PT2379594T - Anticorpos de ligação ao recetor de cgrp humano - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS DE LIGAÇÃO AO RECETOR DE CGRP HUMANO"
ANTECEDENTES A superfamília de calcitonina de péptidos inclui, pelo menos, cinco elementos conhecidos: calcitonina, amilina, adrenomedulina e dois péptidos relacionados com o gene de calcitonina ("CGRP"), CGRP1 (também conhecido como ctCGRP ou CGRP) e CGRP2 (também conhecido como pCGRP). 0 CGRP é um neuropéptido vasoativo de 37 aminoácidos expresso nos sistemas nervosos central e periférico e tem mostrado ser um potente
vasodilatador na periferia, quando os neurónios contendo CGRP estão intimamente associados com vasos sanguíneos. A vasodilatação mediada por CGRP está também associada com inflamação neurogénica, como parte de uma cascata de eventos que resulta no extravasamento de plasma e vasodilatação da microvasculatura e está presente na enxaqueca. A amilina também possui locais de ligação específicos no SNC e pensa-se que regula o esvaziamento gástrico e possui um papel no metabolismo dos hidratos de carbono. A adrenomedulina é um potente vasodilatador. A adrenomedulina possui recetores específicos nos astrócitos e o seu ARN mensageiro é regulado positivamente em tecidos do SNC que são submetidos a isquemia. (Zimmermann, et al., Identification of adrenomedullin receptors in cultured rat astrocytes and in neuroblastoma glioma hybrid cells (NG108-15), Brain Res., 724:238-245 (1996); Wang et al.,
Discovery of adrenomedullin in rat ischemic cortex and evidence for its role in exacerbating focal brain ischemic damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11480-11484 (1995)). A calcitonina está envolvida no controlo de metabolismo ósseo e está também ativa no sistema nervoso central (SNC). As atividades biológicas de CGRP incluem a regulação de junções neuromusculares, de apresentação de antigénio dentro do sistema imunitário, de tónus vascular e de neurotransmissão sensorial. (Poyner, D. R., Calcitonin gene-related peptide: multiple actions, multiple receptors, Pharmacol. Ther., 56:23-51 (1992); Muff et al., Calcitonin, calcitonin gene related peptide, adrenomedullin and amylin: homologous peptides, separate receptors and overlapping biological actions, Eur. J. Endocrinol., 133: 17-20 (1995)). Foram também identificados três péptidos de estimulação de recetor de calcitonina (CRSP) em várias espécies de mamíferos; os CRSP podem formar uma nova subfamília na família de CGRP. (Katafuchi, T e Minamino, N, Structure and biological properties of three calcitonin receptor-stimulating peptides, novel members of the calcitonin gene-related peptide family, Peptides, 25(11):2039-2045 (2004)).
Os péptidos da superfamilia de calcitonina atuam através de sete domínios seter recetores acoplados à proteína G do domínio transmenbranar (GPCR). O recetor de calcitonina ("CT", "CTR" ou "recetor CT") e recetores de CGRP são GPCR do tipo II ("família B"), cuja família inclui outros GPCR que reconhecem péptidos reguladores, tais como secretina, glucagona e polipéptido intestinal vasoativo (VIP). As variantes de excisão-união melhor caracterizadas de recetor de calcitonina humano diferem dependendo da presença (antigamente CTRn+ ou CTRl, agora conhecido como CT(b)) ou ausência (a principal variante de excisão-união, antigamente CTRn- ou CTR2, agora conhecido como CT(a)) de 16 aminoácidos na primeira ansa intracelular. (Gorn et al., Expression of two human skeletal calcitonin receptor isoforms cloned from a giant cell tumor of bone: the first intracellular domain modulates ligand binding and signal transduction, J. Clin. Invest., 95:2680-2691 (1995); Hay et al., Amylin receptors: molecular composition and pharmacology, Biochem. Soc. Trans., 32:865-867 (2004); Poyner et al., 2002). A existência de, pelo menos, dois subtipos de recetores de CGRP foi proposta a partir de afinidades de antagonista e potências de agonista diferenciais numa variedade de bioensaios in vivo e in vitro. (Dennis et al., CGRP8-37, A calcitonin gene-related peptide antagonist revealing calcitonin gene-related peptide receptor heterogeneity in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 254:123-128 (1990); Dennis et al., Structure-activity profile of calcitonin gene-related peptid in peripheral and brain tissues. Evidence for multiplicity, J. Pharmacol. Exp. Ther., 251:718-725 (1989); Dumont et al., A potent and selective CGRP2 agonist, [Cys(Et)2,7]hCGRP: comparison in prototypical CGRPl e CGRP2 in vitro assays, Can. J. Physiol. Pharmacol., 75:671-676 (1997)). O subtipo de recetor de CGRPi foi verificado ser sensível ao fragmento de antagonista CGRP(8-37). (Chiba et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist human CGRP-(8-37), Am. J. Physiol., 256:E331-E335 (1989); Dennis et al. (1990); Mimeault et al., Comparative affinities and antagonistic potencies of various human calcitonin gene-related peptide fragments on calcitonin gene-related peptide receptors in brain and periphery, J. Pharmacol. Exp. Ther., 258:1084-1090 (1991)). Pelo contrário, o recetor de CGRP2 foi sensível aos análogos de CGRP humanos (hCGRP) lineares, em que os resíduos de cisteina nas posições 2 e 7 foram derivatizados (e. g., com acetoaminometilo [Cys (ACM)2'7] ou etilamida [Cys (Et)2'7] ) mas o recetor de CGRP2 foi insensível ao fragmento CGRP(8-37). (Dennis et al. (1989); Dennis et al. (1990); Dumont et al. (1997)). A especificidade de ligando do recetor de calcitonina e recetor do tipo calcitonina ("CL", "CLR" ou "CRLR") depende da co-expressão de elementos de uma família de proteínas auxiliares designadas proteínas modificadorasO da atividade de recetor (RAMP). A família de RAMP inclui três polipéptidos (RAMPl, RAMP2 e RAMP3) que atuam como moduladores de recetor que determinam a especificidade de ligando dos recetores para os elementos da família de calcitonina. As RAMP são proteínas transmembranares de tipo I que partilham cerca de 30% de identidade de sequência de aminoácidos e uma topologia prevista comum, com terminais C citoplasmáticos curtos, um domínio transmembranar e terminais N extracelulares grandes que são responsáveis pela especificidade. (McLatchie et al., (1998) RAMPs regulate the transport and ligand specificity of the calcitonin-receptor-like receptor, Nature, 393:333-339; Fraser et al., (1999) The amino terminus of receptor activity modifying proteins is a critical determinant of glycosylation state and ligand binding of calcitonin receptor-like receptor, Molecular Pharmacology, 55:1054-1059).
Em 1998, o recetor de CGRPi foi identificado como um heterodímero composto por uma nova proteína auxiliar de domínio transmembranar simples, proteína 1 modificadora da atividade de recetor (RAMPl) e CRLR. (McLatchie et al., supra) . As experiências de reticulação sugeriram que o recetor de CGRP consistia num arranjo estequiomético um para um de CRLR e RAMPl (Hilairet et al. JBC 276, 42182-42190 (2001)), estudos mais recentes utilizando várias metodologias, tais como BRET e BiFC, revelaram que o complexo de recetor de CGRP funcional pode ser composto por homo-oligómero assimétrico de CRLR e monómero de RAMPl (Heroux et ai. JBC 282, 31610-31620 (2007)).
Um domínio de N-terminal de CRLR purificado mostrou ligar-se especificamente a 125I-CGRP (Chauhan et ai. Biochemistry 44, 782 (2005)), confirmando a interação importante e direta entre o CRLR com o ligando de CGRP. Em particular, pensa-se que a Leu 24 e Leu 34 de CRLR constituem o local de encaminhamento do C-terminal de Phe37 de CGRP (Banerjee et ai. BMC Pharmacol. 6, 9 (2006)). Além disso, Roller et ai. (FEBS Lett. 531, 464-468 (2002)) obteve evidência de que o N-terminal de 18 resíduos de aminoácidos de CRLR contribui para a interação seletiva com CGRP ou adrenomedulina e Ittner et ai. (Biochemistry 44, 5749-5754 (2005)) sugeriu que os resíduos de aminoácidos 23-60 do N-terminal de CRLR mediam a associação com RAMPl.
Uma análise estrutura-função de RAMPl identificou resíduos 91-103, os quais se correlacionam com a "hélice 3" (Simms et ai. Biophys. J. 91, 662 - 669 (2006)), como potencialmente significativos na interação com CRLR e resíduos Trp74 e Phe92 como interagindo potencialmente com o ligando de CGRP em conjunto com a sua ligação ao complexo de recetor de CGRP. Estudos de ligação de ligando utilizando uma quimera de RAMPl humano/rato sugerem que o local de ligação para determinados inibidores de molécula pequena de CGRP R (e. g., BIBN4096BS), está localizado dentro de uma região que inclui os aminoácidos 66-102 de RAMPl (Mallee et al. JBC 277, 14294 - 14298 (2002)). O CRLR possui 55% de identidade de sequência de aminoácidos global com CTR, apesar dos domínios transmembranares serem quase 80% idênticos. (McLatchie et al. (1998); Poyner et al., International union of pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides, adrenomedullin, amylin and calcitonin receptors, Pharmacol. Rev., 54:233-246 (2002)). O CRLR mostrou formar um recetor de elevada afinidade para CGRP, quando associado com RAMPl ou, ligar-se, de um modo preferido, a adrenomedulina quando associado com RAMP2 ou RAMP3. (McLatchie et al. (1998); Sexton et al., Receptor activity modifying proteins, Cellular Signaling, 13:73-83 (2001); Conner et al., Interaction of calcitonin-gene-related peptide with its receptors, Biochemical Society Transactions 30(Part 4): 451-454 (2002)) . O estado de glicosilação de CRLR está associado com a sua farmacologia. As RAMP 1, 2 e 3 transportam CRLR para a membrana plasmática com eficiências semelhantes, no entanto RAMPl apresenta CRLR como uma glicoproteina madura, terminalmente glicosilada e um recetor de CGRP, enquanto as RAMP 2 e 3 apresentam CRLR como um recetor de adrenomedulina glicosilado no núcleo, imaturo ("AM" ou "AMR" ou "recetor AM". (Fraser et al. (1999)). A caracterização dos recetores de CRLR/RAMP2 e CRLR/RAMP3 em células HEK293T por ligação a radioligando (125I-adrenomedulina como radioligando), ensaio funcional (medição AMPc) ou análise bioquímica (eletroforese em gel SDS-poliacrilamida) revelou-os como sendo indistinguíveis, mesmo apesar das RAMP 2 e 3 partilharem apenas 30% de identidade de sequência de aminoácidos. (Fraser et al. 1999)). Têm sido observadas diferenças, no entanto, na farmacologia para CRLR expresso com RAMP 2 versus RAMP 3. CGRP e CGRP8-37, assim como adrenomedulina e o péptido derivado de adrenomedulina AM 22-52, são ativos no heterodímero de RAMP 3, indicando que este complexo pode atuar como um recetor de CGRP e um de AM. (Howitt et al., British Journal of Pharmacology, 140:477-486 (2003);
Muff et al., Hypertens. Res., 26:S3-S8 (2003)). A co-expressão de CRLR humano com RAMPl de rato e vice-versa, sugeriu que as espécies de RAMPl determinaram as caracteristicas farmacológicas do complexo de CRLR/RAMPl em relação aos vários antagonistas do recetor de CGRP de molécula peguena testados. (Mallee et al., Receptor Activity-Modifying Protein 1 determines the species selectivity of non-peptide CGRP receptor antagonists, J. Biol. Chem., 277(16):14294-14298 (2002)). A menos gue associado com uma RAMP, o CRLR não é conhecido por se ligar a gualguer ligando endógeno; atualmente, é o único GPCR que se pensa comportar-se deste modo. (Conner et ai., A key role for transmembrane prolines in calcitonin receptor-like agonist binding and signaling: implications for family B G-protein-coupled receptors, Molec. Pharmacol., 67(1):20-31 (2005)). O recetor de calcitonina (CT) demonstrou também formar complexos heterodiméricos com as RAMP, que são conhecidos como recetores de amilina ("AMY", "AMY R" ou "recetor AMY") . De um modo geral, os recetores de CT/RAMPl (referidos como "AMYi" ou "AMYl") possuem elevada afinidade para calcitonina, amilina e CGRP de salmão, e menor afinidade para calcitoninas de mamíferos. Para os recetores de CT/RAMP2 ("AMY2" ou "AMY2") e recetores de CT/RAMP3 ("AMY3" ou "AMY3"), um padrão semelhante é principalmente observado, embora a afinidade para CGRP seja menor e possa não ser significativa em concentrações de ligando fisiologicamente relevantes. O fenótipo de recetor preciso está dependente do tipo de célula e variante de excisão-união de CTR (CT (a) ou CT(b>), particularmente para recetores de amilina gerados por RAMP2. Por exemplo, uma população pura de células tipo osteoclasto expressou alegadamente RAMP2, CTR e CRLR, mas não RAMPl ou RAMP3. (Hay et al. (2004); Christopoulos et al., Multiple amylin receptors arise from receptor activity-modifying protein interaction with the calcitonin recetor gene product, Molecular Pharmacology, 56:235-242 (1999); Muff et al., An amylin receptor is revealed following co-transfection of a calcitonin receptor with receptor activity modifying proteins-1 or -3, Endocrinology, 140:2924-2927 (1999); Sexton et al. (2001); Leuthauser et al., Receptor-activity-modifying protein 1 forms heterodimers with two G-protein-coupled receptors to define ligand recognition, Biochem. J., 351:347-351 (2000);
Tilakaratne et al., Amylin receptor phenotypes derived from human calcitonin receptor/RAMP co-expression exhibit pharmacological differences dependent on receptor isoform and host cell environment, J. Pharmacol. Exp. Ther., 294:61-72 (2000); Nakamura et al., Osteoclast-like cells express receptor activity modifying protein 2: application of laser capture microdissection, J. Molec. Endocrinol., 34:257-261 (2005)). A Tabela 1, abaixo, resume a relação dos componentes de recetor discutidos acima.
Tabela 1
Foram propostas utilizações terapêuticas de antagonistas de CGRP. Noda et al., descreveu a utilização de derivados de CGRP ou CGRP para inibir agregação plaguetária e para o tratamento ou prevenção de arteriosclerose ou trombose. (documento EP 0385712 Bl). Liu et al., divulgou agentes terapêuticos que modulam a atividade de CTR, incluindo péptidos conjugados com veiculo, tais como calcitonina e aCGRP humano. (documentos WO 01/83526 A2; US 2002/0090646 Al). Foram divulgados antagonistas de péptido CGRP vasoativos e a sua utilização num método para inibir ligação a CGRP a recetores de CGRP por Smith et al. ; esses antagonistas peptidicos de CGRP foram mostrados inibir a ligação a CGRP a membranas de artéria coronária e relaxar artérias coronárias de porco tratadas com capsaicina. (Pat. U.S. N° 6268474 Bl; e Pat. U.S. N° 6756205 B2). Rist et al. divulgou análogos peptidicos com atividade antagonista do recetor de CGRP e sua utilização num fármaco para tratamento e profilaxia de uma variedade de distúrbios. (documento DE 19732944 Al). O CGRP é um potente vasodilatador que tem sido implicado na patologia de uma série de sintomas vasomotores, tais como todas as formas de dor de cabeça vascular, incluindo enxaquecas (com ou sem aura) e cefaleia em salvas. Durham, N. Engl. J. Med. 350:1073-1 075, 2004. A patofisiologia da enxaqueca envolve a ativação dos gânglios trigeminais, onde o CGRP está localizado e os níveis de CGRP aumentam significativamente durante um ataque de enxaqueca. Isto, por sua vez, promove a dilatação de vasos sanguíneos cranianos e inflamação neurogénica e sensibilização. (Doods, H., Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:1261-1268 (2001)).
Mais, os níveis séricos de CGRP na veia jugular externa são elevados em doentes durante a dor de cabeça de enxaqueca. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183-7, 1990. A administração intravenosa de ci-CGRP humano induziu dor de cabeça e enxaqueca em doentes que sofrem de enxaqueca sem aura, suportando a visão de que o CGRP possui um papel causador na enxaqueca (Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002). A enxaqueca é um estado neurológico comum, complexo que é caracterizado por ataques episódicos, graves de dor de cabeça e características associadas, que podem incluir náuseas, vómitos, sensibilidade à luz, som ou movimento. Em alguns doentes, a dor de cabeça é precedida ou acompanhada por uma aura. A dor de dor de cabeça pode ser grave e pode também ser unilateral em determinados doentes. Os ataques de enxaqueca são perturbadores para a vida diária. Nos EUA e Europa Ocidental, a prevalência global de sofredores de enxaqueca é 11% da população geral (6% de homens; 15-18% de mulheres) . Além disso, a frequência mediana de ataques num indivíduo é 1,5/mês. Embora existam vários tratamentos disponíveis para aliviar ou reduzir sintomas, a terapia preventiva é recomendada para os doentes possuindo mais de 3-4 ataques de enxaqueca por mês. Goadsby, et al. New Engl. J. Med. 346(4): 257-275, 2002. Alguns doentes de enxaqueca foram tratados com topiramato, um anticonvulsivo que bloqueia os canais de sódio dependentes de voltagem e determinados recetores de glutamato (AMPA-cainato) , potência a atividade do recetor de GABA-A e bloqueia anidrase carbónica. O sucesso relativamente recente de serotonina 5HT-I B/ID e/ou um agonista de recetor de 5HT-1, tal como sumatriptano, em alguns doentes, levou os investigadores a propor uma etiologia serotonérgica do distúrbio. Infelizmente, enquanto alguns doentes respondem bem a este tratamento, outros são relativamente resistentes aos seus efeitos. O possível envolvimento de CGRP na enxaqueca tem sido a base para o desenvolvimento e teste de uma série de compostos que inibem a libertação de CGRP (e. g., sumatriptano), antagonizam no recetor de CGRP (e. g., derivado dipeptídico BIBN4096BS (Boehringer Ingelheim); CGRP(8-37)) ou interagem com uma ou mais de proteínas associadas com o recetor, tal como, RAMPl. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Os subtipos de adrenocetor Alfa-2 e recetores Al de adenosina também controlam (inibem) a libertação de CGRP e ativação trigeminal (Goadsby et al., Brain 125:1392- 401, 2002). Por outro lado, o tratamento com compostos que inibem exclusivamente inflamação neurogénica (e. g., antagonistas de recetor NKI de taquicinina) ou ativação trigeminal (e. g., agonistas do recetor de 5HT10) parecem ser relativamente ineficazes como tratamentos agudos para enxaqueca, levando alguns a questionar se inibir a libertação de CGRP é a base de tratamentos anti-enxaqueca eficazes. Arulmani et ai., Eur. J. Pharmacol. 500:315-330, 2004.
Apesar da patofisiologia precisa da enxaqueca não ser ainda bem entendida, a utilização terapêutica de antagonistas de CGRP e aptameros que visam CGRP foi proposta para o tratamento de enxaqueca e outros distúrbios. (E. g., Olesen et al., Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migrain, New Engl. J. Med., 350:1104-1110 (2004); Perspective: CGRP-receptor antagonists--a fresh approach to migrain, New Engl. J. Med., 350:1075 (2004); Vater et al., Short bioactive Spiegelmers to migrain-associated calcitonin gene-related peptide rapidly identified by a novel approach: tailored-SELEX, Nuc. Acids Res., 31(21 el30):l-7 (2003); WO 96/03993). Mais, um antagonista de CGRP de molécula pequena potente mostrou aliviar ataques de enxaqueca moderados a graves, incluindo dor de enxaqueca e sintomas associados com enxaqueca, num ensaio clínico de Fase III recente (Connor, et al. Efficacy and Safety of telcagepant (MK-0974), a Novel Oral CGRP Receptor Antagonist, for Acute Migraine Attacks. Poster, European Headache and Migraine Trust International Congress, Londres, Inglaterra, setembro de 2008) . 0 CGRP pode também estar envolvido em síndromes de dor crónica que não a enxaqueca. Em roedores, o CGRP distribuído intratecalmente induz dor grave e os níveis de CGRP são intensificados em vários modelos de dor. Além disso, os antagonistas de CGRP bloqueiam parcialmente nocicepção em pancreatite aguda em roedores (Wick, et ai., (2006) Surgery, Volume 139, Publicação 2, Páginas 197-201) . Em conjunto, estas observações implicam que um antagonista do recetor de CGRP potente e seletivo pode ser uma terapêutica eficaz para tratamento de dor crónica, incluindo enxaqueca.
Durham et ai., New England Journal of Medicine, Massachusetts Medical Society, Boston, MA, EUA, 350,11, 2004, 1073-1075 divulga antagonistas do recetor de CGRP e a potencial utilização em terapia de enxaqueca. Chauhan et ai., Biology of Reproduction, 2004, 70, 1658-1663 divulga a produção de anticorpos policlonais de CRLR, anti-rato antagonista de rato.
SUMÁRIO
Anticorpos isolados, os seus fragmentos de ligação a antigénio e outras proteínas de ligação a antigénio isoladas que se ligam a CGRP R, particularmente CGRP R de primata, e. g., CGRP R de humano, são aqui descritos. Essas proteínas de ligação a antigénio isoladas podem inibir seletivamente CGRP R de primata (quando comparado com recetores de AMI, AM2, CT ou amilina de primata) e podem ligar-se aos componentes CRLR e RAMPl de CGRP R. Verificou-se que as proteínas de ligação a CGRP R inibem, interferem com ou modulam, pelo menos, uma das respostas biológicas relativas a CGRP R e, como tal, são úteis para melhorar os efeitos de doenças ou distúrbios relacionados com CGRP R. A ligação de determinadas proteínas de ligação a antigénio a CGRP R pode, portanto, possuir uma ou mais das seguintes atividades: inibir, interferir com ou modular CGRP R, inibir a vasodilatação, diminuir inflamação neurogénica e aliviar, melhorar, tratar, prevenir ou reduzir sintomas de dor crónica ou enxaqueca.
As formas de realização da invenção são: 1. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que se liga ao recetor de CGRP humano compreendendo uma CDRHl, uma CDRH2, uma CDRH3, uma CDRLl, uma CDRL2 e uma CDRL3, em que: (a) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 42, 43 e 44, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 73, 74 e 75, respetivamente; (b) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N° : 45, 46 e 47, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 76, 77 e 78, respetivamente; (c) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N° : 48, 49 e 50, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 79, 80 e 81, respetivamente; (d) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 51, 52 e 53, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 82, 83 e 84, respetivamente; (e) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 54, 55 e 56, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 85, 86 e 87, respetivamente; (f) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 57, 58 e 59, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 88, 89 e 90, respetivamente; (g) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N° : 60, 55 e 56, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 85, 86 e 87, respetivamente; (h) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 45, 61 e 47, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 76, 91 e 78, respetivamente; (i) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 62, 63 e 64, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 92, 93 e 94, respetivamente; (j) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 45, 61 e 47, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 76, 95 e 78, respetivamente; (k) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N° : 65, 55 e 56, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 85, 86 e 87, respetivamente; (l) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 42, 43 e 44, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 73, 74 e 96, respetivamente; (m) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 66, 67 e 68, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 97, 98 e 99, respetivamente; (n) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 69, 70 e 71, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 100, 101 e 102, respetivamente; ou (o) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 69, 70 e 72, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 100, 101 e 102, respetivamente . 2. 0 anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio compreende: (a) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 137 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:158; (b) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 138 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:159; (c) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 139 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 160; (d) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 140 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 161; (e) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 141 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:162; (f) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 142 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:158; (g) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 143 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 163; (h) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 144 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 162; (i) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 145 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:158; (j) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 146 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:164; (k) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 147 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 165; (l) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 148 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:166; (m) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 148 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 167; (n) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 149 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:162; (o) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 150 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 168; (p) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 151 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 169; (q) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 152 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 170; ou (r) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 153 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 170. 3. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com os itens 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio é selecionado do grupo consistindo num anticorpo monoclonal, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo e um anticorpo de cadeia simples. 4. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 3, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo num anticorpo totalmente humano, um anticorpo humanizado e um anticorpo quimérico. 5. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 4, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. 6. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 5, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo IgGl ou IgG2. 7. Um polinucleótido isolado que codifica um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer dos itens 1-6. 8. Um vetor de expressão compreendendo o polinucleótido isolado do item 7. 9. Uma linha celular transformada com o vetor de expressão de acordo com o item 8. 10. Um método de preparação de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer dos itens 1-6, compreendendo preparar o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio a partir de uma célula hospedeira que secreta o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio. 11. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que: o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio compreende uma cadeia leve de anticorpo da SEQ ID N°. 17 e uma cadeia pesada de anticorpo da SEQ ID N°. 29. 12. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio compreende uma cadeia leve de anticorpo da SEQ ID N°:17 menos quaisquer sequências sinal e uma cadeia pesada de anticorpo da SEQ ID N°: 29 menos quaisquer sequências sinal. 13. O anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com o item 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio compreende: (i) uma CDRLl compreendendo a SEQ ID N°: 42, uma CDRL2 compreende ndo a SEQ ID N°: 43, uma CDRL3 compreendendo a SEQ ID N°:44, uma CDRHl compreendendo a SEQ ID N°: 73, uma CDRH2 compreendendo a SEQ ID N°: 74 e uma CDRH3 compreendendo a SEQ ID N°: 75; ou (ii) um VL compreendendo a SEQ ID N°:142 e urn VH compreendendo a SEQ ID N°: 158. 14. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6 ou 11 a 13 para utilização no tratamento de um estado associado com o recetor de CGRP, em que o estado é dor de cabeça. 15. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6 ou 11 a 13 para utilização no tratamento de um estado associado com o recetor de CGRP, em que o estado é enxaqueca.
As proteínas de ligação a antigénio isoladas como reivindicadas podem inibir seletivamente o recetor de CGRP humano (quando comparado com os recetores de AMI, AM2 ou de amilina humanos). Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada como reivindicada pode inibir seletivamente o recetor de CGRP humano com uma razão de seletividade de 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 150 ou mais, 200 ou mais, 250 ou mais, 300 ou mais, 400 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais ou 1000 ou mais. O grau de inibição seletiva pode ser determinado utilizando qualquer método adequado, e. g., utilizando um ensaio de AMPc como descrito nos Exemplo aqui. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada liga-se especificamente a CRLR humano e RAMPl humano e não se liga especificamente ao recetor de AMl humano, AM2 humano ou um de amilina humano (e. g., AMYl ou AMY2) . Por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CGRP R humano com uma KD <1 μΜ, <100 nM, <10 nM ou <5 nM. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada liga-se especificamente a CGRP R humano com uma KD <100 nM, <10 nM ou <5 nM como determinada utilizando um ensaio de ligação FACS e analisada, por exemplo, utilizando métodos descritos em Rathanaswami, et al.r Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada possui uma Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a CGRP. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada possui uma Ki de <100 nM, <50 nM, <20 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a 125I-CGRP radiomarcado a membranas a partir de células que expressam CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 aqui.
Noutro aspeto exemplificativo, as proteínas de ligação a antigénio isoladas, como reivindicadas, podem competir para ligação a CGRP R humano, e. g., a parte extracelular de CGRP R, com um anticorpo de referência compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N° :158-170 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:137-153. Em algumas formas de realização, a competição de ligação é avaliada utilizando uns ensaios de ligação sequencial, e. g., utilizando uma análise Biacore, por exemplo, como descrito no Exemplo 7 aqui. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada, como reivindicada, pode competir para ligação a CGRP R humano com um anticorpo de referência, o anticorpo de referência compreendendo (i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°: 161, 163, 164, 166 e 168; e (ii) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°: 140, 143, 146, 148 e 150. Em determinadas formas de realização, o anticorpo de referência compreende (i) uma cadeia pesada definida por uma sequência selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:32, 34, 35, 37 e 39; e (ii) uma cadeia leve definida por uma sequência selecionada do grupo consistindo numa SEQ ID N°: 15, 18, 21, 23 e 25. Em formas de realização mais especificas, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve definidas por um dos seguintes pares de sequências: (i) SEQ ID N°: 32 e SEQ ID N°: 15; (ii) SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 18; (iii) SEQ ID N°: 35 e SEQ ID N°: 21; (iv) SEQ ID N°: 37 e SEQ ID N°: 23; e (v) SEQ ID N° : 39 e SEQ ID N°: 25. Numa forma de realização, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 32 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 15. Noutra forma de realização, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 34 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 18. Noutra forma de realização, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 35 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 21. Noutra forma de realização, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 37 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 23. Noutra forma de realização, o anticorpo de referência compreende uma cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 39 e uma cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 25.
Em determinadas formas de realização, as proteínas de ligação a antigénio isoladas, como reivindicadas, que competem para ligação a CGRP R humano podem também inibir seletivamente o recetor de CGRP humano, e. g., com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 2500 ou mais, 5000 ou mais ou 10000 ou mais e essa seletividade pode ser determinada, e. g., utilizando um ensaio de AMPc como descrito nos Exemplos aqui. Em formas de realização relacionadas, as proteínas de ligação a antigénio isoladas, como reivindicadas, que competem para ligação a CGRP R humano podem ligar-se especificamente a CGRP R humano com uma KD <1 μΜ, <100 nM, <10 nM ou <5 nM, e. g., como determinada utilizando um ensaio de ligação FACS e analisada, por exemplo, utilizando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em formas de realização relacionadas, as proteínas de ligação a antigénio isoladas, como reivindicadas, que competem para ligação a CGRP R humano podem possuir uma Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a CGRP, e. g., num ensaio de competição de ligação a CGRP radiomarcado com 125I para membranas a partir de células que expressam CGRP R humano, por exemplo, o ensaio descrito no Exemplo 5 aqui.
Em qualquer das formas de realização acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada que compete para ligação a CGRP R humano pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (e. g., totalmente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de ligação a antigénio. Mais, o fragmento de anticorpo da proteína de ligação a antigénio isolada que compete para ligação a CGRP R humano pode ser um fragmento Fab e fragmento Fab' , um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia simples; e pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano, e. g., um anticorpo do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em determinadas formas de realização, as proteínas de ligação a antigénio isoladas que competem para ligação a CGRP R humano podem ser proteínas de ligação a antigénio neutralizantes.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (e. g., totalmente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de ligação a antigénio. Mais, o fragmento de anticorpo das proteínas de ligação a antigénio isoladas pode ser um fragmento Fab e fragmento Fab1, um fragmento F(ab')2/ um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia simples. Por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ser um anticorpo monoclonal humano e pode ser, e. g., um anticorpo do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Mais, as proteínas de ligação a antigénio isoladas podem ser proteínas de ligação a antigénio neutralizantes.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CRLR humano e RAMPl humano e ligar-se não especif icamente ao recetor de AMI, AM2 ou a um de amilina humano (e. g., AMYl), por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CGRP R humano com uma KD <1 μΜ, <100 nM, <10 nM, ou <5 nM, e. g., como determinada utilizando um ensaio de ligação FACS e analisada, por exemplo, utilizando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode inibir seletivamente CGRP R humano, em relação aos recetores AMI, AM2 ou AMYl humanos, e. g., com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 2500 ou mais, 5000 ou mais ou 10000 ou mais, em que o grau de inibição seletiva pode ser determinado utilizando qualquer método adequado, e. g., utilizando um ensaio de AMPc como descrito nos Exemplos aqui. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode possuir uma Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a CGRP, e. g., num ensaio de competição de ligação a CGRP radiomarcado com 125I para membranas a partir de células que expressam CGRP R humano, e. g., o ensaio descrito no Exemplo 5 aqui.
As sequências consenso de CDR exemplificativas aqui ilustradas são as seguintes:
Consenso Kl CDRl RASQGIRXiDLG (SEQ ID N° :103), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N e K. CDR2 XiASSLQS (SEQ ID N° :104), em que Xx é selecionado do grupo consistindo em A e G. CDR3 LQYNXiX2PWT (SEQ ID N° :105), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em I e S e X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e F.
Consenso K4 CDR3 QQYGNSLXiR (SEQ ID N° :106), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e C.
Consenso Kl,4 CDRl RASQXiX2X3X4GX5LX6 (SEQ ID N°:107), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em S e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em V e I, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, Ne K, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e D e Χε é selecionado do grupo consistindo em T e G. CDR2 XiASSX2X3X4 (SEQ ID N°: 108), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e L, X3 é selecionado do grupo consistindo em A e Q e X4 é selecionado do grupo consistindo em T e S. CDR3 XiQYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID N° :109), em que X4 é selecionado do grupo consistindo em Q e L, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e N, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e F, X5 é selecionado do grupo consistindo em L e P, Xe é selecionado do grupo consistindo em C, W e S e X7 é selecionado do grupo consistindo em R e T.
Consenso K3 CDRl KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID N° :110), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e K e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T.
Consenso K2,3 CDRl X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID N° :111), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em R e K, X2 é selecionado do grupo consistindo em F, De A, X3 é selecionado do grupo consistindo em Y, Re K, X4 é selecionado do grupo consistindo em N e T e X5 é selecionado do grupo consistindo em D e Y. CDR2 X1X2SNRX3S (SEQ ID N° :112), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em L e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e V e X3 é selecionado do grupo consistindo em A e F. CDR3 MQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID N° :113), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em A e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em Q e P, X4 é selecionado do grupo consistindo em T e L e X5 é selecionado do grupo consistindo em F e L.
Consenso Lm3 CDR2 RXiNQRPS (SEQ ID N° :114), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em N e S.
Consenso Lml,2,3 CDRl SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID N° :115), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e T e X3 é selecionado do grupo consistindo em S, Ne Y. CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID N° :116), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, T e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N e S e X3 é selecionado do grupo consistindo em K e Q. CDR3 X1X2X3DX4X5LX6X7VV (SEQ ID N° :117), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, Χε é selecionado do grupo consistindo em S e N e X7 é selecionado do grupo consistindo em A e G.
Consenso LmAll CDRl X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID N° :118), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e Q, X2 está presente ou ausente e, se presente, é S, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X4 está presente ou ausente e, se presente, é N, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e L, Χε é selecionado do grupo consistindo em G e R, X7 é selecionado do grupo consistindo em N e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em N e F, X9 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em V e A e Xn é selecionado do grupo consistindo em S, N e Y. CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID N° :119), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, G, T e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N, K e S e X3 é selecionado do grupo consistindo em K, N e Q. CDR3 XiX2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID N° :120), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em G, Ne A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T, Se A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, Χε é selecionado do grupo consistindo em L e V, X7 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e N, X8 é selecionado do grupo consistindo em A, H e G e Xg é selecionado do grupo consistindo em V e L.
Consenso HC1 CDRl ΧχΥΥΜΧ2 (SEQ ID N°:121), em que X4 é selecionado do grupo consistindo em G e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em H e Y. CDR2 WIXiPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID N° :122), em que X4 é selecionado do grupo consistindo em N e S. CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID N° :123), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em M e Y, X4 é selecionado do grupo consistindo em I e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e Y, Χε é selecionado do grupo consistindo em M e A, X7 está presente ou ausente e, se presente, é L, X3 está presente ou ausente e, se presente, é R, Xg é selecionado do grupo consistindo em V e L, Xio é selecionado do grupo consistindo em F e Y, Xu é selecionado do grupo consistindo em P e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em P e H e X13 está presente ou ausente e, se presente, é Y.
Consenso HC2 CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID N° :124), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em K e T e X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A.
Consenso HC3 CDRl X1YX2MX3 (SEQ ID N° :125), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em T e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e A e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e S. CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID N° :126), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e R e Xe é selecionado do grupo consistindo em R e T. CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID N° :127), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em E e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em V e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e E, X5 é selecionado do grupo consistindo em G e V, X6 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X7 está presente ou ausente e, se presente, é S, Xs é selecionado do grupo consistindo em I e S e X9 é selecionado do grupo consistindo em S e G.
Consenso HC4 CDRl SXiGMH (SEQ ID N° :128), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em F e Y. CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID N° :129), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em F e Y, X2 é selecionado do grupo consistindo em I e Η, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e Y e X4 é selecionado do grupo consistindo em V e A. CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID N° :130), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e K, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em Y e V, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, Xe é selecionado do grupo consistindo em D e Μ, X7 é selecionado do grupo consistindo em S e T, X8 é selecionado do grupo consistindo em G e L, X9 é selecionado do grupo consistindo em H e Y, X10 está presente ou ausente e, se presente, é Y, Xn é selecionado do grupo consistindo em K e F, X12 é selecionado do grupo consistindo em M e L e X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D.
Consenso HCA CDRl X1X2X3MX4 (SEQ ID N° :131), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, Y e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, A e G e X4 é selecionado do grupo consistindo em S e H. CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID N° :132), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em R, A e V, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, S e W, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, G, F e Y, X4 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em K e T, X5 está presente ou ausente e, se presente, é T, Xe é selecionado do grupo consistindo em D e S, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em T, R, I, N e Η, X9 é selecionado do grupo consistindo em T e K, X10 é selecionado do grupo consistindo em D e Y, Xn é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D e X14 é selecionado do grupo consistindo em P e S.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID N°:133), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em D, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, V e A, Xe é selecionado do grupo consistindo em S, G, Y, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, P, D, A e M, Xs está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em S e Y, X9 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, Se T, X10 é selecionado do grupo consistindo em S, Ge L, Xn é selecionado do grupo consistindo em S, G, L e Y, X12 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em W e Y, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y e H, X44 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X16 está presente ou ausente e, se presente, é Y, Xi7 está presente ou ausente e, se presente, é Y, Xig é selecionado do grupo consistindo em M e L e Xi9 é selecionado do grupo consistindo em D e A.
Consenso HCB CDRl X1X2X3X4X5 (SEQ ID N° :134), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N, G, D, S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, F e Y, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, Y, A e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em M e L e X5 é selecionado do grupo consistindo em S e H. CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID N° :135), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em R, W, A, V, S e F, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, N, S, W e R, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, P, G, F e Y, X4 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em K, Te R, X5 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em T e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em D, N, H, S e Y, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, Xs é selecionado do grupo consistindo em G e S, X9 é selecionado do grupo consistindo em T, G, R, I, N, H e Y, X10 é selecionado do grupo consistindo em T, K, R e P, Xn é selecionado do grupo consistindo em D, N, Y e E, Xi2 é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X13 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X14 é selecionado do grupo consistindo em A, Q e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em P, K e S, X16 é selecionado do grupo consistindo em V e F e Xi7 é selecionado do grupo consistindo em K e Q.
CDR3 X4X2X3X4X5SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16GX17X18V (SEQ ID N°:136), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, G, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, Ge Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, Μ, Y, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, S, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, I, G, V e A, Χβ é selecionado do grupo consistindo em S, I, Y, G, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, Μ, A, P e D, Xs está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em S, L e Y, Xg está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, R, S e T, Xi0 é selecionado do grupo consistindo em S, Ge L, Xu é selecionado do grupo consistindo em S, V, L, G e Y, X12 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em F, Y e W, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y, P, S e H, X44 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y, P, D e Η, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X46 está presente ou ausente e, se presente, é Y, X47 está presente ou ausente e, se presente, é Y e Xis é selecionado do grupo consistindo em M e L.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência consenso acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ser, por exemplo, um polipéptido AVIMER, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (e. g., totalmente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de ligação a antigénio. Mais, o fragmento de anticorpo das proteínas de ligação a antigénio isoladas pode ser um fragmento Fab e fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia simples. Por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ser um anticorpo monoclonal humano e pode ser, e. g., um anticorpo do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Mais, as proteínas de ligação a antigénio isoladas podem ser proteínas de ligação a antigénio neutralizantes.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência consenso acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CRLR humano e RAMPl humano e ligar-se não especif icamente ao recetor de AMI, AM2 ou a um de amilina humano (e. g., AMY1) , por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente ao CGRP R humano com uma KD <1 μΜ, <100 nM, <10 nM ou <5 nM, e. g., como determinada utilizando um ensaio de ligação FACS e analisada, por exemplo, utilizando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência consenso acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode inibir seletivamente CGRP R humano, em relação aos recetores AMI, AM2 ou AMYl humanos, e. g., com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 2500 ou mais, 5000 ou mais ou 10000 ou mais, em que o grau de inibição seletiva pode ser determinado utilizando qualquer método adequado, e. g., utilizando um ensaio de AMPc como descrito nos Exemplos aqui. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência consenso acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode possuir uma Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a CGRP, e. g., num ensaio de competição de ligação a CGRP radiomarcado com 125I para membranas a partir de células que expressam CGRP R humano, e. g., o ensaio descrito no Exemplo 5 aqui.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência VL e VH acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CRLR humano e RAMPl humano e ligar-se não especif icamente ao recetor de AMI, AM2 ou um de amilina humano (e. g., AMYl), por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CGRP R humano com uma KD <1 μΜ, <100 nM, <10 nM ou <5 nM, e. g., como determinada utilizando um ensaio de ligação de FACS e analisada, por exemplo, utilizando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência VL e VH acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode inibir seletivamente CGRP R humano, em relação aos recetores AMI, AM2 ou AMYl humanos, e. g., com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 2500 ou mais, 5000 ou mais ou 10000 ou mais, em que o grau de inibição seletiva pode ser determinado utilizando qualquer método adequado, e. g., utilizando um ensaio de AMPc como descrito nos Exemplos aqui. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência VL e VH acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode possuir uma Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a CGRP, e. g., num ensaio de competição de ligação a CGRP radiomarcado com 125I para membranas a partir de células que expressam CGRP R humano, e. g., o ensaio descrito no Exemplo 5 aqui.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência de cadeia leve e pesada acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode compreender a sequência de cadeia pesada e/ou leve especificada, mas com um péptido sinal diferente ou sem péptido sinal. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência de cadeia leve e pesada acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ser, por exemplo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano (e. g., totalmente humano), um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de ligação a antigénio. Mais, o fragmento de anticorpo das proteínas de ligação a antigénio isoladas pode ser um fragmento Fab e fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia simples. Por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ser um anticorpo monoclonal humano e pode ser, e. g., um anticorpo do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Mais, as proteínas de ligação a antigénio isoladas podem ser proteínas de ligação a antigénio neutralizantes.
Em qualquer das formas de realização definidas de sequência de cadeia leve e pesada acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CRLR humano e RAMPl humano e ligar-se não especificamente ao recetor de AMl, AM2 ou um de amilina humano (e. g., AMYl), por exemplo, a proteína de ligação a antigénio isolada pode ligar-se especificamente a CGRP R humano com uma KD^1 μΜ, ^100 nM, ^10 nM ou <5 nM, e. g., como determinada utilizando um ensaio de ligação FACS e analisada, por exemplo, utilizando métodos descritos em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência de cadeia leve e pesada acima mencionadas, a proteína de ligação a antigénio isolada pode inibir seletivamente CGRP R humano, em relação aos recetores AMI, AM2 ou AMYl humanos, e. g., com uma razão de seletividade de 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, 1000 ou mais, 2500 ou mais, 5000 ou mais ou 10000 ou mais, em que o grau de inibição seletiva pode ser determinado utilizando qualquer método adequado, e. g., utilizando um ensaio de AMPc como descrito nos Exemplos aqui. Em qualquer das formas de realização definidas de sequência de cadeia leve e pesada acima mencionadas, a proteina de ligação a antigénio isolada pode possuir uma Ki de <100 nM, <10 nM, <1 nM, <0,5 nM ou <0,1 nM num ensaio de competição de ligação a CGRP, e. g., num ensaio de competição de ligação a CGRP radiomarcado com 125I para membranas a partir de células que expressam CGRP R humano, e. g., o ensaio descrito no Exemplo 5 aqui.
Num aspeto adicional, são também proporcionados polinucleótidos de ácidos nucleicos isolados que codificam qualquer das proteínas de ligação a antigénio de CGRP R resumidas acima. Em alguns casos, as moléculas de ácidos nucleicos isoladas estão ligadas operativamente a uma sequência de controlo. Em formas de realização relacionadas, os polinucleótido isolados são incorporados num vetor de expressão. São também proporcionadas linhas celulares transformadas com vetores de expressão compreendendo polinucleótidos isolados como descritos acima. Num aspeto relacionado, são também proporcionados vetores de expressão e células hospedeiras transformadas ou transfectadas com os vetores de expressão que compreendem as moléculas de ácido nucleico isoladas acima mencionadas que codificam proteínas de ligação a antigénio de CGRP R descritas acima.
Noutro aspeto, é também proporcionado um método de preparação das proteínas de ligação a antigénio que inclui o passo de preparar a proteína de ligação a antigénio a partir de uma célula hospedeira que secreta a proteína de ligação a antigénio. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio é gerada utilizando um imunogénio compreendendo recetor de CGRP solúvel. Em algumas formas de realização, esse recetor de CGRP solúvel é obtido por co-expressão e purificação de um domínio extracelular de N-terminal (ECD) de CRLR humano e um ECD de RAMPl humano, e. g., um ECD de CRLR humano compreendendo a SEQ ID N°: 6 e um ECD de RAMP 1 compreendendo a SEQ ID N°: 8, por exemplo, como descrito nos Exemplos 1 e 2 aqui.
Ainda noutro aspeto, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, uma das proteínas de ligação a antigénio resumida acima e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização, a composição farmacêutica pode compreender um agente ativo adicional que é selecionado do grupo consistindo num radioisótopo, radionuclídeo, uma toxina ou um grupo terapêutico e um quimioterapêutico.
Num aspeto, a proteína de ligação a antigénio isolada é eficaz para inibir vasodilatação e/ou diminuir inflamação neurogénica quando administrada a um doente. Numa forma de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada é eficaz para reduzir a frequência e/ou gravidade de dores de cabeça, por exemplo, dores de cabeça de enxaqueca. Por exemplo, a proteína de ligação a antigénio pode ser utilizada como um tratamento agudo de enxaqueca e/ou como um tratamento profilático para prevenir ou reduzir a frequência e/ou gravidade de sintomas, particularmente sintomas de dor, associados com um ataque de enxaqueca. São ilustrados métodos para tratar ou prevenir um estado associado com CGRP R num doente, compreendendo administrar a um doente uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma proteína de ligação a antigénio isolada resumida acima. 0 estado pode ser uma dor de cabeça, por exemplo, uma dor de cabeça de enxaqueca ou uma cefaleia em salvas ou outro tipo de dor, e. g., uma dor crónica; noutra forma de realização, é diabetes mellitus (tipo II); em alternativa, é inflamação, particularmente inflamação neurogénica; em alternativa, é um distúrbio cardiovascular; em alternativa, é um distúrbio hemodinâmico associado com endotoxemia e sépsis; em alternativa, é vasodilatação. É também ilustrado um método de inibição da ligação a CGRP a CGRP R humano, e. g., a parte extracelular de CGRP R, num doente compreendendo administrar uma quantidade eficaz de, pelo menos, uma proteina de ligação a antigénio aqui proporcionada e/ou resumida acima.
