PT1648509E

PT1648509E - Anticorpos neutralizantes anti-ngf humanos como inibidores selectivos da via de ngf

Info

Publication number: PT1648509E
Application number: PT04778409T
Authority: PT
Inventors: Frank Martin; Haichun Huang; Kenneth D Wild; James J S Treanor; Heather Inoue; Tie J Zhang
Original assignee: Amgen Inc; Medarex Inc
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2012-10-18
Also published as: MXPA06000583A; DK1648509T3; JP2015042670A; TW201534621A; GEP20104887B; CN102408483B; TW201311721A; TNSN06010A1; SI1648509T1; GEP20146050B; US20160237147A1; EA030259B1; IL214280A0; AU2010202177B2; HRP20060033A2; TW200513468A; AR045056A1; JP2007537703A; PL1648509T3; MA27952A1

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS NEUTRALIZANTES ANTI-NGF HUMANOS COMO INIBIDORES SELECTIVOS DA VIA DE NGF"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a anticorpos monoclonais humanos que se ligam ao factor de crescimento nervoso (NGF). Também são descritas composições e métodos para tratamento da dor e distúrbios relacionados com a dor.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Todos os dias, mais de dois milhões de pessoas nos Estados Unidos ficam incapacitadas pela dor crónica (Jessell e Kelly, 1991, "Pain and Analgesia" in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3a Ed., (Kandel, Schwartz e Jessell, ed.), Elsevier, Nova Iorque). Infelizmente, os tratamentos actuais para a dor são apenas parcialmente eficazes e muitos destes tratamentos causam, eles mesmos, efeitos secundários debilitantes ou perigosos. Por exemplo, embora os fármacos anti-inflamatórios não-esteróides ("NSAID"), tais como aspirina, ibuprofeno e indometacina, sejam moderadamente eficazes contra a dor inflamatória, também são toxinas renais e doses elevadas tendem a causar irritação gastrointestinal, ulceração, hemorragia e confusão mental. Os doentes tratados com opióides também sentem, frequentemente, confusão e a utilização opióide prolongada está associada a tolerância e dependência. Os anestésicos locais, tais como 1 lidocaína e mexiletina, inibem, simultaneamente, a dor e causam perda de sensação normal. A dor é uma percepção baseada em sinais recebidos do ambiente e transmitidos e interpretados pelo sistema nervoso (para revisão, ver Millan, 1999, Prog. Neurobiol. 5_7:1-164). Os estímulos nocivos, tais como calor e tacto, fazem com que receptores sensoriais especializados na pele enviem sinais ao sistema nervoso central ("SNC"). Este processo é denominado nocicepção e os neurónios sensoriais periféricos que o medeiam são nociceptores. Dependendo da intensidade do sinal do(s) nociceptor(es) e da abstracção e elaboração desse sinal pelo SNC, uma pessoa pode ou não sentir um estímulo nocivo como doloroso. Quando a percepção da dor por alquém está apropriadamente calibrada para a intensidade do estímulo, a dor serve a sua função protectora pretendida. Contudo, determinados tipos de lesão tecidular causam um fenómeno, conhecido como hiperalgesia ou pronocicepção, no qual estímulos relativamente inócuos são sentidos como intensamente dolorosos, por os limiares de dor da pessoa terem sido diminuídos. A inflamação e a lesão nervosa podem induzir a hiperalgesia. As pessoas acometidas com estados inflamatórios, tais como queimadura solar, osteoartrite, colite, cardite, dermatite, miosite, nevrite, doenças vasculares de colagénio (que incluem artrite reumatóide e lúpus) e semelhantes, sentem, frequentemente, sensações de dor melhoradas. De modo semelhante, trauma, cirurgia, amputação, abcesso, causalgia, doenças vasculares de colagénio, doenças desmielinizantes, nevralgia trigeminal, cancro, alcoolismo crónico, AVC, síndrome de dor talâmica, diabetes, infecções por herpes, síndrome de imunodeficiência adquirida ("SIDA"), toxinas e quimioterapia, causam lesões nervosas que resultam em dor excessiva. 2 À medida que os mecanismos pelos quais os nociceptores transduzem sinais externos sob condições normais e hiperalgésicas se tornam mais bem compreendidos, os processos implicados na hiperalgesia podem ser direccionados para inibir a diminuição do limiar de dor e, desse modo, diminuir a quantidade de dor sentida.

Mostrou-se que os factores neurotróficos desempenham papéis significativos na transmissão da dor fisiológica e patológica. 0 factor de crescimento nervoso (NGF) parece ser particularmente importante (para revisão, ver McMahon, 1996, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351:431-40,· e Apfel, 2000, The Clinicai Journal of Pain 1_6:S7-S11). Mostrou-se que a administração local e sistémica de NGF deduz hiperalgesia e alodinia (Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6_: 1903-1912) . A infusão intravenosa de NGF em humanos produz uma mialgia de todo o corpo, enquanto a administração local evoca hiperalgesia e alodinia de sitio de injecção, além dos efeitos sistémicos (Apfel et al., 1998, Neurology 5_1:695-702) . Também existe um considerável conjunto de indícios implicando o NGF endógeno, em condições nas quais a dor é uma característica proeminente. Por exemplo, o NGF está regulado positivamente em células de Schwann de gânglios das raízes dorsais (DRG) durante, pelo menos, 2 meses após lesão de nervo periférico e foram referidos níveis aumentados nas articulações de animais sofrendo de uma variedade de modelos de artrite (e. g., Aloe et al., 1993, Growth Factors 9_:149-155). Em humanos, os níveis de NGF estão elevados no fluido sinovial de doentes com artrite reumatóide ou outros tipos de artrite (e. g., Aloe et al., 1992, Arthritis and Rheumatism 35:351-355). Além disso, foi demonstrado que o antagonismo da função de NGF previne a hiperalgesia e alodinia em modelos de dor inflamatória neuropática e crónica. Por exemplo, em modelos animais de dor 3 neuropática (e. g., laqueação de tronco nervoso ou nervo espinal), a injecção sistémica de anticorpos neutralizantes para NGF previne a alodinia e hiperalgesia (Ramer et al., 1999, Eur. J. Neurosci. 11:837-846; e Ro et al., 1999, Pain 79:265-274). Os exemplos de anticorpos anti-NGF conhecidos na técnica incluem, por exemplo, as Publicações PCT N° WO 01/78698, WO 01/64247, WO 02/096458 e WO 2004/032870; Patentes US N° 5844092, 5877016 e 6153189; Hongo et al., 2000, Hybrldoma _19_:215-227; Hongo et al., 1993, Cell. Mol. Biol. _13_: 559-568; e Acessos GenBank N° U39608, U39609, LI7078 ou L17077.

Claramente, há uma necessidade de tratamentos novos e eficazes para a dor, particularmente, visando mediadores ou exacerbadores de moléculas pequenas da dor, tal como NGF.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a novos anticorpos monoclonais humanos que são terapeuticamente úteis para a gestão da dor. Especificamente, a invenção refere-se a anticorpos monoclonais que se ligam ao factor de crescimento nervoso (NGF). Os anticorpos monoclonais são anticorpos monoclonais humanos e neutralizam actividades biológicas do NGF e são úteis para o melhoramento dos efeitos das respostas de dor mediadas por NGF. A invenção também se refere a células que produzem e, de um modo muito preferido, segregam para dentro dos meios de cultura celular, os anticorpos monoclonais da invenção. Além da sua utilização para o tratamento e gestão da dor, os anticorpos da invenção são úteis para o tratamento de respostas neuropáticas e inflamatórias relacionadas com a dor. 4 A invenção é definida pelas reivindicações.

Sao aspectos da invenção: 1. Um anticorpo humano isolado ou seu fragmento de ligação do antigénio que se liga especificamente a NGF, compreendendo: a) regiões de estrutura de cadeia pesada humana, uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo CDR1 (SEQ ID N°: 22), CDR2 (SEQ ID N°: 18) e CDR3 (SEQ ID N°: 14) da SEQ ID N°: 10; e b) regiões de estrutura de cadeia leve humana, uma região variável de cadeia leve humana compreendendo CDR1 (SEQ ID N°: 24), CDR2 (SEQ ID N°: 20) e CDR3 (SEQ ID N°: 16) da SEQ ID N°: 12. 2. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°: 10 e a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve da SEQ ID N°: 12. 3. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável e uma região constante, em que a região variável compreende a SEQ ID N°: 10. 4. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 1, em que a cadeia leve compreende uma região variável e uma região constante, em que a região variável compreende a SEQ ID N°: 12 . 5 5. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligaçao do antigénio do item 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 44. 6. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo as SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42 ou SEQ ID N°: 43. 7. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 44 e uma cadeia pesada compreendendo as SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42 ou SEQ ID N°: 43. 8. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 7, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 44 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 40. 9. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer dos itens 1-8, em que o anticorpo ou fragmento de ligação do antigénio se dissocia de um polipéptido de NGF humano, com uma KD de 4 x 10~12 M. 10. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer dos itens 1-8, em que o anticorpo ou fragmento de ligação do antigénio neutraliza a indução de NGF humano da expressão do receptor-1 vanilóide (VR1) em neurónios DRG, com uma IC50 de 0,5 x 10“9 M. 6 11. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer um dos itens 1 a 10, em que a cadeia pesada e a cadeia leve estão ligadas por um ligante flexível para formar um anticorpo de cadeia única. 12. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio do item 11, que é um anticorpo Fv de cadeia única. 13. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer um dos itens 1 a 10, que é a) um anticorpo Fab; b) um anticorpo Fab'; ou c) um anticorpo (Fab')2. 14. Uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer um dos itens 1 a 13. 15. Um método para detecçao de NGF numa amostra biológica compreendendo: a) colocação em contacto da amostra com o anticorpo de qualquer um dos itens 1 a 13, sob condições que permitem a ligação do anticorpo a NGF; e b) medição do nível de anticorpo ligado na amostra. 16. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer um dos itens 1 a 13. 7 17. A molécula de ácido nucleico do item 16, em que a molécula de ácido nucleico compreende: a) SEQ ID N°: 9; e SEQ ID N°: 11; ou b) SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 13; e SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 15. 18. Uma célula hospedeira isolada compreendendo o ácido nucleico de acordo com o item 16 ou 17. 19. Uma linha celular isolada que produz o anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de acordo com qualquer um dos itens 1 a 13. 20. O anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer um dos itens 1 a 13 ou sais f armaceuticamente aceitáveis do anticorpo ou do seu fragmento de ligação do antigénio para utilização no tratamento de um distúrbio ou estado doloroso, causado por expressão aumentada de NGF ou sensibilidade aumentada a NGF, em que o distúrbio ou estado é dor aguda, dor dentária, dor traumática, dor cirúrgica ou dor resultando de: amputação ou abcesso, causalgia, doenças desmielinizantes, nevralgia trigeminal, cancro, alcoolismo crónico, AVC, sindrome talâmica, diabetes, sindrome de imunodeficiência adquirida ("SIDA"), toxinas, quimioterapia, cefaleia genérica, enxaqueca, cefaleia histaminica, sindromes vasculares mistas ou não vasculares, cefaleia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, fibromialgia, distúrbios inflamatórios intestinais, sindrome intestinal irritável, distúrbios oculares inflamatórios, distúrbios inflamatórios ou instáveis da bexiga, psoríase, queixas cutâneas com 8 componentes inflamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, nevrite, doenças vasculares de colagénio, estados inflamatórios crónicos, inflamação e hiperalgesia e alodínia associadas, neuropatia e hiperalgesia ou alodínia associadas, neuropatia diabética, síndromes de desaferentação, asma, lesão ou disfunção de tecido epitelial, herpes simplex, perturbações da motilidade visceral em regiões respiratórias, geniturinárias, gastrointestinais ou vasculares, feridas, queimaduras, reacções alérgicas da pele, prurite, vitiligo, distúrbios gastrointestinais genéricos, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite vasomotora ou alérgica ou distúrbios brônquicos, dismenorreia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite ou visceralgia. 21. Utilização de uma quantidade famaceuticamente eficaz do anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer um dos itens 1 a 13, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou estado doloroso, causado por expressão aumentada de NGF ou sensibilidade aumentada a NGF, em que o distúrbio ou estado é dor aguda, dor dentária, dor traumática, dor cirúrgica ou dor resultando de: amputação ou abcesso, causalgia, doenças desmielinizantes, nevralgia trigeminal, cancro, alcoolismo crónico, AVC, síndrome talâmica, diabetes, síndrome de imunodeficiência adquirida ("SIDA"), toxinas, quimioterapia, cefaleia genérica, enxaqueca, cefaleia histamínica, síndromes vasculares mistas ou não vasculares, cefaleia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, fibromialgia, distúrbios inflamatórios intestinais, síndrome intestinal irritável, distúrbios oculares inflamatórios, distúrbios inflamatórios 9 ou instáveis da bexiga, psoríase, queixas cutâneas com componentes inflamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, nevrite, doenças vasculares de colagénio, estados inflamatórios crónicos, inflamação e hiperalgesia e alodinia associadas, neuropatia e hiperalgesia ou alodinia associadas, neuropatia diabética, síndromes de desaferentação, asma, lesão ou disfunção de tecido epitelial, herpes simplex, perturbações da motilidade visceral em regiões respiratórias, geniturinárias, gastrointestinais ou vasculares, feridas, queimaduras, reacções alérgicas da pele, prurite, vitiligo, distúrbios gastrointestinais genéricos, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite vasomotora ou alérgica ou distúrbios brônquicos, dismenorreia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite ou visceralgia. A invenção proporciona, ainda, proteínas de fusão compreendendo a sequência de uma região Fc de anticorpo e uma ou mais sequências identificadas como SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12, SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 16, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 20, SEQ ID N° : 22. Essas moléculas podem ser preparadas utilizando métodos como descrito, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional, Publicação N° WO 00/24782. Essas moléculas podem ser expressas, por exemplo, em células de mamífero (e. g., células de Ovário de Hámster Chinês) ou células bacterianas (e. g., células de E. coli).

Em determinados aspectos, os anticorpos da invenção, de um modo preferido, anticorpos monoclonais, de um modo muito preferido, anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos, compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como exposta nas 10 SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 6 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional e a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 10 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. De um modo preferido, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 4.

Em determinados aspectos, os anticorpos da invenção, de um modo preferido, anticorpos humanos e, de um modo mais preferido, anticorpos monoclonais, de um modo muito preferido, anticorpos monoclonais humanos, compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região constante de cadeia pesada seleccionada do grupo consistindo nas regiões constantes de cadeias pesadas de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA e IgE ou qualquer sua variação alélica (como discutido em Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242), e a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 10 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. De um modo preferido, um anticorpo da invenção compreende uma sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada de IgG2 como exposta na SEQ ID N°: 4 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional.

Em determinados aspectos, os anticorpos da invenção, de um modo preferido, anticorpos humanos e, de um modo mais preferido, anticorpos monoclonais, de um modo muito preferido, anticorpos monoclonais humanos, compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia 11 leve, em que a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 8 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 12 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional.

Em determinados aspectos, os anticorpos da invenção, compreendem uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 10 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional e a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 12 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. Em aspectos adicionais, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos como exposta em qualquer das SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 18 ou SEQ ID N°: 22 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. Em ainda mais aspectos, a cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos como exposta em qualquer da SEQ ID N°: 16, 20, 24 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. A invenção também proporciona anticorpos que se ligam especif icamente a NGF, em que a cadeia pesada compreende uma região variável compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 10 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional e a cadeia leve compreende uma região variável compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 12 ou um seu 12 fragmento de ligaçao do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. São ainda aqui descritos anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente a NGF, em que os anticorpos compreendem: (a) uma cadeia pesada tendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 79 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional, e uma cadeia leve tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 80 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; (b) uma cadeia pesada tendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 81 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional, e uma cadeia leve tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 82 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; (c) uma cadeia pesada tendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 83 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional, e uma cadeia leve tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 84 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; ou 13 (d) uma cadeia pesada tendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 8 7 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional, e uma cadeia leve tendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 86 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional.

Também são aqui descritos anticorpos, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência que tem, pelo menos, 75%, de um modo preferido, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 85%, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 10, e em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência que tem, pelo menos, 80%, de um modo preferido, pelo menos, 85%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90%, 91%, 92 %, 93%, . 94%, 95%, 96%, 97%, 9 8% e, de um modo muito preferido, cerca de 9 9% de identidade com a sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 12, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF.

Também são aqui descritos anticorpos compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada e em que a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência que tem, pelo menos, 75%, de um modo preferido, 80%, de um modo mais preferido, pelo menos, 85%, de um modo ainda mais preferido, 14 pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos como exposta em qualquer das SEQ ID N°: 14, SEQ ID N° : 18 ou SEQ ID N° : 22, e em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve e em que a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, 80%, de um modo preferido, pelo menos, 85%, de um modo mais preferido, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e, de um modo muito preferido, cerca de 99% de identidade com a sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 16, em que o anticorpo se liga especificamente a NGF. A invenção também proporciona anticorpos de cadeia única, anticorpos Fv de cadeia única, anticorpos F(ab), anticorpos F(ab)' e anticorpos (Fab')2·

Em aspectos particulares, a invenção proporciona uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 16 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional.

Além disso, a invenção proporciona uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta em qualquer das SEQ ID N°: 14, SEQ ID N°: 18 ou SEQ ID N° : 22 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. A invenção também se refere a anticorpos humanos isolados que se ligam especif icamente a NGF, em que o anticorpo compreende: (a) regiões de estrutura de cadeia pesada humana, uma região CDR1 de cadeia pesada humana, uma região CDR2 de cadeia pesada humana e uma região CDR3 de cadeia pesada humana e 15 (b) regiões de estrutura de cadeia leve humana, uma região CDR1 de cadeia leve humana, uma região CDR2 de cadeia leve humana e uma região CDR3 de cadeia leve humana. Em determinados aspectos, a região CDR1 de cadeia pesada humana pode ser a região CDR1 de cadeia pesada do anticorpo monoclonal (mAb), designado 4D4, como mostrado na SEQ ID N°: 22 e a região CDR1 de cadeia leve humana pode ser a região CDR1 de cadeia leve do mAb 4D4, como mostrado na SEQ ID N°: 24. Noutros aspectos, a região CDR2 de cadeia pesada humana pode ser a região CDR2 de cadeia pesada do mAb 4D4, como mostrado na SEQ ID N°: 18 e a região CDR2 de cadeia leve humana pode ser a região CDR2 de cadeia leve do mAb 4D4, como mostrado na SEQ ID N°: 20. Ainda noutros aspectos, a região CDR3 de cadeia pesada humana é a região CDR3 de cadeia pesada do mAb 4D4, como mostrado na SEQ ID N°: 14, e a região CDR3 de cadeia leve humana é a região CDR3 de cadeia leve do mAb 4D4, como mostrado na SEQ ID N°: 16.

Também são aqui descritos anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente ao factor de crescimento nervoso, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta nas SEQ ID N°: 79, SEQ ID N°: 81, SEQ ID N°: 83, SEQ ID N°: 85 ou SEQ ID N°: 87 ou seus fragmentos de ligação do antigénio ou imunoglobulina imunologicamente funcionais. São ainda aqui descritos anticorpos humanos isolados que se ligam especificamente a NGF, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos como exposta nas SEQ ID N°: 80, SEQ ID N°: 82, SEQ ID N°: 84, SEQ ID N°: 86, SEQ ID N°: 88, SEQ ID N°: 89, 16 SEQ ID N°: 90, SEQ ID N°: 91 ou SEQ ID N°: 131 ou seus fragmentos de ligação do antigénio ou uma imunoglobulina imunologicamente funcionais.

Os anticorpos da invenção são caracterizados pela capacidade de antagonizarem, pelo menos, uma actividade in vitro e/ou in vivo associada a polipéptidos de NGF. De um modo preferido, a invenção proporciona anticorpos humanos anti-NGF humano isolados com ligação de elevada afinidade a polipéptidos de NGF, em que os anticorpos se ligam a um polipéptido de NGF humano e se dissociam do polipéptido de NGF humano com uma constante de dissociação (KD) de cerca de 50 x 10 ”12 M ou inferior, como determinado utilizando KinExA ou que inibem a sobrevivência induzida por NGF num ensaio de neutralização in vitro, com uma IC5o de cerca de 1 x IO”8 M ou inferior.

Também são aqui descritos anticorpos humanos isolados ou seus fragmentos de ligação do antigénio ou imunoglobulina imunologicamente funcionais, que se ligam especificamente a NGF com elevada afinidade, em que os referidos anticorpos ou fragmentos se dissociam de um polipéptido de NGF humano com uma KD de cerca de 1 x IO”9 ou inferior e neutralizam a bioactividade de NGF humano num ensaio in vitro padrão com uma IC5o de cerca de 1 x 10”8 M ou inferior e em que os anticorpos ou fragmentos compreendem uma região variável de cadeia pesada compreendendo: a) uma região CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula:

aWaV 17 em que: a1 é um resíduo de aminoácido hidrófilo polar; a2 é um resíduo de aminoácido aromático; a3 é um resíduo de aminoácido aromático alifático, polar hidrófobo; a4 é um resíduo de aminoácido neutro hidrófobo ou alifático; e a5 é um resíduo de aminoácido hidrófilo alifático ou polar; b) uma região CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: bWbWbVbVVVVVVVV7 em que: b1 é um resíduo de aminoácido alifático, polar hidrófobo ou aromático; b2 é um resíduo de aminoácido alifático hidrófobo; b3 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou aromático; b4 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, hidrófobo ou aromático; b5-b9 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos ou alifáticos; b10 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, aromático ou alifático; b11 é um resíduo de aminoácido aromático ou hidrófobo; b12 é um resíduo de aminoácido alifático hidrófobo ou polar hidrófilo; b13 é um resíduo de aminoácido alifático, hidrófobo ou polar hidrófilo; b14 e b16 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos; b15 é um resíduo de aminoácido alifático ou aromático hidrófobo; e b17 é um resíduo de aminoácido alifático acídico; e 18 c) uma região CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula:

c'cWcWcWV1cWcW em que: c é ausente ou e um resíduo de aminoacido alifatico; c e ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou um aromático hidrófobo; c3 e c4 são, independentemente, ausentes ou são resíduos de aminoácidos polares hidrófilos, aromáticos hidrófobos ou alifáticos; c5 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, alifático ou um aromático; c6 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou alifático; c7 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou um alifático; cs é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, hidrófobo ou um aromático; c9 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, alifático ou um aromático hidrófobo; c10 um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, aromático hidrófobo ou um alifático hidrófobo; c14-c13 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos ou aromáticos hidrófobos; c14 é um resíduo de aminoácido alifático ou aromático hidrófobo; c15 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou neutro hidrófobo; c16 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; e c17 é um resíduo de aminoácido aromático hidrófobo ou alifático hidrófobo.

Num aspecto, a1 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; a é um resíduo de aminoácido aromático hidrofobo; a e um resíduo de aminoácido alifático hidrófobo; a4 é um hidrófobo neutro; a5 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; b1 é um resíduo de aminoácido alifático ou aromático; b e Ile; b é um 19 resíduo de aminoácido polar hidrófilo; b4 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou aromatico; b -b sao, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos ou alifáticos; b10 é um resíduo de aminoácido alifático; b11 é Tyr; b é um resíduo de aminoácido alifático hidrofobo; b e um resíduo de aminoácido alifático ou polar hidrófilo; b14 e b16 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos; e b15 é um resíduo de aminoácido alifático hidrófobo; b17 é um resíduo de aminoácido alifático acídico; c1 é ausente ou é um resíduo de aminoácido alifático; c2 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou um aromático hidrófobo; c3 e c4 são, independentemente, ausentes ou são resíduos de aminoácidos polares hidrófilos, aromáticos hidrófobos ou alifáticos; c5 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; c6 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou alifático; c7 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou um alifático; c8 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, hidrófobo ou um aromático; c9 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, alifático ou um aromático hidrófobo; c10 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, aromático hidrófobo ou um alifático hidrófobo; cn-c13 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos ou aromáticos hidrófobos; c14 é um resíduo de aminoácido alifático ou aromático hidrófobo; c15 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou neutro hidrófobo; c16 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; e c17 é um resíduo de aminoácido aromático hidrófobo ou alifático hidrófobo.

Num aspecto particular, a1 é Ser, Asp ou Thr; a2 é Tyr; a3 é Ala, Ser, Trp ou Gly; a4 é Met ou Ile; a5 é His, Gly ou Asn; b1 é Tyr, Gly, Ile ou Asp; b2 é Ile; b3 é Ser, Thr, Tyr ou Asn; b4 é Trp, Arg ou Pro; b5 é Ser, Asn ou Gly; b6 é Ser, Arg, Asp ou Gly; 20 b7 é Ser, His ou Gly; b8 é Ser, lie, Asp ou Thr; b9 é Leu, Ile ou Thr; b10 é Gly, Lys ou Phe; b11 é Tyr; b12 é Ala ou Ser, b13 é Asp, Gly ou Pro; b14 é Ser; b15 é Vai ou Phe; b16 é Lys ou Gin; b17 é Gly; c1 é ausente ou é um resíduo de aminoácido alifático; c2 é ausente ou é Tyr, c3 e c4 são, independentemente, ausentes, Tyr,

Asn, Vai ou Glu; c5 é ausente, Ser, Gly ou Trp; c6 é ausente,

Ser, Gly, Glu ou Leu; c7 é Gly, Arg ou Asp; c8 é Trp, Pro, Ser ou Thr; c9 é His, Gly ou Tyr; c10 é Vai, Tyr ou Arg; cn-c13 são, independentemente, Ser, Phe, Tyr, Asp ou Asn; c14 é Phe, Vai ou Gly; c é Met ou Asp; c é ausente, Asp ou Asn; e c47 é Tyr ou Vai.

Noutro aspecto particular, a1 é Ser ou Asp; a2 é Tyr; a3 é Ala ou Ser, a4 é Met ou Ile; a5 é His ou Asn; b1 é Tyr ou Gly, b2 é Ile; b3 é Ser, Thr, Tyr ou Asn; b4 é Trp, Arg ou Pro; b5 é Ser ou Asn; b6 é Ser ou Arg; b7 é His ou Gly; b8 é Ile ou Thr, b9 é Leu, Ile ou Thr, b10 é Gly ou Phe; b11 é Tyr; b12 é Ala ou Ser; b13 é Asp ou Gly; b14 é Ser; b15 é Vai ou Phe; b16 é Lys ou Gin; b17 é Gly; c1 é ausente ou é Gly; c2 é ausente ou é Tyr; c3 e c4 são, independentemente, ausentes, Tyr, Gly ou Vai; c5 é ausente ou é Ser; c6 é Ser ou Gly, c7 é Gly ou Arg; c8 é Trp ou Pro; c9 é His, Gly ou Tyr; c10 é Vai ou Tyr; c41-c13 são, independentemente, Ser, Tyr, Phe ou Asp; c14 é Phe ou Vai; c15 é Met ou Asp; c16 é ausente ou é Asp; e c17 é Tyr ou Vai.

Noutros aspectos particulares: a) a CDR1 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 92, a CDR2 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 93 e a CDR 3 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 94; 21 b) a CDR1 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 98, a CDR2 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 99 e a CDR 3 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 100; c) a CDR1 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 104, a CDR2 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 105 e a CDR 3 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 106; d) a CDR1 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 110, a CDR2 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 111 e a CDR 3 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 112; e e) a CDR1 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 116, a CDR2 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 117 e a CDR 3 de cadeia pesada tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 118.

Também é aqui descrito um anticorpo humano isolado ou um seu fraqmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional que se liga especificamente a NGF, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo: 22 a) uma região CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: „ I -2-3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 aaaaaaaaaa a a em que: a1 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; a2, a11 e a12 são, independentemente, resíduos de aminoácidos alifáticos ou hidrófobos; a3, a5, a7 e a8 são, independentemente, resíduos de aminoácidos alifáticos, polares hidrófilos ou hidrófobos; a4 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; a6 é um resíduo de aminoácido alifático ou hidrófobo; a9 é ausente ou é um resíduo de aminoácido alifático ou polar hidrófilo; e a10 é um resíduo de aminoácido alifático, aromático ou hidrófobo; b) uma região CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula:

bWbVbV em que: b1 é um resíduo de aminoácido alifático, polar hidrófobo ou hidrófobo; bz é um resíduo de aminoácido alifático ou hidrófobo; b3 e b4 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos, alifáticos ou hidrófobos; b5 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou alifático hidrófobo; b6 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou alifático hidrófobo; e b7 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo; e 23 c) uma região CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos da fórmula: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 cccccccccc c c c c c c c em que: c1 e c2 são, independentemente, residuos de aminoácidos polares hidrófilos; c3 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, alifático ou hidrófobo; c4, c5 e c6 são, independentemente, resíduos de aminoácidos alifáticos, polares hidrófilos ou hidrófobos; c7 é ausente ou é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou um alifático hidrófobo; c e um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou hidrófobo; e c9 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo e em que o referido anticorpo ou fragmento se dissocia de um polipéptido de NGF humano, com uma KD de cerca de 1 x 1CT9 ou inferior e neutraliza bioactividade de NGF humano, num ensaio in vitro padrão, com uma IC50 de cerca de 1 x IO-8 M ou inferior.

