PT1394179E - Processo para a produção de eritropoietina isenta de proteínas animais - Google Patents

Description

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Descrição "Processo para a produção de eritropoietina isenta de proteínas animais" A invenção é relativa a um processo para a remoção de estabilizadores de preparados de eritropoietina obtidos por produção recombinante, em condições de cultura isentas de soro. Ά eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína humana que estimula a formação de eritrócitos. A sua acção e aplicação terapêutica estão descritas pormenorizadamente, por exemplo, em EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 e EP-B 0 411 678 bem como em Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121 e Sasaki, H. et al. , J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. A eritropoietina para uso terapêutico é produzida por via recombinante (EP-B 0 148 605 e EP-B 0 209 539) . A produção recombinante de eritropoietina é geralmente realizada em células CHO com adição, ao meio de cultura, de soro fetal de vitela e, opcionalmente, de insulina bovina. Como resultado, um preparado de EPO produzido deste modo contém, mesmo após purificação, pelo menos vestígios de substâncias que são derivadas destes aditivos. Estes podem ser, por exemplo, vírus e agentes comparáveis, quantidades residuais de proteínas bovinas e/ou ADN bovino. É sabido que uma fermentação, isenta de soro, de células CHO recombinantes, que contêm um gene de EPO, pode ser realizada utilizando métodos do estado da arte. Tais 2 processos encontram-se descritos, por exemplo, em EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 e de uma forma geral em Kawamoto, T. et al. , Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. e Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B,, Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967. Verificou-se que, numa cultura isenta de soro de células hospedeiras eucarióticas produzindo EPO, a proporção de proteínas da célula hospedeira relativamente à quantidade total de proteínas é mais do dobro da de uma cultura em meio que contenha soro. Uma tal preparação de proteínas também contém ácidos nucleicos das células hospedeiras em quantidades não desprezíveis.

Na EP-A 0 267 678 são descritas, para a purificação de EPO produzida em cultura isenta de soro, após diálise, uma cromatografia de permuta iónica em S-Sepharose, uma HPLC preparativa de fase reversa numa coluna C8 e uma cromatografia de filtração por gel. Neste caso o passo da cromatografia de filtração por gel pode ser substituído por cromatografia de permuta iónica em S-Sepharose fast flow. Também se propõe que se realize uma cromatografia com corante numa coluna de Blue Trisacryl antes da cromatografia de permuta iónica. A EPO purificada deste modo apresenta uma pureza de cerca de 99%, mas ainda contém quantidades consideráveis de proteína e ADN da célula hospedeira.

Na EP-A 0 513 738 encontra-se descrito um processo para a produção de EPO em células de mamífero sem se entrar em detalhes quanto à purificação. 3

Um processo para a purificação de EPO recombinante encontra-se descrito por Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. Neste processo a EPO é, no entanto, tratada com uma solução de Tween(R) 20, fluoreto de fenilmetilsulfonilo, etilmaleimida, pepstatina A, sulfato de cobre e ácido oxâmico antes dos passos de purificação. Embora o preparado farmacêutico apenas contenha vestígios destes aditivos, estes são críticos do ponto de vista terapêutico.

Para uma utilização terapêutica é ainda preferido que um preparado terapeuticamente eficaz esteja completamente isento de proteínas e ácidos nucleicos de células de mamífero e consideravelmente isento de proteínas e ácidos nucleicos da célula hospedeira. A invenção é relativa a um processo para a remoção de um ou mais estabilizadores seleccionados de entre o grupo álcool polivinílico, metilcelulose, polidextrano, polietilenoglicol, pluronic F68, expansor do plasma poligelina (HEMACCEL) ou polivinilpirrolidona, de um preparado de proteínas com actividade de eritropoietina, obtido por produção recombinante, em condições de cultura isentas de soro, através de purificação cromatográfica do preparado de proteínas obtido do sobrenadante das células por cromatografia de afinidade com corante, cromatografia hídrófoba, cromatografia em hidroxiapatite, cromatografia de fase reversa e cromatografia de permuta aniónica, caracterizado por à cromatografia de afinidade com corante se seguir, como segundo passo, uma cromatografia hídrófoba. Para se obter e isolar um preparado de EPO com esta especificação, de preferência com um rendimento elevado, é necessária a combinação dos passos do processo de acordo com a invenção. 4 0 preparado de EPO pode ser obtido, de preferência, após cultivo de uma célula hospedeira, que produza eritropoietina e seja caracterizada por: a) um teor de proteínas derivadas da célula hospedeira não superior a 100 ppm (p/p) , de preferência 40 ppm ou menos, e de maior preferência 20 ppm ou menos, b) um teor de ADN da célula hospedeira não superior a 10 pg por 83 pg EPO, de preferência 1 pg por 83 pg EPO ou menos, e através disso, que c) o preparado esteja completamente isento de proteínas naturais de mamífero que não sejam derivadas da célula hospedeira.