Estes e outros aspetos serão descritos em maior detalhe aqui. Cada dos aspetos proporcionados pode abranger várias formas de realização aqui proporcionadas. Portanto, é antecipado que cada das formas de realização envolvendo um elemento ou combinações de elementos pode ser incluída em cada aspeto descrito e todas essas combinações dos aspetos e formas de realização acima são expressamente consideradas. Outras características, objetos e vantagens da invenção são evidentes na descrição detalhada que se segue.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra um alinhamento de sequências de RAMP-1 de humano, macaco cinomolgo e rato. A Fig. 2 mostra um alinhamento de sequências de CRLR de humano, macaco cinomolgo e rato.
As Fig. 3A e 3B mostram alinhamentos de sequências filogeneticamente baseadas de CDR de cadeia leve dos clones de anticorpo de recetor de anti-CGRP indicados possuindo cadeias leves capa e determinadas sequências consenso correspondentes. A Fig. 4 mostra alinhamentos de sequências filogeneticamente baseadas de CDR de cadeia leve dos clones de anticorpo de recetor de anti-CGRP indicados possuindo cadeias leves lambda e determinadas sequências consenso correspondentes.
As Fig. 5A, 5B, 5C, 5D e 5E mostram alinhamentos de sequências filogeneticamente baseadas de CDR de cadeia pesada dos clones de anticorpo de recetor de anti-CGRP indicados e determinadas sequências consenso correspondentes. A Fig. 5F mostra sequências consenso de CDR de cadeia pesada de anticorpo de recetor de anti-CGRP exemplificativas aqui divulgadas. A Fig. 6 é um gráfico de dados de duas experiências que mostram percentagem de inibição de ligação de ligando marcado a CGRP R por 1092 sobrenadantes de hibridoma de anti-CGRP R (diamantes) e 68 sobrenadantes de controlo negativo (quadrados).
As Fig.. 7A-D mostram dados IC50 de ensaio de AMPc exemplificativo a partir de células que expressam recetor de hCGRP (Fig. 7A) , hAMl (Fig. 7B) , hAM2 (Fig. 7C) e recetores de amilina humanos (Fig. 7D) para três mAbs anti-CGRP R indicadas. A Fig. 8 mostra um exemplo de dados de ligação a 125I-CGRP tais como podem ser utilizados para determinar a Ki de mAbs para recetor de CGRP humano.
As Fig.. 9A-D mostram dados de competição Biacore para anticorpos selecionados aqui divulgados. A Fig. 10 mostra uma determinação de Kd de FACS de mAb 12 G 8. A Fig. 11 mostra um alinhamento de sequências de RAMPl de cinomolgo, humano, quimeras humanas, rato e rhesus.
As Fig. 12A-B mostram um alinhamento de sequências CRLR de humano, cinomolgo, rhesus, rato, quimeras humanas e consenso.
As Fig. 13A-13C mostram dados de FACS representativos de diferentes ligações de recetores de CGRP quiméricos a anticorpos anti-CGRP R. A Fig. 14 mostra mapas de péptidos derivados de digestões com AspN de CGRP R isolado (cromatograma A) e de digestão de uma amostra de controlo contendo anticorpo monoclonal de CGRP R 12G8 (cromatograma B). A Fig. 15 mostra digestões de AspN com CGRP R na presença de diferentes concentrações de anticorpo neutralizante de CGRP R. A Fig. 16 mostra digestões de AspN com CGRP R na presença de diferente concentração de anticorpo neutralizante de CGRP R, 4E4. A Fig. 17 mostra intensidade de coloração de imunohistoquimica de células que expressam várias componentes de recetor com anticorpo 32H7.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Os cabeçalhos aqui utilizados são apenas para fins organizacionais e não são para interpretar como limitativos à matéria descrita. A menos que aqui definido em contrário, os termos técnicos e científicos utilizados em conjunto com o presente pedido devem possuir os significados que são normalmente entendidos pelos especialistas na técnica. Além disso, a menos que requerido em contrário pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e termos plurais devem incluir o singular.
De um modo geral, as nomenclaturas utilizadas em conjunto com e técnicas de cultura celular e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridação de proteínas e ácidos nucleicos aqui descritas são bem conhecidas e normalmente utilizadas na técnica. Os métodos e técnicas do presente pedido são, de um modo geral, realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais especificas que são citadas e discutidas por toda a presente descrição, a menos que indicado em contrário. Ver, e. g., Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1990). As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como normalmente conseguido na técnica ou como aqui descrito. A terminologia utilizada em conjunto com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de química analítica, química orgânica de síntese e química medicinal e farmacêutica aqui descritas são as bem conhecidas e normalmente utilizadas na técnica. As técnicas padrão podem ser utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento de doentes.
Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares, etc., aqui descritos e, como tal, pode variar. A terminologia aqui utilizada é com a finalidade de descrever apenas formas de realização particulares e não pretende limitar o âmbito da presente invenção, que é definido apenas pelas reivindicações.
Além dos exemplos operacionais ou quando indicado de outro modo, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições reacionais aqui utilizadas devem ser entendidos como modificados em todos os casos pela expressão "cerca de." A expressão "cerca de" quando utilizada em conjunto com percentagens significa ±1%.
Definições O termo "polinucleótido" ou "ácido nucleico" inclui polímeros de nucleótidos de cadeia simples e de cadeia dupla. Os nucleótidos compreendendo o polinucleótido podem ser ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleótido. As referidas modificações incluem modificações de base, tais como derivados de bromouridina e inosina, modificações de ribose, tais como 2',3'-didesoxirribose e modificações de ligação de internucleótidos, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosfororaniladato e fosforoamidato. 0 termo "oligonucleótidos" significa um polinucleótido compreendendo 200 ou menos nucleótidos. Em algumas formas de realização, os oligonucleótidos têm 10 a 60 bases em comprimento. Noutras formas de realização, os oligonucleótidos têm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 nucleótidos em comprimento. Os oligonucleótidos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, e. g., para utilização na construção de um gene mutante. Os oligonucleótidos podem ser oligonucleótidos sentido ou antissentido. Um oligonucleótido pode incluir um marcador, incluindo um radiomarcador, um marcador fluorescente, um marcador de hapteno ou um antigénico, para ensaios de deteção. Os oligonucleótidos podem ser utilizados, por exemplo, como iniciadores de PCR, iniciadores de clonagem ou sondas de hibridação.
Uma "molécula de ácido nucleico isolada" significa um ADN ou ARN de origem genómica, ARNm, ADNc ou sintética ou alguma sua combinação que não está associada com todos ou uma parte de um polinucleótido em que o polinucleótido isolado é encontrado na natureza ou está ligado a um polinucleótido ao qual não está ligado na natureza. Para fins desta divulgação, deve ser entendido que "uma molécula de ácido nucleico compreendendo" uma sequência de nucleótidos particular não abrange cromossomas intactos. As moléculas de ácido nucleico isoladas "compreendendo" sequências de ácidos nucleicos especificadas podem incluir, além das sequências especificadas, sequências codificantes até dez ou mesmo até vinte outras proteínas ou suas partes ou pode incluir sequências reguladoras operativamente ligadas que controlam a expressão da região codificante das sequências de ácidos nucleicos enumeradas e/ou podem incluir sequências vetor. A menos que especificado em contrário, a extremidade esquerda de qualquer sequência de polinucleótido com cadeia simples aqui discutida é a extremidade 5'; a direção esquerda das sequências de polinucleótidos com cadeia dupla é referida como a direção 5'. A direção de 5' para a adição 3' de transcriptos de ARN nascente é referida como a direção de transcrição; regiões de sequência na cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que o transcripto de ARN que são 5' para a extremidade 5' do transcripto de ARN são referidas como "sequências a montante"; regiões de sequência na cadeia de ADN possuindo a mesma sequência que o transcripto de ARN que são 3' para a extremidade 3' do transcripto de ARN são referidas como "sequências a jusante". A expressão "sequência de controlo" refere-se a uma sequência de polinucleótidos que pode afetar a expressão e processamento de sequências codificantes à qual está ligada. A natureza dessas sequências de controlo pode depender do organismo hospedeiro. Em formas de realização particulares, as sequências de controlo para procariotas podem incluir um promotor, um local de ligação ribossomal e uma sequência de terminação de transcrição. Por exemplo, sequências de controlo para eucariotas podem incluir promotores compreendendo um ou uma pluralidade de locais de reconhecimento para fatores de transcrição, sequências intensificadoras de transcrição e sequência de terminação de transcrição. As "sequências de controlo" podem incluir sequências lider e/ou sequências de parceiro de fusão. 0 termo "vetor" significa qualquer molécula ou entidade (e. g., ácido nucleico, plasmídeo, bacteriofago ou virus) utilizado para transferir informação codificante de proteína numa célula hospedeira. A expressão "vetor de expressão" ou "construtor de expressão" refere-se a um vetor que é adequado para transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácidos nucleicos que direcionam e/ou controlam (em conjunto com a célula hospedeira) expressão de uma ou mais regiões codificantes heterólogas operativamente ligadas a estas. Um construtor de expressão pode incluir, mas não está limitado a sequências que afetam ou controlam transcrição, tradução e, se estiverem presentes intrões, afetam a união de ARN de uma região codificante operativamente ligada a estas.
Como aqui utilizado, "operativamente ligadas" significa que os componentes aos quais a expressão é aplicada estão numa relação que os permite realizar as suas funções inerentes sob condições adequadas. Por exemplo, uma sequência de controlo num vetor que está "operativamente ligado" a uma sequência codificante de proteína está ligado a esta de modo que a expressão da sequência codificante de proteína seja conseguida sob condições compatíveis com a atividade transcricional das sequências de controlo. A expressão "célula hospedeira" significa uma célula que foi transformada ou é capaz de ser transformada, com uma sequência de ácidos nucleicos e, desse modo, expressa um gene de interesse. A expressão inclui a progenia da célula parental, quer a progenia seja ou não idêntica em morfologia ou em constituição genética à célula parental original, desde que o gene de interesse esteja presente. 0 termo "transdução" significa a transferência de genes de uma bactéria para outra, normalmente por bacteriofago. "Transdução" também se refere à aquisição e transferência de sequências celulares eucarióticas por retrovirus defetivos de replicação. 0 termo "transfeção" significa a captação de ADN estranho ou exógeno por uma célula e uma célula foi "transfetada" quando o ADN exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. São bem conhecidas na técnica várias técnicas de transfeção e são aqui divulgadas. Ver, e. g., Graham et al., 1973, Virology _52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et ai., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene jL3:197. Essas técnicas podem ser utilizadas para introduzir uma ou mais unidades de ADN exógeno em células hospedeiras adequadas. 0 termo "transformação" refere-se a uma alteração numa caracteristica genética da célula e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter novo ADN ou ARN. Por exemplo, uma célula é transformada quando é geneticamente modificada a partir do seu estado nativo introduzindo novo material genético por meio de transfeção, transdução ou outras técnicas. A seguir a transfeção ou transdução, o ADN transformante pode recombinar com o da célula integrando-se fisicamente num cromossoma da célula ou pode ser mantido transientemente como um elemento epissomal sem ser replicado ou pode replicar-se independentemente como um plasmideo. Uma célula é considerada ter sido "estavelmente transformada" quando o ADN transformante é replicado com a divisão da célula.
Os termos "polipéptido" ou "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos também se aplicam a polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um análogo ou mimético de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como polímeros de aminoácidos de ocorrência natural. Os termos podem também abranger polímeros de aminoácidos que foram modificados, e. g., pela adição de resíduos de hidrato de carbono para formar glicoproteínas ou fosforilados. Polipéptidos e proteínas podem ser produzidos por uma célula de ocorrência natural e não recombinante; ou é produzida por uma célula recombinante ou geneticamente construída e compreendem moléculas possuindo as sequências de aminoácidos da proteína nativa ou moléculas possuindo deleções, adições e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos "polipéptido" e "proteína" abrangem especificamente proteínas de ligação a antigénio, e. g., proteínas de ligação a antigénio de CGRPR, proteínas de ligação a CGRPR, anticorpos ou sequências que possuem deleções de, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de uma proteína de ligação a antigénio. A expressão "fragmento polipeptídico" refere-se a um polipéptido que possui uma deleção de terminal amino, uma deleção de C-terminalarboxilo e/ou uma deleção interna quando comparada com a proteína de comprimento total. Esses fragmentos podem também conter aminoácidos modificados quando comparados com a proteína de comprimento total. Em determinadas formas de realização, os fragmentos têm cerca de cinco a 500 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, os fragmentos podem ter, pelo menos, 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de comprimento. Fragmentos de polipéptidos úteis incluem fragmentos imunologicamente funcionais de anticorpos, incluindo domínios de ligação. No caso de um anticorpo de ligação a CGRP R, fragmentos úteis incluem, mas não estão limitados a uma região CDR, um domínio variável de uma cadeia pesada ou leve, uma parte de uma cadeia de anticorpo ou apenas o seu domínio variável incluindo duas CDR e semelhantes. O "recetor de CGRP", ou "CGRP R", é entendido compreender RAMPl e CRLR. A expressão "proteína isolada" (e. g., proteína de ligação a antigénio isolada), "polipéptido isolado" ou "anticorpo isolado" significa que uma proteína, polipéptido ou anticorpo em questão (1) é livre de, pelo menos, algumas outras proteínas com as quais seria normalmente encontrada, (2) é essencialmente livre de outras proteínas da mesma fonte, e. g., da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de, pelo menos, cerca de 50 porcento dos polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais está associada na natureza, (5) está operativamente associada (por interação covalente ou não covalente) com um polipéptido com o qual não está associada na natureza ou (6) não ocorre na natureza. Tipicamente, uma "proteína isolada", "polipéptido isolado" ou "anticorpo isolado" constitui, pelo menos, cerca de 5%, pelo menos, cerca de 10%, pelo menos, cerca de 25% ou, pelo menos, cerca de 50% de uma dada amostra. ADN genómico, ADNc, ARNm ou outro ARN, de origem sintética, ou qualquer sua combinação podem codificar essa proteína isolada. De um modo preferido, o polipéptido ou anticorpo de proteína isolado é substancialmente livre de outras proteínas ou outros polipéptidos ou outros contaminantes que são encontrados no seu ambiente natural que interfeririam com a sua terapêutica, diagnóstico, profilático, investigação ou outra utilização.
Uma "variante" de um polipéptido (e. g., uma proteína de ligação a antigénio ou um anticorpo) compreende uma sequência de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em, deletados de e/ou substituídos na sequência de aminoácidos relativa a outra sequência de polipéptidos. As variantes incluem proteínas de fusão.
Um "derivado" de um polipéptido é um polipéptido (e. g., uma proteína de ligação a antigénio ou um anticorpo) que foi quimicamente modificado em algum modo distinto de variantes de inserção, deleção ou substituição, e. g., por meio de conjugação a outra entidade química. A expressão "de ocorrência natural" como utilizada por toda a descrição em conjunto com materiais biológicos, tais como polipéptidos, ácidos nucleicos, células hospedeiras e semelhantes, refere-se a materiais que são encontrados na natureza.
Uma "proteína de ligação a antigénio" como aqui utilizada significa uma proteína que se liga especificamente a um antigénio alvo especificado, tal como CGRP R, particularmente primata, e. g., CGRP R humano. Uma proteína de ligação a antigénio de CGRP R liga-se especificamente ao recetor de CGRP humano.
Uma proteína de ligação a antigénio é referida "ligar-se especificamente" ao seu alvo quando a constante de dissociação (KD) é <10~6 M. 0 anticorpo liga-se especificamente ao antigénio alvo com "elevada afinidade" quando a KD é ^lx IO-8 M. Numa forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão a CGRP R ou CGRP R humano com uma KD<5x IO-7; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma KD ^lx 10-7; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma KD <5x 10-8; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma KD^lxlO-8; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma Kd<5x10-9; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma KD^lxlO-9; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma KD<5xlO-10; noutra forma de realização, os anticorpos ligar-se-ão com uma KDdlxlO~10.
Um anticorpo, seu fragmento de ligação a antigénio ou proteína de ligação a antigénio "inibe seletivamente" um recetor específico relativo a outros recetores quando o IC50 do anticorpo, seu fragmento de ligação a antigénio ou proteína de ligação a antigénio num ensaio de inibição do recetor específico é, pelo menos, 50 vezes inferior ao IC50 num ensaio de inibição de outro recetor de "referência". A "razão de seletividade" é o IC50 do recetor de referência dividido pelo IC50 do recetor especifico. Um anticorpo, seu fragmento de ligação a antigénio ou proteina de ligação a antigénio inibe seletivamente o recetor de CGRP humano se o IC50 do anticorpo, seu fragmento de ligação a antigénio ou proteina de ligação a antigénio num ensaio de AMPc, e. g., o ensaio de inibição de AMPc como aqui descrito no
Exemplo 4, é, pelo menos, 50 vezes inferior do que o IC50 desse mesmo anticorpo, seu fragmento de ligação a antigénio ou proteina de ligação a antigénio num ensaio de inibição do recetor de AMI, AM2 humano ou um de amilina (e. g., AMY 1) . A titulo de exemplo não limitativo, se o IC50 de um anticorpo anti-CGRP R especifico num ensaio de AMPc de hCGRP R for, e. g., entre 0,1 nM e 20 nM e o IC50 do mesmo anticorpo num ensaio de AMPc do recetor de hAMl, hAM2 ou AMYl humano for 100 0 nM ou mais, esse anticorpo inibe seletivamente o recetor de hCGRP. Uma proteina de ligação a antigénio que inibe seletivamente um recetor específico é também entendida ser uma proteína de ligação a antigénio neutralizante em relação a esse recetor. "Região de ligação a antigénio" significa uma proteína ou uma parte de uma proteína, que se liga especif icamente a um antigénio especificado. Por exemplo, essa parte de uma proteína de ligação a antigénio que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antigénio e conferem à proteína de ligação a antigénio a sua especificidade e afinidade para o antigénio é referida como "região de ligação a antigénio". Uma região de ligação a antigénio tipicamente inclui uma ou mais "regiões de ligação de complementaridade" ("CDR"). Determinadas regiões de ligação a antigénio também incluem uma ou mais regiões de "estrutura". Uma "CDR" é uma sequência de aminoácidos que contribui para a especificidade e afinidade de ligação a antigénio. As regiões de "estrutura" podem ajudar a manter a conformação própria das CDR para promover ligação entre a região de ligação a antigénio e um antigénio.
Em determinados aspetos, são proporcionadas proteínas de ligação a antigénio recombinantes que se ligam a proteína de CGRP R ou CGRP R humano. Neste sentido, uma "proteína recombinante" é uma proteína preparada utilizando técnicas recombinantes, í. e., através da expressão de um ácido nucleico recombinante como aqui descrito. Métodos e técnicas para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica. 0 termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina intacta de qualquer isotipo ou um seu fragmento de ligação a antigénio que pode competir com o anticorpo intacto para ligação específica ao antigénio alvo e inclui, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e biespecíficos. Um "anticorpo", como tal, é uma espécie de uma proteína de ligação a antigénio. Um anticorpo intacto, de um modo geral, compreenderá, pelo menos, duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, mas em alguns casos pode incluir menos cadeias, tais como anticorpos de ocorrência natural em camelídeos que podem compreender apenas cadeias pesadas. Anticorpos podem ser derivados apenas de uma fonte única ou podem ser "quiméricos," isto é, partes diferentes do anticorpo podem ser derivadas de dois anticorpos diferentes como descrito ainda abaixo. As proteínas de ligação a antigénio, anticorpos ou fragmentos de ligação podem ser produzidos em hibridomas, por técnicas de ADN recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. A menos que indicado em contrário, o termo "anticorpo" inclui, além dos anticorpos compreendendo duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, derivados, variantes, seus fragmentos e mutações, exemplos dos quais são descritos abaixo. A expressão "cadeia leve" inclui uma cadeia leve de comprimento total e seus fragmentos possuindo sequência de região variável suficiente para conferir especificidade de ligação. Uma cadeia leve de comprimento total inclui um domínio de região variável, VL e um domínio de região constante, CL. 0 domínio de região variável da cadeia leve está no terminal amino do polipéptido. As cadeias leves incluem cadeias capa e cadeias lambda. A expressão "cadeia pesada" inclui uma cadeia pesada de comprimento total e seus fragmentos possuindo sequência de região variável suficiente para conferir especificidade de
ligação. Uma cadeia pesada de comprimento total inclui um domínio de região variável, VH e três domínios de região constante, CH1, CH2 e CH3. 0 domínio VH está no terminal amino do polipéptido e os domínios CH estão no C-terminalarboxilo, com o Ch3 estando mais próximo do C-terminalarboxilo do polipéptido. As cadeias pesadas podem ser de qualquer isotipo, incluindo IgG (incluindo subtipos IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo os subtipos IgAl e IgA2), IgM e IgE. A expressão "sequência sinal", "sequência líder" ou "péptido sinal" refere-se a uma cadeia de péptido curta (3-60 aminoácidos de comprimento) que direciona o transporte de uma proteína. Os péptidos sinal podem também ser designados sinais de direcionamento, sequências sinal, péptidos de trânsito ou sinais de localização. Alguns péptidos sinal são clivados a partir da proteína por peptidase sinal após as proteínas serem transportadas, tal que a forma biologicamente ativa da proteína (e. g., uma proteína de ligação a antigénio como aqui descrita) seja a forma clivada, mais curta. Como consequência, as expressões tais como "anticorpo compreendendo uma cadeia pesada...", "anticorpo compreendendo uma cadeia leve...", etc., em que o anticorpo é caracterizado como possuindo uma cadeia leve e/ou pesada com uma sequência identificada particular, são entendidas como incluindo anticorpos possuindo as sequências identificadas específicas, anticorpos possuindo as sequências identificadas específicas exceto que as sequências sinal são substituídas por sequências sinal diferentes, assim como anticorpos possuindo as sequências identificadas, menos quaisquer sequências sinal. A expressão "fragmento de ligação a antigénio" (ou simplesmente "fragmento") de um anticorpo ou cadeia (cadeia pesada ou leve) de imunoglobulina, como aqui utilizada, compreende uma parte (independentemente de como essa parte é obtida ou sintetizada) de um anticorpo que carece de, pelo menos, alguns dos aminoácidos presentes numa cadeia de comprimento total, mas a qual é capaz de se ligar especificamente a um antigénio. Esses fragmentos são biologicamente ativos uma vez que se ligam especificamente ao antigénio alvo e podem competir com outras proteínas de ligação a antigénio, incluindo anticorpos intactos, para ligação específica a um dado epítopo. Num aspeto, esse fragmento reterá, pelo menos, uma CDR presente na cadeia leve ou pesada de comprimento total e, em algumas formas de realização, compreenderá uma única cadeia pesada e/ou cadeia leve ou sua parte. Estes fragmentos biologicamente ativos podem ser produzidos por técnicas de ADN recombinante ou podem ser produzidos por clivagem enzimática ou química de proteínas de ligação a antigénio, incluindo anticorpos intactos. Os fragmentos de imunoglobulina imunologicamente funcionais incluem, mas não são limitados a Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticorpos de domínio e anticorpos de cadeia simples e podem ser derivados de qualquer fonte mamífera, incluindo, mas não limitados a humanos, murganhos, ratos, camelídeos ou coelhos. Está ainda contemplado que uma parte funcional das proteínas de ligação a antigénio aqui divulgadas, por exemplo, uma ou mais CDR, podia estar covalentemente ligada a uma segunda proteína ou a uma molécula pequena para originar um agente terapêutico direcionado a um alvo particular no corpo, possuindo propriedades terapêuticas bifuncionais ou possuindo um tempo de meia-vida sérico prolongado.
Um "fragmento Fab" é constituído por uma cadeia leve e o CH1 e regiões variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação dissulfureto com outra molécula de cadeia pesada.
Uma região "Fc" contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios CH1 e CH2 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são suportados em conjunto por duas ou mais ligações dissulfureto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.
Um "fragmento Fab'" contém uma cadeia leve e uma parte de uma cadeia pesada que contém o domínio VH e o domínio CH1 e também a região entre os domínios CH1 e CH2, tal que pode ser formada uma ligação dissulfureto intercadeias entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar uma molécula F(ab')2.
Um "fragmento F(ab')2" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma parte da região constante entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação dissulfureto intercadeias é formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab')2, deste modo, é constituído por dois fragmentos Fab' que são suportados em conjunto por uma ligação dissulfureto entre as duas cadeias pesadas. A "região Fv" compreende as regiões variáveis das cadeias pesada e leve, mas carece das regiões constantes. "Anticorpos de cadeia simples" são moléculas Fv em que as regiões variáveis de cadeia leve e pesada foram ligadas por um ligante flexível para formar uma cadeia de polipéptido simples, que forma uma região de ligação a antigénio. Anticorpos de cadeia simples são discutidos em detalhe na Publicação do Pedido de Patente Internacional N° WO 88/01649 e Patente dos Estados Unidos N° 4946778 e N° 5260203.
Um "anticorpo de domínio" é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo apenas a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH são covalentemente ligadas com um ligante de péptido para originar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente podem direcionar os mesmos ou diferentes antigénios.
Uma "proteína de ligação a antigénio bivalente" ou "anticorpo bivalente" compreende dois locais de ligação a antigénio. Em alguns casos, os dois locais de ligação possuem as mesmas especificidades de antigénio. Proteínas de ligação a antigénio bivalentes e anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos, ver, infra.
Uma "proteína de ligação a antigénio multiespecífica" ou "anticorpo multiespecí fico" é uma que direciona mais do que um antigénio ou epítopo.
Uma proteína ou anticorpo de ligação a antigénio "biespecífica," "duo-específica" ou "bifuncional" é uma proteína ou anticorpo de ligação a antigénio híbrido, respetivamente, possuindo dois locais de ligação a antigénio diferentes. Proteínas e anticorpos de ligação a antigénio biespecíficos são uma espécie de proteína de ligação a antigénio multiespecífica ou anticorpo multiespecífico e podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, e. g., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Os dois locais de ligação de uma proteína ou anticorpo de ligação a antigénio biespecífico ligar-se-ão a dois epítopos diferentes, que podem residir nos mesmos ou diferentes alvos de proteína. A expressão "proteína de ligação a antigénio neutralizante" ou "anticorpo neutralizante" refere-se a uma proteína ou anticorpo de ligação a antigénio, respetivamente, que se liga a um ligando, impede a ligação do ligando ao seu parceiro de ligação e interrompe a resposta biológica que, de outro modo, resultaria da ligação do ligando ao seu parceiro de ligação. Ao avaliar a ligação e especificidade de uma proteína de ligação a antigénio, e. g., um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio imunologicamente funcional, um anticorpo ou fragmento inibirão, substancialmente a ligação de um ligando ao seu parceiro de ligação quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de parceiro de ligação ligado ao ligando em, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais (como medido num ensaio de ligação competitivo in vitro). No caso de uma proteína de ligação a CGRP R, essa molécula neutralizante diminuirá a capacidade de CGRP R para se ligar a CGRP. O termo "competir", quando utilizado no contexto de proteínas de ligação a antigénio que podem ligar-se à mesma região num antigénio alvo, significa que a competição entre proteínas de ligação a antigénio é determinada por um ensaio em que a proteína de ligação a antigénio (e. g., anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio imunologicamente funcional) sob teste inibe ou impede a ligação específica de uma proteína de ligação a antigénio de referência (e. g., um ligando ou um anticorpo de referência) a um antigénio comum (e. g., CGRP R ou um seu fragmento de ligação a antigénio). Podem ser utilizados quaisquer de vários ensaios de ligação competitivos, por exemplo: radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto de fase sólida, imunoensaio (EIA) de enzima direto ou indireto de fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (ver, e. g., Stahli et ai., 1983, Methods in Enzymology _9 :242-253) ; EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (ver, e. g., Kirkland et ai., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) ensaio marcado direto de fase sólida, ensaio em sanduíche marcado direto de fase sólida (ver, e. g., Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcador direto de fase sólida utilizando marcador 1-125 (ver, e. g., Morei et ai., 1988, Molec. Immunol. 2_5:7-15); EIA de biotina-avidina direto de fase sólida (ver, e. g., Cheung, et ai., 1990, Virology 176:546-552); e RIA marcado direto (Moldenhauer et ai., 1990, Scand. J.
Immunol. 32:77-82). Esse ensaio pode envolver a utilização de antigénio purificado ligado a uma superfície sólida ou células que suportam qualquer destes, uma proteína de ligação a antigénio teste não marcada e uma proteína de ligação a antigénio de referência marcada. A inibição competitiva pode ser medida determinando a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da proteína de ligação a antigénio teste. As proteínas de ligação a antigénio identificadas por ensaio de competição (proteínas de ligação a antigénio que competem) incluem ligação de proteína de ligação a antigénios ao mesmo epítopo que as proteínas de ligação a antigénio de referência e ligação de proteínas de ligação a antigénio a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pela proteína de ligação a antigénio de referência para ocorrer impedimento estérico. Normalmente, quando uma proteína de ligação a antigénio que compete está presente em excesso, inibirá ligação específica de uma proteína de ligação a antigénio de referência a um antigénio comum em, pelo menos, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%. Em alguns casos, a ligação é inibida em, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 97% ou mais. A inibição competitiva pode também ser medida imobilizando uma proteína de ligação a antigénio de referência a um substrato, e. g., um "chip sensor", que captura antigénio no substrato por meio de ligação ao anticorpo de referência e avaliando se uma proteína de ligação a antigénio diferente (uma proteína de ligação a antigénio que compete) pode, adicionalmente, ligar-se ao antigénio. Um exemplo do mais recente ensaio de ligação competitiva emprega uma análise Biacore e é descrito no Exemplo 7 aqui. O termo "antigénio" ou "imunogénio" refere-se a uma molécula ou uma parte de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação seletivo, tal como uma proteína de ligação a antigénio (incluindo, e. g., um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio funcional imunológico) e adicionalmente capaz de ser utilizado num animal para produzir anticorpos capazes de se ligar a esse antigénio. Um antigénio pode possuir um ou mais epítopos que são capazes de interagir com diferentes proteínas de ligação a antigénio, e. g., anticorpos. 0 termo "epítopo" é a parte de uma molécula que está ligada por uma proteína de ligação a antigénio (por exemplo, um anticorpo). 0 termo inclui qualquer determinante capaz de se ligar especificamente a uma proteína de ligação a antigénio, tal como um anticorpo ou a um recetor de célula T. Um epítopo pode ser contíguo ou não contíguo (e. g., (i) num polipéptido de cadeia simples, resíduos de aminoácidos que não são contíguos a um outro na sequência de polipéptidos mas que estão dentro do contexto da molécula são ligados pela proteína de ligação a antigénio, ou (ii) num recetor multimérico, e. g., CGRP R, compreendendo dois ou mais componentes individuais, e. g., RAMPl e CRLR, resíduos de aminoácidos presentes em dois ou mais dos componentes individuais, mas que estão dentro do contexto do recetor multimérico são ligados pela proteína de ligação a antigénio). Em determinadas formas de realização, os epítopos podem ser miméticos uma vez que estes compreendem uma estrutura tridimensional que é semelhante a um epítopo utilizado para gerar a proteína de ligação a antigénio, compreendem ainda nenhum ou apenas alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados nesse epítopo utilizado para gerar a proteína de ligação a antigénio. Mais frequentemente, os epítopos residem em proteínas, mas, em alguns casos, podem residir noutros tipos de moléculas, tais como ácidos nucleicos. Os determinantes de epítopos podem incluir agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias secundárias de açúcares, grupos fosforilo ou sulfonilo e podem possuir caracteristicas estruturais tridimensionais especificas e/ou caracteristicas de carga especificas. De um modo geral, anticorpos específicos para um antigénio alvo particular reconhecerão, de um modo preferido, um epítopo no antigénio alvo numa mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. 0 termo "identidade" refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipéptido ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, como determinado alinhando e comparando as sequências. "Percentagem de identidade" significa a percentagem de resíduos idênticos entre os aminoácidos ou nucleótidos nas moléculas comparadas e é calculada com base no tamanho da mais pequena das moléculas a comparar. Para estes cálculos, lacunas em alinhamentos (se alguns) devem ser abordados por um modelo matemático ou programa de computador particular (i. e., um "algoritmo"). Os métodos que podem ser utilizados para calcular a identidade dos ácidos nucleicos ou polipéptidos alinhados incluem os descritos em Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nova Iorque: Oxford
University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, Nova Iorque: Academic Press; Computer
Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987,
Sequence Analysis in Molecular Biology, Nova Iorque: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, Nova Iorque: M. Stockton Press; e Carillo et ai., 1988, SIAM J. Applied Math. 48_:1073.
Ao calcular a percentagem de identidade, as sequências a comparar são alinhadas num modo que dá a maior correspondência entre as sequências. 0 programa de computador utilizado para determinar percentagem de identidade é o pacote de programa GCG, que inclui GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387;
Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) . 0 algoritmo de computador GAP é utilizado para alinhar os dois polipéptidos ou polinucleótidos para os quais a percentagem de identidade de sequência é para determinar. As sequências são alinhadas para correspondência ótima dos seus respetivos aminoácidos ou nucleótidos (o "intervalo de correspondência", como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade por abertura de lacuna (que é calculada como 3x a diagonal média, em que a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação a utilizar; a "diagonal" é a classificação ou número atribuído a cada correspondência de aminoácidos perfeita pela matriz de comparação particular) e uma penalidade por extensão de lacuna (que é, normalmente, 1/10 de vezes a penalidade por abertura de lacuna) , assim como uma matriz de comparação, tais como PAM 250 ou BLOSUM 62, são utilizadas em conjunto com o algoritmo. Em determinadas formas de realização, uma matriz de comparação padrão (ver, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and
Structure 5_: 345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também utilizada pelo algoritmo.
Os parâmetros recomendados para determinar a percentagem de identidade para sequências de polipéptidos ou nucleótidos utilizando o programa GAP são os seguintes:
Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443- 453;
Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et ai., 1992, supra;
Penalidade por lacuna: 12 (mas sem penalidade por lacunas de extremidade)
Penalidade por comprimento de lacuna: 4
Limiar de Semelhança: 0
Determinados esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar na correspondência de apenas uma curta região das duas sequências e esta pequena região alinhada pode possuir identidade de sequência muito elevada mesmo que não exista relação significativa entre as duas sequências de comprimento total. Como consequência, o método de alinhamento selecionado (programa GAP) pode ser ajustado, se assim desejado, para resultar num alinhamento que abrange, pelo menos, 50 aminoácidos contíguos do polipéptido alvo.
Como aqui utilizado, "substancialmente puro" significa que a espécie descrita de molécula é a espécie predominante presente, isto é, numa base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na mesma mistura. Em determinadas formas de realização, uma molécula substancialmente pura é uma composição em que a espécie objeto compreende, pelo menos, 50% (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Noutras formas de realização, uma composição substancialmente pura compreenderá, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Noutras formas de realização, a espécie objeto é purificada para homogeneidade essencial, em que não podem ser detetadas espécies contaminantes na composição por métodos de deteção convencionais e, deste modo, a composição consiste numa única espécie macromolecular detetável. 0 termo "tratar" refere-se a quaisquer indícios de sucesso no tratamento ou melhoria de uma lesão, patologia ou estado, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo, tal como redução; remissão; diminuição de sintomas ou tornar a lesão, patologia ou estado mais tolerável ao doente; abrandamento na velocidade de degeneração ou declínio; tornar o ponto final da degeneração menos debilitante; melhorar o bem-estar físico ou mental do doente. 0 tratamento ou melhoria de sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame físico, exames neuropsiquiátricos e/ou uma avaliação psiquiátrica. Por exemplo, determinados métodos apresentados aqui tratam com sucesso dores de cabeça de enxaqueca profilaticamente ou como um tratamento agudo, diminuindo a frequência de dores de cabeça de enxaqueca, diminuindo a gravidade de dores de cabeça de enxaqueca e/ou melhorando um sintoma associado com dores de cabeça de enxaqueca.
Uma "quantidade eficaz" é, de um modo geral, uma quantidade suficiente para reduzir a gravidade e/ou frequência de sintomas, eliminar os sintomas e/ou causa subjacente, prevenir a ocorrência de sintomas e/ou sua causa subjacente, e/ou melhorar ou remediar o dano que resulta de ou está associado com dor de cabeça de enxaqueca. Em algumas formas de realização, a quantidade eficaz é uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade suficiente para remediar um estado de doença (e. g. dor de cabeça de enxaqueca) ou sintomas, particularmente um estado ou sintomas associados com o estado de doença ou, de outro modo, prevenir, esconder, retardar ou reverter a progressão do estado de doença ou qualquer outro sintoma indesejável associado com a doença de qualquer forma. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" é uma quantidade de uma composição farmacêutica que, quando administrada a um indivíduo, possuirá o efeito profilático pretendido, e. g., prevenir ou atrasar o início (ou recorrência) de dor de cabeça de enxaqueca ou reduzir as probabilidades do início (ou recorrência) de dor de cabeça de enxaqueca ou sintomas de dor de cabeça de enxaqueca. 0 efeito terapêutico ou profilático total não ocorre necessariamente por administração de uma dose e pode ocorrer apenas após administração de uma série de doses. Deste modo, uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz pode ser administrada numa ou mais administrações. "Aminoácido" inclui o seu significado normal na técnica. Os vinte aminoácidos de ocorrência natural e suas abreviaturas seguem a utilização convencional. Ver, Immunology-A Synthesis, 2a Edição, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Os estereoisómeros (e. g., D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como aminoácidos a-,a-disubstituidos, aminoácidos N-alquilo e outros aminoácidos não convencionais podem também ser componentes adequados para polipéptidos e estão incluídos no termo "aminoácidos". Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, ε-Ν,Ν,N-trimetil-lisina, ε-Ν-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos (e. g., 4-hidroxiprolina) semelhantes. Na notação de polipéptido aqui utilizada, a direção esquerda é a direção de terminal amino e a direção direita é a direção de C-terminalarboxilo, de acordo com a utilização e convenção padrão.
Visão Geral São aqui proporcionadas proteínas de ligação a antigénio que se ligam a proteína de CGRP R, incluindo proteína de CGRP R humano (hCGRP R) . As proteínas de ligação a antigénio proporcionadas são polipéptidos em que uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR), como aqui descritas, são incorporadas e/ou juntas. Em algumas proteínas de ligação a antigénio, as CDR são incorporadas numa região de "estrutura", que orienta a(s) CDR(s) de modo que as próprias propriedades de ligação a antigénio da(s) CDR(s) seja(m) conseguida(s) . Em geral, as proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas podem interferir com, bloquear, reduzir ou modular a interação entre CGRP e CGRP R.
Determinadas proteínas de ligação a antigénio aqui descritas são anticorpos ou são derivadas de anticorpos. Em determinadas formas de realização, a estrutura de polipéptido das proteínas de ligação a antigénio é baseada em anticorpos, incluindo, mas não limitados a anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes referidos aqui como "miméticos de anticorpo"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpo (algumas vezes referidos como "conjugados de anticorpo") e seus fragmentos. As várias estruturas são ainda aqui descritas abaixo.
As proteínas de ligação a antigénio aqui proporcionadas demonstraram ligar-se a CGRP R, em particular CGRP R humano.
Como ainda descrito nos exemplos abaixo, determinadas proteínas de ligação a antigénio foram testadas e verificaram ligar-se a epítopos diferentes dos ligados por uma série de outros anticorpos direcionados contra um ou os outros dos componentes de CGRP R. As proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas competem com CGRP e, desse modo, impedem CGRP de se ligar ao seu recetor. Como consequência, as proteínas de ligação a antigénio aqui proporcionadas são capazes de inibir a atividade de CGRP R. Em particular, a ligação de proteínas de ligação a antigénio a estes epítopos pode possuir uma ou mais das seguintes atividades: inibir, inter alia, indução de trajetórias de transdução de sinal de CGRP R, inibir vasodilatação, provocar vasoconstrição, diminuir inflamação, e. g., inflamação neurogénica e outros efeitos fisiológicos induzidos por CGRP R mediante ligação a CGRP.
As proteínas de ligação a antigénio que são aqui divulgadas possuem uma variedade de utilidades. Algumas das proteínas de ligação a antigénio, por exemplo, são úteis em ensaios de ligação específicos, purificação de afinidade de CGRP R, em particular hCGRP R ou seus ligandos e em ensaios de rastreamento para identificar outros antagonistas de atividade de CGRP R. Algumas das proteínas de ligação a antigénio são úteis para inibir ligação a CGRP a CGRP R.
As proteínas de ligação a antigénio podem ser utilizadas numa variedade de aplicações de tratamento, como explicado aqui. Por exemplo, determinadas proteínas de ligação a antigénio de CGRP R são úteis para tratar estados associados com sinalização mediada por CGRP R, tais como reduzir, aliviar ou tratar a frequência e/ou gravidade de dor de cabeça de enxaqueca, reduzir, aliviar ou tratar cefaleia em salvas, reduzir, aliviar ou tratar dor crónica, aliviar ou tratar diabetes mellitus (tipo II), reduzir, aliviar ou tratar distúrbios cardiovasculares e reduzir, aliviar ou tratar distúrbios hemodinâmicos associados com endotoxemia e sépsis num doente. Outras utilizações para proteínas de ligação a antigénio incluem, por exemplo, diagnóstico de doenças ou estados associados com CGRP R e ensaios de rastreamento para determinar a presença ou ausência de CGRP R. Algumas das proteínas de ligação a antigénio aqui descritas são úteis em tratar consequências, sintomas e/ou a patologia associada com atividade de CGRP R. Estas incluem, mas não são limitadas a vários tipos de dores de cabeça de enxaqueca.
Receptor de CGRP
As proteínas de ligação a antigénio aqui divulgadas ligam-se a CGRP R, em particular CGRP R humano. 0 CGRP R é um multímero que inclui CRLR e RAMPl. A sequência de nucleótidos de CRLR humano é aqui proporcionada como SEQ ID N°:l. A sequência de aminoácidos de CRLR humano é aqui proporcionada como SEQ ID N°:2. A sequência de nucleótidos de RAMPl humano é aqui proporcionada como SEQ ID N°:3. A sequência de aminoácidos de RAMPl humano é aqui proporcionada como SEQ ID N°:4. As proteínas de ligação a antigénio aqui descritas ligam-se à parte extracelular de CGRP R, que compreende as partes extracelulares de CRLR e RAMPl. Um domínio extracelular ("ECD") exemplificativo de CRLR humano é codificado pela sequência de nucleótidos apresentada como SEQ ID N°:5 e possui a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N°:6. Esta sequência inclui um péptido sinal; um ECD de CRLR maduro (menos o péptido sinal) exemplificativo possui a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N°:10. Um ECD exemplificativo de RAMPl humano é codificado pela sequência de nucleótidos apresentada como SEQ ID N°:7 e possui a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N°:8. Esta sequência inclui um péptido sinal; um ECD de RAMPl maduro (menos o péptido sinal) exemplificativo possui a sequência de aminoácidos apresentada como SEQ ID N°:ll. Como descrito abaixo, as proteínas de CGRP R podem também incluir fragmentos. Como aqui utilizados, os termos são utilizados indiferentemente para significar um recetor, em particular, a menos que especificado de outro modo, um recetor humano que se liga especificamente a CGRP. 0 termo CGRP R também inclui modificações pós-tradução da sequência de aminoácidos de CGRP R, por exemplo, possíveis locais de glicosilação ligados a N. Deste modo, as proteínas de ligação a antigénio podem ligar-se a ou ser geradas a partir de proteínas glicosiladas numa ou mais das posições.
Proteínas de Ligação ao Recetor de CGRP São proporcionados uma variedade de agentes de ligação seletiva úteis para regular a atividade de CGRP R. Estes agentes incluem, por exemplo, proteínas de ligação a antigénio que contêm um domínio de ligação a antigénio (e. g., anticorpos de cadeia simples, anticorpos de domínio, imunoadesões e polipéptidos com uma região de ligação a antigénio) e ligam-se especificamente a CGRP R, em particular, CGRP R humano. Alguns dos agentes, por exemplo, são úteis na inibição da ligação a CGRP a CGRP R e podem, deste modo, ser utilizados para inibir, interferir com ou modular uma ou mais atividades associadas com sinalização de CGRP R.
Em geral, as proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas, tipicamente, compreendem uma ou mars CDR como aqui descritas (e. g., 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Em alguns casos, a proteína de ligação a antigénio compreende (a) uma estrutura de polipéptido e (b) uma ou mais CDR que são inseridas em e/ou juntas à estrutura de polipéptido. A estrutura de polipéptido pode assumir uma variedade de formas diferentes. Por exemplo, pode ser, ou compreender, a estrutura de um anticorpo de ocorrência natural, ou seu fragmento ou variante, ou pode ser completamente sintético na natureza. Exemplos de várias estruturas de polipéptido são ainda descritas abaixo.
Em determinadas formas de realização, a estrutura de polipéptido das proteínas de ligação a antigénio é um anticorpo ou é derivada de um anticorpo, incluindo, mas não limitada a, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (algumas vezes referidos aqui como "miméticos de anticorpo"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, fusões de anticorpo (algumas vezes referidos como "conjugados de anticorpo") e partes ou fragmentos de cada, respetivamente. Em alguns casos, a proteína de ligação a antigénio é um fragmento imunológico de um anticorpo (e. g., um Fab, um Fab' , um F(ab')2 ou um scFv) . As várias estruturas são ainda aqui descritas e definidas.
Algumas das proteínas de ligação a antigénio, como aqui proporcionadas, ligam-se especificamente a CGRP R humano. Numa forma de realização específica, a proteína de ligação a antigénio liga-se especificamente a proteína de CGRP R humano compreendendo CRLR humano possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2 e RAMPl humano possuindo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:4.
Em formas de realização em que a proteína de ligação a antigénio é utilizada para aplicações terapêuticas, uma proteína de ligação a antigénio pode inibir, interferir com ou modular uma ou mais atividades biológicas de CGRP R. Neste caso, uma proteína de ligação a antigénio liga-se especificamente e/ou inibe substancialmente a ligação a CGRP R humano a CGRP quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade de CGRP R humano ligado a CGRP, ou vice-versa, em, pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou mais (por exemplo, medindo a ligação num ensaio de ligação competitivo in vitro) .