Num aspecto, a1, a3, a4, a7 e a8 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos; a2, a6, a11 e a12 são, independentemente, resíduos de aminoácidos alifáticos hidrófobos; a5 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo ou alifático; a9 é ausente ou é um resíduo de aminoácido alifático ou polar hidrófilo; a10 é um resíduo de aminoácido alifático ou aromático; b1 é um resíduo de aminoácido alifático, polar hidrófobo ou hidrófobo; b2 é um resíduo de aminoácido alifático hidrófobo; b3, b4 e b7 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos; b5 e b6 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos ou alifáticos 24 hidrófobos; c1 e c2 são, independentemente, resíduos de aminoácidos polares hidrófilos; c3 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo, alifático ou hidrófobo; c4, c5 e c6 são, independentemente, resíduos de aminoácidos alifáticos, polares hidrófilos ou hidrófobos; c7 é ausente ou é um resíduo de aminoácido alifático hidrófobo; c8 é um resíduo de aminoácido hidrófobo; e c9 é um resíduo de aminoácido polar hidrófilo.

Num aspecto particular, a1, a3, a4 e a7 são Arg, Ser, Gin e

Ser, respectivamente; a2 é Ala; a5 é Gly ou Ser; a8 é Ser ou Ile; a9 é ausente, Ser ou Gly; a10 é Ala, Tyr, Trp ou Phe; b1 é Asp, Gly, Ala ou Vai; b2 e b3 são Ala e Ser, respectivamente; b4 é Ser ou Asn; b5 é Leu ou Arg; b6 é Glu, Ala ou Gin, b7 é Ser ou Thr; c1 e c2 são Gin; c3 é Phe, Tyr, Arg ou Ala; c4 é Asn, Gly ou Ser; c5 é Ser ou Asn; c6 é Tyr, Ser, Trp ou Phe; c7 é ausente, Pro ou His; c8 é Leu, Trp, Tyr ou Arg; e c9 é Thr.

Noutro aspecto particular, a1, a2, a3, a4 e a7 são Arg, Ala,

Ser, Gin e Ser, respectivamente; a5 é Gly ou Ser, a8 é Ser ou

He; a9 é ausente, Ser ou Gly; a10 é Ala ou Tyr; b1 é Asp ou Gly; b e b são Ala e Ser, respectivamente; b4 é Ser ou Asn; b5 é Leu ou Arg; b6 é Glu , Ala ou Gin; b7 é Ser ou Thr; o (D c2 são Gin; c3 é Phe, Tyr, Arg ou Ala; c4 é Asn, Gly ou Ser; c5 é Ser ou Asn; c6 é Tyr, Ser, Trp ou Phe; c7 é ausente, Pro ou His; c8 é Leu, Trp, Tyr ou Arg; e c9 é Thr.

Noutros aspectos particulares: a) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 95, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na 25 SEQ ID N°: 96 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 97; b) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 101, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 102 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 103; c) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 107, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 108 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 109; d) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 113, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 114 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 115; e) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 119, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 120 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 121; 26 f) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 122, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 123 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 124; g) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 125, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 126 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 127; h) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 128, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ H U o 129 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 13 0; e i) a CDR1 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 132, a CDR2 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 133 e a CDR 3 de cadeia leve tem uma sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 134.

Também são parte da invenção sequências polinucleotídicas que codificam os novos anticorpos humanos anti-NGF humano, vectores compreendendo as sequências polinucleotídicas codificando anticorpos humanos anti-NGF humano, células 27 hospedeiras transformadas com vectores incorporando polinucleótidos que codificam os anticorpos humanos anti-NGF humano, formulações compreendendo anticorpos humanos anti-NGF humano e métodos de preparação e utilização dos mesmos. A invenção também proporciona métodos para a detecção do nível de NGF numa amostra biológica, compreendendo a etapa de colocar a amostra em contacto com um anticorpo da invenção ou seu fragmento de ligação do antigénio. Um anticorpo anti-NGF da invenção pode ser empregue em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios de sanduíche directos e indirectos, ensaios de imunoprecipitação e ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) {Ver, Sola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p. 147-158, CRC Press, Inc.) para a detecção e quantificação de NGF. Os anticorpos podem ligar-se a NGF com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio sendo empregue.

Além disso, a invenção proporciona o tratamento de uma doença associada a produção aumentada de NGF, ou sensibilidade aumentada a NGF, compreendendo a etapa de administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um anticorpo da invenção ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional, a um indivíduo que dela necessita.

As formas de realização preferidas específicas da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição mais detalhada que se segue de determinadas formas de realização preferidas e das reivindicações. 28

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 representa gráficos que demonstram a neutralização da actividade de NGF no bioensaio de neutralização baseado nos neurónios DRG, por anticorpos monoclonais 4D4, purificados a partir dos meios condicionados de hibridoma. A Figura 2 representa gráficos que demonstram a expressão de VR1 estimulada pela actividade de NGF humano e neutralização da actividade de NGF em bioensaios de neutralização baseados nos neurónios DRG, por um anticorpo monoclonal anti-NGF (4D4), purificado a partir dos meios condicionados de hibridoma. A Figura 3 representa gráficos que demonstram a neutralização da actividade de NGF em bioensaios de neutralização baseados nos neurónios DRG, por anticorpos monoclonais 4D4 anti-NGF recombinantes expressos de modo transiente, quando expressos como uma IgGl ou IgG2 e em células cultivadas numa cultura de frascos rotativos (R) ou em frascos spinner (S). A Figura 4 representa alinhamentos de sequências de neurotrofinas. A numeração e elementos de estrutura secundários por cima das sequências referem-se a NGF humano maduro. Os resíduos conservados estão marcados com uma estrela e as regiões com baixa homologia de sequência estão a sombreado. 0 NGF humano é SEQ ID N°: 135; NGF de murganho é SEQ ID N°: 136; BDNF é SEQ ID N°: 137; NT3 é SEQ ID N°: 138. A Figura 5 mostra alinhamento e percentagem de identidade da CDR1 de cadeia pesada de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N° : 98), 6H9 (SEQ ID N° : 104), 7H2 (SEQ ID N° : 110), 4G6 (SEQ ID N°: 116), 14D11 (SEQ ID N°: 92) e 4D4 (SEQ ID N°: 22). 29 A Figura 6 mostra alinhamento e percentagem de identidade da CDR2 de cadeia pesada de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N°: 99), 6H9 (SEQ ID N°: 105), 7H2 (SEQ ID N°: 111), 4G6 (SEQ ID N°: 117), 14D11 (SEQ ID N°: 93) e 4D4 (SEQ ID N°: 18). A Figura 7 mostra alinhamento e percentagem de identidade da CDR3 de cadeia pesada de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N°: 100), 6H9 (SEQ ID N°: 106), 7H2 (SEQ ID N°: 112), 4G6 (SEQ ID N°: 118), 14D11 (SEQ ID N°: 94) e 4D4 (SEQ ID N°: 14). A Figura 8 mostra alinhamento e percentagem de identidade da CDR1 de cadeia leve de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N°: 95), 6H9 (SEQ ID N°: 107), 7H2 (SEQ ID N°: 113), 4G6a (SEQ ID N°: 119), 4G6b (SEQ ID N°: 122), 4G6c (SEQ ID N°: 125), 4G6d (SEQ ID N°: 128), 4G6e (SEQ ID N°: 132), 14D11 (SEQ ID N° : 95) e 4D4 (SEQ ID N° : 24) (4G6a é referido em diversas Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em diversas Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em diversas Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em diversas Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em diversas Figuras como 20031000528) . A Figura 9 mostra alinhamento e percentagem de identidade da CDR2 de cadeia leve de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N°: 96), 6H9 (SEQ ID N°: 108), 7H2 (SEQ ID N°: 114), 4G6a (SEQ ID N°: 120), 4G6b (SEQ ID N°: 123), 4G6c (SEQ ID N°: 126), 4G6d (SEQ ID N°: 129), 4G6e (SEQ ID N°: 133), 14D11 (SEQ ID N° : 96) e 4D4 (SEQ ID N° : 20) (4G6a é referido em diversas Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em diversas

Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em diversas Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em diversas Figuras como 30 20031028344; 20031000528) . 4G6e referido em diversas Figuras como A Figura 10 mostra alinhamento e percentagem de identidade da CDR3 de cadeia leve de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N°: 97), 6H9 (SEQ ID N°: 109), 7H2 (SEQ ID N°: 115), 4G6a (SEQ ID N°: 121), 4G6b (SEQ ID N°: 124), 4G6c (SEQ ID N°: 127), 4G6d (SEQ ID N°: 130), 4G6e (SEQ ID N°: 134), 14D11 (SEQ ID N° : 97) e 4D4 (SEQ ID N°: 16) (4G6a é referido em diversas Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em diversas Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em diversas Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em diversas Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em diversas Figuras como 20031000528) . A Figura 11 mostra alinhamento e percentagem de identidade da cadeia leve de anti-NGF para os anticorpos 14D10 (SEQ ID N°: 82), 6H9 (SEQ ID N°: 84), 7H2 (SEQ ID N°: 86), 4G6a (SEQ ID N° : 88), 4G6b (SEQ ID N° : 89), 4G6c (SEQ ID N° : 90), 4G6d (SEQ ID N°: 91), 4G6e (SEQ ID N°: 131), 14D11 (SEQ ID N°: 80) e 4D4 (SEQ ID N°: 12) (4G6a é referido em diversas Figuras como 20031028340; 4G6b é referido em diversas Figuras como 20031028351; 4G6c é referido em diversas Figuras como 20031071526; 4G6d é referido em diversas Figuras como 20031028344; 4G6e é referido em diversas Figuras como 20031000528) . anticorpos 4D4 (SEQ ID N°: 81), 85) e 6H9 para os '7) , 14D10 (SEQ ID N° A Figura 12 mostra alinhamento e percentagem de identidade da cadeia pesada de anti-NGF (SEQ ID N°: 10), 4G6 (SEQ ID N°: 14D11 (SEQ ID N° : 79), 7H2 (SEQ ID N°: 83) . 31

DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Os títulos das secções aqui utilizados são apenas para fins de organização e não devem ser interpretados como limitando o assunto descrito.

Definições

As técnicas convencionais podem ser utilizadas para ADN recombinante, síntese oligonucleotídica e cultura de tecidos e transformação (e. g., electroporação, lipofecção). As reacções enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como realizadas, em geral, na técnica ou como aqui descritas. As técnicas e procedimentos anteriores podem ser geralmente realizados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica e como descrito em diversas referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente descrição. Ver, e. g., Sambrook et ãl., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. A menos que sejam proporcionadas definições específicas, a nomenclatura utilizada com respeito aos processos laboratoriais e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são os bem conhecidos e geralmente utilizados na técnica. De modo semelhante, as técnicas convencionais podem ser utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e distribuição farmacêuticas e tratamento de doentes. 32

Como utilizados de acordo com a presente divulgação, os termos seguintes, salvo indicação em contrário, devem ser compreendidos como tendo os seguintes significados: As frases "propriedade biológica", "característica biológica" e o termo "actividade", em referência a um anticorpo da presente invenção, são aqui utilizadas com o mesmo significado e incluem mas não estão limitadas a afinidade e especificidade epitópicas (e. g., ligação de anticorpo humano anti-NGF humano a NGF humano), capacidade de antagonizar a actividade do polipéptido visado (e. g., actividade de NGF), a estabilidade in vivo do anticorpo e as propriedades imunogénicas do anticorpo. Outras propriedades ou caracteristicas biológicas identificáveis de um anticorpo reconhecido na técnica incluem, por exemplo, reactividade cruzada, (i. e., com homólogos não humanos do polipéptido visado, ou com outras proteínas ou tecidos, em geral) e capacidade de preservar níveis elevados de expressão de proteína em células de mamífero. As propriedades ou caracteristicas mencionadas acima podem ser observadas ou medidas utilizando técnicas reconhecidas na matéria incluindo mas não limitadas a ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plasmónio de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo (e. g.,

Exemplo 2) e imuno-histoquímica com secções de tecido de diferentes fontes, incluindo humana, primata ou qualquer outra fonte conforme seja necessário. As actividades e propriedades biológicas particulares dos anticorpos humanos anti-NGF humano são descritas de forma mais detalhada nos Exemplos abaixo. 0 termo "polinucleótido isolado", como aqui utilizado, deverá significar um polinucleótido de origem genómica, ADNc, ou sintética ou alguma sua combinação que, em virtude da sua origem, o polinucleótido isolado d ) não está associado à totalidade ou uma porção de um polinucleótido, no qual o 33 polinucleótido isolado se verifica na natureza, (2) está ligado a um polinucleótido ao qual não está ligado na natureza ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. 0 termo "proteína isolada", aqui referido, significa que uma proteína submetida (1) está isenta de, pelo menos, quaisquer outras proteínas com as quais se encontraria normalmente na natureza, (2) está essencialmente isenta de outras proteínas da mesma fonte, e. g., da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de, pelo menos, cerca de 50 por cento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais está associada na natureza, (5) não está associada (por interacção covalente ou não covalente) a porções de uma proteína com a qual a "proteína isolada" está associada na natureza, (6) está associada de um modo operativo (por interacção covalente ou não covalente) a um polipéptido com o qual não está associada na natureza ou (7) não ocorre na natureza. Essa proteína isolada pode ser codificada por ADN genómico, ADNc, ARNm ou outro ARN, de origem sintética ou qualquer sua combinação. De um modo preferido, a proteína isolada está substancialmente isenta de proteínas ou polipéptidos ou outros contaminantes que se verificam no seu ambiente natural, que iriam interferir com a sua utilização (terapêutica, diagnóstica, profiláctica, de investigação ou outra).

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que iriam interferir com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não 34 proteináceos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo será purificado, (1) até mais de 95%, em peso, de anticorpo, como determinado pelo método de Lowry e, de um modo muito preferido, mais de 99%, em peso, (2) até um grau suficiente para se obter, pelo menos, 15 resíduos de sequência de aminoácidos N-terminais ou internos, por utilização de um sequenciador com frasco de rotação ou, (3) até homogeneidade por SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando coloração de azul de Coomassie ou, de um modo preferido, prata. 0 anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que, pelo menos, um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente.

Os termos "polipéptido" ou "proteína" significam moléculas tendo a sequência de proteínas nativas, isto é, proteínas produzidas por células de ocorrência natural e especificamente não recombinantes ou células geneticamente manipuladas ou recombinantes e compreendem moléculas tendo a sequência de aminoácidos da proteína nativa ou moléculas tendo deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos "polipéptido" e "proteína" abrangem, especificamente, anticorpos anti-NGF ou sequências que têm deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um anticorpo anti-NGF. 0 termo "fragmento polipéptídico" refere-se a um polipéptido que tem uma deleção amino-terminal, uma deleção carboxilo-terminal e/ou uma deleção interna. Em determinadas formas de realização, os fragmentos têm, pelo menos, 5 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento. Será entendido que, em determinadas formas de realização, os fragmentos têm, pelo menos, 5, 6, O i—1 V 00 i—1 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 35 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos polipeptídicos particularmente úteis incluem domínios funcionais, incluindo domínios de ligação. No caso de um anticorpo anti-NGF, os fragmentos úteis incluem mas não estão limitados a uma região de CDR, um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, uma porção de uma cadeia de anticorpo ou apenas a sua região variável, incluindo duas CDR e semelhantes. 0 termo "agente de ligação específica" refere-se a uma molécula natural ou não natural que se liga especificamente a um alvo. Os exemplos de agentes de ligação específica incluem mas não estão limitados a proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono e lípidos. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação específica é um anticorpo. 0 termo "agente de ligação específica a NGF" refere-se a um agente de ligação específica que se liga especificamente a qualquer porção de NGF. Em determinadas formas de realização, um agente de ligação específica a NGF é um anticorpo que se liga especificamente a NGF. O termo "fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional", como aqui utilizado, refere-se a um fragmento polipeptídico que contém, pelo menos, as CDR das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção é capaz de se ligar a um antigénio. Em formas de realização preferidas, o antigénio é um ligando que se liga especificamente a um receptor. Nestas formas de realização, a ligação de um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção impede a ligação do ligando ao seu receptor, interrompendo a resposta biológica resultando da ligação de ligando ao receptor. De um modo 36 preferido, um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da invenção liga-se especificamente a NGF. De um modo muito preferido, o fragmento liga-se especificamente a NGF humano. 0 termo "de ocorrência natural", como aqui utilizado e aplicado a um objecto, refere-se ao facto de que o objecto se pode encontrar na natureza. Por exemplo, uma sequência polipeptidica ou polinucleotídica que está presente num organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem é de ocorrência natural. 0 termo "ligado de um modo operativo" significa que os componentes aos quais o termo é aplicado estão numa relação que lhes permite, sob condições adequadas, efectuar as suas funções inerentes. Por exemplo, uma sequência de controlo "ligada de um modo operativo" a uma sequência codificante de proteína está a ela ligada, de modo que a expressão da sequência codificante de proteína é alcançada sob condições compatíveis com a actividade transcricional das sequências de controlo. 0 termo "sequência de controlo", como aqui utilizado, refere-se a sequências polinucleotídicas que podem efectuar a expressão, processamento ou localização intracelular de sequências codificantes às quais estão ligadas. A natureza dessas sequências de controlo pode depender do organismo hospedeiro. Em formas de realização particulares, as sequências de controlo para procariotas podem incluir um promotor, sítio de ligação ribossómico e sequência de terminação de transcrição. Noutras formas de realização particulares, as sequências de controlo para eucariotas podem incluir promotores compreendendo 37 um ou uma pluralidade de sítios de reconhecimento para factores de transcrição, sequências estimuladoras de transcrição, sequências de terminação de transcrição e sequências de poliadenilação. Em determinadas formas de realização, "sequências de controlo" podem incluir sequências líder e/ou sequências parceiras de fusão. 0 termo "polinucleótido", como aqui referido, significa polímeros de ácido nucleico de cadeia única ou cadeia dupla de, pelo menos, 10 nucleótidos em comprimento. Em determinadas formas de realização, os nucleótidos compreendendo o polinucleótido podem ser ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. As referidas modificações incluem modificações de bases, tal como bromouridina, modificações de ribose, tais como arabinósido e 2',3'-didesoxirribose e modificações de ligação internucleotídica, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato. O termo "polinucleótido" inclui, especificamente, formas de ADN de cadeia única e dupla. 0 termo "oligonucleótido", aqui referido, inclui oligonucleótidos de ocorrência natural e modificados, ligados entre si por ligações oligonucleotídicas de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. Os oligonucleótidos são um subconjunto polinucleotídico compreendendo membros que são, em geral, de cadeia única e têm um comprimento de 200 nucleótidos ou menos. Em determinadas formas de realização, os oligonucleótidos têm 10 a 60 nucleótidos em comprimento. Em determinadas formas de realização, os oligonucleótidos têm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 nucleótidos em comprimento. Os oligonucleótidos podem ser de cadeia única ou de 38 cadeia dupla, e. g., para utilização na construção de um mutante genético. Os oligonucleótidos da invenção podem ser oligonucleótidos sentido ou anti-sentido, fazendo referência a uma sequência codificando proteína. 0 termo "nucleótidos de ocorrência natural" inclui desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos. 0 termo "nucleótidos modificados" inclui nucleótidos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e semelhantes. 0 termo "ligações oligonucleotídicas" inclui ligações oligonucleotídicas, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e semelhantes. Ver, e. g., LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 1_4: 9081; Stec et ai., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6_:539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, p. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford, Inglaterra; Stec et al., Pat. U.S. N° 5151510; Uhlmann e Peyman, 1990, Chemical Reviews, 9_0:543. Um oligonucleót ido pode incluir um marcador detectável, para possibilitar a detecção do oligonucleótido ou sua hibridação. O termo "vector" inclui uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vector é um "plasmídeo", que se refere a um gancho de ADN circular de cadeia dupla ao qual podem estar ligados segmentos de ADN adicionais. Outro tipo de vector é um vector virai, em que segmentos de ADN adicionais podem estar ligados ao genoma virai. Determinados vectores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira dentro da qual são introduzidos (e. g., vectores bacterianos tendo uma origem de replicação 39 bacteriana e vectores de mamífero epissomais). Outros vectores (e. g., vectores de mamífero não epissomais) podem estar integrados dentro do genoma de uma célula hospedeira após introdução dentro da célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vectores são capazes de dirigirem a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente. Esses vectores são aqui referidos como "vectores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vectores de expressão"). Em geral, os vectores de expressão de utilidade em técnicas de ADN recombinante estão, frequentemente, na forma de plasmídeos. Na presente descrição, "plasmídeo" e "vector" podem ser utilizados com o mesmo significado, visto que o plasmídeo é a forma de vector mais geralmente utilizada. Contudo, pretende-se que a invenção inclua outras dessas formas de vectores de expressão, tal como vectores virais (e. g.r retrovirus de replicação defeituosa, adenovirus e vírus adeno-associados), que servem funções equivalentes. A frase "célula hospedeira recombinante" (ou, simplesmente, "célula hospedeira") inclui uma célula dentro da qual foi introduzido um vector de expressão recombinante. Será compreendido pelos especialistas na técnica que se pretende que esses termos se refiram, não apenas à particular célula submetida, mas à progénie dessa célula. Em virtude de determinadas modificações poderem ocorrer em gerações sucessivas, devido a mutação ou influências ambientais, essa progénie pode, de facto, não ser idêntica à célula parental mas está ainda incluída dentro do âmbito do termo "célula hospedeira", como aqui utilizado. Uma ampla variedade de sistemas de expressão hospedeiros pode ser utilizada para expressar os anticorpos da presente invenção, incluindo sistemas de expressão bacterianos, de levedura, baculovirais e mamíferos 40 (assim como sistemas de expressão de apresentação fágica). Um exemplo de um vector de expressão bacteriano adequado é pUC19. Para expressar um anticorpo recombinantemente, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vectores de expressão recombinantes transportando fragmentos de ADN codificando as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina do anticorpo, de modo a que as cadeias leves e pesadas sejam expressas na célula hospedeira e, de um modo preferido, segregadas para dentro do meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, a partir de cujo meio os anticorpos podem ser recuperados. As metodologias de ADN recombinante padrão são utilizadas para se obterem genes de cadeias pesadas e leves de anticorpo, incorporar estes genes dentro de vectores de expressão recombinantes e introduzir os vectores dentro de células hospedeiras, tais como as descritas em Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel, F.M. et al. (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) e na Patente U.S. N° 4816397 de Boss et al. O termo "célula hospedeira" é utilizado para se referir a uma célula que foi transformada ou é capaz de ser transformada, com uma sequência de ácidos nucleicos e, depois, de expressar um gene de interesse seleccionado. O termo inclui a descendência da célula parental, quer a descendência seja ou não idêntica em morfologia ou em composição genética à parental original, desde que o gene seleccionado esteja presente. O termo "transdução" é utilizado para se referir à transferência de genes de uma bactéria para outra, habitualmente por um fago. "Transdução" também se refere à aquisição e transferência de sequências celulares eucarióticas por retrovírus. 41 0 termo "transfecção" é utilizado para se referir à absorção de ADN estranho ou exógeno por uma célula e uma célula foi "transfectada" quando o ADN exógeno foi introduzido no interior da membrana celular. Um número de técnicas de transfecção é bem conhecido na técnica e é aqui divulgado. Ver, e. g., Graham et al., 1973, Virology 52_:456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; e Chu et al., 1981, Gene L3:197. Essas técnicas podem ser utilizadas para introduzir uma ou mais fracções de ADN exógeno dentro de células hospedeiras adequadas. O termo "transformação", como aqui utilizado, refere-se a uma alteração nas caracteristicas genéticas de uma célula e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter um novo ADN. Por exemplo, uma célula é transformada se for geneticamente modificada a partir do seu estado nativo. A seguir à transfecção ou transdução, o ADN transformante pode recombinar-se com o da célula pela sua integração física dentro de um cromossoma da célula ou pode ser mantido de forma transiente como um elemento epissomal sem ser replicado ou pode replicar-se independentemente como um plasmídeo. Uma célula é considerada como tendo sido transformada de um modo estável quando o ADN é replicado com a divisão da célula. 0 termo "de ocorrência natural" ou "nativo", quando utilizado com respeito a materiais biológicos, tais como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospedeiras e semelhantes, refere-se a materiais que se verificam na natureza e não são manipulados pelo homem. De modo semelhante, "de ocorrência não natural" ou "não nativo", como aqui utilizado, 42 refere-se a um material que não se verifica na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. 0 termo "antigénio" refere-se a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação selectiva, tal como um anticorpo e, além disso, capaz de ser utilizada num animal para produzir anticorpos capazes de se ligarem a um epitopo desse antigénio. Um antigénio pode ter um ou mais epitopos. 0 termo "identidade", como conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas polipeptídicas ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, como determinado pela comparação das suas sequências. Na técnica, "identidade", também significa o grau de parentesco de sequência entre moléculas de ácido nucleico ou polipéptidos, consoante o caso, como determinado pela correspondência entre segmentos de sequências de dois ou mais nucleótidos ou dois ou mais aminoácidos. A "identidade" mede a percentagem de correspondências idênticas entre a mais pequena de duas ou mais sequências com alinhamentos de lacunas (se existirem) abordados por um particular modelo matemático ou programa de computador (i. e., "algoritmos"). 0 termo "semelhança" é utilizado na técnica com respeito a um conceito relacionado, mas em contraste com "identidade", "semelhança" refere-se a uma medida de parentesco, que inclui correspondências idênticas e correspondências de substituição conservativa. Se duas sequências polipeptídicas têm, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos e as restantes são todas substituições não conservativas, então, a percentagem de identidade e semelhança seriam ambas 50%. Se, no mesmo exemplo, 43 existirem mais cinco posições onde existem substituições conservativas, então a percentagem de identidade permanece 50%, mas a percentagem de semelhança seria 75% (15/20). Por conseguinte, nos casos onde existem substituições conservativas, a percentagem de semelhança entre dois polipéptidos será superior à percentagem de identidade entre esses dois polipéptidos.

Identidade e semelhança de ácidos nucleicos e polipéptidos relacionados podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos. Esses métodos incluem, mas não estão limitados, aos descritos em COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, Nova Iorque; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, Nova Iorque; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Parte 1, (Griffin, A.M. e Griffin, H.G., ed.), 1994, Humana Press, Nova Jérsia; von Heinje, G., SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. e Devereux, J., ed.), 1991, M. Stockton Press, Nova Iorque; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math, 48:1073; e Durbin et al., 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press.

Os métodos preferidos para determinar a identidade são concebidos para proporcionarem a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados ao pacote do programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 1_2:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN e FASTA 44 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410). O programa (Altschul et ai., BLASTX está publicamente disponível do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et ai. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et ai., 1990, supra). O bem conhecido algoritmo de Smith Waterman também pode ser utilizado para determinar a identidade.

Determinados esquemas de alinhamento, para alinhar duas sequências de aminoácidos, podem resultar na correspondência de apenas uma curta região das duas sequências e esta pequena região alinhada pode ter identidade de sequência muito elevada, ainda que não exista relação significativa entre as duas sequências de comprimento completo. Consequentemente, em determinadas formas de realização, o método de alinhamento seleccionado (programa GAP) resultará num alinhamento que abarca, pelo menos, 50 aminoácidos contíguos do polipéptido alvo.

Por exemplo, utilizando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipéptidos para os quais a percentagem de identidade de sequência deva ser determinada, são alinhados para correspondência óptima dos seus respectivos aminoácidos (a "secção correspondida", como determinado pelo algoritmo). Em determinadas formas de realização, uma penalidade de abertura de lacuna (que é calculada como três vezes a diagonal média; onde a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação sendo utilizada; a "diagonal" é a pontuação ou número atribuído a cada correspondência de aminoácido perfeita pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacuna (que é, habitualmente, um décimo da penalidade de abertura de lacuna), assim como uma matriz de comparação, tais como PAM250 45 ou BLOSUM 62, são utilizadas em conjunto com o algoritmo. Em determinadas formas de realização, uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and

Structure, _5:345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Scl USA, 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é utilizada pelo algoritmo.

Em determinadas formas de realização, os parâmetros para uma comparação de sequência polipeptidica incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453;

Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra;

Penalidade de Lacuna: 12

Penalidade de Comprimento de Lacuna: 4

Limiar de Semelhança: 0 O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em determinadas formas de realização, os parâmetros mencionados acima são os parâmetros predefinidos para comparações polipeptidicas (juntamente com nenhuma penalidade para lacunas de extremidade) utilizando o algoritmo GAP. 0 termo "homologia" refere-se ao grau de semelhança entre sequências de proteínas ou ácidos nucleicos. A informação de homologia é útil para a compreensão do parentesco genético de determinadas espécies de proteínas ou ácidos nucleicos. A homologia pode ser determinada pelo alinhamento e comparação de sequências. Tipicamente, para determinar a homologia de aminoácidos, uma sequência de proteínas é comparada com uma base 46 de dados de sequências de proteínas conhecidas. As sequências homólogas partilham identidades funcionais comuns algures ao longo das suas sequências. Um elevado grau de semelhança ou identidade é, habitualmente, indicativo de homologia, embora um baixo grau de semelhança ou identidade não indique, necessariamente, ausência de homologia.

