suas combinações virais respectivas a razões de VP por célula de 100 a 0,01. Ensaios de MTS foram realizados a dias diferentes pós-infecção (como indicado) dependendo da linha de célula. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio feito em quadruplicata e os resultados são expressos como média +/- de desvio- padrão. O painel mostra uma experiência respectiva e todas as combinações virais foram analisadas pelo menos três vezes independentes na linha de célula de tumor alvo (Figura Legenda: -•- Ad5; -□- combinação virai inicial; -■- combinação derivada de célula específica, passagem 20).

[0019] Afigura3. Atividadecitolíticade ColoAdl eAd5em linhagem celular de tumor humanas. Um ensaio de MTS foi realizado em a) um amplo painel de linhagem celular de tumor humanas e B) em um painel de linhagem celular de câncer de cólon humanas para determinar sus especificidade de potência potencial. O ensaio de MTS foi realizado nos dias diferentes dependendo da linha de célula. Cada painel é um experimento representativo que foi repetido pelo menos três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio feito em quadruplicata e os resultados são expressos como médias +/- SD (Figura Legenda: -•- Ad5; -□- ColoAdl).

[0020] A figura 4. Atividade citolítica de ColoAdl e Ad5 em um painel de células normais. Células de HS-27, HUVEC e SAEC (células de fibroblasto primário, endoteliais e epiteliais, respectivamente) foram infectadas com ColoAdl e Ad5 a VP por razões de célula de 100 a 0,01. Ensaio de MST foi realizado nos dias diferentes pós-infecção dependendo da célula e cada painel é um experimento representativo que foi repetido pelo menos três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio feito em quadruplicata e os resultados são expressos como médias +/- SD (Figura Legenda: Ad5; ColoAdl).

[0021] Afigura 5. Atividade citolítica de ColoAdl, Ad5 e ONYX-015 em células endoteliais normais primárias (HUVEC) e uma linha de célula de tumor de cólon (HT-29). Cada painel é um experimento representativo que foi repetido pelo menos três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio feito em quadruplicata e os resultados são expressos como médias +/- SD (Figura Legenda: Ad5; ColoAdl; Onyx-015).

[0022] A figura 6. Atividade citolítica de ColoAdl, Ad11 p e Ad5 em uma linha de célula epitelial normal (SAEC) e uma linha de célula de câncer de cólon humana (HT-29). Cada painel é um experimento representativo que foi repetido pelo menos três vezes. Cada ponto de dados no painel representa um ensaio feito em quadruplicata e os resultados são expressos como médias +/- SD (Figura Legenda: Ad5; Ad11 p; ColoAdl).

[0023] A figura 7. Atividade citolítica de vírus recombinantes. Vírus recombinantes que representam quatro populações virais (Adp11, ColoAdl, Ad11 p de extremidade à esquerda/ColoAdl de extremidade à direita (ColoAd1.1) e ColoAdl de extremidade à esquerda/Adl 1p de extremidade à direita (ColoAdl .2) foram construídos como descritos no exemplo 6. Atividade citolítica de cada população de células em células de HT29 foi determinada como anteriormente descrita. (Figura Legenda: — Ad5; Ad11 p; ColoAdl); -u- ColoAdl.1; -σ- ColoAdl.2).

Descrição Detalhada da Invenção

[0024] Todas as publicações, incluindo patentes e pedidos de patentes, mencionados neste relatório são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse especificamente e individualmente indicada a ser incorporada por referência em sua totalidade.

Definições

[0025] A não ser que de outra maneira indicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que comumente entendido por aquele versado na técnica à qual esta invenção pertence. Em geral, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório descritos abaixo são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na técnica.

[0026] Como usado aqui, o termo "adenovirus", "sorotipo" ou "sorotipo adenoviral"refere-se a qualquer um dos 51 sorotipos adenovirais humanos atualmente conhecidos, ou isolados no futuro. Ver, por exemplo, Strauss, "Adenovirus infections in humans", in The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, págs. 451- 596 (1984). Estes sorotipos são classificados nos subgrupos A-F (ver, Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication", in Fields Virology, vol. 2 4a. ed., Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, págs. 2265-2267 (2001), como mostrado na tabela 1. Tabela 1

[0027] Como usado aqui, "adenovirus quimérico"refere-se a um adenovirus cuja sequência de ácidos nucléicos é constituída das sequências de ácidos nucléicos de pelo menos dois dos sorotipos adenovirais descritos acima.

[0028] Como usado aqui, "sorotipo adenoviral de origem" refere-se ao sorotipo adenoviral que representa o sorotipo a partir do qual a maioria do genoma do adenovirus quimérico é derivado.

[0029] Com usado aqui, o termo "recombinação homóloga" refere- se a duas moléculas de ácido nucléico, cada uma tendo sequências homólogas, onde duas moléculas de ácido nucléico atravessam ou sofrem recombinação na região de homologia.

[0030] Como usado aqui, o termo "potência" refere-se ao potencial lítico de um vírus e representa sua capacidade de replicar, lisar e espalhar. Para as finalidades da presente invenção, potência é um valor que compara atividade citolítica de um dado adenovirus da invenção com aquele de Ad5 na mesma linha de célula, isto é, potência = ICso de AdX/ICõo de Ad5, onde X é o sorotipo adenoviral particular sendo examinado e em que a potência de Ad5 é dado um valor de 1.

[0031] Como usado aqui, o termo "vírus oncolítico" refere-se a um vírus que de preferência mata células de câncer quando comparadas com células normais.

[0032] Como usado aqui, o termo "índice terapêutico" ou "janela terapêutica" refere-se a um número que indica o potencial oncolítico de um dado adenovirus e é determinado por divisão da potência do adenovirus em uma linha de célula de câncer pela potência do mesmo adenovirus em uma linha de célula normal (isto é, não-cancerosa).

[0033] Como usado aqui, o termo "modificado" refere-se a uma molécula com uma sequência de aminoácidos ou sequência de nucleotídeos que difere de uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos do tipo selvagem, por exemplo, de ocorrência natural. Uma molécula modificada pode reter a função ou a atividade de uma molécula do tipo selvagem, isto é, um adenovirus modificado pode reter sua atividade oncolítica. Modificações incluem mutações em ácidos nucléicos como descritos abaixo.

[0034] Como usado aqui, "mutação" com referência a um polinucleotídeo ou e um polipeptídeo refere-se a uma mudança recombinante ou química, sintética de ocorrência natural ou diferença à estrutura primária, secundária ou terciária de um polinucleotídeo ou polipeptídeo, quando comparado com um polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência, respectivamente (por exemplo, quando comparado com um polinucleotídeo ou polipeptídeo do tipo selvagem). Mutações incluem tais mudanças como, por exemplo, deleções, inserções ou substituições. Polinucleotídeos e polipeptídeos tendo mutações podem ser isolados ou gerados usando-se métodos bem conhecidos na técnica.

[0035] Como usado aqui, "deleção" é definida como uma mudança ou em sequências de polinucleotídeos ou aminoácidos em que um ou mais polinucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, estão ausentes.

[0036] Como usado aqui, "inserção" ou "adição" é que mudança em uma sequência de polinucleotídeos ou de aminoácidos que resultou na adição de um ou mais polinucleotídeos ou resíduos de aminoácidos, respectivamente, quando comparados com a sequência de aminoácidos ou de polinucleotídeos de ocorrência natural.

[0037] Como usado aqui, "substituição" resulta da substituição de um ou mais polinucleotídeos ou aminoácidos por polinucleotídeos ou aminoácidos diferentes, respectivamente.

[0038] Como usado aqui, o termo "derivado adenoviral"refere-se a um adenovirus da invenção que foi modificado tal que uma adição, uma deleção ou uma substituição foi feita para ou no genoma virai, tal que o derivado adenoviral resultante exibe uma potência e/ou um índice terapêutico maior do que aquele do andenovírus de origem, ou em algum outro modo é mais terapeuticamente útil (isto é, menos imunogênico, perfil de depuração aperfeiçoado). Por exemplo, um derivado de um adenovirus da invenção pode ter uma deleção dos genes iniciais do genoma virai incluindo, mas não limitado à região de E1A ou E2B do genoma virai.