Por proteína com actividade de eritropoietina entende-se uma proteína que apresenta a função biológica da EPO. Esta função biológica consiste em estimular os processos de diferenciação e divisão em células precursoras eritróides e, assim, fornecer eritrócitos. Esta proteína é nas suas propriedades, de preferência, idêntica ou sensivelmente idêntica à eritropoietina humana e é constituída por 166 aminoácidos, tem um peso molecular de cerca de 34-38 kD e uma percentagem de resíduos de glicosilo no peso molecular de cerca de 4 0%. Os derivados e os fragmentos de EPO que apresentam uma actividade análoga e que são produzidos após cultivo de uma célula hospedeira produtora de EPO, podem também ser produzidos sob forma pura por processos de acordo com a invenção. As sequências de ADN e proteínas da EPO humana são descritas, por exemplo, em EP-B 0 205 564 e EP-B 0 209 539.

Por "completamente isento de proteínas naturais de mamífero" entende-se que, devido ao facto de não serem 5 adicionadas proteínas estranhas de fontes naturais como albumina de soro bovina ou soro fetal de vitela durante a cultura da célula hospedeira, tais proteínas estranhas não se encontram presentes no preparado em quantidades detectáveis. O preparado encontra-se, assim, completamente isento de tais proteínas de mamífero adicionadas tal como planeado, que não são derivadas da célula hospedeira e que são habitualmente adicionadas ao meio de cultura numa cultura isenta de soro para manter e melhorar o crescimento celular e para optimizar o rendimento. Por proteínas naturais de mamífero entendem-se proteínas de mamífero de origem natural tal como de material humano ou de material animal mas não proteínas de mamífero recombinantes que são produzidas por exemplo em procariontes, tais como E. coli.

Tais proteínas de mamífero adicionadas durante a cultura celular são, por exemplo, albumina de soro bovino, soro fetal de vitela, transferrina (humana ou bovina), insulina (porcina ou bovina) ou gelatina.

Por "célula hospedeira" entende-se uma célula animal ou humana, cujo genoma contenha um gene de EPO activo e este gene de EPO seja transcrito e traduzido durante a cultura da célula num meio isento de soro. O gene de EPO pode ser introduzido nesta célula hospedeira como um gene exógeno, de preferência com elementos de regulação (confrontar, por exemplo, com EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539), pode já encontrar-se presente na célula hospedeira como um gene endógeno activo ou ser activado como um gene endógeno não activo. Uma tal activação de genes endógenos pode ser conseguida, por exemplo, pela introdução específica de elementos de regulação no genoma, por exemplo, por recombinação homóloga. Tais métodos são 6

conhecidos e encontram-se descritos, por exemplo em WO 91/09955.

Como células hospedeiras utilizam-se habitualmente células de mamífero. Se for introduzido um gene de EPO humano exógeno, podem utilizar-se como células hospedeiras, por exemplo, células CHO ou BHK. Se para a expressão for utilizado um gene de EPO endógeno, é conveniente utilizar células humanas, tais como por exemplo células de rim, de fígado ou linfáticas.

