NO340708B1 - Rekombinant kimært adenovirus, replikasjonsmanglende variant derav, fremgangsmåte for isolering av adenoviruset, anvendelse derav i terapi, samt fremgangsmåte for å inhibere vekst av en kreftcelle. - Google Patents

Rekombinant kimært adenovirus, replikasjonsmanglende variant derav, fremgangsmåte for isolering av adenoviruset, anvendelse derav i terapi, samt fremgangsmåte for å inhibere vekst av en kreftcelle. Download PDF

Info

Publication number
NO340708B1
NO340708B1 NO20066002A NO20066002A NO340708B1 NO 340708 B1 NO340708 B1 NO 340708B1 NO 20066002 A NO20066002 A NO 20066002A NO 20066002 A NO20066002 A NO 20066002A NO 340708 B1 NO340708 B1 NO 340708B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
adenovirus
cell
region
chimeric
cells
Prior art date
Application number
NO20066002A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20066002L (no
Inventor
Paul Harden
Terry Hermiston
Irene Kuhn
Original Assignee
Psioxus Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Psioxus Therapeutics Ltd filed Critical Psioxus Therapeutics Ltd
Publication of NO20066002L publication Critical patent/NO20066002L/no
Publication of NO340708B1 publication Critical patent/NO340708B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • C12N15/8613—Chimaeric vector systems comprising heterologous sequences for production of another viral vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/861—Adenoviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10344—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Oppfinnelsens område
Oppfinnelsen som er beskrevet her vedrører generelt fagområdet for molekylærbiologi, og mer spesifikt til onkolytiske adenovirus som har terapeutiske applikasjoner.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Kreft er den ledende årsaken til dødsfall i USA og andre steder. Avhengig av krefttypen blir den typisk behandlet med kirurgi, kjemoterapi og/eller stråling. Disse behandlingene svikter ofte, og det er klart at nye terapier er nødvendige, for å bli anvendt alene eller i kombinasjon med klassiske teknikker.
Én tilnærming har vært anvendelsen av adenovirus, enten alene eller som vektorer som er i stand til å levere terapeutiske antikreftproteiner til tumorceller. Adenovirus er ikke-kappekledde, ikosohedriske, dobbeltrådede DNA-virus med et lineært genom på omtrent 36 kilobasepar. Hver ende av virusgenomet har en kort sekvens, kjent som den inverterte terminale repetisjonen (eller ITR), som er nødvendig for virusreplikasjon. Alle humane adenovirusgenomer som pr. i dag er undersøkt har den samme generelle organiseringen, dvs. at genene som koder for spesifikke funksjoner er lokalisert på den samme posisjonen i virusgenomet. Virusgenomet inneholder fem tidligere transkripsjonsenheter (EIA, E1B, E2, E3 og E4), to forsinket tidlige enheter (IX og Iva2) og én sen enhet (store sene) som blir prosessert for å generere fem familier av sene mRNAer (L1-L5). Proteiner som er kodet for av de tidlige genene er involvert i replikasjon, mens de sene genene koder for strukturelle virusproteiner. Deler av virusgenomet kan enkelt bli substituert med DNA av fremmed opprinnelse og rekombinant adenovirus er strukturelt stabile, noe som er egenskaper som gjør disse virusene potensielt nyttige til genterapi (se Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64).
Pr. i dag har forskningsinnsatsene for å frembringe klinisk nyttig adenovirusterapi blitt fokusert på adenovirus serotypen Ad5. Genetikken til dette humane adenoviruset er vel-karakterisertog systemer er godt beskrevet for dens molekylære manipulering. Høykapasitet produksjonsfremgangsmåter har blitt utviklet for å støtte kliniske applikasjoner, og noe klinisk erfaring med midlet er tilgjengelig. Se Jolly, D. (1994) Cancer Gene Therapy, 1:51-64. Forskning vedrørende anvendelsen av humane adenovirus (Ad) ved kreftbehandling har fokusert på utviklingen av Ad5-baserte adenovirus som har en høyere styrke for, eller som fortrinnsvis er rettet mot, spesifikke tumorcelletyper, og det foreligger et behov for generering av mer potente onkolytiske virus hvis adenovirusterapi skal finne praktisk anvendelse i en klinisk setting.
Ad5 er kun én av 51 nåværende kjente adenovirus-serotyper, som er klassifisert i undergruppene A-F, basert på ulike attributter inkludert deres hemagglutineringsegenskaper (se Shenk, "Adenoviridae: The Vimses and Their Replication", in Fields Virology, vol. 2, Fourth Edition, Knipe, ea., Lippincott, Williams & Wilkins, sider 2265-2267 (2001)). Disse serotypene er forskjellig på en mengde ulike nivåer, f.eks. patologi hos mennesker og gnagere, cellereseptorer som ble benyttet til binding, men disse forskjellene har i stor grad blitt ignorert som potensielle måter for å utvikle mer potente onkolytiske adenovirus (med unntaket for f i berend ringer, se Stevenson et al. (1997) J. Virol. 71:4782-4790, Krasnykh et al. (1996) J. Virol. 70:6839-6846, Wickham et al. (1997) J. Virol. 71:8221-8229, Legrand et al. (2002) Curr. Gene Ther. 2:323-329, Barnett et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta 1-3:1-14, US patentsøknad 2003/0017138).
Utnyttelse av forskjeller blant adenovirus-serotyper kan tilveiebringe en kilde for mer effektive adenovirusbaserte terapeutiske midler, ved å benytte nye adenovirus med økt selektivitet og styrke. Det foreligger et behov for slike forbedrede, adenovirusbaserte terapier.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye kimære adenovirus, som er nyttig for virusbasert terapi. Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen kimære adenovirus, som har et genom som omfatter en E2B-region der nevnte E2B-region omfatter en nukleinsyresekvens som er avledet fra en første adenovirus-serotype og en nukleinsyresekvens som er avledet fra en andre adenovirus-serotype, der nevnte første og andre adenovirus-serotype hver er valgt fra adenovirusundergruppene B, C, D, E eller F og er forskjellig fra hverandre og der nevnte kimære adenovirus er onkolytisk og viser en forbedret terapeutisk indeks for en tumorcelle.
I én utførelsesform omfatter det kimære adenoviruset ytterligere regioner som koder for fiber-, hekson- og pentonproteiner, der nukleinsyrene som koder for nevnte proteiner alle er fra den samme adenovirus-serotypen. I en annen utførelsesform omfatter de kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen en modifisert E3- eller E4-region.
I en annen utførelsesform viser de kimære adenovirusene en forsterket terapeutisk indeks i en kolon-, bryst-, pankreas-, lunge-, prostata-, ovarie- eller hemapoietisk tumorcelle. I en spesielt foretrukket utførelsesform oppviser de kimære adenovirusene en forsterket terapeutisk indeks i kolontumorceller.
I en foretrukket utførelsesform omfatter E2B-regionen i de kimære adenovirusene SEKV. ID nr. 3. I en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter det kimære adenoviruset SEKV. ID nr. 1.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et rekombinant kimært adenovirus, eller en variant eller et derivat derav, som har et genom som omfatter en E2B-region
der nevnte E2B-region omfatter en nukleinsyresekvens som er avledet fra en første adenovirus-serotype og en nukleinsyre som er avledet fra en andre adenovirus-serotype,
der nevnte første og andre adenovirus-serotyper hver er valgt fra adenovirus-undergruppene B, C, D, E eller F og som er forskjellig fra hverandre,
der nevnte kimære adenovirus er onkolytisk og viser en forsterket terapeutisk
indeks for en tumorcelle, og
der nevnte kimære adenovirus har blitt gjort replikasjonsmanglende via delesjon av én eller flere adenovirus-regioner som koder for proteiner som er involvert i adenovirus-replikasjon som er valgt fra gruppen som består av El, E2, E3 eller E4.
I én utførelsesform omfatter det kimære adenoviruset ifølge oppfinnelsen ytterligere et heterologt gen som koder for et terapeutisk protein, der nevnte heterologe gen blir uttrykt i en celle som er infisert med nevnte adenovirus. I en foretrukket utførelsesform er det terapeutiske proteinet valgt fra gruppen som består av cytokiner og kjemokiner, antistoffer, prodroge-konverterende enzymer og immunregulatoriske proteiner.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse for de kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen til terapeutiske formål. I én utførelsesform kan de kimære adenovirusene bli benyttet til å inhibere veksten til kreftceller. I en spesiell utførelsesform er et kimært adenovirus som omfatter SEKV. ID nr. 1 nyttig for å inhibere veksten til kolonkreftceller.
I en annen utførelsesform er adenovirusene ifølge oppfinnelsen nyttige som vektorer for å levere terapeutiske proteiner til celler.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av kimære adenovirus ifølge oppfinnelsen, der fremgangsmåten omfatter a) sammenslåing av adenovirus-serotyper som representerer adenovirus-undergrupper B-F, for derved å danne en adenovirusblanding, b) passere den sammenslåtte adenovirusblandingen fra trinn (a) på en aktivt voksende kultur av tumorceller ved et spesielt forhold med partikkel pr. celle som er tilstrekkelig til å oppmuntre til rekombinasjon mellom serotyper, men ikke så høy at prematur celledød fremkommer,
c) høste supernatanten fra trinn (b),
d) infisere en hvilende kultur av tumorceller med supernatanten som høstet i trinn
(c),
e) dyrke cellekultursupernatanten fra trinn (d) før ethvert tegn på CPE,
f) infisere en hvilende kultur av tumorceller med supernatanten som er høstet i trinn
(e), og
g) isolere de kimære adenovirusene fra supernatanten som høstet i trinn (f) ved hjelp av plakkrensing.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1. Ad-retensjonstidsprofiler på en TMAE-HPLC-kolonne. A) Retensjonsprofiler for de individuelle Ad-serotypene som blir benyttet for å generere den opprinnelige utgangsvirussammenslåingen. B) Retensjonsprofiler for passeringen av 20 sammenslåinger som er avledet fra henholdsvis HT-29-, Panc-1-, MDA-231- og PC-3-cellelinjene. Figur 2. Cytolytisk aktivitet for de individuelle virussammenslåingene. A) HT-29-, B) MDA-231-, C) Panc-1- og D) PC-3-celler ble infisert med deres respektive virussammenslåinger ved VP pr. celleforhold fra 100-0,01. MTS-analyser ble utført på ulike dager etter infeksjon (som indikert) avhengig av cellelinjen. Hvert datapunkt i panelet representerer en analyse som er utført i kvadruplikat og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt +/- SD. Panelene avbilder et representativt eksperiment og alle virussammenslåinger ble analysert minst tre uavhengige ganger på måltumorcellelinjen (figurforklaring: —•— Ad5, —□— opprinnelig virussammenslåing, —■— spesifikk celleavledet sammenslåing, passering 20). Figur 3. Cytolytisk aktivitet for ColoAdl og Ad5 på humane tumorcellelinjer. En MTS-analyse ble utført på A) et bredt panel av humane tumorcellelinjer og B) på et panel med humane kolonkreftcellelinjer for å bestemme dens potensielle potensspesifisitet. MTS-analysen ble utført på ulike dager avhengig av cellelinjen. Hvert panel er et representativt eksperiment som har blitt gjentatt minst tre ganger. Hvert datapunkt i panelet representerer en analyse som er utført i kvadruplikat og resultatene er uttrykt som gjennomsnittelig +/-SD (figurforklaring: —•—Ad5,—□—ColoAdl). Figur 4. Cytolytisk aktivitet for ColoAdl og Ad5 på et panel med normale celler. HS-27-, HUVEC- og SAEC-celler (henholdsvis primære fibroblastceller, endotelceller og epitelceller) ble infisert med ColoAdl og Ad5 med VP pr. celleforhold fra 100-0,01. MTS-analyse ble utført på ulike dager etter infeksjon avhengig av cellen og hvert panel er et representativt eksperiment som har blitt gjentatt minst tre ganger. Hvert datapunkt i panelet representerer en analyse utført i kvadruplikat og resultatene er uttrykt som gjennomsnittelig +/- SD (figurforklaring: —•—Ad5,—□—ColoAdl). Figur 5. Cytolytisk aktivitet for ColoAdl, Ad5 og ONYX-015 på primære, normale endotelceller (HUVEC) og en kolontumorcellelinje (HT-29). Hvert panel er et representativt eksperiment som har blitt gjentatt minst tre ganger. Hvert datapunkt i panelet representerer en analyse som er utført i kvadruplikat og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt +/-SD(figurforklaring: —•— Ad5, —□— ColoAdl, ■ Onyx-015). Figur 6. Cytolytisk aktivitet for ColoAdl, Adllp og Ad5 på en normal epitelcellelinje (SAEC) og en human kolonkreftcellelinje (HT-29). Hvert panel er et representativt eksperiment som har blitt gjentatt minst tre ganger. Hvert datapunkt i panelet representerer en analyse som er utført i kvadruplikat og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt +/- SD (figurforklaring: —•— Ad5, —□— Adllp, ColoAdl). Figur 7. Cytolytisk aktivitet for rekombinante virus. Rekombinante virus som representerer fire viruspopulasjoner (Adpll, ColoAdl, venstre ende Adllp/høyre ende ColoAdl (ColoAdl.1) og venstre ende ColoAdl/høyre ende Adllp (ColoAdl.2)) ble konstruert som beskrevet i eksempel 6. Cytolytisk aktivitet for hver populasjon i HT29-celler ble bestemt som tidligere beskrevet. (Figurforklaring: —•—Ad5,—□—Adllp,—■— ColoAdl, — u — ColoAdl.1, —A— ColoAdl.2).