[0039] Como usado aqui, "variante" com referência ao polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que pode variar em estrutura primária, secundária ou terciária, quando comparado com polinucleotídeo ou polipeptídeo, respectivamente (por exemplo, quando comparado com um polinucleotídeo ou polipeptídeo do tipo selvagem). Por exemplo, uma sequência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos pode conter uma mutação ou uma modificação que difere de uma sequência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos de referência. Em algumas concretizações, uma variante adenoviral pode ser uma isoforma ou polimorfismo diferente. Variantes podem ser polinucleotídeos ou polipeptídeos quimicamente modificados ou recombinantes, sintéticos, de ocorrência natural isolados ou gerados usando-se os métodos conhecidos na técnica. Mudanças na sequência de polinucleotídeos da variante podem ser silenciosas. Isto é, elas podem não alterar os aminoácidos codificados pelo polinucleotídeo. Onde alterações são limitadas a mudanças silenciosas deste tipo, uma variante codificará um polipeptídeo com a mesma sequência de aminoácidos que a referência. Alternativamente, tais mudanças na sequência de polinucleotídeos da variante podem alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência, que resulta em mudanças de aminoácidos conservatives ou não-conservativas, como descritas abaixo. Tais mudanças de polinucleotídeo podem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncações de aminoácido no polipeptídeo codificado pela sequência de referência. Várias substituições de códon, tais como mudanças silenciosas que produzem vários sítios de restrição, podem ser introduzidas para otimizar clonagem em um vetor ou expressão virai ou plasmídeo em um sistema procariótico ou eucariótico.

[0040] Como usado aqui, uma "variante adenoviral"refere-se a um adenovirus cuja sequência de polinucleotídeos difere de um polinucleotídeo de referência, por exemplo, um adenovirus do tipo selvagem, como descrito acima. As diferenças são limitadas de modo que as sequências de polinucleotídeos da origem e da variante sejam similares em toda a parte e, na maioria das regiões idênticas. Como usado aqui, uma primeira sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos é dita ser "similar" a uma segunda sequência quando uma comparação das duas sequências mostra que elas têm poucas diferenças de sequência (isto é, a primeira e a segunda sequências são quase idênticas). Como usado aqui, as diferenças de sequência de polinucleotídeos presentes entre a variante adenoviral e o adenovirus de referência não resultam em uma diferença na potência e/ou índice terapêutico.

[0041] Como usado aqui, o termo "conservador"refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido para um resíduo de aminoácido diferente que tem propriedades químicas similares. Substituições de aminoácidos conservadores incluem substituição de uma leucina com uma isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato ou uma treonina com uma serina. Inserções ou deleções estão tipicamente na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos.

[0042] Como usado aqui, o termo "não-conservativo"refere-se ao resíduo de aminoácido como substituto de um resíduo de aminoácido diferente que tem propriedades químicas diferentes. As substituições não-conservativas incluem, mas não são limitadas a ácido aspártico (D) sendo substituído com glicina (G); asparagina (N) sendo substituída com lisina (K); ou alanina (A) sendo substituída com arginina (R).

[0043] Os códigos de única letra para resíduos de aminoácidos incluem a seguir: A = alanina, R = arginina, N = asparagina, D = ácido aspártico, C = cisteína, Q = glutamina, E = ácido glutãmico, G = glicina, H = histidina, I = isoleucina, L = leucina, K = lisina, M = metionina, F = fenilalanina, P = prolina, S = serina, T = treonina, W = triptofano, Y = tirosina, V = valina.

[0044] Será apreciado que polipeptídeos frequentemente contêm aminoácidos outros que não os 20 aminoácidos comumente chamados dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, e que muitos aminoácidos, incluindo os aminoácidos terminais, podem ser modificados em um dado polipeptídeo, ou por processos naturais tais como glicosilação e outras modificações pós-traducionais, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Mesmo as modificações comuns que ocorrem naturalmente em polipeptídeos são demasiadamente numerosos para listar exaustivamente aqui, mas elas são bem descritas nos textos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma literatura de pesquisa volumosa, e elas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Entre as modificações conhecidas que podem estar presentes em polipeptídeos da presente invenção são, para nomear umas pouco ilustrativas, acetilação, acilação, ADP- ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção heme, ligação covalente de um derivado de polinucleotídeo ou polinucleotídeo, ligação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formulação, gama-carboxilação, glicação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos a proteínas tais como arginilação e ubiquitinação.

[0045] Tais modificações são bem conhecidas por aqueles versados e foram descritas em mais detalhes na literatura científica. Várias modificações particularmente comuns, glicosilação, ligação de lipídio, sulfação, gama-carboxilação de resíduos de ácidos glutâmicos, hidroxilação e ADP-ribosilação, por exemplo, são descritos na maioria dos textos básicos, tais como, por exemplo, I. E. Creighton, Proteins- Structure and Molecular Properties, 2a ed. W. H. Freeman and Company, New York, 1993. Muitas revisões detalhadas estão disponíveis neste objeto, tais como, por exemplo, aquelas providas por Wold, F., em Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp.. 1-12, 1983; Seifter e outros, Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990 e Rattan e outros, Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992.

[0046] Será apreciado, como é bem conhecido e como observado acima, que polipeptídeos não estão sempre totalmente lineares. Por exemplo, polipeptídeos pode ser ramificados como um resultado de ubiquitinação, e eles podem ser circulares, com ou sem ramificação, em geral como um resultado de eventos pós-traducionais, incluindo eventos de processamento naturais e eventos realizados por manipulação humana que não ocorrem naturalmente. Polipeptídeos circulares ramificados e ramificados, circulares podem ser sintetizados por processo naturais não-tradicionais e também por métodos totalmente sintéticos.

[0047] Modificações podem ocorrer em qualquer lugar em um polipeptídeo, incluindo a cadeia principal de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e os terminais amino ou carboxila. De fato, bloqueio do grupo amino ou carboxila em um polipeptídeo, ou ambos, por uma modificação covalente, é comum em polipeptídeos sintéticos e de ocorrência natural e também tais modificações podem estar presentes em polipeptídeos da presente invenção. Por exemplo, o resíduo amino terminal de polipeptídeos produzidos em E. coli, antes do processamento proteolítico, quase invariavelmente será N- formilmetionina.

[0048] As modificações que ocorrem em um polipeptídeo frequentemente será uma função de como ele é produzido. Para polipeptídeos produzidos por expressão de um gene clonado em um hospedeiro, por exemplo, a natureza e a extensão das modificações em grande parte serão determinadas pela capacidade de modificação pós- traducional de célula hospedeira e os sinais de modificação presentes na sequência de aminoácidos de polipeptídeo. Por exemplo, como é bem conhecida, glicosilação frequentemente ocorre em hospedeiros bacterianos tais como E. coli. Correspondentemente, quando glicosilação é desejada, um polipeptídeo deve ser expresso em um hospedeiro de glicosilação, em geral uma célula eucariótica. Células de inseto frequentemente realizam as mesmas glicosilações pós- traducionais que células de mamífero, por esta razão, sistemas de expressão de célula de inseto foram desenvolvidos para eficazmente expressar proteínas de mamífero tendo padrões nativos de glicosilação, inter alia. Considerações similares se aplicam a outras modificações.

[0049] Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou grau variável em vários sítios em um dado polipeptídeo. Também, um dado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações.

[0050] Como usado aqui, os seguintes termos usados para descrever as relações de sequência entre duas ou mais sequências de aminoácidos ou de polinucleotídeos: "sequência de referência", "janela de comparação", "identidade de sequência", "percentagem de identidade de sequência", "identidade substancial", "similaridade" e "homólogo". Uma "sequência de referência" é uma sequência definida usada como uma base para uma comparação de sequência; uma sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior, por exemplo, como um segmento de um cDNA de comprimento total ou sequência de gene dada em uma listagem de sequência ou pode compreender um cDNA completo ou sequência de genes. Em geral, uma sequência de referência é pelo menos 18 nucleotídeos ou 6 aminoácidos de comprimento, frequentemente pelo menos 24 nucleotídeos ou 8 aminoácidos de comprimento, e frequentemente pelo menos 48 nucleotídeos ou 16 aminoácidos de comprimento. Uma vez que duas sequências de polinucleotídeos ou de aminoácidos podem, cada uma (1) compreender uma sequência (isto é, uma porção de sequência de polinucleotídeos ou de aminoácidos completa) que é similar entre duas moléculas, e (2) pode ulteriormente compreender uma sequência que é divergente entre duas sequências de polinucleotídeos ou de aminoácidos, comparações de sequências entre duas (ou mais) moléculas são tipicamente realizadas por comparação de sequências das duas moléculas sobre uma "janela de comparação" para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", como usada aqui, refere-se a um segmento conceituai de pelo menos 18 posições de nucleotídeos contíguas ou 6 aminoácidos em que uma sequência de polinucleotídeo ou sequência de aminoácidos pode ser comparada com uma sequência de referência de pelo menos 18 sequências de nucleotídeos contíguos ou 6 sequências de aminoácidos e em que a porção da sequência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições, deleções, substituições e semelhantes (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. Ótimo alinhamento de sequências para alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoríitmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa para método de similaridade de Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988), por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA na Wiscosin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis), VectorNTI da Informatix, Geneworks, ou MacVector Software Packages), ou por inspeção, e o melhor alinhamento (isto é, resultando na percentagem mais alta de homologia sobre a janela de comparação) gerado pelos vários métodos é selecionado.