Por "proteínas derivadas da célula hospedeira" entendem-se as proteínas que se formam durante a cultura das células hospedeiras contendo o gene EPO activo e que apresentam as especificações de EPO acima descritas. O teor de proteína é reportado em ppm relativo a peso (p/p) . O teor destas proteínas pode ser determinado, por exemplo, por ELISA baseado em anticorpos policlonais dirigidos contra as proteínas da célula hospedeira. Tais anticorpos policlonais são obtidos por imunização de animais, de preferência ovelhas, com um extracto das proteínas da célula hospedeira (proteínas extracelulares e intracelulares). O teste é de preferência executado como um teste "sandwich", utilizando um anticorpo policlonal imobilizado e um segundo anticorpo marcado com peroxidase. Como Standard utiliza-se o extracto total de proteína. O limite inferior de detecção de um tal teste é de cerca de 15 ng de proteína por ml. Para uma concentração de EPO normal de cerca 3,0 mg/ml isto corresponde a uma quantidade de 5 ppm de proteínas da célula hospedeira como a mais baixa quantidade detectável. Assim a preparação de acordo com a invenção, contém, de preferência, proteínas da célula hospedeira numa quantidade de 5 ppm a 100 ppm. De particular preferência é a utilização de um preparado de 7 EPO em que as proteínas da célula hospedeira já não sejam detectáveis deste modo.

Por "ADN da célula hospedeira" deve entender-se a quantidade total de ADN desta célula hospedeira (ADN genómico, ribosomal, mitocondrial etc.). Este teor inclui também o ADN que codifica a EPO e que fora obtido por exemplo por transformação com um ADN exógeno. É útil relacionar isto com a dosagem terapêutica da EPO habitualmente utilizada que é de 83 pg. 0 teor de ADN da célula hospedeira é determinado por um teste de hibridização, utilizando detecção de radioactividade ou fluorescência. Como sonda de ADN utiliza-se O ADN total da célula hospedeira. Este ADN total é utilizado como Standard neste teste. 0 limite inferior de detecção de um tal teste de hibridização é de cerca de 1 pg ADN / 83 yg EPO. 0 preparado de acordo com a invenção contém de preferência ADN da célula hospedeira numa quantidade de 1-10 pg, ou com maior preferência menos de 5 pg por 83 yg EPO. A situação mais preferida é a de que, deste modo, o ADN já não possa ser detectado no preparado (^1 pg ADN).

Verificou-se, surpreendentemente, que com este processo se pode obter EPO de elevada pureza e com elevado rendimento, de preferência numa cultura isenta de soro. Assim, em relação ao processo descrito por Nobuo, I., et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359, num teste ELISA competitivo obtém-se, para a EPO, um rendimento aumentado por um factor de cerca de 2 vezes (25% comparativamente com cerca de 13% de acordo com Nobuo et al.). O teste ELISA competitivo utilizado para a detecção da EPO foi executado com os seguintes passos: Revestimento de uma microplaca de titulação com um anticorpo policlonal dirigido contra Fcy de ratinho; reacção com um anticorpo monoclonal contra EPO de ratinho; competição entre a sonda de EPO e a EPO marcada com peroxidase; reacção do substrato Φ com ABTS (2,2'-azino-di-e(3 -)etilbenzotiazolinassulfonato (6) .

0 preparado de proteína será produzido, de preferência, em lotes de 0,1 - 10 g. Surpreendentemente, verificou-se que, uma purificação adequada da EPO para aplicação terapêutica, após cultura num meio que esteja isento de proteínas naturais de mamífero, apenas pode ser alcançada quando à cromatografia de afinidade com um corante se segue, como segundo passo, uma cromatografia hidrófoba. Surpreendentemente, não é necessária uma adição de inibidores da protease (por exemplo CuS04) antes da purificação por cromatografia, tal como descrita em Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359 ou em WO 86/07494. A cromatografia hidrófoba é realizada, de preferência, num suporte alquilado (C4-Ci8) ou arilado (fenilado ou benzilado). Com especial preferência utiliza-se um suporte butilado. Neste caso o rendimento do processo de purificação e a pureza da proteína são particularmente elevados. A expressão de um ADN que codifica a EPO numa célula hospedeira eucariótica pode ser realizada, por exemplo, por transfecção de uma célula hospedeira adequada, de preferência células CHO, com um ADN exógeno que codifica a EPO. Também é possível activar um gene para EPO endógeno que se encontre inactivo na célula (por exemplo células humanas de rim), por exemplo, por um processo de recombinação homóloga (WO 91/09955 e WO 93/09222). O cultivo de células hospedeiras, contendo um gene de EPO activo, é realizada de um modo conhecido para um perito na 9 arte numa cultura à qual não se adicionaram proteínas de mamífero de origem natural. No entanto, nesta cultura são geralmente adicionadas insulinas, albuminas e transferrinas produzidas por via recombinante (de preferência em procariotas, tais como E. coli).