Para determinar a homologia, podem ser utilizadas várias abordagens para comparar aminoácidos de uma sequência com aminoácidos de outra sequência. Em geral, as abordagens dividem-se em duas categorias: (1) comparação de características físicas, tais como polaridade, carga e volume de Van der Waals, para gerar uma matriz de semelhança; e (2) comparação de substituição provável de um aminoácido numa sequência por qualquer outro aminoácido, que se baseia na observação de muitas sequências proteicas a partir de proteínas homólogas conhecidas e para gerar uma Matriz de Mutação Pontual Aceite (PAM). A percentagem de identidade também pode ser calculada pela utilização do programa needle (pacote EMBOSS) ou stretcher (pacote EMBOSS) ou do programa align X, como um módulo do pacote de software vector NTI suite 9.0.0, utilizando os parâmetros predefinidos (por exemplo, penalidade de LACUNA 5, penalidade de abertura de LACUNA 15, penalidade de extensão de LACUNA 6,6).

Como aqui utilizado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver IMMUNOLOGY—A SYNTHESIS, 2a Edição, (E. S. Golub e D. R. Gren, Ed.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991. Estereoisómeros (e. g., aminoácidos D) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos a, aminoácidos α dissubstituídos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico e outros 47 aminoácidos não convencionais, também podem ser componentes adequados para polipéptidos da invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetilisina, ε-Ν-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, σ-Ν-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (e. g., 4-hidroxiprolina). Na notação polipeptídica aqui utilizada, a direcção esquerda é a direcção amino-terminal e a direcção direita é a direcção carboxilo-terminal, de acordo com a utilização e convenção padrão.

Os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades comuns de cadeia lateral: 1) hidrófobo: norleucina (Nor) , Met, Ala, Vai, Leu, Ile,

Phe, Trp, Tyr, Pro; 2) polar hidrófilo: Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, His, Lys, Ser,

Thr; 3) alifático: Ala, Gly, Ile, Leu, Vai, Pro; 4) alifático hidrófobo: Ala, Ile, Leu, Vai, Pro; 5) neutro hidrófilo: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 6) acídico: Asp, Glu; 7) básico: His, Lys, Arg; 8) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly,

Pro; 9) aromático: His, Trp, Tyr, Phe; e 10) aromático hidrófobo: Phe, Trp, Tyr.

As substituições conservativas de aminoácidos podem envolver a troca de um membro de uma destas classes com outro membro da mesma classe. As substituições conservativas de 48 aminoácidos podem abranger resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, que são, tipicamente, incorporados por síntese química peptídica, em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estas incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de fracções de aminoácidos.

As substituições não-conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe. Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos dentro de regiões do anticorpo humano que são homólogas com anticorpos não humanos ou dentro de regiões não homólogas da molécula.

Na realização dessas alterações, de acordo com determinadas formas de realização, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático, com base nas suas caracterí st icas de hidrofobicidade e carga. São: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5) . A importância do indice hidropático de aminoácidos na concessão da função biológica interactiva numa proteína é compreendida na técnica (ver, por exemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131) . Sabe-se que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice hidropático ou pontuação semelhante e reterem, ainda, uma actividade biológica semelhante. Na realização de alterações com 49 base no índice hidropático, em determinadas formas de realização, é incluída a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2. Em determinadas formas de realização, são incluídos os que estão dentro de ±1 e, em determinadas formas de realização, aqueles dentro de ±0,5 são incluídos.

Também é compreendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser realizada eficazmente com base na hidrofilicidade, particularmente, onde a proteína ou péptido biologicamente funcional criado desse modo se destina para utilização em formas de realização imunológicas, como aqui divulgado. Em determinadas formas de realização, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, i. e., com uma propriedade biológica da proteína.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Na realização de alterações com base em valores de hidrofilicidade semelhantes, em determinadas formas de realização, está incluída a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2, em determinadas formas de realização, os que estão dentro de ±1 estão incluídos e, em determinadas formas de realização, aqueles dentro de ±0,5 estão incluídos. Também se podem identificar epitopos a partir 50 de sequências de aminoácidos primárias com base em hidrofilicidade. Estas regiões também são referidas como "regiões nucleares epitópicas".

As substituições de aminoácidos exemplificativas são expostas na Tabela 1.

Tabela 1

Substituições de Aminoácidos

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ala Vai, Leu, Ile Vai Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg Ile Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu Norleucina, Ile, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, Ácido 1,4 Diamino-butírico, Gin, Asn Arg Met Leu, Phe, Ile Leu 51 (continuação)

Residuos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Phe Leu, Vai, Ile, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Um especialista na técnica será capaz de determinar variantes adequados do polipéptido, como aqui exposto, utilizando técnicas bem conhecidas. Em determinadas formas de realização, um especialista na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas, sem destruição de actividade, visando regiões que não se consideram importantes para actividade. Noutras formas de realização, o especialista na técnica pode identificar residuos e porções das moléculas que são conservadas de entre polipéptidos semelhantes. Em formas de realização adicionais, até mesmo áreas que podem ser importantes para actividade biológica ou para estrutura, podem ser submetidas a substituições conservativas de aminoácidos, sem destruição da actividade biológica ou sem afectar adversamente a estrutura polipeptidica. 52

Além disso, um especialista na técnica pode rever estudos de estrutura-função identificando resíduos em polipéptidos semelhantes que sejam importantes para actividade ou estrutura. Em vista dessa comparação, o especialista na técnica pode prever a importância de resíduos de aminoácidos numa proteína que correspondem a resíduos de aminoácidos importantes para actividade ou estrutura em proteínas semelhantes. Um especialista na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para esses resíduos de aminoácidos importantes previstos.

Um especialista na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos em relação à estrutura em polipéptidos semelhantes. Em vista dessa informação, um especialista na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo, com respeito à sua estrutura tridimensional. Em determinadas formas de realização, um especialista na técnica pode escolher não realizar alterações radicais em resíduos de aminoácidos previstos como estando na superfície da proteína, visto que esses resíduos podem estar envolvidos em interacções importantes com outras moléculas. Além disso, um especialista na técnica pode gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. Os variantes podem ser, depois, rastreados utilizando ensaios de actividade, conhecidos dos especialistas na técnica. Esses variantes poderiam ser utilizados para reunir informação acerca de variantes adequados. Por exemplo, se fosse verificado que uma alteração num resíduo de aminoácido particular resultasse em actividade destruída, indesejavelmente reduzida ou não adequada, os variantes com essa alteração podem ser evitados. Por outras palavras, com base em informação reunida a partir dessas experiências de rotina, um especialista 53 na técnica pode facilmente determinar os aminoácidos onde devem ser evitadas substituições adicionais, isoladamente ou em combinação com outras mutações.

Um número de publicações científicas foi dedicado à previsão da estrutura secundária. Ver Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 2;422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222-245,· Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol 4_7_: 45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. AJ_: 251-276; e Chou et al., 1979, Biophys. J. _2_6_: 367 — 384. Além disso, estão actualmente disponíveis programas de computador para auxiliarem na previsão da estrutura secundária. Um método de previsão da estrutura secundária é baseado em modelação de homologia. Por exemplo, dois polipéptidos ou proteínas que tenham uma identidade de sequência superior a 30% ou, de modo semelhante, superior a 40%, frequentemente têm topologias estruturais semelhantes. O recente crescimento da base de dados estrutural de proteína (PDB) proporcionou previsibilidade melhorada da estrutura secundária, incluindo o número potencial de enrolamentos dentro da estrutura de um polipéptido ou proteína. Ver Holm et al., 1999, Nucl. Acid Res. 277:244-247. Foi sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 2;369_376) que existe um número limitado de enrolamentos num determinado polipéptido ou proteína e que, assim que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural tornar-se-á dramaticamente mais precisa. Métodos adicionais de previsão de estrutura secundária incluem "reconhecimento de enrolamento" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. Ί_:3ΊΊ-8η; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), "análise de perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; 54

Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad Sei. 8_4: 4355-4358) e "associação genética evolutiva" (Ver Holm, 1999, supra; e Brenner, 1997, supra).

Em determinadas formas de realização, os variantes de anticorpo incluem variantes de glicosilação, em que o número e/ou tipo de sitio de glicosilação foi alterado, em comparação com as sequências de aminoácidos do polipéptido parental. Em determinadas formas de realizaçao, os variantes de proteína compreendem um maior ou um menor número de sítios de glicosilação ligada a N do que a proteína nativa. Um sítio de glicosilação ligada a N é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, na qual o resíduo de aminoácido, designado como X, pode ser qualquer resíduo de aminoácido, excepto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para criar esta sequência proporciona um potencial novo sítio para a adição de uma cadeia de hidratos de carbono ligada a N. Alternativamente, as substituições que eliminam esta sequência removerão uma cadeia de hidratos de carbonos ligada a N existente. Também é proporcionado um rearranjo de cadeias de hidratos de carbono ligadas a N, em que são eliminados um ou mais sítios de glicosilação ligada a N (tipicamente, os que são de ocorrência natural) e um ou mais novos sítios ligados a N são criados. Variantes de anticorpo preferidos adicionais incluem variantes de cisteína, em que um ou mais resíduos de cisteína são delecionados ou substituídos por outro aminoácido (e. g., serina), em comparação com a sequência de aminoácidos parental. Os variantes de cisteína podem ser úteis quando os anticorpos têm de ser reenrolados numa conformação biologicamente activa, tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. Os variantes de cisteína têm, em geral, menos resíduos de cisteína 55 do que a proteína nativa e, tipicamente, têm um número par, para minimizar interacções resultando de cisteínas desemparelhadas.

Em formas de realização adicionais, os variantes de anticorpo podem incluir anticorpos compreendendo um fragmento Fc modificado ou uma região constante de cadeia pesada modificada. Um fragmento Fc, que representa "fragmento que cristaliza", ou uma região constante de cadeia pesada, pode ser modificado por mutação para conferir num anticorpo características de ligação alteradas. Ver, por exemplo, Burton e Woof, 1992, Advances in Immunology 5_1: 1-84; Ravetch e Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 1_9: 275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem 276: 6591-6604; Telleman e Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol 2_8: 2092-2100). Essas mutações podem incluir substituições, adições, deleções ou qualquer sua combinação e são, tipicamente, produzidas por mutagénese dirigida pontual, utilizando um ou mais oligonucleótidos mutagénicos de acordo com métodos aqui descritos, assim como de acordo com métodos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3 a Ed. , 2001, Cold Spring Harbor, N.I. e Berger e Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA).

De acordo com determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formarem complexos de proteína, (4) alteram afinidades de ligação e/ou (5) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais nesses polipéptidos. De acordo com determinadas 56 formas de realização, as substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em determinadas formas de realização, substituições conservativas de aminoácidos) podem ser realizadas na sequência de ocorrência natural (em determinadas formas de realização, na porção do polipéptido fora do domínio(s) formando contactos intermoleculares) . Em formas de realização preferidas, uma substituição conservativa de aminoácidos, tipicamente, não altera substancialmente as características estruturais da sequência parental (e. g., uma aminoácido de substituição não deve tender a quebrar uma hélice que ocorre na sequência parental ou dissociar outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a sequência parental). Exemplos de estruturas polipeptídicas secundárias e terciárias reconhecidas pela técnica são descritos em PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Freeman e Company, Nova Iorque; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden e J. Tooze, ed.), 1991, Garland Publishing, Nova Iorque, N.I.; e Thornton et al., 1991, Nature 354:105.

Os análogos peptídicos são, geralmente, utilizados na indústria farmacêutica como fármacos não peptídicos, com propriedades análogas às do péptido modelo. Estes tipos de compostos não peptídicos são designados "miméticos peptídicos" ou "peptidomiméticos". Ver Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber & Freidinger, 1985, TINS p. 392; e Evans et ai., 1987, J. Med Chem. 3_0:1229. Esses compostos são, frequentemente, desenvolvidos com o auxílio de modelação molecular computorizada. Os miméticos peptídicos, que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis, podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profiláctico semelhante. Em geral, os peptidomiméticos são estruturalmente semelhantes a um polipéptido de paradigma (i. e., um polipéptido 57 que tem uma propriedade bioquímica ou actividade farmacológica) , tal como anticorpo humano, mas têm uma ou mais ligações peptídicas, opcionalmente substituídas por uma ligação, seleccionada de: -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma região consenso com um aminoácido D do mesmo tipo (e. g., lisina D em vez de lisina L) pode, em determinadas formas de realização, ser utilizada para gerar péptidos mais estáveis. Além disso, péptidos constrangidos, compreendendo uma sequência consenso ou uma variação de sequência consenso substancialmente idêntica, podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 6_1:387); por exemplo, pela adição de resíduos internos de cisteína capazes de formarem pontes dissulfureto intramoleculares que ciclizam o péptido. "Anticorpo" ou "péptido(s) de anticorpo" refere-se a um anticorpo intacto ou a um seu fragmento de ligação que compete com o anticorpo intacto por ligação específica. Em determinadas formas de realização, os fragmentos de ligação são produzidos por técnicas de ADN recombinante. Em formas de realização adicionais, os fragmentos de ligação são produzidos por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem mas não estão limitados a F(ab), F(ab'), F(ab,)2»· Fv e anticorpos de cadeia única. 0 termo "cadeia pesada" inclui qualquer polipéptido de imunoglobulina tendo sequência de região variável suficiente para conferir especificidade para NGF. 0 termo "cadeia leve" inclui qualquer polipéptido de imunoglobulina tendo sequência de região variável suficiente para conferir especificidade para 58 NGF. Uma cadeia pesada de comprimento completo inclui um domínio de região variável, VH, e três domínios de região constante, CH1, Ch2 e CH3. 0 domínio VH está na terminação amino do polipéptido e o domínio CH3 está na terminação carboxilo. 0 termo "cadeia pesada", como aqui utilizado, abrange uma cadeia pesada de comprimento completo e seus fragmentos. Uma cadeia leve de comprimento completo inclui um domínio de região variável, VL, e um domínio de região constante, CL. À semelhança da cadeia pesada, o domínio região variável da cadeia leve está na terminação amino do polipéptido. 0 termo "cadeia leve", como aqui utilizado, abrange uma cadeia leve de comprimento completo e seus fragmentos. Um fragmento F(ab) é constituído por uma cadeia leve e a CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula F(ab) não pode formar uma ligação dissulfureto com outra molécula de cadeia pesada. Um fragmento F(ab') contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios CH1 e CH2, de modo a que uma ligação dissulfureto intercadeia possa ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2· A região Fv compreende as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, mas não tem as regiões constantes. Os anticorpos de cadeia única são moléculas Fv, nas quais as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves foram ligadas por um ligante flexível, para formar uma cadeia de polipéptido simples que forma uma região de ligação do antigénio. Os anticorpos de cadeia única são discutidos em detalhe na Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 88/01649 e Patentes U.S. N° 4946778 e 5260203.

Compreende-se que um anticorpo bivalente que não um anticorpo "multiespecífico" ou "multifuncional", em determinadas 59 formas de realização, compreende sítios de ligação tendo especificidade antigénica idêntica.

Na avaliação da ligação e especificidade de anticorpo de acordo com a invenção, um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um ligando a um receptor, quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de ligando ligado a receptor em, pelo menos, cerca de 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ou mais (como medido, inter alia, utilizando um ensaio de ligação competitiva in vitro).

Por "anticorpo neutralizante" significa-se uma molécula de anticorpo que é capaz de bloquear ou reduzir substancialmente uma função efectora de um antigénio alvo ao qual se liga. Consequentemente, um anticorpo anti-NGF "neutralizante" é capaz de bloquear ou reduzir substancialmente uma função efectora, tais como ligação de receptor e/ou dedução de uma resposta celular de NGF. "Reduzir substancialmente" pretende significar, pelo menos, cerca de 60%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 70%, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 75%, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 80%, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 85%, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 90% de redução de uma função efectora do antigénio alvo (e. g., NGF humano). 0 termo "epitopo" inclui qualquer determinante, de um modo preferido, um determinante polipeptídico, capaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de célula T. Em determinadas formas de realização, os determinantes epitópicos incluem agrupamentos de superfície quimicamente activos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforilo ou grupos sulfonilo e, em determinadas formas 60 de realização, podem ter características estruturais tridimensionais especificas e/ou características de carga específicas. Um epitopo é uma região de um antigénio que está ligada por um anticorpo. Em determinadas formas de realização, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigénio quando reconhece, de um modo preferido, o seu antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em formas de realização preferidas, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antigénio quando a constante de dissociação de equilíbrio é ElCT8 M, de um modo mais preferido, quando a constante de dissociação de equilíbrio é flCT9 M e, de um modo muito preferido, quando a constante de dissociação é <1CT10 M.

Um anticorpo liga-se "essencialmente ao mesmo epitopo" que um anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epitopos idênticos ou de sobreposição estereoquímica. Os métodos mais largamente utilizados e rápidos para determinar se dois anticorpos se ligam a epitopos idênticos ou de sobreposição estereoquímica são os ensaios de competição, que podem ser configurados em todo o número de formatos diferentes, utilizando antigénio marcado ou anticorpo marcado. Habitualmente, o antigénio está imobilizado num substrato e a capacidade dos anticorpos não marcados bloquearem a ligação de anticorpos marcados é medida utilizando marcadores radioactivos ou enzimáticos. 0 termo "agente" é aqui utilizado para denotar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extracto preparado de materiais biológicos.

Como aqui utilizado, os termos "marcador" ou "marcado" referem-se à incorporação de um marcador detectável, e. g., por 61 incorporação de um aminoácido marcado radioactivamente ou conjugação a um polipéptido de fracções de biotina que podem ser detectadas por avidina marcada (e. g., estreptavidina compreendendo, de um modo preferido, um marcador detectável, tais como um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente ou uma actividade enzimática que podem ser detectados por métodos ópticos ou colorimétricos). Em determinadas formas de realização, o marcador também pode ser terapêutico. São conhecidos na técnica diversos métodos de marcação de polipéptidos e glicoproteínas e podem ser utilizados, de um modo vantajoso, nos métodos aqui divulgados. Exemplos de marcadores para polipéptidos incluem, mas não estão limitados, aos seguintes: radioisótopos ou radionuclideos (e. g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99mTC, 311In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (e. g.r isotiocianato de fluoresceina ou FITC, rodamina ou lantanideos fosforescentes), marcadores enzimáticos (e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), marcadores quimioluminescentes, marcadores de hapteno, tal como grupos biotinilo e epitopos polipeptidicos predeterminados, reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências de pares de fechos-éclair de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálicos ou caudas epitópicas). Em determinadas formas de realização, os marcadores são conjugados por braços espaçadores (tal como (CH2)n, onde n < cerca de 20) de diversos comprimentos para reduzir potencial impedimento estereoquímico. O termo "amostra biológica", como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado, a qualquer quantidade de um substância de um ente vivo ou ente anteriormente vivo. Esses entes vivos incluem, mas não estão limitados, a humanos, murganhos, macacos, ratos, coelhos e outros animais. Essas substâncias incluem, mas 62 nao estão limitadas a, sangue, soro, urina, células, órgãos, tecidos, osso, medula óssea, nódulos linfáticos e pele. 0 termo "agente farmacêutico ou fármaco", como aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição química, capaz de induzir um efeito terapêutico desejado, quando convenientemente administrado a um doente. A expressão "quantidade farmaceuticamente eficaz", em referência a uma composição farmacêutica compreendendo um ou uma pluralidade dos anticorpos da invenção, compreende-se que significa, de acordo com a invenção, uma quantidade da referida composição farmacêutica que é capaz de abolir, no doente considerado, a diminuição no limiar de sensibilidade a estímulos externos com o retorno deste limiar de sensibilidade para um nível comparável ao observado em indivíduos saudáveis.

Um "distúrbio" é qualquer estado que beneficiaria do tratamento de acordo com a presente invenção. "Distúrbio" e "estado" são aqui utilizados com o mesmo significado e incluem distúrbios mediados por NGF ou doenças mediadas por NGF, crónicos e agudos, incluindo os estados patológicos que predispõem o mamífero para o distúrbio em questão.

Os termos "doença mediada por NGF" e "distúrbio mediado por NGF" abrangem qualquer estado médico ou distúrbio associado a níveis aumentados de NGF ou sensibilidade aumentada a NGF incluindo mas não limitado a dor aguda, dor dentária, dor traumática, dor cirúrgica, dor resultando de amputação ou abcesso, causalgia, doenças desmielinizantes, nevralgia trigeminal, cancro, alcoolismo crónico, AVC, síndrome de dor talâmica, diabetes, síndrome de imunodeficiência adquirida ("SIDA"), toxinas e quimioterapia, cefaleia genérica, enxaqueca, 63 cefaleia histaminica, síndromes vasculares mistas e não vasculares, cefaleia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, distúrbios inflamatórios intestinais, síndrome intestinal irritável, distúrbios oculares inflamatórios, distúrbios inflamatórios ou instáveis da bexiga, psoríase, queixas cutâneas com componentes inflamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, nevrite, doenças vasculares de colagénio, estados inflamatórios crónicos, dor inflamatória e hiperalgesia e alodínia associadas, dor neuropática e hiperalgesia e alodínia associadas, dor de neuropatia diabética, causalgia, dor mantida de um modo simpático, síndromes de desaferentação, asma, lesão ou disfunção de tecido epitelial, herpes simplex, perturbações da motilidade visceral em regiões respiratórias, geniturinárias, gastrointestinais ou vasculares, feridas, queimaduras, reacções alérgicas da pele, prurite, vitiligo, distúrbios gastrointestinais genéricos, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite vasomotora ou alérgica ou distúrbios brônquicos, dismenorreia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite e visceralgia.

Como aqui utilizados, os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz", quando utilizados fazendo referência a um veículo ou uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais anticorpos humanos anti-NGF humano, referem-se a uma quantidade ou dosagem suficiente para produzir um resultado desejado (i. e., onde, para terapia com o veículo ou anticorpos humanos anti-NGF humano da presente invenção, o resultado desejado é a redução desejada na inflamação e/ou dor, por exemplo) ou ao suporte de uma diminuição observável no nível de uma ou mais actividades biológicas de NGF. De um modo mais específico, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma 64 quantidade do(s) anticorpo(s) humano(s) anti-NGF humano suficiente para inibir, durante um período de tempo, um ou mais dos processos patológicos clinicamente definidos associados ao estado em questão, e. g., inflamação ou dor, num indivíduo tratado in vivo com o agente. Na presente invenção, uma "quantidade eficaz" de um anticorpo anti-NGF pode prevenir, parar, controlar ou reduzir a percepção de dor associada a qualquer estado médico doloroso. Nos métodos da presente invenção, o termo "controlar" e seus variantes gramaticais, são utilizados para se referirem à prevenção, inibição parcial ou completa, redução, atraso ou abrandamento de um evento não desejado, e. g., dor. A quantidade eficaz pode variar, dependendo do veículo específico ou anticorpo(s) humano(s) anti-NGF humano seleccionado(s) e também está dependente de uma variedade de factores e estados relacionados com o indivíduo a ser tratado e a gravidade do distúrbio. Por exemplo, se o veículo ou anticorpo (s) humano(s) anti-NGF humano forem para ser administrados in vivo, factores tais como a idade, peso e saúde do doente, assim como dados de curvas de dose-resposta e toxicidade obtidos em trabalho pré-clínico com animais, devem estar entre os considerados. Se o agente for para ser colocado em contacto com as células in vitro, também se deveria conceber uma variedade de estudos in vitro pré-clínicos para avaliar parâmetros, tais como absorção, meia-vida, dose, toxicidade, etc. A determinação de uma quantidade eficaz ou uma quantidade terapeuticamente eficaz para um determinado agente está bem dentro da capacidade dos especialistas na técnica.

Como aqui utilizados, os termos "factor de crescimento nervoso" e "NGF" são definidos como todas as espécies de mamíferos de NGF de sequência nativa, incluindo NGF 1-120 humano recombinante, mostrado como na SEQ ID N°: 30. 65

Como aqui utilizado "substancialmente puro" ou "substancialmente purificado" significa um composto ou espécie que é a espécie predominante presente (i. e., numa base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em determinadas formas de realização, uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie compreende, pelo menos, cerca de 50 por cento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em determinadas formas de realização, uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em determinadas formas de realização, a espécie é purificada até homogeneidade essencial (as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais), em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. O termo "doente" inclui indivíduos humanos e animais. "Tratamento" ou "tratar" refere-se a tratamento terapêutico e profiláctico ou medidas preventivas. Os que necessitam de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio, assim como os propensos a terem o distúrbio ou aqueles nos quais o distúrbio deve ser prevenido.

Salvo disposição em contrário pelo contexto, os termos singulares deverão incluir pluralidades e os termos no plural deverão incluir o singular.

De acordo com determinadas formas de realização da invenção, os anticorpos dirigidos para NGF podem ser utilizados 66 para tratar dor neuropática e inflamatória e doenças mediadas por NGF, incluindo mas não limitadas às mencionadas acima.

Num aspecto da invenção, são proporcionados anticorpos monoclonais totalmente humanos deduzidos contra e tendo especificidade biológica e imunológica para ligação a NGF humano. Noutro aspecto, a invenção proporciona ácidos nucleicos compreendendo sequências nucleotidicas codificando sequências de aminoácidos para moléculas de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, particularmente, sequências correspondendo às suas regiões variáveis. São formas de realização particulares deste aspecto da invenção sequências correspondendo a regiões determinantes de complementaridade (CDR), especificamente desde CDR1 até CDR3, das cadeias pesadas e leves proporcionadas pela invenção. Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona células de hibridoma e linhas celulares que expressam as moléculas de imunoglobulina e anticorpos, de um modo preferido, anticorpos monoclonais da invenção. A invenção também proporciona preparações de anticorpos biologicamente e imunologicamente purificadas, de um modo preferido, anticorpos monoclonais deduzidos contra e tendo especificidade biológica e imunológica para ligação a NGF humano. A capacidade para clonar e reconstruir loci humanos de megabases de tamanho em cromossomas artificiais de levedura (YAC) e para os introduzir dentro da linha germinal de murganho proporciona uma abordagem vantajosa para elucidar os componentes funcionais de loci muito grandes ou grosseiramente mapeados, assim como a geração de modelos úteis de doença humana. Além disso, a utilização dessa tecnologia para substituição de loci de murganho com os seus equivalentes humanos proporciona conhecimentos únicos da expressão e regulação de produtos 67 génicos humanos durante o desenvolvimento, sua comunicação com outros sistemas e o seu envolvimento na indução e progressão de doença.

Uma aplicação prática importante dessa estratégia é a "humanização" do sistema imunitário humoral do murganho. A introdução de loci de imunoglobulina humana (Ig) dentro de murganhos, nos quais os genes de Ig endógenos foram inactivados, oferece a oportunidade para estudar os mecanismos subjacentes à expressão e agrupamento programados de anticorpos, assim como o seu papel no desenvolvimento de células B. Além disso, essa estratégia proporciona uma fonte para produção de anticorpos monoclonais (MAb) totalmente humanos. 0 termo "anticorpo humano" inclui anticorpos tendo regiões variáveis e constantes correspondendo, substancialmente, às sequências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em determinadas formas de realização, os anticorpos humanos são produzidos em mamíferos não humanos incluindo mas não limitados a roedores, tais como murganhos e ratos, e lagomorfos, tal como coelhos. Em determinadas formas de realização, os anticorpos humanos são produzidos em células de hibridoma. Em determinadas formas de realização, os anticorpos humanos são produzidos recombinantemente. 0 termo "recombinante", em referência a um anticorpo, inclui anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes. Exemplos representativos incluem anticorpos expressos utilizando um vector de expressão recombinante transfectado dentro de uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes, anticorpos isolados de um animal (e. g., 68 um murganho) que é transgénico para genes de imunoglobulina humana (ver, e. g., Taylor, L.D., et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, (1992); ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer meio que envolva excisão de sequências génicas de imunoglobulina humana noutras sequências de ADN. Esses anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germinal humana.

Para utilização em terapia humana, os anticorpos humanos têm, pelo menos, três vantagens em relação a anticorpos não humanos e quiméricos: 1) devido à porção efectora do anticorpo ser humana, pode interagir melhor com as outras partes do sistema imunitário humano (e. g., destruir as células alvo mais eficientemente por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)); 2) o sistema imunitário humano não deverá reconhecer o anticorpo humano como estranho e, por conseguinte, a resposta de anticorpo contra esse anticorpo injectado deverá ser menor do que contra um anticorpo não humano totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho; 3) foi referido que os anticorpos não humanos injectados têm uma meia-vida na circulação humana muito mais curta do que a meia-vida de anticorpos humanos. Os anticorpos humanos injectados terão uma meia-vida essencialmente idêntica à de anticorpos humanos de ocorrência natural, 69 permitindo que sejam administradas doses mais baixas e menos frequentes.

Deste modo, espera-se que os anticorpos totalmente humanos minimizem as respostas imunogénicas e alérgicas intrínsecas aos Mab de murganho ou derivados de murganho e que, desse modo, aumentem a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. Os anticorpos totalmente humanos da invenção, por conseguinte, podem ser utilizados no tratamento da dor crónica e recorrente, o seu tratamento requerendo administração repetida de anticorpo. Deste modo, uma particular vantagem dos anticorpos anti-NGF da invenção é que os anticorpos são totalmente humanos e podem ser administrados a doentes num modo não agudo minimizando, simultaneamente, reacções adversas geralmente associadas a anticorpos anti-murganho humanos ou outros anticorpos não totalmente humanos anteriormente descritos de espécies não humanas.