[0051] Como usado aqui, o termo "identidade de sequência" significa que duas sequências de polinucleotídeos ou de aminoácidos são idênticas (isto é, em uma base de nucleotídeo por nucleotídeo ou resíduo por resíduo) sobre a comparação de janela. O termo "percentagem de identidade de sequência" é calculada por comparação de duas sequências otimamente alinhadas durante a janela de comparação, determinação do número de posições em que a base de ácido nucléico idêntica (por exemplo, A, T, C, G, U ou I) ou resíduo ocorre em ambas as sequências para fornecer o número de posições emparelhadas, divisão do número de posições emparelhadas pelo número total de posições na janela de comparação (isto é, o tamanho de janela), e multiplicação do resultado por 100 para fornecer a percentagem de identidade de sequência. O termo "identidade substancial" como usado aqui significa uma característica de uma sequência de polinucleotídeo ou de aminoácidos, em que o polinucleotídeo ou aminoácido compreende uma sequência que tem pelo menos 85 por cento de identidade, de preferência pelo menos 90 a 95 por cento de identidade de sequência, mais usualmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência quando comparado com uma sequência de referência sobre uma janela de comparação de pelo menos 18 posições de nucleotídeo (6 aminoácidos), frequentemente sobre uma janela de pelo menos 24-48 posições de nucleotídeo (8-16 aminoácidos), em que a percentagem de identidade de sequência é calculada por comparação da sequência de referência com a sequência que pode incluir deleções ou adições que 20 por cento total ou menos da sequência de referência sobre a janela de comparação. A sequência de referência pode ser um subconjunto de uma sequência maior. O termo "similaridade", quando usado para descrever um polipeptídeo, é determinado por comparação da sequência de aminoácidos e os substitutos de aminoácidos conservados de um polipeptídeo com a sequência de um segundo polipeptídeo. O termo "homólogo", quando usado para descrever um polinucleotídeo, indica que dois polinucleotídeos, ou suas sequências designadas, quando otimamente alinhadas e comparadas, eram idênticas, com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos 70% dos nucleotídeos, usualmente de cerca de 75% a 99%, e mais de preferência pelo menos cerca de 98 a 99% dos nucleotídeos.

[0052] Como usado aqui, "homólogo", quando usado para descrever um polinucleotídeo, indica que dois polinucleotídeos, ou suas sequências projetadas, quando otimamente alinhados e comparados, são idênticos, com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos 70% dos nucleotídeos, usualmente de cerca de 75% a 99%, e mais de preferência pelo menos cerca de 98% a 99% dos nucleotídeos.

[0053] Como usado aqui, "reação de cadeia de polimerase" ou "PCR"refere-se a um procedimento em que pedaços específicos de DNA são ampliados como descritos na patente U.S. n° 4.683.195. Em geral, informação de sequência das extremidades do fragmento de polipeptídeo de interesse ou além das necessidades a serem disponíveis, tais que iniciadores de oligonucleotídeo podem ser projetados; estes iniciadores mostrarão ponto um em relação ao grupo, e serão idênticos ou similares em sequência a fios opostos do modelo a ser ampliado. Os nucleotídeos 5’ terminais dos dois iniciadores coincidirão com as extremidades do material ampliado. PCR pode ser usado para ampliar sequências de DNA específicas a partir de DNA genômico total, cDNA transcrito de RNA celular total, sequências de plasmídeos, etc (ver em geral Mullis e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

[0054] Como usado aqui, "estringência" tipicamente ocorre em uma faixa de cerca de Tm (temperatura de fusão) -5°C (5°C abaixo da Tm da sonda) a cerca de 20°C até 25°C abaixo de Tm. Como será entendido por aqueles versados na técnica, uma hibridização estringente pode ser usada para identificar ou detectar sequências de polinucleotídeos idênticas ou para identificar ou detectar sequências de polinucleotídeos relacionadas ou similares. Como usado aqui, o termo "condições estringentes" significa que hibridização ocorrerá apenas se houver pelo menos 95% e de preferência pelo menos 97% de identidade entre as sequências.

[0055] Como usado aqui, "hibridização" como usado aqui, incluirá, "qualquer processo pelo qual uma fita de polinucleotídeo une com uma fita complementar através de emparelhamento de bases"(Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994).

[0056] Como usado aqui, o termo "dose terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" refere-se àquela quantidade de adenovirus que melhora os sintomas ou condições de uma doença. Uma dose é considerada uma dose terapeuticamente eficaz no tratamento de câncer ou a metástase quando crescimento metastático ou de tumor é diminuído ou é parado, ou o tumor ou metástase demonstrou reduzir no tamanho, de modo a levar uma extensão no intervalo de vida para o indivíduo.

Adenovirus da Invenção

[0057] A presente invenção provê adenovirus quiméricos, ou variantes ou derivados dos mesmos, tendo um genoma em que a sequência de nucleotídeos da região E2B do adenovirus quimérico compreende sequências de ácidos nucléicos derivadas de pelo menos dois sorotipos adenovirais, sorotipos esses que são cada um selecionados do subgrupos adenovirais B, C, D, e F e são distintos entre si. Um adenovirus quimérico da invenção é oncolítico e demonstra um índice terapêutico aumentado para uma célula de tumor.

Isolamento de Adenovirus Quimérico

[0058] Os adenovirus quiméricos da invenção, ou variantes ou derivados dos mesmos, podem ser produzidos usando-se a modificação de uma técnica chamada de "biosseleção", em que um adenovirus com propriedades desejadas, tal como oncogenicidade aumentada ou especificidade de tipo de célula, é gerado através do uso de seleção genética sob condições controladas (Yan e outros (2003) J. Virol. 77:2640-2650).

[0059] Na presente invenção, uma mistura de adenovirus de sorotipos diferentes é combinada e é passada, de preferência pelo menos duas vezes, em uma cultura subconfluente de células de tumor a uma razão de partícula por célula alta suficiente para estimular recombinação entre sorotipos, mas não assim tão alta que para produzir morte de célula prematura. Uma razão de partícula por célula preferida é cerca de 500 partículas por célula, e é facilmente determinada por aquele versado na técnica. Como usado aqui, uma "cultura subconfluente" de células refere-se a uma cultura de suspensão ou monocamada em que as células estão ativamente se desenvolvendo. Para células se desenvolverem como uma monocamada, um exemplo seria uma cultura onde cerca de 50% a 80% da área disponível para o crescimento de célula é coberta com células. Preferido é uma cultura onde cerca de 75% da área de crescimento é coberta com células.

[0060] Em uma concretização preferida, a mistura adenoviral é uma que inclui sorotipos adenovirais representativos dos subgrupos adenovirais B, C, D e F. Adenovirus do grupo A não estão incluídos na mistura como eles estão associados à formação de tumor em roedores. Linhagem celular de tumor preferidas úteis no processo de biosseleção incluem, mas não limitadas àquelas derivadas de mama, cólon, pâncreas, pulmão e próstata. Alguns exemplos de linhagem celular de tumor sólido úteis para a passagem "biosseletiva" da mistura adenoviral incluem, mas não são limitados a, células de MDA231, HT29, PAN-1 e PC-3. Linhagem celular hemopoiéticas incluem, mas não são limitadas às células B-linfóides de Raji e Daudi, células eritroblastóides de K562, células mielóides de U937, e células T-linfóides de HSB2.

[0061] Adenovirus produzidos durante estas passagens iniciais são usados para infectar células de tumor quiescentes a uma razão de partícula para célula baixa suficiente para permitir a infecção de uma célula por não mais do que um adenovirus. Depois de até 20 passagens sob estas condições, o sobrenadante oriundo da última passagem é coletado antes do efeito citopático visível (CPE, ver Fields Virology, vol 2, 4a ed., Knipe, ea., Lippincont Williams &Wilkins, pp 135-136) para aumentar seleção de vírus altamente potentes. O sobrenadante coletado pode ser concentrado por técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Um método preferido para alcançar células quiescentes, isto é, aquelas em que crescimento de célula ativa parou, em uma cultura de monocamada é para permitir que a cultura se desenvolva por 3 dias após confluência, onde confluência significa que a área total disponível para crescimento de célula é ocupada (coberta por células). Similarmente, culturas de suspensão podem ser desenvolvidas para densidades caracterizadas pela ausência de crescimento de célula ativa.