Um meio isento de soro, que seja adequado no âmbito da invenção, contém, por exemplo, como meio DMEM/F12 (por exemplo GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, Referência N°. 57-736) e adicionalmente hidrogenocarbonato de sódio, L(+)glutamina, D(+)glucose, insulina recombinante, selenite de sódio, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de ferro(II), asparagina, ácido aspártico, serina e um estabilizador de células de mamífero tal como, por exemplo, álcool polivinílico, metilcelulose, polidextrano, polietilenoglicol, pluronic F68, expansor de plasma poligelina (HEMACCEL) ou polivinilpirrolidona.

Uma vantagem essencial do processo para a purificação de EPO, de acordo com a invenção, é o de através deste processo se conseguir purificar a EPO com elevado rendimento, a qual, depois da cultura em meio isento de soro, contém um dos estabilizadores acima mencionados, e de se realizar uma remoção do ou dos estabilizadores num tal grau que já não sejam detectáveis.

Para a produção de EPO a célula hospedeira que contém o gene de EPO é adaptada ao meio, que não contém proteínas de mamífero de origem natural, através de passagens por culturas de baixo volume. As células adaptadas são opcionalmente criopreservadas, retiradas do banco de células de acordo com as necessidades e expandidas em meio isento de soro. 10

Para purificação o sobrenadante da cultura, isento de células, da célula hospedeira é, de preferência, isolado e sujeito após filtração ao processo de purificação de acordo com a invenção.

Antes de executar o processo de purificação é possível realizar, se necessário, uma filtração adicional para eliminar a turbidez e/ou uma concentração.

No primeiro passo a cromatografia com corante elimina principalmente contaminações por proteases. Como corante utiliza-se de preferência um corante azul de triazina tal como Cibachron° azul. São, também, adequados outros corantes de triazina. O material de suporte para a cromatografia com corante não é crítico, no entanto utiliza-se, de preferência, um material à base de polissacáridos, tal como por exemplo sepharose, de preferência Sepharose 6 fast flow. A coluna é equilibrada com tampão, pH 4,5-5,5, de preferência 4,8-5,2, de preferência com tampão de acetato ou com ácido acético. De preferência, utilizam-se temperaturas de 1-10°C, de maior preferência de cerca de 5°C. A eluição pode ser realizada por aumento da concentração de sal a um valor de pH acídico ou neutro (de preferência pH 5-7). A eluição também pode ser realizada a um valor de pH básico, de preferência pH 8,5-9,5, de especial preferência a pH 8,8-9,2, sem alteração significativa na concentração de sal.

Um factor importante para a qualidade da purificação é que seja realizada, como segundo passo, uma cromatografia num suporte hidrofobizado. Materiais adsorventes adequados à cromatografia hidrófoba encontram-se descritos por 11 exemplo em Protein Purification Methods, A practical approach, Ed. Harris, E, L. V. e Angal. S., IRL Press Oxford, Inglaterra (1989) pãg. 224 e Protein Purification, Ed. Janson, J. C., Ryden L, VCH-Verlag, Weinheim, Alemanha (1989) págs. 207-226. O material de suporte em si mesmo não é crítico e pode ser, por exemplo, Sepharose, um copolímero de ácido acrílico e de ácido metacrílico ou sílica gel. É importante que a este suporte se encontrem ligados, por ligação covalente, grupos hidrófobos, de preferência grupos butilo. Suportes adequados encontram-se disponíveis no comércio (por exemplo, Butyl-Toyopearl da Toso Haas, Alemanha ou Butilsepharose da Pharmacia, Alemanha).