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Definisjoner
Hvis ikke annet er definert, har alle tekniske og vitenskapelige uttrykk som blir benyttet her den samme betydningen som vanligvis tilleggs dem av fagfolk på området. Generelt er nomenklaturer som blir benyttet her og laboratorieprosedyrene som blir beskrevet nedenfor de som er velkjente og som vanligvis blir benyttet på fagområdet.
Som benyttet her refererer uttrykkene "adenovirus", "serotype" eller "adenovirus-serotype" til enhver av de 51 humane adenovirus-serotypene som pr. i dag er kjent, eller som blir isolert i fremtiden. Se for eksempel Strauss, "Adenovirus infections in humans", i The Adenoviruses, Ginsberg, ea., Plenum Press, New York, NY, sidene 451-596 (1984). Disse serotypene er klassifisert i undergruppene A-F (se Shenk, "Adenoviridae: The Viruses and Their Replication", i Fields Virology, bind 2, fjerde utgave, Knipe, ea., Lippincott Williams & Wilkins, sidene 2265-2256 (2001), som vist i tabell 1.
Som benyttet her refererer "kimære adenovirus" til et adenovirus hvis nukleinsyresekvens er omfattet av nukleinsyresekvensene for minst to av adenovirus-serotypene som er beskrevet ovenfor.
Som benyttet her, refererer "mor-adenovirus-serotype" til adenovirus-serotypen som representerer serotypen fra hvilken hoveddelen av genomet til de kimære adenovirusene er avledet.
Som benyttet her refererer uttrykket "homolog rekombinasjon" til to nukleinsyre-molekyler, der hver har homologe sekvenser, der de to nukleinsyremolekylene krysser over eller gjennomgår rekombinasjon i regionen med homologi.
Som benyttet her refererer uttrykket "potensitet" til det lytiske potensialet for et virus og representerer dets evne til å replikere, lysere og spre seg. For formålet ved foreliggende oppfinnelse er potensitet en verdi som sammenligner den cytolytiske aktiviteten for et gitt adenovirus ifølge oppfinnelsen med den samme for Ad5 i den samme cellelinjen, dvs. potensitet = IC50for AdX/IC50for Ad5, der X er den spesielle adenovirus-serotypen som blir undersøkt og der potensiteten til Ad5 er gitt en verdi på 1.
Som benyttet her refererer uttrykket "onkolytisk virus" til et virus som fortrinnsvis dreper kreftceller sammenlignet med normale celler.
Som benyttet her refererer uttrykkene "terapeutisk indeks" eller "terapeutisk vindu" til et tall som indikerer det onkolytiske potensial for et gitt adenovirus og blir bestemt ved å dele potensiteten for adenoviruset i en kreftcellelinje med potensiteten til det samme adenoviruset i en normal (dvs. ikke-kreftrammet) cellelinje.
Som benyttet her refererer uttrykket "modifisert" til et molekyl med en nukleotid-eller aminosyresekvens som er forskjellig fra en naturlig forekommende, f.eks. en villtype nukleotidsekvens eller villtypeaminosyresekvens. Et modifisert molekyl kan opprettholde funksjonen eller aktiviteten til et villtypemolekyl, dvs. at et modifisert adenovirus kan opprettholde dets onkolytiske aktivitet. Modifiseringer inkluderer mutasjoner i nukleinsyrer som beskrevet nedenfor.
Som benyttet her referer "mutasjon", med referanse til et polynukleotid eller polypeptid, til en naturlig forekommende, syntetisk, rekombinant eller kjemisk endring eller forskjell i den primære, sekundære eller tertiære strukturen til et polynukleotid eller polypeptid, sammenlignet med et referansepolynukleotid eller referansepolypeptid (f.eks. som sammenlignet med et villtypepolynukleotid eller villtypepolypeptid). Mutasjoner inkluderer slike endringer som f.eks. delesjoner, innskudd eller substitusjoner. Polynukleotider og polypeptider som har slike mutasjoner kan bli isolert eller fremstilt ved å benytte fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet.
Som benyttet her er "delesjon" definert som en endring i enten polynukleotid- eller aminosyresekvensen der ett eller flere polynukleotider eller aminosyreresidier er fraværende.
Som benyttet her er "innskudd" eller "addisjon" den endringen i en polynukleotidsekvens eller aminosyresekvens som har ført til tillegg av ett eller flere polynukleotider eller aminosyreresidier, sammenlignet med den naturlig forekommende polynukleotidsekvensen eller aminosyresekvensen.
Som benyttet her er "substitusjon" resultatet fra erstatningen av ett eller flere polynukleotider eller aminosyrer med henholdsvis ulike polynukleotider eller aminosyrer.
Som benyttet her refererer uttrykket "adenovirusderivat" til et adenovirus ifølge oppfinnelsen som har blitt modifisert slik at en addisjon, delesjon eller substitusjon har blitt utført på virusgenomet, slik at det resulterende adenovirusderivatet oppviser en potensitet og/eller en terapeutisk indeks som er høyere enn den for moradenoviruset, eller som på noen måte er mer terapeutisk nyttig (dvs. mindre immunogen, har forbedret uttømmingsprofil). For eksempel kan et derivat av et adenovirus ifølge oppfinnelsen ha en delesjon i ett av de tidlige genene i virusgenomet, inkludert EIA- eller E2B-regionen i virusgenomet.
Som benyttet her refererer "variant" med referanse til et polynukleotid eller polypeptid, til et polynukleotid eller polypeptid som kan variere i primær, sekundær eller tertiær tur, sammenlignet med henholdsvis et referanse-polynukleotid eller referansepolypeptid (f.eks. som sammenlignet med et villtype polynukleotid eller villtype polypeptid). Foreksempel kan aminosyresekvensen eller nukleinsyresekvensen inneholde en mutasjon eller modifikasjon som er forskjellig fra en referanse-aminosyresekvens eller referanse-nukleinsyresekvens. I noen utførelsesformer kan en adenovirusvariant være en forskjellig isoform eller en polymorfisme. Varianter kan være naturlig forekommende, syntetiske, rekombinante eller kjemisk modifiserte polynukleotider eller polypeptider som er isolert eller generert ved å benytte fremgangsmåter som er velkjente på fagområdet. Endringer i polynukleotidsekvensen til varianten kan være sovende. Det betyr at de ikke behøver å endre aminosyrene som er kodet for av polynukleotidet. Der endringer er begrenset til sovende endringer av denne typen, vil en variant kode for et polypeptid med den samme aminosyresekvensen som referansen. Alternativt kan slike endringer i polynukleotidsekvensen til varianten endre aminosyresekvensen for et polypeptid som er kodet for av referansepolynukleotidet, noe som fører til konservative eller ikke-konservative aminosyre-endringer, som beskrevet nedenfor. Slike polynukleotidendringer kan føre til aminosyresubstitusjoner, addisjoner, delesjoner, fusjoner eller trunkeringer i polypeptidene som er kodet for av referansesekvensen. Ulike kodonsubstitusjoner, slik som de sovende endringene som frembringer ulike restriksjonsseter, kan bli introdusert for å optimalisere kloning inn i et plasmid eller en virusvektor eller uttrykking i et spesielt prokaryot eller eukaryot system.
Som benyttet her refererer en "adenovirusvariant" til et adenovirus hvis polynukleotidsekvens er forskjellig fra et referansepolynukleotid, f.eks. et villtype adenovirus, som beskrevet ovenfor. Forskjellene er begrenset slik at polynukleotidsekvensene til morviruset og va ria ntvi ruset er tilsvarende i hovedsak og i de fleste regioner identiske. Som benyttet her er en første nukleotidsekvens eller aminosyresekvens sagt å være "lignende" med en andre sekvens når en sammenligning av de to sekvensene viser at de har få sekvensulikheter (dvs. at den første og den andre sekvensen er nesten identiske). Som benyttet her fører ikke polynukleotidsekvensulikhetene som foreligger mellom adenovirus-varianten og referanseadenoviruset til noen forskjell i potensiteten og/eller den terapeutiske indeksen.
Som benyttet her refererer uttrykket "konservativ" til substitusjon for en aminosyrerest med en forskjellig aminosyrerest som har tilsvarende kjemiske egenskaper. Konservative aminosyresubstitusjoner inkluderer erstatning av en leucin med en isoleucin eller valin, en aspartat med en glutamat, eller en treonin med en serin. Insersjoner eller delesjoner er typisk i området på omtrent 1-5 aminosyrer.
Som benytt her refererer uttrykket "ikke-konservativ" til substitusjon av en aminosyrerest med en forskjellig aminosyrerest som har ulike kjemiske egenskaper. De ikke-konservative substitusjonene inkluderer asparaginsyre (D) som blir erstattet med glysin (G), asparagin (N) som blir erstattet med lysin (K), eller alanin (A) som blir erstattet med arginin (R).
Enbokstavkodene for aminosyreresidier inkluderer de følgende: A = alanin, R = arginin, N = asparagin, D = asparaginsyre, C = cystein, Q = glutamin, E = glutaminsyre, G = glysin, H = histidin, I = isoleucin, L = leucin, K = lysin, M = metionin, F = fenylalanin, P = prolin, S = serin, T = treonin, W = tryptofan, Y = tyrosin, V = valin.
Det er på det rene at polypeptider ofte inneholder aminosyrer utover de 20 aminosyrene som vanligvis blir referert til som de 20 naturlig forekommende aminosyrene, og at mange aminosyrer, inkludert de terminale aminosyrene, kan bli modifisert i et gitt polypeptid, enten ved naturlige prosesser slik som glykosylering og andre posttranslasjonelle modifiseringer, eller ved kjemiske modifiseringsteknikker som er velkjente på fagområdet. Til og med de vanlige modifiseringene som forekommer naturlig i polypeptider er for mange til å legge frem uttømmende her, men de er godt beskrevet i grunnleggende tekster og i mer detaljerte monografer, i tillegg til i voluminøs forskningslitteratur, og de er velkjente for fagfolk på området. Blant de kjente modifiseringene som kan foreligge i polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse er, for å navngi noen få illustrative eksempler, acetylering, acylering, ADP-ribosylering, amidering, kovalent kobling av flavin, kovalent kobling av en enhet, kovalent kobling av et polynukleotid eller polynukleotidderivat, kovalent kobling av et lipid eller lipidderivat, kovalent kobling av fosfatidyinositol, kryssbinding, syklisering, disulfidbindingsdannelse, demetylering, dannelse av kovalente kryssbindinger, dannelse av cystein, dannelse av pyroglutamat, formylering, gammakarboksylering, glykation, glykosylering, GPI-forankringsdannelse, hydroksylering, jodering, metylering, myristoylering, oksidering, proteolytisk prosessering, fosforylering, prenylering, racemisering, selenoylering, sulfation, transfer-RNA-mediert addisjon av aminosyrer på proteiner slik som arginylering og ubikinering.