[0062] O perfil de sorotipo do sobrenadante concentrado, que contém a combinação adenoviral selecionada, pode ser examinado por medição dos tempos de retenção da combinação virai coletada em uma coluna de troca de ânions, onde sorotipos adenovirais diferentes são conhecidos como tendo tempos de retenção característicos (Blanche e outros (2000) Gene Therapy 7:1055-1062); vero exemplo 3, figuras 1A e B. Adenovirus da invenção podem ser isolados do sobrenadante concentrado por diluição e purificação de placa, ou outras técnicas bem conhecidas na técnica, e desenvolvidos para outra caracterização. Técnicas bem conhecidas na técnica são usadas para determinar a sequência dos adenovirus quiméricos isolados (ver o exemplo 5).

[0063] Um exemplo de um adenovirus quimérico da invenção é o adenovirus quimérico ColoAdl que foi isolado usando-se células de cólon de HT29 no processo de biosseleção. ColoAdl tem uma sequência de ácidos nucléicos de SEQ. ID NO: 1. A maioria da sequência de nucleotídeos de ColoAdl é idêntica à sequência de nucleotídeos do sorotipo de Ad11 (SEQ. ID NO: 2) (Stone e outros (2003) Virology 309:152-165; Mei e outros (2003) J. Gen. Virology 84:2061-2071). Há duas deleções na sequência de nucleotídeos de ColoAdl quando comparada com Ad11, uma de 2444 pares de bases de comprimento dentro da região de unidade de transcrição de E3 no genoma (pares de base de 27979 a 30423 de SEQ. ID NO: 2) e uma segunda deleção menor, 25 pares de bases de comprimento (pares de bases 33164 a 33189 de SEQ. ID NO: 2), dentro do gene de E4orf4. A região de unidade de transcrição de E2B (SEQ. ID NO: 3) de ColoAdl, que codifica a polimerase de DNA de proteínas adenovirais e proteína terminal, está localizada entre pares de bases 5067 e 10354 de SEQ. ID NO: 1, e é uma área de recombinação homóloga entre os sorotipos de Ad11 e Ad3. Dentro desta região de ColoAdl, há mudanças em 198 pares de bases, quando comparadas com a sequência de Ad11 (SEQ. ID NO: 1). As mudanças resultam em estiramentos de nucleotídeos dentro da região E2B de ColoAdl que são homólogas à sequência dentro de uma porção da região E2B de Ad3 (SEQ. ID NO: 8), com o estiramento mais longo de homologia entre ColoAdl e Ad3 tendo 414 pb de comprimento. A região E2B de ColoAdl (SEQ. ID NO: 3) confere potência aumentada ao adenovirus de ColoAdl quando comparada com adenovirus de Ad11 não modificado (ver o exemplo 6; figura 7). Em outras concretizações, um adenovirus quimérico da invenção pode compreender sequência de ácidos nucléicos de mais do que dois sorotipos adenovirais.

[0064] Um adenovirus quimérico da invenção, ou variante ou derivado do mesmo, pode ser avaliado quanto à sua seletividade em um tipo de tumor específico por exame de seu potencial lítico em um painel de células de tumor derivadas do mesmo tecido em que a combinação adenoviral foi inicialmente passada. Por exemplo, o adenovirus quimérico ColoAdl (SEQ. ID NO: 1), que foi inicialmente derivado de uma combinação adenoviral passada nas linhagem celular de tumor de HT-29, foi reexaminado tanto em células de HT-29 quanto em um painel de outras linhagem celular de tumor derivadas de cólon, incluindo DLD- 1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48, e Colo320DM (ver a figura 3B). Quaisquer linhagem celular de tumor de cólon disponíveis seriam igualmente úteis para tal avaliação. Clones adenovirais isolados de combinações adenovirais selecionadas em outros tipos de células de tumor podem similarmente ser testados em um painel de célula de tumor adequado, incluindo, mas não são limitados a, linhagem celular de próstata (por exemplo, linhagem celular de DU145 e PC-3); linhagem celular pancreáticas (por exemplo, a linha de célula de Panc-1); linhagem celular de tumor de mama (por exemplo, a linha de célula MDA231) e linhagem celular ovarianas (por exemplo, a linha de célula de OVCAR-3). Outras linhagem celular de tumor disponíveis são igualmente úteis no isolamento e na identificação de adenovirus da invenção.

[0065] Os adenovirus quiméricos da invenção têm um índice terapêutico aumentado quando comparado com os sorotipos adenovirais a partir dos quais ele é derivado, (ver a figura 6, que compara a atividade citolítica do adenovirus quimérico ColoAdl com Ad11p).

[0066] A invenção também inclui adenovirus quiméricos que são construídos usando-se técnicas recombinantes bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais adenovirus quiméricos compreendem uma região de sequência de nucleotídeos derivada de um sorotipo adenoviral que é incorporado por técnicas recombinantes no genoma de um segundo sorotipo adenoviral. A sequência incorporada confere uma propriedade, por exemplo, especificidade de tumor ou potência aumentada, ao sorotipo adenoviral de origem. Por exemplo, a região E2B de ColoAdl (SEQ. ID NO: 3) pode ser incorporada no genoma de Ad35 ou Ad9.

Derivados Adenovirais

[0067] A invenção também inclui um adenovirus quimérico da invenção que é modificado para prover outros adenovirus quiméricos terapeuticamente úteis. Modificações incluem, mas não são limitadas àquelas descritas abaixo.

[0068] Uma modificação é a produção de derivados do adenovirus quimérico da invenção substancialmente que carecem da capacidade de ligar p53, como um resultado de uma mutação no gene adenoviral que codifica a proteína de E1B-55K. Tais vírus em geral têm alguma, ou a totalidade, da região de E1B-55K deletada. (ver a patente U.S. n° 5.677.178). A patente U.S. n° 6.080.578 descreve, entre outras coisas, mutantes de Ad5 que têm deleções na região da proteína de E1B-55K que é responsável pela ligação de p53. Uma outra modificação preferida no adenovirus quimérico da presente invenção são mutações na região de E1A, como descritos nas patentes U.S. nos. 5.801.029 e 5.972.706. Estes tipos de modificações provêm derivados dos adenovirus quiméricos da invenção com seletividade maior para células de tumor.

[0069] Um outro exemplo de uma modificação incluída pela invenção é um adenovirus quimérico que exibe um grau aumentado de especificidade de tecido devido à colocação de replicação virai sob o controle de um promotor específico de tecido como descrito na patente U.S. n° 5.998.205. Replicação de um adenovirus quimérico da invenção pode também ser posta sob o controle de um elemento responsável de E2F como descrito no pedido de patente U.S. n° 09/714.409. Esta modificação fornece um mecanismo de controle de replicação viral com base na presença de E2F, que resulta em especificidade de tecido de tumor aumentado, e é distinto do controle realizado por um promotor específico de tecido. Em ambas destas concretizações, o promotor específico de tumor e o elemento responsável de E2F são operavelmente ligados a um gene adenoviral que é essencial para a replicação do adenovirus.

[0070] Uma outra modificação incluída pela invenção é o uso de adenovirus quimérico da invenção, por exemplo, ColoAdl, como a cadeia principal para a produção de novos vetores adenovirais deficientes de replicação. Como descrito em Lai e outros ((2002) DNA Cell Bio. 21:895-913), vetores adenovirais que são deficientes de replicação podem ser usados para fornecer e expressar genes terapêuticos. Tanto vetores adenovirais de primeira geração (em que as regiões de E1 e de E3 são deletadas) quanto segunda geração (em que a região de E4 é adicionalmente deletada) de derivados dos adenovirus quiméricos da invenção são providos aqui. Tais vetores são facilmente produzidos usando-se técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica (ver Imperiale and Kochanek (2004) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 273:335-357; Vogeis e outros (2003) J. Virol. 77:8263-8271).

[0071] Uma outra modificação incluída pela invenção é a inserção de um gene heterólogo, útil como marcador ou repórter para o rastreamento da eficácia da infecção virai. Uma concretização deste tipo de modificação é inserção do gene de timidina cinase (TK). A expressão de TK dentro de células infectadas pode ser usada para rastrear o nível de vírus que permanece em células após a infecção virai, usando-se substratos radiomarcados da reação de TK (Sangro e outros (2002) Mol. Imaging Biol. 4:27-33).

[0072] Métodos para a construção do adenovirus quiméricos modificados são em geral conhecidos na técnica. Ver, Mittal, S. K. (1993) Virus Res. 28:67-90 and Hermiston, T. e outros(1999) Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. World, ed, Humana Press. Técnicas-padrão são usadas para métodos de ácido nucléico recombinante, síntese de polinucleotídeo, e cultura e transformação microbiana (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Em geral, reações enzimáticas e etapas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e os procedimentos em geral são realizados de acordo com os métodos convencionais na técnica em várias referências gerais (ver, em geral, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que são providos através de todo este documento. A nomeclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório em química analítica, química orgânica sintética e formulação farmacêutica descritos abaixo são aqueles conhecidos e comumente empregados na técnica.