Estrutura de Anticorpo de ocorrência natural
Algumas das proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas possuem a estrutura tipicamente associada com anticorpos de ocorrência natural. As unidades estruturais destes anticorpos, tipicamente, compreendem um ou mais tetrâmeros, cada um constituído por dois acoplamentos idênticos de cadeias de polipéptido, embora algumas espécies de mamíferos também produzam anticorpos possuindo apenas uma cadeia pesada simples. Num anticorpo típico, cada par ou acoplamento inclui uma cadeia "leve" de comprimento total (em determinadas formas de realização, cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento total (em determinadas formas de realização, cerca de 50-70 kDa). Cada cadeia de imunoglobulina individual é constituída por vários "domínios de imunoglobulina", cada um consistindo em mais ou menos 90 a 110 aminoácidos e expressando um padrão de dobra característico. Estes domínios são as unidades básicas das quais são constituídos os polipéptidos de anticorpos. A parte de terminal amino de cada cadeia, tipicamente, inclui um domínio variável que é responsável pelo reconhecimento de antigénio. A parte de C-terminalarboxilo é mais evolutivamente conservada do que a outra extremidade da cadeia e é referida como a "região constante" ou "região C". As cadeias leves humanas, de um modo geral, são classificadas como cadeias leves capa e lambda e cada destas contém um domínio variável e um domínio constante. As cadeias pesadas são, tipicamente, classificadas como cadeias mu, delta, gama, alfa ou épsilon e estas definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respetivamente. 0 IgG possui vários subtipos, incluindo, mas não limitado a, IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Os subtipos IgM incluem IgM e IgM2. Os Subtipos IgA incluem IgAl e IgA2. Em humanos, os isotipos IgA e IgD contêm quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves; os isotipos IgG e IgE contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; e o isotipo IgM contém cinco cadeias pesadas e cinco cadeias leves. A região C de cadeia pesada, tipicamente, compreende um ou mais domínios que podem ser responsáveis pela função efetora. 0 número de domínios de região constante de cadeia pesada dependerá do isotipo. Cadeias pesadas de IgG, por exemplo, contêm, cada uma, três domínios de região C conhecidos como CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos que são proporcionados podem possuir qualquer destes isotipos e subtipos. Em determinadas formas de realização, o anticorpo de CGRP R é do subtipo IgGl, IgG2 ou IgG4.
Em cadeias leves e pesadas de comprimento total, as regiões variáveis e constantes estão juntas por uma região "J" de cerca de doze ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de mais dez aminoácidos. Ver, e. g., Fundamental Immunology, 2aed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nova Iorque: Raven Press. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada, tipicamente, formam o local de ligação a antigénio.
Um exemplo de um domínio constante pesado IgG2 de um anticorpo monoclonal de CGRP R exemplificativo possui a sequência de aminoácidos:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVhTFPAVlQSSGLYSL
SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT
LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVhNAKTKPREEQFNSTFRVVSVlTVVhQDWLN
GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK (os últimos 326 resíduos da sequência mostrados como SEQ ID N°:29).
Um exemplo de um domínio constante leve capa de um anticorpo monoclonal de CGRP R exemplificativo possui a sequência de aminoácidos: RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (os Últimos 107 resíduos da sequência mostrados como SEQ ID N°:14).
As regiões variáveis de cadeias de imunoglobulina, de um modo geral, apresentam a mesma estrutura global, compreendendo regiões de estrutura (FR) relativamente conservadas juntas por três regiões hipervariáveis, frequentemente designadas "regiões determinantes de complementaridade" ou CDR. As CDR das duas cadeias de cada par de cadeia pesada/cadeia leve acima mencionado, tipicamente, estão alinhadas pelas regiões de estrutura para formar uma estrutura que se liga especificamente com um epítopo específico na proteína alvo (e. g.r CGRP R) . Do N-terminal ao C-terminal, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve de ocorrência natural, tipicamente, conformam com a seguinte ordem destes elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Tem sido planeado um sistema de numeração para atribuir números a aminoácidos que ocupam posições em cada destes domínios. Este sistema de numeração é definido em Rabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 e 1991, NIH, Bethesda, MD) , ou Chothia &amp; Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.
As várias regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve aqui proporcionadas são representadas na Tabela 3. Cada destas regiões variáveis pode estar ligada às regiões constantes de cadeia pesada e leve acima para formar uma cadeia pesada e leve de anticorpo completa, respetivamente. Mais, cada das sequências de cadeia pesada e leve assim geradas podem ser combinadas para formar uma estrutura de anticorpo completa. Deve ser entendido que as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve aqui proporcionadas podem também estar ligadas a outros domínios constantes possuindo sequências diferentes das sequências exemplificativas acima listadas.
Exemplos específicos de algumas das cadeias pesadas e leves de comprimento total dos anticorpos que são ilustrados e suas sequências de aminoácidos correspondentes são resumidas nas Tabelas 2A e 2B. A Tabela 2A mostra sequências de cadeia leve exemplificativas e a Tabela 2B mostra sequências de cadeia pesada exemplificativas.
Tabela 2A - Sequências de Aminoácidos de Cadeia Leve de Anticorpo Exemplificativas
Tabela 2B - Sequências de Aminoácidos de Cadela Pesada de Anticorpo Exemplificativas
Os primeiros 22 aminoácidos de cada das sequências de cadeia leve na Tabela 2A, exceto 32H7 e 32H7 CS, é uma sequência sinal. No caso de 32H7 e 32H7 CS, a sequência sinal é de 20 aminoácidos. Do mesmo modo, os primeiros 22 aminoácidos de cada das sequências de cadeia pesada na Tabela 2B é uma sequência sinal. Os péptidos sinal podem ser alterados para péptidos sinal possuindo diferentes sequências, e. g., para expressão mais ideal em determinadas células hospedeiras. Será, portanto, entendido que a invenção também inclui anticorpos possuindo as sequências de cadeia leve e/ou pesada como especificado nas Tabelas 2A e 2B, mas com diferentes sequências sinal.
Novamente, cada das cadeias pesadas (Hl, H2, H3 etc.) exemplificativas listadas na Tabela 2B podem ser combinadas com qualquer das cadeias leves exemplificativas mostradas na Tabela 2A para formar um anticorpo. Exemplos dessas combinações incluem Hl combinada com qualquer de Ll através de L17; H2 combinada com qualquer de Ll através de L17; H3 combinada com qualquer de Ll através de L17 e dai em diante. Em alguns casos, os anticorpos incluem, pelo menos, uma cadeia pesada e uma cadeia leve das listadas nas Tabelas 2A e 2B. Em alguns casos, os anticorpos compreendem duas cadeias pesadas diferentes e duas cadeias leves diferentes listadas nas Tabelas 2A e 2B. Noutros casos, os anticorpos contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Como exemplo, um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional podem incluir duas cadeias pesadas Hl e duas cadeias leves Ll ou duas cadeias pesadas H2 e duas cadeias leves L2 ou duas cadeias pesadas H3 e duas cadeias leves L3 e outras combinações semelhantes de pares de cadeias leves e pares de cadeias pesadas como listadas nas Tabelas 2A e 2B.
Outras proteínas de ligação a antigénio que são ilustradas são variantes de anticorpos formadas por combinação das cadeias pesadas e leves mostradas nas Tabelas 2A e 2B e compreendem cadeias leves e/ou pesadas que possuem, cada, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade com as sequências de aminoácidos destas cadeias. Em alguns casos, esses anticorpos incluem, pelo menos, uma cadeia pesada e uma cadeia leve, enquanto noutros casos, as formas variantes contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.
Domínios Variáveis de Anticorpos São também ilustradas proteínas de ligação a antigénio que contêm uma região variável de cadeia pesada de anticorpo selecionada do grupo consistindo numa VH1, VH2, VH3, VH 4, VH5, Vh6, Vh7, Vh8 , Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 e VH13, e/ou uma região variável de cadeia leve de anticorpo selecionada do grupo consistindo numa VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 e VL17, como mostrado na
Tabela 3 abaixo e fragmentos imunologicamente funcionais, derivados, muteínas e variantes destas regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.
Alinhamentos de sequência das várias regiões variáveis de cadeia leve e pesada, respetivamente, são proporcionadas nas Fig.. IA e 1B.
As proteínas de ligação a antigénio deste tipo podem, de um modo geral, ser designadas pela fórmula "VHx/VLy", em que "x" corresponde ao número das regiões variáveis de cadeia pesada e "y" corresponde ao número das regiões variáveis de cadeia leve.
Tabela 3: Sequências de Aminoácidos de Cadeias VH e VL Exempl1£1cativas
Cada das regiões variáveis de cadeia pesada listadas na Tabela 3 pode ser combinada com qualquer das regiões variáveis de cadeia leve mostradas na Tabela 3 para formar uma proteína de ligação a antigénio. Exemplos dessas combinações incluem VH1 combinado com qualquer de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 ou Vl17; Vh2 combinado com qualquer de VLl, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VLll, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16 ou Vl17; VH3 combinado com qualquer de VLl, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, Vl13, Vl14 , Vl15, Vl16 ou VL17; e daí em diante.
Em alguns casos, a proteína de ligação a antigénio inclui, pelo menos, uma região variável de cadeia pesada e/ou uma região variável de cadeia leve das listadas na Tabela 3. Em alguns casos, a proteína de ligação a antigénio inclui, pelo menos, duas regiões variáveis de cadeia pesada e/ou regiões variáveis de cadeia leve diferentes das listadas na Tabela 3. Um exemplo dessa proteína de ligação a antigénio compreende (a) um VH1 e (b) um de Vh2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 ou Vh13. Outro exemplo compreende (a) um VH2 e (b) um de VH1, VH3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, VH8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 ou Vh13. Novamente outro exemplo compreende (a) um VH3 e (b) um de VH1, VH2, VH4,
Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh11, Vh12 ou Vh13, etc. Novamente outro exemplo dessa proteína de ligação a antigénio compreende (a) um VlI e (b) um de Vl2, Vl3, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7, Vl8, Vl9, VlIO, VL11, VL12, Vl13, Vl14, VL15, VL16, ou VL17, VL18, VL19, VL20 ou VL21. Novamente outro exemplo dessa proteína de ligação a antigénio compreende (a) um VL2 e (b) um de VL1, VL3, VL4, VL5, Vl6, Vl7 , Vl8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14, Vl15, Vl16, Vl17, Vl18, Vl19, Vl20 ou Vl21. Novamente outro exemplo dessa proteína de ligação a antigénio compreende (a) um VL3 e (b) um de VL1, Vl2, Vl4, Vl5, Vl6, Vl7 , VL8, Vl9, Vl10, Vl11, Vl12, Vl13, Vl14,
Vl15, VL16, VL17, Vl18, Vl19, Vl20 ou Vl21, etc.
As várias combinações de regiões variáveis de cadeia pesada podem ser combinadas com qualquer das várias combinações de regiões variáveis de cadeia leve como é evidente para um especialista na técnica.
Noutros casos, a proteína de ligação a antigénio contém duas regiões variáveis de cadeia leve idênticas e/ou duas regiões variáveis de cadeia pesada idênticas. Como exemplo, a proteína de ligação a antigénio pode ser um anticorpo ou fragmento imunologicamente funcional que inclui duas regiões variáveis de cadeia leve e duas regiões variáveis de cadeia pesada em combinações de pares de regiões variáveis de cadeia leve e pares de regiões variáveis de cadeia pesada como listadas na Tabela 3.
Algumas proteínas de ligação a antigénio que são ilustradas compreendem um domínio variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de um domínio variável de cadeia pesada selecionado de VH1, VH2, VH3, Vh4, Vh5, Vh6, Vh7, Vh8, Vh9, VhIO, VhII, Vh12 e Vh13 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada dessa diferença de sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido, com as deleções, inserções e/ou substituições resultando em não mais do que 15 alterações de aminoácidos em relação às sequências de domínio variável anteriores. A região variável de cadeia pesada em algumas proteínas de ligação a antigénio compreende uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6,
Vh7, Vh8, Vh9, Vh10, Vh1 1, VH12 e VH13.
Determinadas proteínas de ligação a antigénio compreendem um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de um domínio variável de cadeia leve selecionado de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, Vl13, VL14, VL15, VL16 ou VL17 em apenas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada uma dessa diferença de sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um aminoácido, com as deleções, inserções e/ou substituições resultando em não mais do que 15 alterações de aminoácidos em relação às sequências de domínio variável anteriores. A região variável de cadeia leve em algumas proteínas de ligação a antigénio compreende uma sequência de aminoácidos que possui, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6,
Vl7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16 ou VL17.
Em casos adicionais, as proteínas de ligação a antigénio compreendem os seguintes emparelhamentos de domínios variáveis de cadeias leves e de cadeias pesadas: VL1 com VH1, VL2 com VH2, Vl3 com Vh3, Vl4 com VH4, VL5 com VH5, VL6 com VH1, VL7 com VH6, VL8 com Vh5, Vl9 com VH1, VL10 com VH7, VL11 com VH8, VL12 com VH9, VL12 com VH10, Vl13 com VH5, VL14 com VH11, VL15 com VH12, VL16 com VH13 e Vl17 com VH13. Em alguns casos, as proteínas de ligação a antigénio nos emparelhamentos acima podem compreender sequências de aminoácidos que possuem 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade de sequência com os domínios variáveis especificados.
Ainda outras proteínas de ligação a antigénio, e. g., anticorpos ou fragmentos imunologicamente funcionais, incluem formas variantes de uma cadeia pesada variante e de uma cadeia leve variante como acabado de descrever.
CDR
As proteínas de ligação a antigénio aqui divulgadas são polipéptidos em que uma ou mais CDR são enxertadas, inseridas e/ou juntas. Uma proteína de ligação a antigénio pode possuir 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDR. Uma proteína de ligação a antigénio pode, deste modo, possuir, por exemplo, uma CDRl de cadeia pesada ("CDRHl") , e/ou uma CDR2 de cadeia pesada ("CDRH2") , e/ou uma CDR3 de cadeia pesada ("CDRH3") , e/ou uma CDRl de cadeia leve ("CDRLl"), e/ou uma CDR2 de cadeia leve ("CDRL2"), e/ou uma CDR3 de cadeia leve ("CDRL3") . Algumas proteínas de ligação a antigénio incluem uma CDRH3 e uma CDRL3. As CDR de cadeia pesada e leve específicas são identificadas nas Tabelas 4A e 4B, respetivamente.
As regiões determinantes de complementaridade (CDR) e regiões de estrutura (FR) de um dado anticorpo podem ser identificadas utilizando o sistema descrito por Rabat et ai. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicação n° 91-3242, 1991. Determinados anticorpos que são aqui divulgados compreendem uma ou mais sequências de aminoácidos que são idênticas ou possuem identidade de sequência substancial com as sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDR apresentadas na Tabela 4A (CDRH) e Tabela 4B (CDRL).
Tabela 4Ά: Sequências de Aminoácidos de CDR de Cadeia Pesada Exemplificativas
(continuação)
(continuação)
Tabela 4B: Sequências de Aminoácidos de CDR de Cadeia Leve Exemplificativas
(continuação)
(continuação)
A estrutura e propriedades das CDR dentro de um anticorpo de ocorrência natural foi descrita, supra. Em resumo, num anticorpo tradicional, as CDR são incorporadas dentro de uma estrutura na região variável de cadeia pesada e leve, em que estas constituem as regiões responsáveis pela ligação e reconhecimento de antigénio. Uma região variável compreende, pelo menos, três CDR de cadeia pesada ou leve, ver, supra (Rabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,
Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; ver também Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de uma região de estrutura (designadas regiões de estrutura 1-4, FRl, FR2, FR3 e FR4, por Rabat et al., 1991, supra; ver também Chothia and Lesk, 1987, supra). As CDR agui proporcionadas, no entanto, podem não apenas ser utilizadas para definir o dominio de ligação a antigénio de uma estrutura de anticorpo tradicional, mas podem ser incorporadas numa variedade de outras estruturas de polipéptido, como descrito agui.
As CDR ilustradas são (a) uma CDRH selecionada do grupo consistindo (i) numa CDRHl selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 e 100; (ii) numa CDRH2 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 e 129; (iii) numa CDRH3 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 e 123; e (iv) numa CDRH de (i), (ii) e (iii) gue contém uma ou mais, e. g., uma, duas, três, guatro ou mais substituições de aminoácidos (e. g., substituições de aminoácidos conservativas), deleções ou inserções de não mais do que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos; (B) uma CDRL selecionada do grupo consistindo (i) numa CDRLl selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 e 69; (ii) numa CDRL2 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 e 70; (iii) numa CDRL3 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 e 72; e (iv) numa CDRL de (i) , (ii) e (iii) que contém uma ou mais, e. g., uma, duas, três, quatro ou mais substituições de aminoácidos (e. g., substituições de aminoácidos conservativas) , deleções ou inserções de não mais do que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos.
Uma proteína de ligação a antigénio pode incluir 1, 2, 3,4, 5 ou 6 formas variantes das CDR listadas nas Tabelas 4A e 4B, possuindo cada, pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade de sequência com uma sequência de CDR listada nas Tabelas 4A e 4B. Algumas proteínas de ligação a antigénio incluem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das CDR listadas nas Tabelas 4A e 4B, diferindo, cada, em não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos das CDR listadas nestas tabelas.
As CDR aqui divulgadas incluem sequências consenso derivadas dos grupos de anticorpos monoclonais relacionados. Como aqui descrito, uma "sequência consenso" refere-se a sequências de aminoácidos possuindo aminoácidos conservados comuns entre uma série de sequências e aminoácidos variáveis que variam dentro de umas dadas sequências de aminoácidos. As sequências consenso de CDR ilustradas incluem CDR correspondentes a cada de CDRHl, CDRH2, CDRH3, CDRLl, CDRL2 e CDRL3.
Uma proteína de ligação a antigénio pode incluir as seguintes associações de CDRLl, CDRL2 e CDRL3: SEQ ID N°: 42, 43 e 44; SEQ ID N°: 45, 46 e 47; SEQ ID N°: 48, 49 e 50; SEQ ID N°: 51, 52 e 53; SEQ ID N°: 54, 55 e 56; SEQ ID N°: 57, 58 e 59; SEQ ID N°: 60, 55 e 56; SEQ ID N°: 45, 61 e 47; SEQ ID N°: 62, 63 e 64; SEQ ID N°: 65, 55 e 56; SEQ ID N°: 66, 67 e 68; SEQ ID N°: 69, 70 e 71; e SEQ ID N°: 69, 70 e 72.
Uma proteína de ligação a antigénio pode incluir as seguintes associações de CDRHl, CDRH2 e CDRH3: SEQ ID N°: 73, 74 e 75; SEQ ID N°: 76, 77 e 78; SEQ ID N°: 79, 80 e 81; SEQ ID N°: 82, 83 e 84; SEQ ID N°: 85, 86 e 87; SEQ ID N°: 88, 89 e 90; SEQ ID N°: 76, 91 e 78; SEQ ID N°: 92, 93 e 94; SEQ ID N°: 76, 95 e 78; SEQ ID N°: 73, 74 e 96; SEQ ID N°: 97, 98 e 99; e SEQ ID N°: 100, 101 e 102.
Uma proteína de ligação a antigénio pode incluir as seguintes associações de CDRLl, CDRL2 e CDRL3 com CDRHl, CDRH2 e CDRH3: SEQ ID N°: 42, 43 e 44 com SEQ ID N°: 73, 74 e 75; SEQ ID N°: 45,46 e 47 com SEQ ID N°: 76, 77 e 78; SEQ ID N°: 48,49 e 50 com SEQ ID N°: 79, 80 e 81; SEQ ID N°: 51, 52 e 53 com SEQ ID N°: 82, 83 e 84; SEQ ID N°: 54, 55 e 56 com SEQ ID N°: 85, 86 e 87; SEQ ID N°: 57, 58 e 59 com SEQ ID N°: 88, 89 e 90; SEQ ID N°: 60, 55 e 56 com SEQ ID N°: 85, 86 e 87; SEQ ID N°: 45, 61 e 47 com SEQ ID N°: 76, 91 e 78; SEQ ID N°: 62, 63 e 64 com SEQ ID N°: 92,93 e 94; SEQ ID N°: 45, 61 e 47 com SEQ ID N°: 76, 95 e 78; SEQ ID N° : 65, 55 e 56 com SEQ ID N°: 85, 86 e 87; SEQ ID N°: 42, 43 e 44 com SEQ ID N°: 73, 74 e 96; SEQ ID N°: 66, 67 e 68 com SEQ ID N°: 97, 98 e 99; SEQ ID N°: 69, 70 e 71 com SEQ ID N°: 100, 101 e 102; e SEQ ID N°: 69, 70 e 72 com SEQ ID N°: 100, 101 e 102.
As sequências consenso foram determinadas utilizando análises filogénicas padrão das CDR correspondentes aos VH e VL de anticorpos anti-CGRP R. As sequências consenso foram determinadas mantendo as CDR contíguas dentro da mesma sequência correspondente a um VH ou VL.
Como ilustrado nas Fig. 3A, 3B, 4, 5A, 5B, 5C, 5D e 5E, a análise de linhagem de uma variedade das proteínas de ligação a antigénio aqui ilustradas resultou em grupos de sequências relacionadas, designadas como grupos de CDR de cadeia leve Kl, K2, K3 e K4 (Fig. 3A e 3B) , grupos de CDR de cadeia leve Ll, L2, L3 e L4 (Fig. 4) e grupos de CDR de cadeia pesada HC1 (Fig. 5A) , HC2 (Fig. 5B) , HC3 (Fig. 5C) , HC4 (Fig. 5C) , HC5 (Fig. 5D) e HC6 (Fig. 5E) . Alguns dos grupos acima foram utilizados para gerar sequências consenso adicionais, como ilustrado nas Fig. 3A, 3B, 4 e 5F, para produzir grupos de CDR de cadeia leve Kl, 4 (Fig. 3A) , K2,3 (Fig. 3B) , Ll,2,3 (Fig. 4) e LA11 (Fig. 4) e grupos de CDR de cadeia pesada HCA e HCB (Fig. 5F).
As sequências consenso dos vários grupos de região CDR são proporcionadas abaixo:
Consenso Kl CDRl RASQGIRXiDLG (SEQ ID N° :103), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N e K. CDR2 XiASSLQS (SEQ ID N° :104), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em A e G. CDR3 LQYNX1X2PWT (SEQ ID N°: 105), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em I e S e X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e F.
Consenso K4 CDR3 QQYGNSLXiR (SEQ ID N° :106), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e C.
Consenso Kl,4 CDRl RASQX1X2X3X4GX5LX6 (SEQ ID N° :107), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em V e I, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, Ne K, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e D e Χε é selecionado do grupo consistindo em T e G. CDR2 X1ASSX2X3X4 (SEQ ID N° :108), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e L, X3 é selecionado do grupo consistindo em A e Q e X4 é selecionado do grupo consistindo em T e S. CDR3 X1QYX2X3X4X5X6X7 (SEQ ID N° :109), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em Q e L, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e N, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T, X4 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e F, X5 é selecionado do grupo consistindo em L e P, Χε é selecionado do grupo consistindo em C, W e S e X7 é selecionado do grupo consistindo em R e T.
Consenso K3 CDRl KSSQSLLHSX1GX2X3YLY (SEQ ID N° :110), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em D e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em R e K e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e T.
Consenso K2,3 CDRl X1SSQSLLHSX2GX3X4YLX5 (SEQ ID N° :111), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em R e K, X2 é selecionado do grupo consistindo em F, De A, X3 é selecionado do grupo consistindo em Y, Re K, X4 é selecionado do grupo consistindo em N e T e X5 é selecionado do grupo consistindo em D e Y. CDR2 XiX2SNRX3S (SEQ ID N° :112), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em L e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e V e X3 é selecionado do grupo consistindo em A e F. CDR3 MQXiX2X3X4PX5T (SEQ ID N° :113), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em A e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em Q e P, X4 é selecionado do grupo consistindo em T e L e X5 é selecionado do grupo consistindo em F e L.
Consenso Lm3 CDR2 RXiNQRPS (SEQ ID N° :114), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N e S.
Consenso Lml,2,3 CDRl SGSSSNIGX1NX2VX3 (SEQ ID N° :115), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em Y e T e X3 é selecionado do grupo consistindo em S, Ne Y. CDR2 XiX2NX3RPS (SEQ ID N° :116), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, Te R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N e S e X3 é selecionado do grupo consistindo em K e Q. CDR3 XÍX2X3DX4X5LX6X7W (SEQ ID N° :117), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em G e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, Xe é selecionado do grupo consistindo em S e N e X7 é selecionado do grupo consistindo em A e G.
Consenso LAll CDRl X1GX2X3SX4X5X6X7X8X9X10X11 (SEQ ID N° :118), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e Q, X2 está presente ou ausente e, se presente, é S, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X4 está presente ou ausente e, se presente, é N, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e L, Χε é selecionado do grupo consistindo em G e R, X7 é selecionado do grupo consistindo em N e S, Xs é selecionado do grupo consistindo em N e F, X9 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X10 é selecionado do grupo consistindo em V e A e Xn é selecionado do grupo consistindo em S, Ne Y. CDR2 X1X2NX3RPS (SEQ ID N° :119), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, G, T e R, X2 é selecionado do grupo consistindo em N, K e S e X3 é selecionado do grupo consistindo em K, N e Q. CDR3 X1X2X3DX4X5X6X7X8X9V (SEQ ID N° :120), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em G, Ne A, X2 é selecionado do grupo consistindo em T, Se A, X3 é selecionado do grupo consistindo em W e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e D, X5 é selecionado do grupo consistindo em R e S, Χε é selecionado do grupo consistindo em L e V, X7 é selecionado do grupo consistindo em S, Y e N, Xs é selecionado do grupo consistindo em A, H e G e X9 é selecionado do grupo consistindo em V e L.
Consenso HCl CDRl XiYYMX2 (SEQ ID N° :121), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em G e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em H e Y. CDR2 WIXiPNSGGTNYAQKFQG (SEQ ID N°:122), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N e S. CDR3 X1X2X3SX4X5X6X7X8GX9X10X11X12YYX13GMDV (SEQ ID N° :123), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D e G, X2 é selecionado do grupo consistindo em Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em M e Y, X4 é selecionado do grupo consistindo em I e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em I e Y, Χε é selecionado do grupo consistindo em M e A, X7 está presente ou ausente e, se presente, é L, Xs está presente ou ausente e, se presente, é R, Xg é selecionado do grupo consistindo em V e L, X10 é selecionado do grupo consistindo em F e Y, Xn é selecionado do grupo consistindo em P e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em P e H e X13 está presente ou ausente e, se presente, é Y.
Consenso HC2 CDR2 RIKSX1TDGGTTDYX2APVKG (SEQ ID N° :124), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em K e T e X2 é selecionado do grupo consistindo em T e A.
Consenso HC3 CDRl X1YX2MX3 (SEQ ID N° :125), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em T e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e A e X3 é selecionado do grupo consistindo em N e S. CDR2 X1ISX2SX3X4X5X6YYADSVKG (SEQ ID N° :126), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e G, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e R e Xe é selecionado do grupo consistindo em R e T. CDR3 X1X2X3X4X5X6X7PYSX8X9WYDYYYGMDV (SEQ ID N°:127), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em E e D, X2 é selecionado do grupo consistindo em G e Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em V e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em S e E, X5 é selecionado do grupo consistindo em G e V, Xg é selecionado do grupo consistindo em S e G, X7 está presente ou ausente e, se presente, é S, Xa é selecionado do grupo consistindo em I e S e Xg é selecionado do grupo consistindo em S e G.
Consenso HC4 CDRl SXiGMH (SEQ ID N° :128), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em F e Y. CDR2 VISX1DGSX2KYX3X4DSVKG (SEQ ID N° :129), em que Χχ é selecionado do grupo consistindo em F e Y, X2 é selecionado do grupo consistindo em I e H, X3 é selecionado do grupo consistindo em S e Y e X4 é selecionado do grupo consistindo em V e A. CDR3 X1RX2X3X4X5X6SX7X8YYX9X10X11YYGX12X13V (SEQ ID N° :130), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em L e K, X3 é selecionado do grupo consistindo em N e R, X4 é selecionado do grupo consistindo em Y e V, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y e T, X6 é selecionado do grupo consistindo em D e Μ, X7 é selecionado do grupo consistindo em S e T, X8 é selecionado do grupo consistindo em G e L, X9 é selecionado do grupo consistindo em H e Y, X10 está presente ou ausente e, se presente, é Y, Xn é selecionado do grupo consistindo em K e F, X12 é selecionado do grupo consistindo em M e L e X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D.
Consenso HCA CDRl X1X2X3MX4 (SEQ ID N° :131), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em N e S, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, Y e F, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, A e G e X4 é selecionado do grupo consistindo em S e H. CDR2 X1IX2X3X4X5X6GX7X8X9X10X11X12X13X14VKG (SEQ ID N° : 132) , em que Xi é selecionado do grupo consistindo em R, A e V, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, S e W, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, G, F e Y, X4 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em K e T, X5 está presente ou ausente e, se presente, é T, Xè é selecionado do grupo consistindo em D e S, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, X8 é selecionado do grupo consistindo em T, R, I, N e H, Xg é selecionado do grupo consistindo em T e K, Χχ0 é selecionado do grupo consistindo em D e Y, Xn é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X12 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X13 é selecionado do grupo consistindo em A e D e X44 é selecionado do grupo consistindo em P e S.
CDR3 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17GX18X19V (SEQ ID N°:133), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, Q e G, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, V e A, X6 é selecionado do grupo consistindo em S, G, Y, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, P, D, A e M, X8 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em S e Y, X9 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, Se T, X40 é selecionado do grupo consistindo em S, Ge L, Xu é selecionado do grupo consistindo em S, G, L e Y, X12 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em W e Y, X13 é selecionado do grupo consistindo em Y e H, X14 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X46 está presente ou ausente e, se presente, é Y, X17 está presente ou ausente e, se presente, é Y, Xis é selecionado do grupo consistindo em M e L e X19 é selecionado do grupo consistindo em D e A.
Consenso HCB CDRl X1X2X3X4X5 (SEQ ID N° :134), em que X4 é selecionado do grupo consistindo em N, G, D, S e A, X2 é selecionado do grupo consistindo em A, Fe Y, X3 é selecionado do grupo consistindo em W, Y, A e G, X4 é selecionado do grupo consistindo em M e L e X5 é selecionado do grupo consistindo em S e H. CDR2 X1IX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17G (SEQ ID N° :135), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em R, W, A, V, Se F, X2 é selecionado do grupo consistindo em K, N, S, W e R, X3 é selecionado do grupo consistindo em S, P, G, F e Y, X4 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em K, Te R, X5 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em T e A, Xe é selecionado do grupo consistindo em D, N, H, S e Y, X7 é selecionado do grupo consistindo em G e S, Xs é selecionado do grupo consistindo em G e S, X9 é selecionado do grupo consistindo em T, G, R, I, N, H e Y, X10 é selecionado do grupo consistindo em T, K, R e P, Xn é selecionado do grupo consistindo em D, N, Y e E, X12 é selecionado do grupo consistindo em Y e S, X13 é selecionado do grupo consistindo em T, A e V, X14 é selecionado do grupo consistindo em A, Q e D, X15 é selecionado do grupo consistindo em P, K e S, X16 é selecionado do grupo consistindo em V e F e X47 é selecionado do grupo consistindo em K e Q.
CDR3 X1X2X3X4X5 SX6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X1 6GXi7Xi 8 V (SEQ ID N°:136), em que Xi é selecionado do grupo consistindo em D, G, A e E, X2 é selecionado do grupo consistindo em R, Ge Q, X3 é selecionado do grupo consistindo em T, Μ, Y, R, L, G e K, X4 é selecionado do grupo consistindo em G, S, E, N, I e R, X5 é selecionado do grupo consistindo em Y, I, G, V e A, Xe é selecionado do grupo consistindo em S, I, Y, G, A e T, X7 é selecionado do grupo consistindo em I, M, A, P e D, Xs está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em S, L e Y, X9 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em W, R, S e T, X40 é selecionado do grupo consistindo em S, Ge L, Xn é selecionado do grupo consistindo em S, V, L, G e Y, X12 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em F, Y e W, Xi3 é selecionado do grupo consistindo em Y, P, S e Η, X14 está presente ou ausente e, se presente, é selecionado do grupo consistindo em Y, P, D e Η, X15 é selecionado do grupo consistindo em Y, K e F, X16 está presente ou ausente e, se presente, é Y, X17 está presente ou ausente e, se presente, é Y e Xis é selecionado do grupo consistindo em M e L.
Em alguns casos, a proteína de ligação a antigénio compreende, pelo menos, uma CDRl, CDR2 ou CDR3 de cadeia pesada possuindo uma das sequências consenso acima. Em alguns casos, a proteína de ligação a antigénio compreende, pelo menos, uma CDRl, CDR2 ou CDR3 de cadeia leve possuindo uma das sequências consenso acima. Noutros casos, a proteína de ligação a antigénio compreende, pelo menos, duas CDR de cadeia pesada de acordo com as sequências consenso acima e/ou, pelo menos, duas CDR de cadeia leve de acordo com as sequências consenso acima. Ainda noutros casos, a proteína de ligação a antigénio compreende, pelo menos, três CDR de cadeia pesada de acordo com as sequências consenso acima e/ou, pelo menos, três CDR de cadeia leve de acordo com as sequências consenso acima.
Proteínas de ligação a antigénio Exemplificativas É ilustrada uma proteína de ligação a antigénio isolada que se liga a CGRP R compreendendo (A) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDRH) selecionadas do grupo consistindo: (i) numa CDRHl selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 e 100; (ii) numa CDRH2 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 e 129; (iii) numa CDRH3 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 e 123; e (iv) numa CDRH de (i) , (ii) e (iii) que contém uma ou mais, e. g., uma, duas, três, quatro ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de não mais do que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos; (B) uma ou mais regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (CDRL) selecionadas do grupo consistindo: (i) numa CDRLl selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°: 42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 e 69; (ii) numa CDRL2 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 e 70; (iii) numa CDRL3 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 e 72; e (iv) numa CDRL de (i), (ii) e (iii) que contém uma ou mais, e. g., uma, duas, três, quatro ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de não mais do que cinco, quatro, três, dois ou um aminoácidos; ou (C) uma ou mais CDRH de cadeia pesada de (A) e uma ou mais CDRL de cadeia leve de (B). A proteina de ligação a antigénio isolada pode compreender (A) uma CDRH selecionada do grupo consistindo (i) numa CDRHl selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 e 100; (ii) numa CDRH2 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 e 129; e (iii) numa CDRH3 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 e 123; (B) numa CDRL selecionada do grupo consistindo (i) numa CDRLl selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 e 69; (ii) numa CDRL2 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°: 43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 e 70; e (iii) numa CDRL3 selecionada do grupo consistindo na SEQ ID N°:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 e 72; ou (C) numa ou mais CDRH de cadeia pesada de (A) e numa ou mais CDRL de cadeia leve de (B) . Numa forma de realização, a proteina de ligação a antigénio isolada pode incluir (A) uma CDRHl da SEQ ID N°:73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 e 100, uma CDRH2 da SEQ ID N°:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 e 129 e uma CDRH3 da SEQ ID N°:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 e 123 e (B) uma CDRLl da SEQ ID N°:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 e 69, uma CDRL2 da SEQ ID N°:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 e 70 e uma CDRL3 da SEQ ID N°:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 e 72.
Também ilustrada é uma proteína de ligação a antigénio isolada que se liga especificamente a um epítopo formado por resíduos de aminoácidos dos componentes CRLR e RAMPl do CGRP R. A primeira sequência de aminoácidos da proteína de ligação a antigénio isolada pode incluir a CDRH3 da SEQ ID N°:75, 78, 81, 84, 87, 90, 96, 99, 102 e 123, CDRH2 da SEQ ID N°:74, 77, 80, 83, 86, 89, 91, 93, 95, 98, 101 e 129 e CDRHl da SEQ ID N°: 73, 76, 79, 82, 85, 88, 92, 97 e 100, e/ou a segunda sequência de aminoácidos da proteína de ligação a antigénio isolada pode compreender a CDRL3 da SEQ ID N°:44, 47, 50, 53, 56, 59, 64, 68, 71 e 72, CDRL2 da SEQ ID N°:43, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 63, 67 e 70 e CDRLl da SEQ ID N°:42, 45, 48, 51, 54, 57, 62, 65, 66 e 69. A proteína de ligação a antigénio pode compreender, pelo menos, duas sequências CDRH de sequências de cadeia pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12 ou H13, como mostrado na Tabela 5A. Igualmente, a proteína de ligação a antigénio pode compreender, pelo menos, duas sequências CDRL de sequências de cadeia leve Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, Ll 1, L12, L13, L14, Ll5, L16 ou L17, como mostrado na
Tabela 5B. Igualmente, a proteína de ligação a antigénio pode compreender, pelo menos, duas sequências CDRH de sequências de cadeia pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12 ou H13, como mostrado na Tabela 5A e, pelo menos, duas CDRL de sequências de cadeia leve Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Ll 1, L12, L13, L14, L15, L16 ou L17, como mostrado na Tabela 5B.
Igualmente, a proteína de ligação a antigénio pode compreender as sequências CDRHl, CDRH2 e CDRH3 de sequências de cadeia pesada Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12 ou H13, como mostrado na Tabela 5A. Igualmente, a proteína de ligação a antigénio pode compreender as sequências CDRLl, CDRL2 e CDRL3 de sequências de cadeia leve Ll, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, LIO, Ll 1, L12, L13, L14, L15, L16 ou L17, como mostrado na Tabela 5B.
Igualmente, a proteína de ligação a antigénio pode compreender todas as seis CDR de Ll e Hl, ou L2 e H2, ou L3 e H3, ou L4 e H4, ou L5 e H5, ou L6 e Hl, ou L7 e H6, ou L8 e H5, ou L9 e Hl, ou LIO e H7, ou Lll e H8, ou L12 e H9, ou L12 e H10, ou Ll3 e H5, ou L14 e Hll, ou L15 e H12, ou L16 e H13, ou L17 e Hl3, como mostrado nas Tabelas 5A e 5B.
Tabela 5A - Regiões de Sequências de Aminoácidos de Cadeia Pesada Exemplificativas
Tabela 5B - Regiões de Sequências de Aminoácidos de Cadeia Leve Exemplificativas
Num aspeto, as proteínas de ligação a antigénio isoladas aqui proporcionadas podem ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de ligação a antigénio de anticorpo.
Noutra forma de realização, o fragmento de anticorpo das proteínas de ligação a antigénio isoladas aqui proporcionadas pode ser um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia simples.
Numa forma de realização adicional, a proteína de ligação a antigénio isolada aqui proporcionada é um anticorpo humano e pode ser do tipo IgGl, IgG2 IgG3 ou IgG4.
Noutra forma de realização, a proteína de ligação a antigénio consiste apenas num polipéptido de uma cadeia leve ou uma pesada, como exposto nas Tabelas 5A-5B. Em algumas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio consiste apenas num domínio variável de cadeia leve ou variável de cadeia pesada tais como os listados nas Tabelas 5A-5B. Essas proteínas de ligação a antigénio podem ser peguiladas com uma ou mais moléculas de PEG.
Ainda noutro aspeto, a proteína de ligação a antigénio isolada aqui proporcionada pode ser acoplada a um grupo marcador e pode competir para ligação à parte extracelular de CGRP R humano com uma proteína de ligação a antigénio de uma das proteínas de ligação a antigénio isoladas aqui proporcionadas. Numa forma de realização, a proteína de ligação a antigénio isolada aqui proporcionada pode reduzir a quimiotaxia de monócitos, inibir a migração de monócitos para tumores ou inibir a acumulação e função de macrófago associada a tumor num tumor quando administrada a um doente.
Como será entendido pelos especialistas na técnica, para qualquer proteína de ligação a antigénio com mais do que uma CDR das sequências representadas, qualquer combinação de CDR independentemente selecionadas das sequências representadas é útil. Deste modo, podem ser geradas proteínas de ligação a antigénio com uma, duas, três, quatro, cinco ou seis de CDR independentemente selecionadas. No entanto, como será entendido pelos especialistas na técnica, as formas de realização específicas, de um modo geral, utilizam combinações de CDR que são não repetitivas, e. g., proteínas de ligação a antigénio não são, de um modo geral, preparadas com duas regiões CDRH2, etc.
Algumas das proteínas de ligação a antigénio proporcionadas são discutidas abaixo em maior detalhe.
Proteínas de ligação a antigénio e Epítopos de Ligação e Domínios de Ligação como reivindicados
Quando uma proteína de ligação a antigénio é referida como ligando-se a um epítopo, tal como um ou ambos os componentes de CGRP R ou o domínio extracelular de CGRP R, por exemplo, o que se entende é que a proteína de ligação a antigénio se liga especificamente a uma parte especificada de CGRP R, que pode ser em partes CRLR, RAMP 1 ou intervalo de CRLR e RAMP 1. Em casos em que a proteína de ligação a antigénio se liga apenas a CRLR (e não a RAMPl), a proteína de ligação a antigénio não seria esperada ligar-se seletivamente a CGRP R uma vez que CRLR é partilhado, inter alia, com AMl e recetores AMI. Do mesmo modo, em casos em que a proteína de ligação a antigénio se liga apenas a RAMPl (e não a CRLR), a proteína de ligação a antigénio não seria esperada ligar-se seletivamente a CGRP R porque RAMPl é partilhada, inter alia, com recetor AMYl. Em casos em que a proteína de ligação a antigénio interage com CRLR e RAMPl, a proteína de ligação a antigénio é esperada ligar-se a resíduos ou sequências de resíduos ou regiões em CRLR e RAMPl. Em nenhuma das formas de realização anteriores é esperada uma proteína de ligação a antigénio contactar cada resíduo dentro de CRLR ou RAMPl. Do mesmo modo, nem toda a substituição ou deleção de aminoácidos dentro de CRLR, RAMPl ou dos seus domínios extracelulares é esperada afetar significativamente a afinidade de ligação.
Os métodos detalhados, e. g., no Exemplo 10, podem ser utilizados para avaliar que regiões de recetores multiméricos, tal como CGRP R, podem estar envolvidas em ligação a proteínas de ligação a antigénio selecionadas.
Proteínas de ligação a antigénio Competitivas como reivindicadas
Noutro aspeto, são proporcionadas proteínas de ligação a antigénio que competem com um dos anticorpos exemplificados ou de "referência" ou ligação de fragmentos funcionais ao epítopo descritos acima para ligação específica a CGRP R. Essas proteínas de ligação a antigénio podem também ligar-se ao mesmo epítopo aqui exemplificadas como uma das proteínas de ligação a antigénio ou um epítopo sobreposto. Proteínas e fragmentos de ligação a antigénios gue competem com ou se ligam ao mesmo epítopo como as proteínas de ligação a antigénio exemplificadas ou de referência são esperados mostrar propriedades funcionais semelhantes. As proteínas e fragmentos de ligação a antigénios exemplificados incluem os com os domínios de região variável de cadeias pesadas e leves, VL1- VL17 e VH1- VH13 e CDR incluídas nas Tabelas 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A e 5B. Deste modo, como exemplo específico, as proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas incluem as que competem com um anticorpo possuindo: (a) todas as 6 das CDR listadas para um anticorpo listado nas Tabelas 5A e 5B; (b) um VH e um VL selecionado de VL1 - Vl17 e VH1 - Vh13 e listados para um anticorpo listado nas Tabelas 5A e 5B; ou (c) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas como especificadas para um anticorpo listado nas Tabelas 5A e 5B. Outros exemplos de anticorpos de referência adequados incluem os que possuem uma região variável de cadeia pesada possuindo uma sequência correspondente a qualquer das sequências identificadas como SEQ ID N°:158-170 e uma região variável de cadeia leve possuindo uma sequência correspondente a qualquer das sequências identificadas como SEQ ID N°:137-153. A competição de ligação pode ser avaliada, por exemplo, utilizando um ensaio sequencial, tal como o ensaio Biacore descrito no Exemplo 7, abaixo. Nesse exemplo, 19 anticorpos aqui descritos foram testados contra cada de seis anticorpos "de referência" -- cinco anticorpos neutralizantes (11D11, 3B6, 4H6, 12G8 e 9F5) e um anticorpo não neutralizante (34E3). Os resultados de ensaio, mostrados na Tabela 13, indicam que todos os anticorpos neutralizantes testados (1E11, 1H7, 2E7, 3B6, 3C8, 4E4, 4H6, 5F5, 9D4, 9F5, 10E4, 11D11, 11H9, 12E8, 12G8, 13H2 e 32H7) se ligam essencialmente à mesma região de CGRP R, que é distinta da região de CGRP R que está ligada pelos anticorpos não neutralizantes testados (32H8, 33B5, 33E4 e 34E3) . Com base nestes dados, qualquer dos anticorpos neutralizantes faria proteínas de ligação a antigénio de referência exemplificativas num ensaio de competição, particularmente qualquer dos anticorpos neutralizantes que foram imobilizados no ensaio descrito no Exemplo 7 --- 11D11, 3B6, 4H6, 12G8 e 9F5.
Anticorpos Monoclonais
As proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas incluem anticorpos monoclonais que se ligam a CGRP R. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, e. g., imortalizando células de baço recolhidas do animal transgénico após conclusão do esquema de imunização. As células de baço podem ser imortalizadas utilizando qualquer técnica conhecida na técnica, e. g., fundindo-as com células de mieloma para produzir hibridomas. As células de mieloma para utilização em procedimentos de fusão que produzem hibridoma, de um modo preferido, são não produtoras de anticorpo, possuem elevada eficiência de fusão e deficiências de enzima que as tornam incapazes de crescer em determinados meios seletivos que suportam o crescimento apenas das células (hibridomas) fundidas desejadas. Exemplos de linhas celulares adequadas para utilizar em fusões de ratinho incluem Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPCII-X45-GTG 1.7 e S194/5XXO Bul; exemplos de linhas celulares utilizadas em fusões de rato incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhas celulares úteis para fusões celulares são U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2 e UC729-6. Um método exemplificativo de preparar anticorpos monoclonais é descrito no Exemplo 2, abaixo.