Com especial preferência utiliza-se um suporte butilado. Outros suportes alquilados ou arilados ou se ligam em parte irreversivelmente à EPO ou conduzem a uma pior separação. A eluição na cromatografia hidrófoba é executada de preferência com redução da concentração de sal (por exemplo, com um gradiente de 4 mole/1 até 0 mole/1 ou por adição de agentes caotrópicos, tais como iodeto, perclorato ou tiocianato ou por adição de álcoois, tais como glicerol, etilenoglicol ou isopropanol. A cromatografia hidrófoba é com especial preferência executada a um valor de pH neutro e na presença de sal, de preferência NaCl, cerca de 0,75 mole/1. Também é com especial preferência que a cromatografia hidrófoba é executada na presença de um álcool de baixo peso molecular e com especial preferência na presença de isopropanol. A concentração do álcool no tampão de eluição é de preferência cerca de duas a três vezes mais elevada do que no tampão de equilíbrio, e no tampão de lavagem cerca de 12 duas vezes mais elevado que no tampão de equilíbrio. Para equilibrar a coluna (carga do material de cromatografia) adicionam-se, de preferência, aproximadamente 10-15%, de preferência cerca de 10% de isopropanol, para a eluição adicionam-se cerca de 25% a 35%, de preferência cerca de 27% de isopropanol e ao tampão de lavagem adicionam-se 19% de isopropanol (as concentrações também são adequadas para outros álcoois, dados em % em volume, v/v). A cromatografia hidrófoba pode ser executada num intervalo de temperaturas amplo de cerca de 10-40°C. No entanto, é preferível utilizar uma temperatura controlada a 27+2°C. Temperaturas abaixo de 10°C são menos adequadas.

Como passo adicional de purificação, no processo de acordo com a invenção, executa-se uma separação em hidroxiapatite. É conveniente que o material da coluna seja composto de hidroxiapatite impregnada numa matriz de agarose. A EPO liga-se à matriz e é eluída de preferência com baixas concentrações de fosfato. Um material de coluna adequado é por exemplo Hidroxiapatite-Ultrogel (Biosepra, Alemanha) ou HA-Biogel HT (Biorad, Alemanha). É conveniente executar a cromatografia a um valor de pH aproximadamente neutro. 0 tampão de eluição contém fosfato, de preferência fosfato de potássio numa concentração de 1 mmole/1 a 100 mmole/1, de preferência de cerca de 10 mmole/1.

Como passo adicional na purificação segue-se uma cromatografia de fase reversa num suporte hidrofobizado. A este respeito utiliza-se de preferência o suporte que também é utilizado para a cromatografia hidrófoba. Materiais de cromatografia adequados à cromatografia de 13 fase reversa são, por exemplo, materiais como: Phenylsepharose e Octilsepharose (Pharmacia, Suécia), Butyl-Toyopearl (Toso Haas, Alemanha) ou Propyl-TSK (Merck, Alemanha). No entanto, também é preferida neste passo do processo a utilização de suportes que contenham grupos alquilo mais longos (por exemplo, C8 ou Ci8) . A coluna é de preferência equilibrada num intervalo de pH entre 2 e 7, de preferência pH 2,5 em que é utilizado de preferência ácido trifluoroacético aquoso. Um gradiente de tampão de equilíbrio até uma solução aquosa de um solvente orgânico polar, tal como por exemplo acetonitrilo, é utilizado para a eluição. É conveniente neutralizar o eluído após a cromatografia.

Como passo seguinte do processo de purificação, de acordo com a invenção, segue-se uma cromatografia de permuta aniónica. Neste caso DEAE-Sepharose fast flow é preferencialmente utilizada como o material da coluna. O equilíbrio da coluna é realizado a pH 6-9, de preferência a pH 7,5. Opcionalmente, após a lavagem, de preferência com uma solução ácida (a cerca de pH 4,5), elui-se num intervalo neutro ou ligeiramente básico (pH 6-9, de preferência a pH 7,5, enquanto se aumenta a força iónica, de preferência com NaCl). Como tampão utiliza-se, de preferência, tampão fosfato. O processo de acordo com a invenção é ilustrado, mais de perto, pelos seguintes exemplos: 14

EXEMPLO 1. Material de partida A EPO é fermentada em células CHO pelo processo de batch. O fermentador é inoculado com uma pré-cultura e o conteúdo do fermentador é colhido após cerca de 5 dias. Depois da colheita as células CHO são removidas da calda de fermentação por centrifugação. O sobrenadante da cultura, isento de células, é ajustado para pH 5,0-5,2 com 1 mole/1 de ácido acético e é filtrado a 1-9°C.