Determinação de Potencial Terapêutico

[0073] Adenovirus quiméricos da invenção, ou variantes ou derivados dos mesmos podem ser avaliados quanto à sua utilidade terapêutica por exame de seu potencial lítico em células de tumor derivadas de tecidos de interesse como alvos terapêuticos. Linhagem celular de tumor para testagem de tais adenovirus incluem, mas não são limitadas a, linhagem celular de cólon, incluindo mas não limitadas a, linhas de célula de DLD-1, de HCT116, de HT29, LS1034 e de SW48; linhagem celular de próstata, incluindo mas não limitadas a, linhagem celular de DU145 e de PC-3; linhagem celular pancreáticas, incluindo mas não limitadas a, a linha de célula de Panc-1; linhagem celular de tumor de mama, incluindo mas não limitadas a, a linha de célula de MDA231 e linhagem celular ovarianas, incluindo mas não limitadas a, a linha de célula de OVCAR-3. Linhagem celular hemopoiéticas incluem, mas não são limitadas às células B-linfóides de Daudi e Raji, células eritoblastóides de K562, células mielóides de U937, células T-linfóides de HSB2. Quaisquer outras linhagem celular de tumor que estão disponíveis podem ser usados na avaliação e identificação de adenovirus da invenção para o uso no tratamento de neoplasia.

[0074] A atividade citolítica de adenovirus da invenção pode ser determinada em linhagem celular de tumor representativas e os dados convertidos em uma medida de potência, com um adenovirus que pertence a subgrupo C, de preferência Ad5, sendo usado como um padrão (isto é, dada uma potência de 1). Um método preferido para determinação da atividade citolítica é um ensaio de MTS (ver o exemplo 4, figura 2).

[0075] O índice terapêutico de um adenovirus da invenção em uma linha de célula particular pode ser calculado por comparação da potência do dado adenovirus em uma linha de potência com a potência daquele mesmo adenovirus em uma linha de célula não-cancerosa. Linhagem celular não-cancerosas preferidas são células de SAEC que são de origem epitelial e células de HUVEC que são de origem endotelial (ver a figura 4). Estes dois tipos de células representam células normais a partir das quais órgãos e vasculatura, respectivamente, são derivados, e são representados de sítios prováveis de toxicidade durante a terapia adenoviral, dependendo do modo de fornecimento do adenovirus. No entanto, a prática da invenção não é limitada ao uso destas células, e outras linhagem celular não- cancerosas (por exemplo, células B, células T, macrófagos, monócitos, fibroblastos) podem ser usadas.

[0076] Os adenovirus quiméricos da invenção podem ulteriormente ser avaliados quanto a sua capacidade de direcionar crescimento de célula neoplásica (isto é, câncer) por sua capacidade de reduzir carga de célula neoplásica ou tumorigênese em camundongos nus que abrigam um transplante de célula neoplásicas, quando comparados com camundongos não tratados que abrigam uma carga de células neoplásica equivalente (ver o exemplo 7).

[0077] Avaliação dos adenovirus da invenção podem também ser realizados usando-se explantes de tumores humanos primários (Lam e outros(2003) Cancer Gene Therapy; Grill e outros(2003) Mol. Therapy 6:609-614), que provê em condições de teste presentes em tumores que não podem normalmente ser produzidos usando-se os estudos de xenoenxerto de tumor.

Utilidade Terapêutica

[0078] A presente invenção provê para o uso de adenovirus quiméricos da invenção para a inibição de crescimento de célula de tumor bem como para o uso de vetores adenovirais derivados destes adenovirus quiméricos para fornecer proteínas terapêuticas úteis no tratamento de neoplasia e outros estados de doença.

Composições Farmacêuticas e Administração

[0079] A presente invenção também refere-se a composições farmacêuticas que compreendem os adenovirus quiméricos da invenção, incluindo variantes e derivados dos mesmos, formulados para a administração terapêutica a um paciente. Para o uso terapêutico, uma composição estéril contendo uma dosagem farmacologicamente eficaz de adenovirus é administrada a um paciente humano ou paciente não- humano veterinário para o tratamento, por exemplo, de uma condição neoplásica. Em geral, a composição compreenderá cerca de 1011 ou mais partículas de adenovirus em uma suspensão aquosa. Um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável é frequentemente empregado em tais composições estéreis. Uma variedade de soluções aquosas podem ser usadas, por exemplo, água, água tamponada, 0,4% de solução salina, 0,3% de glicina e similares. Estas soluções são estéreis e em geral livres de matéria outra que não o vetor adenoviral desejado. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis quando exigidas para aproximar condições fisiológicas tais como ajuste de pH e agentes de tamponamento, agentes de ajuste de toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, etc. Excipientes que aumentam infecção em células por adenovirus podem ser incluídos, (ver a patente U.S. n° 6.392.069).

[0080] Adenovirus da invenção podem também ser fornecidos a células neoplásicas por fornecimento de lipossoma ou de imunolipossoma; tal fornecimento pode ser seletivamente direcionado a células neoplásicas com base em uma propriedade de superfície de célula sobre a população de célula neoplásica (por exemplo, a presença de uma proteína de superfície de célula que liga uma imunoglobulina em um imunolipossoma). Tipicamente, uma suspensão aquosa contendo os virions é encapsulada em lipossomas ou imunolipossomas. Por exemplo, uma suspensão de virions de adenovirus pode ser encapsulada em micelas para formar imunolipossomas por métodos convencionais (a patente U.S. N° 5.043.164. a patente U.S. N° 4.957.735; a patente U.S. N° 4.925.661; Connor e Huang, (1985) J. Cell Biol. 101: 581; Lasic D.D. (1992) Nature 355: 279; Novel Drug Delivery (eds. Prescott and Nimmo, Wiley, New York-, 1989); Reddy e outros(1992) J. Immunol. 148:1585). Immunolipossomas compreendendo um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno de célula de câncer (por exemplo, CALLA, CEA) presente nas células de câncer do indivíduo podem ser usados para direcionar virions para aquelas células (Fisher (2001) Gene Therapy 8:341-348).

[0081] Para ulteriormente aumentar a eficácia dos adenovirus da invenção, eles podem ser modificados para exibir tropismo aumentado para tipos de células de tumor particular. Por exemplo, como mostrado na PCT/US98/04964, uma proteína sobre o revestimento exterior de um adenovirus pode ser modificada para exibir um agente químico, de preferência um polipeptídeo, que se liga a um receptor presente nas células de tumor a um grau maior do que células normais (ver, também as patentes U.S. n° 5.770.442 e 5.712.136). O polipeptídeo pode serum anticorpo, e de preferência é um anticorpo de cadeia simples.

Terapia Adenoviral

[0082] Os adenovirus da invenção ou composições farmacêuticas dos mesmos, podem ser administrados para tratamento terapêutico de câncer ou doença neoplásica. Em aplicações terapêuticas, composições são administradas a um paciente já afetado pela doença neoplásica particular, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente controlar a condição e suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz" ou "dose eficaz". Quantidades eficazes para este uso dependerá da severidade da condição, do estado geral do paciente e da rota de administração.

[0083] Por exemplo, mas não a título de limitação, um paciente humano ou um mamífero não-humano tendo uma doença neoplásica hematológica ou sólida (por exemplo, carcinoma pancreático, de cólon, ovariano ou de mama, leucemia ou mieloma múltiplo) pode ser tratado por administração de uma dosagem terapeuticamente eficaz de um adenovirus apropriado da invenção, isto é, um que demonstrou ter um índice terapêutico para aquele tipo de tecido. Por exemplo, um adenovirus quimérico preferido para o tratamento de câncer de cólon seria o adenovirus ColoAdl (SEQ. ID NO: 1). Suspensões de partículas de adenovirus infecciosas podem ser fornecidas a tecido neoplásico por várias rotas, incluindo intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica e tópica. Uma suspensão de adenovirus contendo cerca de 103 a 1012 ou mais partículas vírion por mol pode ser administrada por infusão (por exemplo, para dentro da cavidade peritoneal para o tratamento de câncer ovariano, para dentro da veia porta para o tratamento de hepatocarcinoma ou metástase de fígado a partir de outros tumores primários não-hepáticos) ou outra rota adequada, incluindo injeção direta para dentro uma massa de tumor (por exemplo, um tumor de mama), enema (por exemplo, câncer de cólon), ou cateter (por exemplo, câncer de bexiga). Outras rotas de administração podem ser adequadas para carcinomas de outras origens, isto é, inalação como uma névoa (por exemplo, para fornecimento pulmonar para tratar carcinoma broncogênico, carcinoma de pulmão de célula pequena, carcinoma de pulmão de célula não-pequena, adenocarcinoma de pulmão ou câncer de laringe) ou aplicação direta a um sítio de tumor (por exemplo, carcinoma broncogênico, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de laringe, ou carcinoma cervical).