Em alguns casos, uma linha celular de hibridoma é produzida imunizando um animal (e. g., um animal transgénico possuindo seguências de imunoglobulina humana) com um imunogénio de CGRP R; recolhendo células de baço do animal imunizado; fundindo as células de baço recolhidas para uma linha celular de mieloma, gerando, desse modo, células de hibridoma; estabelecendo linhas celulares de hibridoma a partir das células de hibridoma e identificando uma linha celular de hibridoma que produz um anticorpo que se liga a CGRP R (e. g., como descrito nos Exemplos 1-3, abaixo). Essas linhas celulares de hibridoma e anticorpos monoclonais anti-CGRP R produzidos por estas são aspetos do presente pedido.
Os anticorpos monoclonais secretados por uma linha celular de hibridoma podem ser purificados utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Hibridomas ou mAbs podem ser ainda rastreados para identificar mAbs com propriedades particulares, tais como a capacidade de se ligar a células que expressam CGRP, capacidade para bloquear ou interferir a ligação do ligando de CGRP ou péptido CGRPs-37 ou a capacidade para bloquear funcionalmente o recetor, e. g., utilizando um ensaio de AMPc, e. g., como descrito abaixo.
Anticorpos Quiméricos e Humanizados São também proporcionados anticorpos quiméricos e humanizados baseados nas sequências anteriores. Os anticorpos monoclonais para utilização como agentes terapêuticos podem ser modificados em vários modos antes de utilização. Um exemplo é um anticorpo quimérico, que é um anticorpo constituído por segmentos de proteína de diferentes anticorpos que estão covalentemente juntos para produzir cadeias leves ou pesadas de imunoglobulina funcional ou suas partes imunologicamente funcionais. De um modo geral, uma parte da cadeia pesada e/ou cadeia leve é idêntica com ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o resto da(s) cadeia(s) é/são idênticas com ou homólogas a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo. Para métodos relativos a anticorpos quiméricos, ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 4816567; e Morrison et ai., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1:6851-6855. 0 enxerto de CDR é descrito, por exemplo, nas
Patentes dos Estados Unidos N° 6180370, N° 5693762, N° 5693761, N° 5585089 e N° 5530101.
De um modo geral, o objetivo de preparar um anticorpo quimérico é originar uma quimera em que o número de aminoácidos da espécie doente pretendida é maximizado. Um exemplo é o anticorpo "com enxerto de CDR", em que o anticorpo compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o resto da(s) cadeia(s) de anticorpo é/são idênticas com ou homólogas a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos. Para utilização em humanos, a região variável ou CDR selecionadas de um anticorpo de roedor, muitas vezes, são enxertadas num anticorpo humano, substituindo as regiões variáveis de ocorrência natural ou CDR do anticorpo humano.
Um tipo útil de anticorpo quimérico é um anticorpo "humanizado". De um modo geral, um anticorpo humanizado é produzido a partir de um anticorpo monoclonal desencadeado inicialmente num animal não humano. Determinados resíduos de aminoácidos neste anticorpo monoclonal, tipicamente de partes que não reconhecem antigénio do anticorpo, são modificados para serem homólogos a resíduos correspondentes num anticorpo humano de isotipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por exemplo, utilizando vários métodos substituindo, pelo menos, uma parte de uma região variável de roedor para as regiões correspondentes de um anticorpo humano (ver, e. g., Patente dos Estados Unidos N° 5585089 e N° 5693762; Jones et al., 1986,
Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332;323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).
Num aspeto, as CDR das regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos aqui proporcionados (ver, Tabela 4) são enxertadas para regiões de estrutura (FR) de anticorpos da mesma ou uma diferente espécie filogenética. Por exemplo, as CDR das regiões variáveis de cadeia leve e pesada VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, Vh7, VH8, VH9, VH10, Vh11, Vh12 e VH13, e/ou VL1, VL2, VL3,
Vl4 , Vl5 , Vl6, Vl7 , Vl8 , VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16 e Vl17 podem ser enxertadas para FR humanas consenso. Para criar FR humanas consenso, FR de várias sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humanas podem ser alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos consenso. Noutras formas de realização, as FR de uma cadeia pesada ou cadeia leve aqui divulgada são substituídas com as FR de uma cadeia pesada ou cadeia leve diferente. Num aspeto, os aminoácidos raros nas FR das cadeias pesada e leves de anticorpo anti-CGRP R não são substituídos, enquanto o resto dos aminoácidos de FR são substituídos. Um "aminoácido raro" é um aminoácido específico que está numa posição em que este aminoácido particular não é normalmente encontrado numa FR. Em alternativa, as regiões variáveis enxertadas a partir de uma cadeia pesada ou leve podem ser utilizadas com uma região constante que é diferente da região constante dessa cadeia pesada ou leve particular como aqui divulgada. Noutras formas de realização, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia simples.
Em determinadas formas de realização, podem ser utilizadas regiões constantes de espécies que não humana em conjunto com a(s) região(ões) variável(eis) humana(s) para produzir anticorpos híbridos.
Anticorpos Totalmente Humanos São também proporcionados anticorpos totalmente humanos. Estão disponíveis métodos para preparar anticorpos totalmente humanos específicos para um dado antigénio sem expor seres humanos ao antigénio ("anticorpos totalmente humanos"). Um meio específico proporcionado para implementar a produção de anticorpos totalmente humanos é a "humanização" do sistema imunitário humoral de ratinho. A introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana local em ratinhos em que os genes de Ig endógenos foram inativados é um meio de produzir anticorpos monoclonais totalmente humanos (mAbs) em ratinho, um animal que pode ser imunizado com qualquer antigénio desejável. Utilizando anticorpos totalmente humanos podem minimizar-se as respostas imunogénicas e alérgicas que podem, por vezes, ser provocadas administrando mAbs de ratinho ou derivados de ratinho a humanos como agentes terapêuticos.
Os anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos imunizando animais transgénicos (normalmente ratinhos) que são capazes de produzir um reportório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Os antigénios para este fim, tipicamente, possuem seis ou mais aminoácidos contíguos e, de um modo opcional, são conjugados a um veículo, tal como um hapteno. Ver, e. g., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA _9_0:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; e Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. Num exemplo desse método, são produzidos animais transgénicos incapacitando a imunoglobulina de ratinho endógena local que codifica as cadeias de imunoglobulina pesadas e leves de ratinho aí e inserindo no genoma de ratinho fragmentos grandes de ADN de genoma humano contendo locais que codificam proteínas de cadeia pesada e leve humanas. Animais parcialmente modificados, que possuem menos do que o complemento total de local de imunoglobulina humana são, em seguida, cruzados para obter um animal possuindo todas as modificações de sistema imunitário desejadas. Quando administrado um imunogénio, estes animais transgénicos produzem anticorpos que são imunoespecíficos para o imunogénio mas possuem sequências de aminoácidos humanas em vez de murinas, incluindo as regiões variáveis. Para detalhes adicionais desses métodos, ver, por exemplo, os documentos WO 96/33735 e WO 94/02602. Métodos adicionais relativos a ratinhos transgénicos para preparar anticorpos humanos são descritos na Patente dos Estados Unidos N° 5545807; N° 6713610; N° 6673986; N° 6162963; N° 5545807; N° 6300129; N° 6255458; N° 5877397; N° 5874299 e N° 5545806; nas publicações PCT WO 91/10741, WO 90/04036 e na EP 546073B1 e EP 546073A1.
Os ratinhos transgénicos acima descritos, referidos aqui como ratinhos "HuMab", contêm um minilocus do gene de imunoglobulina humano que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada ( [mu] e [gama] ) e leve [capa] humanas não organizadas, em conjunto com mutações direcionadas que inativam a cadeia [mu] e [capa] endógena local (Lonberg et al., 1994, Nature 368;856-859) . Como consequênciaos ratinhos apresentam expressão reduzida de IgM ou [capa] de ratinho e em resposta a imunização e os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos sofrem alteração de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais [capa] de IgG humanos de elevada afinidade (Lonberg et ai., supra.; Lonberg e Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. _13_: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). A preparação de ratinhos HuMab é descrita em detalhe em Taylor et ai., 1992, Nucleic Acids Research 2_0: 6287-6295; Chen et ai., 1993, International Immunology _5:647-656; Tuaillon et ai., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg e
Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. _13_: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996,
Nature Biotechnology L4:845-851. Ver, outras Patentes dos Estados Unidos N° 5545806; N° 5569825; N° 5625126; N° 5633425; N° 5789650; N° 5877397; N° 5661016; N° 5814318; N° 5874299; e N° 5770429; assim como Patente dos Estados Unidos N° 5545807; Publicação Internacional N° WO 93/1227; WO 92/22646; e WO 92/03918. As tecnologias utilizadas para produzir anticorpos humanos nestes ratinhos transgénicos são divulgadas também no documento WO 98/24893 e Mendez et al., 1997, Nature Genetics ]J5: 146-156. Por exemplo, as estirpes de ratinhos transgénicos HCo7 e HCol2 podem ser utilizadas para gerar anticorpos anti-CGRP R. Detalhes adicionais relativamente à produção de anticorpos humanos utilizando ratinhos transgénicos são proporcionados nos exemplos abaixo.
Utilizando tecnologia de hibridoma, mAbs humanos específicos de antigénio com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados a partir dos ratinhos transgénicos tais como os descritos acima. Esses anticorpos podem ser clonados e expressos utilizando um vetor e célula hospedeira adequados ou os anticorpos podem ser recolhidos a partir das células de hibridoma cultivadas.
Os anticorpos totalmente humanos podem também ser derivados de bibliotecas de apresentação de fagos (como divulgado em Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581) . As técnicas de apresentação de fagos imitam a seleção imunitária através da apresentação de reportórios de anticorpos na superfície do bacteriofago filamentoso e subsequente seleção de fago pela sua ligação a um antigénio de escolha. Uma dessas técnicas é descrita na Publicação PCT N° WO 99/10494, que descreve o isolamento de anticorpos agonistas de elevada afinidade e funcionais para recetores de MPL e msk utilizando essa abordagem.
Proteínas de ligação a antigénio Biespecíficas Ou Bifuncionais
As proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas também incluem anticorpos biespecíficos e bifuncionais que incluem uma ou mais CDR ou uma ou mais regiões variáveis como descritas acima. Um anticorpo biespecífico ou bifuncional em alguns casos é um anticorpo híbrido artificial possuindo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes e dois locais de ligação diferentes. Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo, mas não limitados a, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Ver, e. g., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Várias Outras Formas
Algumas das proteínas de ligação a antigénio que são proporcionadas são formas variantes das proteínas de ligação a antigénio divulgadas acima (e. g., aquelas possuindo as sequências listadas nas Tabelas 2-5) . Por exemplo, algumas das proteínas de ligação a antigénio possuem uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas numa ou mais das cadeias pesadas ou leves, regiões variáveis ou CDR listadas nas Tabelas 2-5.
Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base nas propriedades de cadeia secundária comuns: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) acídicos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
As substituições de aminoácidos conservatives podem envolver troca de um elemento de uma destas classes com outro elemento da mesma classe. As substituições de aminoácidos conservativas podem abranger resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, que são tipicamente incorporados por síntese de péptido química em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estas incluem peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de unidades de aminoácidos.
As substituições de aminoácidos não conservativas podem envolver a troca de um elemento de uma destas classes por um elemento de outra classe. Esses resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo que são homólogas com anticorpos humanos ou nas regiões não homólogas da molécula.
Ao fazer essas alterações, de acordo com determinadas formas de realização, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. 0 perfil hidropático de uma proteína é calculado atribuindo a cada aminoácido um valor numérico ("índice hidropático") e, em seguida, em média estes valores ao longo da cadeia de péptido. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e de carga. Estas são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5). A importância do perfil hidropático em conferir função biológica interativa numa proteína é entendida na técnica (ver, e. g., Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131) . É conhecido que determinados aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos possuindo um índice hidropático ou classificação semelhantes e ainda retêm atividade biológica semelhante. Ao fazer alterações com base no índice hidropático, em determinadas formas de realização, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2 está incluída. Em alguns aspetos, os que estão dentro de ±1 estão incluídos e, noutros aspetos, os que estão dentro de ±0,5 estão incluídos. É também entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita efetivamente com base na hidrofilicidade, particularmente quando a proteína ou péptido biologicamente funcional originada desse modo é pretendida para utilização em formas de realização imunológicas, como no presente caso. Em determinadas formas de realização, a melhor hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e ligação a antigénio ou imunogenicidade, isto é, com uma propriedade biológica da proteína.
Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,511); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao fazer alterações com base nos valores de hidrofilicidade semelhantes, em determinadas formas de realização, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2 está incluída, noutras formas de realização, os que estão dentro de ±1 estão incluídos e ainda noutras formas de realização, os que estão dentro de ±0,5 estão incluídos. Em alguns casos, podem também identificar-se epítopos a partir de sequências de aminoácidos primárias com base na hidrofilicidade. Estas regiões são também referidas como "regiões de núcleo epitópico".
As substituições de aminoácidos conservativas exemplificativas são expostas na Tabela 6.
Tabela 6: Substituições de Aminoácidos Conservativas
Um especialista na técnica estará apto para determinar variantes adequadas de polipéptidos como aqui expostas utilizando técnicas bem conhecidas. Um especialista na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser alteradas sem destruir atividade direcionando reqiões que não se pensa serem importantes para atividade. 0 especialista na técnica estará também apto para identificar resíduos e partes das moléculas que são conservadas entre polipéptidos semelhantes. Em formas de realização adicionais, mesmo áreas que podem ser importantes para atividade biológica ou para estrutura podem ser submetidas a substituições de aminoácidos conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura de polipéptido.
Além disso, um especialista na técnica pode rever estudos de estrutura-função que identificam resíduos em polipéptidos semelhantes que são importantes para a atividade ou estrutura. Em vista dessa comparação, pode prever-se a importância de resíduos de aminoácidos numa proteína que correspondem a resíduos de aminoácidos importantes para a atividade ou estrutura em proteínas semelhantes. Um especialista na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para esses resíduos de aminoácidos importantes previstos.
Um especialista na técnica pode também analisar a estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos em relação a essa estrutura em polipéptidos semelhantes. Em vista dessa informação, um especialista na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo em relação à sua estrutura tridimensional. Um especialista na técnica pode escolher não fazer alterações radicais a resíduos de aminoácidos previstos estarem na superfície da proteína, uma vez que esses resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, um especialista na técnica pode gerar variantes teste contendo uma substituição de aminoácidos simples em cada resíduo de aminoácidos desejado. Estas variantes podem, em seguida, ser rastreadas utilizando ensaios para atividade neutralizante de CGRP R, (ver exemplos abaixo), produzindo, deste modo, informação relativa a quais aminoácidos podem ser alterados e quais não devem ser alterados. Por outras palavras, com base na informação recolhida dessas experiências de rotina, um especialista na técnica pode facilmente determinar as posições de aminoácidos em que devem ser evitadas substituições adicionais, isoladas ou em combinação com outras mutações. Várias publicações científicas foram dedicadas à previsão da estrutura secundária. Ver, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7_:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13_:222-245; Chou et ai., 1974, Biochemistry 113:211-222; Chou et ai., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. _47_:45-148; Chou et ai., 1979, Ann. Rev. Biochem. _jh7:251-27 6; e Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Além disso, estão atualmente disponíveis programas de computador para ajudar na previsão de estrutura secundária. Um método de previsão de estrutura secundária é baseado no modelo de homologia. Por exemplo, dois polipéptidos ou proteínas que possuem uma identidade de sequência de mais de 30%, ou similaridade superior a 40% podem possuir topologias estruturais semelhantes. O recente crescimento da base de dados estrutural de proteínas (PDB) proporcionou previsibilidade melhorada de estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras dentro de uma estrutura do polipéptido ou da proteína. Ver, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27_:244-247. Sugeriu-se (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7_:369-376) que existe um número limitado de dobras num dado polipéptido ou proteína e que quando um número essencial de estruturas tiver sido resolvido, a previsão estrutural tornar-se-á dramaticamente mais precisa. Métodos adicionais de previsão de estrutura secundária incluem "enovelamento" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7_:377-387; Sippl et al., 1996, Structure _4:15-19), "análise de perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sei. M: 4355-4358) e "ligação evolucionária" (Ver, Holm, 1999, supra; e Brenner, 1997, supra).
Em algumas formas de realização, são feitas substituições de aminoácidos que: (1) reduzem suscetibilidade a proteolise, (2) reduzem suscetibilidade a oxidação, (3) alteram afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alteram afinidades de ligando ou de ligação a antigénio, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais nesses polipéptidos. Por exemplo, substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (em determinadas formas de realização, substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural. As substituições podem ser feitas nessa parte do anticorpo que fica fora dos contactos intermoleculares que formam o(s) domínio (s)) . Nessas formas de realização, podem ser utilizadas substituições de aminoácidos conservativas que não alteram substancialmente as características estruturais da sequência parental (e. g., uma ou mais substituições de aminoácidos que não quebram a estrutura secundária que caracteriza a proteína de ligação a antigénio parental ou nativa). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipéptidos reconhecidas na técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.)/ 1984, W. H. Nova Iorque: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, Nova Iorque: Garland Publishing; e Thornton et al., 1991, Nature 354:105.
As variantes de anticorpo preferidas adicionais incluem variantes de cisteina em que um ou mais resíduos de cisteína na sequência de aminoácidos parental ou nativa são deletados ou substituídos com outros aminoácidos (e. g., serina) . As variantes de cisteína são úteis, inter alia quando anticorpos devem ser redobrados numa conformação biologicamente ativa. As variantes de cisteína podem possuir menos resíduos de cisteína do que o anticorpo nativo e, tipicamente, possuem um número par para minimizar interações resultantes de cisteínas não emparelhadas.
As cadeias pesadas e leves, domínios de regiões variáveis e CDR que são divulgadas podem ser utilizadas para preparar polipéptidos que contêm uma região de ligação a antigénio que pode ligar-se especificamente a CGRP R. Por exemplo, uma ou mais das CDR listadas nas Tabelas 4 e 5 pode ser incorporada numa molécula (e. g., um polipéptido) covalentemente ou não covalentemente para fazer uma imunoadesão. Uma imunoadesão pode incorporar a(s) CDR como parte de uma cadeia de polipéptido maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR a outra cadeia de polipéptido ou pode incorporar a(s) CDR não covalentemente. A(s) CDR permitem a imunoadesão para se ligarem especificamente a um antigénio particular de interesse (e. g., CGRP R ou seu epítopo). São também proporcionados miméticos (e. g., "miméticos de péptido" ou "peptidomiméticos") baseados nos domínios de regiões variáveis e CDR que são aqui descritas. Estes análogos podem ser péptidos, não péptidos ou combinações de regiões de péptido e não péptido. Fauchere, 198 6, Adv. Drug Res. b5:29; Veber e Freidinger, 1985, TINS p. 392; e Evans et ai., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Os miméticos de péptido que são estruturalmente semelhantes a péptidos terapeuticamente úteis podem ser utilizados para produzir um efeito terapêutico ou profilático semelhante. Esses compostos são, muitas vezes, desenvolvidos com a ajuda de modelos moleculares computorizados. De um modo geral, peptidomiméticos são proteínas que são estruturalmente semelhantes a um anticorpo que apresenta uma atividade biológica desejada, tal como aqui a capacidade de se ligar especificamente a CGRP R, mas possuem uma ou mais ligações de péptido, de um modo opcional, substituídas por uma ligação selecionada de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH- (cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência consenso com um D-aminoácido do mesmo tipo (e. g., D-lisina no lugar de L-lisina) pode ser utilizada em determinadas formas de realização para gerar proteínas mais estáveis. Além disso, péptidos constrangidos compreendendo uma sequência consenso ou uma variação de sequência consenso substancialmente idêntica pode ser gerada por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387)) , por exemplo, adicionando resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes dissulfureto intramoleculares que ciclizam o péptido. São também proporcionados derivados de proteína de ligação a antigénios que são aqui descritos. As proteínas de ligação a antigénio derivadas podem compreender qualquer molécula ou substância que confira uma propriedade desejada ao anticorpo ou fragmento, tal como meia-vida aumentada numa utilização particular. A proteína de ligação a antigénio derivada pode compreender, por exemplo, uma unidade detetável (ou marcada) (e. g., uma molécula radioativa, colorimétrica, antigénica ou enzimática), uma esfera detetável (tal como uma esfera magnética ou eletrodensa (e. g., ouro)) ou uma molécula que se liga a outra molécula (e. g., biotina ou estreptavidina)), uma unidade terapêutica ou de diagnóstico (e. g., uma unidade radioativa, citotóxica ou farmaceuticamente ativa) ou uma molécula que aumenta a adequabilidade da proteína de ligação a antigénio para uma utilização particular (e. g., administração a um indivíduo, tal como um indivíduo humano ou outras utilizações in vivo ou in vitro). Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas para derivar uma proteína de ligação a antigénio incluem albumina (e. g., albumina de soro humano) e polietilenoglicol (PEG). Os derivados ligados a albumina e PEGuilados de proteínas de ligação a antigénio podem ser preparados utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Determinadas proteínas de ligação a antigénio incluem um polipéptido de cadeia simples peguilado como aqui descrito. Numa forma de realização, a proteína de ligação a antigénio é conjugada ou, de outro modo, ligada a transtirretina (TTR) ou uma variante de TTR. A TTR ou variante de TTR pode ser quimicamente modificada com, por exemplo, um químico selecionado do grupo consistindo num dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilenoglicóis, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliois polioxietilados e álcoois polivinílicos.
Outros derivados incluem conjugados covalentes ou agregados de proteínas de ligação a CGRP R com outras proteínas ou polipéptidos, tal como por expressão de proteínas de fusão recombinantes compreendendo polipéptidos heterólogos fundidos ao N-terminal ou C-terminal de uma proteína de ligação a CGRP R. Por exemplo, o péptido conjugado pode ser um polipéptido sinal (ou líder) heterólogo, e. g., o líder do fator alfa de levedura, ou um péptido tal como um marcador de epítopo. As proteínas de fusão contendo proteína de ligação a antigénio de CGRP podem compreender péptidos adicionados para facilitar purificação ou identificação da proteína de ligação a CGRP R (e. g., poli-His). Uma proteína de ligação a CGRP R pode também ser ligada ao péptido FLAG como descrito em Hopp et ai., 1988, Bio/Technology 6:1204; e Patente dos Estados Unidos N°. 5011912. O péptido FLAG é altamente antigénico e proporciona um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal (mAb) específico, permitindo ensaio rápido e fácil purificação de proteína recombinante expressa. Os reagentes úteis para preparar proteínas de fusão em que o péptido FLAG é fundido a um dado polipéptido estão comercialmente disponíveis (Sigma, St. Louis, MO).
Os oligómeros que contêm uma ou mais proteínas de ligação a CGRP R podem ser empregues como antagonistas de CGRP R. Os oligómeros podem estar na forma de dímeros, trímeros ou oligómeros superiores covalentemente ligados ou não covalentemente ligados. Os oligómeros compreendendo duas ou mais proteínas de ligação a CGRP R estão contemplados para utilização, com um exemplo sendo um homodímero. Outros oligómeros incluem heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrâmeros, heterotetrâmeros, etc.
Uma forma de realização é dirigida a oligómeros compreendendo múltiplos polipéptidos de ligação a CGRP R ligados por meio de interações covalentes ou não covalentes entre unidades de péptido fundidas as proteínas de ligação a CGRP R. Esses péptidos podem ser ligantes de péptidos (espaçadores) ou péptidos que possuem a propriedade de promover oligomerização. Os fechos de leucina e determinados polipéptidos derivados de anticorpos estão entre os péptidos que podem promover oligomerização de proteínas de ligação a CGRP R ligadas a estes, como descrito em maior detalhe abaixo.
Em formas de realização particulares, os oligómeros compreendem desde duas a quatro proteínas de ligação a CGRP R. As unidades de proteína de ligação a CGRP R do oligómero podem estar em qualquer das formas acima descritas, e. g., variantes ou fragmentos. De um modo preferido, os oligómeros compreendem proteínas de ligação a CGRP R que possuem atividade de ligação a CGRP R.
Numa forma de realização, um oligómero é preparado utilizando polipéptidos derivados de imunoglobulinas. A preparação de proteínas de fusão compreendendo determinados polipéptidos heterólogos fundidos a várias partes de polipéptidos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) tem sido descrita, e. g., por Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_8:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; e Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", em Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10,19.1-10.19.11.
Uma forma de realização é dirigida a um dímero compreendendo duas proteínas de fusão originadas fundindo uma proteína de ligação a CGRP R à região Fc de um anticorpo. O dímero pode ser feito, por exemplo, inserindo uma fusão de gene que codifica a proteína de fusão num vetor de expressão apropriado, expressando a fusão de gene em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante e permitindo à proteína de fusão expressa montar moléculas de anticorpo muito parecidas, onde se formam as ligações de dissulfureto entre cadeias entre as unidades Fc para produzir o dímero. A expressão "polipéptido Fc" como aqui utilizada inclui formas nativas e muteínas de polipéptidos derivados da região Fc de um anticorpo. As formas truncadas desses polipéptidos contendo a região de erticulação que promove dimerização também estão incluídas. As proteínas de fusão compreendendo unidades Fc (e oligómeros formados destes) oferecem a vantagem de fácil purificação por cromatografia de afinidade ao longo das colunas de Proteína A ou Proteína G.
Um polipéptido Fc adequado, descrito no pedido PCT WO 93/10151 e Patente dos Estados Unidos N°5426048 e N° 5262522, é um polipéptido de cadeia simples que se estende da região de articulação N-terminal para o C-terminal nativo da região Fc de um anticorpo IgGl humano. Outro polipéptido Fc útil é a muteína Fc descrita na Patente dos Estados Unidos N° 5457035 e em Baum et al., 1994, EMBO J. _13:3992-4001. A sequência de aminoácidos desta muteína é idêntica à da sequência Fc nativa apresentada no documento WO 93/10151, exceto que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu e o aminoácido 22 foi alterado de Gly para Ala. A muteína apresenta afinidade reduzida para recetores de Fc.
Noutras formas de realização, a parte variável das cadeias pesadas e/ou leves de uma proteína de ligação a CGRP R, tal como aqui divulgada, pode ser substituída pela parte variável de uma cadeia pesada e/ou leve de anticorpo.
Em alternativa, o oligómero é uma proteína de fusão compreendendo múltiplas proteínas de ligação a CGRP R, com ou sem ligantes de péptido (péptidos espaçadores). Entre os ligantes de péptido adequados estão os descritos nas Patente dos Estados Unidos N° 4751180 e N° 4935233.
Outro método para preparar derivados de proteína de ligação a CGRP R oligoméricos envolve utilização de um fecho de leucina. Os domínios de fecho de leucina são péptidos que promovem oligomerização das proteínas em que estes se encontram. Os fechos de leucina foram originalmente identificados em várias proteínas de ligação de ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759) e já foram encontrados numa variedade de diferentes proteínas. Entre os fechos de leucina conhecidos estão péptidos de ocorrência natural e seus derivados que dimerizam ou trimerizam. Exemplos de domínios de fecho de leucina adequados para produzir proteínas oligoméricas solúveis são descritos no pedido PCT WO 94/10308 e o fecho de leucina derivado de proteína D tensioativa de pulmão (SPD) descrito em Hoppe et al., 1994, FEES Letters 344:191. A utilização de um fecho de leucina modificado que permite trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida a este é descrita em Fanslow et ai., 1994, Semin. Immunol. _6 :2 67-27 8. Numa abordagem, as proteínas de fusão recombinantes compreendendo um fragmento ou derivado de proteína de ligação a CGRP R fundido a um péptido de fecho de leucina são expressos em células hospedeiras adequadas e os fragmentos ou derivados de proteína de ligação a CGRP R oligoméricos que formam são recuperados do sobrenadante de cultura.
Em determinadas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio possui uma KD (afinidade de ligação de equilíbrio) inferior a 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM ou 50 nM.
Outro aspeto proporciona uma proteína de ligação a antigénio possuindo uma meia-vida de, pelo menos, um dia in vitro ou in vivo (e. g., quando administrada a um indivíduo humano) . Numa forma de realização, a proteína de ligação a antigénio possui uma meia-vida de, pelo menos, três dias. Noutra forma de realização, o anticorpo ou sua parte possui uma meia-vida de quatro dias ou mais. Noutra forma de realização, o anticorpo ou sua parte possui uma meia-vida de oito dias ou mais. Noutra forma de realização, o anticorpo ou sua parte de ligação a antigénio é derivada ou modificada tal que este possui uma meia-vida maior quando comparada ao anticorpo não derivado ou não modificado. Noutra forma de realização, a proteína de ligação a antigénio contém mutações pontuais para aumentar a meia-vida sérica, tal como descrito no documento WO 00/09560, publicado em 24 de fev. de 2000.
Glicosilação
As proteínas de ligação a antigénio podem possuir um padrão de glicosilação que é diferente ou alterado a partir do encontrado nas espécies nativas. Como é conhecido na técnicaos padrões de glicosilação podem depender da sequência da proteína (e. g., da presença ou ausência de resíduos de aminoácidos de glicosilação particulares, discutidos abaixo) ou da célula hospedeira ou organismo em que a proteína é produzida. Os sistemas de expressão particulares são discutidos abaixo. A glicosilação de polipéptidos é tipicamente ligada a N ou ligada a 0. Ligada a N refere-se à ligação da unidade de hidrato de carbono à cadeia secundária de um resíduo de asparagina. As sequências de tri-péptido asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para ligação enzimática da unidade de hidrato de carbono à cadeia secundária de asparagina. Deste modo, a presença de qualquer destas sequências de tri-péptido num polipéptido origina um potencial local de glicosilação. Glicosilação ligada a 0 refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose, a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, apesar de poderem também ser utilizadas 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição de locais de glicosilação à proteína de ligação a antigénio é convenientemente conseguida alterando a sequência de aminoácidos tal que esta contenha uma ou mais das sequências tri-péptido acima descritas (para locais de glicosilação ligados a N) . A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência inicial (para locais de glicosilação ligados a 0). Para facilidade, a sequência de aminoácidos de proteína de ligação a antigénio pode ser alterada através de alterações ao nível de ADN, particularmente mutando o ADN que codifica o polipéptido alvo em bases pré-selecionadas tal que sejam gerados codões que traduzirão nos aminoácidos desejados.
Outros meios de aumentar o número de unidades de hidrato de carbono na proteína de ligação a antigénio é por acoplamento químico ou enzimático de glicósidos à proteína. Estes procedimentos são vantajosos uma vez que estes não requerem produção da proteína numa célula hospedeira que possui capacidades de glicosilação para glicosilação ligada a N e a 0. Dependendo do modo de acoplamento utilizado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser ligado(s) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo livres, (c) grupos sulfidrilo livres, tais como os de cisteína, (d) grupos hidroxilo livres, tais como os de serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos, tais como os de fenilalanina, tirosina, ou triptofano ou (f) o grupo amida de glutamina. Estes métodos são descritos no documento WO 87/05330 publicado em 11 de set. de 1987 e em Aplin e Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., pp. 259-306. A remoção de unidades de hidrato de carbono presentes na proteína de ligação a antigénio inicial pode ser conseguida química ou enzimaticamente. A desglicosilação química requer exposição da proteína ao composto ácido trifluorometanossulfónico ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou de todos dos açúcares exceto o açúcar de ligação (Nl-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o polipéptido intacto. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin et al., 1987,
Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. A clivagem enzimática de unidades de hidrato de carbono em polipéptidos pode ser conseguida pela utilização de uma variedade de endo e exo-glicosidases como descrito por Thotakura et ai., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. A glicosilação em potenciais locais de glicosilação pode ser prevenida pela utilização do composto tunicamicina como descrito por Duskin et ai., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. A tunicamicina bloqueia a formação de ligações proteína-N-glicósido.
Assim, aspetos incluem variantes de glicosilação das proteínas de ligação a antigénio em que o número e/ou tipo de locais de glicosilação foram alterados em comparação com sequências de aminoácidos do polipéptido parental. Em determinadas formas de realização, as variantes de proteína de anticorpo compreendem um número maior ou menor de locais de glicosilação ligados a N do que o anticorpo nativo. Um local de glicosilação ligado a N é caracterizado pela sequência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido exceto prolina. A substituição de resíduos de aminoácidos para originar esta sequência proporciona um potencial novo local para a adição de uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N. Em alternativa, as substituições que eliminam ou alteram esta sequência prevenirão a adição de uma cadeia de hidrato de carbono ligada a N presente no polipéptido nativo. Por exemplo, a glicosilação pode ser reduzida pela deleção de uma Asn ou substituindo a Asn com um aminoácido diferente. Noutras formas de realização, são originados um ou mais novos locais ligados a N. Os anticorpos tipicamente possuem um local de glicosilação ligado a N na região Fc.
Marcadores e Grupos Efetores
Em algumas formas de realização, a ligação de antigénio compreende um ou mais marcadores. A expressão "grupo marcador" ou "marcador" significa qualquer marcador detetável. Exemplos de grupos marcadores adequados incluem, mas não são limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (e. g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, 11]-In, 125I, 1311) , grupos fluorescentes (e. g., FITC, rodamina, lantanídeo fosforoso), grupos enzimáticos (e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos biotinilo ou epítopos de polipéptido predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências par de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, marcadores de epítopo). Em algumas formas de realização, o grupo marcador é acoplado à proteína de ligação a antigénio por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico. São conhecidos na técnica vários métodos para marcar proteínas e podem ser utilizados como adequado. A expressão "grupo efetor" significa qualquer grupo acoplado a uma proteína de ligação a antigénio que atua como um agente citotóxico. Exemplos para grupos efetores adequados são radioisótopos ou radionuclídeos (e. g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, 11:LIn, 125I, 131I) . Outros grupos adequados incluem toxinas, grupos terapêuticos ou grupos quimioterapêuticos. Exemplos de grupos adequados incluem caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina e maitansina. Em algumas formas de realização, o grupo efetor é acoplado à proteína de ligação a antigénio por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico.
Em geral, os marcadores estão dentro de uma variedade de classes, dependendo do ensaio em que estas são para detetar: a) marcadores isotópicos, que podem ser radioativos ou isótopos pesados; b) marcadores magnéticos (e. g., partículas magnéticas) ; c) unidades ativas redox; d) corantes óticos; grupos enzimáticos (e. g. peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilados; e f) epítopos de polipéptido predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências par de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, alvos de epítopo, etc.)· Em algumas formas de realização, o grupo marcador é acoplado à proteína de ligação a antigénio por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potential impedimento estérico. São conhecidos na técnica vários métodos para marcar proteínas.
Os marcadores específicos incluem corantes óticos, incluindo, mas não limitados a cromóforos, fósforos e fluoróforos, com o último sendo específico em muitos casos. Os fluoróforos podem ser fluores de "molécula pequena" ou fluores proteináceos.
Por "marcador fluorescente" entende-se qualquer molécula que pode ser detetada por meio das suas propriedades fluorescentes inerentes. Os marcadores fluorescentes adequados incluem, mas não são limitados a fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarinas, pireno, verde de Malaquita, estilbeno, amarelo de Lucifer, Cascade BlueJ, Vermelho Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, verde Oregon, os corantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR) , FITC, Rodamina e Vermelho Texas (Pierce, Rockford, IL) , Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA) . Os corantes óticos adequados, incluindo fluoróforos, são descritos em MOLECULAR PROBES HANDBOOK por Richard P. Haugland.
Os marcadores fluorescentes proteináceos adequados também incluem, mas não são limitados a proteína fluorescente verde, incluindo uma espécie Renilla, Ptilosarcus ou Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., Número de Acesso Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canada; Stauber, 1998, Biotechniques 2_4 :462-471,- Heim et al., 1996, Curr. Biol. ^6:178-182), proteína fluorescente amarela melhorada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8_5: 2603-2607) e Renilla (documentos WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, Patentes dos Estados Unidos N° 5292658, N° 5418155, N° 5683888, N° 5741668, N° 5777079, N° 5804387, N° 5874304, N° 5876995, N° 5925558).
Sequências de Ácidos Nucleicos que codificam Proteínas de ligação a antigénio CGRP São também proporcionados ácidos nucleicos que codificam para as proteínas de ligação a antigénio aqui descritas, ou suas partes, incluindo ácidos nucleicos que codificam uma ou ambas as cadeias de um anticorpo, ou um seu fragmento, derivado, muteína ou variante, polinucleótidos que codificam regiões variáveis de cadeia pesada ou apenas CDR, polinucleótidos suficientes para utilização como sondas de hibridação, iniciadores de PCR ou iniciadores de sequenciação para identificação, análise, mutação ou amplificação de um polinucleótido que codifica um polipéptido, ácidos nucleicos antissentido para inibir a expressão de um polinucleótido e sequências complementares dos anteriores. Os ácidos nucleicos podem ser de qualquer comprimento. Estes podem ter, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500 ou mais nucleótidos em comprimento, e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras e/ou ser parte de um ácido nucleico maior, por exemplo, um vetor. Os ácidos nucleicos podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla e podem compreender nucleótidos de ARN e/ou ADN e suas variantes artificiais (e. g., ácidos nucleicos de péptido). A Tabela 7 mostra sequências de ácidos nucleicos exemplificativas que codificam uma região constante de cadeia pesada IgG2, uma região constante de cadeia leve capa e uma região constante de cadeia leve hCL-1 lambda. Qualquer região variável aqui pode ser ligada a estas regiões constantes para formar sequências de cadeia pesada e leve completas. No entanto, deve ser entendido que estas sequências de regiões constantes são proporcionadas apenas como exemplos específicos - um dos especialistas na técnica pode empregar outras regiões constantes, incluindo região constante de cadeia pesada de IgGl, regiões constantes de cadeia pesada de IgG3 ou IgG4, qualquer das sete regiões constantes de cadeia leve lambda, incluindo hCL-1, hCL-2, hCL-3 e hCL-7; regiões constantes que foram modificadas para estabilidade, expressão, manufaturabilidade melhoradas ou outras características desejadas e semelhantes. Em algumas formas de realização, as sequências de região variável estão ligadas a outras sequências de região constante que são conhecidas na técnica. As sequências de ácidos nucleicos exemplificativas que codificam regiões variáveis de cadeia leve e pesada são proporcionadas na Tabela 8.
Tabela 7: Sequências de Ácidos Nucleicos de Região Constante de Cadeia Pesada e Leve Exemplificativas
A Tabela 8 mostra sequências de ácidos nucleicos exemplificativas que codificam regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve, em que estão incorporadas as várias sequências de CDRLl, CDRL2 e CDRL3, ou CDRHl, CDRH2 e CDRH3.
Tabela 8: Sequências de Ácidos Nucleicos de Região Variável de Cadeia Leve e Pesada Exemplificativas
A Tabela 9 mostra a SEQ ID N° de sequências de ácidos nucleicos exemplificativas que codificam cadeias pesada e leves completas, assim como regiões variáveis de cadeia leve e pesada, de proteínas de ligação a antigénio isolada exemplificativas, especificamente, proteínas de ligação de hCGRP R, aqui divulgadas.
Tabela 9 - SEQ ID N°. de Sequências de Ácidos Nucleicos HC, LC, VH e VL Exemplificativas
Os ácidos nucleicos que codificam determinadas proteínas de ligação a antigénio ou suas partes (e. g., anticorpo de comprimento total, cadeia pesada ou leve, domínio variável ou CDRHl, CDRH2, CDRH3, CDRLl, CDRL2 ou CDRL3) podem ser isolados a partir de células B de ratinhos que foram imunizados com CGRP R ou seus componentes imunogénicos, e. g., imunizando com CGRP R de comprimento total (compreendendo ambos CRLR e RAMPl), com o domínio extracelular de CGRP R (compreendendo domínios extracelulares de CRLR e RAMPl), com células completas que expressam CGRP R, com membranas preparadas a partir de células que expressam CGRP R, com proteínas de fusão, e. g., fusões de Fc, compreendendo CRLR, RAMPl (ou seus domínios extracelulares) fundidos a Fc e outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito nos Exemplos 1-3 aqui. 0 ácido nucleico pode ser isolado por procedimentos convencionais tal como reação de polimerase em cadeia (PCR) . A apresentação de fago é outro exemplo de uma técnica conhecida pela qual derivados de anticorpos e outras proteínas de ligação a antigénio podem ser preparadas. Numa abordagem, os polipéptidos que são componentes de uma proteína de ligação a antigénio de interesse são expressos em qualquer sistema de expressão recombinante adequado e os polipéptidos expressos são deixados a montar para formar moléculas de proteína de ligação a antigénio.
Os ácidos nucleicos proporcionados nas Tabelas 7-9 são apenas exemplificativos. Devido à degenerescência do código genético, cada das sequências de polipéptidos listadas nas Tabelas 2-5 ou de outro modo representadas aqui são também codificadas por um grande número de outras sequências de ácido nucleico além das proporcionadas. Um especialista na técnica comum entenderá que o presente pedido proporciona, deste modo, descrição escrita adequada e habilitação para cada sequência de nucleótidos degenerada que codifica cada proteína de ligação a antigénio.
Um aspeto proporciona ainda ácidos nucleicos que hibridam para outros ácidos nucleicos (e. g., ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleótidos listada na Tabela 7, Tabela 8, Tabela 9 e/ou SEQ ID N° :224-258) sob condições de hibridação particulares. Os métodos para hibridar ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Ver, e. g., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &amp; Sons, N.I. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como aqui definido, um estado de hibridação moderadamente estringente utiliza uma solução de pré-lavagem contendo 5x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), 0,5% de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampão de hibridação de cerca de 50% de formamida, 6x SSC e uma temperatura de hibridação de 55 °C (ou outras soluções de hibridação semelhantes, tais como a contendo cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridação de 42 °C) e condições de lavagem de 60 °C, em 0,5x SSC, 0,1% SDS. Um estado de hibridação estringente híbrida em 6x SSC a 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,lx SSC, 0,2% de SDS a 68 °C. Além disso, um especialista na técnica pode manipular a hibridação e/ou condições de lavagem para aumentar ou diminuir a estringência de hibridação tal gue ácidos nucleicos compreendendo seguências de nucleótidos gue são, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% idênticas umas às outras, tipicamente, permanecem hibridadas umas às outras.
Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridação e orientação para elaboração de condições adequadas são expostos, por exemplo, por Sambrook, Fritsch e Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley &amp; Sons, Inc., secções 2.10 e 6.3-6.4) e podem ser facilmente determinadas pelos que possuem especialidade na técnica com base, e. g., no comprimento e/ou composição de base do ácido nucleico.
As alterações podem ser introduzidas por mutação num ácido nucleico, levando, desse modo, a alterações na sequência de aminoácidos de um polipéptido (e. g., um anticorpo ou derivado de anticorpo) que o codifica. As mutações podem ser introduzidas utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Numa forma de realização, um ou mais resíduos de aminoácidos particulares são alterados utilizando, por exemplo, um protocolo de mutagénese dirigido ao local. Noutra forma de realização, um ou mais resíduos aleatoriamente selecionados é alterado utilizando, por exemplo, um protocolo de mutagénese aleatório. No entanto é feito, um polipéptido mutante pode ser expresso e rastreado para uma propriedade desejada.
As mutações podem ser introduzidas num ácido nucleico sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipéptido que o codifica. Por exemplo, podem fazer-se substituições de nucleótidos levando a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos não essenciais. Em alternativa, uma ou mais mutações podem ser introduzidas num ácido nucleico que altera seletivamente a atividade biológica de um polipéptido que o codifica. Por exemplo, a mutação pode alterar quantitativa ou qualitativamente a atividade biológica. Exemplos de alterações quantitativas incluem aumentar, reduzir ou eliminar a atividade. Exemplos de alterações qualitativas incluem alterar a especificidade de antigénio de um anticorpo. Numa forma de realização, um ácido nucleico que codifica qualquer proteína de ligação a antigénio aqui descrita pode ser mutada para alterar a sequência de aminoácidos utilizando técnicas de biologia molecular que estão bem definidas na técnica.
Outro aspeto proporciona moléculas de ácido nucleico que são adequadas para utilização como iniciadores ou sondas de hibridação para a deteção de sequências de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico pode compreender apenas uma parte de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido de comprimento total, por exemplo, um fragmento que pode ser utilizado como sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma parte ativa (e. g., uma parte de ligação a CGRP R) de um polipéptido.
As sondas baseadas na sequência de um ácido nucleico podem ser utilizadas para detetar o ácido nucleico ou ácidos nucleicos semelhantes, por exemplo, transcriptos que codificam um polipéptido. A sonda pode compreender um grupo marcador, e. g. , a radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator de enzima. Essas sondas podem ser utilizadas para identificar uma célula que expressa o polipéptido.
Outro aspeto proporciona vetores compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipéptido ou uma sua parte (e. g., um fragmento contendo uma ou mais CDR ou um ou mais domínios de região variável). Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a plasmídeos, vetores virais, vetores de mamíferos não epissomais e vetores de expressão, por exemplo, vetores de expressão recombinantes. Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico numa forma adequada para expressão do ácido nucleico numa célula hospedeira. Os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a utilizar para expressão, que é operativamente ligada à sequência de ácidos nucleicos a expressar. As sequências reguladoras incluem as que direcionam expressão constitutiva de uma sequência de nucleótidos e muitos tipos de células hospedeiras (e. g., intensificador de gene precoce de SV40, promotor de vírus de sarcoma de Rous e promotor de citomegalovírus) , as que direcionam expressão da sequência de nucleótidos apenas em determinadas células hospedeiras (e. g., sequências reguladoras específicas de tecido, ver, Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sei. 1JL:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237) e as que direcionam expressão induzível de uma sequência de nucleótidos em resposta a tratamento ou estado particular (e. g., o promotor de metalotionina em células de mamíferos e o promotor responsivo a tet e/ou responsivo a estreptomicina em sistemas procariótico e eucariótico (ver, id.) . Será entendido pelos especialistas na técnica que a conceção do vetor de expressão pode depender desses fatores como a escolha da célula hospedeira a transformar, o nivel de expressão de proteína desejado, etc. Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras para, desse modo, produzirem proteínas ou péptidos, incluindo proteínas de fusão ou péptidos, codificados por ácidos nucleicos como aqui descritos.
Outro aspeto proporciona células hospedeiras em que um vetor recombinante de expressão foi introduzido. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (por exemplo, E. coli) ou (por exemplo, células de levedura, inseto ou células de mamíferos (e. g., células CH0) ) . 0 ADN de vetor pode ser introduzido em células procariótica ou eucariótica por meio de técnicas de transformação ou transfeção convencionais. Para transfeção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfeção utilizada, apenas uma fração pequena de células pode integrar o ADN estranho no seu genoma. De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador de seleção (e. g., para resistência a antibióticos) é, de um modo geral, introduzido nas células hospedeiras em conjunto com o gene de interesse. Os marcadores de seleção preferidos incluem os que conferem resistência a fármacos, tais como G418, higromicina e metotrexato. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármaco (e. g., células que incorporaram o gene marcador de seleção sobreviverão, enquanto as outras células morrem), entre outros métodos.