Como meio de cultura utiliza-se um meio isento de soro que é composto do meio base DME (HG) HAM's F-12 modified (R5) (GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA, Ref. N° . 57-736), hidrogenocarbonato de sódio, L-( + )glutamina, D-(+)glucose, insulina recombinante, selenite de sódio, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de ferro(II), aspargina, ácido aspártico, serina e álcool polivinílico. 2. Cromatografia em Sepharose Azul 2.1. Princípio de Separação A Sepharose azul (Pharmacia) é composta por esferas de Sepharose à superfície das quais se encontra ligado por ligação covalente o corante Cibacron® azul. A EPO liga-se a este suporte a uma baixa força iónica e a valores de pH neutros a ácidos. A EPO é eluída aumentando a força iónica e o valor do pH. 15 2.2. Execução A coluna de cromatografia (Amicon P440 x 500, Amicon, GB) é cheia com 60-80 1 de Sepharose azul e regenerada com 0,5 N NaOH. Subsequentemente, a coluna é equilibrada com cerca de 3 vezes o volume da coluna (VC) de tampão acetato. 0 sobrenadante da cultura, isento de células, ajustado para pH 5, é aplicado na coluna a uma temperatura de 10±5°C e a uma taxa de fluxo de 800-1400 ml/min. A coluna é lavada de novo à mesma taxa de fluxo e a 5+4 °C com cerca de 1 VC de tampão de lavagem 1. Isto é, então, seguido por cerca de 2 VC de tampão de lavagem 2. Subsequentemente a coluna é eluída com cerca de 3 VC de tampão de eluição. O pico de proteína é recolhido na totalidade (cerca de 30-60 1) , ajustado com HC1 para pH 6,9 e armazenado a 5±4°C até processamento posterior. Neste passo cromatogrãfico a solução do produto é concentrada, alcançando-se uma pureza de cerca de 40-50%.

Tampão de equilíbrio: 20 mM Acetato de Na, 5 mM CaCl2, 0,1 M NaCl, pH 5,0±0,2

Tampão de lavagem 1: 20 mM acetato de Na, 5 mM CaCl2, 0,25 M NaCl, pH 5,0±0,2

Tampão de lavagem 2: 20 mM Tris HC1, 5 mM CaCl2, pH 6,5+0,3

Tampão de eluição: 100 mM Tris HC1, 5 mM CaCl2, 1 M NaCl, pH 9,0±0,2. 3. Cromatografia Butil-Toyopearl (Cromatografia hidrófoba) 3.1. Princípio de Separação O Butyl-Toyopearl (TosoHaas) é um suporte a cuja superfície se encontram ligados, por ligação covalente, 16 resíduos de butilo. A EPO liga-se a esta matriz e é eluída com um tampão contendo isopropanol. 3.2. Condições de carregamento e eluição

Depois de se ligar a proteína à matriz de butilo num tampão de equilíbrio que continha 10% isopropanol, a EPO foi eluída por um gradiente composto de solução de tampão aquoso e 50% isopropanol. Esta eluição começa acima de cerca de 20% isopropanol.

Seria de esperar que a adição do agente de eluição isopropanol ao tampão de equilíbrio minimizasse a ligação de "proteínas estranhas" e enfraquecesse a ligação da EPO (menor capacidade). Surpreendentemente verificou-se que a adição de isopropanol ao tampão de equilíbrio em concentrações definidas (10-15%) aumenta a ligação de EPO e, assim, melhora também o rendimento (confrontar Tabela D · A EPO não se liga ao Butyl-Toyopearl a +4°C. A +25°C ligam-se 800 pg EPO/ml de adsorvente (aumentado para 1000 pg/ml pelo isopropanol) e a +35°C, surpreendentemente, até se ligam 1700 pg EPO/ml de Butyl-Toyopearl.