[0084] Terapia de adenovirus usando-se os adenovirus da presente invenção pode ser combinada com outros protocolos antineoplásicos, tal como quimioterapia convencional ou terapia de raios X para tratar um câncer particular. Tratamento pode ser concorrente ou sequencial. Um agente de quimioterapia preferido é cisplatina, e a dose preferida pode ser escolhida pelo médico com base na natureza do câncer a ser tratado, e em outros fatores rotineiramente considerados na administração de cisplatina. De preferência, cisplatina será administrada intravenosamente a uma dose de 50-120 mg/m2 durante 3-6 horas. Mais de preferência ela é administrada intravenosamente a uma dose de 80 mg/m2 durante 4 horas. Um segundo agente quimioterapêutico preferido é 5-fluorouracila, que é frequentemente administrado em combinação com cisplatina. A dose preferida de 5- fluorouracila é de 800-1200 mg/m2 por dia por 5 dias consecutivos.

[0085] Terapia adenoviral usando-se os adenovirus da presente invenção com vetores adenovirais pode também ser combinada com outros genes conhecidos como sendo úteis na terapia à base de vírus. Ver a patente U.S. n° 5.648.478. Em tais casos, o adenovirus quimérico ulteriormente compreende um gene heterológo que codifica uma proteína terapêutica, incorporado dentro do genoma virai, tal que o gene heterólogo é expresso dentro de uma célula infectada. Uma proteína terapêutica, como usada aqui, refere-se a uma proteína que seria esperada prover algum benefício terapêutico quando expressa em uma dada célula.

[0086] Em uma concretização, o gene heterólogo é um gene ativador de pró-fármaco, tal como desaminase de cistosina (CD) (ver, as patentes U.S. nos. 5.631.236; 5.358.866; e 5.677.178). Em outras concretizações, o gene heterólogo é um indutor conhecido de morte de célula, por exemplo, apoptina ou proteína de morte adenoviral (ADP), ou uma proteína de fusão, por exemplo, glicoproteína de membrana fusogênica (Danen-Van Oorschot e outros(1997) Proc. Nat. Acad. Sei. 94:5843-5847; Tollefson e outros(1996) J. Virol. 70:2296-2306; Fu e outros(2003) Mol. Therapy 7: 48-754, 2003; Ahmed e outros(2003) Gene Therapy 10:1663-1671; Galanis e outros(2001) Human Gene Therapy 12(7): 811-821).

[0087] Outros exemplos de genes heterólogos, ou seus fragmentos heterológos, incluem aqueles que codificam proteínas imunomoduladoras, tais como citocinas ou quimiocinas. Exemplos incluem interleucina 2, patente U.S. Nos. 4.738.927 ou 5.641.665; interleucina 7, as patentes U.S. nos. 4.965.195 ou 5.328.988; e interleucina 12, a patentes U.S. no. 5.457.038; fator alfa de necrose de tumor, as patentes U.S. n° 4.677.063 ou 5.773.582; interferon gama, as patentes U.S. N° 4.727.138 ou 4.762.791; ou GM CSF, patente U.S. N° 5.393.870 ou 5.391.485, Mackensen e outros(1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8:119-128). Proteínas imunomoduladoras adicionais ulteriormente incluem proteínas inflamatórias de macrófago, incluindo MIP- 3. Proteína quimiotática de monócito (MCP-3 alfa) pode ser usada; uma concretização preferida de um gene heterólogo é um gene quimérico que consiste em um gene que codifica uma proteína que atravessa membranas celulares, por exemplo, VP22 ou TAT, fundidas a um gene que codifica uma proteína que é de preferência tóxica a câncer mas não a células normais.

[0088] Os adenovirus quiméricos da invenção podem também ser usados como vetores para fornecer genes que codificam moléculas de RNA terapeuticamente úteis, isto é, siRNA (Dorsett and Tuschl (2004) Nature Rev Drug Disc 3:318-329).

[0089] Em alguns casos, genes podem ser incorporados em um adenovirus quimérico da invenção para ulteriormente aumentar a capacidade do vírus oncolítico para erradicar o tumor, embora não tendo qualquer impacto direto no próprio tumor - estes incluem genes que codificam proteínas que comprometem apresentação de classe I de MHC (Hewitt e outros(2003) Immunology 110: 163-169), complemento por blocos, mecanismos induzidos por IFNs e IFN, quimiocinas e citocinas, morte baseada em célula de NK (Orange e outros, (2002) Nature Immunol. 3: 1006-1012; Mireille e outros(2002) Immunogenetics 54: 527-542; Alcami (2003) Nature Rev. Immunol. 3: 36-50; regulam para baixo a resposta imune (por exemplo, IL-10, TGF- Beta, Khong e Restifo (2002) Nature Immunol. 3: 999-1005; 2002) e metaloproteases que podem romper a matriz extracelular e aumentar e aumentam espalhamento do vírus dentro do tumor (Bosman e Stamenkovic (2003) J. Pathol. 2000: 423-428; Visse and Nagase (2003) Circulation Res. 92: 827-839).

Kits

[0090] A invenção ulteriormente refere-se a kits e a embalagens farmacêuticas compreendendo um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dos ingredientes das composições acima mencionadas da invenção. Associado(s) a tal(is) recipiente(s) pode(m) ter uma informação na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, o uso ou a venda de produtos biológicos ou farmacêuticos, que refletem a aprovação pela agência da fabricação, do uso ou da venda do produto para a administração humana.

[0091] A presente invenção é ulteriormente descrita pelos seguintes exemplos, que são ilustrativos das concretizações específicas da invenção, e seus vários usos. Estas exemplificações, que ilustram certos aspectos específicos da invenção, não retratam as limitações ou não delimitam o escopo da invenção descrita.

[0092] A não ser que de outra maneira indicada, a prática da presente invenção emprega técnicas convencionais de cultura de célula, biologia molecular, microbiologia, manipulação de DNA recombinante, ciência de imunologia, que estão dentro da habilidade da técnica. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Ver, por exemplo, Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Celis (Ed).Academic Press. N.Y. (1996); Graham, F.L. and Prevec, L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. In: Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed) Butterworth, p.p. 363-390; Grahan and Prevec Manipulation of adenovirus vectors. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray and J.M. Walker (eds) Humana Press Inc., Clifton, N.J. pp 109-128, 1991; Sambrook e outros(1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2aed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook e outros(1989), and Ausubel e outros(1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

Exemplos Métodos

[0093] Técnicas-padrão são usadas para métodos de ácidos nucléicos recombinantes, síntese de polinucleotídeo, e transformação e cultura microbiana (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Em geral, etapas de purificação e reações enzimáticas são realizadas de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e os procedimentos são em geral realizados de acordo com os métodos convencionais na técnica e várias referências gerais (ver em geral, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) que são providas através de todo este documento. A nomenclatura usada aqui e os procedimentos de laboratório em química analítica, química sintética orgânica, e fornecimento e formulação farmacêutica, e tratamento de pacientes. Métodos para a construção de mutantes adenovirais são em geral conhecidos na técnica. Ver, Mittal, S. K., Virus Res.,1993, vol: 28, p.p. 67-90; e Hermiston, T. e outros, Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods e Protocols, W.S.M. Wold, ed, Humana Press, 1999. Além disso, o genoma adenovirus 5 é registrado como Genbank 10 no. de acesso M73260, e o vírus está disponível a partir da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, II. S. A., sob o número de acesso VR-5.

Vírus e Linhagem celular

[0094] Os sorotipos Ad Ad3 (cepa de GB), Ad4 (cepa de RI-67), Ad5 (cepa Adenoid 75), Ad9 (cepa de Hicks), Ad11p (cepa de Slobitski), Ad 16 (cepa de Ch. 79) e todas as linhagem celular, com a exceção de que os seguintes foram todos adquiridos do ATCC: MDA231-mt1 (urn derivado isolado por Dr. Deb Zajchowski de urn xenoenxerto implantado subcutâneo de desenvolvimento rápido de células de MDA231) e Panel-set (derivado por Dr. Sandra Biroc de urn xenoenxerto implantado subcutâneo de desenvolvimento rápido de células de Panel), HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, NY), e SAEC (Clonetics, Walkersville, MD). Ad40 era uma espécie de doação de Dr. William S.M. World at St. Louis University.