Preparação de Proteínas de ligação a antigénio
Os anticorpos não humanos que são proporcionados podem ser, por exemplo, derivados de qualquer animal que produz anticorpos, tais como ratinho, rato, coelho, cabra, burro ou primata não humano (tais como macaco (e. g., Cinomolgo ou Macaco Rhesus) ou simio (e. g., chimpanzé)). Os anticorpos não humanos podem ser utilizados, por exemplo, em cultura celular in vitro e aplicações à base de cultura celular ou qualquer outra aplicação em que uma resposta imunitária ao anticorpo não ocorre ou é insignificante, pode ser evitada, não é uma preocupação ou é desejada. Em determinadas formas de realização, os anticorpos podem ser produzidos imunizando animais utilizando métodos conhecidos na técnica, como descritos acima e/ou nos Exemplos 1-3 abaixo. Os exemplos descrevem a geração de anticorpos anti CGRP R utilizando três preparações de imunogénio diferentes - (i) células totais que expressam versões de comprimento total de duas componentes principais de CGRP R - RAMPl e CRLR; (ii) extratos de membrana a partir dessas células; e (iii) CGRP R solúvel obtido co-expressando e purificando os domínios extracelulares de N-terminal de CRLR e RAMPl. Os anticorpos podem ser policlonais, monoclonais ou podem ser sintetizados em células hospedeiras expressando ADN recombinante. Os anticorpos totalmente humanos podem ser preparados como descrito acima imunizando animais transgénicos contendo imunoglobulina humana local ou selecionando uma biblioteca de apresentação de fago que está a expressar um reportório de anticorpos humanos.
Os anticorpos monoclonais (mAb) podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, e. g., a técnica de hibridação de célula somática padrão de Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495. Em alternativa, podem ser empregues outras técnicas para produzir anticorpos monoclonais, por exemplo, a transformação virai ou oncogénica de linfócitos B. Um sistema animal adequado para preparar hibridomas é o sistema murino, que é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica e abordagens ilustrativas são descritas nos Exemplos, abaixo. Para esses procedimentos, células B de ratinhos imunizados são, tipicamente, fundidas com um parceiro de fusão imortalizado adequado, tal como uma linha celular de mieloma de murino. Se desejado, ratos ou outros mamíferos além destes podem ser imunizados em vez de ratinhos e células B desses animais podem ser fundidas com a linha celular de mieloma de murino para formar hibridomas. Em alternativa, pode ser utilizada uma linha celular de mieloma de murino de uma fonte que não ratinho. São também bem conhecidos procedimentos de fusão para fazer hibridomas.
Os anticorpos de cadeia simples que são proporcionados podem ser formados ligando fragmentos de domínio (região Fv) variável de cadeia pesada e leve por meio de uma ponte de aminoácidos (ligante de péptido curto), resultando numa cadeia de polipéptido simples. Essas Fv de cadeia simples (scFvs) podem ser preparadas fundindo ADN que codifica um ligante de péptido entre ADN que codifica os dois polipéptidos de domínio variável (VL e VH) . Os polipéptidos resultantes podem dobrar-se sobre si mesmos para formarem monómeros de ligação a antigénio ou estes podem formar multímeros (e. g., dímeros, trímeros ou tetrâmeros), dependendo do comprimento de um ligante flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. jL0_:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 1_8:95-108). Combinando diferentes polipéptidos compreendendo VL e VH, um pode formar scFvs multiméricas que se ligam a diferentes epítopos (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). As técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos de cadeia simples incluem as descritas em Pat.U.S. N° 4946778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. _85g5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387. Os anticorpos de cadeia simples derivados de anticorpos aqui proporcionados incluem, mas não são limitados a scFvs compreendendo as combinações de domínio variável das regiões variáveis de cadeia leve e pesada representadas na Tabela 3 ou combinações de domínios variáveis de cadeia leve e pesada que incluem CDR representadas nas Tabelas 4A e 4B.
Os anticorpos aqui proporcionados que são de uma subclasse podem ser alterados para anticorpos de uma subclasse diferente utilizando métodos de troca de subclasse. Deste modo, os anticorpos IgG podem ser derivados de um anticorpo IgM, por exemplo e vice-versa. Essas técnicas permitem a preparação de novos anticorpos que possuem as propriedades de ligação a antigénio de um dado anticorpo (o anticorpo parental), mas também apresentam propriedades biológicas associadas com um isotipo ou subclasse de anticorpo diferente da do anticorpo parental. Podem ser empregues técnicas de ADN recombinante. O ADN clonado que codifica polipéptidos de anticorpos particulares podem ser empregues nesses procedimentos, e. g., ADN que codifica o domínio constante de um anticorpo do isotipo desejado. Ver, e. g., Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316.
Como consequênciaos anticorpos que são proporcionados incluem os compreendendo, por exemplo, as combinações de domínio variável descritas, supra., possuindo um isotipo desejado (por exemplo, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgD) assim como os seus fragmentos Fab ou F(ab')2- Além disso, se for desejado um IgG4, pode também ser desejado introduzir uma mutação pontual (CPSCP->CPPCP) na região de articulação como descrito em Bloom et al., 1997, Protein Science _6:407 para aliviar uma tendência para formar ligações dissulfureto de cadeia intra-H que podem levar a heterogeneidade nos anticorpos de IgG4.
Além disso, são também conhecidas técnicas para derivar anticorpos possuindo diferentes propriedades (i. e., variando afinidades para o antigénio ao qual estes ligam). Uma dessas técnicas, referida como baralhamento de cadeia, envolve apresentar reportórios de gene de domínio variável de imunoglobulina na superfície de bacteriófago filamentoso, muitas vezes referida como apresentação de fago. 0 baralhamento de cadeia tem sido utilizado para preparar anticorpos de elevada afinidade para hapteno 2-feniloxazol-5-ona, como descrito por Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.
As modificações conservativas podem ser feitas às regiões variáveis de cadeia leve e pesada descritas na Tabela 3 ou às CDR descritas nas Tabelas 4A e 4B (e correspondentes modificações aos ácidos nucleicos que codificam) para produzir uma proteína de ligação a CGRP R possuindo determinadas características funcionais e bioquímicas desejáveis. Os métodos para conseguir essas modificações são descritos acima.
As proteínas de ligação a antigénio de CGRP podem ser ainda modificadas de vários modos. Por exemplo, se estas são para utilizar para fins terapêuticos, estas podem ser conjugadas com polietilenoglicol (peguilado) para prolongar a meia-vida sérica ou para intensificar a distribuição de proteína. Em alternativa, a região V dos anticorpos ou seus fragmentos em questão pode ser fundida com a região Fc de uma molécula de anticorpo diferente. A região Fc utilizada para este fim pode ser modificada de modo que esta não se liga ao complemento, reduzindo, deste modo, a probabilidade de induzir lise celular no doente quando a proteína de fusão é utilizada como um agente terapêutico. Além disso, os anticorpos ou seus fragmentos funcionais em questão podem ser conjugados com albumina de soro humano para intensificar a meia-vida sérica do anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio. Outro parceiro de fusão útil para as proteínas de ligação a antigénio ou seus fragmentos é transtirretina (TTR). A TTR possui a capacidade para formar um tetrâmero, deste modo, uma proteína de fusão de anticorpo-TTR pode formar um anticorpo multivalente que pode aumentar a sua avidez de ligação.
Em alternativa, podem ser conseguidas modificações substanciais nas características funcionais e/ou bioquímicas das proteínas de ligação a antigénio aqui descritas originando substituições na sequência de aminoácidos das cadeias pesada e leve que diferem significativamente no seu efeito de manter (a) a estrutura do esqueleto molecular na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helical, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo ou (c) a carga da cadeia secundária. Uma "substituição de aminoácidos conservativa" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo não nativo que possui pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga dos resíduos de aminoácidos nessa posição. Ver, Tabela 4, supra. Além disso, qualquer resíduo nativo no polipéptido pode também ser substituído com alanina, como foi anteriormente descrito para mutagénese de rastreamento de alanina.
As substituições de aminoácidos (quer conservativas ou não conservativas) dos anticorpos em questão podem ser implementadas pelos especialistas na técnica aplicando técnicas de rotina. As substituições de aminoácidos podem ser utilizadas para identificar resíduos importantes dos anticorpos aqui proporcionados ou para aumentar ou diminuir a afinidade destes anticorpos para CGRP R humano ou para modificar a afinidade de ligação de outras proteínas de ligação a antigénio aqui descritas. Métodos de Expressão de Proteínas de ligação a antigénio
Os sistemas de expressão e construtores na forma de plasmídeos, vetores de expressão, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem, pelo menos, um polinucleótido como descrito acima são também aqui proporcionados, assim como células hospedeiras compreendendo esses sistemas de expressão ou construtores.
As proteínas de ligação a antigénio aqui proporcionadas podem ser preparadas por qualquer de uma série de técnicas convencionais. Por exemplo, proteínas de ligação a antigénio de CGRP R podem ser produzidas por sistemas de expressão recombinantes, utilizando qualquer técnica conhecida na técnica. Ver, e. g., Monoclonal Antibodies, Hybridoms: A New Dimension in Biological Analyses, Rennet et al. (eds.) Plenum Press, Nova Iorque (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1988).
As proteínas de ligação a antigénio podem ser expressas em linhas celulares de hibridoma (e. g., em anticorpos particulares podem ser expressos em hibridomas) ou em linhas celulares que não hibridomas. Os construtores de expressão que codificam os anticorpos podem ser utilizados para transformar uma célula hospedeira de mamífero, inseto ou microbiana. A transformação pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido para introduzir polinucleótidos numa célula hospedeira, incluindo, por exemplo empacotar o polinucleótido num vírus ou bacteriofago e transduzir uma célula hospedeira com o construtor por procedimentos de transfeção conhecidos na técnica, como exemplificado por Patentes dos Estados Unidos N° 4399216; N° 4912040; N° 4740461; N° 4959455. O procedimento de transformação ótima utilizado dependerá do tipo de célula hospedeira a ser transformado. Métodos para introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a transfeção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfeção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleótido (s) em lipossomas, misturar ácido nucleico com lípidos positivamente carregados e direcionar microinjeção do ADN em núcleos.
Os construtores de expressão recombinantes, tipicamente, compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido compreendendo uma ou mais dos seguintes: uma ou mais CDR aqui proporcionadas; uma região constante de cadeia leve; uma região variável de cadeia leve; uma região constante de cadeia pesada (e. g., CHi, CH2 e/ou CH3) ; e/ou outra parte de esqueleto de uma proteína de ligação a antigénio de CGRP R. Estas sequências de ácido nucleico são inseridas num vetor de expressão apropriado utilizando técnicas de ligação padrão. Numa forma de realização, a região constante de cadeia pesada ou leve é anexa ao C-terminal da região variável de cadeia pesada ou leve específica de anti-CGRP R e é ligada num vetor de expressão. 0 vetor é, tipicamente, selecionado para ser funcional na célula hospedeira particular empregue (i. e., o vetor é compatível com a maquinaria de célula hospedeira, permitindo amplificação e/ou pode ocorrer expressão do gene). Em algumas formas de realização, são utilizados vetores que empregam ensaios de complementação proteína-fragmento utilizando repórteres de proteína, tal como di-hidrofolato redutase (ver, por exemplo, Pat. U.S. N° 6270964). Os vetores de expressão adequados podem ser comprados, por exemplo, de Invitrogen Life Technologies ou BD Biosciences (antigamente "Clontech"). Outros vetores úteis para clonar e expressar os anticorpos e fragmentos incluem os descritos em Bianchi e McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 8_4:439-44. Vetores de expressão adequados adicionais são discutidos, por exemplo, em Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, Nova Iorque: Academic
Press.
Tipicamente, os vetores de expressão utilizados em qualquer das células hospedeiras conterão sequências para manutenção de plasmídeos e para clonagem e expressão de sequências de nucleótidos exógenas. Essas sequências, referidas coletivamente como "sequências flanqueadoras" em determinadas formas de realização incluirão, tipicamente, uma ou mais das seguintes sequências de nucleótidos: um promotor, uma ou mais sequências intensificadoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência de intrão completa contendo um local de excisão-união de dador e aceitador, uma sequência que codifica uma sequência líder para secreção de polipéptido, um local de ligação a ribossoma, uma sequência de poliadenilação, uma região poliligante para inserir o ácido nucleico que codifica o polipéptido a expressar e um elemento marcador de seleção. Cada uma destas sequências é discutida abaixo.
De um modo opcional, o vetor pode conter uma sequência que codifica um "marcador", í. e., uma molécula de oligonucleótido localizada na extremidade 5' ou 3' da sequência codificante de proteína de ligação a CGRP R; a sequência de oligonucleótidos codifica poliHis (tal como hexaHis), outro "marcador" tal como FLAG®, HA (vírus influenza de hemaglutinina) ou myc, para a qual existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este alvo é tipicamente fundido ao polipéptido mediante expressão do polipéptido e pode servir como um meio para purificação de afinidade ou deteção da proteína de ligação a CGRP R a partir da célula hospedeira. A purificação de afinidade pode ser conseguida, por exemplo, por cromatografia em coluna utilizando anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. De um modo opcional, o marcador pode ser subsequentemente removido da proteína de ligação a CGRP R purificada por vários meios, tais como utilizando determinadas peptidases para clivagem.
As sequências flanqueadoras podem ser homólogas (í. e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heterólogas (i. e., de uma espécie que não a espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbridas (i. e., uma combinação de sequências flanqueadoras de mais do que uma fonte), sintéticas ou nativas. Como tal, a fonte de uma sequência flanqueadora pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, desde que a sequência flanqueadora seja funcional na, e possa ser ativada pela maquinaria de célula hospedeira.
As sequências flanqueadoras úteis nos vetores podem ser obtidas por qualquer de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências flanqueadoras úteis aqui terão sido previamente identificadas por mapeamento e/ou por digestão com endonuclease de restrição e podem, deste modo, ser isoladas a partir de fontes de tecido apropriadas utilizando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência de nucleótidos total de uma sequência flanqueadora pode ser conhecida. Aqui, a sequência flanqueadora pode ser sintetizada utilizando os métodos aqui descritos para síntese ou clonagem de ácido nucleico.
Se toda ou apenas uma parte da sequência flanqueadora for conhecida, esta pode ser obtida utilizando reação de polimerase em cadeia (PCR) e/ou rastreando uma biblioteca genómica com uma sonda adequada, tal como um oligonucleótido e/ou fragmento de sequência flanqueadora da mesma ou de outra espécie. Quando a sequência flanqueadora não é conhecida, um fragmento de ADN contendo uma sequência flanqueadora pode ser isolado de um pedaço grande de ADN que pode conter, por exemplo, uma sequência codificante ou mesmo outro gene ou genes. 0 isolamento pode ser conseguido por digestão de endonuclease de restrição para produzir o fragmento de ADN apropriado seguido por isolamento utilizando purificação de gel de agarose, cromatografia em coluna Qiagen® (Chatsworth, CA) ou outros métodos conhecidos do especialista na técnica. A seleção de enzimas adequadas para conseguir este fim serão evidentes para um comum especialista na técnica.
Uma origem de replicação é, tipicamente, uma parte desses vetores de expressão procarióticos comercialmente comprados e a origem auxilia na amplificação do vetor numa célula hospedeira. Se o vetor de escolha não contiver uma origem de local de replicação, pode ser quimicamente sintetizada com base numa sequência conhecida e ligada no vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas e várias origens virais (e. g., SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus, tais como HPV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. De um modo geral, a origem de componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é muitas vezes utilizada apenas porque esta contém o promotor precoce de vírus).
Uma sequência de terminação de transcrição está, tipicamente, localizada 3' em relação à extremidade de uma região codificante de polipéptido e serve para terminar a transcrição. Normalmente, uma sequência de terminação de transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C seguido por uma sequência poli-T. Enquanto a sequência é facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo comercialmente comprada como parte de um vetor, pode também ser facilmente sintetizada utilizando métodos para síntese de ácido nucleico, tal como os aqui descritos.
Um gene marcador de seleção codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira cultivada num meio de cultura seletivo. Os genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e. g., ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes essenciais não disponíveis a partir dos meios complexos ou definidos. Os marcadores de seleção específicos são o gene de resistência a canamicina, o gene de resistência a ampicilina e o gene de resistência a tetraciclina. De um modo vantajoso, um gene de resistência a neomicina pode também ser utilizado para seleção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.
Outros genes de seleção podem ser utilizados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes que são necessários para produção de uma proteína essencial para crescimento ou sobrevivência celular são reiterados em também dentro dos cromossomas de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores de seleção adequados para células de mamíferos incluem -hidrofolato redutase (DHFR) e genes de timidina cinase sem promotor. Os transformantes de células de mamíferos são colocados sob pressão de seleção em que apenas os transformantes são unicamente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão de seleção é imposta cultivando as células transformadas sob condições em que a concentração de agente de seleção no meio é sucessivamente aumentada, levando, desse modo, à amplificação do gene de seleção e do ADN que codifica outro gene, tal como uma proteína de ligação a antigénio que se liga a CGRP R. Como resultado, quantidades crescentes de um polipéptido, tal como uma proteína de ligação a antigénio, são sintetizadas a partir de ADN amplificado.
Um local de ligação a ribossoma é normalmente necessário para iniciação de tradução de ARNm e é caracterizado por uma sequência Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma sequência Kozak (eucariotas). 0 elemento está, tipicamente, localizado 3' em relação ao promotor e 5' em relação à sequência codificante do polipéptido a expressar.
Em alguns casos, tal como quando a glicosilação é desejada num sistema de expressão de célula hospedeira eucariótica, podem manipular-se as várias sequências pré ou pró para melhorar a glicosilação ou rendimento. Por exemplo, pode alterar-se o local de clivagem de peptidase de um péptido sinal particular ou adicionar-se pró-sequências, que também podem afetar a glicosilação. 0 produto de proteína final pode possuir, na posição 1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura), um ou mais aminoácidos adicionais incidentes para expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto de proteína final pode possuir um ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no local de clivagem de peptidase, ligados ao terminal amino. Em alternativa, a utilização de alguns locais de clivagem de enzima pode resultar numa forma ligeiramente truncada do polipéptido desejado, se a enzima cortar nessa área dentro do polipéptido maduro. A expressão e clonagem conterão, tipicamente, um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e operativamente ligado à molécula que codifica uma proteína de ligação a CGRP R. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (í. e., 5') ao codão inicial de um gene estrutural (de dum modo geral, dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores estão convencionalmente agrupados numa de duas classes: promotores induzíveis e promotores constitutivos. Os promotores induziveis iniciam niveis aumentados de transcrição de ADN sob o seu controlo em resposta a algumas alterações em condições de cultura, tais como a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração em temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, transcrevem uniformemente um gene ao qual estes estão operativamente ligados, isto é, com pequeno ou sem controlo sobre a expressão de gene. São bem conhecidos um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras. Um promotor adequado está operativamente ligado ao ADN que codifica a cadeia pesada ou cadeia leve compreendendo uma proteína de ligação a CGRP R removendo o promotor da fonte de ADN por digestão com enzima de restrição e inserindo a sequência de promotor desejada no vetor.
Os promotores adequados para utilização com hospedeiros de levedura são também bem conhecidos na técnica. Os intensificadores de levedura são, de um modo vantajoso, utilizados com promotores de levedura. Os promotores adequados para utilização com células hospedeiras de mamíferos são bem conhecidos e incluem, mas não são limitados aos obtidos a partir dos genomas de vírus, tais como poliomavírus, vírus de varíola, adenovirus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovirus, vírus de hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores de mamíferos adequados incluem promotores de mamíferos heterólogos, por exemplo, promotores de choque térmico e o promotor de actina.
Os promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, mas não são limitados a: promotor precoce de SV40 (Benoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-310) ; promotor CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 8_1:659-663) ; o promotor contido na repetição de terminal longo 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:187-797) ; promotor a timidina cinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7_8: 1444-1445) ; promotor e sequências reguladoras do gene de metalotionina (Prinster et al., 1982,
Nature 296:39-42); e promotores procarióticos, tal como ο promotor de beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 15_: 3727-3731) ; ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8_0:21-25) . Também de interesse são as seguintes regiões de controlo transcricional animal, que apresentam especificidade de tecido e têm sido utilizadas em animais transgénicos: a região de controlo do gene da elastase I que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 3_8:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5_0 : 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7_:425-515); a região de controlo do gene da insulina que é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); a região de controlo do gene da imunoglobulina que é ativa em células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 3_8: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. Ί_: 1436-1444) ; a região de controlo do virus do tumor mamário de ratinho que é ativa em células testiculares, mamárias, linfóides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 4_5:485-495) ; a região de controlo do gene da albumina que é ativa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. _l:268-276); a região de controlo do gene da alfa-feto-proteína que é ativa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol.
Cell. Biol. 5_: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); a região de controlo de gene alfa 1-antitripsina que é ativa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1_: 161-171); a região de controlo de gene da beta-globina que é ativa em células mielóides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 4_6:89-94); a região de controlo do gene da proteína mielina básica que é ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); a região de controlo do gene da cadeia leve-2 de miosina que é ativa em músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); e a região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrópica que é ativa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Uma sequência intensificadora pode ser inserida no vetor para aumentar a transcrição de ADN que codifica a cadeia leve ou cadeia pesada compreendendo uma proteína de ligação a CGRP R humano em eucariotas superiores. Os intensificadores são elementos que atuam em cis de ADN, normalmente cerca de 10-300 pb em comprimento, que atuam no promotor para aumentar a transcrição. Os intensificadores são relativamente independentes da orientação e posição, tendo sido encontrados em posições 5' e 3' em relação à unidade de transcrição. São conhecidas várias sequências intensificadoras disponíveis de genes de mamíferos (e. g., globina, elastase, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, no entanto, é utilizado um intensificador de um vírus. O intensificador de SV40, o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma e intensificadores de adenovirus conhecidos na técnica são exemplificativos de elementos intensificadores para a ativação de promotores eucarióticos. Embora um intensificador possa ser posicionado no vetor 5' ou 3' em relação a uma sequência codificante, este está tipicamente localizado num local 5' do promotor. Uma sequência que codifica uma sequência sinal (sequência líder ou péptido sinal) nativa ou heteróloga apropriada pode ser incorporada num vetor de expressão, para promover secreção extracelular do anticorpo. A escolha de péptido sinal ou líder depende do tipo de células hospedeiras em que o anticorpo é para produzir e uma sequência sinal heteróloga pode substituir a sequência sinal nativa. Exemplos de péptidos sinal que são funcionais em células hospedeiras de mamíferos incluem os seguintes: a sequência sinal para interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente US N° 4965195; a sequência sinal para o recetor de interleucina-2 descrito em Cosman et ai., 1984, Nature 312:768; o péptido sinal do recetor de interleucina-4 descrito na Patente EP N° 0367566; o péptido sinal do recetor de interleucina-1 tipo I descrito na Patente US N°. 4968607; o péptido sinal do recetor de interleucina-1 tipo II descrito na Patente EP N° 0460846.
Os vetores de expressão que são proporcionados podem ser construídos a partir de um vetor de iniciação tal como um vetor comercialmente disponível. Esses vetores podem ou não conter todas as sequências flanqueadoras desejadas. Quando uma ou mais das sequências flanqueadoras aqui descritas já não estão presentes no vetor, estas podem ser individualmente obtidas e ligadas no vetor. Os métodos utilizados para obter cada das sequências flanqueadoras são bem conhecidos para um especialista na técnica.
Após o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico que codifica umacadeia leve, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de ligação a antigénio de CGRP R ter sido inserida no local apropriado do vetor, o vetor completo pode ser inserido numa célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão de polipéptido. A transformação de um vetor de expressão para uma proteína de ligação a antigénio numa célula hospedeira selecionada pode ser conseguida por métodos bem conhecidos incluindo transfeção, infeção, co-precipitação de fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofeção, transfeção mediada com DEAE-dextrano ou outras técnicas conhecidas. 0 método selecionado será, em parte, em função do tipo de célula hospedeira a utilizar. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos do especialista na técnica e são expostos, por exemplo, em Sambrook et al., 2001, supra.
Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza uma proteina de ligação a antigénio que pode, subsequentemente, ser recolhida do meio de cultura (se a célula hospedeira a secreta no meio) ou diretamente da célula hospedeira que a produz (se não for secretada). A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, tais como níveis de expressão desejados, modificações de polipéptido que são desejáveis ou necessárias para atividade (tais como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de dobra numa molécula biologicamente ativa.
As linhas celulares de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitadas a linhas celulares imortalizadas disponíveis da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas não limitadas a células de ovário de hamster Chinês (CH0) , células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (e. g., Hep G2) e uma série de outras linhas celulares. Em determinadas formas de realização, as linhas celulares podem ser selecionadas através de determinação de quais as linhas celulares que possuem níveis de expressão elevados e produzem constitutivamente proteínas de ligação a antigénio com propriedades de ligação a CGRP R. Noutra forma de realização, pode ser selecionada uma linha celular da linhagem celular B que não faz o seu próprio anticorpo mas possui uma capacidade para fazer e secretar um anticorpo heterólogo.
Utilização de Proteínas de ligação a antigénio de CGRP Humano para Fins de Diagnóstico e Terapêuticos
As proteínas de ligação a antigénio são úteis para detetar CGRP R em amostras biológicas e identificação de células ou tecidos que produzem CGRP R. Por exemplo, as proteínas de ligação a antigénio de CGRP R podem ser utilizadas em ensaios de diagnóstico, e. g., ensaios de ligação para detetar e/ou quantificar CGRP R expresso num tecido ou célula. As proteínas de ligação a antigénio que se ligam especificamente a CGRP R podem também ser utilizadas no tratamento de doenças relacionadas com CGRP R num doente em sua necessidade. Além disso, proteínas de ligação a antigénio de CGRP R podem ser utilizadas para inibir o CGRP R de formar um complexo com o seu ligando CGRP, modulando, desse modo, a atividade biológica de CGRP R numa célula ou tecido. Exemplos de atividades que podem ser moduladas incluem, mas não são limitados a inibir vasodilatação e/ou diminuir inflamação neurogénica. As proteínas de ligação a antigénio que se ligam a CGRP R podem, deste modo, modular e/ou bloquear a interação com outros compostos de ligação e, como tal, podem possuir utilização terapêutica na melhoria de doenças relacionadas com CGRP R.
Indicações
Uma doença ou estado associado com CGRP R humano inclui qualquer doença ou estado cujo inicio num doente é provocado, pelo menos, em parte, pela interação de CGRP R com o seu ligando, CGRP. A gravidade da doença ou estado pode também ser aumentada ou diminuída pela interação de CGRP R com CGRP.
Exemplos de doenças e estados que podem ser tratados com as proteínas de ligação a antigénio aqui descritas incluem dores de cabeça, tais como cefaleia em salvas, enxaqueca, incluindo dores de cabeça de enxaqueca, dor crónica, diabetes mellitus tipo II, inflamação, e. g., inflamação neurogénica, distúrbios cardiovasculares e distúrbios hemodinâmicos associados com endotoxemia e sépsis.
Em particular, as proteínas de ligação a antigénio aqui descritas podem ser utilizadas para tratar enxaqueca, como um tratamento agudo que começa após um ataque de enxaqueca ter começado e/ou como um tratamento profilático administrado, e. g., diariamente, semanalmente, bissemanalmente, mensalmente, bimensalmente, bianulamente, etc.) para prevenir ou reduzir a frequência e/ou gravidade de sintomas, e. g., sintomas de dor, associados com ataques de enxaqueca. Métodos de Diagnóstico
As proteínas de ligação a antigénio aqui descritas podem ser utilizadas para fins de diagnóstico para detetar, diagnosticar ou monitorizar doenças e/ou estados associados com CGRP R. São também proporcionados métodos para a deteção da presença de CGRP R numa amostra utilizando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos dos especialistas na técnica (e. g., Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon e P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdão); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105:3087-3096) . A deteção de CGRP R pode ser realizada in vivo ou in vitro.
As aplicações de diagnóstico aqui proporcionadas incluem utilização das proteínas de ligação a antigénio para detetar expressão de CGRP R e ligação dos ligandos a CGRP R. Exemplos de métodos úteis na deteção da presença de CGRP R incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA).
Para aplicações de diagnóstico, a proteína de ligação a antigénio, tipicamente, será marcada com um grupo marcador detetável. Os grupos marcadores adequados incluem, mas não são limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (e. g., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, 11]-In, 1251, 131I), grupos fluorescentes (e. g., FITC, rodamina, lantanida fosforosa), grupos enzimáticos (e. g., peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos biotinilo ou epítopos de polipéptido pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (e. g., sequências pares de fecho de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metal, alvos de epítopo). Em algumas formas de realização, o grupo marcador está acoplado à proteína de ligação a antigénio por meio de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico. São conhecidos na técnica e podem ser utilizados vários métodos para marcação de proteínas.
Noutro aspeto, uma proteína de ligação a antigénio pode ser utilizada para identificar uma célula ou células que expressam CGRP R. Numa forma de realização específica, a proteína de ligação a antigénio é marcada com um grupo marcador e a ligação da proteína de ligação a antigénio marcada para CGRP R é detetada. Numa forma de realização adicional específica, a ligação da proteína de ligação a antigénio para CGRP R é detetada in vivo. Numa forma de realização adicional específica, a proteína de ligação a antigénio de CGRP R é isolada e medida utilizando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor (ed. 1991 e suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology Nova Iorque: John Wiley &amp; Sons.
Outro aspeto proporciona a deteção da presença de uma molécula teste que compete para ligação a CGRP R com as proteínas de ligação a antigénio proporcionadas. Um exemplo desse ensaio envolveria detetar a quantidade de proteína de ligação a antigénio livre numa solução contendo uma quantidade de CGRP R na presença ou ausência da molécula teste. Um aumento na quantidade de proteína de ligação a antigénio livre (í. e., a proteína de ligação a antigénio não ligada a CGRP R) indicaria que a molécula teste é capaz de competir para ligação a CGRP R com a proteína de ligação a antigénio. Numa forma de realização, a proteína de ligação a antigénio é marcada com um grupo marcador. Em alternativa, a molécula teste é marcada e a quantidade de molécula teste livre é monitorizada na presença e ausência de uma proteína de ligação a antigénio. Métodos de Tratamento: Formulações Farmacêuticas, Vias de Administração São também ilustrados métodos de utilização das proteínas de ligação a antigénio. Em alguns métodos, uma proteína de ligação a antigénio é proporcionada a um doente. A proteína de ligação a antigénio inibe a ligação a CGRP a CGRP R humano. São também proporcionadas composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou uma pluralidade das proteínas de ligação a antigénio e um diluente, veículo, solubilizante, emulsionante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável. Além disso, estão incluídos métodos de tratamento de um doente, e. g., para enxaqueca, administrando essa composição farmacêutica. 0 termo "doente" inclui doentes humanos.
Os materiais de formulação aceitáveis são não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregues. Em formas de realização específicas, são proporcionadas composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteínas de ligação a antigénio de CGRP R humano.
Em determinadas formas de realização, os materiais de formulação aceitáveis, de um modo preferido, são não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregues. Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou libertação, adsorção ou penetração da composição. Nessa formas de realização, os materiais de formulação adequados incluem, mas não são limitados a aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos) ; agentes de carga (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tal como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)); agentes de complexação ( tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacáridos; dissacáridos; e outros hidratos de carbono (tais como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas) ; agentes corantes, aromatizantes e diluentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (tal como polivinilpirrolidona); polipéptidos de baixo peso molecular; contraiões formadores de sal (tal como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcónio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, cloro-hexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogénio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglocol); álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensioativos ou agentes molhantes (tais como, plurónicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos tais como, polissorbato 20, polissorbato, tritão, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes intensificadores de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes intensificadores de tonicidade (tais como, halogenetos de metais alcalinos, de um modo preferido, cloreto de sódio ou potássio, manitol sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Ver, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edição, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.
Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica ótima será determinada por um especialista na técnica dependendo, por exemplo, da via pretendida de administração, formato de distribuição e dosagem desejada. Ver, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Em determinadas formas de realização, essas composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa de eliminação in vivo das proteínas de ligação a antigénio divulgadas. Em determinadas formas de realização, o veículo ou transportador primário numa composição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. São ainda veículos exemplificativos solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina de soro. Em formas de realização específicas, as composições farmacêuticas compreendem tampão Tris de pH de cerca de 7,0-8,5 ou tampão acetato de pH de cerca de 4,0-5,5 e podem ainda incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em determinadas formas de realização, as composições de proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano podem ser preparadas para armazenamento misturando a composição selecionada possuindo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Mais, em determinadas formas de realização, a proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano pode ser formulada como um liofilizado utilizando excipientes apropriados, tal como sacarose.
As composições farmacêuticas podem ser selecionadas para distribuição parentérica. Em alternativa, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para distribuição através do trato digestivo, tal como oralmente. A preparação dessas composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da especialidade na técnica.
Os componentes de formulação estão presentes, de um modo preferido, em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Em determinadas formas de realização, os tampões são utilizados para manter a composição a pH fisiológico ou a um pH ligeiramente inferior, tipicamente dentro de uma gama de pH desde cerca de 5 a cerca de 8.
Quando é contemplada administração parentérica, as composições terapêuticas podem ser proporcionadas na forma de uma solução aquosa parentericamente aceitável, sem pirogénio compreendendo a proteína de ligação a CGRP R humano desejada num veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parentérica é água destilada estéril em que a proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano é formulada como uma solução isotónica, estéril, adequadamente conservada. Em determinadas formas de realização, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tais como microsferas injetáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que podem proporcionar libertação controlada ou prolongada do produto que pode ser distribuído por meio de injeção de depósito. Em determinadas formas de realização, pode também ser utilizado ácido hialurónico, possuindo o efeito de promover duração prolongada na circulação. Em determinadas formas de realização, podem ser utilizados dispositivos de distribuição de fármacos implantáveis para introduzir a proteína de ligação a antigénio desejada.
Determinadas composições farmacêuticas são formuladas para inalação. Em algumas formas de realização, as proteínas de ligação a antigénio de CGRP R humano são formuladas como um pó seco, inalável. Em formas de realização específicas, soluções de inalação de proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano podem também ser formuladas com um propulsor para distribuição de aerossol. Em determinadas formas de realização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar e métodos de formulação, portanto, são ainda descritos no Pedido de Patente Internacional N° PCT/US94/001875, que descreve distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas. Algumas formulações podem ser administradas oralmente. As proteínas de ligação a antigénio de CGRP R humano que são administradas neste modelo podem ser formuladas com ou sem veículos habitualmente utilizados na composição de formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Em determinadas formas de realização, uma cápsula pode ser concebida para libertar a parte ativa da formulação no momento no trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistémica é minimizada. Podem ser incluídos agentes adicionais para facilitar absorção da proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano. Podem também ser empregues diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes.
Algumas composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de uma ou uma pluralidade de proteínas de ligação a antigénio de CGRP R humano numa mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para o fabrico de comprimidos. Dissolvendo os comprimidos em água estéril ou outro veículo apropriado, podem ser preparadas soluções em forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem, mas não são limitados a diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para os especialistas na técnica, incluindo formulações envolvendo proteínas de ligação a antigénio de CGRP R humano em formulações de distribuição prolongada ou controlada. São também conhecidas do especialista na técnica técnicas para formular uma variedade de outros meios de distribuição prolongada ou controlada, tais como veículos de lipossoma, micropartícuias erodíveis ou esferas porosas e injeções de depósito. Ver, por exemplo, Pedido de Patente Internacional N° PCT/US93/00829, que descreve libertação controlada de micropartículas poliméricas porosas para distribuição de composições farmacêuticas. As preparações de libertação prolongada podem incluir matrizes de polímero semipermeáveis na forma de artigos com forma, e. g., películas ou microcápsulas. As matrizes de libertação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidos (como divulgado na Patente US N° 3773919 e Publicação de Pedido de Patente Europeia N° EP 058481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2_: 547-556), poli (2-hidroxietil-inetacrilato) (Langer et al., 1981, J.
Biomed. Mater. Res. L5 :167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetato etilenovinilico (Langer et al., 1981, supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicação de Pedido de Patente Europeia N° EP 133988). As composições de libertação prolongada podem também incluir lipossomas gue podem ser preparados por qualguer de vários métodos conhecidos na técnica. Ver, e. g., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8>2g 3688-3692; Publicação de Pedido de Patente Europeia N° EP 036676; EP 088046 e EP 143949.
As composições farmacêuticas utilizadas para administração in vivo são, tipicamente, proporcionadas como preparações estéreis. A esterilização pode ser conseguida por filtração através de membranas de filtração estéril. Quando a composição é liofilizada, a esterilização utilizando este método pode ser conduzida antes ou a seguir à liofilização e reconstituição. As composições para administração parentérica podem ser armazenadas em forma liofilizada ou numa solução. As composições parentéricas, de um modo geral, são colocadas num recipiente possuindo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasquinho de solução intravenosa possuindo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
Em determinadas formas de realização, as células que expressam uma proteína de ligação a antigénio recombinante como aqui divulgada é encapsulada para distribuição (ver, Invest. Ophthalmol Vis Sci 43:3292-3298, 2002 e Proc. Natl. Acad. Sciences 103:3896-3901, 2006).
Em determinadas formulações, uma proteína de ligação a antigénio possui uma concentração de, pelo menos, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/ mL ou 150 mg/mL. Algumas formulações contêm um tampão, sacarose e polissorbato. Um exemplo de uma formulação é uma contendo 50-100 mg/mL de proteína de ligação a antigénio, 5-20 mM de acetato de sódio, 5-10% p/v de sacarose e 0,002-0,008% p/v de polissorbato. Determinadas formulações, por exemplo, contêm 65-75 mg/mL de uma proteína de ligação a antigénio em tampão de acetato de sódio 9-11 mM, 8-10% p/v de sacarose e 0,005-0,006% p/v de polissorbato. O pH de algumas dessas formulações está na gama de 4,5-6. Outras formulações possuem um pH de 5,0-5,5 (e. g., pH de 5,0, 5,2 ou 5,4).
Quando a composição farmacêutica tiver sido formulada, pode ser armazenada em frasquinhos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou como um pó desidratado ou liofilizado. Essas formulações podem ser armazenadas numa forma pronta a usar ou numa forma (e. g., liofilizada) que é reconstruída antes de administração. São também proporcionados kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Determinados kits contêm um primeiro recipiente possuindo uma proteína seca e um segundo recipiente possuindo uma formulação aquosa. Em determinadas formas de realização, são proporcionados kits contendo seringas pré-cheias simples e multi-câmara (e. g., seringas líquidas e liosseringas). A quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica contendo proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano a empregar dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um especialista na técnica entenderá que os níveis de dosagem apropriados para tratamento variarão dependendo, em parte, da molécula distribuída, da indicação para qual a proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano está a ser utilizada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho de órgãos) e/ou estado (a idade e saúde geral) do doente. Em determinadas formas de realização, o clinico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo.
Uma dosagem típica pode variar de cerca de 1 yg/kg até cerca de 30 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Em formas de realização específicas, a dosagem pode variar de 10 yg/kg a cerca de 30 mg/kg, de um modo opcional, de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, em alternativa de 0,3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em algumas aplicações, a dosagem é de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. Em alguns casos, uma proteína de ligação a antigénio é doseada a 0,3 mg/kg, 0,5mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg ou 2 0 mg/kg. O esquema de dosagem em alguns regimes de tratamento é numa dose de 0,3 mg/kg qW, 0,5mg/kg qW, 1 mg/kg qW, 3 mg/kg qW, 10 mg/kg qW ou 20 mg/kg qW. A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano particular na formulação utilizada. Tipicamente, um clínico administra a composição até ser atingida uma dosagem que consegue o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo ou como uma infusão contínua por meio de um dispositivo de implantação ou cateter. As dosagens apropriadas podem ser verificadas através da utilização de dados de resposta de dose apropriados. Em determinadas formas de realização, as proteínas de ligação a antigénio podem ser administradas a doentes ao longo de um período de tempo extenso. A administração crónica de uma proteína de ligação a antigénio minimiza a resposta imunitária ou alérgica adversa comumente associada com proteínas de ligação a antigénio que não são totalmente humanos, por exemplo, um anticorpo desencadeado contra um antigénio humano num animal não humano, por exemplo, um anticorpo não totalmente humano ou anticorpo não humano produzido numa espécie não humana. A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, e. g., oralmente, através de injeção por vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de libertação prolongada ou por dispositivos de implantação. Em determinadas formas de realização, as composições podem ser administradas por injeção bólus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação. A composição também pode ser administrada localmente por meio de implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Em determinadas formas de realização, quando é utilizado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado e a distribuição da molécula desejada pode ser por meio de difusão, bólus de libertação temporizada ou administração continua.
Pode também ser desejável utilizar composições farmacêuticas de proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano ex vivo. Nesses casos, células, tecidos ou órgãos que foram removidos do doente são expostos a composições farmacêuticas de proteína de ligação a antigénio de CGRP R humano, após o qual as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta no doente.
Em particular, proteínas de ligação a antigénio de CGRP R humano podem ser distribuídas implantando determinadas células que foram geneticamente manipuladas, utilizando métodos tais como os aqui descritos, para expressar e secretar o polipéptido. Em determinadas formas de realização, essas células podem ser células animais ou humanas e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogénicas. Em determinadas formas de realização, as células podem ser imortalizadas. Noutras formas de realização, de modo a diminuir a hipótese de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar infiltração de tecidos envolventes. Em formas de realização adicionais, os materiais de encapsulação são, tipicamente, biocompatíveis, invólucros ou membranas poliméricas semi-permeáveis que permitem a libertação do(s) produto (s) de proteína, mas previnem a destruição das células pelo sistema imunitário do doente ou por outros fatores prejudiciais dos tecidos envolventes. EXEMPLO 1
GERAÇÃO DE RECEPTOR DE CGRP COMO ANTIGÉNIOS A. Clonagem molecular de CRLR e RAMP1 humano
Clonaram-se ADNc de CRLR humano (Acesso GenBank N° U17473; SEQ ID N°:1) e ADNc de RAMPl (Acesso GenBank N° AJ001014; SEQ ID N°:3) nos vetores de expressão celular de mamíferos pcDNA3.1-Zeo e pcDNA3.1-Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA), respetivamente, para transfecções de células HEK 293EBNA (Invitrogen) como descrito abaixo. 0 ADNc de hCRLR e ADNc de hRAMPl foram também clonados no vetor pDSRa24 (Kim, Η. Y. et al. J. Inv. Derm. Symp. Proc. (2007) 1_2: 48-49) para transfecções de células AM-1 CHO (Patente US Número 6210924). B. Linhas Celulares Estavelmente Transfectadas
1. Expressão estável de CGRP R humano em células 293EBNA
Cultivaram-se células HEK 293EBNA (disponíveis de ATCC ou Invitrogen) a uma densidade de l,5xl06 células por placa de 100 mm. Após 24 horas, as células foram co-transfectadas com 6 pg de ADN linearizados de huRAMPl/pcDNA3.1-Hyg e huCRLR/pcDNA3.1-Zeo com FuGene6 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções fornecidas por Invitrogen. Após dois dias, as células foram tripsinizadas e subcultivadas em meio de crescimento contendo 400 pg/mL de higromicina + 250 pg/mL de zeocina. Após duas semanas, as colónias resistentes a fármaco resultantes foram tripsinizadas e combinadas em agrupamentos. Os agrupamentos foram submetidos a quatro rondas de FACS que classificam um análogo de péptido CGRPg-37 marcado com Alexa 647 (descrito abaixo) . Os mais altos 5% de células que expressam foram recolhidas em cada ronda.
2. Expressão estável de CGRP R humano em células AM-1 CHO
Cultivaram-se células AM-1 CHO (uma variante adaptada a meios de crescimento sem soro a partir da linha celular deficiente em CHO DHFR descrita em Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. 77, 4216 (1980), a l,5xl06 células por placa de 100 mm. Após 24 horas, as células foram co-transfectadas com 4 pg de ADN linearizados cada de pDSRa24/huRAMPl e pDSRa24/huCRLR com FuGeneô (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções fornecidas pela Invitrogen. As células transfectadas foram tripsinizadas 2 dias após transfeção e cultivadas em meio de crescimento seletivo CHO DHFR contendo FBS dializado a 10% e sem suplemento de hipoxantina/timidina. Após 2 semanas, as colónias transfetadas resultantes foram tripsinizadas e agrupadas. Os agrupamentos foram submetidos a análise de classificação FACS. 3. Expressão estável de adrenomedulina (AMl) humana em
células HEK 293EBNA
Cultivaram-se células 293EBNA em placas de 100 mm a l,5xl06 células/placa em DMEM (glucose elevada) + FBS a 5% + aminoácidos não essenciais MEM a 1% + piruvato de sódio a 1%. No dia seguinte, as células foram co-transfectadas utilizando reagente de transfeção FuGENE 6 (Roche) com pcDNA3.1/zeocina/huCRLR mais pcDNA3.l/higromicina/huRAMP2. Ambas construções de ADN foram linearizadas com FspI. Após 48 horas, as células foram subcultivadas em discos de 100 mm a 3 densidades celulares (8xl05, 3,2xl05 e 8xl04 células/placa) em meio de crescimento contendo 200 pg/mL de zeocina. O meio foi alterado duas vezes por semana. Após uma semana, as placas foram alimentadas com meio contendo 200 pg/mL de higromicina + 200 pg/mL de zeocina. Após duas semanas, isolaram-se 96 colónias com anéis de clonagem. As colónias remanescentes foram recolhidas numa cultura de agrupamento simples. Os clones e agrupamentos foram ensaiados para a sua resposta a estimulação por agonista recetor ou forscolina. Vários clones mostraram uma boa resposta e um foi selecionado para utilização em experiências subsequentes.