Um especialista na técnica pode manipular estirpes de murganho, deficientes na produção de anticorpo de murganho com grandes fragmentos dos loci de Ig humana, de modo a que esses murganhos produzam anticorpos humanos na ausência de anticorpos de murganho. Fragmentos de grandes dimensões de Ig humana podem preservar a grande diversidade génica variável, assim como a correcta regulação da produção e expressão de anticorpo. Pela exploração da maquinaria celular de murganho para a diversificação e selecção de anticorpo e a ausência de tolerância imunológica a proteínas humanas, o repertório de anticorpo humano reproduzido nestas estirpes de murganho produz anticorpos de elevada afinidade contra qualquer antigénio de interesse, incluindo antigénios humanos. Utilizando a tecnologia 70 de hibridoma, podem ser produzidos e seleccionados MAb humanos específicos de antigénio com a especificidade desejada.

Podem ser empregues animais transgénicos (e. g., murganhos) que, na ausência de produção de imunoglobulina endógena, são capazes, após imunização, de produzirem um repertório completo de anticorpos humanos. A transferência da matriz génica de imunoglobulina de linha germinal humana nesses murganhos mutantes de linha germinal resultará na produção de anticorpos humanos após provocação de antigénio (ver, e. g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551-2555, (1993);

Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, (1993; Bruggemann et al., Year in Immun., 7:33 (1993); Nature 148:1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996); Gross, J.A., et al.,

Nature, 404:995-999 (2000); e patentes U.S. N° 5877397, 5874299, 5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126, 5569825 e 5545806) . Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de apresentação fágica (Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therap, Alan R Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147 ( 1):86-95 (1991) ) .

Os anticorpos humanos recombinantes também podem ser submetidos a mutagénese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências de Ig humana, mutagénese somática in vivo) e, deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões de VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas das relacionadas com sequências de VH e VL de linha germinal humana, podem não existir 71 naturalmente dentro do repertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo.

Em determinadas formas de realização, o especialista na técnica pode utilizar regiões constantes de espécies que não a humana, juntamente com a ou as regiões variáveis humanas nesses murganhos, para produzir anticorpos quiméricos.

Estrutura de Anticorpo de Ocorrência Natural

As unidades estruturais de anticorpo de ocorrência natural, tipicamente compreendem um tetrâmero. Cada desses tetrâmeros é, tipicamente, composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, tendo, cada par, uma cadeia "leve" de comprimento completo (tendo, tipicamente, um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento completo (tendo, tipicamente, um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). A porção amino-terminal de cada cadeia leve e pesada inclui, tipicamente, uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que é, tipicamente, responsável pelo reconhecimento de antigénio. A porção carboxilo-terminal de cada cadeia define, tipicamente, uma região constante responsável pela função efectora. As cadeias leves humanas são, tipicamente, classificadas como cadeias leves kappa e lambda. As cadeias pesadas são, tipicamente, classificadas como mu, delta, gama, alfa ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. A IgG tem várias subclasses incluindo mas não limitadas a IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. A IgM tem subclasses incluindo mas não limitadas a IgMl e IgM2. A IgA está igualmente subdividida em subclasses incluindo mas não limitadas a IgAl e IgA2. Dentro das cadeias leves e pesadas de comprimento 72 completo, tipicamente, as regiões variáveis e constantes estão unidas por uma região "J", de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a região pesada incluindo também uma região "D", de cerca de 10 aminoácidos mais. Ver, e. g., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Cap. 7, 2a ed., (Paul, W., ed.), 1989, Raven Press, N.I. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam, tipicamente, o sitio de ligação do antigénio.

As regiões variáveis exibem, tipicamente, a mesma estrutura geral de regiões de estrutura (FR) relativamente conservadas, unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões determinantes de complementaridade ou CDR. As CDR das duas cadeias de cada par estão, tipicamente, alinhadas pelas regiões de estrutura, que podem possibilitar a ligação a um epitopo especifico. De N-terminal para C-terminal, as regiões variáveis de cadeias leves e pesadas compreendem, tipicamente, os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio está, tipicamente, de acordo com as definições de Kabat Sequences of Proteins of Immunological

Interest (1987 e 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), ou Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917,-Chothia et al., 1989, Nature 342 ; 878-883.

Anticorpos Bi-específicos ou Bifuncionais

Um anticorpo bi-específico ou bifuncional é, tipicamente, um anticorpo híbrido artificial, tendo dois pares de cadeia pesada/cadeia leve diferentes e dois sítios de ligação diferentes. Os anticorpos bi-específicos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos F(ab'). Ver, e. g., 73

Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. T9_: 315-321;

Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.

Preparação de Anticorpos A invenção proporciona anticorpos que se ligam a NGF humano. Estes anticorpos podem ser produzidos por imunização com NGF de comprimento completo ou seus fragmentos. Os anticorpos da invenção podem ser policlonais ou monoclonais e/ou podem ser anticorpos recombinantes. Em formas de realização preferidas, os anticorpos da invenção são anticorpos humanos preparados, por exemplo, por imunização de animais transgénicos, capazes de produzirem anticorpos humanos (ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional, Publicação WO 93/12227) .

As regiões determinantes de complementaridade (CDR) das regiões variáveis de cadeias leves e cadeias pesadas de anticorpos anti-NGF da invenção podem ser enxertadas em regiões de estrutura (FR) da mesma ou outra espécie. Em determinadas formas de realização, as CDR das regiões variáveis de cadeias leves e cadeias pesadas do anticorpo anti-NGF podem ser enxertadas em FR consenso humanas. Para criar FR consenso humanas, as FR de várias sequências de aminoácidos de cadeias pesadas ou cadeias leves humanas são alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos consenso. As FR da cadeia pesada ou cadeia leve de anticorpo anti-NGF podem ser substituídas com as FR de uma cadeia pesada ou cadeia leve diferente. Os aminoácidos raros nas FR das cadeias pesadas e leves do anticorpo anti-NGF não são, tipicamente, substituídos, enquanto o resto dos aminoácidos de FR podem ser substituídos. Os aminoácidos raros são aminoácidos específicos que estão em posições nas quais não 74 se encontram habitualmente nas FR. As regiões variáveis enxertadas de anticorpos anti-NGF da invenção podem ser utilizadas com uma região constante que é diferente da região constante do anticorpo anti-NGF. Alternativamente, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia única. 0 enxerto de CDR é descrito, e. g., nas Patentes U.S. N° 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 e 5530101.

Os anticorpos da invenção são, de um modo preferido, preparados utilizando murganhos transgénicos que têm uma porção substancial do lócus de produção de anticorpo humano inserido em células de produção de anticorpo dos murganhos e que são, ainda, manipulados para serem deficientes na produção de anticorpos endógenos, murinos. Esses murganhos são capazes de produzirem moléculas e anticorpos de imunoglobulina humana e não produzem, ou produzem quantidades substancialmente reduzidas, de moléculas e anticorpos de imunoglobulina murina. As tecnologias utilizadas para alcançar este resultado são divulgadas nas patentes, pedidos e referências divulgados na presente descrição. Em formas de realização preferidas, o especialista pode empregar métodos como divulgados na Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 98/24893 que é, para qualquer efeito, por este meio incorporado por referência. Ver, também Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156 .

Os anticorpos monoclonais (mAb) da invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo a metodologia de anticorpo monoclonal convencional, e. g., a técnica de hibridação de célula somática padrão de Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495). Embora sejam preferidos os processos de hibridação de célula somática, em principio, podem ser empregues outras técnicas para a produção de anticorpos 75 monoclonais, e. g., transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. 0 sistema animal preferido, para preparação de hibridomas é o murganho. A produção de hibridomas no murganho está muito bem estabelecida e os protocolos e técnicas de imunização para o isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são bem conhecidos na técnica. Os parceiros de fusão (e. g., células de mieloma murino) e processos fusão também são conhecidos.

Numa forma de realização preferida, os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra NGF podem ser gerados utilizando murganhos transgénicos transportando partes do sistema imunitário humano, em vez do sistema de murganho. Estes murganhos transgénicos, aqui referidos como murganhos "HuMab", contêm um minilócus do gene de imunoglobulina humana, que codifica sequências não rearranjadas de cadeia pesada (μ e γ) e cadeia leve κ de imunoglobulina humana, juntamente com mutações direccionadas que inactivam os loci endógenos de cadeia μ e κ (Lonberg et ai., 1994, Nature 368:856-859) . Consequentemente, os murganhos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de murganho e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e cadeia leve humanos introduzidos sofrem uma troca de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgG κ humanos de elevada afinidade (Lonberg et ai., supra; Lonberg e Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol L3:65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação de murganhos HuMab é descrita em detalhe em Taylor et ai., 1992, Nucleic Acids Res. 2_0:6287-6295; Chen et ai., 1993, International Immunology _5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor 76 et al., 1994, International Immunology 6_: 579 — 591; Lonberg &

Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. L3:65-93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad Sei 764:536-546; Fishwild et al., 1996,

Nature Biotechnology 1_4 :845-851. Ver, ainda, as Patentes U.S. N° 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; e 5770429; todas de Lonberg e Kay, assim como a Patente U.S. N° 5545807 de Surani et al. ; Publicações de Pedido de Patente Internacional N° WO 93/1227, publicada a 24 de Junho de 1993; WO 92/22646, publicada 23 de

Dezembro de 1992 e WO 92/03918, publicada a 19 de Março de 1992. Alternativamente, as estirpes de murganhos transgénicos HCo7, HCol2 e KM, descritas nos Exemplos abaixo, podem ser utilizadas para gerar anticorpos anti-NGF humanos. A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais humanos que são específicos e neutralizam polipéptidos bioactivos de NGF humano. Também são proporcionadas sequências de aminoácidos de cadeia pesada e leve de anticorpo que são altamente especificas e neutralizam polipéptidos de NGF quando estão ligadas a estes. Esta elevada especificidade possibilita que os anticorpos humanos anti-NGF humano e anticorpos monoclonais humanos com especificidade semelhante sejam imunoterapia eficaz para doenças associadas a NGF. São aqui descritos anticorpos humanos isolados que se ligam ao mesmo ou essencialmente ao mesmo epitopo que o anticorpo 4D4 aqui proporcionado. São aqui descritos anticorpos humanos isolados compreendendo, pelo menos, uma das sequências de aminoácidos mostrada nas SEQ ID N° : 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 79-130 que se ligam a um epitopo de polipéptido de NGF com elevada 77 afinidade e têm a capacidade de antagonizar a actividade de polipéptido de NGF. Estes anticorpos humanos ligam-se ao mesmo ou essencialmente mesmo epitopo que o anticorpo 4D4 aqui proporcionado.

Também são aqui descritos anticorpos humanos isolados que se ligam a polipéptido de NGF com uma constante de dissociação (KD) de 1 x 1CT9 M ou inferior e inibem a sobrevivência induzida por NGF num ensaio de neutralização in vitro, com uma IC50 de 1 x 1CT7 M ou inferior. Em determinados aspectos, os anticorpos humanos isolados ligam-se a polipéptido de NGF com uma constante de dissociação (KD) de 1 x 10' ~10 M ou inferior e inibem a sobrevivência induzida por NGF num ensaio de neutralização in vitro, com uma IC50 de 1 x 1CT8 M ou inferior. Em determinados aspectos, os anticorpos humanos anti-NGF isolados ligam-se a polipéptido de NGF humano, com uma constante de dissociação (KD) de 1 x 1CT11 M ou inferior e inibem a sobrevivência induzida por NGF num ensaio in vitro, com uma IC50 de 1 x 10~9 M ou inferior. São aqui descritos exemplos de anticorpos humanos anti-NGF humano que cumprem os critérios de ligação e neutralização mencionados acima. 0 anticorpo humano anti-NGF humano da presente invenção é aqui referido como 4D4 e tem sequências polipeptídicas de VL e VH, como mostradas nas SEQ ID N°: 12 e SEQ ID N°: 10, respectivamente. A sequência polinucleotidica codificando a VL e VH de 4D4 é mostrada na SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 9, respectivamente. As propriedades dos anticorpos humanos anti-NGF humano da presente invenção são especificamente divulgadas nos Exemplos. É particularmente notável a elevada afinidade para polipéptido de NGF e elevada capacidade de antagonizar a actividade de polipéptido de NGF aqui demonstradas. 78 A constante de dissociação (KD) de um anticorpo humano anti-NGF humano pode ser determinada por ressonância de plasmónio de superfície, como descrito, em geral, no Exemplo 9. Em geral, a análise de ressonância de plasmónio de superfície mede interacções de ligação em tempo real entre ligando (polipéptido de NGF recombinante imobilizado numa matriz biossensora) e analito (anticorpos em solução) por ressonância de plasmónio de superfície (SPR), utilizando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) . A análise de plasmónio de superfície também pode ser realizada pela imobilização do analito (anticorpos numa matriz biossensora) e apresentação do ligando (V recombinante em solução). A constante de dissociação (KD) de um anticorpo humano anti-NGF humano também pode ser determinada pela utilização da metodologia de KinExA. Em determinadas formas de realização da invenção, os anticorpos ligam-se a NGF com uma KD compreendida entre, aproximadamente, 1CT8 M e IO-12 M. Pretende-se que o termo "KD", como aqui utilizado, se refira à constante de dissociação de uma particular interacção de anticorpo-antigénio. Para efeitos da presente invenção, a KD foi determinada como mostrado no Exemplo 9 .

Em formas de realização preferidas, os anticorpos da invenção são do isotipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. De um modo preferido, os anticorpos são do isotipo IgG3. De um modo mais preferido, os anticorpos são do isotipo IgGl. De um modo muito preferido, os anticorpos são do isotipo IgG2. Noutras formas de realização, os anticorpos da invenção são do isotipo IgM, IgA, IgE ou IgD. Em formas de realização preferidas da invenção, os anticorpos compreendem uma cadeia leve kappa humana e uma cadeia pesada IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. A expressão de anticorpos da invenção compreendendo uma região constante de 79 cadeia pesada de IgGl ou de IgG2 é descrita nos Exemplos abaixo. Em formas de realização particulares, as regiões variáveis dos anticorpos estão ligadas a uma região constante que não a região constante para o isotipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em determinadas formas de realização, os anticorpos da invenção foram clonados para expressão em células de mamífero.

Em determinadas formas de realização, as modificações conservativas às cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos anti-NGF (e modificações correspondentes aos nucleótidos codificantes) produzirão anticorpos anti-NGF, tendo características funcionais e químicas semelhantes às dos anticorpos anti-NGF aqui descritos. Em contraste, as modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas dos anticorpos anti-NGF podem ser realizadas pela selecção de substituições na sequência de aminoácidos das cadeias pesadas e leves que diferem significativamente no seu efeito na manutenção (a) da estrutura do esqueleto molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) do volume da cadeia lateral.

Por exemplo, uma "substituição conservativa de aminoácido" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não nativo, de modo a que haja pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido nessa posição. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipéptido também pode ser substituído com alanina, como foi anteriormente descrito para "mutagénese de rastreio de alanina". 80

As substituições de aminoácidos desejadas (conservativas ou não conservativas) podem ser determinadas pelos especialistas na técnica, no momento que essas substituições sejam desejadas. Em determinadas formas de realização, as substituições de aminoácidos podem ser utilizadas para identificar resíduos importantes do anticorpo anti-NGF ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos anti-NGF aqui descritos.

Como é bem sabido, alterações menores numa sequência de aminoácidos, tais como deleção, adição ou substituição de um, alguns ou até vários aminoácidos, podem conduzir a uma forma alélica da proteína original que tem propriedades substancialmente idênticas. Por conseguinte, além dos anticorpos especificamente aqui descritos, outros anticorpos "substancialmente homólogos" podem ser facilmente concebidos e preparados, utilizando diversas técnicas de ADN recombinante bem conhecidas dos especialistas na técnica. Em geral, as modificações dos genes podem ser facilmente alcançadas por uma variedade de técnicas bem conhecidas, tal como mutagénese dirigida pontual. Por conseguinte, a presente invenção contempla anticorpos humanos anti-NGF "variantes" ou "mutantes", tendo características substancialmente semelhantes aos anticorpos humanos anti-NGF aqui divulgados (ver, por exemplo, o documento WO 00/56772). Deste modo, com o termo "variante" ou "mutante", em referência a um anticorpo humano anti-NGF, significa-se qualquer molécula de ligação (molécula X) (i) na qual as regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada ou as regiões hipervariáveis CDRl, CDR2 e CDR3 da cadeia leve, tomadas como um todo, são, pelo menos, 80% homólogas, de um modo preferido, pelo menos, 90% homólogas, de um modo mais preferido, pelo menos, 95% homólogas às regiões hipervariáveis como mostradas nas SEQ ID N°: 14, 18 e 22 ou SEQ ID N°: 16, 20 e 24, 81 respectivamente, e (ii) em que o variante ou mutante é capaz de inibir a actividade de NGF humano na mesma extensão que um anticorpo humano anti-NGF de referência tendo regiões de estrutura idênticas às da molécula X.

Habitualmente, um variante de anticorpo humano anti-NGF terá CDR de cadeias leves e/ou pesadas, quando tomadas como um todo, que têm, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 91% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 92% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 93% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 94% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 96% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 97% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 98% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 14, 18 e 22 e/ou SEQ ID N°: 16, 20 e 24, respectivamente.

De um modo mais preferido, um variante de anticorpo humano anti-NGF terá uma região variável de cadeia leve, quando tomada como um todo, que tem, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 81% de identidade de sequência, de um modo ainda 82 mais preferido, pelo menos, cerca de 82% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 83% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 84% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 86% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 87% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 88% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 89% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 91% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 92% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 93% de identidade de sequência de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 94% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 96% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 97% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 98% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ou 91 e/ou uma região variável de cadeia pesada, quando tomada como um todo, que tem, pelo menos, cerca de 70% de identidade de sequência de aminoácidos, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 75% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 81% de identidade de 83 sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 82% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 83% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 84% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 86% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 87% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 88% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 89% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 91% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 92% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 93% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 94% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 96% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 97% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 98% de identidade de sequência, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos como mostrada nas SEQ ID N°: 10, 81, 83, 85 ou 87.

Pretende-se que um "variante", em referência a um polinucleótido, se refira a uma molécula de ácido nucleico tendo, pelo menos, cerca de 75% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com uma sequência polinucleotidica da presente invenção. Habitualmente, um variante polinucleotidico terá, pelo 84 menos, cerca de 75% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 81% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 82% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 83% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 84% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 85% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 86% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 87% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 88% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 89% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 90% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 91% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 92% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 93% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 94% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 95% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 96% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 97% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 85 98% de identidade de sequência de ácidos nucleicos, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, cerca de 99% de identidade de sequência de ácidos nucleicos com uma nova sequência de ácidos nucleicos aqui divulgada. São aqui descritos anticorpos que têm uma percentagem de identidade com um anticorpo da invenção ou um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região CDR1, CDR2 ou CDR3 que tem uma percentagem de identidade com uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região CDR1, CDR2 ou CDR3 da invenção, como aqui mostrado no Exemplo 10 e Figuras 5-10. É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que é: pelo menos, 70% ou 75% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 10 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 80%, 85% ou 95% homóloga à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 81 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 80%, 85% ou 95% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 83 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 75%, 80% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 85 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 75% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na 86 SEQ ID N°: 8 7 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 56% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 79 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é: pelo menos, 75%, 80% ou 90% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 12 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 85% ou 90% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 80 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 74%, 90% ou 94% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 88 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 80%, 85% ou 87% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 89 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 85%, 90% ou 94% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 90 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 85%, 90%, 95% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 91 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 80%, 90%, 95% ou 96% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 82 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo 87 menos, 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 84 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; ou, pelo menos, 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 86 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma CDR1 de cadeia pesada humana, em que a CDR1 de cadeia pesada é uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 40% ou 60% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta nas SEQ ID N°: 98, SEQ ID N°: 105, SEQ ID N°: 110 ou SEQ ID N°: 22 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma CDR2 de cadeia pesada humana, em que a CDR2 de cadeia pesada é uma sequência de aminoácidos que é: pelo menos, 70%, 82% ou 94% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 99 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 76% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 106 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 59% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 18 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 117 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de 88 imunoglobulina imunologicamente funcional; ou, pelo menos, 70%, 75% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 111 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma CDR1 de cadeia leve humana, em que a CDR1 é uma sequência de aminoácidos que é: pelo menos, 70% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 101 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70%, 75%, 80% ou 90% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 95 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 75%, 80% ou 90% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 119 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 75%, 80% ou 90% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 122 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 80% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 125 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 75%, 80% ou 90% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 24 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 107 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; ou, pelo menos, 70% ou 80% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na 89 SEQ ID N°: 113 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma CDR2 de cadeia leve humana, em que a CDR2 é uma sequência de aminoácidos que é: pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 102 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 96 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 120 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 123 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 126 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 129 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 20 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 108 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 133 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de 90 imunoglobulina imunologicamente funcional; ou, pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 114 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional. É aqui descrito um anticorpo humano isolado que se liga especificamente ao factor de crescimento nervoso e compreende uma CDR3 de cadeia leve humana, em que a CDR3 é uma sequência de aminoácidos que é: pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 103 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 97 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 78% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 121 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 78% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 127 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 78% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 130 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 78% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 16 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 70% ou 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 109 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional; pelo menos, 78% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 134 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina 91 imunologicamente funcional; ou, pelo menos, 85% idêntica à sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N°: 115 ou um seu fragmento de ligação do antigénio ou de imunoglobulina imunologicamente funcional.

As sequências das regiões variáveis de cadeias pesadas e cadeias leves do anticorpo 4D4 são mostradas nas SEQ ID N°: 10 e 12, respectivamente. Contudo, muitos dos potenciais resíduos de contacto de CDR são passíveis de substituição por outros aminoácidos e permitem, ainda, ao anticorpo, reter afinidade substancial para o antigénio. Do mesmo modo, muitos dos resíduos de estrutura não em contacto com as CDR nas cadeias pesadas e leves podem acomodar substituições de aminoácidos das correspondentes posições de outros anticorpos humanos por aminoácidos consenso humanos ou de outros anticorpos de murganho, sem perda significativa da afinidade ou não imunogenicidade do anticorpo humano. A selecção de diversos aminoácidos alternativos pode ser utilizada para produzir versões dos anticorpos anti-NGF divulgados e seus fragmentos que têm combinações variáveis de afinidade, especificidade, não imunogenicidade, facilidade de preparação e outras propriedades desejáveis.

Em formas de realização alternativas, os anticorpos da invenção podem ser expressos em linhas celulares que não as linhas celulares de hibridoma. Nestas formas de realização, as sequências codificando anticorpos particulares podem ser utilizadas para transformação de uma célula hospedeira mamífera adequada. De acordo com estas formas de realização, a transformação pode ser alcançada utilizando qualquer método conhecido para a introdução de polinucleótidos dentro de uma célula hospedeira incluindo, por exemplo, empacotando o 92 polinucleótido num vírus (ou dentro de um vector virai) e transduzindo uma célula hospedeira com o vírus (ou vector) ou por processos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificados pelas Pat. U.S. N° 4399216, 4912040, 4740461 e 4959455. Em geral, o processo de transformação utilizado pode depender do hospedeiro a transformar. Os métodos para a introdução de polinucleótidos heterólogos dentro de células de mamífero são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados, a transfecção mediada por dextrano, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, encapsulamento do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e micro-injecção directa do ADN dentro dos núcleos.

Uma molécula de ácido nucleico codificando a sequência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada, uma região variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve ou uma região variável de cadeia leve de um anticorpo de NGF da invenção é inserida dentro de um vector de expressão apropriado, utilizando técnicas de ligação padrão. Numa forma de realização preferida, a região constante de cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpo anti-NGF está acrescentada à terminação C da região variável apropriada e está ligada a um vector de expressão. O vector é, tipicamente, seleccionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregue (i. e., o vector é compatível com a maquinaria da célula hospedeira, de modo a que a amplificação do gene e/ou expressão do gene possa ocorrer) . Para uma revisão dos vectores de expressão, ver METH. ENZ. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press. 93

Tipicamente, os vectores de expressão utilizados em qualquer das células hospedeiras conterão sequências para manutenção plasmidica e para clonagem e expressão de sequências nucleotidicas exógenas. Essas sequências, colectivamente referidas como "sequências flanqueadoras", em determinadas formas de realização, incluirão, tipicamente, uma ou mais das seguintes sequências nucleotidicas: um promotor, uma ou mais sequências estimuladoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência intrónica completa contendo um sitio dador e aceitador de excisão, uma sequência codificando uma sequência lider para secreção polipeptidica, um sitio de ligação de ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poliadaptadora para inserir o ácido nucleico codificando o polipéptido a expressar e um elemento marcador seleccionável. Cada destas sequências é discutida abaixo.

Opcionalmente, o vector pode conter uma sequência codificando uma "cauda", i. e., uma molécula oligonucleotídica localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência codificando o polipéptido do anticorpo anti-NGF; a sequência oligonucleotídica codifica poliHis (tal como hexaHis) ou outra "cauda", tais como FLAG, HA (vírus da influenza de hemaglutinina) , ou myc, para as quais existem anticorpos comercialmente disponíveis. Esta cauda está, tipicamente, fundida ao polipéptido após expressão do polipéptido e pode servir como um meio para purificação de afinidade ou detecção do anticorpo de NGF a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser alcançada, por exemplo, por cromatografia de coluna, utilizando anticorpos contra a cauda como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, a cauda pode ser subsequentemente removida do polipéptido de 94 tal como anticorpo anti-NGF purificado por diversos meios, utilizando determinadas peptidases para clivagem.

As sequências flanqueadoras podem ser homólogas (i. e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heterólogas (i. e., de uma espécie que não a espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbridas (i. e., uma combinação de sequências flanqueadoras de mais do que uma fonte), sintéticas ou nativas. Como tal, a fonte de uma sequência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, desde que a sequência flanqueadora seja funcional e possa ser activada pela maquinaria da célula hospedeira.

As sequências flanqueadoras úteis nos vectores desta invenção podem ser obtidas por qualquer de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as presentes sequências flanqueadoras úteis terão sido anteriormente identificadas por mapeamento e/ou por digestão de endonuclease de restrição e podem, deste modo, ser isoladas da fonte de tecido conveniente, utilizando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência nucleotídica total de uma sequência flanqueadora pode ser conhecida. Aqui, a sequência flanqueadora pode ser sintetizada utilizando os métodos aqui descritos para a síntese ou clonagem de ácido nucleico.

Se a totalidade ou apenas uma porção da sequência flanqueadora for conhecida, pode ser obtida utilizando a reacção de polimerização em cadeia (PCR) e/ou pelo rastreio de uma biblioteca genómica com uma sonda adequada, tais como um oligonucleótido e/ou fragmento de sequência flanqueadora, da mesma ou de outra espécie. Se a sequência flanqueadora não for conhecida, um fragmento de ADN contendo uma sequência 95 flanqueadora pode ser isolado de um fragmento de ADN maior que pode conter, por exemplo, uma sequência codificante ou mesmo outro gene ou genes. 0 isolamento pode ser realizado por digestão de endonuclease de restrição, para produzir o fragmento de ADN conveniente, seguido de isolamento utilizando purificação em gel de agarose, cromatografia de coluna Qiagen® (Chatsworth, CA) ou outros métodos conhecidos do especialista. A selecção de enzimas adequadas para realizar esta finalidade será facilmente evidente para alguém com conhecimentos gerais na técnica.

Uma origem de replicação é, tipicamente, uma parte dos vectores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente e a origem auxilia na amplificação do vector numa célula hospedeira. Se o vector de escolha não contiver um sitio de origem de replicação, pode ser quimicamente sintetizado com base numa sequência conhecida e ligado ao vector. Por exemplo, a origem de replicação do plasmideo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas e diversas origens virais (e. g., SV40, polioma, adenovirus, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus, tais como HPV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero. Em geral, o componente de origem de replicação não é necessário para vectores de expressão de mamífero (por exemplo, a origem de SV40 é frequentemente utilizada apenas porque também contém o promotor precoce do vírus.

Uma sequência de terminação de transcrição está, tipicamente, localizada 3' em relação à extremidade de uma região codificante polipeptídica e serve para terminar a transcrição. Habitualmente, uma sequência de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C, 96 seguido de uma sequência poli-T. Embora a sequência seja facilmente clonada de uma biblioteca ou até mesmo comercialmente adquirida como parte de um vector, também pode ser facilmente sintetizada utilizando métodos para síntese de ácido nucleico, tal como aqueles aqui descritos.

Um gene marcador seleccionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira cultivada num meio de cultura selectivo. Os genes marcadores de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, tetraciclina ou canamicina, para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos ou definidos. São marcadores seleccionáveis preferidos, o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. De um modo vantajoso, um gene de resistência à neomicina também pode ser utilizado para selecção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

Outros genes seleccionáveis podem ser utilizados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes que são requeridos para a produção de uma proteína crítica para o crescimento ou sobrevivência celular são reiterados em tandem dentro dos cromossomas de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero incluem a di-hidrofolato redutase (DHFR) e genes da timidina cinase sem promotor. Os transformantes de células de mamífero são colocados sob pressão de selecção, em que apenas os transformantes estão adaptados, de modo único, a sobreviverem, em virtude do gene 97 seleccionável presente no vector. A pressão de selecção é imposta pelo cultivo das células transformadas, sob condições nas quais a concentração de agente de selecção no meio é sucessivamente aumentada, conduzindo, desse modo, à amplificação do gene seleccionável e do ADN que codifica outro gene, tal como um anticorpo que se liga ao polipéptido de NGF. Como resultado, quantidades aumentadas de um polipéptido, tal como um anticorpo anti-NGF, são sintetizadas do ADN amplificado.