Exemplo 1 - Quantificação e purificação viral

[0095] Estoques virais foram propagados sobre 293 células e foram purificados em gradientes de CsCI (Hawkins e outros, 2001). O método usado para quantificar partículas virais é baseado naquele de Shabram e outros(1997) Human Gene Therapy 8:453-465, com a exceção de que o trocador de ânions TMAE Fractogel foi usado ao invés de Resource Q. Em resumo, uma coluna de 1,25 ml foi embalada com Fractogel EMD TMAE-650 (S) (catálogo n° 116887-7 EM Science, Gibbstown, NJ 08027). Separação de HPLC foi realizada em um HPLC Angilent HP 1100 usando-se as seguintes condições: Tampão A = HEPES a 50 mM, pH 7,5; Tampão B = NaCI a 1,0 M em Tampão A; taxa de fluxo de 1 mL por minuto. Depois da equilibração da coluna por não menos do que 30 minutos em Tampão A, cerca de 109-1011 partículas virais de amostra foram carregadas sobre a coluna em 10-100 pL de volume, seguido por 4 volumes de coluna de Tampão A. Um gradiente linear que estende sobre 16 volumes de coluna e que finaliza em 100% de tampão B foi aplicado.

[0096] O efluente de coluna foi monitorado a A260 e A280 nm, áreas de pico foram calculadas, e a razão de 260 a280 nm determinada. Picos virais foram identificados como aqueles picos tendo uma razão de A260/A280 próxima a 1,33. Um padrão de vírus foi incluído com cada série de amostra. O número de partículas virais por ml do padrão tinha sido determinado usando-se o método de Lehmberg e outros(1999) J. Chrom. B, 732:411-423}. Na faixa de concentração virai usada, a área de pico de A260 nm de cada amostra é diretamente proporcional ao número de partículas virais na amostra. O número de partículas virais por ml em cada amostra de teste foi calculado por multiplicação do número conhecido de partículas virais por mL no padrão pela razão da área de pico viral de A260 nm da amostra para a área de pico virai de A260 nm viral do padrão.

[0097] A coluna foi regenerada depois que cada gradiente de amostra por lavagem com dois volumes de coluna de NaOH a 0,5 N seguido por dois volumes de coluna de 100% de tampão A, 3 volumes de coluna de 100% de tampão B, e então 4 volumes de coluna de 100% de tampão A.

Exemplo 2 - Biosseleção

[0098] Sorotipos virais que representam subgrupos Ads B-F foram combinados e foram passados sobre culturas subconfluentes das linhagem celular de tumor alvo a uma razão alta de partícula para célula para dois ciclos para provocar recombinação ocorrer entre sorotipos. Sobrenadante (1,0, 0,1 0,01, 0,001 ml) oriundo do segundo ciclo da infecção de partícula por célula virai alta, culturas subconfluentes, foi então usado para infectar uma série de frascos de cultura de tecido T- 75 ultraconfluentes de linhagem celular de tumor alvo PC-3, HT-29, Panc-1 e MDA-231. Para alcançar ultraconfluência, cada linha de célula foi semeada a razões de separação que deixaram que linha de célula alcance confluência entre 24 e 40 horas pós-semeadura, e as células foram deixadas que se desenvolva um total de 72 horas pós-semeadura antes da infecção. Isto é feito para maximizar a confluência das células para imitar condições de crescimento em tumores sólidos humanos.

[0099] Sobrenadante de cultura de célula foi coletada do primeiro frasco na série de diluição de 10 vezes que não mostrou qualquer sinal de CPE no dia 3 ou 4 pós-infecção (no caso de HT-29 e PC-3, isto foi modificado para passagens 10-20 para coletar do segundo frasco, isto é, coleta 100 vezes abaixo da diluição em que CPE foram detectáveis pelo dia 3 pós-infecção). Cada coleta serviu como o material de partida para a passagem sucessiva do vírus. Este processo foi repetido até que a combinação virai alcançasse 20 passagens biosseletivas.

[00100] Vírus individuais oriundos de cada combinação biosselecionada foram isolados por dois ciclos de purificação de placas em células de A549 usando-se métodos padrão (Tollefson, A., Hermiston, T.W., e Wold, W.S.M.; "Preparation and Titration of CsCI- banded Adenovirus Stock" in Adenovirus Methods and Protocols, Humana Press, 1999, pp 1-10, W.S.M. World, Ed). Em resumo, diluições do sobrenadante coletadas da vigésima passagem em cada linha de tumor alvo foram usadas para infectar células de A549 em um ensaio de placa padrão. Placas bem individualizadas foram coletadas, e o mesmo método de ensaio de placa foi usado para gerar um segundo ciclo de placas individuais a partir destas coletas. Placas bem isoladas do segundo ciclo de purificação de placa foram consideradas puras, culturas infectadas foram preparadas usando-se estas placas purificadas, e a potência oncolítica destes sobrenadantes de cultura determinada por ensaio de MTS como descrito.

Exemplo 3 - Caracterização do sorotipo

[00101] Os sorotipos adenovirais de origem compreendendo as combinações virais ou adenovirus de ColoAdl isolado foram identificados usando-se cromatografia de trocas de ânions similar àquela descrita em Shabram e outros(1997) Human Gene Therapy 8:453:465, com a exceção de que o meio TMAE Fractogel de trocador de ânions media (EM Industries, Gibbstown, NJ) foi usado ao invés de Resource Q, como descrito no Exemplo 1 (ver a figura 1).

[00102] Adenovirus tipo 5 eluído a cerca de 60% de tampão B durante o gradiente. Os outros sorotipos (3,4, 9, 11 p, 16, 35, e 40) cada um eluído a um tempo de retenção característico consistente com os tempos de retenção em Q Sepharose XL plubicado por Blanche e outros(2000) Gene Therapy 7:1055-1062.

Exemplo 4 - Ensaio citolítico

[00103] A capacidade lítica virai foi medida por uso de uma modificação do Ensaio de MTT (Shen e outros, 2001). Resumidamente, o Ensaio de MTS (Promega, CelITiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) foi usado no lugar do Ensaio de MTT uma vez que conversão de MTS por células em formazano solúvel, aquoso reduz tempo e elimina o uso de um solvente orgânico volátil associado ao Ensaio de MTT.

[00104] Para realizar o ensaio, células foram semeadas a uma densidade definida para cada linha de célula de tumor que gerou uma monocamada confluente no período de 24 h. Estas células densamente semeadas foram deixadas se desenvolver por 2 dias adicionais antes da exposição ao(s) vírus de teste. Infecções tanto de células normais primárias quanto de tumor foram realizadas em quadruplicata com diluições em série de três vezes dos vírus que partem a uma razão de partícula para célula de 0,005. Células infectadas foram incubadas a 37°C e o ensaio de MTS foi realizado nos pontos indicados para as células primárias individuais ou linhagem celular de tumor. Células infectadas por Mock serviram como controles negativos e estabeleceram o ponto de sobrevivência de 100% para o dado ensaio.

Exemplo 5 - Sequenciamento de DNA

[00105] Sequenciamento de DNA dos DNAs genômicos de Ad11p (SEQ ID NO: 2) e de ColoAdl (SEQ ID NO: 1) foi realizada como se segue. Resumidamente, DNA de adenovirus purificado oriundo de ColoAdl e Ad11p foi parcialmente digerido com a endonuclease de restrição Sau3A1 e "shotgun"clonado no vetor de plasmídeo pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA). Clones positivos foram propagados e foram sequenciados usando-se os iniciadores M13R e KS (Stratagene, La Jolla, CA). Reações de sequência individuais foram equilibradas, editadas e reunidas usando-se Sequencher® (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan). Lacunas na cobertura foram ampliadas com iniciadores de oligonucleotideo de costume e foram sequenciados. As extremidades dos genomas virais foram sequenciadas diretamente fora do DNA adenoviral. Na totalidade, cada genoma foi sequenciado à cobertura de 3X+ e 431 bases à cobertura de 2X.

[00106] Para determinar a origem da região de ColoAdl E2B, dois conjuntos de iniciador foram gerados, um para dar o gene de E2B pTP (bp 9115, 5’GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3’ (SEQ ID NO: 4) e pb 9350, 5’ GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3’ (SEQ ID NO: 5)) e um para dar o gene de polimerase de DNA (pb 7520 5’CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3’ (SEQ ID NO: 6) e pb 7982, 5’GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3’ (SEQ ID NO: 7) e usados para PCR isolar fragmentos de DNA dos vários sorotipos (Ad3, 4, 5,9, 11p, 16 e 40) usando-se reagentes do kit de PCR Advantage 2 (Clonetics, Walkersville, MD; Cat N° K1910-Y) e continuam em um termociclador PTC-200 da MJ Research (Watertown, MA). Estes fragmentos foram subsequentemente sequenciados com a sequência de DNA de Ad3 usando-se sequenciamento de terminador de corante em um analisador genético ABI 3100.