Slike modifiseringer er velkjente for fagfolk på området og har blitt beskrevet i inngående detalj i forskningslitteraturen. Mer spesielt vanlige modifiseringer, glykosylering, lipidpåkobling, sulfatering, gammakarboksylering av glutaminsyreresidier, hydroksylering og ADP-ribosylering, for eksempel er beskrevet i de fleste grunnleggende tekster, slik som for eksempel I. E. Creighton, Proteins- Structure and Molecular Properties, 2. utgave, W.H. Freeman and Company, New York, 1993. Mange detaljerte gjennomganger er tilgjengelige på dette området, slik som for eksempel de som er tilveiebrakt av Wold, F., i Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, red., Academic Press, New York, sider 1-12, 1983, Seifter et al., Met/7. Enzymol. 182: 626-646, 1990 og Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sei. 663: 48-62, 1992.
Det er på det rene, slik det er velkjent som påpekt ovenfor, at polypeptider ikke alltid er fullstendig lineære. For eksempel kan polypeptider være forgrenede som et resultat av ubikitinering, og de kan være sirkulære, med eller uten forgrening, generelt som et resultat av posttranslasjonelle hendelser, inkludert naturlige prosesseringshendelser og hendelser som er frembrakt ved human manipulasjon som ikke forekommer naturlig. Sirkulære, forgrenede og forgrenede, sirkulære polypeptider kan bli syntetisert ved hjelp av ikke-translasjonelle, naturlige prosesser og ved fullstendig syntetiske fremgangsmåter i tillegg.
Modifiseringer kan forekomme hvor som helst på et polypeptid, inkludert peptid-ryggradstrukturen, aminosyresidekjedene og aminoterminalen eller karboksylterminalen. Faktisk er blokkering av aminogruppen eller karboksylgruppen i et polypeptid, eller begge, ved en kovalent modifisering, vanlig i naturlig forekommende og syntetiske polypeptider og slike modifiseringer kan foreligge på polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel vil den aminoterminale resten i polypeptidet fremstilt i E. coli, før proteolytisk prosessering, nesten alltid være N-formylmetionin.
Modifiseringene som forekommer i et polypeptid vil ofte være en funksjon av hvordan de er fremstilt. For polypeptider som er fremstilt ved å uttrykke et klonet gen i en vert, vil for eksempel egenskapene og omfanget av modifiseringene i stor grad være bestemt av vertscellens posttranslasjonelle modifiseringskapasitet og modifiseringssignalene som foreligger på polypeptidaminosyresekvensen. Slik det er velkjent vil for eksempel glykosylering ofte ikke forekomme i bakte heverter slik som E. coli. Når glykosylering er ønskelig bør derfor et polypeptid bli uttrykt i en glykosylerende vert, generelt en eukaryot celle. Insektceller utfører ofte de samme posttranslasjonelle glykosyleringene som pattedyr-celler, og av denne grunn har insektcelle ekspresjonssystemet blitt utviklet for effektivt å uttrykke pattedyrproteiner som blant annet har native mønstre med glykosylering. Tilsvarende overveielser gjelder andre modifiseringer.
Det er på det rene at den samme typen av modifisering kan foreligge i samme eller varierende grad på flere seter i et gitt polypeptid. Et gitt polypeptid kan også inneholde mange typer av modifiseringer.
Som benyttet her blir de følgende uttrykkene benyttet til å beskrive sekvens-sammenhengene mellom to eller flere polynukleotidsekvenser eller aminosyresekvenser: "referansesekvens", "sammenligningsvindu", "sekvensidentitet", "prosentandel av sekvensidentitet", "vesentlig identitet", "likhet" og "homolog". En "referansesekvens" er en definert sekvens som blir benyttet som en basis for en sekvenssammenligning, der en referansesekvens kan være en del av en større sekvens, for eksempel fordi et segment av en fullengde-cDNA- eller gensekvens som er gitt i en sekvensliste eller kan omfatte en fullstendig cDNA-sekvens eller gensekvens. Generelt er en referansesekvens minst 18 nukleotider eller 6 aminosyrer lang, ofte minst 24 nukleotider eller 8 aminosyrer lang, og ofte minst 48 nukleotider eller 16 aminosyrer lang. Siden to polynukleotider eller aminosyresekvenser hver kan (1) omfatte en sekvens (dvs. en del av den fullstendige polynukleotidsekvensen eller aminosyresekvensen) som er lik mellom de to molekylene, og (2) kan ytterligere omfatte en sekvens som er forskjellig mellom de to polynukleotidene eller aminosyresekvensene, sekvenssammenligninger mellom to (eller flere) molekyler ble typisk utført ved å sammenligne sekvenser for de to molekylene over et "sammenligningsvindu" for å identifisere og sammenligne lokale regioner for sekvenslikhet. Et "sammenligningsvindu", slik som det blir benyttet her, refererer til et konseptuelt segment på minst 18 kontinuerlige nukleotidposisjoner eller 6 aminosyrer der en polynukleotidsekvens eller aminosyresekvens kan bli sammenlignet med en referansesekvens på minst 18 kontinuerlige nukleotider eller 6 aminosyresekvenser og der delen av polynukleotidsekvensen i sammenligningsvinduet kan omfatte addisjoner, delesjoner, substitusjoner og lignende (dvs. åpninger) på 20 % eller mindre sammenlignet med referansesekvensen (som ikke omfatter addisjoner eller delesjoner) for optimal sammenstilling av de to sekvensene. Optimal sammenstilling av sekvenser for sammenstilling i et sammenligningsvindu kan bli utført ved f.eks. å benytte den lokale homologi algoritmen til Smith og Waterman, Adv. Appl. Matn. 2:482 (1981), ved hjelp av homologi sammenstillings-algoritmen til Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443
(1970), ved hjelp av fremgangsmåten som søker etter likhet fra Pearson og Lipman, Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA) 85:2444 (1988), ved datastyrte implementeringer av disse algoritmene (GAP, BESTFIT, FASTA og TFASTA i the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), VectorNTI fra Informatix, Geneworks eller MacVector-programvarepakker), eller ved inspeksjon, og den beste sammenstillingen (dvs. den som resulterer i den høyeste prosentandelen med homologi over sammenligningsvinduet) som ble generert ved hjelp av de ulike fremgangs-måtene blir valgt. Som benyttet her betyr uttrykket "sekvensidentitet" at to polynukleotidsekvenser eller aminosyresekvenser er identiske (dvs. på en nukleotid-for-nukleotid eller rest-for-rest basis) over sammenligningsvinduet. Uttrykket "prosentandel av sekvensidentitet" blir beregnet ved å sammenligne to optimalt sammenstilte sekvenser over sammenligningsvinduet, bestemme antallet posisjoner der den identiske nukleinsyrebasen (f.eks. A, T, C, G, U eller I) eller resten forekommer i begge sekvenser for å gi antallet matchede posisjoner, dele antallet matchede posisjoner på det totale antallet posisjoner i sammenligningsvinduet (dvs. vindusstørrelsen), og multiplisere resultatet med hundre for å få prosentandelen med sekvensidentitet. Uttrykket "vesentlig identitet", slik som det blir benyttet her, betegner et karaktertrekk for en polynukleotidsekvens eller aminosyresekvens, der polynukleotidet eller aminosyren omfatter en sekvens som har minst 85 % sekvensidentitet, fortrinnsvis minst 90-95 % sekvensidentitet, mer vanlig minst 99 % sekvensidentitet sammenlignet med en referansesekvens over et sammenligningsvindu på minst 18 nukleotidposisjoner (6 aminosyrer), ofte over et vindu på minst 24-48 nukleotidposisjoner (8-16 aminosyrer), der prosentandelen av sekvensidentitet blir beregnet ved å sammenligne referansesekvensen med sekvensen som kan inkludere delesjoner eller addisjoner som utgjør totalt 20 % eller mindre av referansesekvensen over sammenligningsvinduet. Referansesekvensen kan være en del av en større sekvens. Uttrykket "likhet", når det ble benyttet til å beskrive et polypeptid, blir bestemt ved å sammenligne aminosyresekvensen og de konserverte aminosyresubstitusjonene i et polypeptid med sekvensen til et andre polypeptid. Uttrykket "homolog", når det blir benyttet til å beskrive et polynukleotid, indikerer at to polynukleotider, eller betegnede sekvenser derav, når de er optimalt sammenstilt og sammenlignet, er identiske, med passende nukleotid-insersjoner eller -delesjoner, i minst 70 % av nukleotidene, vanligvis fra omtrent 75 % til 99 % og mer foretrukket minst omtrent 98-99 % av nukleotidene. Som benyttet her indikerer uttrykket "homolog", når det blir benyttet til å beskrive et polynukleotid, at to polynukleotider, eller betegnede sekvenser derav, når de er optimalt sammenstilt og sammenlignet, er identiske, med passende nukleotid-insersjoner eller -delesjoner i minst 70 % av nukleotidene, vanligvis fra omtrent 75 % til 99 % og mer foretrukket minst 98-99 % av nukleotidene. Som benyttet her refererer "polymerase kjedereaksjonen" eller "PCR" til en prosedyre der spesifikke biter av DNA blir amplifisert som beskrevet i US patentskrift nr. 4 683 195. Generelt trenger sekvensinformasjon fra endene til polypeptidfragmentet av interesse eller forbi enden å være tilgjengelig, slik at oligonukleotidprimere kan bli designet, der disse primerne vil peke mot hverandre, og vil være identiske eller lignende i sekvens med motstående tråder på templatet som skal bli amplifisert. De 5' terminale nukleotidene til de to primerne vil sammenfalle med endene til det amplifiserte materialet. PCR kan bli benyttet for å amplifisere spesifikke DNA-sekvenser fra totalt genomisk DNA, cDNA som er transkribert fra totalt cellulært RNA, plasmidsekvenser, osv. (se generelt Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987, Erlich, red. PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989). Som benyttet her forekommer "stringens" typisk i et område fra omtrent Tm (smeltetemperatur) 5 °C (5° under Tm for proben) til omtrent 20 °C til 25 °C under Tm. Slik det er åpenbart for fagfolk på området kan en stringent hybridisering bli benyttet for å identifisere og påvise identiske polynukleotidsekvenser eller for å identifisere eller påvise lignende eller beslektede polynukleotidsekvenser. Som benyttet her betyr uttrykket "stringente betingelser" at hybridisering vil foregå kun hvis det er minst 95 % og fortrinnsvis minst 97 % identitet mellom sekvensene. Som benyttet her skal "hybridisering" inkludere "enhver prosess ved hvilken en polynukleotidtråd assosieres med en komplementær tråd via baseparing" (Coombs, J., Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, N.Y., 1994). Som benyttet her refererer uttrykket "terapeutisk effektiv dose" eller "effektiv mengde" til den mengden av adenovirus som lindrer symptomene eller tilstandene for en sykdom. En dose er ansett å være en terapeutisk effektiv dose i behandlingen av kreft eller dens metastaser når tumorvekst eller metastatisk vekst blir bremset eller stoppet, eller når tumoren eller metastasen blir funnet å skrumpe i størrelse, slik at dette fører til en forlengning i livslengde for individet.
Adenovirus ifølge oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer kimære adenovirus som har et genom der nukleotidsekvensen til E2B-regionen i det kimære adenoviruset omfatter nukleinsyresekvenser som er avledet fra minst to adenovirus-serotyper, der serotypene hver er valgt fra adenovirusundergruppene B, C, D, E og F og er forskjellig fra hverandre. Et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen er onkolytisk og viser en forsterket terapeutisk indeks for en tumorcelle.
Isolering av kimære adenovirus
De kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ved å benytte modifisering av en teknikk som er referert til som "bioseleksjon", der et adenovirus med ønskede egenskaper, slik som forsterket onkogenisitet eller selektiv spesifisitet, blir fremstilt via anvendelsen av genetisk seleksjon ved kontrollerte betingelser (Yan et al. (2003) J. Virol. 77:2640-2650).
I foreliggende oppfinnelse blir en blanding av adenovirus av ulike serotyper slått sammen og blir passert, fortrinnsvis minst to ganger, på en subkonfluent kultur av tumorceller ved et spesielt forhold pr. celle som er høyt nok til å frembringe rekombinasjon mellom serotyper, men ikke så høyt at det fremprovoserer prematur celledød. Et foretrukket forhold av partikler pr. celle er omtrent 500 partikler pr. celle, og kan enkelt bli bestemt av en fagperson på området. Som benyttet her refererer en "subkonfluent kultur" av celler til en monolagskultur eller suspensjonskultur der cellene vokser aktivt. For celler som ble dyrket som et monolag vil et eksempel være en kultur der omtrent 50 % til 80 % av arealet som er tilgjengelig for cellevekst er dekket med celler. Foretrukket er en kultur der omtrent 75 % av vekstarealet er dekket med celler.