Um sitio de ligação de ribossoma é, habitualmente, necessário para a iniciação de tradução de ARNm e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma sequência de Kozak (eucariotas). 0 elemento está, tipicamente, localizado 3' em relação ao promotor e 5' em relação à sequência codificante do polipéptido a expressar.

Em alguns casos, tal como onde a glicosilação é desejada num sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, podem manipular-se as diversas pré-sequências ou pro-sequências para melhorar a glicosilação ou rendimento. Por exemplo, pode alterar-se o sitio de clivagem de peptidase de um péptido sinal particular ou adicionar-se pro-sequências, que também podem afectar a glicosilação. 0 produto proteico final pode ter, na posição -1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura), um ou mais aminoácidos adicionais incidentes à expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto proteico final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos verificados no sítio de clivagem de peptidase, conjugados à terminação amino. Alternativamente, a utilização de alguns sítios de clivagem enzimática pode resultar numa forma ligeiramente truncada do polipéptido desejado, se a enzima cortar nessa área dentro do polipéptido maduro. 98

Os vectores de expressão e clonagem da invenção irão, tipicamente, conter um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e ligado, de um modo operativo, à molécula codificando o anticorpo anti-NGF. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (i. e., 5') em relação ao codão de iniciação de um gene estrutural (geralmente, dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores são agrupados, de modo convencional, dentro de uma de duas classes: promotores indutíveis e promotores constitutivos. Os promotores indutíveis iniciam níveis aumentados de transcrição a partir de ADN sob o seu controlo, em resposta a alguma alteração nas condições de cultura, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, transcrevem de modo uniforme o gene ao qual estão ligados de um modo operativo, ou seja, com pouco ou nenhum controlo sobre a expressão génica. É bem conhecido um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Um promotor adequado está ligado, de um modo operativo, ao ADN codificando a cadeia pesada ou cadeia leve, compreendendo um anticorpo anti-NGF da invenção, pela remoção do promotor do ADN fonte por digestão de restrição enzimática e inserção da sequência promotora desejada dentro do vector.

Os promotores adequados para utilização com hospedeiros de levedura também são bem conhecidos na técnica. Estimuladores de levedura são utilizados, de um modo vantajoso, com promotores de levedura. Os promotores adequados para utilização com células hospedeiras de mamífero são bem conhecidos e incluem, mas não estão limitados, aos obtidos dos genomas de vírus, tais como poliomavírus, vírus da varíola das aves de capoeira, adenovírus (tal como Adenovírus 2), papilomavírus bovino, vírus do sarcoma 99 aviário, citomegalovirus, retrovirus, vírus da hepatite B e, de um modo muito preferido, Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores de mamífero adequados incluem promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, promotores do choque térmico e o promotor da actina.

Promotores adicionais que podem ser de interesse incluem mas não estão limitados a: promotor precoce de SV40 (Bemoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-10); promotor de CMV (Thomsen et ai., 1984, Proc. Natl. Acad USA 8_1:659-663) ; o promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 2_2 : 787-97) ; promotor da timidina cinase de herpes (Wagner et ai., 1981, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 7_8:1444-45) ; promotor e sequências regulatórias do gene da metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42) ; e promotores procarióticos, tal como o promotor da lactamase beta (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.

Natl. Acad. Sei. U.S.A., Ί5_:3Ί2Ί-31) ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 8_0:21-25) . Também são de interesse as seguintes regiões de controlo transcricional animal, que exibem especificidade de tecido e foram utilizadas em animais transgénicos: a região controlo do gene de elastase I que é activa em células acinosas pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 3_8:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor

Symp. Quant. Biol. 5_0:399-409 (1986); MacDonald, 1987,

Hepatology 7:425-515); a região de controlo do gene da insulina que é activa em células pancreáticas beta (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); a região de controlo do gene da imunoglobulina que é activa em células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 3_8:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7_: 1436-44) ; a região de controlo do vírus do tumor mamário de murganho que é activa em células 100 testiculares, da mama, linfóides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 4_5:485-95); a região de controlo do gene de albumina que é activa no fígado (Pinkert et ai., 1987, Genes and Devei. l_:268-76) ; a região de controlo do gene da alfa-feto-proteína que é activa no fígado (Krumlauf et ai., 1985, Mol. Cell. Biol., _5:1639-48; Hammer et ai., 1987, Science 235:53-58) ; a região de controlo do gene da alfa-l-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1:161-11); a região de controlo do gene da globina beta que é activa em células mielóides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-40; Kollias et al., 1986, Cell 4_6_: 89-94); a região de controlo do gene da proteína básica de mielina que é activa em células oligodendrocíticas no cérebro (Readhead et ai., 1987, Cell _48_: 703-12) ; a região de controlo do gene da cadeia leve 2 de miosina que é activa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314;283-86) ; e a região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrópica que é activa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-78) .

Uma sequência estimuladora pode ser inserida dentro do vector para aumentar a transcrição de ADN codificando a cadeia leve ou cadeia pesada, compreendendo um anticorpo anti-NGF da invenção por eucariotas superiores. Os estimuladores são elementos actuantes em cis de ADN, habitualmente, cerca de 10-300 pb em comprimento, que actuam no promotor para aumentar a transcrição. Os estimuladores são independentes em relação à orientação e posição, tendo sido verificados nas posições 5' e 3' em relação à unidade de transcrição. São conhecidas várias sequências estimuladoras, disponíveis de genes de mamífero (e. g., globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, contudo, é utilizado um estimulador de um vírus. O estimulador de SV40, o estimulador do promotor precoce de 101 citomegalovírus, o estimulador de polioma e estimuladores de adenovirus conhecidos na técnica são elementos estimuladores exemplificativos para a activação de promotores eucarióticos. Embora um estimulador possa ser posicionado no vector 5' ou 3' em relação a uma sequência codificante, está tipicamente localizado num sítio a 5' do promotor.

Os vectores de expressão da invenção podem ser construídos de um vector de partida, tal como um vector comercialmente disponível. Esses vectores podem ou não conter a totalidade das sequências flanqueadoras desejadas. Se uma ou mais das sequências flanqueadoras aqui descritas não estiverem já presentes no vector, podem ser individualmente obtidas e ligadas ao vector. Os métodos utilizados para a obtenção de cada das sequências flanqueadoras são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Depois de o vector ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico codificando cadeia leve, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo um anticorpo anti-NGF ter sido inserida dentro do sítio conveniente do vector, o vector completado pode ser inserido dentro de uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão polipeptídica. A transformação de um vector de expressão para um anticorpo anti-NGF dentro de uma célula hospedeira seleccionada pode ser alcançada por métodos bem conhecidos, incluindo transfecção, infecção, co-precipitação por fosfato de cálcio, electroporação, micro-injecção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE-dextrano ou outras técnicas conhecidas. 0 método seleccionado será, em parte, uma função do tipo de célula hospedeira a ser utilizada. Estes métodos e outros métodos 102 adequados sao bem conhecidos do especialista na técnica e são expostos, por exemplo, em Sambrook et al., supra.

Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza um anticorpo anti-NGF que pode ser subsequentemente recolhido do meio de cultura (se a célula hospedeira o segregar para dentro do meio) ou directamente da célula hospedeira que o produz (se não for segregado). A selecção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de diversos factores, tais como níveis de expressão desejados, modificações polipeptídicas que sejam desejáveis ou necessárias para actividade (tais como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de enrolamento numa molécula biologicamente activa.

As linhas celulares de mamífero, disponíveis como hospedeiros para expressão, são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas, a linhas celulares imortalizadas, disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas não limitadas a células de ovário de hámster Chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hámster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (e. g., Hep G2) e um número de outras linhas celulares. Em determinadas formas de realização, as linhas celulares podem ser seleccionadas através da determinação de que linhas celulares têm níveis de expressão elevados e produzem, de um modo constitutivo, anticorpos com propriedades de ligação de NGF. Noutra forma de realização, pode ser seleccionada uma linha celular da linhagem de célula B que não produz o seu próprio anticorpo mas tem uma capacidade para preparar e segregar um anticorpo heterólogo. 103

Os anticorpos da invenção são úteis para a detecção de NGF em amostras biológicas e identificação de células ou tecidos que produzem a proteina NGF. Os anticorpos da invenção, que se ligam especificamente a NGF, podem ser úteis no tratamento de doenças mediadas por NGF. Os referidos anticorpos podem ser utilizados em ensaios de ligação para detectar NGF e para inibir o NGF de formar um complexo com receptores de NGF. Os referidos anticorpos que se ligam a NGF e bloqueiam a interacção com outros compostos de ligação podem ter utilização terapêutica na modulação de doenças mediadas por NGF. Em formas de realização preferidas, os anticorpos para NGF podem bloquear a ligação de NGF ao seu receptor, o que pode resultar na disrupção da cascata de transdução de sinal induzida por NGF. A presente invenção também se refere à utilização de um ou mais dos anticorpos da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou estado doloroso causado por expressão aumentada de NGF ou sensibilidade aumentada a NGF num doente, tais como qualquer um dos distúrbios ou estados aqui divulgados.

Em formas de realização preferidas, a invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou uma pluralidade dos anticorpos da invenção, juntamente com um diluente, veículo, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. De um modo preferido, os materiais de formulação aceitáveis, às dosagens e concentrações empregues, são não tóxicos para os receptores. Em formas de realização preferidas, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos anti-NGF. 104

Em determinadas formas de realização, os materiais de formulação aceitáveis, às dosagens e concentrações empregues, são, de um modo preferido, não tóxicos para os receptores.

Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificação, manutenção ou conservação, por exemplo, do pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou libertação, adsorção ou penetração da composição. Nessas formas de realização, os materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio; tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina) ; agentes quelantes (tal como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, ciclodextrina beta ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina; espessantes; monossacáridos; dissacáridos; e outros hidratos de carbono (tais como glucose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas) ; agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de baixo peso molecular; contra-iões de formação de sal (tal como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, cloro-hexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcar (tais como manitol ou 105 sorbitol); agentes de suspensão; surfactantes ou agentes molhantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbato, tais como polissorbato 20, polissorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de melhoramento de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes de melhoramento de tonicidade (tais como halogenetos metálicos alcalinos, de um modo preferido, cloreto de sódio ou potássio, manitol, sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a Edição, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica óptima será determinada por um especialista na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de distribuição e dosagem desejada. Ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Em determinadas formas de realização, essas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de depuração in vivo dos anticorpos da invenção.

Em determinadas formas de realização, o veículo ou transportador primário numa composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso em natureza. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injecção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são veículos exemplificativos adicionais. Em formas de realização preferidas, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem tampão Tris, de pH de cerca 7,0-8,5, ou 106 tampão acetato, de pH de cerca 4,0-5,5 e podem, ainda, incluir sorbitol, sacarose, Tween-20 e/ou um respectivo substituto adequado. Em determinadas formas de realização da invenção, as composições de anticorpo anti-NGF podem ser preparadas para armazenamento pela mistura da composição seleccionada, tendo o grau de pureza desejado, com agentes de formulação opcionais (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra), na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, em determinadas formas de realização, o produto de anticorpo anti-NGF pode ser formulado como um liofilizado, utilizando excipientes apropriados, tal como sacarose.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser seleccionadas para distribuição parentérica. Alternativamente, as composições podem ser seleccionadas para inalação ou para distribuição através do aparelho digestivo, tal como oralmente. A preparação dessas composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da especialidade da técnica.

Os componentes de formulação estão presentes, de um modo preferido, em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Em determinadas formas de realização, são utilizados tampões para manter a composição a pH fisiológico ou a pH ligeiramente inferior, tipicamente dentro de uma gama de pH desde cerca de 5 a cerca de 8.

Quando for contemplada a administração parentérica, as composições terapêuticas para utilização nesta invenção podem ser proporcionadas na forma de uma solução aquosa apirogénica, parentericamente aceitável, compreendendo o anticorpo anti-NGF desejado num veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injecção parentérica é água 107 destilada estéril, na qual o anticorpo anti-NGF é formulado como uma solução isotónica, estéril, convenientemente preservada. Em determinadas formas de realização, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microsferas injectáveis, partículas bio-erodiveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que podem proporcionar libertação controlada ou prolongada do produto, que pode ser distribuído por meio de injecção de depósito. Em determinadas formas de realização, também pode ser utilizado ácido hialurónico, tendo o efeito de promover a duração prolongada na circulação. Em determinadas formas de realização, para introduzir a molécula de anticorpo desejada, podem ser utilizados dispositivos de distribuição de fármaco implantáveis.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas para inalação. Nestas formas de realização, os anticorpos anti-NGF são formulados, de um modo vantajoso, como um pó seco, inalável. Em formas de realização preferidas, as soluções de inalação de anticorpo anti-NGF também podem ser formuladas com um propulsor para distribuição de aerossol. Em determinadas formas de realização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar e métodos de formulação para o efeito são, ainda, descritos no Pedido de Patente Internacional W094/20069, que descreve a distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Também está contemplado que as formulações podem ser administradas oralmente. Os anticorpos anti-NGF que são administrados deste modo podem ser formulados com ou sem transportadores habitualmente utilizados na combinação de formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Em 108 determinadas formas de realização, pode ser concebida uma cápsula para libertar a porção activa da formulação no ponto no aparelho gastrointestinal, quando a biodisponibilidade está maximizada e a degradação pré-sistémica está minimizada. Podem ser incluídos agentes adicionais para facilitar a absorção do anticorpo anti-NGF. Também podem ser empregues diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes.

Uma composição farmacêutica da invenção é, de um modo preferido, proporcionada para compreender uma quantidade eficaz de um ou uma pluralidade de anticorpos anti-NGF numa mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a preparação de comprimidos. Pela dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veiculo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de aglutinação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

As composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para os especialistas na técnica, incluindo formulações envolvendo anticorpos anti-NGF em formulações de distribuição prolongada ou controlada. As técnicas para a formulação de uma variedade de outros meios de distribuição prolongada ou controlada, tais como transportadores lipossomais, microparticulas bio-erodíveis ou esferas porosas e injecções de depósito, também são conhecidas dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional WO 93/15722, 109 que descreve a libertação controlada de micropartículas poliméricas porosas para distribuição de composições farmacêuticas. As preparações de libertação prolongada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis, na forma de artigos perfilados, e. g., filmes ou microcápsulas. As matrizes de libertação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (como divulgados na Patente U.S N° 3773919 e Publicação de Pedido de Patente Europeia N° EP 058481), copolimeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed Mater. Res. 15_:16Ί-2Π e Langer, 1982, Chem. Tech. 1_2:98-105), acetato de etileno vinilico (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutirico (Publicação de Pedido de Patente Europeia N° EP 133988). As composições de libertação prolongada também podem incluir lipossomas que podem ser preparados por qualquer de vários métodos conhecidos na técnica. Ver, e. g., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688-3692; Publicação de Pedidos de Patente Europeia N° EP 036676; EP 088046 e EP 143949.

As composições farmacêuticas utilizadas para administração in vivo são, tipicamente, proporcionadas como preparações estéreis. A esterilização pode ser alcançada por filtração, através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser conduzida antes ou a seguir à liofilização e reconstituição. As composições para administração parentérica podem ser armazenadas na forma liofilizada ou numa solução. As composições parentéricas são, em geral, colocadas dentro de um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco de 110 solução intravenosa ou frasco-ampola tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injecção hipodérmica.

Assim que a composição farmacêutica tiver sido formulada, pode ser armazenada em frasquinhos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólida ou como um pó desidratado ou liofilizado. Essas formulações podem ser armazenadas numa forma pronta-a-utilizar ou numa forma (e. g., liofilizada) que é reconstituída antes da administração. A invenção também proporciona kits para a produção de uma unidade de administração de dose única. Os kits da invenção podem conter, cada, um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Em determinadas formas de realização desta invenção, são proporcionados kits contendo seringas pré-cheias simples e com múltiplas câmaras (e. g., seringas de líquido e liosseringas). A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica contendo anticorpo anti-NGF a ser empregue terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto terapêutico e objectivos. Um especialista na técnica entenderá que os níveis de dosagem apropriados para tratamento variarão dependendo, em parte, da molécula distribuída, da indicação para a qual o anticorpo anti-NGF está sendo utilizado, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho de órgão) e/ou estado (a idade e saúde geral) do doente. Em determinadas formas de realização, o clínico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico óptimo. Uma dosagem típica pode variar desde cerca de 0,1 pg/kg a cerca de 30 mg/kg ou mais, dependendo dos factores mencionados acima. Em formas de realização preferidas, a dosagem pode variar 111 desde 0,1 yg/kg a cerca de 30 mg/kg; de um modo mais preferido, desde 1 yg/kg a cerca de 30 yg/kg; ou, de um modo ainda mais preferido, desde 5 yg/kg a cerca de 30 mg/kg. A frequência do doseamento dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do anticorpo anti-NGF particular na formulação utilizada. Tipicamente, um clinico administra a composição até ser atingida uma dosagem que alcance o efeito desejado. A composição pode, por conseguinte, ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo ou como uma infusão continua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. O refinamento adicional da dosagem apropriada é rotineiramente realizado por alguém com conhecimentos gerais na técnica e está dentro do âmbito das tarefas rotineiramente realizadas pelos mesmos. As dosagens apropriadas podem ser apuradas através da utilização de dados de dose-resposta apropriados. Em determinadas formas de realização, os anticorpos da invenção podem ser administrados a doentes durante um período de tempo alargado. A administração crónica de um anticorpo da invenção minimiza a resposta imunitária ou alérgica adversa, geralmente associada a anticorpos que são deduzidos contra um antigénio humano num animal não humano, por exemplo, um anticorpo não totalmente humano produzido numa espécie não humana. A via de administração da composição farmacêutica está em conformidade com métodos conhecidos, e. g., oralmente, através de injecção pelas vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral intramuscular, intralesional; (intraparênquimatosa), intracerebroventricular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou por sistemas de libertação prolongada ou por 112 dispositivos de implantação. Em determinadas formas de realização, as composições podem ser administradas por injecção de bólus ou continuamente, por infusão ou por dispositivo de implantação. A composição também pode ser administrada localmente, por meio de implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado, sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Em determinadas formas de realização, se for utilizado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado dentro de qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser por meio de difusão, bólus de libertação temporizada ou administração continua.

Também pode ser desejável utilizar composições farmacêuticas de anticorpo anti-NGF de acordo com a invenção ex vivo. Nesses casos, células, tecidos ou órgãos que tenham sido removidos do doente são expostos a composições farmacêuticas de anticorpo anti-NGF, após o que as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta para dentro do doente.

Em particular, os anticorpos anti-NGF podem ser distribuídos pela implantação de determinadas células que foram geneticamente manipuladas, utilizando métodos, tais como os aqui descritos, para expressar e segregar o polipéptido. Em determinadas formas de realização, essas células podem ser células animais ou humanas e podem ser autólogas, heterólogas ou xenógenas. Em determinadas formas de realização, as células podem ser imortalizadas. Noutras formas de realização, de modo a diminuir a probabilidade de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas, para evitar a infiltração de tecidos 113 circundantes. Em formas de realização adicionais, os materiais de encapsulamento são, tipicamente, invólucros ou membranas poliméricos biocompativeis, semipermeáveis, que permitem a libertação do(s) produto(s) proteico(s) mas previnem a destruição das células pelo sistema imunitário do doente ou por outros factores prejudiciais dos tecidos circundantes.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos, incluindo as experiências conduzidas e resultados alcançados são proporcionados apenas para efeitos ilustrativos e não podem ser interpretados como limitando a invenção.

Exemplo 1

Geração de proteína NGF humana a partir de células de E. coli

Clonagem de rHu-NGF (1-120) A sequência nucleotídica codificando NGF humano foi amplificada de ADNc utilizando os iniciadores oligonucleotídicos com sequências como mostradas nas SEQ ID N°: 27 e SEQ ID N°: 28 e tecnologia de PCR padrão. O iniciador 5' cria um sítio de restrição Nde I e codão de iniciação de metionina imediatamente anterior ao codão 1 (serina) da sequência madura. 0 iniciador 3' cria um sítio de restrição BamHI imediatamente após o codão de terminação. O produto de PCR resultante foi purificado em gel, digerido com as endonucleases de restrição NdeI e BamHI e, 114 depois, ligado dentro do vector pCFM1656, também digerido com Nde I e BamHI. 0 ADN ligado foi transformado dentro de células hospedeiras competentes da estirpe 657 de E. coli. Os clones foram rastreados para a capacidade de produzirem o produto proteico recombinante e para possuírem um plasmideo tendo a sequência nucleotidica correcta (i. e., SEQ ID N°: 29). A sequência de aminoácidos do NGF 1-120 humano recombinante é mostrada como SEQ ID N°: 30. O vector de expressão pCFM1656 (ATCC N° 69576) era derivado do sistema vector de expressão descrito na Patente US N° 4710473. O plasmideo pCFM1656 pode ser derivado do plasmideo pCFM836 descrito (Patente N° 4710473) pela: (a) destruição dos dois sítios de restrição Ndel endógenos por preenchimento de extremidades com a enzima T4 polimerase, seguida de ligação de extremidades rombas; (b) substituição da sequência de ADN entre os sítios de restrição únicos Aatll e Ciai contendo o promotor PL sintético com um fragmento semelhante obtido de pCFM636 (patente N° 4710473) contendo o promotor PL e, depois, (c) substituição da pequena sequência de ADN entre os sítios de restrição únicos Ciai e Kpnl com oligonucleótido resultando do emparelhamento de duas sondas tendo sequências nucleotídicas como mostradas nas SEQ ID N°: 31 e SEQ ID N°: 32. A estirpe hospedeira K12 de E. coli (estirpe 657 Amgen) é um derivado de W1485 de E. coli (uma estirpe K12), obtida do E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT (estirpe 6159 CGSC). 115

Expressão de rHu-NGF(1-120)

As células de E. coli contendo a construção de expressão de NGF (como descrito acima) foram fermentadas em meio rico, no modo semicontínuo. As células foram cultivadas, a 30 °C, até uma D.O. a 600 nm de 49 e, depois, induzidas por mudança de temperatura para 42 °C. As células foram recolhidas por centrifugação, quatro horas após indução. A D.O. final foi 75. O rendimento de expressão foi determinado como sendo, aproximadamente, 0,15 g/L.

Reenrolamento e purificação de rHu-NGF(1-120) A pasta celular foi lisada num Microfluidizador, centrifugada, a 10000 X g, durante 30 minutos, o sedimento foi lavado com ácido desoxicólico a 1%, centrifugado como acima e o sedimento resultante foi, depois, lavado com água fria e recentrifugado. O sedimento resultante (WIB - corpos de inclusão lavados) foi ressuspenso em desnaturante, guanidina HC1 a 8 M, Tris a 50 mM, pH 8,5, contendo DTT a 10 mM e solubilizado, à temperatura ambiente, durante 1 hora, centrifugado a 10000 x g, durante 30 minutos e o sobrenadante foi cuidadosamente decantado e, depois, diluído 25 vezes para dentro de um tampão aquoso contendo um par redox, a 4 °C, durante 5 dias. O reenrolado resultante foi, depois, titulado a pH 3,0, filtrado através de um filtro de 0,45 μΜ. O reenrolado foi purificado utilizando uma coluna Sp-Sepharose fast flow, utilizando um gradiente de NaCl padrão. O agregado da coluna de permuta catiónica foi, subsequentemente, concentrado e as alíquotas foram congeladas a -80 °C. A pureza da proteína foi avaliada por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e analisado por coloração 116 de azul de Coomassie. Por este método, a proteína purificada foi superior a 90% da banda principal.

Exemplo 2

Produção de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra o Factor de Crescimento Nervoso (NGF)

Murganhos HuMab e KM Transgénicos

Os anticorpos monoclonais totalmente humanos para NGF foram preparados utilizando as estirpes HCo7, HCol2, HCo7+HCol2 e KM de murganhos transgénicos, cada qual expressa genes de anticorpo humano. Em cada destas estirpes de murganho, o gene endógeno de cadeia leve capa de murganho fora homozigoticamente dissociado como descrito em Chen et ai., (1993, EMBO J. 1_2:811-820) e o gene endógeno de cadeia pesada de murganho fora homozigoticamente dissociado como descrito no Exemplo 1 da Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 01/09187. Cada destas estirpes de murganho transporta um transgene de cadeia leve capa humana, KCo5, como descrito em Fishwild et ai., (1996, Nature Biotechnology _P4: 845-851) . A estirpe HCo7 transporta o transgene de cadeia pesada humana de HCo7, como

descrito nas Patentes U.S. N° 5545806, 5625825 e 5545807. A estirpe HCol2 transporta o transgene de cadeia pesada humana de HCol2, como descrito no Exemplo 2 da Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 01/09187. A estirpe HCo7+HCol2 transporta os transgenes de cadeia pesada de HCo7 e HCol2 e é hemizigótica para cada transgene. Os murganhos KM compreendem o transgene de cadeia pesada de SC20, como descrito em Tomizuka et ai., (1997, Nature Genet. 16, 133-143 e 2000, Proc. Natl. 117

Acad. Sei, 97, 722-727) . Este transgene não está integrado dentro de um cromossoma de murganho mas é, ao invés, propagado como um fragmento de cromossoma independente. 0 fragmento inclui, aproximadamente, 15 MB do cromossoma 14 humano. Contém o lócus integral de cadeia pesada humana, incluindo todos os segmentos génicos de VH, D e JH e todos os isotipos de região constante de cadeia pesada. Todas estas estirpes são aqui referidas como murganhos HuMab.

Imunizações de HuMab:

Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para NGF, os murganhos HuMab foram imunizados com NGF recombinante purificado, derivado de células E. coli como antigénio (Exemplo 1). Os esquemas gerais de imunização para murganhos HuMab são descritos em Lonberg et al., (1994, Nature 368:856- 859; Fishwild et al., supra., e Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 98/24884). Após a primeira infusão de antigénio, os murganhos tinham 6-16 semanas de idade. Uma preparação recombinante purificada (25-100 pg) de antigénio de NGF foi utilizada para imunizar os murganhos HuMab intraperitonealmente (IP) ou subcutaneamente (SC).

As imunizações dos murganhos transgénicos HuMab foram alcançadas utilizando antigénio em adjuvante completo de Freund e duas injecções, seguidas de 2-4 semanas de imunização IP (até um total de 9 imunizações) com o antigénio em adjuvante incompleto de Freund. Para cada antigénio, várias dúzias de murganhos foram imunizados. Foi imunizado um total de 118 murganhos das estirpes HCo7, HCol2, HCo7+HCol2 e KM com o 118 antigénio de NGF. A resposta imunitária foi monitorizada por sangramentos retroorbitais.

Para seleccionar murganhos HuMab produzindo anticorpos que se ligam a NGF, soro de murganhos imunizados foram testados por ELISA, como descrito por Fishwild et ai., supra. Resumidamente, placas de microtitulação foram revestidas com NGF recombinante purificado de E. coli (Exemplo 1), a 1-2 pg/mL, em PBS e 50 pL/poço incubados a 4 °C, de um dia para o outro, depois, bloqueadas com 200 pL/poço de soro de galinha a 5% em PBS/Tween (0,05%). As diluições de plasma de murganhos imunizados com NGF foram adicionadas a cada poço e incubadas, durante 1-2 horas, à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e, depois, incubadas com um reagente policlonal especifico de Fc de IgG de cabra anti-humano, conjugado a peroxidase de rábano (HRP), durante 1 hora, à temperatura ambiente. Placas foram lavadas com PBS/Tween e incubadas com um reagente policlonal especifico de Fc de IgG de cabra anti-humano, conjugado a peroxidase de rábano (HRP), durante 1 hora, à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram reveladas com substrato ABTS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Catálogo N° A-1888, 0,22 mg/mL) e analisadas espectrofotometricamente pela determinação da densidade óptica (D.O.), a comprimentos de onda desde 415-495 nm. Os murganhos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-NGF foram utilizados para produzir anticorpos monoclonais, como se descreve abaixo. 119

Geração de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais humanos para NGF

Os murganhos foram preparados para produção de anticorpos monoclonais pelo reforço com antigénio, intravenosamente, 2 dias antes do sacrifício e os baços foram removidos a seguir. Os esplenócitos de murganho foram isolados dos murganhos HuMab e fundidos com PEG a uma linha celular de mieloma de murganho, utilizando protocolos padrão. Tipicamente, para cada antigénio, foram realizadas 10-20 fusões. Resumidamente, as suspensões de células únicas de linfócitos esplénicos de murganhos imunizados foram fundidas a um quarto do número de células de mieloma de murganho não segregando P3X63-Ag8.653 (ATCC, N° de Acesso CRL 1580) com PEG a 50% (Sigma). As células foram plaqueadas a, aproximadamente, lxl05/poço em placas de microtitulação de fundo achatado, seguido de uma incubação de cerca de duas semanas em meio selectivo contendo soro bovino fetal a 10%, meio condicionado P388D1 (ATCC, N° de Acesso CRL TIB-63) a 10%, origen (IGEN) a 3-5% em DMEM (Mediatech, Catálogo N° CRL 10013, com elevado teor de glucose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais HEPES a 5 mM, 2-mercaptoetanol a 0,055 mM, gentamicina a 50 mg/mL e lx HAT (Sigma, Catálogo N° CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído com HT.