4. Expressão estável de CGRP R de cino em células HEK 293EBNA
Cultivaram-se células 293EBNA em placas de 100 mm a l,5xl06 células/placa em DMEM (glucose elevada) + FBS a 5% + aminoácidos não essenciais MEM a 1% + piruvato de sódio a 1%. No dia seguinte, as células foram co-transfectadas utilizando FuGENE 6 com pcDNA3.1/zeocina/huCRLR mais pcDNA3.l/higromicina/huRAMP2. Ambas as construções de ADN foram linearizadas com FspI. Após 48 horas, as células foram subcultivadas em meio de crescimento contendo 200 pg/mL de zeocina + 400 pg/mL de higromicina a diluições de 1:20, 1:40, 1:100 e 1:200. O meio foi alterado duas vezes por semana. Após duas semanas, isolaram-se 96 colónias transfectadas com anéis de clonagem. Os clones foram ensaiados para a sua resposta a estimulação por ligando de CGRP. Vários clones mostraram níveis elevados de resposta semelhantes e um foi selecionado para utilização em experiências subsequentes. C. Isolamento de células de recetor de CGRP de expressão elevada
Foi sintetizado um péptido análogo a CGRPs-37 (Midwest Bio-Tech Inc. Fishers, IN) com a sequência abaixo: AC-WVTHRLAGLLSRSGGVVRCNFVPTDVGPFAF-NH2 (SEQ ID N°:9) O péptido foi marcado com Alexa 647-NHS seguindo as instruções do fabricante (Molecular Probes, Inc. Cat A 2006). 0 CGRPs-37 marcado com Alexa 647 mostrou coloração específica de células transfetadas com recetor de CGRP e não as células parentais não transfetadas e foi utilizado como o reagente FACS.
Os agrupamentos de células 293EBNA e AM-1 CHO transfectados com recetor de huCGRP (gerados como acima) foram classificadas repetidamente até quatro vezes em agrupamentos utilizando com péptido CGRPs-37 marcado com Alexa 647. As células de expressão elevada foram recolhidas em cada classificação, expandidas e, após a classificação final, congeladas em frasquinhos. As células AM-1 CHO/huCGRP R foram utilizadas para imunização como descrito abaixo e as células 293EBNA/huCGRP R foram utilizadas para titular soros de ratinho após imunização e em rastreios de ligação dos sobrenadantes de hibridoma. D. Geração de recetor de CGRP solúvel
Foram gerados polipéptidos de recetor de CGRP solúveis contendo os domínios extracelulares de N-terminal (ECD) de CRLR humano (SEQ ID N°:6) e RAMPl humano (SEQ ID N°:8) co-transfectando transientemente células 293 6E (Durocher, et al., Nucleic Acids Res. 30:E9 (2002)) com vetores contendo os ADNc correspondentes (SEQ ID N°:5 ou SEQ ID N°:7) como descrito abaixo. Os marcadores comummente utilizados (poliHis, Flag, HA e/ou Fc) foram empregues para facilitar a secreção e/ou purificação subsequente.
Preparou-se um ECD de CGRP R heterodimérico solúvel fundido a Fc por clonagem de PCR com os iniciadores apropriados para o vetor de expressão transiente pTT5 (Durocher, et al., supra). O ECD-Fc N-terminal de CRLR consistia do domínio extracelular de N-terminal de CRLR (SEQ ID N°:6) fundido a Fc de IgGl humano. O ECD-Fc de RAMPl contém o domínio extracelular de RAMPl (SEQ ID N°:8) fundido a Fc de IgGl humano. Em ambos os casos, existe um ligante que consiste de cinco glicinas consecutivas entre o domínio ECD e Fc. 0 recetor de CGRP heterodimérico solúvel foi expresso co-transfectando as duas construções como se segue. Transfectaram-se células 293-6E a lxlO6 células/mL em balões de agitação com 0,5 mg/L de ADN (hCRLR N-ter ECD-Fc/pTT5 e huRAMPl ECD-Fc/pTT5) com 3 mL de PEI/mg de ADN em meios Freestyle 293 (Invitrogen) . As células foram cultivadas em suspensão em meio de expressão Freestyle 293 suplementado com Pluronic F68 a 0,1% e 50 yg/mL de Geneticina durante 7 dias e recolhidas para purificação.
As purificações a partir de meios condicionados ("CM") foram realizadas tamponando os CM com a adição de 50 mM de Tris, 400 mM de citrato de sódio e ajustando o pH a 8,5. O CM tamponado foi, em seguida, passado sobre uma coluna de afinidade de Proteína A equilibrada em 50 mM de Tris, 400 mM de citrato de sódio e pH ajustado a pH 8,5. A coluna de Proteína A foi lavada com PBS e a proteína de fusão Fc eluída com 0,1 N de HOAc. O pico eluído continha ambos os componentes CRLR e RAMPl quando testado por transferência de western utilizando anticorpos individuais específicos para CRLR ou RAMPl. Mais, a LC-MS e sequenciação de N-terminal confirmaram a presença de heterodímero CRLR:RAMPl e homodímero CRLR:CRLR em, aproximadamente, razão (2:3). Este "recetor de CGRP solúvel" foi mostrado competir em ligaçãode CGRPs-37 marcado com Alexa647 ao recetor de CGRP que expressa células recombinantes na análise FMAT, embora este falhe em ligar-se a ligando de CGRP como determinado utilizando teste Biacore. O material foi utilizado como um imunogénio como descrito no Exemplo, apesar, inter alia, da sua heterogeneidade e falta de ligação de ligando de CGRP. E. Geração de extratos de membrana de células que expressam recetor de CGRP recombinante
Os extratos de membrana foram preparados a partir de células que expressam recetor de CGRP utilizando um método descrito por Bossé, R. et al., (Journal of Biomolecular
Screening, 3(4): 285-292 (1998)). Em resumo, sedimentaram-se aproximadamente 5 gramas de pasta celular em 50 mL de PBS a 3000 rpm durante 10 min a 4 °C e ressuspenderam-se em 30 mL de tampão de lise frio (HEPES 25 mM, pH 7,4, MgCl2 3 mM mais um comprimido cocktail inibidor de protease Roche/50 mL). O lisado foi homogeneizado com Glas-Col (homogeneizador de vidro Teflon) com ~20 pulsações a 5000 rpm e girou num rotor JA21 a 20000 rpm durante 15 min a 4 °C. Este processo foi repetido mais uma vez e o sedimento final foi ressuspenso em ~l-5 mL de tampão de 'sedimento final' (HEPES 25 mM, pH 7,4, MgCl2 3 mM, 10% (p/v) de sacarose mais um comprimido cocktail inibidor de protease
Roche/50 mL) . Os extratos de membrana foram cortados passando através de agulhas 16 G e 25 G 2-3 vezes. A concentração de proteína de membrana total foi determinada com um Ensaio de
Proteína BCA de Microplaca (Pierce). EXEMPLO 2
GERAÇÃO DE ANTICORPOS PARA RECEPTOR DE CGRP A. Imunização
Foram conduzidas imunizações utilizando as seguintes formas de antigénios de recetor de CGRP, preparados como descrito no Exemplo 1: (i) transf ectantes AM-1 CHO que expressam CRLR e RAMPl humano de comprimento total na superfície celular, obtidos co-transf ectando células CHO com ADNc de CRLR de comprimento total humano (SEQ ID N°:l) que codificam um polipéptido possuindo a sequência SEQ ID N°:2 e ADNc de RAMPl (SEQ ID N°:3) que codificam um polipéptido possuindo a sequência SEQ ID N°:4 (ii) extrato de membrana das células descritas em (i) acima; e (iii) recetor de CGRP solúvel obtido co-expressando e purificando o ECD N-terminal de CRLR (SEQ ID N°:6) e o domínio extracelular (ECD) de RAMPl (SEQ ID N°:8) como descrito no
Exemplo 1.
Imunizaram-se animais XENOMOUSE com proteína de recetor de CGRP solúvel purificada e membranas de CGRP R purificadas preparadas a partir de células AM-1 CHO que expressam, de modo estável, CGRP R do mesmo modo utilizando doses de 10 yg/ratinho e 150 yg/ratinho respetivamente. As membranas de CGRP foram preparadas utilizando métodos descritos acima.
Foram administrados reforços subsequentes a doses de dez yg/ratinho de CGRP R solúvel ou 75 yg de membranas de CGRP R purificadas. Foram também imunizados animais XENOMOUSE com células que expressam o recetor de CGRP utilizando doses de 3,4 x 106 células transfectadas de CGRP R/ratinho e os reforços subsequentes foram de 1,7 x 106 células transfectadas de CGRP R/ratinho. Os locais de injeção utilizados foram combinações de base de cauda subcutânea e intraperitoneal. Foram realizadas imunizações de acordo com métodos divulgados na Patente U.S. Número 7064244, apresentada em 19 de fevereiro de 2002. Os adjuvantes TiterMax Gold (Sigma; cat. N° T2684), Alum (E.M. Sergent Pulp e Chemical Co., Clifton, NJ, cat. N° 1452-250) foram preparados de acordo com as instruções do fabricante e misturados numa razão 1:1 de emulsão de adjuvante para solução de antigénio.
Foram recolhidos soros 4-6 semanas após a primeira injeção e foram determinados títulos específicos por coloração FAC de células 293EBNA que expressam recetor de CGRP recombinante.
Foram imunizados ratinhos com células/membranas que expressam células de CGRP R de comprimento total ou domínio extracelular de CGRP R solúvel, com uma gama de 11-17 imunizações durante um período de aproximadamente um a três meses e meio. Os ratinhos com o maior título de soros foram identificados e preparados para geração de hibridoma. As imunizações foram realizadas em grupos de múltiplos ratinhos, tipicamente dez. Os nódulos linfáticos popliteais e inguinais e tecidos de baço foram, tipicamente, agrupados a partir de cada grupo para gerar fusões. B. Preparação de Anticorpos Monoclonais
Os animais que apresentam títulos adequados foram identificados e foram obtidos linfócitos a partir de drenagem de nódulos linfáticos e, se necessário, agrupados para cada coorte. Os linfócitos foram dissociados de tecido linfoide num meio adequados (por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco; DMEM; obtido de Invitrogen, Carlsbad, CA) para libertar as células dos tecidos e suspendidos em DMEM. Foram selecionadas e/ou expandidas células B utilizando um método adequado e fundidas com parceiro de fusão adequado, por exemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma não secretor (American Type Culture
Collection CRL 1580; Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) .
Os linfócitos foram misturados com células parceiras de fusão a uma razão de 1:4. A mistura celular foi gentilmente sedimentada por centrifugação a 400 x g durante 4 minutos, o sobrenadante decantado e a mistura celular gentilmente misturada utilizando uma pipeta de 1 mL. A fusão foi induzida com PEG/DMSO (polietilenoglicol/dimetilssulfóxido; obtido de Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 mL por milhão de linfócitos) . O PEG/DMSO foi lentamente adicionado com agitação gentil ao longo de um minuto seguido por um minuto de mistura. O IDMEM (DMEM sem glutamina; 2 mL por milhão de células B) , foi, em seguida, adicionado ao longo de 2 minutos com agitação gentil, seguido por IDMEM adicional (8 mL por milhão de células B) que foi adicionado ao longo de 3 minutos.
As células fundidas foram gentilmente sedimentadas (400 x g 6 minutos) e ressuspensas em 20 mL de meios de Seleção (por exemplo, DMEM contendo Azasserina e Hipoxantina [HA] e outros materiais suplementares como necessário) por milhão de células B. As células foram incubadas durante 20-30 minutos a 37 °C e, em seguida, ressuspensas em 200 mL de meios de Seleção e cultivadas durante três a quatro dias em balões T175 antes de colocar em placas de 96 poços.
As células foram distribuídas em placas de 96 poços utilizando técnicas padrão para maximizar a clonalidade das colónias resultantes. Após vários dias de cultura os sobrenadantes de hibridoma foram recolhidos e submetidos a ensaios de rastreamento como detalhados nos exemplos abaixo, incluindo confirmação de ligação a recetor de CGRP humano, identificação de anticorpos de bloqueio por um ensaio de competição de ligação de ligando e avaliação de reatividade cruzada com outros recetores relacionados com o recetor de CGRP (por exemplo, recetor de Adrenomedulina humano). Foram ainda selecionadas células positivas e submetidas a técnicas de clonagem e subclonagem padrão. As linhas clonais foram expandidas in vitro e os anticorpos humanos secretados obtidos para análise. C. Análise de Sequência de Anticorpos Monoclonais Selecionados
Os anticorpos monoclonais subclonados selecionados foram sequenciados utilizando métodos RT-PCR padrão. A Tabela 2A mostra as sequências de aminoácidos das cadeias leves de anticorpos exemplificativos aqui divulgados. A Tabela 2B mostra as sequências de aminoácidos das cadeias pesadas de anticorpos exemplificativos aqui divulgados.
As sequências de aminoácidos correspondentes a regiões de CDR de anticorpos sequenciados foram alinhadas e os alinhamentos foram utilizados para agrupar os clones por similaridade.
Os alinhamentos de sequências de CDR de cadeia leve de clones possuindo cadeias leves capa e determinadas sequências consenso correspondentes são mostradas nas Fig. 3A e 3B.
Os alinhamentos de sequências de CDR de cadeia leve de clones possuindo cadeias leves lambda e determinadas sequências consenso correspondentes são mostradas na Fig. 4.
Os alinhamentos de sequências de CDR de cadeia pesada de anticorpos exemplificativos aqui divulgados e determinadas sequências consenso correspondentes são mostradas nas Fig.. 5A, 5B, 5C, 5D e 5E.
Determinadas sequências consenso de CDR de cadeia pesada exemplificativas aqui divulgadas são mostradas na Fig. 5F. EXEMPLO 3
IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS DE RECEPTOR DE CGRP
A. Seleção de anticorpos de ligação específicos de recetor de CGRP por FMAT
Após 14 dias de cultura, rastrearam-se sobrenadantes de hibridoma para anticorpos monoclonais específicos de CGRP R por Tecnologia de Ensaio de Microvolume Fluorométrico (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os sobrenadantes foram rastreados contra células AM-1 CHO huCGRP R ou células HEK 293 recombinantes que foram transfectadas com CGRP R humano e contra-rastreadas contra células HEK293 parentais (preparadas como descrito no Exemplo 1).
Em resumo, as células em meios Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram cultivadas em placas FMAT de 384 poços num volume de 50 yL/poço a uma densidade de aproximadamente 4000 células/poço para os transfetantes estáveis e a uma densidade de aproximadamente 16000 células/poço para as células parentais e as células foram incubadas, de um dia para o outro, a 37 °C. Em seguida, adicionaram-se 10 pL/poço de sobrenadante e as placas foram incubadas durante, aproximadamente, uma hora a 4 °C, após a qual se adicionaram 10 pL/poço de anticorpo secundário IgG-Cy5 anti-humano (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) a uma concentração de 2,8 pg/mL (400 ng/mL concentração final). As placas foram, em seguida, incubadas durante uma hora a 4 °C e a fluorescência foi lida utilizando um digitalizador macroconfocal FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Para contra rastreamentos, as células AM-1 CHO parentais ou células HEK 2 93 foram cultivadas do mesmo modo e os sobrenadantes rastreados por FMAT nestas células em paralelo para diferenciar e eliminar ligação de hibridomas a proteínas celulares, mas não ao recetor de CGRP.
B. Identificação de anticorpos de bloqueio por ensaio de competição de ligação a ligando através de FMAT
Desenvolveu-se um método de competição de ligação de ligando para identificar anticorpos (nos sobrenadantes de hibridoma) que liga o recetor de CGRP e bloqueia liqação ao ligando de CGRP. Prepararam-se placas de 384 poços (Corning Costar, Cat: N°3712) com 5000 células AM-1 huCGRP R Grupo 2 e 20000 células CHO-S não transfectadas em cada poço. Adicionaram-se 20 pL de sobrenadante de hibridoma de anti-CGRP R a cada poço e as placas foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, adicionaram-se 10 pL de péptido Alexa647-CGRPs-37 2,8 yg/mL a cada poço e as placas foram incubadas durante 3 horas adicionais à temperatura ambiente. A quantidade de Alexa647-CGRPs-37 ligado às células foi ensaiado num Sistema de Deteção Celular FMAT 8200 (Applied Biosystems) . Os dados de salda foram ambos um valor de FLl numérico de intensidade de sinal (valores de FLl superiores indicam intensidade de sinal superior) e também uma imagem das células.
As experiências incluíram sobrenadantes de hibridoma de controlo negativo. O valor de FLl médio observado nestas experiências de controlo negativo foi adotado como o sinal máximo possível para o ensaio. Os sobrenadantes experimentais foram comparados a este sinal máximo e foi calculada uma percentagem de inibição para cada poço (% de inibição = (1-(FL1 do sobrenadante de hibridoma anti-CGRP R/Sinal FLl máximo)).
Uma visão global dos dados é mostrada na Fig. 6. Nesta experiência, 1092 sobrenadantes anti-CGRP R foram testados utilizando o ensaio de ligando de recetor. Os dados foram classificados utilizando a inibição de percentagem média. Noventa sobrenadantes possuíam inibição média >25%, 31 destes eram >50% e 7 eram >70% de inibição média.
Um conjunto de dados abreviado é mostrado na Tabela 10, abaixo. As amostras ID N° 1-5 ilustram exemplos de sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R que inibiram a ligação de péptido Alexa647-CGRP8-37 ao recetor de CGRP e as amostras ID N° 536 - 540 ilustram exemplos de sobrenadantes de hibridoma anti-CGRP R que não inibiram a ligação do péptido Alexa647-CGRP8-37 ao recetor de CGRP.
Tabela 10 - Dados exemplificativos de ensaio de competição de ligação de ligando FMAT
(continuação)
Com base nos ensaios de competição de ligação, selecionaram-se aproximadamente 30 sobrenadantes para caracterização adicional. EXEMPLO 4 ATIVIDADE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE BLOQUEIO ESPECÍFICO PARA O RECEPTOR CGRP NUM ENSAIO FUNCIONAL DE AMPc A. atividade de anticorpo de recetor de CGRP.
Rastrearam-se anticorpos do recetor de CGRP selecionados num ensaio de AMPc mediado por recetor de CGRP in vitro para determinar potência intrínseca. O ensaio de AMPc in vitro empregou uma linha celular derivada de neuroblastoma humano (SK-N-MC; Spengler, et al., (1973) In Vitro 8: 410) obtido de ATCC (Número ATCC HTB-10; "células HTB-10") . As células HTB-10 expressam CRLR e RAMP1, que formam o recetor de CGRP (L. M. McLatchie et al.r 1998). Uma linha celular 293EBNA que expressa CGRP R de cinomolgo recombinante foi gerada como descrito no Exemplo 1 e uma linha celular de rato L6 que expressa recetor de CGRP de rato foi obtida da ATCC (CRL-1458). 0 kit de ensaio de AMPc LANCE (PerkinElmer, Boston, MA) foi utilizado no rastreamento. Os ensaios foram realizados em placas brancas de 96 poços num volume total de 60 yL. Em resumo, no dia do ensaio, as células HTB-10 congeladas foram descongeladas a 37 °C, as células foram lavadas uma vez com tampão de ensaio e adicionaram-se 12 yL de suspensão celular contendo 10000 células misturadas com anticorpo anti-AMPc marcado com Alexa em 96 placas brancas com metade da área. Após adicionar 12 yL de anticorpo de recetor de CGRP, a mistura foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, adicionaram-se 12 yL de agonista do recetor de CGRP humano α-CGRP (concentração final 1 nM) e incubou-se ainda durante 15 min à temperatura ambiente. Após estimulação de α-CGRP humano, adicionaram-se 24 yL de mistura de deteção e incubaram-se durante 60 minutos à temperatura ambiente e as placas foram lidas no instrumento Envision (PerkinElmer, Boston, MA) a Em665nM. Os dados foram processados e analisados por Prizm (GraphPad Software Inc.) ou ActivityBase (IDBS). A Fig. 7A mostra dados exemplificativos obtidos como descrito acima utilizando o recetor de hCGRP que expressa a linha celular HTB-10 para três anticorpos - 3C8, 13H2 e 1E11. Os dados são representados em gráfico como percentagem sobre o controlo ("POC") em uma função de concentração de anticorpo (3C8, 13H2 ou 1E11) e estão ajustados com curvas de regressão não linear padrão para produzir os valores IC50 mostrados no fundo da figura. B. Ausência de atividade de anticorpo em recetores relacionados.
As células que expressam os recetores relacionados AMl (células HEK 293 que expressam hCRLR+hRAMP2; D. R. Poyner, et al., Pharmacological review, 54:233-246, 2002), AM2 (células CHO que expressam hCRLR+hRAMP3; D. R. Poyner, et al., Pharmacological review, 54:233-246, 2002) ou recetor AMYl de amilina humana (células MCF-7 hCTR+hRAMPl; Wen-Ji Chen, et al., Molecular pharmacology, 52: 1164-1175, 1997) foram utilizadas para determinar a seletividade dos anticorpos testados. A linha celular HEK 293 que expressa AMl foi gerada como descrito no Exemplo 1, acima. A linha celular CHO que expressa AM2 foi comprada de EuroScreen (agora PerkinElmer, Inc.); e a linha celular MCF-7 que expressa recetor AMYl de amilina humano (Zimmermann, et al., Journal of Endocrinology, 423-431, 1997), foi obtida da ATCC (HTB-22). Os resultados exemplificativos, representados graficamente como descrito acima, são mostrados nas Fig.. 7B (células hAMl-HEK) , 7C (células hAM2-CH0) e 7D (células hAMY-MCF-7). Note-se que nenhum dos anticorpos testados possuía atividade inibidora significativa contra os recetores hAMl, hAM2 ou hAMYl ao longo da gama testada.
Foram realizadas experiências semelhantes utilizando células HEK recombinantes que expressam recetores de CGRP de cinomolgo e células L6 de rato que expressam recetor de CGRP de rato (ATCC) . Os dados destes estudos, assim como dados de IC50 adicionais obtidos como descrito na parte A deste Exemplo, são mostrados nas colunas "AMPc" na Tabela 11, abaixo. Note-se que os valores de IC50 contra AMPc os recetores de CGRP humano e cino estão na gama nanomolar, enquanto atividades contra recetor de CGRP de rato e recetores humanos AMI, AM2 e AMYl, assim como células MCF7 que expressam calcitonina (dados não mostrados) são todos superiores a 1 micromolar. A diferença no IC50 entre recetor de CGRP humano e os recetores humanos AMI, AM2, amilina e calcitonina ilustra a elevada seletividade destes anticorpos para o recetor de CGRP em relação aos recetores relacionados formados em parte dos mesmos componentes de recetor. 0 IC50 obtido utilizando recetores de CGRP humano e cinomolgo eram semelhantes, enquanto os anticorpos testados não aparentaram reagir cruzado com recetor de CGRP de rato.
Tabela 11
EXEMPLO 5 ENSAIO DE LIGAÇÃO A CGRP RADIOLIGANDO PARA ANTICORPOS DE BLOQUEIO DE RECEPTOR DE DETERMINAÇÃO Ki
Utilizaram-se CGRP marcados com 125I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e membranas celulares de células HTB-10 (PerkinElmer Inc., Waltham, Massachusetts) para experiência de ligação a radioligando na presença de várias concentrações dos anticorpos de teste para determinar os valores Ki correspondentes. 0 ensaio de ligação a CGRP foi configurado à temperatura ambiente em placas de 96 poços contendo: 110 pL de tampão de ligação (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgSCh 5,0 mM, BSA a 0,2% (Sigma), 1 comprimido de Complete™/50 mL de tampão (um inibidor de protease)); 20 pL de composto de teste (10X); 20 pL de 125I-haCGRP (Amersham Biosciences; 10X); e 50 pL de suspensão de membrana celular de neuroblastoma (HTB-10) humano (10 pg por poço, PerkinElmer) . As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas com agitação a 60 rpm e, em seguidaos conteúdos de cada poço foram filtrados sobre placas de filtro de 96 poços de GF/C tratadas com 0,5% de polietileneimina (PEI) (durante, pelo menos, uma hora) . As placas de filtro de GF/C foram lavadas seis vezes com Tris 50 mM gelado, pH 7,5 e secas num forno a 55 °C durante 1 hora. Os fundos das placas de GF/C foram, em seguida, vedados. Adicionaram-se 40 pL de Microscint™ 20 a cada poço, os topos das placas de GF/C foram vedados com TopSeal™-A (uma película de vedação adesiva por pressão) e as placas de GF/C foram contadas com TopCount NXT (Packard). Os dados foram analisados utilizando Prizm (GraphPad Software Inc.)
Os dados exemplificativos e valores Ki obtidos utilizando anticorpos 3C8, 12H2 e 1E11 são mostrados na Fig. 8. A coluna mais à direita na Tabela 11, acima, lista os valores Ki dos mAbs indicadas no ensaio de ligação de competição de CGRP radiomarcado com 125I a membranas celulares de HTB-10. Os dados demonstram que os anticorpos do recetor de CGRP foram altamente competitivos (todos na gama sub-nanomolar) contra ligação a CGRP. EXEMPLO 6
ENSAIO DE LIGAÇÃO FACS PARA DETERMINAÇÃO DE KD DE ANTICORPOS DE BLOQUEIO DE RECEPTOR DE CGRP
As afinidades de mAbs anti-CGRP R para recetores de CGRP expressos em células foram determinadas utilizando um método FACS. Em resumo, células que expressam AM-1 CHO huCGRP R, preparadas como descrito acima, foram colocadas em placas de 96 poços a densidades de 16000 ou 160000 células por poço em meio DMEM contendo 10% FBS, NEAA, PS, L Glut, NaPyr e 0,05% de azido de sódio. Os anticorpos do recetor de CGRP foram titulados no mesmo meio de 50 nM a 1 pM e incubados com células. Após uma incubação de um dia para o outro a 4 °C num volume total de 12 0 yL, num agitador de placas, as células foram lavadas 2X com PBS+FBS a 2%, centrifugando e descartando o sobrenadante a cada vez. Adicionaram-se, em seguida, 100 yL/poço de G anti-Hu Fc Cy5 (5 yg/mL; Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, EUA) contendo 7AAD (5 yL/poço) e incubaram-se a 4 °C durante 40 min. As células foram lavadas 2X com PBS+2%FBS, centrifugando e descartando o sobrenadante a cada vez. Adicionaram-se, em seguida, 100 yL de tampão PBS+FBS a 2% e analisaram-se por FACS para determinar a média geométrica de ligação. A Kd foi calculada utilizando software KinExA tomando a média geométrica negativa a cada concentração de anticorpo como a quantidade de Ab livre presente Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013. Os dados obtidos nas duas diferentes concentrações celulares foram analisados por análise n-curva para determinar a Kd e o intervalo de confiança a 95% como descrito em Rathanaswami, et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 334 (2005) 1004-1013.
Os dados exemplificativos com ajustes de curva correspondentes são mostrados na Fig. 10 para o anticorpo 12G8.2. Os dados de oito anticorpos de bloqueio gerados em suporte da presente divulgação são mostrados na Tabela 12. Um dos anticorpos (3B6) foi analisado em dois dias diferentes. A razão de 0, 9 obtida para a experiência com células 16K indica que a concentração de antigénio é prevista como 0,9X a Kd e assim a curva obtida por esta experiência é uma curva controlada de Kd. Pode ser entendido que os valores de Kd obtidos neste modo foram na gama nanomolar digito único baixo para todos os anticorpos testados.
Tabela 12
EXEMPLO 7
LIGAÇÃO SEQUENCIAL DE ANTICORPOS DE BLOQUEIO DO RECETOR DE CGRP POR COMPETIÇÃO DE LIGAÇÃO BICORE
As análises Biacore (Karlsson, R. et al., Methods; A
Companion to Methods in Enzymology, 6: 99-110 (1994) foram realizadas como se segue. A imobilização de anticorpos anti-recetor de CGRP à superfície do chip sensor CM5 foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um fluxo contínuo de HEPES 10 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 3,4 mM, 0,005% P-20, pH 7,4 (tampão HBS-EP). Os grupos carboxilo nas superfícies de chip sensor foram ativadas injetando 60 pL de uma mistura contendo 0,2 M de N-etil-N'
(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e 0,05 M N-hidroxisuccinimida (NHS). As superfícies específicas foram obtidas injetando 180 pL de anticorpo anti-recetor de CGRP diluído em acetato 10 mM, pH 4,0 a uma concentração de 30 pg/mL. Os grupos reativos em excesso nas superfícies foram desativados injetando 60 pL de 1 M de etanolamina. Os níveis imobilizados finais para os anticorpos individuais foram os seguintes:
Anticorpo Unidades de Ressonância (RU) 11D11 -5,900 3B6 -7,200 4H6 -8,000 12G8 -7,800 9F5 -6,600 34E3 -3,700
Uma superfície de referência acoplada simulada, branca foi também preparada no chip sensor. 0 recetor de huCGRP solúvel a uma concentração de 100 nM foi capturado nos chips sensores possuindo um dos seis anticorpos imobilizados referenciados acima (11D11, 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 ou 34E3) . Cada um dos 20 anticorpos anti-CGRP R teste foi, em seguida, injetado sobre o recetor de huCGRP capturado. Se o anticorpo injetado reconheceu um epítopo distinto em relação ao reconhecido pelo anticorpo imobilizado, uma eventual segunda ligação seria observada. Se os anticorpos reconhecem o mesmo epítopo ou muito semelhantes, apenas a ligação do recetor de huCGRP seria observada.
Os dados exemplificativos obtidos utilizando um chip sensor revestido com anticorpo imobilizado 3B6 são mostrados na Fig. 9A. Os quatro vestígios são dados obtidos utilizando os anticorpos 1E11, 4E4, 2E7 e 12G8 na solução injetada. Os acontecimentos durante a experiência são representados por letras, com "A" correspondendo a injeção de huCGRP R-Fc, "B" correspondendo a fim da injeção de huCGRP R-Fc, "C" correspondendo a injeção de segundo mAb e "D" correspondendo a fim da segunda injeção de mAb e início da lavagem de tampão. Note-se que não existe indicação de qualquer sinal de ligação de qualquer do anticorpo injetado na superfície de anticorpo imobilizado, indicando que os quatro anticorpos injetados reconhecem aparentemente o(s) mesmo(s) epítopo(s) ou muito semelhantes como o anticorpo imobilizado. Observaram-se essencialmente os mesmos resultados com todos os anticorpos de bloqueio testados, lavados sobre cada das cinco superfícies de anticorpo neutralizante imobilizado, indicando que todos os anticorpos de bloqueio de recetor de anti-huCGRP testados reconhecem o(s) mesmo(s) epítopo(s) ou muito semelhantes e fortemente sobreposto(s).
Pelo contrário, como mostrado em parte nas Fig. 9B, 9C e 9D, os quatro anticorpos específicos de recetor de CGRP, de não bloqueio testados 32H8, 33B5, 33E4 e 34E3 falharam a competir com 11D11 (dados não mostrados), 3B6 (Fig. 9B), 12G8 (Fig. 9C) e 9F5 (dados não mostrados) apesar de 34E3 estar apto para competir com 4H6 (Fig. 9D) e fracamente com 32H7 (dados não mostrados). 32H8 falhou a competir com 3B6, 4H6, 12G8, 9F5 ou o anticorpo de não bloqueio 34E3, mas 33B5 e 33E4 puderam competir com o anticorpo de não bloqueio 34E3. Os dados para todos os anticorpos de bloqueio e de não bloqueio estão resumidos na Tabela 13, abaixo. "NB" indica sem ligação; "+" indica ligação significativa; e "Fraco" indica ligação fraca.
Tabela 13
Como pode ser entendido a partir dos dados, todos os anticorpos de bloqueio ou neutralizantes testados ligaram-se à mesma região como os cinco anticorpos de bloqueio imobilizados; i. e., todos os anticorpos neutralizantes testados ligaram-se à mesma região da molécula de CGRP R. Por outro lado, os anticorpos de não bloqueio, de um modo geral, não competiram com os anticorpos de bloqueio imobilizados, indicando que anticorpos
de não bloqueio se ligam primariamente a uma região de CGRP R diferente. EXEMPLO 8
LIGAÇÃO DE ANTICORPOS DO RECEPTOR DE CGRP AO RECETOR DE CGRP SOLÚVEL EM TRANSFERÊNCIA DE WESTERN
Testaram-se três anticorpos de bloqueio de recetor de CGRP representativos utilizando transferências de Western para ligação a uma proteína de fusão muFc de recetor de CGRP-muFc solúvel.
Utilizaram-se 100 ng de muFc de CGRP R-muFc purificado (produzida e purificada como descrito acima para o huFc de CGRP-muFc que R exceto o Fc de ratinho e o ligante entre ECD de RAMPl ou CRLR e muFc foi alterado para "GGGGGVDGGGGGV" (SEQ ID N° :213)) foi diluído em PBS com tampão amostra PAGE com beta-mercaptoetanol (βΜΕ) (reduzido) ou sem (não reduzido) à concentração de 13,3%. A amostra contendo βΜΕ foi, em seguida, aquecida até ebulição durante 4 min. As amostras reduzidas e não reduzidas foram carregadas sobre géis de 4-20% Tris-glicina (Invitrogen) separados com pistas alternadas de proteína de CGRP R-Fc e marcadores de peso molecular (Invitrogen) . Os géis foram eletrotransferidos sobre filtros de nitrocelulose (Invitrogen) de 0,2 ym. As transferências foram lavadas com solução salina tamponada com Tris + 1% de Tween 20 (TBST) e, em seguida, bloqueadas com TBST + 5% leite seco em pó durante 30 min. As transferências foram cortadas em tiras ao longo das pistas de marcadores de peso molecular. Incubou-se uma tira, cada com de CGRP R-muFc reduzida e não reduzida com anticorpos de huCGRP R purificados 4E4, 9F5 ou 3B6 (diluição 1:500 em TBST + 5% leite), N-20 anti-huRAMPl de cabra (1:500; Santa Cruz
Biotechnology, Inc), anti-IgG-Fc-HRP de ratinho de coelho (1:10000) (Pierce) ou anti-IgG-Fc-HRP humano de cabra (1:10000) (Pierce) . As transferências foram incubadas com os anticorpos durante uma hora seguido por 3xl0min de lavagens com TBST + 1 % leite. As transferências tratadas com os anticorpos huCGRP R foram, em seguida, incubadas com anti-IgG-Fc-HRP de ratinho de coelho (1:10000 em TBST + 1% leite) e as transferências tratadas com anti-huRAMPl (anticorpo policlonal de cabra anti-RAMPl N-20, Santa Cruz Biotech, CA) foram incubadas com anti-IgG-Fc-HRP de ratinho de coelho (1:10000) durante 20 min. As transferências foram lavadas 3xl5min com TBST. As transferências de anticorpo huCGRP R e anti-huRAMPl foram tratadas com reagente de Pierce Supersignal West Pico Detection e as transferências de anti-IgG-Fc-HRP de humano e anti-ratinho foram tratadas com Reagente Pierce Standard Detection (1 min.)· As transferências foram, em seguida, expostas com película de raios X MS Kodak Biomax.
Todos os três anticorpos de recetor de CGRP, 4E4, 9F5 e 3B6 estavam aptos para detetar CGRP R_muFc solúvel (contendo ECD de RAMPl e ECD de CRLR) sob estado não reduzido, mas não sob estado reduzido indicando que o epítopo de ligação destes anticorpos de CGRP R era conformacional e sensível às ligações dissulfureto (3 pares em ECD de RAMPl e 3 pares em ECD N-ter de CRLR) . Pelo contrário, o anticorpo anti-RAMPl comercial N-20 (Santa Cruz Biotech) ligou RAMPl sob condições reduzidas e não reduzidas indicando que o local de ligação para anticorpo N-20 era primariamente linear e não sensível a ligações dissulfureto. EXEMPLO 9
LIGAÇÃO DE ANTICORPOS DE BLOQUEIO DE RECETOR DE CGRP A RECETORES QUIMÉRICOS
Utilizaram-se recetores de CGRP formados de RAMPl nativo com CRLR quimérico ou CRLR nativo com RAMPl quimérico, para identificar sequências de recetor de CGRP envolvidas em ligação de anticorpo. Uma vez que todos os anticorpos de bloqueio de recetor de CGRP humano testados falharam ao mostrar atividade funcional para o recetor de CGRP de rato, os componentes quiméricos continham regiões de sequência de rato numa sequência humana antecedente. As seguintes quimeras foram geradas para análise de ligação por FACS: RAMPl quimera N° 1 (Q28 a A34): SEQ ID N°:217
Os resíduos de aminoácidos Q2 8 a A34 no RAMPl humano foram substituídos com as sequências correspondentes de RAMPl de rato. Esta extensão incluiu cinco resíduos de aminoácidos que são diferentes entre RAMPl humano e de rato. RAMPl quimera N° 2 (Q43 a E53): SEQ ID N°:218
Os resíduos de aminoácidos Q43 a E53 no RAMPl humano foram substituídos com as sequências correspondentes de RAMPl de rato. Esta extensão incluiu seis resíduos de aminoácidos que são diferentes entre RAMPl humano e de rato. RAMPl quimera N° 3 (R67 a E78): SEQ ID N°:219
Os resíduos de aminoácidos R67 a E7 8 no RAMPl humano foram substituídos com as sequências correspondentes de RAMPl de rato. Esta extensão incluiu sete resíduos de aminoácidos que são diferentes entre RAMPl humano e de rato. CRLR quimeraN0 1 (L24 a Q33); SEQ ID N°:223
Os resíduos de aminoácidos L24 a Q33 no CRLR humano foram substituídos com as sequências correspondentes CRLR de rato.
Esta extensão incluiu oito resíduos de aminoácidos que são diferentes entre humano e rato CRLR. A Fig. 11 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos de RAMPl de macaco cinomolgo (SEQ ID N°:215), humano (SEQ ID N°:4), rato (SEQ ID N°:214) e macaco resus (SEQ ID N°:216), em conjunto com sequências de RAMPl quimera N° 1 (SEQ ID N° :217), quimera N° 2 (SEQ ID N° :218) e quimera N° 3 (SEQ ID N°: 219) . As Fig. 12A e 12B mostram um alinhamento de sequências de aminoácidos de CRLR de humano (SEQ ID N°:2), macaco cinomolgo (SEQ ID N°:221), macaco resus (SEQ ID N°:222), rato (SEQ ID N°:220) e, assim como a sequência de aminoácidos de CRLR quimera N° 1 (SEQ ID N°:223).
As células 293-6E foram transientemente transfectadas com construções de ADN de quimera CGRP R (CRLR wt + RAMPl Q28-A34; CRLR wt + RAMPl Q43-E53; CRLR wt + RAMPl R67-E78; CRLR L24-Q33 + RAMP wt; CRLR wt + RAMPl wt ; vetor de controlo pTT5) . As células foram recolhidas após 72 h, lavadas com PBS + BSA a 0,5% e contadas. Cada linha celular trasnfetor foi ressuspensa a uma diluição de 5xl05 células por 100 yL de PBS/BSA. 100 yL de suspensão celular foram aliquotados por poço numa placa de fundo redondo de 96 poços (Falcon). As células foram sedimentadas a 12 0 0 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi removido e substituído com 100 yL contendo 0,5 yg de anticorpos de huCGRP R purificados 1H7, 2E7, 3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 11D11,
32H8 ou 33B5. Os poços de controlo foram tratados com anti-DNP
huIgG2 (0,5 yg) , péptido Alexa647-CGRP (0,5 yg) ou PBS/BSA isolado. As células foram incubadas em gelo durante lhe, em seguida, lavadas duas vezes com PBS/BSA. As células foram ressuspensas em 100 yl/poço de PBS/BSA contendo anti-hug-Fc-FITC (0,5 yg) (exceto para células tratadas com Alexa647-CGRP) . As células foram incubadas em gelo no escuro durante lhe, em seguida, lavadas duas vezes com PBS/BSA. As células foram ressuspensas em 200 yL de PBS/BSA e analisadas utilizando um FACS Calibur.
Testaram-se dez anticorpos de bloqueio representativos (3B6, 9F5, 4H6, 12G8, 3C8, 10E4, 32H7, 4E4, 11D11 e 1H7) e dois anticorpos de não bloqueio (32H8 e 33B5). Os dados
representativos (anticorpo 9F5) são mostrados nas Fig.. 13A, 13B e 13C. A Fig. 13A mostra ligação ao recetor de CGRP do tipo selvagem; a Fig. 13B mostra ligação aos recetores de CGRP contendo a quimera de CRLR L24-Q33 e a Fig. 13C mostra ligação a recetores de CGRP contendo a quimera RAMP1 Q28-A34. A análise FACS mostrou que todos os 12 anticorpos se ligam ao recetor de CGRP humano de controlo do tipo selvagem, como esperado. Todos os 12 anticorpos mostraram ligação significativamente reduzida a qualquer das três quimeras de RAMPl (Q28-A34), (Q43-E53) e (R67 - E78) . Isto podia resultar (1) do nível de expressão do recetor de quimera ser muito inferior, (2) da quimera RAMPl prejudicar a dobra com CRLR humano e alterar a conformação do complexo recetor e/ou (3) destas três regiões selecionadas em RAMPl estarem diretamente envolvidas na ligação destes anticorpos ao recetor de CGRP.
Quando o rastreamento FACS foi fechado para incluir apenas as populações de célula "que expressam" muito pequenas, os anticorpos de não bloqueio 33B5 e 32H8 pareceram ligar-se consistentemente menos bem (médias geométricas inferiores) à quimera de RAMPl Q43-E53 quando comparado aos anticorpos de bloqueio, sugerindo que ligação à região RAMPl Q43-E53 pode ser mais importante para os anticorpos de não bloqueio. Por outro lado, 33B5 e 32H8 ligaram-se consistentemente melhor à quimera de RAMPl R67-E78 do que os anticorpos de bloqueio, sugerindo que a sequência RAMPl R67-E78 pode ser mais importante para os anticorpos de bloqueio.
Todos os anticorpos do recetor de CGRP testados ligaram-se razoavelmente bem à quimera CRLR (L24-Q33), sugerindo que este local não é essencial para ligação de anticorpos de bloqueio.
Em resumo, os dados mostram que três regiões descontinuas em RAMPl — (Q28-A34), (Q43 - E53) e (R67-E78) - podiam estar envolvidas em ligação de anticorpo ao recetor de CGRP, com (R67-E7 8) mais importante para os anticorpos de bloqueio. As sequências N-terminais (L24-Q33) de CRLR não pareceram estar criticamente envolvidas em ligação para os anticorpos do recetor de CGRP como analisada por este método. Esta abordagem não exclui locais de ligação adicionais que partilham sequências idênticas ou semelhantes entre recetores de CGRP humano e de rato que não foram visados na análise. EXEMPLO 10
IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS DE CGRP R HUMANOS PARA. ANTICORPOS NEUTRALIZANTES ANTI-CGRP R POR ENSAIO DE PROTEÇÃO DE PROTEASE A parte CRLR na forma madura da molécula de fusão CRLR-Fc (com péptido sinal removido; aqui divulgado como SEQ ID N°:10) contém 116 aminoácidos (precedendo o ligante Glicina) e possui três estruturas de ansa maiores originadas por formação de três ligações dissulfureto. As três ligações dissulfureto na CRLR são Cysl na posição de sequência 26 (todas as posições de sequência CRLR listadas neste parágrafo são em relação à sequência madura apresentada como SEQ ID N°:10) ligada a Cys3 na posição de sequência 52 (referida como CRLR C1-C3), Cys2 na posição de sequência 43 ligada a Cys5 na posição de sequência 83 (referida como CRLR C2-C5) , Cys4 na posição de sequência 66 ligada a Cys6 na posição de sequência 105 (referida como CRLR C4-C6) . A parte RAMPl na forma madura da molécula de fusão RAMPl-Fc contém 91 aminoácidos (SEQ ID N°:ll) precedendo o ligante Glicina, que também forma três ligações dissulfureto intramoleculares. As três ligações dissulfureto em RAMPl são Cysl na posição de sequência 1 (todas as posições de sequência RAMPl sequência posições listadas neste parágrafo são em relação à sequência madura apresentada como SEQ ID N°:ll) ligada a Cys5 na posição de sequência 56 (referida como RAMPl C1-C5), Cys2 na posição de sequência 14 ligada a Cys4 na posição de sequência 46 (referida como RAMPl C2-C4), Cys3 na posição de sequência 31 ligada a Cys6 na posição de sequência 78 (referida como RAMPl C3-C6).
As regiões da proteína de recetor de CGRP humano ligadas por anticorpos monoclonais neutralizantes anti-CGRP foram identificadas fragmentando hCG-RP R em péptidos com proteases específicas e determinando a sequência dos péptidos hCG-RP R resultantes (í. e., fragmentos de péptido contendo ambos dissulfureto e não dissulfureto para as partes de CRLR e RAMPl). Um ensaio de proteção de protease foi, em seguida, realizado para determinar a digestão proteolítica de hCGRP R na presença de anticorpos monoclonais de ligação. O princípio geral deste ensaio é que a ligação de um mAb a CGRP R pode resultar em proteção de determinados locais de clivagem de protéase específicos e esta informação pode ser utilizada para determinar a região ou parte de CGRP R em que o mAb se liga.
Em resumo, as digestões de péptido foram submetidos a mapeamento de péptido por HPLC; os picos individuais foram recolhidos e os péptidos identificados e mapeados por análises de ionização por eletropulverização LC-MS (ESI-LC-MS) e/ou por sequenciação de N-terminal. Todas as análises de HPLC para estes estudos foram realizadas utilizando uma coluna C18 de fase inversa de furo estreito (2,1 mm i.d. x 15 cm de comprimento; Zorbax 300SB, 5 ym, Agilent Technologies) para análise off-line e utilizando uma coluna C18 de fase inversa de capilaridade (0,5 mm i.d. x 25 cm Vydac C18 MS, 5 ym; The Separation Group) para LC-MS. O mapeamento de péptido por HPLC foi realizado com um gradiente linear de ácido trifluoroacético a 0,05% (fase móvel A) a acetonitrilo a 90% em ácido trifluoroacético a 0,05%. As colunas foram desenvolvidas ao longo de 90 minutos a um caudal de 0,25 mL/min para HPLC de furo estreito para análises LC-MS off-line ou on-line e 0,018 mL/min para HPLC de capilaridade para análises LC-MS on-line. A forma madura de CGRP R humano foi digerida com AspN (que cliva após ácido aspártico e alguns resíduos de ácido glutâmico na extremidade amino) incubando cerca de 100 yg de CGRP R a 1,0 mg/mL em fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,5) durante 20 h a 37 °C com 2 yg de AspN. A cromatografia HPLC das digestões de AspN gerou um perfil de péptido como mostrado na Fig. 14 (cada amostra de 30 yg injetada), cromatograma marcado A para CGRP R isolado (concentração 1 mg/mL), enquanto uma digestão de controlo com uma quantidade semelhante de anticorpo neutralizante CGRP R, clone 12G8, mostra que o anticorpo é essencialmente resistente a endoproteinase AspN (cromatograma marcado B; razão CGRP R:anticorpo, 100:2; 100:7; 100:20, peso por peso, respetivamente). As análises de sequência foram conduzidas por LC-MS/MS on-line e por sequenciação de Edman nos picos de péptido recuperados de HPLC. As análises LC-MS ESI on-line da digestão de péptido foram realizadas para determinar a massa precisa e sequência dos péptidos que foram separados por HPLC. As identidades de vários péptidos presentes nos picos de péptido da digestão AspN foram, deste modo, determinados (indicados como picos numerados na Fig. 14) . A Tabela 14, abaixo, mostra as localizações destas sequências de péptido no componente correspondente (CRLR ou RAMPl) do hCGRP R. Uma letra maiúscula C seguida por um número ou X representa um péptido identificado como péptido CRLR; uma letra maiúscula R seguida por um número ou X é um péptido RAMPl e "Fc" representa o fragmento Fc não digerido, grande libertado das moléculas de fusão CRLR-Fc e RAMPl-Fc.