I en foretrukket utførelsesform er adenovirusblandingen én som inkluderer adenovirus-serotyper som er representative for adenovirusundergruppene B, C, D, E og F. Gruppe-A-adenovirus er ikke inkludert i blandingen siden det er assosiert med tumor-dannelse hos gnagere. Foretrukne tumorcellelinjer som er nyttige i bioseleksjonsprosessen inkluderer, men er ikke begrenset til, de som er avledet fra bryst, kolon, pankreas, lunge og prostata. Noen eksempler på faste tumorcellelinjer som er nyttige for den "bioselektive" passeringen av adenovirusblandingen inkluderer, men er ikke begrenset til, MDA231-, HT29-, PAN-1- og PC-3-celler. Hemopoietiske cellelinjer inkluderer, men er ikke begrenset til, Raji-og Daudi-B-lymfoide celler, K562-erytroblastoidceller, U937-myeloidceller og HSB2-T-lymfoide celler.
Adenovirus som blir produsert i løpet av disse første passeringene blir benyttet til å infisere hvilende tumorceller ved et forhold mellom partikkel og celle som er lavt nok til å tillate infeksjonen av en celle med ikke mer enn ett adenovirus. Etter opptil 20 passeringer ved disse betingelsene blir supernatanten fra den siste passeringen høstet før synlig cytopatisk effekt (CPE, se Fields Virology, bind 2, fjerde utgave, Knipe, e.a., Lippincott Williams & Wilkins, sidene 135-136), for å øke seleksjonen av høyt potente virus. Den høstede supernatanten kan bli konsentrert ved hjelp av teknikker som er velkjente for fagfolk på området. En foretrukket fremgangsmåte for å få tak i hvilende celler, dvs. de der aktiv cellevekst har stoppet opp, i en monolagskultur er å tillate kulturen å vokse i tre dager etter konfluens, der konfluens betyr at hele arealet som er tilgjengelig for cellevekst er okkupert (dekket med celler). Tilsvarende kan suspensjonskulturer bli dyrket til tettheter som erkarakterisert vedfraværet av aktiv cellevekst.
Serotypeprofilen for den konsentrerte supernatanten, som inneholder den bioselekterte adenovirussamlingen, kan bli undersøkt ved å måle retensjonstidene for den høstede virussamlingen på en anionbytterkolonne, der ulike adenovirustyper er kjent for å ha karakteristiske retensjonstider (Blanche et al. (2000) Gene Therapy 7:1055-1062), se eksempel 3, fig. IA og B. Adenovirus ifølge oppfinnelsen kan bli isolert fra den konsentrerte supernatanten ved fortynning og plakkrensing, eller ved andre teknikker som er velkjente på fagområdet, og dyrket for ytterligere karakterisering. Teknikker som er velkjente på fagområdet blir benyttet for å bestemme sekvensen til de isolerte kimære adenovirusene (se eksempel 5).
Et eksempel på et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen er det kimære adenoviruset ColoAdl, som ble isolert ved å benytte HT29-kolonceller i bioseleksjonsprosessen. ColoAdl har nukleinsyresekvensen ifølge SEKV. ID nr. 1. Hoveddelen av nukleotidsekvensen til ColoAdl er identisk med nukleotidsekvensen til Adll-serotypen (SEKV. ID nr. 2) (Stone et al. (2003) Virology 309:152-165, Mei et al. (2003) J. Gen. Virology 84:2061-2071). Det foreligger to delesjoner i ColoAdl-nukleotidsekvensen sammenlignet med Ad 11, en på 2444 basepar i lengde innenfor E3-transkripsjonsenhetsregionen i genomet (basepar 27979 til 30423 i SEKV. ID nr. 2) og en annen, mindre delesjon, 25 basepar i lengde (basepar 33164 til 33189 ifølge SEKV. ID nr. 2) innenfor E4orf4-genet. E2B-transkripsjonsenhetsregionen (SEKV. ID nr. 3) for ColoAdl, som koder for adenovirusproteinene DNA-polymerase og terminalprotein, er lokalisert mellom basepar 5067 og 10354 ifølge SEKV. ID nr. 1, og er et område med homolog rekombinasjon mellom Adll- og Ad3-serotypene. Innenfor denne regionen i ColoAdl er det 198 baseparendringer, sammenlignet med sekvensen til Adll (SEKV. ID nr. 1). Endringene fører til strekninger av nukleotider innenfor E2D-regionen til ColoAdl som er homologe med sekvensen innenfor en del av E2B-regionen til Ad3 (SEKV. ID nr. 8), der den lengste strekningen med homologi mellom ColoAdl og Ad3 er 414 bp i lengde. E2B-regionen til ColoAdl (SEKV. ID nr. 3) overfører forsterket potensitet for ColoAdl-adenovirus sammenlignet med umodifisert Adll-adenovirus (se eksempel 6, fig. 7). I andre utførelsesformer kan et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen omfatte nukleinsyresekvenser fra mer enn to adenovirus-serotyper.
Et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen kan bli evaluert for dets selektivitet i en spesifikk tumortype ved undersøkelse av dets lytiske potensial i et panel av tumorceller som er avledet fra det samme vevet på hvilket adenovirussamlingen opprinnelig ble passert. F.eks. ble det kimære adenoviruset ColoAdl (SEKV. ID nr. 1), som opprinnelig var avledet fra en adenovirussamling basert på HT-29-kolontumorcellelinjer, undersøkt på nytt både i HT-29-celler og et panel med andre kolonavledede tumorcellelinjer, inkludert DLD-1, LS174T, LS1034, SW403, HCT116, SW48 og Colo320DM (se fig. 3B). Enhver tilgjengelig kolontumorcellelinje vil være like nyttig for en slik evaluering. Isolerte adenoviruskloner fra adenovirussamlinger som er valgt på andre tumorcelletyper kan tilsvarende bli testet i et passende tumorcellepanel, inkludert prostatacellelinjer (f.eks. DU145- og PC-3-cellelinjer), pankreascellelinjer (f.eks. Panc-l-cellelinjen), brysttumorcellelinjer (f.eks. MDA231-cellelinjen) og ovariecellelinjer (f.eks. OVCAR-3-cellelinjen). Andre tilgjengelige tumorcellelinjer er like nyttige for å isolere og identifisere adenovirus ifølge oppfinnelsen.
De kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen har en forbedret terapeutisk indeks sammenlignet med adenovirustypene de er avledet fra. (Se fig. 6, som sammenligner den cytolytiske aktiviteten til de kimære adenovirusene ColoAdl med Adllp).
Oppfinnelsen omfatter også kimære adenovirus som er konstruert ved å benytte rekombinante teknikker som er velkjent for fagfolk på området. Slike kimære adenovirus omfatter en region med nukleotidsekvens som er avledet fra én adenovirus-serotype som er inkorporert ved rekombinante teknikker inn i genomet til en annen adenovirus-serotype. Den inkorporerte sekvensen overfører en egenskap, f.eks. tumorspesifisitet eller forsterket potensitet, til mor-adenovirus-serotypen. F.eks. kan E2B-regionen til ColoAdl (SEKV. ID nr.
3) bli inkorporert inn i genomet til Ad35 eller Ad9.
Adenovirusderivater
Foreliggende oppfinnelse omfatter og beskriver et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen som er modifisert for å tilveiebringe andre terapeutisk nyttige kimære adenovirus. Modifiseringer inkluderer, men er ikke begrenset til, de som er beskrevet nedenfor.
Én modifisering beskrevet er fremstillingen av derivater av de kimære adenovirusene som vesentlig mangler evnen til å binde p53, som et resultat av en mutasjon i adenovirusgenet som koder for ElB-55K-proteinet. Slike virus har generelt noe av eller hele ElB-55-K-regionen fjernet. (Se US patentskrift nr. 5 677 178). US patentskrift nr. 6 080 578 beskriver blant annet Ad5-mutanter som har delesjoner i regionen for ElB-55K-proteinet som er ansvarlig for binding til p53. En annen modifisering på de kimære adenovirusene er mutasjoner i ElA-regionen, som beskrevet i US patentskrift nr. 5 801 029 og 5 972 706. Disse typene av modifiseringer tilveiebringer derivater av de kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen med større selektivitet for tumorceller.
Et eksempel på modifisering som er omfattet av denne oppfinnelsen er et kimært adenovirus som oppviser en forbedret grad av vevsspesifisitet på grunn av plassering av virusreplikasjon under kontrollen av en vevsspesifikk promoter som beskrevet i US patentskrift nr. 5 998 205. Replikasjon for et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen kan også bli satt under kontrollen av et E2F-responsivt element som beskrevet i US patent-søknad nr. 09/714,409. Denne modifiseringen giren virusreplikasjonskontrollmekanisme som er basert på tilstedeværelsen av E2F, noe som fører til forsterket tumorvevsspesifisitet, og er forskjellig fra kontrollen som blir gitt ved en vevsspesifikk promoter. I begge disse utførelsesformene er den vevsspesifikke promoteren og det E2F-responsive elementet opererbart bundet til et adenovirusgen som er essensielt for replikasjon til adenoviruset.
En annen modifisering omfattet av oppfinnelsen er anvendelse av et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen, f.eks. ColoAdl, som grunnstrukturen for fremstilling av nye replikasjonsmanglende adenovirusvektorer. Som beskrevet i Lai et al. (2002) DNA Cell Bio. 21:895-913), kan adenovirusvektorer som er replikasjonsmanglende bli benyttet til å levere og uttrykke terapeutiske gener. Både første generasjons- (der El- og E3-regionene er fjernet) og andre generasjons- (der E4-regionen i tillegg er fjernet) adenovirusvektorer som er avledet fra de kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen bli tilveiebrakt. Slike vektorer kan enkelt bli fremstilt ved å benytte teknikker som er velkjente for fagfolk på området (se Imperiale og Kochanek (2004) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 273:335-357, Vogels et al.
(2003) J. Virol. 77:8263-8271).
En ytterligere modifisering omfattet av oppfinnelsen er insersjonen av et heterologt gen, som er nyttig som en markør eller en reporter for å følge effektiviteten av virusinfeksjon. En utførelsesform av denne typen av modifisering er insersjon av tymidinkinase (TK)-genet. Ekspresjon av TK i infiserte celler kan bli benyttet for å følge nivået av virus som er igjen i cellene etter virusinfeksjon, ved å benytte radiomerkede substrater i TK-reaksjonen (Sangro et al. (2002) Mol. Imaging Biol. 4:27-33).
Fremgangsmåter for konstrueringen av de modifiserte kimære adenovirusene er generelt kjent på fagområdet. Se Mittal, S. K. (1993) Virus Res. 28:67-90 og Hermiston, T. et al. (1999) Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W. S. M. Wold, red. Humana Press. Standardteknikker blir benyttet for rekombinante nukleinsyrefremgangsmåter, polynukleotid syntese og mikrobedyrking og transformasjon (f.eks. elektroporering, lipofeksjon). Vanligvis blir enzymatiske reaksjoner og rensetrinn utført i overensstemmelse med produsentens spesifikasjoner. Teknikkene og prosedyrene blir vanligvis utført i overensstemmelse med konvensjonelle fremgangsmåter på fagområdet og ulike generelle referanser (se generelt, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) som er tilveiebrakt gjennom hele dette dokumentet. Nomenklaturen som blir benyttet her og laboratorieprosedyrene i analytisk kjemi, organisk syntetisk kjemi og farmasøytisk formulering som beskrevet nedenfor, er de som er velkjente og som vanligvis blir benyttet på fagområdet.
Bestemmelse av terapeutisk potensial
Kimære adenovirus ifølge oppfinnelsen kan bli evaluert for deres terapeutiske anvendbarhet ved å undersøke deres lytiske potensial i tumorceller som er avledet fra vev av interesse som terapeutiske mål. Tumorcellelinjer som er nyttige for å teste slike adenovirus inkluderer koloncellelinjer DLD-1-, HCT116-, HT29-, LS1034- og SW48-cellelinjer, prostatacellelinjer, inkludert DU145- og PC-3-cellelinjer, pankreascellelinjer, inkludert panc-l-cellelinjen, brysttumorcellelinje, inkludert MDA231-cellelinjen og ovariecellelinjer, inkludert OVCAR-3-cellelinjen. Hemopoietiske cellelinjer inkluderer Raji- og Daudi-B-lymfoidcellene, K562-erytroblastoidceller, U937-myeloidceller og HSB2-T-lymfoide celler. Enhver annen tumorcellelinje som er tilgjengelig kan bli benyttet for å evaluere og identifisere adenovirus ifølge oppfinnelsen for anvendelse i behandlingen av neoplasi.