Os hibridomas resultantes foram rastreados para a produção de anticorpos específicos de antigénio. Os poços individuais foram rastreados por ELISA (descrito acima) para anticorpos de IgG monoclonais anti-NGF humano. Após a ocorrência de extenso crescimento de hibridoma, o meio foi monitorizado, habitualmente, após 10-14 dias. Os hibridomas segregando 120 anticorpo foram replaqueados, rastreados de novo e, se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-NGF foram subclonados, pelo menos, duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis foram, depois, cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

Selecção de Anticorpos Monoclonais Humanos que se Ligam a

NGF

Um ensaio ELISA, como descrito acima, foi utilizado para rastrear para hibridomas que mostravam reactividade positiva com imunogénio de NGF. Os hibridomas segregando um anticorpo monoclonal que se liga com elevada avidez a NGF foram subclonados e caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retinha a reactividade de células parentais (como determinado por ELISA), foi escolhido para preparação de um banco celular de 5-10 frasquinhos, armazenado em azoto líquido.

Um ELISA específico de isotipo foi realizado para determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais produzidos como aqui divulgado. Nestas experiências, os poços de placas de microtitulação foram revestidos com 50 pL/poço de uma solução de cadeia leve capa de murganho anti-humano, a 1 pg/mL, em PBS e incubados, a 4 °C, de um dia para o outro. Após bloqueio com soro de galinha a 5%, as placas foram feitas reagir com sobrenadante de cada anticorpo monoclonal testado e um controlo de isotipo purificado. As placas foram incubadas, à temperatura ambiente, durante 1-2 horas. Os poços foram, depois, feitos reagir com diversos anti-soros policlonais de cabra anti-humanos conjugados a peroxidase de rábano específicos de IgG humana e as placas foram reveladas e analisadas como descrito acima. 121

Os anticorpos monoclonais purificados de sobrenadantes de hibridoma que mostravam ligação significativa a NGF, como detectada por ELISA, foram ainda testados para actividade biológica, utilizando uma variedade de bioensaios, como se descreve abaixo.

Exemplo 3

Selecção e Clonagem de Anticorpos anti-NGF com Potente Actividade Neutralizante de NGF A eficácia dos anticorpos, inicialmente identificados no Exemplo 2 como inibidores da actividade de NGF (i. e., "neutralização" de NGF), foi avaliada pela medição da capacidade de cada péptido modificado bloquear a indução de NGF da expressão do receptor 1 vanilóide (VR1).

Culturas Neuronais de Gânglios das Raízes Dorsais

Os gânglios das raízes dorsais (DRG) foram dissecados, um por um, sob condições assépticas de todos os segmentos espinais de ratos embrionários de 19 dias de idade (E19) que foram cirurgicamente removidos do útero de ratos Sprague-Dawley de prenhez programada, terminalmente anestesiados (Charles River, Wilmington, MA). Os DRG foram recolhidos em meios L-15 gelados (GibcoBRL, Grand Island, N.I.) contendo soro de cavalo inactivado por calor (GibcoBRL) a 5% e qualquer tecido conjuntivo e vasos sanguíneos soltos foram removidos. Os DRG foram enxaguados duas vezes em solução salina tamponada com fosfatos de Dulbecco isenta de Ca2+ e Mg2+ (DPBS) , pH 7,4 122 (GibcoBRL). Os DRG foram, depois, dissociados em suspensão de células únicas, utilizando um sistema de dissociação de papaína (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Resumidamente, os DRG foram incubados numa solução de digestão contendo 20 U/mL de papaina em Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS), a 37 °C, durante cinquenta minutos. As células foram dissociadas por trituração através de pipetas de Pasteur polidas à chama, num meio de dissociação consistindo em MEM/F12 de Ham, 1:1, inibidor ovomucóide a 1 mg/mL e ovalbumina a 1 mg/mL e desoxirribonuclease I a 0,005% (DNase).

As células dissociadas foram sedimentadas, a 200 x g, durante cinco minutos e ressuspensas em EBSS contendo inibidor ovomucóide a 1 mg/mL, ovalbumina a 1 mg/mL e DNase a 0,005%. A suspensão celular foi centrifugada através de uma solução de gradiente contendo inibidor ovomucóide a 10 mg/mL, ovalbumina a 10 mg/mL, a 200 x g, durante seis minutos, para remover detritos celulares e, depois, filtrada através de uma malha de nylon de 88 pm (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) para remover quaisquer grumos. O número de células foi determinado com um hemocitómetro e as células foram semeadas dentro de placas de 96 poços revestidas com poli-ornitina a 100 pCg/mL (Sigma, St. Louis, MO) e laminina de murganho a 1 pg/mL (GibcoBRL), a 10 x 103 células/poço, em meio completo. O meio completo consistia em meio mínimo essencial (MEM) e F12 de Ham, 1:1, penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 pg/mL) e soro de cavalo inactivado por calor (GibcoBRL) a 10%. As culturas foram mantidas a 37 °C, C02 a 5% e 100% de humidade. Para controlar o crescimento de células não neuronais, foram incluídas no meio 5-fluoro-2'-desoxiuridina (75 pM) e uridina (180 pM). 123

Tratamento com NGF e anti-NGF

Duas horas após plaqueamento, as células foram tratadas com β-NGF recombinante humano (Amgen) ou β-NGF recombinante de rato (R&D Systems, Minneapolis, MN) , a uma concentração de 10 ng/mL (0,38 nM) . Os controlos positivos compreendendo anticorpo anti-NGF diluido em série (R&D Systems) foram aplicados a cada placa de cultura. Os anticorpos de teste foram adicionados a dez concentrações, utilizando diluições em série de 3,16 vezes. Antes de ser adicionada às culturas, a totalidade das amostras foi diluida em meio completo. O tempo de incubação foi 40 horas antes da medição da expressão de VR1.

Medição da Expressão de VR1 em Neurónios DRG

As culturas foram fixadas com paraformaldeido a 4% em solução salina equilibrada de Hank, durante quinze minutos, bloqueadas com Superblock (Pierce, Rockford, IL) e permeabilizadas com Nonidet P-40 (Sigma) a 0,25% em solução salina tamponada com Tris-HCl (Sigma) (TBS), durante uma hora, à temperatura ambiente. As culturas foram enxaguadas, uma vez, com TBS contendo Tween 20 (Sigma) a 0,1% e incubadas com IgG de coelho anti-VRl, durante meia hora, à temperatura ambiente, seguido de incubação de anticorpo secundário anti-coelho marcado com Eu (Wallac Oy, Turku, Finlândia), durante uma hora, à temperatura ambiente. As lavagens com TBS (3 x cinco minutos com agitação lenta) foram aplicadas após cada incubação de anticorpo. A solução Enhance (150 pL/poço, Wallac Oy) foi adicionada às culturas. O sinal de fluorescência foi, depois, medido num fluorómetro de resolução temporal (Wallac Oy). A expressão de VR1 em amostras tratadas com os péptidos 124 modificados foi determinada pela comparação com uma curva-padrão de titulação de NGF de 0-1000 ng/mL. A percentagem de inibição (comparada com inibição máxima possivel) do efeito de NGF na expressão de VR1 em neurónios DRG foi determinada pela comparação com controlos que não foram tratados com NGF. Os resultados são dados nas Tabelas 2 e 5.

As linhas celulares foram rotuladas N° 110-N° 129. Os anticorpos das linhas celulares N° 119, N° 124 e N° 125 demonstraram actividade de neutralização de NGF extremamente potente (Figura 1). A linha celular N° 124 era uma linha celular parental, também referida como 4D4. As linhas celulares N° 119 e N° 125 eram subclones da 4D4 parental. Uma amostra adicional do frasco-ampola original compreendendo o hibridoma N° 124 (4D4) foi cultivada e rotulada N° 167 (4D4).

Os anticorpos gerados pelo hibridoma N° 167 (4D4) foram submetidos ao mesmo ensaio de neutralização de NGF baseado em neurónios DRG que as amostras anteriores. O anticorpo N° 167 (4D4) demonstrou forte actividade anti-NGF, com uma IC50 de 0,50 nM (Figura 2), que foi consistente com a actividade das amostras N° 119, N° 124 e N° 125. As actividades das 4 amostras são mostradas na Tabela 2. 125

Tabela 2

Actividade Anti-hNGF em células DRG utilizando hNGF a 0,38 nM N° de Código IC50 119 (de 124) < 1,2 nM 124 (parental) < 0,57 nM 125 (de 124) < 0,3 nM 167 (da mesma amostra que 124)* 0,50 nM

Sequenciação N-terminal e Espectrometria de Massa

As amostras de anticorpos de hibridoma anti-NGF purificados foram preparadas para sequenciação de proteína e análise de LC/MS. Os anticorpos foram purificados a partir de meios condicionados pela concentração dos meios utilizando Amicon centriprep-3 0, até que o volume fosse inferior a 15 mL. Um lote de resina rProA (Pharmacia) foi lavado 4x com PBS e uma pasta a 50% preparada em PBS após a última lavagem. Uma quantidade apropriada de resina rProA (aproximadamente, 5 pg de anticorpo/pL de resina, mas utilizar não menos de 50 pL de resina) foi adicionada à amostra de anticorpo e incubada, de um dia para o outro, a 4 °C. A mistura de Ab-resina foi centrifugada e a fracção não ligada foi recolhida. Após adição de 0,5 mL de PBS e transferência para um tubo Spin-X (CoStar) de 0,45 pm, a amostra foi centrifugada a 10000 rpm, durante 3 min. A resina foi, a seguir, lavada, pelo menos, 3 vezes com 0,5 mL de PBS e, depois, foi adicionada glicina a 0,1 M (pH 2,7), a l,5x de volume de resina e incubada, durante 10 minutos, à temperatura ambiente, seguida de outra centrifugação, durante 3 minutos, a 10000 rpm, recolhendo o sobrenadante. Esta etapa de eluição foi repetida mais duas vezes e, depois, o sobrenadante 126 combinado foi neutralizado com 1/25 de volume de tris a 1,0 M (PH 9,2) .

Após uma etapa de filtração final, através de um novo tubo Spin-x (0,2 um), o anticorpo foi quantificado utilizando um ensaio de Bradford padrão, utilizando IgG humana como padrão ou, alternativamente, absorvência a 280 para amostras maiores. Um gel também foi corrido utilizando com 2 pg de cada amostra juntamente com 2 pg de IgGl,k humana (Sigma). Para espectrometria de massa, quatro microgramas das amostras foram desglicosilados, reduzidos e carregados num HPLC (HP1090) em linha ligado a um espectrómetro de massa Finingan LCQ. A cadeia leve foi separada da cadeia pesada por HPLC de fase reversa. As cadeias leves e cadeias pesadas também foram recolhidas para análise de sequenciação de proteína N-terminal.

Ambas as sequências N-terminais da cadeia leve e cadeia pesada da amostra de anticorpo anti-NGF N° 167 (4D4) corresponderam a ambas as sequências N-terminais da amostra do anticorpo anti-NGF N° 119 (4D4). Além disso, a massa medida dos anticorpos indicou que os anticorpos isolados dos hibridomas N° 167 e N° 119 eram os mesmos. A massa desdobrada medida (23096) da cadeia leve do anti-NGF N° 167 correspondeu à massa medida (23096) da cadeia leve do Ab anti-NGF N° 119.

Clonagem das Cadeias Pesadas e Leves do Anticorpo anti-NGF O hibridoma expressando o anticorpo monoclonal de ligação a NGF mais potente, 4D4.D7, foi utilizado como fontes para isolar ARN total utilizando o reagente TRIzol® (Invitrogen). O ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando um iniciador 127 aleatório, com um adaptador de extensão (5'-GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT-3') (SEQ ID N°: 33) e um ensaio preparativo de RACE 5' (rápida amplificação de extremidades de ADNc) foi realizado utilizando o kit GeneRacer™ (Invitrogen), de acordo com instruções do fabricante. Para preparação de ADNc codificando a cadeia leve completa, o iniciador directo foi o iniciador interno GeneRacer™ e o iniciador reverso foi 5'-GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG-3' (SEQ ID N°: 34). Para preparação de ADNc codificando a região variável da cadeia pesada, o iniciador directo foi o iniciador interno GeneRacer™ e o iniciador reverso foi 5' -TGA GGA CGC TGA CCA CAC G-3' (SEQ ID NO 35). Os produtos RACE foram clonados dentro de pCR4-T0P0 (Invitrogen) e as sequências determinadas. As sequências consenso foram utilizadas para conceber iniciadores para a amplificação por PCR da cadeia de anticorpo de comprimento completo.

Para preparação de ADNc codificando a cadeia leve kappa de 4D4.D7 anti-NGF, o iniciador de PCR 5' codificou a terminação amino da sequência sinal, um sitio de restrição enzimática XbaI e uma sequência de Kozak optimizada (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT GCC CGC TCA GCT CCT GGG-3' ; SEQ ID N°: 36). 0 iniciador 3' codificou a terminação carboxilo e codão de terminação, assim como um sitio de restrição Sal I (5'-CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3'; SEQ ID N° : 37) . 0 fragmento do produto de PCR resultante foi purificado, digerido com Xbal e SAII e, depois, isolado em gel e ligado dentro do vector expressão de mamífero pDSRa20 (ver a Publicação de Pedido Internacional N° WO 90/14363. O pDSRa20 foi produzido pela alteração do nucleótido 2563 em pDSRal9 de uma "Guanosina" para uma "Adenosina" por mutagénese dirigida pontual). 128

Para preparação de ADNc codificando a cadeia pesada de 4D4.D7 anti-NGF, o iniciador de PCR 5' codificou a terminação amino da sequência sinal, um sitio de restrição enzimática Xbal e uma sequência de Kozak optimizada (5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGG GCT GTG CTG GGT TTT CCT TGT T-3'; SEQ ID N°: 38). 0 iniciador 3' codificou a terminação carboxilo e codão de terminação, assim como um sitio de restrição Sall (5'-GCA TGT CGA CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G-3 '; SEQ ID N°: 39). 0 produto resultante foi purificado, digerido com Xba I e Sall, isolado em gel e ligado dentro do vector pDSRcx20. A massa calculada (23099), como determinada pela tradução da sequência nucleotidica em aminoácidos previstos e adição conjunta dos pesos moleculares dos aminoácidos, da sequência de ADN da cadeia leve do clone do Ab 4D4 anti-NGF, correspondeu à massa medida como determinada por espectrometria de massa. A massa medida, desdobrada (49479) da cadeia pesada do Ab N° 167 anti-NGF correspondeu à massa medida (49484) da cadeia pesada do Ab N° 119 anti-NGF e também correspondeu à massa teórica (49484) da sequência de ADN da cadeia pesada do clone do Ab 4D4 anti-NGF (Tabela 3), dentro do desvio instrumental.

Os dados da sequência de proteína N-terminal e LC/MS confirmaram que o hibridoma N° 119 expressava o mesmo anticorpo que o hibridoma N° 167. Além disso, a massa calculada dos anticorpos com base na sequência confirmou ainda a observação. 129

Tabela 3 - Sumário das Verificações de Espectrometria de Massa

Ab anti NGF Massa medida de Ab N° 167 Massa medida de Ab N° 119 Massa teórica derivada da sequência de ADN do Ab 4D4 cadeia leve 23096 23096 23099 cadeia pesada 49479 49484 49484

Exemplo 4

Expressão de Anticorpos Anti-NGF em Células de Ovário de Hámster Chinês (CHO) A expressão estável do mAb 4D4 anti-NGF foi alcançada por co-transfecção dos plasmídeos 4D4-cadeia pesada/IgG2 de pDSRcxl9 ou 4D4-cadeia pesada/IgGl de pDSRcxl9 e NGF-capa/pDSRal9 dentro de células de ovário de hámster Chinês (CHO) adaptadas à isenção de soro deficientes em di-hidrofolato redutase (DHFR-) , utilizando um método de fosfato de cálcio. As células transfectadas foram seleccionadas em meio contendo soro dialisado mas não contendo hipoxantina-timidina, para assegurar o crescimento de células expressando a enzima DHFR. Os clones transfectados foram rastreados utilizando ensaios, tal como ELISA, de modo a detectar a expressão do mAb 4D4 anti-NGF no meio condicionado. Os clones com expressão mais elevada foram submetidos a concentrações crescentes de metotrexato (MTX) para amplificação de DHFR. Os clones amplificados por MTX foram rastreados utilizando ensaios, tal como ELISA, de modo a detectar expressão mais elevada do mAb 4D4 anti-NGF no meio condicionado. Os clones com expressão mais elevada foram 130 submetidos a subclonagem para se obter uma população homogénea e criação de bancos celulares.

Os anticorpos anti-NGF recombinantes da invenção podem ser gerados em células de ovário de hámster Chinês deficientes em DHFR, utilizando o mesmo protocolo como descrito acima para o anticorpo monoclonal anti-NGF. As sequências de ADN codificando a cadeia pesada ou cadeia leve completas de cada anticorpo anti-NGF da invenção são clonadas dentro de vectores de expressão. As células CHOd são co-transfectadas com um vector de expressão capaz de expressar uma cadeia pesada completa e um vector de expressão expressando a cadeia leve completa do anticorpo anti-NGF apropriado. Por exemplo, para gerar o anticorpo anti-NGF, as células são co-transfectadas com um vector capaz de expressar uma cadeia pesada completa, compreendendo a sequência de aminoácidos como exposta na SEQ ID N° : 40 e um vector capaz de expressar uma cadeia leve completa, compreendendo a sequência de aminoácidos exposta na SEQ ID N°: 44. A Tabela 4 sumaria as cadeias pesadas completas e leves completas para os anticorpos 4D4 tendo diversas regiões constantes de cadeias pesadas de IgG. 131

Tabela 4

Anticorpo Região Variável de Cadeia Pesada + Região Constante de Cadeia Pesada Cadeia Pesada Completa 4D4(IgG2) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 4 SEQ ID N°: 40 4D4(IgGl) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 2 SEQ ID N°: 41 4D4(IgG4) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 6 SEQ ID N°: 42 4D4(IgG3) SEQ ID N°: 10 + SEQ ID N°: 26 SEQ ID N°: 43 Anticorpo Região Variável de Cadeia Leve + Região Constante de Cadeia Leve Cadeia Leve Completa 4D4 SEQ ID N°: 12 + SEQ ID N°: 8 SEQ ID N°: 44

Exemplo 5

Caracterizar a Actividade dos Anticorpos 4D4 anti-NGF

Os anticorpos 4D4 anti-NGF expressos de modo transiente, gerados em células cultivadas sob condições spinner (S) ou rotativas (R) , foram testados para confirmar a sua capacidade para neutralizar NGF num bioensaio de neutralização de NGF baseado em neurónios DRG, realizado como descrito acima (Exemplo 3).

Os anticorpos NGF foram expressos de modo transiente em células 293T adaptadas a suspensão isenta de soro. As transfecções foram realizadas como culturas de 500 mL ou 1 L.

Resumidamente, o inoculo celular (5,0 X 105 células/mL X volume 132 de cultura) foi centrifugado a 2500 RPM, durante 10 minutos, a 4 °C, para remover o meio condicionado. As células foram ressuspensas em DMEM isento de soro e centrifugadas de novo a 2500 RPM, durante 10 minutos, a 4 °C. Após aspiração da solução de lavagem, as células foram ressuspensas em meio de crescimento [DMEM/F12 (3:1) + IX Suplemento de Insulina-Transferrina-Selénio + IX Pen Strep Glut + L-Glutamina a 2 mM + HEPES a 20 mM + Pluronic F68 a 0,01%] numa cultura de frasco spinner de 1 L ou 3 L. A cultura de frasco spinner foi mantida numa placa de agitação magnética, a 125 RPM, que foi colocada numa incubadora humidificada, mantida a 37 °C e CO2 a 5%. O ADN plasmidico foi complexado ao reagente de transfecção num tubo cónico de 50 mL. O complexo de ADN-reagente de transfecção foi preparado em 5% do volume de cultura final em DMEM isento de soro. 1 yg de ADN plasmídico/mL d cultura foi, em primeiro lugar, adicionado a DMEM isento de soro, seguido de 1 yL de X-TremeGene RO-1539/mL de cultura. Os complexos foram incubados à temperatura ambiente durante, aproximadamente, 30 minutos e, depois, adicionados às células no frasco spinner. A transfecção/expressão foi realizada durante 7 dias, após a qual o meio condicionado foi recolhido por centrifugação a 4000 RPM, durante 60 minutos, a 4 °C.

Para as transfecções transientes de frascos rotativos, utilizaram-se células 293T aderentes, cultivadas e mantidas em DMEM suplementado com FBS a 5% + IX Aminoácidos Não Essenciais + IX Pen Strep Glut + IX Piruvato de Sódio. Aproximadamente, 4-5 X 107 células 293T foram semeadas em frascos rotativos de 850 cm2, de um dia para o outro. As células semeadas anteriormente foram, depois, transfectadas no dia seguinte utilizando o reagente de transfecção FuGeneô. A mistura de ADN - reagente de transfecção foi preparada em, 133

aproximadamente, 6,75 mL de DMEM isento de soro. 675 pL do reagente de transfecção FuGeneô foram, em primeiro lugar, adicionados, seguidos de 112,5 pg de ADN plasmidico. 0 complexo foi incubado, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A mistura integral foi, depois, adicionada a um frasco rotativo. O frasco rotativo foi gaseado com uma mistura de gás C02 a 5%, capsulado firmemente e colocado numa incubadora, a 37 °C, num suporte rotativo, girando a 0,35 RPM. A transfecção foi realizada, durante 24 horas, após o que o meio foi substituído com 100 mL de DMEM + IX Suplemento de Insulina-Transferrina-Selénio + IX Pen Strep

Glu + IX Aminoácidos Não Essenciais + IX Piruvato de Sódio. Tipicamente, foram obtidas duas colheitas de 48 horas de 100 mL de cada frasco rotativo. O meio condicionado isento de soro recolhido foi agregado em conjunto e centrifugado a 4000 RPM, durante 30 minutos, a 4 °C.

Os 4D4.IgGl e 4D4.IgG2 mostraram potente actividade, com valores de IC50 de cerca de 0,14 nM a cerca de 0,2 nM, contra NGF humano (Figura 2) . Os resultados do ensaio de actividade são sumariados na Tabela 5. Os anticorpos mostraram pouca actividade contra NGF de rato (Figura 3) . Os resultados assemelham-se à actividade dos anticorpos testados directamente a partir de hibridomas descritos acima. TABELA 5

Ab IC50 Θ hNGF (nM) IC50 @ rNGF (nM) 4D4.IgGl.R 0,1488 > 34 nM 4D4.IgGl.S 0,1587 > 45 nM 4D4.IgG2.R 0,2047 > 59 nM 134 (continuação)

Ab IC50 0 hNGF (nM) IC50 0 rNGF (nM) 4D4.IgG2.S 0,2063 > 37 nM hNGF = NGF humano, rNGF = NGF de rato, R = Cultura rotativa, S = Cultura spinner

Exemplo 6

Produção de anticorpo anti-NGF 0 anticorpo anti-NGF é produzido por expressão numa linha clonal de células CHO. Para cada fase de produção, as células de um único frasco-ampola são descongeladas para dentro de meios de cultura celular isentos de soro. As células são inicialmente cultivadas num frasco T, seguido de frascos spinner e, depois, cultivadas em reactores de aço inoxidável, de escala crescente até um biorreactor de 2000 L. A produção é efectuada num biorreactor de 2000 L, utilizando uma cultura em semicontínuo, na qual uma alimentação de nutriente contendo componentes de meios concentrados é adicionada para manter o crescimento celular e viabilidade de cultura. A produção subsiste durante, aproximadamente, duas semanas, tempo durante o qual o anticorpo anti-NGF é produzido, de modo constitutivo, pelas células e segregado para dentro do meio da cultura celular. 0 reactor de produção é controlado a um pH, temperatura e nível de oxigénio dissolvido predeterminados: o pH é controlado por adição de gás de dióxido de carbono e carbonato de sódio; o oxigénio dissolvido é controlado por fluxos gasosos de ar, azoto e oxigénio. 135

No final da produção, o caldo celular é alimentado a uma centrífuga de pilha de discos e o sobrenadante de cultura é separado das células. 0 concentrado é, ainda, clarificado através de um filtro de profundidade, seguido de um filtro de 0,2 pm. Os meios condicionados clarificados são, depois, concentrados por ultrafiltração de fluxo tangencial. Os meios condicionados são concentrados 15 a 30 vezes. O meio condicionado concentrado resultante é, depois, processado através de purificação ou congelado para purificação numa data ulterior.

Exemplo 7

Reactividade Cruzada com Outras Neurotrofinas

Os anticorpos 4D4 foram testados para a sua reactividade cruzada contra NT3 humano ou BDNF humano em bioensaios diferentes, incluindo o ensaio de sobrevivência de neurónios DRG para NT3 humano e o ensaio de absorção de DA em neurónios DA cultivados para BDNF humano.

Tratamento de culturas de DRG com os anticorpos sNT3, anti-NT3 e anti-NGF

Duas horas após plaqueamento, as células DRG (processo de isolamento descrito acima no Exemplo 3) foram tratadas com hNT-3 recombinante a 100 ng/mL (3,8 nM) . O anticorpo anti-hNT3 diluído em série (R&D) foi utilizado como um controlo positivo. Os desconhecidos (amostras de Ab anti-NGF) foram adicionados a diversas concentrações com diluições em série de 3,16 vezes, de 136 10 pontos. Antes de serem adicionadas às culturas, todas as amostras foram diluídas em meio completo.

Medição da Expressão de MAP2 em Neurónios DRG

As culturas foram fixas com paraformaldeído a 4% em solução salina equilibrada de Hank, durante 15 min, bloqueadas com Superblock (Pierce), durante 1 hora e permeabilizadas com Nonidet P-40 (Sigma) a 0,25% em solução salina tamponada com Tris-HCl (TBS) (Sigma), durante 1 hora, à temperatura ambiente (T.A.). As culturas foram enxaguadas, uma vez, com TBS contendo Tween20 (Sigma) a 0,1% e incubadas com IgG de murganho anti-MAP2 (Chemicon, Temecula, CA), durante 1,5 horas, à temperatura ambiente, seguido de incubação de anticorpo secundário anti-murganho marcado com Eu (Wallac Oy, Turku, Finlândia), durante 1 hora, à temperatura ambiente. As lavagens com TBS (3x5 min, com agitação suave) foram aplicadas após cada incubação de anticorpo. A solução Enhance (150 mL/poço, Wallac Oy) foi adicionada às culturas e o sinal de fluorescência foi, depois, medido num fluorómetro de resolução temporal (Wallac Oy).

Cultura Mesencefálica Embrionária

Foram utilizados ratos embrionários Sprague-Dawley de 19 dias de idade (E19) (Jackson Labs). O tecido de mesencéfalo ventral enriquecido para neurónios dopaminérgicos foi removido e transferido para solução salina tamponada com fosfatos de Dulbecco gelada (DPBS), pH 7,4, sem Ca++ e Mg++ (Gibco) . Os fragmentos de tecido foram dissociados em suspensão de células 137 únicas, utilizando um sistema de dissociação de papaína (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Resumidamente, os fragmentos de tecido foram incubados numa solução de digestão contendo 20 unidades/mL de papaína em Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS), a 37 °C, durante 50 min. As células foram dissociadas por trituração através de pipetas de Pasteur polidas à chama, num meio de dissociação consistindo em MEM/F12 de Ham, 1:1, inibidor ovomucóide a 1 mg/mL e ovalbumina a 1 mg/mL e desoxirribonuclease I a 0,005% (DNase). As células dissociadas foram sedimentadas, a 200 x g, durante 5 min e ressuspensas em EBSS contendo inibidor ovomucóide a 1 mg/mL, ovalbumina a 1 mg/mL e DNase a 0,005%. A suspensão celular foi centrifugada através de uma solução de gradiente contendo inibidor ovomucóide a 10 mg/mL, ovalbumina a 10 mg/mL, a 200 x g, durante 6 min, para remover os detritos celulares; e filtrada através de uma malha de nylon Nitex de 25 pg (Tetko, Inc.) para remover os grumos. As células dissociadas foram plaqueadas em placas de cultura de tecidos, a uma densidade de 100000/cm2. As placas foram pré-revestidas com poli-ornitina a 100 pg/mL (Sigma) e laminina de murganho a 1 pg/mL (Gibco BRL), como anteriormente descrito (Louis JC et al., J. Pharmacol. Exp. Ther . 1992; 262:1274-1283 . ) . 0 meio de cultura consistiu em meio mínimo essencial (MEM)/F12 de Ham, 1:1, soro de cavalo a 12% (Gibco), transferrina a 100 pg/mL e insulina a 2,5 pg/mL (Sigma). As culturas foram mantidas a 37 °C, C02 a 5% e 100% de humidade, durante 6 dias. 138

Tratamento de Culturas Mesencefálicas com BDNF e anti-BDNF ou anti-NGF 0 BDNF a 10 ng/mL foi adicionado às células 2 horas após plaqueamento, seguido de concentrações em série de amostras de Ab anti-NGF. O anticorpo Anti-BDNF (gerado na Amgen) foi utilizado como um controlo positivo.