Tabela 1: Adsorção e desorção em função da adição de isopropanol o. Ό de Isopropanol no tampão de equilíbrio 0 10 15 17 19 % de EPO no tampão de lavagem 24 <1 <1 <1 10 O, "0 de EPO no eluído 76 96 93 83 69 17 3.3. Execução A coluna de cromatografia (Pharmacia BPG 300/500) é cheia com 30-4 0 1 de Butyl-Toyopearl e regenerada com 4 M guanidina-HCl e 0,5 N NaOH. A coluna é subsequentemente equilibrada com pelo menos 3 VC de tampão de equilíbrio. O eluído da coluna de Sepharose azul é ajustado para 10% de isopropanol e aplicado na coluna a uma temperatura de 27+2°C e a uma taxa de fluxo de 800-1200 ml/min. A coluna é lavada de novo à mesma temperatura e taxa de fluxo com cerca de 1 VC de tampão de equilíbrio e depois com cerca de 2 VC de tampão de lavagem. Subsequentemente, é eluída com cerca de 3 VC de tampão de eluição. A totalidade do pico de proteína foi recolhido (cerca de 10-18 1) , imediatamente diluído, por um factor de 3, com tampão de diluição e armazenado a 15 °C até processamento posterior. Nesta cromatografia alcançou-se uma pureza de cerca de 90%.

Tampão de equilíbrio: 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0,75 M NaCl, 10% isopropanol, pH 6,9±0,2

Tampão de lavagem: 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0,75 M

NaCl, 19% isopropanol pH 6,9±0,2

Tampão de eluição: 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0,75 M

NaCl, 27% isopropanol pH 6,9+0,2

Tampão de diluição: 2 0 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 6,9±0,2 4. Cromatografia em Hidroxiapatite Ultrogel 4.1. Princípio de Separação O Hidroxiapatite Ultrogel (Biosepra) é composto por hidroxiapatite (fosfato de cálcio cristalino) que se encontra incorporada numa matriz de agarose de modo a 18 melhorar as suas propriedades mecânicas e hidrodinâmicas. A EPO liga-se a esta matriz e é eluída a uma concentração de fosfato mais baixa do que a maioria das impurezas de proteína. 4.2. Execução A coluna de cromatografia (Amicon P440 x 500 ou equivalente) é cheia com 30-40 1 de Hidroxiapatite Ultrogel e regenerada com 0,5 N NaOH. A coluna é subsequentemente equilibrada com pelo menos 4 VC de tampão de equilíbrio. O eluído da coluna de Butyl-Toyopearl é aplicado na coluna a uma temperatura de cerca de 15 °C e a uma taxa de fluxo de 500-1200 ml/min. A coluna é lavada de novo à mesma temperatura e taxa de fluxo com cerca de 1 VC de tampão de equilíbrio e depois com cerca de 2 VC de tampão de lavagem. Subsequentemente é eluída com cerca de 3 VC de tampão de eluição. O pico de proteína é recolhido na totalidade (cerca de 10-18 1) e armazenado a 15 °C até posterior processamento. Nesta cromatografia alcançou-se uma pureza de cerca de 95%.

Tampão de equilíbrio: 20 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0,25 M NaCl, 9% isopropanol, pH 6,9±0,2

Tampão de lavagem: 10 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 6,8 + 0,2

Tampão de eluição: 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato de K 0,5 mM CaCl2, pH 6,8±0,2 19 5. HPLC de fase reversa (RP-HPLC) 5.1. Princípio de separação O material de RP-HPLC, por exemplo, Vydac C4 (Vydac, USA) é composto por partículas de sílica gel, cuja superfície contém cadeias de C4 alquilo. A EPO liga-se a esta matriz devido a interacções hidrófobas e é eluída selectivamente por um gradiente de acetonitrilo em ácido trifluoroacético diluído. 5.2. Execução A HPLC preparativa é executada a uma temperatura de 22+4 °C utilizando um equipamento de separação Merck Prepbar 100 (ou um equivalente) . A coluna de separação (100 mm x 400 mm, 3,2 1) é cheia com material Vydac C4. Antes de ser utilizada a coluna é regenerada por aplicação, por diversas vezes, de um gradiente do tampão A até 100% de solvente e é subsequentemente equilibrada com tampão A. O eluído da coluna de hidroxiapatite é acidificado até cerca de pH 2,5 com ácido trifluoroacético e esterilizado por filtração. Subsequentemente, é aplicado na coluna a uma temperatura de 22+4 °C e a uma taxa de fluxo de 250-310 ml/min. A coluna é eluída à mesma temperatura e taxa de fluxo com um gradiente linear do tampão A até ao tampão B. 0 pico de eluição é recolhido em fracções. O eluído é imediatamente neutralizado ao ser adicionado a 4 volumes de tampão de diluição para HPLC.