Den cytolytiske aktiviteten til adenovirus ifølge oppfinnelsen kan bli bestemt i representative tumorcellelinjer, og dataene kan bli konvertert til en måling av potensitet, der et adenovirus som tilhører undergruppe C, fortrinnsvis Ad5, blir benyttet som en standard (dvs. gitt en potensitet på 1). En foretrukket fremgangsmåte for å bestemme cytolytisk aktivitet er en MTS-analyse (se eksempel 4, fig. 2).
Den terapeutiske indeksen for et adenovirus ifølge oppfinnelsen i en spesiell tumorcellelinje kan bli beregnet ved sammenligning av potensiteten for det gitte adenoviruset i en tumorcellelinje med potensiteten til det samme adenoviruset i en ikke-kreftrammet cellelinje. Foretrukne ikke-kreftrammede cellelinjer er SAEC-celler, som er epitelceller opprinnelig, og HUVEC-celler som opprinnelig er endotelceller (se fig. 4). Disse to celletypene representerer normale celler fra hvilke organer og vaskulatur henholdsvis er avledet, og er representative for sannsynlige steder for toksisitet i løpet av adenovirusterapi, avhengig av leveringsmåten for adenoviruset. Likevel er ikke utøvelse av oppfinnelsen begrenset til anvendelsen av disse cellene, og andre ikke-kreftrammede cellelinjer (f.eks. B-celler, T-celler, makrofager, monocytter, fibroblaster) kan også bli benyttet.
De kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan ytterligere bli evaluert for deres evne til å målsøke neoplastisk cellevekst (dvs. kreft) ved deres kapasitet til å redusere tumorigenese eller neoplastisk cellebyrde i nakenmus som bærer et transplantat av neoplastiske celler, sammenlignet med ubehandlede mus som bærer en ekvivalent neoplastisk cellebyrde (se eksempel 7).
Evaluering av adenovirusene ifølge oppfinnelsen skal også bli utført ved å benytte primære, humane tumoreksplantater (Lam et al. (2003) Cancer Gene Therapy, Grill et al.
(2003) Mol. Therapy 6:609-614), som tilveiebringer testbetingelser som foreligger i tumorer som ikke normalt kan bli frembrakt ved å benytte tumorxenograftundersøkelsene.
Terapeutisk anvendelse
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelsen av kimære adenovirus ifølge oppfinnelsen til inhiberingen av tumorcellevekst, i tillegg til anvendelsen av adenovirusvektorer som er avledet fra disse kimære adenovirusene for å levere terapeutiske proteiner som er nyttige i behandlingen av neoplasi og andre sykdomstilstander.
Farmasøytiske preparater oa administrerin<g>
Foreliggende oppfinnelse vedrører også farmasøytiske preparater som omfatter de kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen som er formulert for terapeutisk administrering til en pasient. For terapeutisk anvendelse blir et sterilt preparat som inneholder en farmakologisk effektiv dosering av adenovirus administrert til en human pasient eller en ikke-human veterinærpasient for behandling, f.eks. av en neoplastisk tilstand. Generelt vil preparatet omfatte omtrent IO<11>eller flere adenoviruspartikler i en vandig suspensjon. En farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens blir ofte benyttet i slike sterile preparater. En mengde vandige løsninger kan bli benyttet, f.eks. vann, 0,4 % saltløsning, 0,3 % glysin og lignende. Disse løsningene er sterile og generelt frie for partikkelmateriale utenom den ønskede adenovirusvektoren. Preparatene kan inneholde farmasøytisk akseptable tilleggsstoffer der dette er nødvendig for å tilnærme seg fysiologiske betingelser slik som pH-justerende og bufrende midler, toksisitetsjusterende midler og lignende, f.eks. natriumacetat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, natriumlaktat osv. Eksipienser som forsterker infeksjon av celler ved adenovirus kan bli inkludert (se US patentskrift nr. 6 392 069).
Adenovirus ifølge oppfinnelsen kan også bli levert til neoplastiske celler ved liposomlevering eller immunliposomlevering, der slik levering kan være selektivt målsøkt mot neoplastiske celler på basis av en celleoverflateegenskap som foreligger på den neoplastiske cellepopulasjonen (f.eks. tilstedeværelsen av et celleoverflateprotein som binder et immunoglobulin på et immunliposom). Typisk blir en vandig suspensjon som inneholder virionene innkapslet i liposomer eller immunliposomer. Foreksempel kan en suspensjon av adenovirusvirioner bli innkapslet i miceller for å danne immunliposomer ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter (US patentskrift nr. 5 043 164, US patentskrift nr. 4 957 735, US patentskrift nr. 4 925 661, Connor og Huang, (1985) J. Cell Biol. 101: 581, Lasic D.D. (1992) Nature 355: 279, Novel Drug Delivery (red. Presoctt og Nimmo, Wiley, NewYorl, 1989), Reddy et al. (1992) J. Immunol. 148: 1585). Immunliposomer som omfatter et antistoff som binder spesifikt til et kreftcelleantigen (f.eks. CALLA, CEA) som er tilstede på kreftcellene hos individet kan bli benyttet for å styre virioner til disse cellene (Fisher (2001) Gene Therapy 8:341-348).
For ytterligere å øke effektiviteten for adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan de bli modifisert for å oppvise forsterket tropisme for spesielle tumorcelletyper. Som vist i PCT/US98/04964 kan f.eks. et protein på utsiden av kappen til et adenovirus bli modifisert for å oppvise et kjemisk middel, fortrinnsvis et polypeptid, som binder til en reseptor som foreligger på tumorceller i større grad enn på normale celler. (Se også US patentskrift nr. 5 770 442 og 5 712 136). Polypeptidet kan være et antistoff, og er fortrinnsvis et enkeltkjedeanti stoff.
Adenovirusterapi
Adenovirusene ifølge oppfinnelsen, eller farmasøytiske preparater derav, kan bli administrert for terapeutisk behandling av neoplastisk sykdom eller kreft. I terapeutiske applikasjoner blir preparater administrert til en pasient som allerede er rammet av den spesielle neoplastiske sykdommen, i en mengde som er tilstrekkelig til å kurere eller i det minste delvis stoppe tilstanden og dens komplikasjoner. En mengde som er tilstrekkelig til å oppnå dette er definert som en "terapeutisk effektiv dose" eller "effektiv dose". Mengder som er effektive til denne anvendelsen vil være avhengig av alvorligheten av tilstanden, den generelle tilstanden til pasienten og administreringsmåten.
For eksempel kan en human pasient eller et ikke-humant pattedyr som har en fast eller hematologisk neoplastisk sykdom (f.eks. pankreas-, kolon-, ovarie-, lunge- eller bryst-karsinom, leukemi eller multippelt myelom) bli behandlet ved å administrere en terapeutisk effektiv dosering av et passende adenovirus ifølge oppfinnelsen, dvs. ett som har blitt vist å ha en forbedret terapeutisk indeks for denne virustypen. For eksempel vil et foretrukket kimært adenovirus til behandlingen av kolonkreft være adenoviruset ColoAdl (SEKV. ID nr. 1). Suspensjoner av infiserende adenoviruspartikler kan bli levert til neoplastisk vev ved hjelp av ulike veier, inkludert intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær, subdermal og topisk administrering. En adenovirussuspensjon som inneholder omtrent IO<3>til IO<12>eller flere virionpartikler pr. ml kan bli administrert ved infusjon (f.eks. inn i det peritoneale hulrommet for å behandle ovariekreft, inn i portåren for å behandle hepatokarsinom eller levermetastaser fra andre ikke-hepatiske, primære tumorer) eller annen passende administreringsvei, inkludert direkte injeksjon inn i en tumormasse (f.eks. en brysttumor), klyster (f.eks. kolonkreft) eller kateter (f.eks. blærekreft). Andre administreringsmåter kan være passende for karsinomer av annet opphav, dvs. inhalering som en luftfordelt løsning (f.eks. for pulmonal levering for å behandle bronkogent karsinom, småcellet lungekarsinom, ikke-småcellet lungekarsinom, lungeadenokarsinom eller strupekreft) eller direkte påføring på et tumorsted (f.eks. bronkogent karsinom, nasofaryngealt karsinom, laryngealt karsinom, cervixkarsinom).
Adenovirusterapi ved å anvende adenovirusene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli kombinert med andre antineoplastiske protokoller, slik som konvensjonell kjemoterapi eller røntgenterapi for å behandle en spesiell kreftform. Behandling kan være samtidig eller sekvensiell. Et foretrukket kjemoterapeutisk middel er cisplatin, og den foretrukne dosen kan bli valgt av utøveren basert på egenskapene til kreftformen som skal bli behandlet og andre faktorer som rutinemessig blir overveid ved administrering av cisplatin. Fortrinnsvis vil cisplatin bli administrert intravenøst ved en dose på 50-120 mg/m<2>i løpet av 3-6 timer. Mer foretrukket blir det administrert intravenøst ved en dose på 80 mg/m<2>i løpet av 4 timer. Et annet foretrukket kjemoterapeutisk middel er 5-fluoruracil, som ofte blir administrert i kombinasjon med cisplatin. Den foretrukne dosen av 5-fluoruracil er 800-1200 mg/m<2>/dag i 5 påfølgende dager.
Adenovirusterapi ved å anvende adenovirusene ifølge foreliggende oppfinnelse som adenovirusvektor kan også bli kombinert med andre gener som er kjent for å være nyttige ved virusbasert terapi. Se US patentskrift nr. 5 648 478. I slike tilfeller omfatter de kimære adenovirusene ytterligere et heterologt gen som koder for et terapeutisk protein, som er inkorporert i virusgenomet, slik at det heterologe genet blir uttrykt i en infisert celle. Et terapeutisk protein, slik det blir benyttet her, refererer til et protein som vil være forventet å tilveiebringe en terapeutisk fordel når det blir uttrykt i en gitt celle.
I én utførelsesform er det heterologe genet et prolegemiddelaktivatorgen, slik som cytosindeaminase (CD) (se US patentskrift nr. 5 631 236, 5 358 866 og 5 677 178). I andre utførelsesformer er det heterologe genet en kjent induserer av celledød, f.eks. apoptin eller adenovirusdødsprotein (ADP), eller et fusjonsprotein, f.eks. fusogent membranglykoprotein (Danen-Van Oorschot et al. (1997) Proe. Nat. Acad. Sei. 94:5843-5847, Tollefson et al.
(1996) J. Virol. 70:2296-2306, Fu et al. (2003) Mol. Therapy 7: 48-754, 2003, Ahmed et al.
(2003) Gene Therapy 10: 1663-1671, Galanis et al. (2001) Human Gene Therapy 12(7): 811-821).
Ytterligere eksempler på heterologe gener, eller fragmenter derav, inkluderer de som koder for immunmodulatoriske proteiner slik som cytokiner eller kjemokiner. Eksempler inkluderer interleukin-2, US patentskrift nr. 4 738 927 eller 5 641 665, interleukin-7, US patentskrift nr. 4 965 195 eller 5 328 988 og interleukin-12, US patentskrift nr. 5 457 038, tumornekrosefaktor alfa, US patentskrift nr. 4 677 063 eller 5 773 582, interferon-gamma, US patentskrift nr. 4 727 138 eller 4 762 791 eller GM-CSF, US patentskrift nr. 5 393 870 eller 5 391 485, Mackensen et al. (1997) Cytokine Growth Facto r Rev. 8:119-128). Ytterligere immunmodulatoriske proteiner inkluderer ytterligere makrofaginflammatoriske proteiner, inkludert MIP-3. Monocyttkjemotaktisk protein (MCP-3-alfa) kan også bli benyttet, en foretrukket utførelsesform av et heterologt gen er et kimært gen som består av et gen som koder for et protein som traverserer cellemembraner, f.eks. VP22 eller TAT, som er fusjonert til et gen som koder for et protein som fortrinnsvis er toksisk overfor kreft men ikke overfor normale celler.
De kimære adenovirusene ifølge oppfinnelsen kan også bli benyttet som vektorer for å levere gener som koder for terapeutisk nyttige RNA-molekyler, dvs. siRnA (Dorsett og Tuschl (2004) Nature Rev. Drug Dise 3:318-329).