Tabela 14
Péptidos CRLR e RAMPl identificados por mapeamento de péptidos de digestão AspN de CGRP
A Fig. 15 mostra uma comparação de uma experiência de digestão de AspN (cada amostra de 30 yg injetada) com CGRP R isolado (cromatograma marcado A) com uma realizada na presença de anticorpo neutralizante 12G8 (cromatograma marcado B). A razão de peso de CGRP R:anticorpo foi 1:1. Os vários picos (C5, C6 e C7) mostram uma diminuição na altura do pico no cromatograma B em relação ao cromatograma A, enquanto dois outros picos (C-X e R-X) mostram um aumento na altura de pico no cromatograma B em relação ao cromatograma A. Um padrão de mapeamento de péptido semelhante era também observado se um anticorpo anti-CGRP R neutralizante diferente (10E4, 3B6, 3C8 ou 4E4) a uma quantidade semelhante estivesse presente na amostra de digestão como observado no cromatograma marcado C. C6 e C7 são péptidos ligados a dissulfureto que cobrem uma parte principal da molécula CRLR enquanto C5 é um péptido não contendo dissulfureto CRLR residindo na extremidade de N-terminal da molécula e é penúltimo em relação ao péptido dissulfureto C7. O pico C-X contém três ligações dissulfureto CRLR com múltiplas sequências, indicando, pelo menos, dois a três péptidos estão ligados em conjunto por ligações dissulfureto. O facto de o pico C-X ter aumentado a altura de pico numa digestão de CGRP R na presença de anticorpo neutralizante CGRP indica que o anticorpo protegeu CGRP R de digestão com AspN em vários locais de clivagem relacionados com Glu25 e Asp55. O anticorpo não aparece possuir um efeito protetor significativo em Asp33 e Asp72 uma vez que a intensidade de pico para péptidos C2 e C4 não diminuiu de todo. Portanto, o anticorpo parece ligar-se a uma região de CRLR que inclui a região dissulfureto CRLR C1-C3 e CRLR C4-C6 em conjunto com a região de ansa entre Cys53 e Cys66. 0 mapeamento AspN de hCGRP R também identificou um péptido dissulfureto RAMPl (R2) e um péptido não dissulfureto RAMPl (Rl) (ver Tabela 14 e Fig. 14) . Na presença de qualquer dos mencionados anticorpos neutralizantes acima (12G8, 10E4, 4E4, 3B6 ou 3C8), o péptido R-X foi recuperado a uma intensidade de pico significativamente superior à que foi obtida a partir da digestão sem anticorpo na amostra. Análises de massa e sequência mostraram que R-x contém uma cadeia de polipéptido simples correspondente à sequência RAMPl entre Cysl e Arg86. Estas experiências indicam que o anticorpo neutralizante CGRP R pode proteger uma região significativa de RAMPl da digestão proteolitica com AspN.
Para avaliar se o efeito protetor de proteólise com AspN de CGRP R é especifico para anticorpos neutralizantes (de bloqueio) de CGRP R (quando comparado com anticorpos não neutralizantes anti-CGRP) , uma digestão com AspN de CGRP R foi realizada na presença de um anticorpo monoclonal de controlo não relacionado que não neutraliza atividade de CGRP R. Os resultados são mostrados na Fig. 15 no cromatograma D. 0 anticorpo não neutralizante não mostra qualquer efeito de bloqueio significativo na proteólise com AspN de CGRP R; de facto, o perfil de mapeamento de péptido (cromatograma D) é quase indistinguível nos aspetos relevantes ao perfil derivado de digestão de CGRP R isolado (cromatograma A). 0 efeito de proteção da proteólise era dependente da concentração adicionada à amostra de digestão. Como observado na Fig. 16, uma quantidade de CGRP R fixa na amostra (100 pg) com quantidades variáveis de anticorpo neutralizante anti-CGRP R 4E4 (razão CGRP R:anticorpo em microgramas, 100:2; 100:7; 100:20, peso por peso, respetivamente) foi realizada para proteólise
Aspen. 0 perfil de proteção pode ser observado e a proteção é dependente da concentração de anticorpo.
Considerados em conjunto, estes dados demonstram que anticorpos anti-CGRP R de bloqueio ou neutralizantes aqui divulgados podem bloquear CGRP R (em ambos os componentes CRLR e RAMPl) a partir de proteólise AspN, sugerindo que os anticorpos de bloqueio se ligam a CRLR e a RAMPl quando estes anticorpos se ligam ao recetor de CGRP. Mais, o efeito de proteção é dependente da concentração de anticorpo. Estes resultados também indicam que anticorpos neutralizantes de CGRP R se ligam a regiões comuns no CGRP R humano que são próximas aos locais de clivagem de Asp N. EXEMPLO 11
ANTICORPOS ΑΝΤΙ-RAMPl E ANTI-CRLR COMERCIALMENTE DISPONÍVEIS NUM ENSAIO FUNCIONAL AMPc
Os anticorpos comercialmente disponíveis direcionados contra um ou os outros componentes (RAMPl ou CRLR) do recetor de CGRP humano foram rastreados no recetor de CGRP mediado por ensaio de AMPc utilizando células HTB-10 como descrito no Exemplo 4, acima, para determinar se os anticorpos possuíam atividade biológica. Os dados são apresentados na Tabela 15, abaixo. Os anticorpos possuíam atividade biológica não detetável ("ND"), muito fraca ("VW") ou fraca ("W") ao longo de uma gama de concentração em que os anticorpos exemplificativos aqui divulgados possuíam atividade biológica forte.
Tabela 15 Atividade de anticorpos comercialmente disponíveis
EXEMPLO 12
Coloração Imuno-histoquímica de Células que Expressam Diferentes Componentes de Recetor
Injetaram-se 2-4xl06 células por collaplug (Integra
LifeSciences Co., Plainsboro, NJ). Os Collaplugs foram incorporados em meio OCT (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA), congelados a -20 °C e cortados em secções de 20 ym utilizando um criostato. As secções foram fixas com paraformaldeido a 4% durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) e subsequentemente lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A peroxidase endógena foi bloqueada com H2O2/PBS a 3% durante 15 min e incubaram-se secções em solução de bloqueio (PBS com soro de cabra normal a 3% (Vector Labs, Burlingame, CA) e triton X-100 a 0,3%) durante 1 hora. Subsequentemente, incubaram-se secções em anticorpo primário de anti-recetor de CGRP humano (32H7, 0,03-0,1 yg/mL) a 4 °C de um dia para o outro, lavaram-se em PBS e incubaram-se em anticorpo secundário (fragmento Fc anti-IgG humano de cabra biotinilado, 1:800, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) em soro de cabra normal a 1%/PBS durante 1 hora à RT. A imunorreatividade foi amplificada utilizando o Kit Vector Elite de acordo com as instruções do fabricante (Vector Labs, Burlingame, CA) e a coloração foi desenvolvida utilizando 3,3'-diaminobenzidina-níquel como cromogénio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As secções foram limpas com xileno e a cobertura lubrificada com Permount (Fisher Chemicals, Fair Lawn, NJ) . A imunorreatividade foi analisada utilizando um microscópio Nikon E-800 e software associado (Nikon, Melville, NI).
Os dados de células que expressam diferentes componentes de recetor (como identificados abaixo) utilizando anticorpo 32H7 como descrito acima revelaram coloração pronunciada de células CHO que expressam recetor de CGRP recombinante humano (CRLR+RAMPl; "células CH0/CGRP R") e coloração mais fraca de células SK-N-MC que expressam endogenamente recetores de CGRP (devido à densidade de recetor muito mais baixa). Não se observou coloração na linha celular CH0 parental, nas células CHO que expressam uma proteína recombinante não relacionada (TRPM8), nas células CHO/CGRP R após pré-absorção com o antigénio 32H7 correspondente, nas células CHO que expressam recetor 2 de adrenomedulina humano recombinante (CRLR+RAMP3), nas células MCF-7 que expressam endogenamente recetores de amilina, nas células HEK que expressam recetor 1 de adrenomedulina humano recombinante (CRLR+RAMP2) ou nas células HEK parentais. Os dados destas experiências estão resumidos na Tabela 16, abaixo.
Tabela 16 Intensidade de coloração imuno-histoquímica de células indicadas
<110> AMGEN INC.
<120> PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO A RECETOR DE CGRP HUMANO
<130> A-1472-WO-PCT <140> <141> <150> 61/264622 <151> 2009-11-25 <150> 61/203569 <151> 2008-12-23 <160> 261 <170> Patentln versão 3.5
<210> 1 <211> 1419 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 afcgfcfc&amp;tasa gcatatttca ttttggctta atgatggaga aaaagtgtac cctgtatttt 60 ctggttctct tgcctttttt tatgattctt gttacagcag aattagaaga gagtcctgag 120 gactcaattc agttgggagt tactagaaat aaaatcatga cagctcaata tgaatgttae 180 caaaagatta tgcaagaccc cattcaacaa gcagaaggcg tttactgcaa cagaacctgg 240 gatggatggc tctgctggaa cgatgttgca gcaggaactg aatcaatgca gctctgccct 300 gattactttc aggactttga tccatcagaa aaagttaeaa agatctgtga ccaagatgga 360 aactggttta gacatccagc aagcaacaga acatggacaa attataccca gtgtaatgtt 420 aacacccacg agaaagtgaa gactgcacta aatttgtttt açctgaccat aattggacac 480 ggattgtcta ttgcatcaet gettaÇgÇgg' cttggcatat tcttttattt caagagccta 540 agttgccaaa ggattacctt acacaaaaat ctgttcttct catttgtttg taactctgtt 600 gtaaeaatea ttcacctcae tgeagtggcc aacaaccagg ecttagtage cacaaatcct 660 gttagttgca aagtgtccea gttcatteat ctttacctga tgggctgtaa ttacttttgg 720 atgctctgtg aaggeattta icetacaeaea ctcattgtgg tggccgtgtt tgcagagaag 780 gaagafetfcaa tgtggtatta ttttcttggc tggggatttc cactgattcc tgcttgtata 840 catgccattg atagaagett atattacaat, gacaattgct ggatcagtte tgatacccat 900 :ataetataa^ ttatccatgg gfegaatttgt gctgctttac tggtgaatct ttttttcttg 960 ttaaatattg taegegttet aatcaceaag ttaaaagtta aacaceaage ggaatccaat 1020 gtgtaeatga aagctgtgag agctactctt atcttggtgc cattgcttgg cattgaattt 1080 gtgctgattc catggcgacc tgaaggaaag attgeagagg aggtatatga ctacatcatg 1140 cacatcctta tgcacttcca gggtcttttg gtctctacca ttttctgctt ctttaatgga 1200 gaggttcaag caattctgag aagaaactgg aatcaata<sa aaatccaatt tggaaacagc 1260 ttttccaact eagaagetet tcgtagtgcg tcttacacag tgtcaacaat cagtgatggt 1320 ccaggttâta gtcatgactg tcctagtgaa cacttaaatg gaaaaagcat ccatgatatt 1380 gaaaatgttc tcttaaaacc agaaaattta tafeaafetga 1419 <210> 2 <211> 472
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Leu Tyr Ser lie Phe His Phe Gly Leu Met Met Glu Lys Lys Cys 1 5 10 15
The Leu Tyr Phe Leu Val Leu Leu pro Phe Phe Met lie Leu Val Thr 20 25 30
Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser lie Gin Leu Gly Val Thr 35 40 45
Arg Asn Lys lie Met Thr Ala Gin Tyr Glu Cys Tyr Gin Lys lie Met 50 55 60
Gin Asp Pro lie Gin Gin Ala Glu Gly Val Tyr Cys Asn Arg Thr Trp 65 70 75 80
Asp Sly Trp Leu Cys Trp Asn Asp Val Ala Ala Gly Thr Glu Ser Met 85 90 95
Gin, Leu Cys pro .Asp· Tyr Phe Gin Asp·· Phe: Asp Pro Ser Glu Lys Val 100 105 110
Thr Lys lie Cys. Asp: Gin Asp: Gly Asn Trp Phe Arg His Pro Ala Ser 115 ' 120 ' 125
Asn &amp;rg Thr Trp Thr' Asn Tyr Thr Gin Cys Asn, Val Asn Thr His Glu 130 135 140
Lys Val Lys Thr Ala Leu Asn Leu Phe Tyr Leu Thr lie lie Gly His 145 150 155 160
Gly Leu Ser lie Ala Ser Leu Leu lie Ser Leu Gly lie Phe Phe Tyr 165 170 175
Phe Lys Ser Leu Ser Cys Gin Arg lie Thr Leu His Lys Asn Leu Phe 180 185 190
Phe Ser Phe Vai Cys Asn Ser Vai Vai Thr lie Ile His Leu Thr Ala 195 200 205
Vai ,Ala Asn Asn. Gin Ala. Leu Vai Ala Thr ASn Pro Vai. Ser Cys Lys 210 21S 220 Vã! Ser Gin Phe Ile His Leu Tyr Leu Met Gly Cys Asn Tyr Phe Trp 225 230 235 240
Met Leu Cys Glu Gly Ile Tyr Leu His Thr Leu Ile Vàl Vai Ala Vai 24.5 250 255
Phe Ala Glu Lys Gin His Leu Met Trp Tyr Tyr Phe Leu Gly Trp Gly 260 2 65 27-0
Phe Pro Leu lie Pro Ala Cys Ile His Ala Ile Àla Arg Ser Leu Tyr 275 280 285
Tyr Asn Asp Asn Cys Trp Ile Ser Ser Asp Thr His Leu Leu Tyr Ile 290 295 300 lie His Gly Pro lie Cys Ala Ala Leu Leu Vai Asn Leu Phe Phe Leu 305 310 315 320
Leu Asn Ile Vai Arg Vai Leu Ile Thr Lys Leu Lys Vai Thr His Gin 325 330 335
Ala Glu Ser Asn Leu Tyr Met Lys Ala Vai Arg Ala Thr Leu Ile Leu 340 345 350
Vai Pro Leu Leu Gly Ile Glu Phe Vai Leu He Pro Trp Arg Pro Glu 355 360 365
Gly Lys lie Ala Glu Glu Vai Tyr Asp Tyr lie Met His lie Leu Met 370 375 380
His Pfcte Gin Gly Leu Leu Vai Ser Thr Ile Phe Cys Phe Phe Asn Gly 385 390 395 400
Glu Vai Gin Ala Ile Leu Arg Arg Asn Trp Asn Gin Tyr Lys Ilè Gin 405 410 415
Phe Gly Asn Ser Phe Ser Asn. Sèr Glu Ala Leu Arg Set Ala Ser Tyr 420 425 430
Tfer Vai Sèr" Thr lie 'Ser Asp Gly Pro Gly Tyr Ser Hie Asp Cys Pr©· 435 440 445
Ser Glu His Leu Asn Gly LyS Ser He His Asp lie Glu Asn Val Leu 450 455 450
Leu Lys Pro Glu Asa Leu Tyr Asa 465 47Q
<210> 3 <211> 447 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 atggcccggg ccctgtgccg cctcccgcgg cgcggcctct ggctgctcct ggcccatcac 60 ctcttcatga ccactgcetg eeaggaggct aactacggtg ccctcctccg ggagctctgc 120 ctcacccagt feceaggraga catggaggcc gtcggggaga cgctgtggtg tgactggggc 180 aggaccatca ggagctacag ggagctggcc gactgcacct ggcacatggc ggagaagctg 240 ggctgcttct ggcccaatgc agaggtggac aggttcttcc tggcagtgca tggccgctac 300 ttcaggagct geeeeafcet© aggcagggcc gtgcgggacc cgcccggcag catcctctac 360
cccttcatcg tggtccccat cacggtgacc õfcgctggtga çggcactggt ggtctggcag 42Q agcaagcgca ctgagggcat tgtgtag 447
<210> 4 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Met Ala Arg Ala Lèu Cys Arg Léu Pro Arg Arg Gly Léu Trp Leu Leu 1 5 10 ' ' IS
Leu Ali: :Iis His Leu Phe Met Thr Thr Ala Cys Gin Glu Ala: Asn Tyr 20 :2Si 30
Gly Ala Léu Leu Arg Glu Léu Cys Leu Thr Gin Phe Gin Val Asp Met ..35 40 45
Glu Ala Val Gly Glu Thr Léu Trp Cys Asp Trp Gly; Arg Thr lie .Arg· 50 :S:S Μ
Ser Tyr Arg Glu Leu .Ala. Asp Cys Thr Trp His Met Ala Glu Lys Leu SS 70 75 80
Gly Cys Phe Trpf Pro: Asn Ala Glu. Val. Asp Arg Phe Phe Leu Ala Val 85 90 95
His Gly Arg Tyr Phe .Arg Ser Cys Pro lie Ser Gly Arg Ala Val Arg 100 105 110
Asp Pro Pro Gly :Ser He Leu Tyr Pro Phe lie Val Val Pro He Thr 115 120 125
Val Thr Léu. Leu 'Val Thr Ala. Leu Val Val. Trp'· Gin Ser Lys Arg Thr 130 135 140
Glu Gly lie val 141
<210> 5 <211> 414 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atggagaaaa agtgtaccct gtattttctg gttctcttge ctttttttat gattcttgtt 60 acagcagaat tagaagagag tcctgaggac tcaattcagt tgggagttac tagaaataaa 120 atcatgacag ctcaatatga atgttaccaa aagattatgc aagaccccat tcaacaagea 180 gaaggcgttt actgcaacag aacctgggat ggatggctct gctggaacga tgttgcagca 240 ggaactgaat caatgcagct ctgccctgat tactttcagg actttgatcc ateagaaaaa 300 gttacaaaga tctgtgacca agatggaaac tggtttagac atccagcaag caacagaaca 360 tggacaaatt atacccagtg taatgttaac acccacgaga aagtgaagac tgca 414
<210> 6 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Met Glu Lys Lys Cys Thr Leu Tyr Phe Leu Val Leu Leu Pro Phe Phe 1 5 10 15
Met lie Leu Val Thr Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser lie 20 25 30
Gin Leu Gly Val Thr Arg Asm Lys lie Met Thr Ala Gin Tyr Glu Cys 35 40 45
Tyr Gin Lys He Met Gin Asp Pro lie Gin Gin Ala Glu Gly Val Tyr 50: 05"' 60
Cys Asn Arg Thr Trp Asp Gly Trp Leu Cys Trp Asn Asp Val Ala Ala 05 70 75 80
Gly Thr Glu Ser Met Gin Lew Cys Pro Asp Tyr Phe Gin Asp Phe Asp 85 90 95
Pro Ser Glu Lys Val Thr Lys lie Cys Asp Gin Asp Gly Asn Trp Phe 100 105 110
Arg His Pro Ala Ser Asn Arg Thr Trp Thr Asn Tyr Thr Gin Cys Asn 115 120 125
Val Asn Thr His Glu Lys Val Lys Thr Ala 130 135
<210> 7 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 afcggcGeggg ccctgtgccg cctcccgcgg cgcggcctct ggctgctcct ggcccatcac 60 ctcttcatga ccactgcctg ccaggaggct aactacggtg ccctcctccg ggagctctgc 120 ctcacecagt taeaggtaga catggaggcc gtcggggaga cgctgtggtg tgactggggc 180 aggaeeatca ggagctacag ggagctggcc gactgcacct ggcacatggc ggagaagctg 240 ggctgcttct ggcccaatgc agaggtggac aggttcttcc tggcagtgca tggeegctae 300 ttcaggagct gccccatctc aggcagggcc gtgcgggaco cgcccggcag c 351
<210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Met Ala. Arg Ala Leu Cys Arg Leg. Pro: Arg Arg Gly Leu: Trp Leu Leu. 1 &amp; io " :11
Leu Ala His His Leu Phe Met Thr Thr Aia.: Cys Gin Glu; Ala Asn Tyr 2«; £$: 30
Gly Alá: Leu Leu Ar§f Glu Léu Cys Leu Thr Gin Phe Gin Val Asp Met 40 :4t
Glu Ala Val Gly·' Glu Thr Leu Trp Cys Asp: Tip Gly Arg Thr lie Arg 50 55:· m" ;Sér Tyr·· Arg Glu Leu Ala. Asp Cys Thr Trp His .Met Ala Glu Ay® Leu 15 70 75 80
Gly Cys Phe Trp Pro Asn Ala Glu val Asp Arg Phe Phe Leu Ala Val 85 90 95
His Gly Arg Tyr Phe Arg Her Cys Pro: lie Ser Gly Arg Ala Val Arg 100 105 ' 110
Asp Pro Pro; Gly Ser 115
<210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Trp Val Thr His Arg Leu Ala Gly Leu Leu Ser Arg Ser Gly Gly Val 1 5 10 15
Val Arg Cys Asn Phe Val Pro Thr Asp Vál Gly Pro Phe Ala Phe 20 25 30
<210> 10 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10
Glu lie» Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser lie Gin Leu Gly Val Thr Arg 1 5 10 15
Asn Lys lie Met Thr Ala Gin Tyr Glu Cys Tyr Gin Lys lie Met Gin 20 25 30 iftsp Pro lie Gin Gin Ala Glu Gly Val Tyr Cys Asn Arg Thr Trp Asp 35 40 45
Gly Trp Leu Cys Trp Asn Asp val Ala Ala Gly Thr Glu Ser Met Gin 50 55 60
Leu Cys Pro Asp Tyr Phe Gin Asp Phe Asp Pro Ser Glu Lys Val Thr
65 70 75 SO
Lys He Cys Asp Gin Asp Gly Asn Trp Phe Arg His Pro Ala Ser Asn 66 90 95
Arg Thr Trp Thr Asn Tyr Thr Gin Cys Asn Vâl Asn Thr His Glu Lys 100 ids 110
Val Lys Thr Ala 115
<210> 11 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11
Cys Gin Glu Ala Asn Tyr Gly Ala Leu Leu Arg Glu Leu Cys Leu Thr 1 5 10 15
Gin Phe Gin Val Asp Met Glu Ala Val Gly Glu Thr Leu Trp Cys Asp 20 25 30
Trp Gly Arg Thr lie Arg Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Cys Thr Trp 35 40 45
His Met Ala Glu Lys Leu Gly Cys Phe Trp Pro Ash Alá Glu Val Asp 50 55 60
Arg Phe Phe Leu Ala Val His Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Cys Pro lie 65 70 75 80
Set Gly Arg Alá Vál Arg Asp Pro Pro Gly Ser 85 90
<210> 12 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 12
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Léu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala: Atg: Cys Gin. Ser "Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser val 20 25 30
Ser Glu Ala 'Pro Gly Gin Lys Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 35 40 45
Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly 50 55 50
Thr Ala Pro Lys Leu. Leu lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser;' Gly 15 70 75 80 lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu 85 90 95
Gly lie Thr Gly Leu Gin Thr Gly Asp Glu Ala, Asp Tyr· 'Tyr Cys Gly 100 105 110
Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Ala Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys 111 W&amp;- 125
Leu Thr Vai Leu Gly Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr Vai Thr Leu Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Vai Cys 145 150 155 160
Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Vai Thr Vai Ala Trp Lys Ala 165 170 175
Asp Gly Ser Pro Vai Lys Ala Gly Vai Glu Thr Thr lys Pro Ser Lys 180 185 190
Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205
Glu Gin Trp: Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Vai Thr His Glu 210 215 220
Gly Ser Thr Vai Glu Lys Thr Vai Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235
<210> 13 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 13
Met Asp Met Arg Val Pro; Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gin Sen Val Leu Thr Gin Pro Pro Set Ala 20 25 30
Ser Gly Thr Pro Gly Gin Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser 35 40 45
Ser Asn lie Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly 50 55 60
Ala Ala Pro Lye Leu Leu lie Phe Arg Ser Asn Gin Arg Pro Ser Gly 65 70 75 80
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu 85 90 95
Ala lie Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110
Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125
Lem Thr Val Leu Gly Gin Fro Lys Ala Asn Pro Thr Vial Thr Leu Phe 130 135 14#
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160
Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala: Val Thr Val Ala Trp Lys Ala 165 170 175
Asp. Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 180 185 190
Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205
GlU. Gin Trp Lys Ser His Airg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu 210 ' 215 ’ 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 :2,30 235
<210> 14 <211> 236 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 14
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Arg Asn Asp Leu Gly Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Arg Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ger Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 100 105 110
Tyr ASn lie Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140
Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175
Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Lem Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205
Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 ’ 230 " 235
<210> 15 <211> 236 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 15
Met Asp Met Arg: Vai· Pro Ala Gin Lètí Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Àla Arg Cys Ser Ser Glu Leu Thr Gin Asp Pro Thr Val 20 25 30
Ser Val Ala Leu Gly Gin Thr Val Lys lie Thr Cys Gin Gly Asp Ser 35 40 45
Leu Arg Ser Phe Tyr Ala Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Val Leu Val Phe Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly lie Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Sear Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie 85 90 99
Thr Gly Ala Gin Ala Glu. Asp Glu Ala Asp' Tyr Tyr Gys: Asn Ser Arg' 100 109 110
Asp Ser Ser Val 'Tyr His Leu Val Leu Gly' Gly Gly" Thr Lys Leu: Thr 115 120 ;125
Val Leu Gly Gin. Pro. Lys Ala: Asn Pro: Thr Val Thr Leu Phe Pr©: Pro 130 135: 140
Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He 145 150 155 160
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly 165 170 175
Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gin Ser 180 1|9 190
Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser: Ser Tyr Leu. Ser- Leu Thr Pro Glu Gin 195 200 205
Trp Lys Ser; His· Arg Ser Tyr Ser Cys Gin· Val Thr His Glu Gly Ser 210 :21,5 220
Thr "Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu GyS Ser 225 230 .235:
<210> 16 <211> 241 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 16
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 " 5 10 i$
Leu. Atg Gly Ala Arg Cys A8Í* He lie LeU Ala, Gin ift# :®ro Leu Ser 20 Í5 30
Leu :Se^; 'Wl LÍir Pro Gig Gin Pro Ala· ;5#η He Sen Gy#. iLys: GAt" Ser 31................. ....... 40.......................... 4l"
Gin Sen Leu, Leu Hie Ser Ala. Gig Lys Ttir Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu SO 55 60
Gin Lys Pro Gly Gin pro Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu val Ser Asn 61 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 85 90 95
Asp Phe Thr Leu Lys He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly He 100 105 110
Tyr Tyr Cys Met Gin Ser Phe Pro Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125
Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He 130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 180 185 190
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 2 IS 220
His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240 :6ys;
<210> 17 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 17
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 § 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gin 'Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 20 25 30
Ser Ala Ala Pro Gly Gin Lys Pal Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser ::Sèr 35 40 45
Ser Asn lie Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly 50 55 60
Thr Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly 65 70 75 80
He Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu 85 90 95
Gly lie Thr Gly Leu Gin Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly 100 105 110
Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125
Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Léu Phè 130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160
Leu He Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ale Trp Lys Ala 165 170 175
Asp Gly Ser Pro val Lys Ala Gly val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 180 185 190
Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205
Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu 210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235
<210> 18 <211> 241 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 18
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Ale Arg Gys Asp lie Val Met Thr Gin 'Ser Pro Leu Ser 20 25 30
Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ale Ser lie. Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45
Gin. Ser Leu. Leu Hie Get Phe Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu 30 55 60
Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Leu Gly Ser Asn
65 70 75 SO
Arg' Ala Ser Gly Val Pro; Asp Arg Phe Her Gly Ser Gly Ser Gly Thr 15 90 95
Asp Phe: Thr Leu Lys lie: Set Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val loo iOS no
Tyr Tyr Cys Met Glu Ala: Leu Gin Thr pro Phe. Thr Phe Gly Pro Gly 115 120 125
Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie 130 135 140
Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys 165 170 175
Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu 180 185 190
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 215 220
His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240
Cys_
<210> 19 <211> 241 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 19
Met Asp Met Arg Val Fro Ala Gin Lee Lee Gly Lee Lee Lee Lee Trp 1 5 io ' is
Lee Arg .Gly Ala Arg Cys Asp lie "lie Lee Thr Gin Thr Pro Lee Ser 20 2.5: 30
Lee Ser- Val. Thr fro: Gly Gin Pro Ala Ser- He Ser Gy a Lys Ser Ser 35 40 45
Gin Ser Lee Lee His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Lee Tyr Trp Tyr Leu 50 55 60
Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro. Gin.. Lee Lee lie Tyr Gle Val Ser Asn 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Glu Pro Asp .Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr' 85 90 95
Asp Phe Thr Lee Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Thr 100 105 110
Tyr Tyr Gys Met Gin Ser Phe Pro Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly I'll 120 125
Thr. Lys Val Glu lie Lys Arg Thr" Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie 130 135 140
Phe Pro PrO" Ser Asp Glu- Gin Leu. Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val :;145: 150 155 160
Gys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu. Ala: Lys Val Gin Trp Lys :165 ' 170 175
Val Asp- Asn. .Ala Leu Gin Ser Gly" Asn Ser- Gin Glu Ser Val -Thr Glu. 180 185 190
Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu. "Thr Leu 195 200 205
Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 210 215 220
His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 225 230 235 240
Cys
<210> 20 <211> 238 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 20
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu .léu Leu 'Tip 1 I 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 20 25 30
Ser Ala Ala: Pro; Gly Gin Lys Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser· Ser 35 40 45
Ser Asn lie Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gin Gin Phe Pro Gly 50 55 60
Th* Ala Pro Lys leu leu lie Tyr Asp Asn Asn lys Arg Pro Ser Gly 65 70 75 80 lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr leu 85 90 95
Gly He Thr Gly leu Gin Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Gys Gly 100 105 110
Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr lys 115 120 125 leu Thr Val leu Gly Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr leu Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160 leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Alá 165 170 175
Asp Gly Ser Pro Val lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser lys 180 185 190
Gin Ser Asn Asn lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205
Glu Gin Trp lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu 210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235
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Itet; Asp Met Arg Val Pro Ala; Gin Leu lieu. Gly Leu Leu Leu. Leu Trp 1 S 10 15
Leu Arg Gly Ala iArg Cys Gin Ser Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala 20 25 30
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Ala Ala Pro Lys Leu Leu lie Leu Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly 65 70 75 80
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Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys 111 ill 125
Leu Thr Val Leu Gly- 'Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr "Val Thr Leu Phe 130 135 140
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145 150 155 liO
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Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Gys Ser 225 230 235
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Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 i 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala 20 25 30
Ser Gly Thr Pro Gly Gin Arg Val Thr He Ser Cys Ser Gly Ser Ser 35 40 45
Ser Ash He Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly 50 55 60
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Ala lie Ser Gly Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Ala 100 105 110
Ala Arg Asp Glu Ser Leu Asn Gly Val Val Phe Gly Glj Gly Thr Lys 115 120 125
Leu Thr Val Leu Gly Gin pro Lys Ala Asn pro Thr val Thr leu Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160
LeU lie Ser ASp Phe Tyr Pro Gly Ala val Thr val Ala Trp Lys Ala 165 170 175
Asp Gly Ser Pro Val Lys Alá Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys ISO 185 190
Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205
Glu Gin Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu 210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235
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Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Gys Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala :20 25 m
Ser- Gly Thr Pro Gly Gin Arg- Val Thr lie. Ser Cys Ser Gly Ser Ser 35 ΙΟ 45
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Ala Ala Pro Lys Leu Leu lie Phe Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly
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Ala lie Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110
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Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe 130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys 145 150 155 160
Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Vãl Thr Val Ala Trp Lys Ala 165 170 175
Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys 180 185 190
Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro 195 200 205
Glu Gin Trp Lys $er His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu 210 215 220
Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 225 230 235
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Mat Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Let: Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Léu- Are Gly Ala Are Cvs Agp: lie Thr Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser 20 25 30
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Cys
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Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 IS
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 20 25 30
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Met Asp Met Arg vai Pro.· Ala Gin Leu Leu, 'Gly Leu, Leu Leu Leu irp 1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Afg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 ..... 25 30 'Léu Sei- Ala Sér yal Gly Asp Arg Val Thr· lie Thr Cys .-Arg' Ala Ser 35 40 45
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Tyr Asn Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
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Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp 180 185 190
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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser 210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235
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Met Glu Thr Pro Ala .(Sift Leu, Leu Phe 'Leu Leu Leu Leu Trp Leu. Pro 1 I 10 15
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Val Ser Ser Gly Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110
Gly Aáú Sèr Leu Cys Arg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 115 120 125
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Ash Arg Gly Glu Cys ;2t5 ........ 230 235
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Mefc Glu Thr pro·· Ala Gin Leu Léu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15
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Gly Asn Sér Leu Ser Arg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 115 120 125
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Met Asp Met Arg Val Pro Ale Gin Leu Lett Gly Leu Lett, Leu Lett Trp 1 5 10 15
Lett. Arg Gly Ala .Arg: Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30
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Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Ash Gly Lys Glu Tyr Lys 340 345 350
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Lys Pro Α**ϊ Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 325 330 335
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Lieu Arg Gly Ala Arg Cyst Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu 20 25 30
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Gly Thr Thr Vâl Thr Val Sèr Set Ala Set Thr Lys Gly pro Ser Val 145 150 115 160
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Trp Asn Ser Gly Ala leu Thr Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala Val 1:35 :200 205
Leu Gin. Ser Ser Gly Leu Tyr Ser· Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro 21-0 21,5: 220
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Lie Ser Arg Thr Pro 275 280 285
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Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu ASn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350
Lys val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 355 360 365
Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp tie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pró Pró Met Leu Asp Ser Asp 420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ásp Lys Ser Arg Trp 435 440 445
Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460
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Val Vál Gin Pró Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu 275 200 285
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 405 410 415
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Leu Arg Gly Ala Arg Cys Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly 20 25 30
Leu Vai Lys Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly 35 40 45
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Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Phe lie Arg Ser Arg Ala Tyr Gly Gly W 70 "" 75 " to:'
Thr· .Pro' Glu Tyr Ala Alia Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr' He Ser Arg 85 90 95 A$P: Asp Ser Lys Thr Tie .Ala Tyr Leu Gin Met Asn Sèr· Leu Lys Thr 100 105 110
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Vai Ser Leu Thr Gys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ilè Ala 385 390 395 400 val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Ash Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser phe Phe Léu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430
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Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Lea Gly Leu Lea Leu Leu Trp 1 5 10 15 LÉU: Arg Gly Ala Arg Gy# Glu Val: Gin, Léa :Val Glu Ser- Gly Gly· Gly .20 25 30
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Gys Gys 245 250 255
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 275 280 285
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415
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Val Val Gin Pro Sly Arg Sen Leu Arg Leu Sen Cys Ala Ala Ser Gly 35 40 45
Phe Thr Phe Ser Sen Tyr Sly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Sly 50 55 60
Lys Sly Leu Slu Trp Val Ala Val lie Trp Tyr Asp Sly Sen Asn Lys 65 70 75 SO
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Ser Lys Asn Thr Lew Tyr Leu Gin Met Asn Set" Leu Arg Ala Glu Asp 100 105 110
Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Gly lie Ala Ala Ala Gly 115 120 125
Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 130 135 140
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 145 150 155 160
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 165 170 175
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 180 185 190
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Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro 245 250 255
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp 290 295 300
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Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr 1 5 Id 15
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Gly -Mete Asp Vai 20
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Gly
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Tyr Gly Met Asp Vai 20
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Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Alá Glii Lys Phe Gin 1 10 15
Gly
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Tyr Gly Met Asp Val 20
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Phe ;Ile Arg Ser Arg Ala Tyr (31y Gly Thr Pro Glu Tyr Alá Alá Ser 1 5 10 15
Val Lys Gly
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Arg lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Ala Pro 1 5 10 15
Val Lys Gly
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Gly
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Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Tyr Ser His Tyr Tyr Gly Met 1 5 10 15
Asp Vai
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Arg Ilê Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pró 1 5 10 15
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Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr His Tyr Lys Tyr X 5 10 15
Tyr Gly Leu Ala Val 20
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Thr Tyr Ser Met Asa 1 ' ..........5..... <210> 98 <211> 17
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Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Tyr Tyt Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15
Gly
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Glu Gly Vai Ser Gly Ser Ser Pro Tyr Ser Ile Ser Trp Tyr Asp Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 20
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Ser Tyr Gly Met His 1 $
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Val lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala, Asp Ser Val Ays 1 5 10 15
Gly
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Ala Sly Sly lie Ala Ala Ala Sly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Sly Met Asp 1 5 10 15
Val
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Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp Leu Gly 1 5 10
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Ala Ala Ser Ser Leu Gin Sér 1 5
<210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Phe" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5)..(6) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 105
Leu Gin Tyr Asn lie Tyr Prõ Trp Thr 1 5
<210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Cys" <220> <221> misc_caracteristica <222> (8) .. (8) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 106
Gin Gin Tyr Gly Asn Ser Leu Ser Arg 1 5
<210> 107 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Ile" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Asn" ou "Lys" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5)..(8) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (10) .. (10) <223> /substituir="Asp" <220> <221> misc_caracteristica <222> (10) .. (10) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referi da posição" <220> <221> VARIANTE <222> (12) .. (12) <223> /substituir="Gly" <220> <221> misc_caracteristica <222> (12) .. (12) <223> /nota="Resíduo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 107
Arg Ala Ser Sin Ser Val Ser Ser Sly Tyr Leu Thr 1 5 10
<210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Gln" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5)..(7) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 108
Gly Ala S⣠Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Leu" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Asn" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Tyr" ou "Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Pro" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Trp" ou "Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Thr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (4)..(9) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 109
Gin Gin Tyr Gly Asn Ser Leu Gys Arg 1 5
<210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (10) .. (10) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Lys" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Thr" <220> <221> misc_característica <222> (12)..(13) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 110
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Sis Ser Asp Gly Arg Asn Tyr Leu Tyr 1 5 1© 15
<210> 111 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Lys" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (10) . . (10) <223> /substituir="Asp" ou "Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (10) .. (10) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Arg" ou "Lys" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Thr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (12) . . (13) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (16)..(16) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (16) .. (16) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 111
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu His; Ser Phe Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15
<210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Glu" <220> <221> VARIANTE <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Val" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (2) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Phe" <220> <221> misc_caracteristica <222> (6)..(6) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 112
Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser 1 5
<210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Pro" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Leu" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3)..(6) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (8) .. (8) <223> /substituir="Leu" <220> <221> misc_caracteristica <222> (8) .. (8) <223> /nota="Resxduo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 113
Met Gin AiLa, Leu Gin- Thr Pro Pfcwe: Thr 1 5
<210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (2)..(2) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (2) .. (2) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 114
Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser 1 5
<210> 115 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (9)..(9) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Thr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (11)..(11) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Asn" ou "Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (13) .. (13) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àqueles na notação para a referida
Posição" <400> 115
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Vai Ser 1 5 10
<210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Thr" ou "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (2)..(2) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(2) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (4) .. (4) <223> /substituir="Gln" <220> <221> misc_caracteristica <222> (4)..(4) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 116
Asp Asp Asp LyS Arg Pro Sér 1 5
<210> 117 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . (2) <223> /substituir="Ala" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Arg" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (3) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Asp" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5)..(6) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Asn" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Gly" <220> <221> misc_caracteristica <222> (8)..(9) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 117
Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Ala Vai Vai 1 " ’ ' i 10
<210> 118 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Gln" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir=" " <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Asp" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3)..(4) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir=" " <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Ala" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Asn" ou "Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (6) .. (13) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 118 iSôr; Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10
<210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. (1) <223> /substituir="Gly" ou "Thr" ou "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (2)..(2) <223> /substituir="Lys" ou "Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(2) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem Preferência em relação àqueles nas notações para as referidas Posições" <220> <221> VARIANTE <222> (4)..(4) <223> /substituir="Asn" ou "Gin" <220> <221> misc_caracteristica <222> (4) .. (4) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 119
Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 1 5
<210> 120 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Asn" ou "Ala" <220> <221> VARIANTE <222> (2)..(2) <223> /substituir="Ser" ou "Ala" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Arg" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (3) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Asp" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Val" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Tyr" ou "Asn" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="His" ou "Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Leu" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5) .. (10) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 120
Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu Ser Alá Vai Vál 1 5 10
<210> 121 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1) .. (1) <223> /substituir="Asp" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não pussui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (5) .. (5) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5) .. (5) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida
Posição" <400> 121
Gly Tyr Tyr Met His 1; $
<210> 122 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (3) .. (3) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3)..(3) <223> /nota="Residuo dado na sequência não ~
Possui
Preferência em relação àquele na notação para a referi da Posição" <400> 122
Trp He Asa Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 1 5 10 15
Gly
<210> 123 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1) . . (2) <223> /substituir="Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (3) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Ala" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(9) <223> /substituir=" " <220> <221> misc_caracteristica <222> (5)..(9) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (13) . . (13) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (14) .. (14) <223> /substituir="His" <220> <221> misc_caracteristica <222> (11) .. (14) <223> /nota="Residuos dados na sequência não ηη„„1ιαι„ vo SΙΙΘΓΠ preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (17) . . (17) <223> /substituir=" " <220> <221> misc_caracteristica <222> (17) .. (17) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida Posição" <400> 123
Asp Gift Met Ser lie He Met Leu Arg Gly Val Phe Pro Pro Tyr Tyr 1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Val 20
<210> 124 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Thr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5) .. (5) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220>
<221> VARIANTE <222> (14)..(14) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (14) .. (14) <223> /nota="Residuo dado na sequência não
Possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 124
Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Ala Pro 1 5 10 15
Vai Lys Gly
<210> 125 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3) .. (3) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5) .. (5) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 125
Thr Tyr Ser Met Asn 1 5
<210> 126 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (4)..(4) <223> /substituir="Gly" <220> <221> misc_caracteristica <222> (4) .. (4) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (6) . . (7) <223> /substituir="Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Thr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (6)..(9) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas Posições" <400> 126
Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai Lys 1 5 10 15
Gly
<210> 127 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Asp" <220> <221> VARIANTE <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Gln" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (4)..(4) <223> /substituir="Glu" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Val" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir=" " <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(7) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Gly" <220> <221> misc_caracteristica <222> (11)..(12) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 127
Glu Gly Vai Ser Gly Ser Ser Pro Tyr Ser Tie Ser Trp Tyr Asp Tyr 1 5 10 15
Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 20
<210> 128 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (2)..(2) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (2) .. (2) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 128
Ser Phe Gly Met His 1 5
<210> 129 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> misc_caracteristica <222> (4) .. (4) <223> /nota="Resíduo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="His" <220> <221> misc_caracteristica <222> (8) .. (8) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida
Posição" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (11) .. (12) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 129
Vai 11« S«r Wm. Asp Gly B«r:' 11« Lys Tyr Ser Vai Asp ;S«r: Vai Ay» 1 5 1# 15
Gly'
<210> 130 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Glu" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Lys" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Val" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Met" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3)..(7) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Leu" <220> <221> misc_caracteristica <222> (9) .. (10) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (14)..(14) <223> /substituir=" " <220> <221> VARIANTE <222> (15)..(15) <223> /substituir="Phe" <220> <221> misc_caracteristica <222> (13) .. (15) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (19)..(19) <223> /substituir="Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (20)..(20) <223> /substituir="Asp" <220> <221> misc_caracteristica <222> (19) .. (20) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 130
Asp Atg Leu Asn Tyr Tyr Asp Sei? Set í3Ly Tyr Tyr His Tyt Lys Tyr 1 5 10 15
Tyt Gly Met Ala Vai 20
<210> 131 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Tyr" ou "Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Ala" ou "Gly" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (3) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="His" <220> <221> misc_caracteristica <222> (5) .. (5) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àquele na notação para a referida posição" <400> 131
Asn AÍa Trp Met Ser 1 5
<210> 132 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Ala" ou "Vai" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1) .. (1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Ser" ou "Trp" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Gly" ou "Phe" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Thr" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir=" " <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3)..(7) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Arg" ou "Ile" ou "Asn" ou "His" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Lys" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (14)..(14) <223> /substituir="Ala" ou "Val" <220> <221> VARIANTE <222> (15)..(15) <223> /substituir="Asp" <220> <221> VARIANTE <222> (16)..(16) <223> /substituir="Ser" <220> <221> misc_caracteristica <222> (9) .. (16) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 132
Arg Ilé Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Tlir Ala Pro 1 5 10 15
Val Lys Gly
<210> 133 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Ala" ou "Glu" <220>
<221> VARIANTE <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Gln" ou "Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Arg" ou "Leu" ou "Gly" ou "Lys" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Glu" ou "Asn" ou "lie" ou "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Val" ou "Ala" <220>
<221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Gly" ou "Tyr" ou "Ala" ou "Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Pro" ou "Asp" ou "Ala" ou "Met" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Tyr" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Ser" ou "Thr" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Gly" ou "Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Gly" ou "Leu" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Tyr" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="His" <220> <221> VARIANTE <222> (14)..(14) <223> /substituir="Asp" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (15)..(15) <223> /substituir="Lys" ou "Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (16) ..(17) <223> /substituir=" " <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(17) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (19)..(19) <223> /substituir="Leu" <220>
<221> VARIANTE <222> (20)..(20) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (19)..(20) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 133
Asp Arg Dili? Gly Tyr Sei? Tie Se* Trp Se* Se* T*p Ty* Tyr Tyr Ty* 1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp vai 20
<210> 134 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Gly" ou "Asp" ou "Ser" ou "Ala" <220>
<221> VARIANTE <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Phe" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Tyr" ou "Ala" ou "Gly" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="His" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(5) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 134 Ué» Ala Trp Met Ser 1 5
<210> 135 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Trp" ou "Ala" ou "Vai" ou "Ser" ou "Phe" <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(1) <223> /nota="Residuo dado na sequência não possui preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Asn" ou "Ser" ou "Trp" ou "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Pro" ou "Gly" ou "Phe" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Thr" ou "Arg" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Ala" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Asn" ou "His" ou "Ser" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(9) <223> /substituir="Ser" <220>
<221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Gly" ou "Arg" ou "lie" ou "Asn" ou "His" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Lys" ou "Arg" ou "Pro" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Asn" ou "Tyr" ou "Glu" <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (14)..(14) <223> /substituir="Ala" ou "Val" <220> <221> VARIANTE <222> (15)..(15) <223> /substituir="Gln" ou "Asp" <220> <221> VARIANTE <222> (16)..(16) <223> /substituir="Lys" ou "Ser" <220> <221> VARIANTE <222> (17)..(17) <223> /substituir="Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (18)..(18) <223> /substituir="Gln" <220> <221> misc_caracteristica <222> (3) .. (18) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 135
Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Ala Pr© 1 5 10 15
Vai Lys Gly
<210> 136 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <220> <221> VARIANTE <222> (1)..(1) <223> /substituir="Gly" ou "Ala" ou "Glu" <220> <221> VARIANTE <222> (2) . . (2) <223> /substituir="Gly" ou "Gin" <220> <221> VARIANTE <222> (3)..(3) <223> /substituir="Met" ou "Tyr" ou "Arg" ou "Leu" ou "Gly" ou "Lys" <220> <221> VARIANTE <222> (4) . . (4) <223> /substituir="Ser" ou "Glu" ou "Asn" ou "lie" ou "Arg" <220> <221> VARIANTE <222> (5)..(5) <223> /substituir="Ile" ou "Gly" ou "Vai" ou "Ala" <220> <221> VARIANTE <222> (6)..(6) <223> /substituir="Ile" ou "Tyr" ou "Gly" ou "Ala" ou "Thr" <220> <221> VARIANTE <222> (7) . . (7) <223> /substituir="Met" ou "Ala" ou "Pro" ou "Asp" <220> <221> VARIANTE <222> (8)..(8) <223> /substituir="Leu" ou "Tyr" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (9)..(9) <223> /substituir="Arg" ou "Ser" ou "Thr" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (10)..(10) <223> /substituir="Gly" ou "Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (11)..(11) <223> /substituir="Val" ou "Leu" ou "Gly" ou "Tyr" <220> <221> VARIANTE <222> (12)..(12) <223> /substituir="Tyr" ou "Trp" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (13)..(13) <223> /substituir="Pro" ou "Ser" ou "His" <220> <221> VARIANTE <222> (14)..(14) <223> /substituir="Pro" ou "Asp ou "His" ou " " <220> <221> VARIANTE <222> (15)..(15) <223> /substituir="Lys" ou "Phe" <220> <221> VARIANTE <222> (16) ..(17) <223> /substituir=" " <220> <221> misc_caracteristica <222> (1)..(17) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <220> <221> VARIANTE <222> (19)..(19) <223> /substituir="Leu" <220> <221> VARIANTE <222> (20)..(20) <223> /substituir="Ala" <220> <221> misc_caracteristica <222> (19)..(20) <223> /nota="Residuos dados na sequência não possuem preferência em relação àqueles nas notações para as referidas posições" <400> 136
Asp ftrg Thr Gly Tyr Sei1 II© Ser Trp Ser Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15
Tyr Gly Met Asp Vai 20
<210> 137 <211> 110 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 137
Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pró Pro Ser Vai Ser Glu Ala Pró Gly Gin 1................... '5................... 10........ 15
Ly£: Vai Thr Ile Ser Cys ;Ser· Gly Ser Ser Ser Asn lie 'Gly Asn Asn 20....... 25 m
Tyr 'Vai Ser' Trp Tyr Gin Gin -Leu Pro Gly Thr Ala Pró: Lys Leu ;Lên 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn :Lys Arg Pro Ser Gly ílè Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu 85 90 95
Ser Ala Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
<210> 138 <211> 110 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 138
Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 1 5 10 15
Arg Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30
Tyr Vai Tyr Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 ilg Phe Arg Ser Asn Gin Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Sen :Lys Sen Gly Thr Sen Ala Ser Leu· Ala Ile Ser Gly Leu -Arg 65 70 75 80
Sen Glu ASp. Glu Ala Asp Tyr- Tyr Cys Ala Alá; Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
<210> 139 <211> 107 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 139
Asp· lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Set Leu Ser .Ale. Ser Vai Gly 1 5 10 15 .Asp- Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 2i 30
Leu Gly Trp 'Phe Gin. Gin Lys Pro Gly lys Ala. pro· Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Aia Ala Ser Ser Leu Gin. 'Ser Gly Vai. Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asn lie Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105
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Ser Séít Glu Leu Thr Gin Asp Pro Thr Vai Sé# Vai Alá Léu Gly Glh 1 5 10 IS rhr Vai Lys Ile Thr Cys Gin Gly Asp Sêr Leu Arg Sé# Phe Tyr Ala 20 25 30
Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Vai Leu Vai Phe Tyr 35 40 45
Gly Lys Asn Asn Arg Pro Sér- Gly Ilé Pró Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 15 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Vai Tyr His 85 90 95
Leu Val Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105
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Asp tie lie Lee Ala Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser m 25 30
Ala Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50........................ " 55....................... ' 60.........