Absorção de DA em Neurónios Mesencefálicos O ensaio de absorção de dopamina foi efectuado como descrito anteriormente (Friedman, L. e Mytilineou, C., Neuroscience Letters 1987; 79:65-72). No dia 6, as culturas foram lavadas, uma vez, com tampão de fosfatos de Krebs-Ringer pré-aquecido (pH 7,4), contendo glucose a 5,6 mM, EDTA a 1,3 mM e pargilina a 0,5 mM, um inibidor de monoamina oxidase. As culturas foram incubadas em tampão de absorção contendo [3H]DA a 50 nM (NEN), durante 60 minutos, a 37 °C. A absorção foi interrompida pela remoção do tampão de absorção e as culturas foram lavadas, três vezes, com tampão de fosfatos de

Krebs-Ringer. As células foram lisadas para libertação de [3H]DA, pela adição de um cocktail de cintilação liquida, opticphase supermix (Wallac), directamente às culturas. Os lisados celulares foram, depois, contados para radioactividade num contador de cintilação liquida microbeta-plus (Wallac, Inc.). A absorção de DA de baixa afinidade foi avaliada pela adição de GBR12909 a 0,5 mM, um inibidor especifico dos sítios de absorção de DA de elevada afinidade (Heikkila RE e Mazino L, European Journal of Pharmacology 1984; 103:241-8), ao tampão de absorção e subtraída da quantidade de absorção total para se obter o valor de absorção de DA de elevada afinidade. 139

Tabela 6

Anticorpo IC5O0 hNT-3 (nM) IC5O0 hBDNF (nM) 4D4 (IgG2) > 13,75 > 13,75

Exemplo 8

Identificação de um Epitopo para Anticorpos anti-NGF

Mapeamento Epitópico por Proteólise Limitada

Cinco microgramas (pg) de NGF foram incubados com 4D4 (11 pg) , durante 30 minutos, a 4 °C, em tampão TRIS a 0,1 M, pH 7,5. O complexo foi, depois, digerido com 1 pg de protease (subtilisina) , a 37 °C, durante 1 e 2 horas. Os mapas peptídicos de HPLC foram comparados entre si para pesquisar péptidos que fossem protegidos pelos anticorpos 4D4. A proteólise limitada de NGF indicou que vários péptidos principais foram inicialmente libertados de NGF. De particular interesse, os péptidos S18.3, S18.5 e S34.4, foram gerados e protegidos com anticorpo da proteólise. Outros picos não foram significativamente formados ou protegidos. Os péptidos protegidos de duas experiências (digestão de 1 hora e 2 horas) são mostrados na Tabela 7. 140

Tabela 7 % de protecção digestão de 1 hora digestão de 2 horas S16.1 QAA (96-98) C-terminal — 57 S18.3 FFETK (53-57) (SEQ ID N°: 45) Região de gancho 40 45 S18.5 SSSHPIFHR(1-9) (SEQ ID N°: 46) (HWNSY)* (SEQ ID N°: 47) N-terminal 40 50 S34.4 NSVEKQYFFETK (46-57) (SEQ ID N°: 48) Região de gancho 69 38 A percentagem de protecção foi calculada a partir da altura do pico peptidico. 0 S18.5 continha dois péptidos, mas apenas um péptido (SSSHPIFHR; SEQ ID N°: 46) foi protegido com o anticorpo 4D4, visto que o outro pico peptidico (HWNSY; SEQ ID N° : 47) permaneceu inalterado pela adição de anticorpos 4D4, como detectado à absorvência de 280 nm. O péptido S18.3 era uma parte C-terminal de S34.4, ambos da mesma região de gancho. nas regiões de gancho N-terminais e centrais também eram possíveis epitopos. 141

Separação Microcon de Péptidos Digeridos 0 material digerido com subtilisina (3 yg cada) foi incubado com anticorpos 4D4 activos e um anticorpo monoclonal inactivo (N° 162) (8 yg) , durante 30 minutos, a 4 °C, em tampão TRIS a 0,1 M, pH 7,5. Os péptidos ligados/não ligados foram separados por Microcon 10 (Millipore Corp., Bedford, Mass) e ambas as fracções (ligada e não ligada) foram analisadas por HPLC para pesguisar péptidos ligados a anticorpos. Dois picos deplecionados, identificados por comparação de HPLC das fracções não ligadas após tratamento com anticorpos 4D4 e N° 162 e separação de Microcon, foram recuperados, indicando péptidos ligados a anticorpo. Os péptidos ligados a 4D4 foram: 51 (4.4) ----SRKAVRR (113-119) (SEQ ID N°: 49), C-terminal; e 52 (28.3) ----EVMVL (35-39) (SEQ ID N°: 50), Região de

Gancho.

Uma amostra de NGF foi, alternativamente, digerida com Lys-C (K), durante 24 horas. Os resíduos de cisteína foram reduzidos e carboximetilados sem desnaturante. A amostra foi incubada com os anticorpos monoclonais 4D4 e AMG162, seguido de separação de Microcon 100. As fracções ligadas e não ligadas foram analisadas por HPLC de fase reversa. Apenas dois péptidos foram identificados como péptidos K de ligação a anticorpo, como indicado abaixo. A massa calculada para os péptidos, determinada por análise de sequência e a espectrometria de massa dos péptidos foram consistentes. Os péptidos, como indicado abaixo, mapearam para a região N-terminal e C-terminal. 142

Kl(37.6) ----SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVVWGDK (SEQ ID N°: 51)

Massa calculada = 2821; Massa observada = 2828,2; N-terminal K2(39.5) ----QAAWRFIRIDTACVCVLSRK (SEQ ID N°: 52)

Massa calculada = 2452; Massa observada = 2459,5; C-terminal

As experiências de mapeamento epitópico anteriores indicaram que, pelo menos, três regiões eram possíveis epitopos para os anticorpos 4D4, incluindo as regiões de terminação N (1-9), interna (46-57) e C-terminal (96-98). Além disso, uma digestão de AspN revelou que um fragmento peptídico, consistindo em ---SSHPIFHRGEFSVC— (SEQ ID N° : 53), foi protegido pelo anticorpo4D4, ao passo que uma digestão de tripsina mostrou que um fragmento peptídico, consistindo em ---SSHPIFHR---- (SEQ ID N°: 54), não foi protegido pelo anticorpo 4D4. Deste modo, na terminação N, a sequência de GEFSVC (SEQ ID N° : 55) é muito importante para ligação a anticorpos 4D4.

De modo a definir mais claramente o epitopo para o anticorpo anti-NGF 4D4.IgGl, um total de 23 péptidos foi gerado sinteticamente, utilizando técnicas padrão baseadas na sequência integral de NGF maduro humano (hNGF) (Tabela 8) . Os péptidos tinham 15 aminoácidos de comprimento, sobrepostos por 10 aminoácidos e com cauda de cisteína nas terminações C, para permitir a conjugação a uma matriz. O Ab anti-hNGF humano 4D4.IgGl, descrito acima, foi utilizado para a experiência de mapeamento. 143

Tabela δ N— de Péptido Sequência SEQ ID N2 33582-27-01 SSSHPIFHRGEFSVC (1-15) 56 33582-27-02 IFHRGEFSVADSVSVC (6-20) 57 33582-27-03 EFSVADSVSVWVGDKC (11-25) 58 33582-27-04 DSVSVWVGDKTTATDC (16-30) 59 33582-27-05 WVGDKTTATDIKGKEC (21-35) 60 33582-27-06 TRATDIKGKEVMVLGC (26-40) 61 33582-27-07 IKGKEVMVLGEVNIN (31-45) 62 33582-27-08 VMVLGEVNINNSVFKC (36-50) 63 33582-27-09 EVNINNSVFKQYFFEC (41-55) 64 33582-27-10 NSVFKQYFFETKARDC (46-60) 65 33582-27-11 QYFFETKARDPNPVDC (51-65) 66 33582-27-12 TKARDPNPVDS GARDC (56-70) 67 33582-27-13 PNPVDSGARDIDSKHC (61-75) 68 33582-27-14 SGARDIDSKHWNSYC (66-80) 69 33582-27-15 IDSKHWNSYATTTHTC (71-85) 70 33582-27-16 WNSYATTTHTFVKALC (76-90) 71 33582-27-17 TTTHTFVKALTMDGKC (81-95) 72 33582-27-18 FVKALTMDGKQAAWRC (86-100) 73 33582-27-19 TMDGKQAAWRFIRIDC (91-105) 74 33582-27-20 QAAWRFIRIDTAAVC (96-110) 75 33582-27-21 FIRIDTAAVAVLSRKC (101-115) 76 33582-27-22 TAAVAVLS RKAVRRAC (106-120) 77 33582-27-23 CAAVAVLS RKAVRRA (10 7-120) 78 144

Os fragmentos peptídicos de NGF humano foram diluídos em PBS com DMSO a 5%, EDTA a 1 mM, pH 6,23. A concentração peptídica final foi normalizada para a mesma concentração molar a 55 μΜ (cerca de 100 pg/mL) . Os péptidos foram incubados em placas de microtitulação de 96 poços activados por Reacti-Bind Maleimide (Pierce N° de Cat. 15150), 100 pL/poço, à temperatura ambiente, durante 2 horas e, depois, a 4 °C, de um dia para o outro, com agitação. O NGF humano (100 pg/mL) foi utilizado como controlo positivo. As placas foram lavadas com tampão de lavagem (KPL) e bloqueadas com leite magro desidratado a 0,2% (em tampão PBS-EDTA, pH 6,23), durante 2 horas, à temperatura ambiente e, depois, ainda bloqueadas com BSA a 5%, durante 1 hora. As placas foram, depois, incubadas com o anticorpo anti-NGF humano a diversas concentrações (0, 3, 10, 30 pg/mL), seguido de Ab-HRP de cabra anti-hFc (KPL), durante 2 horas. O sinal foi revelado com substrato TMB e lido a 450 nm, após adição de solução de terminação (KPL).

Em todos os 23 péptidos de NGF humano foram observados, pelo menos, 4 picos principais, indicando ligação de 4D4. Estes picos correspondiam aos seguintes péptidos: Péptido N° 1 (SEQ ID N°: 56), SSSHPIFHRGEFSVC (1-15); Péptido N° 10 (SEQ ID N°: 65), NSVFKQYFFETKARD (46-60); Péptidos N° 16-17 (SEQ ID N°: 71-SEQ ID N°: 72), WNSYATTTHTFVKAL--- (76-95); e Péptidos N° 18-21 (SEQ ID N°: 73 - SEQ ID N°: 76), TTTHT--- LSRKC (100-115).

Os quatro picos de ligação de 4D4 mapearam para os domínios de terminação N, terminação C, interno, assim como ganchos L2 e L4 em NGF, como descrito em Weismann et al. (1999, Nature 401:184-8) . Estes resultados são sumariados na Tabela 9. 145

Tabela 9 9ΐΊ

Epitopos de hNGF Terminação N L2 Interno L4 Interno Terminação C péptido N° 1 péptido N° 10 péptido N° 16 péptido N° 17 péptido N° 19 péptidos N° 20-21 Péptido N° (SEQ ID N°: 56), (SEQ ID N°: 65), (SEQ ID N°: 71), (SEQ ID N°: 72), (SEQ ID N°: 74), (SEQ ID N°: 75-SEQ ID N°: 76), SSSHPI—, 1-15 NSVFKQ—, 46-60 WNSYA—, 76-90 TMDGKQ—, 81-95 TMDGK—, 91-105 QAAWR—, 96-115 Sinal de ligação de Ab +++ + ++ ++ +++ ++

Wiesmann et al. resolveram a estrutura cristalina de hNGF ligado ao receptor trkA, mostrando que a terminação N (resíduos 2-9) era importante para a ligação de receptor (Wiesmann et al., 1999, Nature 401 :184-8) . Os resíduos deste segmento em NGF também são importantes para a especificidade para trkA em relação aos receptores trkB ou trkC. O anticorpo 4D4 é selectivo para NGF humano em relação a NGF de murganho/rato, assim como BDNF e NT-3, muito provavelmente devido às diferenças N-terminais entre NGF humano e outras neurotrofinas. O anticorpo 4D4 liga-se ao péptido N° 10 (SEQ ID N° : 65) (NSVFK---, 46-60) e péptido N° 17 (SEQ ID N° : 72) (TTTHTFVKALTMDGKC, 81-95), correspondendo, respectivamente, aos ganchos L2 e L4, que representam duas de sete regiões distintas, com diversidade de sequência superior à média entre as neurotrofinas. Experiências de troca entre NGF e BDNF destas sete regiões mostraram que L2 e L4 eram importantes para a actividade biológica de NGF. Além disso, a substituição de cinco resíduos de NT3 nos ganchos L2 e L4 com os de NGF introduziu actividade semelhante a NGF mantendo, simultaneamente, a actividade de NT3. Deste modo, L2 e L4 são regiões prováveis onde o anticorpo 4D4 se liga selectivamente a NGF e não a BDNF ou NT-3. O anticorpo 4D4 também se liga ao péptido N° 16 (SEQ ID N°: 71) (WNSYATTTHTFVKAL, 76-90), correspondendo ao domínio interno da estrutura cristalina de NGF. Esta região é 100% homóloga entre NGF humano e NGF de murganho, mas distinta de outras neurotrofinas. O 4D4 mostrou actividade muito mais fraca contra NGF de rato/murganho, quando comparada com a sua actividade contra NGF humano. Deste modo, a ligação a esta parte 147 de NGF é, muito provavelmente, não crítica para a especificidade de espécie, mas é importante para selectividade entre as neurotrofinas. 0 anticorpo 4D4 também se liga à região C-terminal de NGF (péptidos N° 19-21 (SEQ ID N°: 74 - SEQ ID N°: 76) TMDGK---LSRKC, 91-115), que é uma das regiões de NGF humano que distingue o NGF de outras neurotrofinas (BDNF e NT3). A ligação a esta região ajuda a explicar por que motivo o 4D4 não é activo contra outras neurotrofinas. Além disso, na terminação C, existe uma única diferença de aminoácido entre NGF humano e NGF de murganho, sugerindo que este único aminoácido pode ser uma das razões por que o 4D4 é selectivo para NGF humano em relação a NGF de rato/murganho, semelhante à terminação N onde as diferenças de espécie são observadas.

Por último, o 4D4 também interage com um domínio interno descrito pelo péptido N° 10 (SEQ ID N°: 65) (---KARDC, 50-60) de NGF humano, que é uma região importante para a ligação preferida de NGF a trkA, em vez de trkB ou trkC, explicando ainda a sua actividade de neutralização selectiva contra NGF humano.

Exemplo 9

Medição de Afinidade de Anticorpos Monoclonais por KinExA A ligação do Ab 4D4 (38859-80) a huNGF (29714-91) foi testada em KinExA. Resumidamente, Reacti-Gel 6x (Pierce) foram pré-revestidas com huNGF e bloqueadas com BSA. 10 pM e 30 pM de amostras de Ab 4D4 foram incubadas com diversas concentrações de 148 huNGF (Amgen), à temperatura ambiente, durante 8 horas, antes de serem corridas através de esferas revestidas com huNGF. A quantidade do anticorpo ligado a esferas foi quantificada por anticorpo IgG de cabra anti-humano marcado de modo fluorescente (Cy5) (Jackson Immuno Research). 0 sinal de ligação era proporcional à concentração de anticorpo livre em equilíbrio. A constante de equilíbrio de dissociação (KD) foi obtida da regressão não linear das curvas de competição, utilizando um modelo de ligação homogéneo de um sítio de dupla curva (software KinEx™). A KD foi cerca de 4 pM para ligação do Ab 4D4 a huNGF.

Exemplo 10

Identificação de anticorpos anti-NGF adicionais

Anticorpos anti-NGF adicionais (designados 14D10, 6G9,7H2, 14F11 e 4G6), gerados e identificados como descrito nos Exemplos 2 e 3 acima, foram seleccionados para estudo adicional. Resumidamente, os meios condicionados foram testados para actividade de ligação. Os anticorpos dos meios foram purificados e sequenciados. A massa prevista foi comparada com dados de espectrometria de massa de anticorpos dos meios condicionados. Os anticorpos foram clonados. Dois dos clones foram expressos em células CHO e testados para actividade como descrito acima. Os resultados são mostrados na Tabela 10. 149

Tabela 10 IC50 Θ IC50 0 IC50 Θ IC50 Θ hNGF rNGF Clone hNGF rNGF clone (nM) (nM) Notas Molecular (nM) (nM) 7H2 3,294 1,748 clonado 7H2-rFc 0, 963 0,792 6H9 3,172 1, 699 clonado 6H9-rFc 13, 93 0, 653 14D10 0,3918 > 13 clonado 14D11 0,2803 > 20 clonado 4G6 0,414 > 10 clonado

As sequências das regiões variáveis de cadeias pesadas destes anticorpos foram, depois, comparadas com a sequência do anticorpo 4D4, assim como entre si (Figuras 5 e 6). As homologias em percentagem das regiões variáveis de cadeias pesadas como identificadas a partir destas comparações são mostradas na Tabela 11. As homologias em percentagem das regiões variáveis de cadeias leves são mostradas na Tabela 12. Além disso, as homologias em percentagem das regiões de CDR dos diversos anticorpos são mostradas nas Figuras 5-10.

Tabela 11 4D4 VH 14D10 VH 6H9 VH 7H2 VH 14D11 VH 4G6 VH 4D4 VH 100% 70,9% 70, 1% 75,6% 47,2% 73, 4% 14D10 VH 100% 95,3% 85% 54,3% 81, 1% 6H9 VH 100% 86,6% 54,3% 81, 1% 7H2 VH 100% 51,2% 79, 8% 14D11 VH 100% 56, 8% 4G6 VH 100% 150

Tabela 12 V4D4 VK 14D11 LC 4G6a LC 4G6b LC 4G6c LC 14D10 LC 6H9 LC 4G6d LC 7H2 LC 4G6e V4D4 VK 100% 89% 91% 72% 74% 69% 71% 71% 70% 73% 14D11 LC 100% 94% 68% 71% 67% 68% 68% 68% 70% 4G6a LC 100% 69% 74% 68% 70% 70% 69% 71% 4G6b LC 100% 87% 83% 86% 86% 86% 96% 4G6c LC 100% 91% 94% 94% 94% 91% 14D10 LC 100% 91% 94% 94% 86% 6H9 LC 100% 99% 98% 89% 4G6d LC 100% 99% 89% 7H2 LC 100% 4G6e 100% 151

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Kenneth, Wild Treanor, James Huang, Haichun Inoue, Heather Zhang, Tie J.

Martin, Frank

<120> Anticorpos Neutralizantes Anti-Ngf Humanos Como Inibidores Selectivos da Via de NGF <13 0> 02-1240 <150> US 60/487431 <151> 2003-07-15 <160> 138 <170> Patentln ver <210> 1 <211> 990 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 cacctctggg 60 gacggtgtcg 120 acagtcctca 180 cacccagacc 240 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg 152 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Ala ser Thr Lys Gly pro Ser vai phe pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Th r Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 phe Pro Gl u Pro vai Thr vai Ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly vai Hi S Thr Phe Pro Ala val Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser vai Vai Thr vai Pro ser ser ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr lie cys Asn Vai Asn Hi s Lys Pro ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 153

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 vai Vai val ASP Val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Vai Asp Gly val Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg val val ser val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu pro Ala Pro ile Glu Lys Thr Xle ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gl n val ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser ASp ile Ala val Glu Trp Glu Ser ASP Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr pro pro val Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300 vai Phe Ser cys Ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gl n Lys Ser Leu ser Leu ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <21: L> 9 78 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 154 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 780 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 tccctgtctc cgggtaaa 978

<210> 4 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser val Phe Pro Leu Ala pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro val Thr val ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai HlS Thr Phe Pro Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser ser Val val Thr Val Pro ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys 85 90 95 Thr vai Glu Arg Lys cys Cys val Glu cys Pro Pro cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro val Ala Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr pro Glu val Thr Cys val val val Asp 130 135 140 155 val Ser His Glu Asp Pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Vai Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gl n Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser val Leu Thr Val val His Gl n Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro lie Gl u Lys Thr lie ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gin val ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASP ile 245 250 255 Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr 290 val Asp Lys Ser Arg 295 Trp Gin Gin Gly Asn 300 val Phe Ser Cys Ser val Met HIS Glu Ala Leu His Asn HIS Tyr Thr Gin Lys ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

<210> 5 <211> 981 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 gccagcacca aggggccatc agcacagccg ccctgggctg tggaactcag gcgccctgac ggactctact ccctcagcag tacacctgca acgtagatca cgtcttcccc ctggcgccct cctggtcaag gactacttcc cagcggcgtg cacaccttcc cgtggtgacc gtgccctcca caagcccagc aacaccaagg gctccaggag cacctccgag ccgaaccggt gacggtgtcg cggctgtcct acagtcctca gcagcttggg cacgaagacc tggacaagag agttgagtcc 60 120 180 240 300 156 aaatatggtc ccccatgccc atcatgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360 ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660 gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840 gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtgraca agagcaggtg gcaggagggg 900 aatgtcttct catgctccgt gakgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960 ctctccctgt ctctgggtaa a 981

<210> 6 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Ala Ser Thr Lys Gly pro Ser val Phe Pro Leu Ala Pro cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu val Lys ASp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser ser val val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro ser Asn Thr Lys val ASP Lys 85 90 95 Arg val Glu Ser Lys Tyr Gly pro Pro cys pro Ser cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro ser val Phe Leu phe Pro Pro Lys pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val Thr Cys Val val val 130 135 140 157 ASp vai Ser Gin Glu Asp pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr val Asp 145 150 155 160 Gly vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val val Ser Val Leu Thr Val Leu HÍS Gin Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro ser Ser Ile Glu Lys Thr ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gin val Ser Leu Thr cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp 245 250 255 Ile Ala val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr pro Pro Val Leu Asp Ser ASP Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gl u Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 cys ser val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 305 310 315 320 Leu ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

<210> 7 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 18O agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321 158

<210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Arg Thr vai Ala Ala pro Ser vai Phe lie Phe Pro Pro ser Asp Glu 1 5 10 15 Gin Leu Lys ser Gly Thr Ala ser vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gin Trp Lys vai Asp Asn Ala Leu Gin 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Vai Tyr Ala cys Glu vai Thr His Gin Gly Leu ser Ser 85 90 95 Pro vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu cys 100 105

<210> 9 <211> 369 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggctt caccttaaga agttatagca tgaactgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatac attagtcgta gtagtcatac catattctac 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ttcactgtat 240 ctgcaaatgg acagcctgag agacgaggac acggctatgt attactgtgc gagagtatat 300 agcagtggct ggcacgtctc tgattatttt gactactggg gccagggaat cctggtcacc 360 gtttcctca 369 159

<210> 10 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ser Tyr lie Ser Arg Ser Ser HÍS Thr ile phe Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gl n Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly lie Leu Val Thr Val Ser Ser 1X5 120

<210> 11 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 11 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 160

<210 > 12 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 12 Al a ile Gin Leu Thr Gin Ser pro Ser Ser Leu ser 1 5 10 Asp Arg val Thr 20 Ile Thr cys Arg Ala 25 ser Gin Gly Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Lys Al a Pro 35 40 Tyr Asp Ala ser Ser Leu Glu ser Gly val Pro Ser 50 55 60 Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Glu ASp phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn 85 90 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 45 <210> 13 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens 15 30 80 95 <400> 13 42 gtatatagca gtggctggca cgtctctgat tattttgact ac

<210> 14 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens 161 <4 Ο 0> 14 val Tyr ser ser Gly Trp His vai Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 15 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 caacagttta atagttaccc gctcact 27

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Gin Gin Phe Asn ser Tyr Pro Leu Thr 1 5

<210> 17 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 tacattagtc gtagtagtca taccatattc tacgcagact ctgtgaaggg c 51

<210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens 162 <4 Ο 0> 18

Tyr lie Ser Arg Ser Ser His Thr ile Phe Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 19 gatgcctcca gtttggaaag t <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ala ser 1 ser Leu Glu ser 5 <210> 21 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 agttatagca tgaac <210> 22 <211> 5 163

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22

Ser Tyr Ser Met Asn 1 5

<210> 23 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 cgggcaagtc agggcattag cagtgcttta gcc 33

<210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala 15 10

<210> 25 <211> 1131 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 164 tacacctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagctc 300 aaaaccccac ttggtgacac aactcacaca tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt 360 gacacacctc ccccgtgccc acggtgccca gagcccaaat cttgtgacac acctcccccg 420 tgcccacggt gcccagagcc caaatcttgt gacacacctc ccccatgccc acggtgccca 480 gcacctgaac tcctgggagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggatacc 540 cttatgattt cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 600 cccgaggtcc agttcaagtg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgttc cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 780 cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa ggacagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca gcgggcagcc ggagaacaac 960 tacaacacca cgcctcccat gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1020 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacatcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1131

<210> 26 <211> 376 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Ala ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe pro Leu Ala pro cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly cys Leu vai Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Vai His Thr phe Pro Ala vai Leu Gin ser ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser vai vai Thr vai Pro Ser ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn vai Asn His Lys Pro ser Asn Thr Lys vai Asp Lys 85 90 95 Arg Vai Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly ASp Thr Thr His Thr cys Pro 100 105 110 165

Arg Cys Pro Glu pro Lys ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys ser Cys ASp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 ΡΓΟ Glu Pro Lys ser cys Asp Thr pro pro Pro cys Pro Arg cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Vai Vai Asp Vai Ser Hi s Glu Asp Pro Glu val Gin Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Vai Asp Gly Vai Glu Val Hi S Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gin Phe Asn ser Thr Phe Arg Val Val ser val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gin ASp Trp Leu Asn Gly Lys GlU Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys Thr Lys Gly Gin 260 265 270 ΡΓΟ Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser cys Ser Val Met HÍS Glu Ala Leu Hi s Asn Arg Phe Thr Gin 355 360 365 Lys Ser Leu ser Leu ser Pro Gly 370 375 <210> 27 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial 166 <220> <223> Iniciador de PCR para NGF humano <400> 27 acaccacata tgtcatcatc ccatcccat 29 <210> 28 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR para NGF humano <400> 28 accacaggat cctccttatg cacgacgcac agctttacgg 40 <210> 29 <211> 375 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência nucleotídica codificando met-NGF humano recombinante <400> 29 catatgtcat catcccatcc catcttccac aggggcgaat tctcggtgtg tgacagtgtc 60 agcgtgtggg ttggggataa gaccaccgcc acagacatca agggcaagga ggtgatggtg 120 ttgggagagg tgaacattaa caacagtgta ttcaaacagt acttttttga gaccaagtgc 180 cgggacccaa atcccgttga cagcgggtgc cggggcattg actcaaagca ctggaactca 240 167 tattgtacca cgactcacac ctttgtcaag gcgctgacca tggatggcaa gcaggctgcc 300 tggcggttta tccggataga tacggcctgt gtgtgtgtgc tcagccgtaa agctgtgcgt 360 cgtgcataag gatcc 375 <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sequência de aminoácidos de met-NGF humano recombinante (1-120) <400> 30

Met Ser ser Ser His pro Ile Phe Hi S Arg Gly Glu Phe Ser val Cys 1 5 10 15 Asp Ser val Ser val Trp val Gly ASp Lys Thr Thr Ala Thr ASp Ile 20 25 30 Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu val Asn Ile Asn Asn Ser 35 40 45 val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys cys Arg ASp pro Asn Pro 50 55 60 vai Asp ser Gly cys Arg Gly Ile Asp ser Lys Hi S Trp Asn Ser Tyr 65 70 75 80 cys Thr Thr Thr His Thr Phe val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys 85 90 95 Gin Al a Ala Trp 100 Arg Phe Ile Arg ile 105 Asp Thr Ala cys val 110 Cys val Leu 5er Arg 115 Lys Ala val Arg Arg 120 Ala <210> 31 <211> 55

<212> ADN <213> Artificial 168 <220> <223> Sequência de iniciador 5' para gerar o vector de expressão pCFM1656 (ATCC N° 69576) <400> 31 cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaacgc gttggaattc ggtac 55 <210> 32 <211> 49 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência de iniciador 3 ' para gerar o vector de expressão pCFM1656 (ATCC N° 69576) <400> 32 taaactaaga tcttcctcct tattgtatac caattgcgca accttaagc 49 <210> 33 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <220> <221> Incerto <222> (18)..(23) <223> n é a, c, t ou g 169 <4Ο0> 33 ggccggatag gcctccannn nnnt 24 <210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 34 ggggtcaggc tggaactgag g 21 <210> 35 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 35 tgaggacgct gaccacacg 19 <210> 36 <211> 54 <212> ADN <213> Artificial <220> 170

<223> Iniciador de PCR <400> 36 cagcagaagc ttctagacca ccatggacat gagggtgccc gctcagctcc tggg 54 <210> 37 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 37 cttgtcgact caacactctc ccctgttgaa gctc 34 <210> 38 <211> 55 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador de PCR <400> 38 cagcagaagc ttctagacca ccatggagtt ggggctgtgc tgggttttcc ttgtt 55 <210> 39 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial 171 <220> <223> Iniciador de PCR <400> 39 gcatgtcgac tcatttaccc ggagacaggg agag

<210> 40 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Glu vai Gl n Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin pro Gly Gly 1 5 10 15 ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala Ser Gly phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gl n Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Arg ser Ser Hi S Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg ASp Asn Ala Lys A$n ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Vai Tyr Ser Ser Gly Trp Hi S val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly ile Leu val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 pro ser Vai phe pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val 145 150 155 160 Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe 165 170 175 pro Ala vai Leu Gin ser 5er Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr vai Pro Ser ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn val 195 200 205 Asp His Lys pro ser Asn Thr Lys Val ASp Lys Thr val Glu Arg Lys 210 215 220 172