I noen tilfeller kan gener være inkorporert i et kimært adenovirus ifølge oppfinnelsen for ytterligere å forsterke evnen til det onkolytiske viruset i å utrydde tumoren, selv om det ikke har noen direkte påvirkning på tumoren selv - disse inkluderer gener som koder for proteiner som omfatter MHC-klasse-I-presentasjon (Hewitt et al. (2003) Immunology 110: 163-159), blokker komplement, inhiber IFN og IFN-induserte mekanismer, kjemokiner og cytokiner, NK-cellebasert dreping (Orange et al., (2002) Nature Immunol. 3: 1006-1012, Mireille et al. (2002) Immunogenetics 54: 527-542, Alcami (2003) Nature Rev. Immunol. 3: 36-50, nedregulerer immunresponsen (f.eks. IL-10, TGF-beta, Khong og Restifo (2002) Nature Immunol. 3: 999-1005, 2002), og metallproteaser som kan bryte ned den ekstracellulære matriksen og forsterke spredning av viruset inn i tumoren (Bosman og Stamenkovic (2003) J. Pathol. 2000: 423-428, Visse og Nagase (2003) Circulation Res. 92: 827-839).
Sett
Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske påpakninger og sett som omfatter én eller flere beholdere som er fylt med én eller flere av ingrediensene i de tidligere nevnte preparatene ifølge oppfinnelsen. Sammen med slike beholdere kan det foreligge en uttalelse i formen foreskrevet av et myndighetskontor som regulerer fremstillingen, anvendelsen eller salget av farmasøytiske midler eller biologiske produkter, som gjenspeiler godkjenning av myndigheten for fremstillingen, anvendelsen eller salget av produktet til human administrering.
Foreliggende oppfinnelse blir ytterligere beskrevet ved hjelp av de følgende eksemplene, som er illustrative for spesifikke utførelsesformer av oppfinnelsen, og ulike anvendelser derav.
Hvis ikke annet er indikert benytter utøvelsen av foreliggende oppfinnelse konvensjonelle teknikker for celledyrking, molekylær biologi, mikrobiologi, rekombinant DNA-manipulering, immunologivitenskap, som ligger innenfor kunnskapen på fagområdet. Slike teknikker er fullt ut forklart i litteraturen. Se f.eks. Cell Biology: a Laboratory Handbook: J. Celis (red.) Academic Press. N.Y. (1996), Graham, F.L. og Prevec, L. Adenovirus-based expression vectors and recombinant vaccines. I: Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R. W. El lis (red.) Butterworth. sidene 363-390, Grahan og Prevec Manipulation of adenovirus vectors. I: Methods in Molecular Biology, bind 7: Gene Transfer and Expression Techniques. E.J. Murray og J.M. Walker (red.) Humana Press Inc., Clifton, N.J. sidene 109-128, 1991, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook et al. (1989), og Ausubel et al. (1995), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.
EKSEMPLER
Fremgangsmåter
Standardteknikker blir benyttet til rekombinante nukleinsyrefremgangsmåter, polynukleotidsyntese og mikrobedyrking og transformasjon (f.eks. elektroporering, lipofeksjon). Vanligvis blir enzymatiske reaksjoner og rensetrinn utført i overensstemmelse med produsentens spesifikasjoner. Teknikkene og prosedyrene blir vanligvis utført i overensstemmelse med konvensjonelle fremgangsmåter på fagområdet og ulike generelle referanser (se generelt Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), som er tilveiebrakt gjennom hele dette dokumentet. Nomenklaturen som blir benyttet her og laboratorieprosedyrene i analytisk kjemi, organisk syntetisk kjemi og farmasøytisk formulering og levering, og behandling av pasienter. Fremgangsmåte for konstrueringen av adenovirus-mutanter er generelt kjent på fagområdet. Se Mittal, S. K., Virus Res., 1993, bind: 28, sidene 67-90, og Hermiston, T. et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, red., Humana Press, 1999. Adenovirus-5-genomet er registrert som Genbank 10 aksesjonsnummer M73260, og viruset er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA under aksesjonsnummeret VR-5.
Virus og cellelinjer
Ad-serotypene Ad3 (GB-stamme), Ad4 (RI-67-stamme), Ad5 (Adenoid-75-stamme), Ad9 (Hicks-stamme), Adllp (Slobitski-stamme), Adl6 (Ch. 79-stamme) og alle cellelinjene, med unntaket for de følgende ble alle kjøpt fra ATCC: MDA321-mtl (et derivat som er isolert av Dr. Deb Zajchowski fra en raskt voksende subkutant implantert xenograft av MDA231-celler) og Panc-l-sct (avledet av Dr. Sandra Biroc fra en raskt voksende subkutant implantert xenograft av Panc-l-celler), HUVEC (Vec Technologies, Rensselaer, NY), og SAEC (Clonetec, Walkersville, MD). Ad40 var en hyggelig gave fra Dr. William S.M. Wold ved St. Louis University.
Eksempel 1 - Virusrensing og kvantitering
Virusstamløsninger ble propagert på 293-celler og renset på CsCI-gradienter (Hawkins et al., 2001). Fremgangsmåten som ble benyttet for å kvantitere viruspartikler er basert på fremgangsmåten til Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453-465, med det unntaket at anionbytteren TMAE Fractogel ble benyttet istedenfor Resource-Q. Kort fortalt ble en kolonne på 1,25 ml pakket med Fractogel EMD TMAE-650 (S) (katalog nr. 116887-7 EM Science, Gibbstown, NJ 08027). HPLC-separasjon ble utført på en Agilent HP
1100 HPLC ved å benytte de følgende betingelsene: Buffer A = 50 mM HEPES, pH 7,5, buffer B = 1,0 M NaCI i buffer A, strømningshastighet på 1 ml/min. Etter kolonneekvilibrering i ikke mindre enn 30 min. i buffer A ble omtrent 109-10n viruspartikler i prøve påsatt på kolonnen i 10-100^1 volum, etterfulgt av 4 kolonnevolumer med buffer A. En lineær gradient som strakk seg over 16 kolonnevolumer og endte med 100 % buffer B ble påsatt.
Kolonneutslippet ble overvåket ved A260 og A280 nm, topparealet ble beregnet og forholdet mellom 260 og 280 nm ble bestemt. Virustopper ble identifisert som de toppene som hadde et forhold mellom A260/A280 tett på 1,33. En virusstandard ble inkludert sammen med hver prøveserie. Antallet viruspartikler pr. ml av standarden hadde blitt bestemt ved å benytte fremgangsmåten til Lehmberg et al. (1999) J. Chrom. B, 732:411-423). I viruskonsentrasjonsområdet som ble benyttet er A260 nm topparealet til hver prøve direkte proporsjonal med antallet viruspartikler i prøven. Antallet viruspartikler pr. ml i hver testprøve ble beregnet ved å multiplisere det kjente antallet viruspartikler pr. ml i standarden med forholdet mellom virustoppareal i prøven ved A260 med virustopparealet i standarden ved A260.
Kolonnen ble regenerert etter hver prøvegradient ved å vaske med to kolonnevolumer med 0,5 N NaOH etterfulgt av to kolonnevolumer med 100 % buffer-A, tre kolonnevolumer med 100 % buffer-B og deretter fire kolonnevolumer med 100 % buffer-A.
Eksempel 2 - bioseleksjon
Virus-serotyper som representerer undergruppene Ads B-F ble slått sammen og passert på subkonfluente kulturer av måltumorcellelinjene ved et høyt forhold mellom partikkel pr. celle i to runder for å invitere til rekombinasjon mellom serotypene. Supernatant (1,0, 0,1, 0,01, 0,001 ml) fra den andre runden med infeksjon med høyt antall viruspartikler pr. celle, subkonfluente kulturer, ble deretter benyttet for å infisere en serie av overkonfluente T-75-vevskulturflasker med måltumorcellelinjer PC-3, HT-29, Panc-1 og MDA-231. For å oppnå overkonfluens ble hver cellelinje utsådd ved forskjellige forhold som tillot cellelinjen å nå konfluens mellom 24 og 40 timer etter utsåing, og cellene ble tillatt å vokse i totalt 72 timer etter utsåing før infeksjon. Dette ble utført for å maksimalisere konfluensen til cellene for å herme vekstbetingelser i humane faste tumorer.
Cellekultursupernatant ble høstet fra den første flasken i 10-gangers fortynnings-serien som ikke viste noen tegn på CPE på dag 3 eller 4 etter infeksjon (i tilfelle med HT-29 og PC-3 ble dette modifisert for passeringene 10-20 for å høste den andre flasken, dvs. høste 100 ganger under fortynningen der CPE var påvisbart ved dag 3 etter infeksjon). Hver høsting virket som utgangsmateriale for den suksessive passeringen av viruset. Denne prosessen ble gjentatt inntil virussammenslåingen oppnådde 20 bioselektive passeringer.
Individuelle virus fra hver bioselekterte sammenslåing ble isolert ved hjelp av to runder med plakkrensing på A549-celler ved å benytte standardfremgangsmåter (Tollefson, A., Hermiston, T.W., og Wold, W.S.M., "Preparation and Titration of CsCI-banded Adenovirus Stock" i Adenovirus Methods and Protocols, Humana Press, 1999, sidene 1-10, W.S.M. Wold, red.). Kort fortalt ble fortynninger av supernatanten som er høstet fra den tyvende passeringen på hver måltumorcellelinje benyttet til å infisere A549-celler i en standard plakkanalyse. Velavgrensede plakk ble høstet og den samme plakkanalysefremgangsmåte ble benyttet for å generere en andre runde med individuelle plakk fra disse høstingene. Velisolerte plakk fra den andre enden med plakkrensing ble ansett for å være rene, infiserte kulturer ble fremstilt ved å benytte disse rensede plakkene og den onkolytiske potensiteten til disse kultursupernatantene ble bestemt ved hjelp av MTS-analyse som beskrevet.
Eksempel 3 - serotype karakterisering
Moradenovirus-serotypene som omfatter virussammenslåingene eller det isolerte ColoAdl-adenoviruset ble identifisert ved å benytte anionbyttekromatografi tilsvarende til det som er beskrevet i Shabram et al. (1997) Human Gene Therapy 8:453-465, med unntaket av at anionbytteren TMAE Fractogel media (EM Industries, Gibbstown, NJ) ble benyttet istedenfor Resource Q, som beskrevet i eksempel 1 (se fig. 1).
Adenovirus type 5 eluerte ved omtrent 60 % buffer-B i gradienten. De andre serotypene (3, 4, 9,lip, 16, 35 og 40) eluerte hver ved en karakteristisk retensjonstid som er i overensstemmelse med retensjonstidene på Q Sepharose XL publisert av Blanche et al.
(2000) Gene Therapy 7:1055-1062.
Eksempel 4 - cytolytisk analyse
Den lytiske viruskapasiteten ble målt ved å benytte en modifisering av MTT-analysen (Shen et al., 2001). Kort fortalt ble MTS-analysen (Promega, CellTiter 96<®>Aqueous Non- Radioactive Cell Proliferation Assay) benyttet istedenfor MTT-analysen siden konvertering av MTS ved celler inn i vandig løselig formazan reduserer tiden og eliminerer anvendelsen av flyktig organisk løsemiddel som er assosiert med MTT-analysen.
For å utføre analysen ble celler sådd ut ved en definert tetthet for hver tumorcellelinje som genererte et konfluent monolag i løpet av 24 timer. Disse tett utsådde cellene ble tillatt å vokse i 2 ytterligere dager før eksponering overfor testvirus. Infeksjoner av både tumorceller og primære normale celler ble utført i kvadruplikat med tre ganger serie-fortynninger av virusene ved å starte med et forhold med partikkel pr. celle på 100 og avslutte med et forhold med partikkel pr. celle på 0,005. Infiserte celler ble inkubert ved 37 °C og MTS-analyse ble utført ved tidspunktene som er indikert for de individuelle, primære cellene eller tumorcellelinjene. Ikke-infiserte celler virket som negative kontroller og etablerte overlevelsespunktet på 100 % for den gitte analysen.