As fracções que apresentem uma pureza de pelo menos 99% no HPLC analítico são reunidas (volume das fracções reunidas cerca de 4-6 1). Nesta cromatografia, são 20 separados vestígios de impurezas e alcança-se uma pureza superior a 99%. água ácido Na/K,

Tampão A: 0,1% Ácido trifluoroacético em

Tampão B: 80% Acetonitrilo, 0,1% trifluoroacético em água

Tampão de diluição para HPLC: 10 mM fosfato de pH 7,5 ± 0,2 6. Cromatografia em DEAE-Sepharose ff 6.1. Princípio de Separação A DEAE Sepharose fast flow (Pharmacia) é composta por grupos DEAE que se encontram ligados à superfície das esferas de Sepharose por ligação covalente. A EPO liga-se a esta matriz devido a interacções iónicas e é eluída aumentando a força iónica. 6.2. Execução A coluna de cromatografia (Amicon P90 x 250 ou equivalente) é cheia com 100-200 ml de gel por g de EPO aplicada e é regenerada com 0,5 N NaOH. Subsequentemente a coluna é primeiramente equilibrada com 100 mM de tampão fosfato de Na/K, pH 7,5 e depois com pelo menos 12 VC de tampão de equilíbrio. O eluído da coluna de HPLC é aplicado na coluna a uma temperatura de 5±4°C e uma taxa de fluxo de cerca de 150 ml/min. A coluna é lavada à mesma temperatura e taxa de fluxo com pelo menos 5 VC de tampão de equilíbrio e depois lavada com cerca de 10 VC de tampão de lavagem. Subsequentemente é novamente lavada com cerca de 10 VC de 21 tampão de equilíbrio e depois eluída com cerca de 7 VC de tampão de eluição. O pico de proteína é recolhido na totalidade (cerca de 2-5 1), esterilizado por filtração e cheio.

Nesta cromatografia, o solvente do passo de HPLC ê separado e são eliminados vestígios de impurezas. A pureza é superior a 99%.

Tampão de equilíbrio: 10 mM Fosfato de Na/K, pH 7,5+0,2

Tampão de lavagem: 30 mM Acetato de Na, pH 4,5±0,1 Tampão de eluição: 10 mM Fosfato de Na/K, 80 mM NaCl pH 7,5+0,2

Lista de Referências

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Lisboa, 10 de Outubro de 2006

Claims (3)

1 Reivindicações 1. Processo para a remoção de um ou mais estabilizadores seleccionados de entre o grupo álcool polivinílico, metilcelulose, polidextrano, polietilenoglicol, pluronic F68, expansor do plasma poligelina (HEMACCEL) ou polivinilpirrolidona, de um preparado de proteínas com actividade de eritropoietina, que é obtido por produção recombinante, num processo de cultura isento de soro, através de purificação cromatográfica do preparado de proteínas obtido do sobrenadante das células por cromatografia de afinidade com corante, cromatografia hidrófoba, cromatografia em hidroxiapatite, cromatografia de fase reversa e cromatografia de permuta aniónica, caracterizado por ã cromatografia de afinidade com corante se seguir, como segundo passo, uma cromatografia hidrófoba.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cromatografia hidrófoba ser realizada num suporte alquilado (C4 a Ci8) , fenilado ou benzilado.

3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a cromatografia hidrófoba ser realizada num suporte butilado. Lisboa, 10 de Outubro de 2006