Cys Cys Vai Glu cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro val Ala Gly Pro 225 230 235 240 Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai vai Asp vai Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu vai Gin Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn ser Thr Phe Arg val 290 295 300 vai Ser vai Leu Thr vai Vai HÍS Gin ASP Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Vai 325 Ser Asn Lys Gly Leu 330 Pro Ala Pro ile Glu 335 Lys Thr ile Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gl n val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro ser Asp ile Ala val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val Asp Lys 405 410 415 ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai phe ser cys Ser Val Met HÍS Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445

Lys

<210> 41 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Glu Vai Gin Leu vai Glu ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 173

Ser Leu Arg Leu ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser ' Tyr 20 25 30 Ser Met Asn 35 Trp val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp i Val Ser Tyr Ile ser Arg ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser ASp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gin Gly Ile Leu Val Thr Val Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr Phe pro Glu Pro val 145 150 155 160 Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn Hi s Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser cys ASP Lys Thr Hi S Thr cys Pro Pro Cys pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp val 260 265 270 Ser His Gl u Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val ASp Gly val 275 280 285 Glu val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 174 ΡΓΟ Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gin vai Tyr Thr Leu pro Pro ser Arg ASp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 355 360 365 vai Ser Leu Thr cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr pro Ser ASp Ile Ala 370 375 380 vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 ΡΓΟ Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Th r val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe ser Cys Ser 420 425 430 vai Met His Glu Ala Leu Hl s Asn HIS Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 435 440 445

Leu ser Pro Gly Lys 450

<210> 42 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42

Glu val Gin Leu val Glu ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr 20 25 30 ser Met Asn Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser HÍS Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Arg val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 175

Trp Gly Gin Gly lie Leu val Thr val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 ΡΓΟ Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro val 145 150 155 160 Thr Val ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hi S Thr Phe 165 170 175 ΡΓΟ Ala val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu ser ser Val Val 180 185 190 Thr val Pro ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys Arg val Gl u Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu val Thr cys val Val val Asp val Ser Gin Glu 260 265 270 Asp Pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 vai val Ser val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser ser ile Glu 325 330 335 Lys Thr ile ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Arg Leu Thr Val Asp 405 410 415 176

Lys Ser Arg Trp 420 Gin Glu Gly Asn val 425 Phe Ser Cys Ser val 430 Met His Glu Ala Leu 435 His Asn Hl S Tyr Thr 440 Gin Lys ser Leu Ser 445 Leu ser Leu Gly Lys 450 <210> 43 <211> 499 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu val 1 Gin Leu val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Val Gl n pro Gly Gly 15 Ser Leu Arg Leu 20 ser cys Ala Al a Ser 25 Gly Phe Thr Leu Arg 30 Ser Tyr Ser Met Asn 35 Trp Val Arg Gin Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp val Ser Tyr 50 Ile Ser Arg Ser ser 55 His Thr ile Phe Tyr 60 Ala Asp ser val Lys Gly 65 Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn ser Leu Tyr 80 Leu Gin Ala Arg Met val Asp Tyr 100 Ser 85 Ser Leu Ser Arg Gly Asp Trp Glu His 105 Asp 90 Val Thr Ala Met Tyr Tyr cys 95 Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr 110 Trp Gly Gin 115 Gly Ile Leu val Thr 120 Val Ser Ser Ala ser 125 Thr Lys Gly Pro ser 130 Val Phe Pro Leu Ala 135 Pro Cys Ser Arg Ser 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 Ala Leu Gly Cys 150 Leu val Lys Asp Tyr 155 Phe Pro Glu Pro Val 160 Thr Val ser Trp Asn 165 Ser Gly Ala Leu Thr 170 Ser Gly val His Thr 175 Phe pro Ala val Leu 180 Gin Ser Ser Gly Leu 185 Tyr Ser Leu ser Ser 190 Val val Thr Val pro 195 Ser Ser Ser Leu Gly 200 177 Thr Gl n Thr Tyr Thr 205 Cys Asn val

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 210 215 Thr pro Leu Gly Asp Thr Thr His 225 230 Lys Ser cys Asp Thr Pro Pro Pro 245 Ser cys ASP Thr Pro Pro Pro Cys 260 cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro 275 280 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 290 295 Met lie Ser Arg Thr Pro Glu val 305 310 His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe 325 Vai His Asn Ala Lys Thr Lys pro 340 Phe Arg val val Ser Val Leu Thr 355 360 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val 370 375 ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr 385 390 val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 405 Ser Leu Thr Cys Leu val Lys Gly 420 Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro 435 440 pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 450 455 Val Asp Lys ser Arg Trp Gin Gin 465 470 Met His Glu Ala Leu Hi s Asn Arg 485 ser Pro Gly

Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys 220 Thr Cys pro Arg Cys Pro Glu Pro 235 240 Cys Pro Arg Cys Pro Gl u Pro Lys 250 255 Pro Arg Cys pro Glu Pro Lys ser 265 270 Arg Cys pro Ala Pro 285 Glu Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 300 Thr Cys val val val Asp val ser 315 320 Lys Trp Tyr Val Asp Gly val Glu 330 335 Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr 345 350 Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 365 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 380 Lys Gly Gin Pro Arg Gl u Pro Gin 395 400 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 410 415 phe Tyr pro ser Asp Ile Ala val 425 430 Gl u Asn Asn Tyr Asn Thr Thr pro 445 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 460 Gly Asn Ile Phe Ser cys ser val 475 480 Phe Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 490 495 178 <210> 44

<211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Ala ile Gin Leu Thr Gl n Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15 Asp Arg val Thr lie Thr cys Arg Al a Ser Gin Gly lie ser ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Gl u Ser Gly val Pro ser Arg Phe ser Gly 50 55 60 Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Vai Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin ser Gly Asn ser Gin 145 150 155 160 Glu ser val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys HlS Lys val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr Hl s Gl n Gly Leu Ser Ser pro val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu cys 210

<210> 45 <211> 5 <212> PRT 179 <213> Homo sapiens <400> 45 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Phe Phe Glu Thr Lys ser ser ser His Pro Ile Phe His Arg 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47

His Trp Asn Ser Tyr 1 5 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48

Asn ser vai Glu Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys 15 10 180 <210> 49

<211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49

Ser Arg Lys Ala vai Arg Arg 1 5

<210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50

Glu Vai Met Vai Leu 1 5

<210> 51 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51

Ser Ser Ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Vai Cys Asp 15 10 15

Ser Vai Ser vai Trp vai Gly Asp Lys 20 25 <210> 52 <211> 20

<212> PRT <213> Homo sapiens 181 <4Ο0> 52

Gin Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg lie Asp Thr Ala Cys vai Cys Vai 15 10 15

Leu Ser Arg Lys 20 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 53 ser Ser His Pro ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser vai Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 54 ser Ser His Pro ile Phe His Arg 1 5 <210> 55 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55

Gly Glu Phe ser vai cys 1 5 182 <210> 56

<211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56

Ser ser ser His Pro lie Phe His Arg Gly Glu Phe ser vai Cys 15 10 15

<210> 57 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 lie phe His Arg Gly Glu Phe ser vai Ala Asp ser vai Ser vai cys 15 10 15

<210> 58 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

Glu Phe Ser vai Ala Asp Ser vai Ser Vai Trp vai Gly Asp Lys Cys 15 10 15

<210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens 183 <400> 59

Asp ser vai ser vai Trp vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Cys 1 5 10 15

<210> 60 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60

Trp vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys Gly Lys Glu cys 15 10 15

<210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61

Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys Gly Lys Glu vai Met Vai Leu Gly cvs 1 5 10 15

<210> 62 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 lie Lys Gly Lys Glu Vai Met vai Leu Gly Glu Vai Asn Ile Asn 15 10 15 <210> 63 <211> 16 184

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 val Met vai Leu Gly Glu vai Asn ile Asn Asn Ser Vai Phe Lys Cys 15 10 15

<210> 64 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64

Glu Val Asn lie Asn Asn ser val Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu cys 15 10 15

<210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65

Asn Ser val phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Ala Arg Asp cys 15 10 15

<210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6 6

Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Ala Arg Asp Pro Asn Pro val Asp cys 15 10 15 185 <210> 67

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67

Thr Lys Ala Arg Asp Pro Asn Pro vai Asp Ser Gly Ala Arg Asp Cys 15 10 15

<210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68

Pro Asn Pro vai Asp Ser Gly Ala Arg Asp lie Asp ser Lys His Cys 15 10 15

<210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 6 9

Ser Gly Ala Arg Asp lie Asp Ser Lys His Trp Asn ser Tyr cys 15 10 15

<210> 70 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens 186 <4Ο0> 70

Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Ala Thr Thr Thr His Thr cys 15 10 15

<210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71

Trp Asn Ser Tyr Ala Thr Thr Thr His Thr Phe Vai Lys Ala Leu Cys 15 10 15

<210> 72 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72

Thr Thr Thr His Thr Phe Vai Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Cys 15 10 15

<210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73

Phe vai Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Cys 15 10 15 <210> 74 <211> 16 187

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74

Thr Met Asp Gly Lys Gin Ala Ala Trp Arg Phe lie Arg lie Asp cy: 15 10 15

<210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75

Gin Ala Ala Trp Arg Phe ile Arg ile Asp Thr Ala Ala Vai cys 15 10 15

<210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76

Phe lie Arg ile Asp Thr Ala Ala vai Ala vai Leu ser Arg Lys Cys 15 10 15

<210> 77 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77

Thr Ala Ala vai Ala vai Leu ser Arg Lys Ala vai Arg Arg Ala Cys 15 10 15 188 <210> 78

<211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78

Cys Ala Ala vai Ala vai Leu ser Arg Lys Ala vai Arg Arg Ala 1 5 io 15 <210> 79 <211> 125

<212> PRT <213> homo sapien <400> 79

Glu vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp ile Gly Trp vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu GlU Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly ASP ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro ser Phe 50 55 60 Gin Gly Gin vai Thr ile Ser Ala ASp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser ASP Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asn Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr vai Ser Ser 115 120 125

<210> 80 <211> 107 <212> PRT 189 <213> homo sapien <400> 80 ASP Ile Gin Met Thr Gin Ser pro Ser Ser val Ser Ala Ser val Gly 1 5 10 15 ASp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly Ile ser Ile Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly vai pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95 Thr phe Gly Gl n Gly Thr Lys vai Gl u Ile Lys 100 105 \—1 CM V D> 81 \—1 CM V L> 127 <212> PRT <213> homo sapien <400> 81 Gl U val Gln Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin pro Gly Arg 1 5 10 15 ser Leu Arg Leu Ser cys Thr Ala ser Gly Phe Thr Phe Glu ASP Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 ser Gly He ser Trp Asn Arg Gly Ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser val 50 55 60 Lys 65 Gly Arg phe Thr val 70 Ser Arg Asp Asn Ala 75 Lys Asn ser Leu Tyr 80 Leu Gl n Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu ASP 90 Thr Ala Leu Tyr Tyr 95 Cys 190

Ala Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly ser Gly Arg pro Gly Tyr Phe Tyr Tvr 100 105 110 y

Vai Met Asp Vai Trp Gly cln Gly Thr Thr Vai Thr vai Ser ser 115 120 125 <210> 82 <211> 108 <212> PRT <213> homo sapien <400> 82

Glu lie Vai Leu Thr Gin ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser cys Arg Ala ser Gin ser vai ser ser Gly 20 25 30

Phe Leu Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arq Ala Thr Ala Ile Pro Asp Arg phe Ser 50 55 60

Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Arg Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly ser ser Pro 85 ' go 95

Tyr Thr phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 127

<212> PRT <213> homo sapien <400> 83

Glu Vai Gin Leu vai Glu ser Gly Glv Gly Leu Va3 G3n Pro G]y Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly phe ile phe Asp Asp Tyr 20 25 30 191

Ala Met H1S Trp Vai Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ser Gly ile ser Trp Asn Arg Gly ile Ile Gly Tyr Ala Gly Ser Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg ASp Asn Ala Lys Asn ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 vai Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr 100 105 110 Vai Met ASD vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr vai Ser Ser 115 120 125 <210> 84 <211> 108

<212> PRT <213> homo sapien <400> 84

Glu Ile val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser cys Arg Ala ser Gin Ser val Ser Ser ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Al a Pro Arg Leu Leu 35 40 45 ile Tyr 50 val Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly ile Pro 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp phe Ala Val Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly ser Ser Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu ile Lys 100 105

<210> 85 <211> 121 <212> PRT 192 <213> homo sapien <400> 85

Glu 1 vai Gin Leu vai 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu val Gin Pro Gly 15 Arg Ser Leu Arg Leu 20 ser cys Ala Ala ser 25 Gly phe Ile Phe Asp 30 Asp Tyr Ala Met HTS 35 Trp vai Arg Gin Ala 40 pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ser Gly 50 Ile Thr Trp Asn Ser 55 Gly Ile Leu Gly Tyr 60 Ala Asp Ser val Lys Gly Arg 65 Phe Thr ile 70 Ser Arg Asp Asp Ala 75 Lys Asn ser Leu Tyr 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr cys 85 90 95 Ala Lys Glu Glu Gly 100 ser Gly Arg Tyr 105 Tyr Asn Phe Asp Tyr 110 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr Vai ser ser 115 120 <210> 86 <211> 107

<212> PRT <213> homo sapien < 4 0 0 > 8 6

Glu ile vai Leu Thr Gin ser pro Gly Thr Leu Ser Leu ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser ser Arg Ala Thr Gly ile Pro Asp Arg Phe ser 50 55 60

Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 193

Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Gly ser Ser Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 87 <211> 124

<212> PRT <213> homo sapien <400> 87

Glu val Gin Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly vai vai Arg pro Gly Glv 1 5 io 15 ser Leu Arg Leu Ser cys Ala Ala ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

Gly Met Asn Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45

Ser Asp Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn ser Leu Tvr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Gin Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asd 100 105 110

Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 107

<212> PRT <213> homo sapien <400> 88

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 194

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys pro Glu Lys Ala pro Lys Ser Leu ile

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 100 105 <210> 89 <211> 107

<212> PRT <213> homo sapien <400> 89

Glu lie vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Gly val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin Ala pro Arg 45 Leu Leu ile Tyr ASp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu ASp Phe Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Hi 5 Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys val Glu lie Lys 100 105 <210> 90 <211> 108

<212> PRT <213> homo sapien 195 < 4 Ο Ο > 90

Glu He Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu ser Cys Arg Ala Ser Gin ser Vai Ser Ser ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gl n Lys pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr 50 Gly Ala Ser Ser Arg 55 Ala Thr Gly Ile Pro 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gl U 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Asn ser Tyr Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 100 105 <210> 91 <211> 107

<212> PRT <213> homo sapien <400> 91

Glu Ile 1 vai Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Thr 10 Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 Glu Arg Ala Thr 20 Leu Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser val Ser 30 ser Tyr Leu Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin Ala Pro Arg 45 Leu Leu ile Tyr Asp 50 Ala Ser Asn Arg Ala 55 Thr Gly ile Pro Ala 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65 ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr ile 75 Ser ser Leu Glu pro 80 Glu A5p Phe Ala val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly 100 Thr Lys val Glu 105 Ile Lys 196 <210> 92 <211> 5

<212> PRT <213> homo sapien <400> 92

Thr Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 93 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapien <400> 93 ile ile Tyr Pro Gly Asp ser Asp Thr Lys Tyr ser Pro ser Phe Gin 1 Gly 5 10 15 <210> 94 <211> 16 <212> PRT <213> homo sapien <400> 94

Asn Tyr Tyr Gly ser Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asn vai 15 10 15 <210> 95 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapien 197 <4Ο0> 95

Arg Ala Ser Gin Gly Ile Ser ile Trp Leu Ala 15 10 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapien <400> 96

Ala Ala ser Ser Leu Gin ser 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapien <40 0> 97

Gin Gin Ala Asn Ser phe Pro Trp Thr 1 5 <210> 98 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapien <400> 98

Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 99 <211> 17 198

<212> PRT <213> homo sapien <400> 99

Gly ile Ser Trp Asn Arg Gly ile Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 100 <211> 17

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 100

Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr vai Met Asp 15 10 15 val <210> 101 <211> 12

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 101

Arg Ala ser Gin Ser val ser ser Gly Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 102 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien 199 <4 Ο 0> 102

Gly Ala ser ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 103 <211> 9

<212> PRT <213> homo sapien <400> 103

Gin Gin Tyr Gly ser ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 104 <211> 5

<212> PRT <213> homo sapien <400> 104

Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 105 <211> 17

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 105

Gly ile ser Trp Asn Arg Gly ile lie Gly Tyr Ala Gly ser vai Lys 15 10 15

Gly 200 <210> 106 <211> 17

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 106

Gly Tyr Tyr Gly ser Gly Arg Pro Gly Tyr Phe Tyr Tyr vai Met Asp 15 10 15 vai <210> 107 <211> 12

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 107

Arg Ala ser Gin Ser vai ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 108 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 108 val Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 109 <211> 9

<212> PRT <213> homo sapien 201 <4 Ο 0> 109

Gin Gin Tyr Gly ser Ser Pro Tyr Thr X 5

<210> 110 <211> 5 <212> PRT <213> homo sapien <400> 110

Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 111 <211> 17 <212> PRT <213> homo sapien <40 0> 111

Gly lie Thr Trp Asn ser Gly Ile Leu Gly Tyr Ala Asp ser vai Lys 15 10 15

Gly <210> 112 <211> 11 <212> PRT <213> homo sapien <40 0> 112

Glu Gly ser Gly Arg Tyr Tyr Asn Phe Asp Tyr 1 5 10 202 <210> 113 <211> 12

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 113

Arg Ala Ser Gin Ser vai ser Ser ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 114

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 115 <211> 8

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 115

Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 116 <211> 5

<212> PRT <213> homo sapien 203 <4 Ο 0> 116

Asp Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 117 <211> 17

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 117

Asp lie Asn Trp Asn Gly Gly 5er Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 15 10 15

Gly <210> 118 <211> 15

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 118

Glu Gin Trp Leu Asp Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15 <210> 119 <211> 11

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 119

Arg Ala Ser Gin Gly lie ser ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 120 204 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 120

Ala Ala Ser ser Leu Gin ser 1 5 <210> 121 <211> 9

<212> PRT <213> homo sapien <400> 121

Gin Gin Tyr Asn ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 122 <211> 11

<212> PRT <213> homo sapien <400> 122

Arg Ala Ser Gin Gly vai ser ser Tyr Leu Ala 15 10 <210> 123 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien <400> 123

Asp Ala ser Asn Arg Ala Thr 1 5 205 <210> 124 <211> 9

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 124

Gin Gin Arg Ser Asn Trp hís Arg Thr <210> 125 <211> 12

<212> PRT <213> homo sapien <400> 125

Arg Ala ser Gin ser vai ser ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 126 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien <40 0> 126

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 127 <211> 9

<212> PRT <213> homo sapien 206 <4 Ο 0> 127

Gin Gin Tyr Asn ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 128 <211> 11

<212> PRT <213> homo sapien <400> 128 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> homo sapien <40 0> 129 Asp Ala ser 1 Asn Arg Ala Thr 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> homo sapien <400> 130 Gin Gin Arg 1 Ser Asn Trp Pro Trp Thr <210> 131 <211> 108

Arg Ala ser Gin ser vai ser ser Tyr Leu Ala 207 <212> PRT <213> homo sapien <40 0> 131

Gl u 1 ile vai Leu Thr 5 Gin Ser Pro Glu Arg Ala Thr 20 Leu ser Cys Arg Tyr Leu Ala 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 ile Tyr 50 Gly Ala ser ser Arg 55 Ala Gly Ser 65 Gly ser Gly Thr 70 Asp Phe Pro Glu Asp Phe Ala 85 Vai Tyr Tyr Tyr Thr Phe Gly 100 Gin Gly Thr Lys <210> 132 <211> 11

<212> PRT <213> homo sapien

Gly Thr Leu Ser Leu Ser pro Gly 10 15 Al a Ser Gin Ser val ser ser Ser 25 30 Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 45 Thr Gly ile Pro 60 Asp Arg phe ser Thr Leu Thr ile Ser Arg Leu Glu 75 80 Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 90 95 Leu Glu Ile Lys 105 <40 0> 132

Arg Ala Ser Gin Gly Vai ser ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 133 <211> 7

<212> PRT <213> homo sapien <400> 133

Gly Ala ser ser Arg Ala Thr 1 5 208 <210> 134 <211> 9

<212> PRT <213> homo sapien <400> 134

Gin Gin Tyr Gly ser ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 135 <211> 120 <212> PRT <213> homo sapien <400> 135

Ser ser Ser HÍS Pro ile phe HÍS Arg Gly Glu Phe Ser val Cys Asp 1 5 10 15 Ser vai Ser val 20 Trp val Gly ASp Lys 25 Thr Thr Ala Thr ASp 30 Ile Lys Gly Lys Glu val Met val Leu Gly Glu val Asn Ile Asn Asn Ser val 35 40 45 Phe Lys Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys cys Arg Asp Pro Asn Pro val 50 55 60 Asp Ser Gly cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys HlS Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Hi s Thr phe val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gl y Lys Gin 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala cys val Cys Val Leu 100 105 Uo Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120

<210> 136 <211> 120 <212> PRT <213> mus musculus 209 <4 Ο 0> 136 ser ser Thr His pro vai Phe His Met Gly Glu Phe Ser Vai cys Asp 15 10 15

Ser val ser vai Trp Vai Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp lie Lys 20 25 30

Gly Lys Glu val Thr Val Leu Ala Glu val Asn ile Asn Asn ser val 35 40 45

Phe Arg Gin Tyr Phe Phe Glu Thr Lys cys Arg Ala ser Asn Pro val 50 55 60

Glu ser Gly cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn ser Tyr Cys 65 70 75 80

Thr Thr Thr His Thr phe val Lys Ala Leu Thr Thr Asp Glu Lys Gin 85 90 95

Ala Ala Trp Arg Phe ile Arg ile Asp Thr Ala cys val cys val Leu 100 105 110

Ser Arg Lys Ala Thr Arg Arg Ala 115 120 <210> 137 <211> 126 <212> PRT <213> homo sapien <400> 137

His Ser Asp Pro Ala Arg Arg HÍS Ser ASp Pro Ala Arg Arg Gly Glu 1 5 10 15 Leu Ser val cys ASp Ser Ile Ser Glu Trp val Thr Ala Ala Asp Lys 20 25 30 Lys Thr Ala 35 val ASp Met Ser Gly 40 Gly Thr val Thr Val 45 Leu Glu Lys Val Pro Val ser Lys Gly Gin Leu Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys 50 55 60 Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys 65 70 75 80 Arg His Trp Asn Ser Gin Cys Arg Thr Thr Gin Ser Tyr Val Arg Ala 85 90 95 Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg ile 100 105 110 210

Asp Thr Ser cys vai cys Thr Leu Thr ile Lys Arg Gly Arg 115 120 125 <210> 138 <211> 119 <212> PRT <213> homo sapien <400> 138

Tyr Ala Glu His Lys ser His Arg Gly Glu Tyr ser val cys Asp ser 1 5 10 15 Glu ser Leu Trp val Thr Asp Lys ser Ser Ala Ile Asp ile Arg Gly 20 25 30 His Gin val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro val 35 40 45 Lys Gin Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg pro val Lys 50 55 60 Asn Gly Cys Arg Gly ile ASp Asp Lys His Trp Asn ser Gin Cys Lys 65 70 75 80 Thr Ser Gin Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr ser Glu Asn Asn Lys Leu 85 90 95 Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser cys Val cys Ala Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 115

Lisboa, 10 de Outubro de 2012 211

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humano isolado ou seu fragmento de ligaçao do antigénio que se liga especificamente a NGF, compreendendo: a) regiões de estrutura de cadeia pesada humana, uma região variável de cadeia pesada humana compreendendo CDR1 (SEQ ID N°: 22), CDR2 (SEQ ID N°: 18) e CDR3 (SEQ ID N°: 14) da SEQ ID N°: 10; e b) regiões de estrutura de cadeia leve humana, uma região variável de cadeia leve humana compreendendo CDR1 (SEQ ID N°: 24), CDR2 (SEQ ID N°: 20) e CDR3 (SEQ ID N°: 16) da SEQ ID N°: 12.
2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada da SEQ ID N°: 10 e a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve da SEQ ID N°: 12.
3. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 1, em que a cadeia pesada compreende uma região variável e uma região constante, em que a região variável compreende a SEQ ID N°: 10.
4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 1, em que a cadeia leve compreende uma região variável e uma região constante, em que a região variável compreende a SEQ ID N°: 12. 1
5. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 44.
6. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia pesada compreendendo as SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42 ou SEQ ID N°: 43.
7. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 1, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 44 e uma cadeia pesada compreendendo as SEQ ID N°: 40, SEQ ID N°: 41, SEQ ID N°: 42 ou SEQ ID N°: 43 • 8 . Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 7, em que o anticorpo compreende uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 44 e uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 40. 9 . Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer das reivindicações 1-8, em que o anticorpo ou fragmento de ligaçao do antigénio se dissocia de um polipéptido de NGF humano com uma KD de 4 x 10~12 M. 10. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer das reivindicações 1-8, em que o anticorpo ou fragmento de ligação do antigénio neutraliza a indução de NGF humano da expressão do receptor vanilóide 1 (VR1) em neurónios DRG, com uma IC50 de 0,5 x 10-9 M. 2 11.12. 13. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a cadeia pesada e a cadeia leve estão ligadas por um ligante flexível para formar um anticorpo de cadeia única. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio da reivindicação 11, que é um anticorpo Fv de cadeia única. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, que é a) um anticorpo Fab; b) um anticorpo Fab'; ou c) um anticorpo (Fab')2. 14. Composição farmacêutica compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 13. 15. Método para detecção de NGF numa amostra biológica compreendendo: a) colocação em contacto da amostra com o anticorpo de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, sob condições que permitem a ligação do anticorpo a NGF; e b) medição do nível de anticorpo ligado na amostra. Molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 13. 3 16.
17. Molécula de ácido nucleico da reivindicação 16, em que a molécula de ácido nucleico compreende: (a) SEQ ID N°: 9; e SEQ ID N°: 11; ou (b) SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 13; e SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 15.
18. Célula hospedeira isolada compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16 ou 17.
19. Linha celular isolada que produz o anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
20. Anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer uma dos das reivindicações 1 a 13 ou sais farmaceuticamente aceitáveis do anticorpo ou do seu fragmento de ligação do antigénio para utilização no tratamento de um distúrbio ou estado doloroso, causado por expressão aumentada de NGF ou sensibilidade aumentada a NGF, em que o distúrbio ou estado é dor aguda, dor dentária, dor traumática, dor cirúrgica ou dor resultando de: amputação ou abcesso, causalgia, doenças desmielinizantes, nevralgia trigeminal, cancro, alcoolismo crónico, AVC, sindrome talâmica, diabetes, sindrome de imunodeficiência adquirida ("SIDA"), toxinas, quimioterapia, cefaleia genérica, enxaqueca, cefaleia histamínica, sindromes vasculares mistas ou não vasculares, cefaleia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, fibromialgia, distúrbios inflamatórios intestinais, sindrome intestinal irritável, distúrbios oculares inflamatórios, distúrbios inflamatórios 4 ou instáveis da bexiga, psoríase, queixas cutâneas com componentes inflamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, nevrite, doenças vasculares de colagénio, estados inflamatórios crónicos, inflamação e hiperalgesia e alodinia associadas, neuropatia e hiperalgesia ou alodinia associadas, neuropatia diabética, sindromes de desaferentação, asma, lesão ou disfunção de tecido epitelial, herpes simplex, perturbações da motilidade visceral em regiões respiratórias, geniturinárias, gastrointestinais ou vasculares, feridas, queimaduras, reacções alérgicas da pele, prurite, vitiligo, distúrbios gastrointestinais genéricos, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite vasomotora ou alérgica ou distúrbios brônquicos, dismenorreia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite ou visceralgia.
21. Utilização de uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo ou seu fragmento de ligação do antigénio de qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou estado doloroso, causado por expressão aumentada de NGF ou sensibilidade aumentada a NGF, em que o distúrbio ou estado é dor aguda, dor dentária, dor traumática, dor cirúrgica ou dor resultando de: amputação ou abcesso, causalgia, doenças desmielinizantes, nevralgia trigeminal, cancro, alcoolismo crónico, AVC, sindrome talâmica, diabetes, síndrome de imunodeficiência adquirida ("SIDA"), toxinas, quimioterapia, cefaleia genérica, enxaqueca, cefaleia histamínica, sindromes vasculares mistas ou não vasculares, cefaleia de tensão, inflamação geral, artrite, doenças reumáticas, lúpus, osteoartrite, fibromialgia, distúrbios inflamatórios intestinais, síndrome intestinal irritável, 5 distúrbios oculares inflamatórios, distúrbios inflamatórios ou instáveis da bexiga, psoríase, queixas cutâneas com componentes inflamatórios, queimadura solar, cardite, dermatite, miosite, nevrite, doenças vasculares de colagénio, estados inflamatórios crónicos, inflamação e hiperalgesia e alodinia associadas, neuropatia e hiperalgesia ou alodinia associadas, neuropatia diabética, sindromes de desaferentação, asma, lesão ou disfunção de tecido epitelial, herpes simplex, perturbações da motilidade visceral em regiões respiratórias, geniturinárias, gastrointestinais ou vasculares, feridas, queimaduras, reacções alérgicas da pele, prurite, vitiligo, distúrbios gastrointestinais genéricos, colite, ulceração gástrica, úlceras duodenais, rinite vasomotora ou alérgica ou distúrbios brônquicos, dismenorreia, dispepsia, refluxo gastroesofágico, pancreatite ou visceralgia. Lisboa, 10 de Outubro de 2012 6