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly lie Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95
Phe Pro LêU Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110
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Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Ala Alá Pro Gly Gin 1 5 10 15
Lys: Vai Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30
Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie: Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Thr Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin || 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Alá Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu 85 90 95
Ser Alá Vai Vai Phè Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
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Asp lie Vai Met Thr Gin Ser Pro lien Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Leu Hls Ser 20 25 30
Phe Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Lee ®eh Tie Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gin Ala 85 90 95
Leu Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys 100 105 110
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Asp lie Ile Léu Thr Gin Thr Pro Léu Ser Léu Ser Vai Thr Pro Gly 1 5 10 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gift. $ér Léu Léu His Ser 20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr :LéU Tyr Trp Tyr Léu Gift: Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Gin Leu Léu ílé Tyr Glu Vai Ser Âsft Arg Phe Ser Gly Glu Pro SO SS 60
Asp Arg Phé Ser Gly Sér Gly Ser Gly Thr Asp Phé Thr Leu Lys Ilé 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Thr Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95
Phe Pro Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai. Glu II» Lys 100 105 110
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Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vai Ser Ala Ala Pro Gly Gin 1 1 ........10............ 15
Lys Vai Thr Ile Ser- Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30
Tyr Vai Ser" Trp Tyr Gin Gin Phe Pro Gly Thr- Ala Pro Lys Leu.. Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Gys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu 85 90 95
Ser Ala Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
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Gin Ser Vai Leu -fiar; Gin 'Ser Pu©· Ser .Ala. Ser Gly Thr Pro- Gly Gin. 1 5 10 15
Arg ¥al Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn 20 25 30
Tyr Vai Tyr Trp Tyr Gin Gin Leu Pr© Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 íle Leu Arg Asn Asn Gin Arg Pr© Ser Gly Vai Pr© Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
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Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 1 5 10 15
Arg Vai. Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30
Thr Vai Asn Trp Tyr Gin Gin Leu Prò Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Thr·' A$á Ash;· Gin Arg Pro: Ser" Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Lee Ala Ile Ser Gly Leu Gin 65' ...... 70 75 80
Ser Glu A»p: Glu Ala Asp Phè Tyr Cys Al.a Ala -Arg Asp Glu Ser Leu 85 90 95
Asn Gly Vai vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
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Gin Ser Vai Leu Thr Gin Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gin 1 5 10 15
Aro Vai Thr Ile Ser Gys Ser Gly Ser Ser Ser Asa Ile Gly Ser Asn 20 25 30
Tyr Vãl Tyr Trp Tyr Gift Gin Leu Pro Gly Ala Alá Pro Lys Leu Leu 35 40 45
Ile Phe Arg Asn Asn Gin Arg Pro Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Sér 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Sér Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Trp Vãl Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vãl Leu 100 105 110
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Asp lie Thr Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Ser Vai Ser Pro Gly 15 10 15
Gin Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asp Gly Arg Asn Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Pro 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Glu Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Leu Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly lie Tyr Tyr Cys Met Gin Ser 85 90 95
Phe Pro Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110
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Lys Vai Thr Ile #er Cys S©r Gly Ser Ser Ser Asn. Ile Gly' Asn Asn 20 2.5; 30
Tyr Vai Ser Tyr Gin Gin: Leu Pr© Gly Thr -Ala Pr©: 'Lya :Leu Leu 35 40 45
He Tpr Asp Asn Asn ''Lys Arg Pro S©r: Gly lie Pro Asp 'Arg Eh© Ser 50' 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Arg Leu 85 SO 95
Ser Ala Vai Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alai Ser Vai: Gly 1 5 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Lys Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arq Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu. Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu &amp;Sp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105
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Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Gly 20 25 30
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Asn Ser Leu 85 90 95
Cys Arg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pr© Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr :Leu Ser Cys Arg Ala Ser- Glu Ser Vai Ser Ser Gly 20 25 30
Tyr Lèu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pró Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 €0
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Asn Ser Leu 85 90 95
Ser Arg Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
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Asp lie Vai Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Vai Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser lie Leu Asp Ser 20 25 30
Ser Asn Asn Asp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Vai Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Asp Ile 100 105 110
Lys
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Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Asp 20 25 30
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Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Tyr Trp Thr Pro 85 90 95 lie Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105
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Tyr Vai Ser Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gin 65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asn Tyr Cys Cys Gly Thr Trp Asp Ile Gly Leu 85 90 95
Ser Vai Trp Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu 100 105 110
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Gin Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30
Gly Met His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Ala Vai Ile Ser Phe Asp Gly Se* He Lys Tyr Ser Vai Asp Se* Vai 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Sér Lys Asa Thr Leu Phe 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Th* Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Leu Asn Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Hls Tyr 100 105 110
Lys Tyr Tyr Gly Met Ala vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr vai 115 120 125
Ser Ser 130
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Glu Val 'Gin. Leu Hal, Glu Ser Gly Gly Gly Leu Hal Lys !pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala. .Ala Ser' Gly She· Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30
Trp Met Ser Trp Hal Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly Arg lie Lys Ser Thr Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Arg Thr Gly Tyr Ser lie Ser Trp Ser Ser Tyr 100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 115 120 125
Vai Ser Ser 130
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Glu Vai Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly leu Vai Gin Pro Gly Glu 1 | 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu. Trp Vai 35 rn ......45
Ser Ala. Ilè Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser vai 50 55 60
Lys Gly íArg· Phe Thr lie Ser' Arg Asp Asn Ser lys Asn Thr Lee, Tyr
65 70 75 SO
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 S5
Ala Lys Asp Gin Arg Glu Vai Gly Pro Tyr Ser Ser Gly Trp Tyr Asp 100 105 110
Tyr Tyr Tyr Sly Met. Asp Val Trp Sly Sin Sly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125
Ser Ser 130
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Sin Val Gin Leu Val Gin Ser Sly Ala Glu Val Lys Lys Pro Sly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg;; :Ser; Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gin Met Set lie lie Met Leu Arg Gly Val Phe Pro Pro 100 105 110
Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp VSl Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 115 120 125
Ser Ser 130
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Gin Val Gin lieu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser His Glu Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Pine Thr He Ser Arg Asp lie Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn let Leu Àrg Ala Glu Àsp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala ATg Glu Arg Lys Arg Val Thr Met Ser Thr LeU Tyr Tyr Tyr Phe 100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val set 115 120 125
Set
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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Phe lie Arg Ser Arg Ala Tyr Gly Gly Thr Pro Glu Tyr Ala Ala 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Thr lie 65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gin Met, Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95
Phe Cys Ala Arg Gly Arg Gly lie Ala Ala Arg Trp Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
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Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30
Trp: Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Gly- Arg" lie Lys Ser Lys Thr Asp Gly· Gly Thr Thr Asp Tyr Thr Ala 50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asa Thr €5 ' 70 75 80
Leu Tyr 'Leu Gin Met. Asn Ser Leu Lys .Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr S5 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Arg Thr Gly Tyr Ser lie Ser Trp Ser Ser Tyr 100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr
115 120 " MB
Val Ser Ser 130
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Gin Val Gin Leu Val Gin Sea? Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 i 10 15
Ser Val Lys Val Sar Cys Lys Ala Gar Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Tyr Mat Tyr Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Mat 35 40 45
Gly Trp 11« Gar Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Pha 50 55 60
Gin Gly Arg Val Tht Met Thr Arg- Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 SO
Met Glu Leu Get Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Ala Gly Leu Tyr Ser His Tyr Tyr 100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125
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Glu Vai Gin Leu Vai Glu Sen Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 ' 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Ala 20 25 30
Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60
Pro Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 7# 75 80
Leu. Tyr Leu Gift "Met Asa Ser· Leu Lys Thr Glu. Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95
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Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met ASp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr 115 120 125
Vai Ser: Ser· :1.30:
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Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asa Ala 20 25 30
Trp Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
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Pro Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asa Thr 65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Vai Tyr 85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Arg Thr Gly Tyr Sér Ile Sér Trp Ser Ser Tyr 100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Giy Met Asp Vai Trp Gly Gin Gly Thr Thr VaL Thr 115 120 125 vai Ser Ser 130
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Sly Mel His Trp: Val Arg: Gin Ala. Pro Sly Lys Sly Léu Glu Trp Val 35 40 45
Ala. ml He Ser" Pile Asp Sly Ser lie Lys Tyr Ser ml Asp·: 'Ser Val 50 55 60
Lys· Sly Arg Phe Thr lie· Ser Arg Asp Asn Ser Lys As® Thr Leu Phe 65 70 75 80
Leu Sin Mel As®. Ser Leu Arg Ala Glu Asp: 'Thr Ala. Val Tyr· Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg- Asp Arg Leu As®. Tyr Tyr Asp Ser' Ser Sly Tyr Tyr His Tyr 100 105 110
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Ser Ser 130
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Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ser He Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
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Val Ser Set 150
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
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Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Gat Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gly lie Ala Ala Ala Gly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 1Q0 105 110
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Leu Val Thr Val .Sér ser ll|
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Vai: Thr Vai· Ser Ser 115
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1 I ' 10 II
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Trp Leu Alã Leu lie Tyr Trp Thr Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60
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Polinucleótido sintético" <400> 197 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactactata tgtactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcccta atagtggtgg cacaaactat 180 gcccagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtctatcag cacagcctac 240 atggagctga gtaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgt gagaggagga 300 tatàgtggct acgctgggct ctactcccac tactacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 sgcsáèggtgs ccgtctctag t 381
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Polinucleótido sintético" <400> 198 caggtgeagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 eeetgeaagg cttctggata caccttcacc gcctactatt tacactgggt gcgaeãggec 120 eetggaeaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctc acagtggtgg çaeaaaetat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagçctac 240 atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt tctactgtgc gagaggaagg 300 eagtggctgg gctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc tagt 354 <210> 199 <211> 321
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 199 gacatccagá tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagttace 60 attacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgtt gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggtfieagcg gcagtggatc fcgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caaetfeatta ctgtctacag tataacactt aeccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg t^agafceaa g 321 <210> 200 <211> 393
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 200 gaggtaeagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc cctcagactc 6Õ" tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtattt ctgtaccaca 300 gatcggaccg ggtatagcat cagctggtct agttactact actactacgg tatggacgtc 360 tggggccaag ggaccacggt caccgtctct agt 393
<210> 201 <211> 393 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 201 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaactgatgg tgggacaaca 180 gactacactg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaatag cctgaaagcc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300 gatcggaccg ggtatagcat cagctggtct agttactact actactacgg tatggacgtc 360 tggggccaag ggaccacggt caccgtctct agt 393 <210> 202 <211> 393
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 202 gaggtacagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcggt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aaaetgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300 gatcggaccg ggtatagcat cagctggtct agttactact actactacgg tatggacgtc 360 tggggccaag ggaccacggt caccgtctct agt 393 <210> 203 <211> 393
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 203 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacgcctgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca caactgatgg tgggacaaca 180 gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240 ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtaccaca 300 gatcggaccg gatatagcat cagctggtct agttactact actactacgg tatggacgtc 360 tggggccaag ggaccacggt caccgtctct agt_393
<210> 204 <211> 393 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 204 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag çctetggâta caccttcagt acctatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagfcg ggtctcatcc attagtagfea gtagtagtta cagatattac 180; gcagactcag· tgaagggcdg attcaecãte tccagagaca aegceaagaa cteastgtat 240: ctgcaaatga gtagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaaggg 300 g£gtctgpea gttcgccgta tagcatcagc tggtacgact actattacgg tatggacgtc 360 tggggccaag ggaccacggt caccgtctct agt 393
<210> 205 <211> 390 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 205 gaggtgcagc tattggagtc tgggggaggc ttggtacage ctggggagtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctgggtt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ecagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtcg cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcaa 300 agggaggtag ggccgtatag cagtggctgg tacgactact actacggtat ggacgtctgg 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtctctagt 390
<210> 206 <211> 387 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial:
Polinucleótido sintético" <400> 206 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atttcatatg atggaagtca tgaatcctat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca tttccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt atttctgtgc gagagagagg 300 aaacgggtta cgatgtctac cttatattac tacttctact acggtatgga cgtctggggc 360 caagggacca cggtcaccgt ctctagt 387
<210> 207 <211> 390 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial:
Polinucleótido sintético" <400> 207 caggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgeag cctetggatt caccttcagt agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120 eeaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatttg ãtggaagtat taagtattet 180 gtagactecg tgaagggccg1 attCaCeatç tccagagaca attcaaagaa caCgctgttt 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 ctcaattact atgatagtag tggttattat cactacaaat actacggtat ggccgtctgg 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtctctagt 390 <210> 208 <211> 390
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 208 caggtgcagc tggtggaatc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctttggca tgcattgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatttg atggaagtat taagtactct 180 gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcaaagaa cacgctgttt 240 ctgcaaatga acagcctgcg agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300 ctcaattact atgatagtag tggttattat cactacaaat actacggtct ggccgtctgg 360 ggccaaggga ccacggtcac cgtctctagt 390 <210> 209 <211> 363
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 209 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtaaagc cagggcggtc cctgagactc 60 teetgtaeag cttctggatt cacctttggt gattatgcta tgagctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg gataggtttc attagaagca gagcttatgg tgggacacca 180 gaatacgccg cgtctgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc caaaaccatc 240 gcctatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtattt ctgtgctaga 300 ggacggggta ttgcagctcg ttgggactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctct 360 agt 363
<210> 210 <211> 378 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 210 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcatcatc tccagagata aatccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagcgggg 300 ggtatagcag cagctggcct ctactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctctagt_378 <210> 211 <211> 351
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 211 caggtgcagt tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 agctgcgctg tctatggtgg gtccttcggt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaggcac caagtacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt tctgtgcgag aggcgatgta 300 gtaggtttct ttgactattg gggccaggga accctggtca ccgtctctag t 351 <210> 212 <211> 354
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 212 cagatcacct taaaggagtc tggtcctacg ctggtgaaac ccacacagac cctcacgctg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggtg tgggtgtggc ctggatccgt 120 cagccccccg gaaaggccct ggagtggctt gcactcattt attggactga tgataagcgc 180 tacagtccat ctctgaagag caggctcacc atcaccaagg acacctccaa gaaccaggtg 240 gtccttagaa tgaccaacat ggaccctttg gacacagcca cttatttctg tgcacacaga 300 ccagggggct ggttcgaccc ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc tagt 354
<210> 213 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Péptido sintético" <400> 213
Gly Gly Gly Gly Gly Vai Asp Gly Gly Gly Gly Gly Vai 15 10
<210> 214 <211> 148 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 214
Met Ala Pit© Sly l«e»£ Arg Gly Leu Pro Arg Arg Sly Leu Trp Leu lieu 1 5 10 15
Leu Ala His His Leu Phe Met Val Thr Ala Cys Arg Asp Pro Asp Tyr 20 25 30
Gly Thr Leu lie Gin Glu Leu Cys Leu Ser Arg Phe Lys Glu Asp Met 35 40 45
Glu Thr lie Gly Lys Thr Leu Trp Cys Asp Trp Gly Lys Thr lie Gly 50 55 60 Sér Tyr Gly Glu Leu Thr His Cys Thr Lys Leu Val Ala Asn Lys lie 65 70 75 80
Gly "Cys Phe Trp Pro Ash Pro Glu Val Asp Lys Phe Phe lie Ala Val 85 90 95
His His Arg Tyr Phe Ser Lys Cys Pro Val Ser Gly Arg Ala Leu Arg 100 105 110
Asp Pro Pro- Ash :Ser lie Leu Cys Pro 'Phe lie Val Leu Pro lie Thr 115 120 125
Val. Thr Leu Leu Met Thr Ala. Leu Val Val Trp: Arg Ser- Lys Arg: ihr 130 135 140
Glu Sly lie Val 145 <210> 215 <211> 148
<212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 215
Met Alá. Arg Ala Leu Cys Arg Leu Pro Gin Arg Gly Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15
Leu Ala His His Leu Phe Met Ala Thr Ala Cys Gin Glu Ala Asn Tyr 20 25 30
Gly Ala Leu Leu Gin Glu Leu Cys Leu Thr Gin Phe Gin Val Asp Met 35 40 45
Glu Ala Val Gly Glu Thr Leu Trp Cys Asp Trp Gly Arg Thr lie Gly ...... 50 55 " 60
Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Cys Thr Trp His Met Ala Glu Lys Leu 65 70 75 80
Gly Cys Phe Trp Pro Asn Ala Glu Val. Asp: Arg Phe Phe Leu. Ala Val 85 90 95
His Gly' .His Tyr Phe Arg Ala Cys. Pro Ties Ser Gly Arg Ala Val Arg 100 105 110
Asp Pro Pro Gly Ser val Leu Tyr Pro Phe lie val Val Pro lie Thr 115 120 125
Val Thr' Leu Leu Val Thr· Ala Leu Val Val Trp Glu. Ser Lys His Thr' 130 1:35 140
Glu Gly He Val 145
<210> 216 <211> 148 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 216
Met Ala Arg Ala Leu Cys Arg Leu Pro Gin Arg Gly Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15
Leu Ala His His Leu Phe Met Ala Thr Ala Cys Gin Glu Ala Asn Tyr 20 25 30
Gly Ala Leu Leu Gin Glu Leu Cys Leu Thr Gin Phe Gin Val Asp Met 35 40 45
Glu Ala Val Gly Glu Thr Leu Trp Cys Asp Trp Gly Arg Thr lie Gly 50 55 60
Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Cys Thr Trp His Met Ala Glu Lys Leu M .......... 70..... '' 75 80 '
Gly Cys Phe Trp Pro Asn Ala Glu Val Asp Arg Phe Phe Leu Ala Val 85 90 95
His Gly Hie Tyr Phe Arg Ala: Cys Prg Tie ser Gly Arg Ala: Val Arg 100 105 110
Asp Pro Pro Gly Set· val. Leu Tyr Pro Phe lie Val. Val Pro. lie Thr 115 120 125
Val Thr Leu Leu Val Thr Ala Leu Val Val Trp Gin Ser Lys His Thr 130 135 140
Glu Gly lie Val 145
<210> 217 <211> 148 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 217
Met Ala Arg Ala Lea Cys Arg Leu Pro Arg Arg Gly Leu Trp Leu Leu 1 5 10 ' 1|
Leu Ala Hie His Leu Phe 'Met Thr Thr Ala Cys Arg Asp· Prc* Asp Tyr 20 21 " 30
Gly Thr Leu Leu Arg Glu Leu Cys Leu Thr Gin Phe Gin Val Asp Met 35 40 45
Glu Ala Val Gly Glu Thr Leu Trp Cys Asp Trp Gly Arg Thr lie Arg 50 55 60
Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Cys Thr Trp His Met Ala Glu Lys Leu 65 70 75 80
Gly Cys Phe Trp Pro Asn Ala Glu Val Asp Arg Phe; Phé L#u Ala VAI' 85 90 95
His Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Cys Pro lie Ser Gly Arg Ala Val Arg 100 105 110
Asp Pro Pro Gly Ser He Leu Tyr Pro Phe lie Val Val Pro He Thr 115 120 125
Vai Thr Leu. Leu Vai Thr Ala Leu Vai Vai Trp Gin Ser Lys Arg Thr 130 135 140
Glu Gly lie Vai
<210> 218 <211> 148 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 218
Met Ala Arg Ala Lea Cys Arg Leu Pro Arg Arg Gly Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15
Leu Ala His His Leu Phe Met Thr Thr Ala Cys Gin Glu Ala Asn Tyr 20 25 30
Gly Ala Leu Leu Arg Glu Leu Cys Leu Thr Arg Phe Lys Glu Asp Met 35 40 45
Glu Thr lie Gly Lys Thr Leu Trp Cys Asp Trp Gly Arg Thr Ile Arg 50 55 60
Ser Tyr Arg Glu Leu Ala Asp Cys Thr Trp His Met Ala Glu Lys Leu 65 70 '75 'Sf
Gly Qyg phe Trp Pro Asn Ala Glu Vai Asp Arg Phe Phe Leu Ala Vai 85 90 95
His Gly Arg Tyr Phe Arg Ser Gys Pro lie Sex Gly Arg Ala Val Arg 100 105 110
Asp Pro Pro· Gly Her lie leu Tyr Pro· Phe. lie Val Val Pro·· He Thr 115 1:20 125
Val Thr lieu Lem Val Thr Ala Lem Val Val Tip Gin Ser Lys Arg Thr :130 1:35 "" 140
Glu Gly lie: Val 145
<210> 219 <211> 148 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polipéptido sintético" <400> 219
Met Ala Arg Ala Lem Gys Arg Lem Pro Arg Arg Gly Lem Trp Leu Lem 1 5 10 15
Leu Ala His His Leu Phe Met Thr Thr Ala Cys Gin Glu Ala Asn Tyr 20 25 30
Gly Ala Lem Leu Arg Glm Leu Cys Lem Thr Gin Phe Gin Val Asp Met 35 40 45
Glu Ala. Vai Gly Glu Thr Leu Trp Cys Asp; :frp Gly Arg Thr Ile Arg so IS 60
Se® Tyr Gly Glu, Leu Thr His Cys Thr Lys: Leu Vai Ala Asn Lys Leu. 63: 70 75 80
Gly Cys Phe Trp Pro Asn Ala Glu Vai Asp Arg Phe Phe Leu Ala Vai.. 85 9Q 95
His Gly Arg Tyr Phe Arg Sér Cys Pro lie Ser Gly Arg Ala Vai Arg 100 105 110
Asp Pro Pro Gly Ser lie ..Leu Tyr Pro Phe lie Vai Vai Pro lie Th® 115 120 125
Vai Thr Leu Leu Vai Thr Ala Leu Vai Vai Trp Gin Ser Lys Arg Thr 1:50 155 140
Glu Gly lie Vai 145 <210> 220 <211> 464 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 220
Met Met Asp LyS Ays Gy# Thr Leu Gy® S*hé 'Léu Phe Leu Léu Léu Léu 1.............. $..... 10 15
Asn Met· Ala Léu He Alá; Ala Glu Ser Glu Glu Gly Ala Ash Gin Thr 20 25 30
Asp Leu Gly Vai Thr Arg Asn Lys lie Met Thr Ala Gin Tyr Glu Cys 35 40 45
Tyr Gin Lys lie Met Gin Asp Pro lie Gin Gin Gly Gin Gly Leu Tyr 50 m' 60
Cys Asn Arg Thr Trp Asp Gly Trp Leu Cys Trp Asn Asp Val Ala Ala 65 70 75 80
Gly Thr Glu Ser Met. 'Gin Tyr Cys Pr®: Asp Tyr Phe Gin Asp Phe; Asp 85 90 ' St·
Pro Ser Glu Lys Val Thr Lys lie Cys Asp Gin Asp Gly Asn Trp Phe 100 105 110
Arg His Pr# Asp Ser Asn Arg Thr Trp Thr Asn Tyr Thr Leu Cys Asn 115 120 125
Asn Ser Thr His Glu Lys Val Lys Thr Ala Leu Asn Leu Phe Tyr Leu 130 135 140
Thr lie lie Gly His Gly Leu Ser lie Ala Ser Leu lie lie Ser .Leu 145 150 155 168 lie lie Phe Phe Tyr Phe Lys; Ser Leu Ser Cys: 'Gin Arg lie Thr Leu 165 170 175
His Lys Asn Leu Phe Phe Ser Phe Val Cys Asn Ser lie Val Thr lie 180 185 190; lie ,Bi:e Leu Thr Ala. Val Ala Asn Asn Girt Ala "Leu Val Ala Thr Asn 1,9:5.. 200; 2 05
Pro: 'Val Ser Gys :Lys Val Ser 'Gin Phe lie His ,Leu Tyr Leu Met Gly 210 215 220
Cys Asn Tyr Phe Trp Met Leu Cys Glu Gly lie Tyr Leu His Thr Leu 225 230 235 240 lie Val Val Ala Val Phe Ala Glu Lys Gin His Leu Met Trp Tyr Tyr 245 250 255
Phe Leu Gly Trp Gly Phe Pro Leu Leu Pro Ala Cys lie His Ala lie 260 265 270
Ala Arg Ser' Leu Tyr Tyr Asn Asp Asn Cys Trp lie Sear Ser Asp Thr 275 280 285
His Leu Leu Tyr lie lie His Gly Pro lie Cys Ala Ala Leu Leu Val 290 295 300
Asn Leu Phe Phe Leu Leu Asn lie :Val Arg Val Leu lie Thr Lys Leu 305 310 315 320
Lys Val Thr His Gin Ala Glu Ser Asn Leu Tyr Met Lys Ala Val Arg 325 330 335
Ala Thr Leu lie Leu val Pro Leu Leu Gly lie Glu Phe Val Leu Phe 340 345 350
Pro Trp Arg Pro Glu Gly Lys Val Ala Glu Glu Val Tyr Asp Tyr Val 355 360 865
Met His lie Leu Met His Tyr Gin Gly Leu Léu Val Ser Thr lie Phe 370 375 380
Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Gin Ala lie Leu Arg Arg Asn Trp Asn 385 390 395 400
Gin Tyr Lys lie Gin Phe Gly Asn Gly Phe Ser His Ser Asp Ala Leu 405 410 415
Arg Ser Ala Ser Tyr Thr val Ser Thr He Ser Asp Val Gin Gly Tyr 420 425 430
Ser His Asp Cys Pro Thr Glu His Leu Asn Gly Lys Her lie Gin Asp 435 440 445 lie Glu Asn Val Ale Leu Lys Pro Glu Lys Met Tyr Asp Leu Val Met 450 455 460
<210> 221 <211> 461 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 221
Met Glu Lys Lys Cys Thr Leu Tyr Phe Leu Val Leu Leu Pro Phe Phe 15 10 15
Met lie Phe Val Thr Ala Glu Leu Glu Glu Ser Pro Glu Asp Ser lie 20 25 30
Gin Leu Gly Val Thr Arg Asn Lys lie Met Thr Ala Gin Tyr Glu Cys 35 40 45
Tyr Gin Lys lie Met Gin Asp Pro lie Gin Gin Ala Glu Gly Val Tyr 50 55 60
Cys Asn Arg Thr Trp Asp Gly Trp Leu Cys Trp Asn Asn Val Ala Ala 65 70 75 80
Gly Thr Glu Ser Met Gin Leu Cys Pro Asp Tyr Phe Gin Asp Phe Asp 85 90 95
Pro Ser Glu Lys Val Thr Lys lie Cys Asp Gin Asp Gly Asn Trp Phe 100 105 110
Arg His Pro Ala Ser Asn Arg Thr Trp Thr Asn Tyr Thr Gin Cys Asn 115 120 125
Val Asn Thr His Glu Lys Val Lys Thr Ala Leu Asn Leu Phe Tyr Leu 130 135 140
Thr lie lie Gly His Gly Leu Ser lie Ala Ser Leu Leu lie Ser Leu 145 150 155 160
Gly lie Phe Phe Tyr Phe Lys Ser Leu Ser Cys Gin Arg lie Thr Leu 165 170 175
His Lys Asn Leu Phe Phe Ser Phe Val Cys Asn Ser Val Val Thr lie 180 185 190 lie His Leu Thr Ala Val Ala Asn Asn Gin Ala Leu Val Ala Thr Asn 195 200 205
Pro Val Ser Cys Lys Val Ser Gin Phe lie His Leu Tyr Leu Met Gly 210 215 220
Cys Asn Tyr Phe Trp Met Leu Cys Glu Gly lie Tyr Leu His Thr Leu 225 230 235 240 lie Val Val Ala Val Phe Ala Glu Lys Gin His Leu Met Trp Tyr Tyr 245 250 255
Phe Leu Gly Trp Gly Phe Pro Leu lie Pro Ala Cys lie His Ala lie 260 265 270
Ala Arg Ser Leu Tyr Tyr Asn Asp Asn Cys Trp lie Ser Ser Asp Thr 275 280 285
His Leu Leu Tyr lie lie His Gly Pro lie Cys Ala Ala Leu Leu Val 290 295 300
Asn Leu Phe Phe Leu Leu Asn lie Val Arg Val Leu lie Thr Lys Leu 305 310 315 320
Lys Val Thr His Gin Ala Glu Ser Asn Leu Tyr Met Lys Ala Val Arg 325 330 335
Ala Thr Leu lie Leu Val Pro Leu Leu (Sly lie Glu Phe Val Leu He 340 345 350
Pro Trp Arg Pro Glu (Sly Lys tie Ala Glu Glu Val Tyr Asp Tyr lie 335: 360 365;
Met His He :Leu Met His: Phe Gin Gly Leu Leu Val Her' Thr He Phe 370 375 380
Cys Phe Phe Asn Gly Glu Val Gin Ala He Leu Arg Arg Asn Trp Asn 385 390 395 400
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Arg Ser Ala Ser Tyr Thr Val Ser Thr lie Ser As» Gly Pro Gly Tyr 420 425 430
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<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 253 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 cgctgtgagg tacagctggt ggagtcfcggg ggaggcttgg taaagcctgg ggggtccctc Í2Ò
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<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 254 a^ggg#afega gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 egctgtgagg tacagctggt ggagtctggg ggaggcttgg taaagcctgg ggggtccett 120 agactctect gtgcagcctc tggattcact ttcggtaacg cetggatgag ctgggtccgc 180 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtt ggccgtatta aaagcaaaac tgatggtggg 240 adaacagact aggdfegeaeè cgtgaaaggc agattcaeca tctcaagaga tgattcaaaa 300 aacacgetglfc atctgcaaat gaacagcctg aaaacegagg acacagccgt gtattactgt 360 accacagatc ggaccgggta tagcatcagc tggtctagtt actactacta ctacggfcatg 420 gacgtctggg geeaagggae cacggtcacc gtctctagtg cctccaccaa gggcccatcg 480 gfcefefeecGee tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc 540 efcggfegaagg; actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc 600 agcggcgtgc acaccttccc agctgtecta eagtectcag gactctactc cctcagcagc 660 gtggtgaceg tgccctccag caacttcggc aggg^aggti acacctgcaa cgtagatcae 720 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgecca 780 ccgtgcccag caccacctgt ggcaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840 gacaccctca tgatctcccg gaeggèfcgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac 900 gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960 acaaagccac gggaggagca gttcaacagc acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt 1020 gtgcaecagg actggctgaa eggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 1080: ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa accaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140 tacaocctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1200 gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260 aacaactaca agaccacacc tcccatgctg gactccgacg gctccttctt eetctacagc 1320 aagceeaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380 .©afcgaggefce tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1437 <210> 255 <211> 1431
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 255 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 cgctgtcagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc 180 caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttattt catatgatgg aagtcatgaa 240 tcctatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacatttc caagaacacg 300 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgtgtattt ctgtgcgaga 360 gagaggaaac gggttacgat gtctacctta tattactact tctactacgg tatggacgtc 420 tggggccaag ggaGGaGggd caccgtcfcct agtgccdcca ccaagggccc atcggtcttc 480 cocctggGgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc 540 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg dcgdggaaefc caggcgctct gaccagcggc 600 gtgcacacct fceceagefegt cctacagtcc tcaggactct actccctcag eagcgtggtig 660 accgtgccct eeagcaactt cggcacccag acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc 720 agcaacaeea aggteggacaa gacagttgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc 780 ccagcaccac etgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc cceeaaaace caaggacacc 840
GtdatgaGGte GGGggàGGdG tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900 cccgaggtcc agttcaactg gfcacgtggac ggcgtggagg tgeataatgc caagacaaag 960
Gdacgggagg: agGâgdfcGaá GagGádgGfcG. dgfcgtggtGa. gcgtcctcac cgttgfcgdae 1020 caggactggG tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ecaaGaaagg Gctcceagee 1080 .CGdaddfaga a&amp;addaddlSd caaaacGiad· gggcagcccc gagaaccaca ggfcgiGdacc- 1140 etgccdcsafe GGGgggagga gatgaccaag aaceaggtea gcctgacctg Gctggtcaaa 1200 ggct-tG-fcaGG: ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcG ggagaacaac :12-60 't.acaagaedS eacctcccat getggaetea gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320· accgtggaca agagdaggtg' geagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380 gctdtgdada aGeâct-deac geagaagagd: ctctccctgt GG«sgggfeàa: &amp; 1-4-31 <210> 256 <211> 1434
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 256 atggacatga gggfcgsgggc tcagc-tectg gggetcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 egefcgfceagg tgcagctggt ggaatctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120 .ggaetectecli: gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct ttggcatgca fctgggtccgc 180 caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat catttgatgg aagtattaag 240 taatetgtag actccgtgaa gggcagattc accatctcca gagacaattc aaagaacacg 300
Gfcgfefcfectgc aaatgaacag cctgcgagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360 gateggefeca afetactatga tagtagtggt tattatcact acaaatacta cggtctggcc 420 gtgfeggggec aagggaccac ggtçaccgte tctagtgcct ccaccaaggg cccatcggtc 480 ttcee&amp;Gtgg cgccctgctc caggagcacc tccgagagca cagcggccct gggctgcctg 540 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc 600 ggcgtgcsaca ccttcccagc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 660 gtgaccgtgc cctccagcaa cttcggcacc cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag 720 cccagcaaca ccaaggtgga caagacagtt gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg 780 tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840 acGcteatga tctcçcggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900 gaccecgagg tccagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960 aagccacggg aggagcagtt caacagcacg ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg 1020 eageaggaet ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140 a#e<^geeee catcccggga ggagatgacc aagaâccagg tcagccfegac ctgcctggtc 1200 -aaagge®fcels acGccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260 aactacaaga ccacacctcc catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320 ctcacçgtgg acaagagcãg gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1434 <210> 257 <211> 1437
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 257 afcggacafega: gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 cgctgtgagg tgcagctggt ggagfcetggg ggaggcctgg tcaagcctgg ggggtccctg 120 sgidfeefeset· 'gfcggâgôgfeg tggafe^oâCsè ttcagtàccfe atagcatgaa ctgggtccgc 180 caggctocag ggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacaga 240 fc^fcaggeag 'a^fcfiagfcgaa ggggegafcfeG accatctcca gagacaacgc caagaactca 300 efcgtatctge aaatgagtag cctgagagce gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360 gaaggggtgii ctggcagttc gGcgtatagc atcagctggt acgactacta ttacggtatg 420 gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc gtctctagtg cctccaccaa gggcccatcg 480 gteefeteecfieei tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc 540 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtegt ggaactcagg cgctctgacc 600 ..aggggegtgg agaggttcec agctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660 gtggtgaccg egeegtccag' caacttcggc acccagacct acacctgcaa cgtagatcac 720 aagcccagca aeaegaaggt ggacaagaca gttgagcgca aatgttgtgt cgagtgccca 780 gegfegGcSag Gaccacctgt ggcaggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccac 900 gaagaccccg aggtccagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960 acaaagccac gggaggagca gttcaacagc acgttccgtg tggtcagcgt cctcaccgtt 1020 gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 1080 ccagccGcca tcgagaaaaG catctccaaa accaaagggc agccccgaga accacaggtg 1140 tacaeecfcgc cccGatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgeet,g 1200 gtGaáàggefc tdtaGCdcag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260 aacaastaea agaccacacc tcccatgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1320 aa|tGfc#acieg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380 eafegagicfce tgcacaaGca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1437 <210> 258 <211> 1422
<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <221> fonte <223> /nota="Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido sintético" <400> 258 atggacatga gggtgcccgc tcagctcctg gggctcctgc tgctgtggct gagaggtgcg 60 cgctgtcagg tgeagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120 agactctcct gtgcagcgtc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc 180 caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat ggtatgatgg aagtaataaa 240 tactatgçag actccgtgaa gggccgattc atcatctcca gagataaatc caagaacacg 300 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360 gcggggggta tagcagcagc tggcctctac tactactacg gteátjggaegíi ctggggccaa 420 gggaccacgg tcaecgtctc tagtgcctee accaagggcc catcggtctt ccccctggcg 480 ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca gegggggtLgg gctgcctggt caaggactac 340 ttecccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc 600 ttcceâgefcg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 660 tccagcaact tcggcaccca gacctacacc tgcaacgtag atcacaagce cagcaacacc 720 aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca 780 çctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 840 tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc 900 cagfclcááefe ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag 960 gageagttísa acagcacgtt ccgtgtggtc agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg 1020 ^igáagggsía aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ^gfcgeõagç ccccatcgag 1080 aaaaceafcGfc ccaaaaccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgecccca 1140 tcccgggagg agatgággaa gaaccaggtc agggfcl&amp;gçt; gcctggtcaa aggcttctac 1200 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa otacaagacc 1260 acacctcGca tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1320 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1380 aacÈagfâea cgcagaagag cctctcectg tctccgggta ãa 1422
<210> 259 <211> 981 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 259 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtectca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacaectgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag caggfeÈGegt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt. tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtcfccca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaceacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 èaggfceageíe tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcge egtggagbgg 780 gagagcaatg ggfeagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 840 ggctcctiiGt:: tcctctacag caagctcaec gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 900 gtCttctcat gctoegtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 960 teegigtetc cgggtaaatg a 981
<210> 260 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 260 .ggfcaeggfcgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaafcet 60 ggaagtgecfe ctgttgtgtg Gctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtaeag 120 tggaaggfcgg ataacgccct ccaatcgggt aactccoagg agagtgtcac agagcaggac 180 agâaággagá gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgâgcaaagc agactacgag 240 aaaeaeaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcaeaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 261 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 261 ggtcagccca aggsgaagc# cáctgtcact ctgttcccgc cctcctctga ggagctccaa 60 gccaacaagg ccacactagt gfcgtetgatc agtgacttet acccgggagc tgtgaeagtg 120 gegeggaagg cagatggcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccâecaa. accctccaaa 180
Gagaggaaga acaagtacgc ggccagcagc tacctgagcc tgacgcccga gcagtggaag 240 GGGeagagaa gctacagctg ccaggtcacg catgaaggga gcaccgtgga :gaagagagtg 300 gqgecfeacag aalgtteeata g 321
Lisboa, 9 de novembro de 2017

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio que se liga ao recetor de CGRP humano compreendendo uma CDRHl, uma CDRH2, uma CDRH3, uma CDRLl, uma CDRL2 e uma CDRL3, em que: (a) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das 42, 43 e 44, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 73, 74 e 75, respetivamente; (b) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 45, 46 e 47, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 76, 77 e 78, respetivamente; (c) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 48, 49 e 50, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 79, 80 e 81, respetivamente; (d) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 51, 52 e 53, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 82, 83 e 84, respetivamente; (e) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 54, 55 e 56, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 85, 8 6 e 87, respetivamente; (f) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 57, 58 e 59, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 88, 89 e 90, respetivamente; (g) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 60, 55 e 56, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 85, 8 6 e 87, respetivamente; (h) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 45, 61 e 47, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 76, 91 e 78, respetivamente; (i) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 62, 63 e 64, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 92, 93 e 94, respetivamente; (j) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 45, 61 e 47, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 76, 95 e 78, respetivamente; (k) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 65, 55 e 56, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 85, 8 6 e 87, respetivamente; (l) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 42, 43 e 44, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 73, 74 e 96, respetivamente; (m) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 66, 67 e 68, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 97, 98 e 99, respetivamente; (n) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 69, 70 e 71, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 100, 101 e 102, respetivamente; ou (o) CDRLl, CDRL2 e CDRL3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 69, 70 e 72, respetivamente e CDRHl, CDRH2 e CDRH3 possuem a sequência das SEQ ID N°: 100, 101 e 102, respetivamente.
  2. 2. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio compreende: (a) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 137 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:158; (b) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 138 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 159; (c) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 139 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:160; (d) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 140 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:161; (e) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 141 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 162; (f) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 142 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 158; (g) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 143 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:163; (h) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 144 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:162; (i) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 145 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:158; (j) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 146 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:164; (k) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 147 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:165; (l) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 148 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:166; (m) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N° : 148 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:167; (n) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 149 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:162; (o) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 150 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:168; (p) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 151 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:169; (q) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 152 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:170; ou (r) um VL compreendendo a sequência da SEQ ID N°: 153 e um VH compreendendo a sequência da SEQ ID N°:170.
  3. 3. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio é selecionado do grupo consistindo num anticorpo monoclonal, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um diacorpo e um anticorpo de cadeia simples.
  4. 4. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo num anticorpo totalmente humano, um anticorpo humanizado e um anticorpo quimérico.
  5. 5. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo do tipo IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4.
  6. 6. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 5, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo IgGl ou IgG2.
  7. 7. Polinucleótido isolado que codifica um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1-6.
  8. 8. Vetor de expressão compreendendo o polinucleótido isolado da reivindicação 7.
  9. 9. Linha celular transformada com o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 8.
  10. 10. Método de preparação de um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, compreendendo preparar o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio a partir de uma célula hospedeira que secreta o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio.
  11. 11. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que: o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio compreende uma cadeia leve de anticorpo da SEQ ID N° 17 e uma cadeia pesada de anticorpo da SEQ ID N° 29.
  12. 12. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio compreende uma cadeia leve de anticorpo da SEQ ID N°:17 menos quaisquer sequências sinal e uma cadeia pesada de anticorpo da SEQ ID N°:29 menos quaisquer sequências sinal.
  13. 13. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antigénio compreende: (i) uma CDRLl compreendendo a SEQ ID N°:42, uma CDRL2 compreendendo a SEQ ID N°:43, uma CDRL3 compreendendo a SEQ ID N°:44, uma CDRHl compreendendo a SEQ ID N°:73, uma CDRH2 compreendendo a SEQ ID N°:74 e uma CDRH3 compreendendo a SEQ ID N°:75; ou (ii) um VL compreendendo a SEQ ID N°:142 e um VH compreendendo a SEQ ID N°:158.
  14. 14. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 ou 11 a 13 para utilização no tratamento de um estado associado com o recetor de CGRP, em que o estado é dor de cabeça.
  15. 15. Anticorpo ou seu fragmento de ligação a antigénio de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6 ou 11 a 13 para utilização no tratamento de um estado associado com o recetor de CGRP, em que o estado é enxaqueca. Lisboa, 9 de novembro de 2017
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