Eksempel 5 - DNA-sekvensering
DNA-sekvensering av det genomiske Adllp (SEKV. ID nr. 2) og ColoAdl (SEKV. ID nr. 1) DNA ble utført som følger. Kort fortalt ble renset adenovirus-DNA fra ColoAdl og Adllp delvis fordøyd med restriksjonsendonukleasen Sau3Al og shotgun-klonet inn i plasmidvektoren pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA). Positive kloner ble videreført og sekvensert ved å benytte primerne M13R og KS (Stratagene, La Jolla, CA). Individuelle sekvensreaksjoner ble trimmet, editert og sammensatt ved å benytte Sequencher™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan). Åpninger i dekning ble amplifisert med spesiallagde oligonukleotidprimere og sekvensert. Endene på virusgenomene ble sekvensert direkte fra adenovirus-DNA. Totalt ble hvert genom sekvensert med en dekning på 3X+ og 431 baser ved 2X dekning.
For å bestemme opprinnelsen for ColoAdl-E2B-regionen ble to primersett generert, ett til E2B-pTP-genet (bp9115, 5'GGGAGTTTCGCGCGGACACGG3' (SEKV. ID nr. 4) og bp9350, 5'GCGCCGCCGCCGCGGAGAGGT3' (SEKV. ID nr. 5)) og ett for DNA-polymerase-genet (bp 7520 5'CGAGAGCCCATTCGTGCAGGTGAG3' (SEKV. ID nr. 6) og bp 7982, 5'GCTGCGACTACTGCGGCCGTCTGT3' (SEKV. ID nr. 7) og benyttet for å PCR-isolere DNA- fragmenter fra de ulike serotypene (Ad3, 4, 5, 9, lip, 16 og 40) ved å benytte reagenser fra Advantgage 2 PCR kit (Clonetics, Walkersville, MD, kat. nr. K1910-Y) og kjørt på en PTC-200 termosykler fra MJ Research (Watertown MA). Disse fragmentene ble deretter sekvensert sammen med DNA-sekvensen til Ad3 ved å benytte dye terminator sequencing på en ABI 3100 genetisk analysator.
E2B-regionen til Ad3 ble sekvensert ved å benytte isolert Ad3-DNA og overlappende primere.
Sekvensinformasjon ble analysert ved å benytte vektor NTI-programmet (Informatix).
Eksempel 6 - konstruksjon av rekombinante virus
Genomisk DNA for ADllp (SEKV. ID nr. 2) og ColoAdl (SEKV. ID nr. 1) ble renset fra CsCI-gradientbåndede viruspartikler. De genomiske DNA ble fordøyd med PacI som hvert kutter kun én gang i virusgenomet. Pacl-kutt forekommer ved base 18141 på ColoAdl-nukleotidsekvens (SEKV. ID nr. 1) og på base 18140 på Adll-nukleotidsekvensen (SEKV. ID nr. 2). Fordøyde DNA ble blandet i like mengder og ligert i nærvær av T4-DNA-ligase ved 16°C over natt. Denne ligeringsblandingen ble transfektert inn i A549-celler ved å benytte CaP04-transfeksjonssettet fra Invitrogen, Carlsbad, CA (kat. nr. K2780-01). Isolerte plakk ble plukket og screenet ved restriksjonsenzymfordøying og PCR-analyse for å skille de fire viruspopulasjonene (Adllp, ColoAdl, venstre ende Adllp/høyre ende ColoAdl (ColoAdl.1) og venstre ende ColoAdl/høyre ende Adllp (ColoAdl.2)).
Den lytiske viruskapasiteten for hver populasjon ble bestemt i flere cellelinjer, inkludert HT29- og HUVEC-cellelinjer, som beskrevet i eksempel 3. Resultatene viste rekkefølgen av potensitet, fra minst potent til mest potent, som Adllp, ColoAdl.2, ColoAdl.1, ColoAdl (se fig. 7 for resultatene i HT29-celler).
Også konstruert ble kimære adenovirus pCJ144 og pCJ146, som inneholder fullengde-ColoAdl-genomet der villtype-Adllp-E3- og E4-regionen, henholdsvis har blitt gjenopprettet. Disse modifiseringene ble introdusert ved homolog rekombinasjon inni BJ5183-E. coli (Chartier et al. (1996) J. Virol. 70:4805-4810). Begge disse kimære adenovirusene viste redusert lytisk kapasitet i HT29- og HUVEC-celler sammenlignet med ColoAdl eller ColoAdl.2.
Eksempel 7 - In vivo-effektivitet for adenovirus
I et typisk humant tumor xenograft nakenmus eksperiment ble dyr injisert med 5 x IO<6>celler subkutant i bakre flanke av musen. Når tumorene nådde en størrelse på 100-200^1 blir de injisert med vehikkel (PBS) eller med virus ved 2 x 10<10>partikler i fem påfølgende dager (1 x 10<11>partikler totalt). En reduksjon i størrelsen for tumoren vil bli bemerket relativt i forhold til PBS-kontrollen og ytterligere kontrollvirus (Ad4, ONYX-015).
Eksempel 8 - ColoAdl-selektivitet på primære, humane vevseksplantater
Vevsprøver fra kolorektale tumorer og tilliggende normale vev som er fjernet ved
kirurgi ble plassert i kulturmedium og infisert med likt antall med enten ColoAdl- eller Ad5-virus. Kultursupernatanter ble samlet ved 24 timer etter infeksjon og antallet viruspartikler som var produsert ble bestemt. ColoAdl produserte flere viruspartikler pr. innsatt partikkel enn Ad5 på tumorvev, mens den produserte færre partikler pr. innsatt partikkel enn Ad5 på normalt vev.

Claims (25)

1. Rekombinant kimært adenovirus, som har et genom som omfatter en E2B-regionkarakterisert vedat nevnte E2B-region omfatter en nukleinsyresekvens som er avledet fra en første adenovirus-serotype og en nukleinsyresekvens som er avledet fra en andre adenovirus-serotype, der nevnte første og andre serotyper hver er valgt fra adenovirusundergruppene B, C, D, E eller F og som er forskjellig fra hverandre, og der nevnte kimære adenovirus er onkolytisk og viser en forbedret terapeutisk indeks for en tumorcelle.
2. Adenovirus ifølge krav 1, hvor det ytterligere omfatter regioner som koder for fiber-, hekson- og pentonproteiner, der nukleinsyren som koder for fiber-, hekson- og penton-proteinene i nevnte adenovirus er fra den samme adenovirus-serotypen.
3. Adenovirus ifølge krav 1 eller 2, hvor det ytterligere omfatter en modifisert E3-region eller ytterliger omfatter en modifisert E4-region
4. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, hvor nevnte tumorcelle er en kolon-, bryst-, pankreas-, lunge-, prostata-, ovarie- eller hemopoietisk tumorcelle.
5. Adenovirus ifølge krav 4, hvor nevnte tumorcelle er en kolontumorcelle.
6. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor nukleotidsekvensen til E2B-regionen i nevnte adenovirus omfatter SEKV. ID nr. 3.
7. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor nukleotidsekvensen til nevnte adenovirus omfatter SEKV. ID nr. 1.
8. Rekombinant kimært adenovirus som har et genom som omfatter en E2B-region,karakterisert vedat nevnte E2B-region omfatter en nukleinsyresekvens som er avledet fra en første adenovirus-serotype og en nukleinsyresekvens som er avledet fra en andre adenovirus-serotype, der nevnte første og andre adenovirus-serotype hver er valgt fra adenovirus-undergruppene B, C, D, E eller F og er forskjellig fra hverandre, der nevnte kimære adenovirus er onkolytisk og viser en forbedret terapeutisk indeks for en tumorcelle, og der nevnte kimære adenovirus har blitt gjort replikasjonsmanglende via delesjon av én eller flere adenovirusregioner som koder for proteiner som er involvert i adenovirus-replikasjon som er valgt fra gruppen som består av El, E2, E3 eller E4.
9. Replikasjonsmanglende adenovirus ifølge krav 8, hvor El- og E3-regionen har blitt fjernet.
10. Replikasjonsmanglende adenovirus ifølge krav 9, hvor det ytterligere omfatter en delesjon av E4-regionen.
11. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det ytterligere omfatter et heterologt gen, der nevnte heterologe gen blir uttrykt i en celle som er infisert med nevnte adenovirus.
12. Adenovirus ifølge krav 11, hvor det heterologe gen er tymidinkinase.
13. Adenovirus ifølge krav 11, hvor nevnte heterologe gen koder for et terapeutisk protein som er valgt fra gruppen som består av cytokiner og kjemokiner, antistoffer, prolegemiddelkonverterende enzymer og immunregulatoriske proteiner.
14. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 for anvendelse i terapi.
15. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 for anvendelse i behandlingen av neoplastisk sykdom eller kreft, eller for inhibering av veksten av en kreftcelle.
16. Fremgangsmåte for å inhibere vekst av en kreftcelle, karakterisert vedat den omfatter å infisere nevnte kreftcelle in vitro med adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13.
17. Adenovirus ifølge krav 15 eller fremgangsmåten ifølge krav 16, hvor nevnte kreftcelle er en kolon kreftcelle.
18. Adenovirus eller fremgangsmåten ifølge krav 17, hvor nukleotidsekvensen i nevnte adenovirus omfatter SEKV. ID nr. 1.
19. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13 for anvendelse for levering av et terapeutisk protein til en celle.
20. Fremgangsmåte for isolering av adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert vedat nevnte fremgangsmåte omfatter å: a) slå sammen adenovirus-serotyper som representerer adenovirus-undergruppene B-F, for derved å danne en adenovirusblanding, b) passere den sammenslåtte adenovirusblandingen fra trinn (a) på en aktivt voksende kultur av tumorceller ved et forhold med partikkel pr. celle som er høyt nok til å frembringe rekombinasjon mellom serotyper, men ikke så høyt at det fremprovoseres prematur celledød, c) høste supernatanten fra trinn (b), d) infisere en hvilende kultur med tumorceller med supernatanten som er høstet i trinn (c), e) høste cellekultursupernatanten fra trinn (d) før ethvert tegn på CPE, f) infisere en hvilende kultur av tumorceller med supernatanten som er høstet i trinn (e), og g) isolere virus ifølge krav 1 fra supernatanten som er høstet i trinn (f) ved hjelp av plakkrensing.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, hvor trinn (b) blir utført to ganger før supernatanten i trinn (c) blir høstet.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 20, hvor trinnene (e) og (f) blir gjentatt opptil 20 ganger før trinn (g).
23. Fremgangsmåte ifølge krav 20, hvor en andre runde med plakkrensing blir utført etter trinn (g).
24. Fremgangsmåte ifølge krav 20, hvor tumorcellen er en kolon-, bryst-, pankreas-, lunge-, prostata-, ovarie- eller hemopoietisk tumorcelle.
25. Rekombinant kimært adenovirus, som har et genom som omfatter en E2B-region,karakterisert vedat nevnte E2B-region omfatter en nukleinsyresekvens som er avledet fra en første adenovirus-serotype og en nukleinsyresekvens som er avledet fra en andre adenovirus-serotype, der nevnte første og andre adenovirus-serotyper hver er valgt fra adenovirus-undergruppene B, C, D, E eller F og som er forskjellig fra hverandre og der nevnte kimære adenovirus er onkolytisk og viser en forbedret terapeutisk indeks for en tumorcelle, som er fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 20 til 24.
NO20066002A 2004-05-26 2006-12-22 Rekombinant kimært adenovirus, replikasjonsmanglende variant derav, fremgangsmåte for isolering av adenoviruset, anvendelse derav i terapi, samt fremgangsmåte for å inhibere vekst av en kreftcelle. NO340708B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57485104P 2004-05-26 2004-05-26
PCT/US2005/018301 WO2005118825A2 (en) 2004-05-26 2005-05-24 Chimeric adenoviruses for use in cancer treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20066002L NO20066002L (no) 2006-12-22
NO340708B1 true NO340708B1 (no) 2017-06-06

Family

ID=35355425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20066002A NO340708B1 (no) 2004-05-26 2006-12-22 Rekombinant kimært adenovirus, replikasjonsmanglende variant derav, fremgangsmåte for isolering av adenoviruset, anvendelse derav i terapi, samt fremgangsmåte for å inhibere vekst av en kreftcelle.