[00107] A região E2B de Ad3 foi sequenciada usando-se DNA de Ad3 isolado e iniciadores de sobreposição.

[00108] Informação de sequenciamento foi analisada usando-se o programa de Vector NTI (Informatix).

Exemplo 6 - Contrução de vírus recombinantes

[00109] DNAs genômicos de Ad11p (SEQ ID NO: 2) e de ColoAdl (SEQ ID NO: 1) foram purificados de partículas de vírus de tira de gradiente de CsCI. Os DNAs genômicos foram digeridos com Pad que corta cada um apenas uma vez dentro do genoma virai. O corte de Pad ocorre na base 18141 na sequência de nucleotídeos de ColoAdl (SEQ ID NO: 1) e na base 18140 na sequência de nucleotídeos de Ad11 (SEQ ID NO: 2). DNAs digeridos foram misturados em quantidades iguais e foram ligados na presença de ligase de DNA de T4 a 16°C de um dia para o outro. Esta mistura de ligação foi transfectada para dentro de células de A549 usando-se o kit de transfecção de CaPO4da Invitrogen, Carlsbad, CA (Cat N° K2780-01). Placas isoladas foram apanhadas e foram tríadas por digestão de enzima de restrição e análise de PCR para distinguir as quatro populações virais (Ad11p, ColoAdl. Ad11p de extremidade à esquerda/ColoAdl extremidade à direita (ColoAd1.1) e ColoAdl extremidade à esquerda/Ad11p de extremidade à direita (ColoAdl.2)).

[00110] A capacidade lítica virai de cada população foi determinada em várias linhagem celular, incluindo linhagem celular de HT29 e de HUVEC, como descrito no Exemplo 3. Os resultados demonstraram a ordem de potência, do menos potente até o mais potente, como Ad11 p, ColoAdl.2, ColoAdl.1, ColoAdl (ver a figura 7 para os resultados de células de HT29).

[00111] Também construídos foram adenovirus quiméricos pCJ144 e pCJ146, que contêm o genoma de ColoAdl de comprimento total em que a região de E3 e E4 de Ad11p de tipo selvagem, respectivamente, foi restaurado. Estas modificações foram introduzidas por recombinação homóloga em BJ5183 E. Coli (Chartier e outros (1996) J. Virol. 70:4805- 4810). Ambos estes adenovirus quiméricos demonstraram capacidade lítica reduzida em células de HT29 e de HUVEC em comparação com ColoAdl ou ColoAdl.2.

Exemplo 7 - Eficácio In Vivo de adenovirus

[00112] Em uma experiência de camundongo nu de xenoenxerto de tumor típico, animais foram injetados com 5 x 106 células subcutaneamente para dentro do flanco traseiro do camundongo. Quando os tumores alcançaram 100-200 pL de tamanho, eles são injetados com veículo (PBS) ou com vírus a 2 x 1010 partículas por cinco dias consecutivos (1 x 1011 partículas totais). Uma redução no tamanho do tumor seria observado em relação ao controle de PBS e vírus de controle adicionais (Ad5, ONYX-015).

Exemplo 8 - Seletividade de ColoAdl em explantes de tecido humano primário

[00113] Espécie de tecido oriunda dos tumores de colorretais e tecidos normais adjacentes removidos durante a cirurgia foram colocados em meios de cultura e foram infectados com números iguais ou de vírus de ColoAdl ou de Ad5. Sobrenadantes de cultura foram coletados a 24 horas pós-infecção e o número de partículas de vírus produzidas foi determinado. ColoAdl produziu mais partículas de vírus por partícula de entrada do que Ad5 no tecido de tumor, enquanto ele produziu menos partículas por partícula de entrada do que Ad5 no tecido normal.

Claims (25)

1. Adenovirus quimérico recombinante, caracterizado pelo fato de que apresenta um genoma compreendendo uma região E2B, em que a dita região E2B compreende uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um primeiro sorotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um segundo sorotipo adenoviral; em que os ditos primeiro e segundo sorotipos são, cada um, selecionados dos subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos entre si; em que a sequência de nucleotídeo da região E2B compreende SEQ ID NO: 3, e em que o dito adenovirus quimérico é oncolítico.

2. Adenovirus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda regiões que codificam proteínas de fibra, hexon, e penton, em que o ácido nucléico que codifica proteínas de fibra, hexon, e penton dos ditos adenovirus são do mesmo sorotipo adenoviral.

3. Adenovirus de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita célula de tumor é uma célula de tumor de cólon, de mama, de pâncreas, de pulmão, de próstata, ovariano, ou hemopoiética.

4. Adenovirus de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a dita célula de tumor é uma célula de tumor de cólon.

5. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do dito adenovirus compreende SEQ ID NO: 1.

6. Adenovirus quimérico recombinante, caracterizado pelo fato de que apresenta um genoma compreendendo uma região E2B, em que a dita região E2B compreende uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um primeiro sorotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um segundo sorotipo adenoviral; em que os ditos primeiro e segundo sorotipos adenovirais são cada um selecionados dos subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos entre si; em que a sequência de nucleotídeo da região E2B compreende SEQ ID NO: 3, em que o dito adenovirus quimérico é oncolítico; e em que o dito adenovirus quimérico foi convertido em deficiente de replicação através da deleção de uma ou mais das regiões adenovirais que codificam proteínas envolvidas em replicação adenoviral selecionadas do grupo que consiste em E1, E2, E3 ou E4.

7. Adenovirus deficiente de replicação de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as regiões E1 e E3 foram deletadas.

8. Adenovirus deficiente de replicação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma deleção da região E4.

9. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um gene heterólogo, em que o dito gene heterólogo é expresso dentro de uma célula infectada com o dito adenovirus.

10. Adenovirus de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito gene heterólogo é timidina cinase.

11. Adenovirus de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito gene heterólogo codifica uma proteína terapêutica selecionada do grupo que consiste em citocinas e quimiocinas, anticorpos, enzimas conversoras de pró-fármaco, e proteínas imunorreguladoras.

12. Uso de um adenovirus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para tratamento de doença neoplásica ou câncer, ou para inibir o crescimento de uma célula cancerígena.

13. Método de inibição de crescimento de uma célula de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a infecção da dita célula de câncer in vitrocom o adenovirus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita célula de câncer é uma célula de câncer de cólon.

15. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a dita célula de câncer é uma célula de câncer de cólon.

16. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do dito adenovirus compreende SEQ ID NO: 1.

17. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos do dito adenovirus compreende SEQ ID NO: 1.

18. Adenovirus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para entregar uma proteína terapêutica a uma célula.

19. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é para entregar uma proteína terapêutica a uma célula.

20. Método para o isolamento do adenovirus como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende a) combinação de sorotipos adenovirais que representam subgrupos adenovirais B-F, desse modo criando uma mistura adenoviral; b) passagem da mistura adenoviral combinada da etapa (a) em uma cultura de crescimento ativo de células de tumor a uma razão de partícula para célula alta o suficiente para estimular recombinação entre sorotipos, mas não tão alta quanto para produzir morte de célula prematura; c) coleta do sobrenadante da etapa (b); d) infecção de uma cultura quiescente de células de tumor com o sobrenadante coletado na etapa (c); e) coleta do sobrenadante de cultura de célula da etapa (d) antes de qualquer sinal de CPE; f) infecção de uma cultura quiescente de células de tumor com o sobrenadante coletado na etapa (e); e g) isolamento do vírus da reivindicação 1 do sobrenadante coletado na etapa (f) por purificação de placa.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é realizada duas vezes antes da coleta do sobrenadante na etapa (c).

22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que as etapas (e) e (f) são repetidas até 20 vezes antes da etapa (g).

23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que um segundo ciclo de purificação de placa é realizado após a etapa (g).

24. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a célula de tumor é uma célula de tumor de cólon, de mama, de pâncreas, de pulmão, de próstata, ovariano, ou hematopoiético.

25. Adenovirus quimérico recombinante, ou uma sua variante ou derivado do mesmo, caracterizado pelo fato de que apresenta um genoma compreendendo uma região E2B em que a dita região E2B compreende uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um primeiro sorotipo adenoviral e uma sequência de ácidos nucléicos derivada de um segundo sorotipo adenoviral; em que os ditos primeiro e segundo sorotipos adenovirais são, cada um, selecionados dos subgrupos adenovirais B, C, D, E, ou F e são distintos entre si; em que a sequência de nucleotídeo da região E2B compreende SEQ ID NO: 3, e em que o dito adenovirus quimérico é oncolítico; produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 24.

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