Country Status (33)

Country Link
US (6) US7510868B2 (no)
EP (1) EP1749098B1 (no)
JP (1) JP4787936B2 (no)
KR (1) KR101169109B1 (no)
CN (3) CN1997746B (no)
AR (2) AR049188A1 (no)
AT (1) ATE491799T1 (no)
AU (1) AU2005250396B2 (no)
BR (2) BRPI0510475B8 (no)
CA (2) CA2836987C (no)
CR (1) CR8794A (no)
DE (1) DE602005025340D1 (no)
DK (1) DK1749098T3 (no)
EC (1) ECSP067088A (no)
ES (1) ES2358204T3 (no)
GT (1) GT200500129A (no)
HK (3) HK1109421A1 (no)
HR (1) HRP20110179T1 (no)
IL (2) IL179098A (no)
MX (1) MXPA06013570A (no)
MY (1) MY140829A (no)
NO (1) NO340708B1 (no)
NZ (1) NZ551443A (no)
PA (1) PA8634201A1 (no)
PE (1) PE20060277A1 (no)
PL (1) PL1749098T3 (no)
PT (1) PT1749098E (no)
RU (1) RU2448157C2 (no)
TW (1) TWI366603B (no)
UA (1) UA89957C2 (no)
UY (1) UY28926A1 (no)
WO (1) WO2005118825A2 (no)
ZA (1) ZA200610763B (no)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ551443A (en) * 2004-05-26 2010-01-29 Schering Ag Chimeric adenoviruses for use in cancer treatment
US20070258952A1 (en) * 2006-05-04 2007-11-08 Baylor Research Institute Anti-Tumor Activity of an Oncolytic Adenovirus-Delivered Oncogene siRNA
WO2008108890A2 (en) * 2006-10-18 2008-09-12 University Of Rochester Conditionally replicating viruses for cancer therapy
WO2008060510A2 (en) * 2006-11-13 2008-05-22 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger nuclease for targeting the human glucocorticoid receptor locus
WO2008080003A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of oncolytic adenoviruses and uses thereof
KR100856310B1 (ko) 2007-02-28 2008-09-03 삼성전기주식회사 이동통신 단말기
GB201022007D0 (en) 2010-12-24 2011-02-02 Imp Innovations Ltd DNA-sensor
AU2013231423B2 (en) * 2012-03-12 2018-10-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
CN104334188B (zh) * 2012-03-22 2016-08-24 克鲁塞尔荷兰公司 抗rsv疫苗
WO2014131898A1 (en) * 2013-02-28 2014-09-04 Psioxus Therapuetics Limited A process for the production of adenovirus
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
CN112516179A (zh) 2013-06-14 2021-03-19 普赛奥克苏斯治疗公司 用于b型腺病毒的给药方案及制剂
GB201322851D0 (en) * 2013-12-23 2014-02-12 Psioxus Therapeutics Ltd Method
LT3021859T (lt) * 2013-10-25 2018-06-11 Psioxus Therapeutics Limited Onkolitiniai adenovirusai su heterologiniais genais
GB2531821A (en) * 2013-10-25 2016-05-04 Psioxus Therapeutics Ltd Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
GB201415579D0 (en) 2014-09-03 2014-10-15 Psioxus Therapeutics Ltd A process
MA39818A (fr) 2014-03-30 2017-02-08 Benevir Biopharm Inc Virus oncolytiques « armés » comprenant un inhibiteur de tap exogène et leurs utilisations thérapeutiques
GB201406608D0 (en) 2014-04-12 2014-05-28 Psioxus Therapeutics Ltd Virus
GB201510197D0 (en) 2014-06-12 2015-07-29 Psioxus Therapeutics Ltd Method of treating ovarian cancer
US20170313990A1 (en) 2014-08-27 2017-11-02 Psioxus Therapeutics Limited A process for the production of adenovirus
EP3391892A1 (en) * 2015-04-30 2018-10-24 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding a b7 protein
JP7064437B2 (ja) 2015-12-17 2022-05-10 サイオクサス セラピューティクス リミテッド 抗ｔｃｒ複合体抗体又は断片をコードするｂ群アデノウイルス
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
KR102471633B1 (ko) 2016-02-23 2022-11-25 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈 바이러스 동역학에 미치는 영향 최소화를 위한 치료용 아데노바이러스의 외인성 유전자 발현
US11273170B2 (en) * 2016-07-25 2022-03-15 Ascend Biopharmaceuticals Ltd Methods of treating cancer
EP3503918B1 (en) 2016-08-29 2020-09-30 Psioxus Therapeutics Limited Adenovirus armed with bispecific t cell engager (bite)
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
WO2018083257A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding transgenes
WO2018083258A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenovirus encoding at least three transgenes
CN110062630A (zh) 2016-12-12 2019-07-26 萨克生物研究学院 肿瘤靶向合成腺病毒及其用途
BR112019024918A2 (pt) 2017-06-01 2020-06-23 Psioxus Therapeutics Limited Vírus oncolítico e método
EP3679128A1 (en) 2017-09-05 2020-07-15 GLAdiator Biosciences, Inc. Method of targeting exosomes
GB201801614D0 (en) 2018-01-31 2018-03-14 Psioxus Therapeutics Ltd Formulation
KR20210093303A (ko) 2018-11-21 2021-07-27 메이오 파운데이션 포 메디칼 에쥬케이션 앤드 리써치 아데노바이러스 및 아데노바이러스의 사용 방법
JP7381604B2 (ja) 2019-04-29 2023-11-15 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 癌を治療するための多価ｐｄ－ｌ１結合化合物
GB201909081D0 (en) 2019-06-25 2019-08-07 Psioxus Therapeutics Ltd Method
CA3207359A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Cecile Chartier-Courtaud Adjuvant therapy for cancer
GB202102049D0 (en) 2021-02-13 2021-03-31 Psioxus Therapeutics Ltd Viruses

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5358866A (en) 1991-07-03 1994-10-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cytosine deaminase negative selection system for gene transfer techniques and therapies
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
FR2705361B1 (fr) 1993-05-18 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
DK0667912T3 (da) 1993-07-13 2008-11-10 Centelion Defekte adenovirusvektorer og anvendelse heraf i genterapi
US5631236A (en) 1993-08-26 1997-05-20 Baylor College Of Medicine Gene therapy for solid tumors, using a DNA sequence encoding HSV-Tk or VZV-Tk
US5830686A (en) 1994-01-13 1998-11-03 Calydon Tissue-specific enhancer active in prostate
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
US5877011A (en) * 1996-11-20 1999-03-02 Genzyme Corporation Chimeric adenoviral vectors
CN1242051A (zh) 1996-12-31 2000-01-19 昂尼克斯药物公司 用于肿瘤治疗和预防的致细胞病变病毒
EP1036183B1 (en) 1997-02-20 2007-10-03 The Johns Hopkins University School Of Medicine Mutations in atp-dependent transposition proteins that reduce target-site specificity
US6291214B1 (en) 1998-05-11 2001-09-18 Glaxo Wellcome Inc. System for generating recombinant viruses
US20020019051A1 (en) * 1998-05-27 2002-02-14 Monika Lusky Chimeric adenoviral vectors
US20030017138A1 (en) 1998-07-08 2003-01-23 Menzo Havenga Chimeric adenoviruses
CN1110553C (zh) 1998-07-15 2003-06-04 杭州赛狮生物技术开发有限公司 基因工程腺病毒及其用途
WO2000070071A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Crucell Holland B.V. Adenovirus derived gene delivery vehicles comprising at least one element of adenovirus type 35
EP1083228A1 (en) * 1999-09-10 2001-03-14 Introgene B.V. Modified adenoviral vectors for use in gene therapy
US7396679B2 (en) 1999-11-15 2008-07-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Oncolytic adenovirus
EP1301612A2 (en) 2000-05-31 2003-04-16 Genvec, Inc. Method and composition for targeting an adenoviral vector
ATE449859T1 (de) * 2001-01-04 2009-12-15 Goeran Wadell Virusvektor zur gentherapie
AU2003223775A1 (en) 2002-04-30 2003-11-17 Duke University Adeno-associated viral vectors and methods for their production from hybrid adenovirus and for their use
CN1327899C (zh) * 2003-05-10 2007-07-25 彭朝晖 腺病毒载体与p53基因的基因重组体的应用
NZ551443A (en) 2004-05-26 2010-01-29 Schering Ag Chimeric adenoviruses for use in cancer treatment
EP1819823A2 (en) 2004-12-01 2007-08-22 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of replication competent viruses for therapeutic use
WO2008080003A2 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of oncolytic adenoviruses and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HERMISTON T.W. og KUHN I., Armed therapeutic viruses: Strategies and Challenges to arming oncolytic viruses with therapeutic genes, Cancer Gene Therapy, 2002, vol. 9 (12), side 1022-1035, Dated: 01.01.0001 *
YAN W. et al, Developing Novel Oncolytic Adenoviruses through Bioselection, Journal of Virology, 2003, vol. 77 (4), side 2640-2650, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20120231524A1 (en) 2012-09-13
IL226820A (en) 2017-07-31
UA89957C2 (ru) 2010-03-25
ZA200610763B (en) 2009-06-24
IL179098A (en) 2015-09-24
BR122013008865B8 (pt) 2021-05-25
NO20066002L (no) 2006-12-22
US20130209409A1 (en) 2013-08-15
MXPA06013570A (es) 2007-02-08
US20130230902A2 (en) 2013-09-05
ES2358204T3 (es) 2011-05-06
JP4787936B2 (ja) 2011-10-05
JP2008500051A (ja) 2008-01-10
US20150037874A1 (en) 2015-02-05
CA2567094C (en) 2014-11-25
MY140829A (en) 2010-01-29
GT200500129A (es) 2006-03-23
HK1179655A1 (en) 2013-10-04
UY28926A1 (es) 2006-01-31
BRPI0510475B8 (pt) 2021-05-25
ECSP067088A (es) 2007-01-26
US7510868B2 (en) 2009-03-31
AU2005250396B2 (en) 2010-11-11
BR122013008865B1 (pt) 2020-11-24
WO2005118825A3 (en) 2006-11-23
PT1749098E (pt) 2011-02-02
US20090227000A1 (en) 2009-09-10
US20050265973A1 (en) 2005-12-01
TW200611974A (en) 2006-04-16
US8765463B2 (en) 2014-07-01
HK1109421A1 (en) 2008-06-06
BRPI0510475A (pt) 2007-11-06
CN102816742A (zh) 2012-12-12
BRPI0510475B1 (pt) 2020-09-29
CN104263703A (zh) 2015-01-07
CN102816742B (zh) 2014-04-09
CR8794A (es) 2007-08-28
US8158599B2 (en) 2012-04-17
KR101169109B1 (ko) 2012-07-26
CN1997746A (zh) 2007-07-11
RU2448157C2 (ru) 2012-04-20
HK1205529A1 (en) 2015-12-18
CN1997746B (zh) 2012-09-26
CA2836987A1 (en) 2005-12-15
US9034344B2 (en) 2015-05-19
PA8634201A1 (es) 2006-11-09
TWI366603B (en) 2012-06-21
RU2006145071A (ru) 2008-07-10
US9115337B2 (en) 2015-08-25
EP1749098A2 (en) 2007-02-07
CN104263703B9 (zh) 2019-12-17
US9234185B2 (en) 2016-01-12
CN104263703B (zh) 2018-01-09
DE602005025340D1 (de) 2011-01-27
HRP20110179T1 (hr) 2011-04-30
US20130217095A1 (en) 2013-08-22
KR20070020302A (ko) 2007-02-20
PE20060277A1 (es) 2006-05-25
ATE491799T1 (de) 2011-01-15
AR090647A2 (es) 2014-11-26
WO2005118825A2 (en) 2005-12-15
DK1749098T3 (da) 2011-04-04
AR049188A1 (es) 2006-07-05
CA2836987C (en) 2016-07-05
CA2567094A1 (en) 2005-12-15
IL226820A0 (en) 2013-07-31
IL179098A0 (en) 2007-03-08
EP1749098B1 (en) 2010-12-15
NZ551443A (en) 2010-01-29
AU2005250396A1 (en) 2005-12-15
PL1749098T3 (pl) 2011-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9234185B2 (en) Chimeric adenoviruses for use in cancer treatment
US8216819B2 (en) Generation of oncolytic adenoviruses and uses thereof
KR20160145825A (ko) 알부민-결합 모이어티를 포함하는 아데노바이러스
HUE026386T2 (en) Tumor-selective adenovirus E1A and E1B mutants
Ugai et al. Thermostability/infectivity defect caused by deletion of the core protein V gene in human adenovirus type 5 is rescued by thermo-selectable mutations in the core protein X precursor
JP4955397B2 (ja) 腫瘍崩壊性のアデノウイルス
AU781775B2 (en) Adenoviral vectors for treating disease

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: PSIOXUS THERAPEUTICS LTD., GB