KR101443257B1

KR101443257B1 - 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법

Info

Publication number: KR101443257B1
Application number: KR1020110106230A
Authority: KR
Inventors: 고여욱; 이상용; 김국희; 이승희; 김하나; 김수연; 성진현; 조용현
Original assignee: 주식회사 종근당
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2014-09-19
Also published as: JP2014532080A; US9994627B2; EP2768846A1; US20140243510A1; WO2013058485A1; JP6049740B2; EP2768846A4; ES2621208T3; KR20130042107A; EP2768846B1

Abstract

본 발명은 (a) 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포의 배양액으로부터 동물세포를 제거하여 전처리 용액을 수득하는 단계; (b) 상기 전처리 용액을 1차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제1분획물을 수득하는 단계; (c) 상기 제1분획물을 흡착 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제2분획물을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 제2분획물을 2차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제3분획물을 수득하는 단계를 포함하는 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 시알산이 많이 결합된 동형체를 정밀하게 분리 정제하면서 상대적으로 간단한 3단계의 크로마토그래피 공정으로 보다 저렴한 비용과 짧은 시간에 정제할 수 있는 이점이 있다.

Description

낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법{Methods for Purifying Erythropoietin Analogs Having Lower Isoelectric Point}

본 발명은 N-연결 당쇄의 추가에 의해 4 미만의 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체(Erythropoietin Analog)를 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

에리스로포이에틴은 적혈구 생성 자극인자로서 조혈모세포를 자극하고 적혈구로의 분화를 촉진하여 적혈구의 생성을 증가시킨다. 에리스로포이에틴 혹은 EPO는 3개의 N-연결 당쇄와 1개의 O-연결 당쇄가 결합된 단백질로서 만성신부전 환자 및 암환자 등의 빈혈 치료제로 사용된다. EPO의 당쇄에 있는 시알산의 개수는 EPO의 핼액 내 반감기와 생물학적 활성에 영향을 미치며, 시알산의 개수가 더 많은 이소폼(isoform)은 생체내 분해가 억제됨에 따라 더 높은 생물학적 활성을 가진다(Egrie JC., and Browne JK., Br. J. Cancer , 2001;84, 3-10 and Egrie et al., Glycoconj . J., 1993; 10:263-269)

더 높은 생물학적 활성을 가지도록 천연형 인 에리스로포이에틴에 N-연결 당쇄를 추가하도록 유전자 조작하여 얻어진, 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체는 NESP(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein)라고도 불리우며, 다베포에틴 알파(Darbepoetin alfa)는 NESP 중에서 현재 의약품으로 개발된 단백질이다(Egrie and Browne, Br . J. Cancer . 84 Suppl. 1, 3-10 (2001)). NESP는 165개의 아미노산으로 구성된 당단백질로서, EPO가 최고 14개의 시알산(sialic acid)을 갖는 것과는 달리 최고 18개 혹은 22개의 시알산을 가질 수 있도록 N-연결 당쇄를 추가하였다. 시알산은 산성당으로서, N-연결 당쇄의 추가에 의해서 시알산 개수가 증가함에 따라 NESP 분자의 전체 pI 값은 점차 더 낮아지게 된다(Rush RS, et al., Anal . Chem ., 1995; 67:1441-52).

시알산 개수의 추가에 의해서 NESP의 혈청 반감기는 기존의 재조합 인 에리스로포이에틴보다 3배나 길기 때문에 만성신부전 환자의 빈혈 치료에서 적은 투여 빈도로 동등한 치료효과를 기대할 수 있다. EPO의 시알산 함량은 체내 약물 투여 지속 기간과 직접적인 연관이 있어서, 시알산 함량은 당단백질의 중요한 성질로 여겨진다. EPO 당사슬 말단의 시알산 잔기는 당사슬의 두 번째 갈락토오스기를 보호함으로써 간세포 수용체에 의한 갈락토오스기의 분해를 차단하여 EPO의 생체내 반감기를 연장시켜 생체내 활성도에 영향을 미친다(Goldwasser et al., J. Biol . Chem . 249, 4202-4206(1974), Lowy et al., Nature . 185, 102-103(1960)).

동물세포를 사용하여 EPO를 생산하는 방법이 하기에 제시된 특허에 공지되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-0423615호에서는 EPO 생산 세포를 무혈청 플라스크 또는 롤러에서 배양한 다음, 블루-세파로스(Blue-sepharose) 흡착 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및 고속 액상 크로마토그래피의 4단계 크로마토그래피 공정을 순차적으로 행하여 에리스로포이에틴을 제조하는 방법을 기술하였다. 그러나, 상기 특허에서는 NESP를 생산하는 방법에 대해서는 기술하지 않았고, 4단계의 크로마토그래피 공정을 수행함으로써 정제 공정이 복잡해지는 면이 있다.

또한, 면역 흡착 크로마토그래피를 사용하는 대한민국 등록특허 제10-0153808호와 등록특허 제10-0900013호가 있고, 염료 친화성 크로마토그래피를 사용하는 대한민국 등록특허 제10-0390325호와 등록특허 제10-0423615호가 있으며, 역상 크로마토그래피를 사용하는 대한민국 등록특허 제10-0065197호, 등록특허 제10-0423615호, 공개특허 제10-2004-0065567호 및 등록특허 제10-0900033호가 있다. 또, 소수성 크로마토그래피를 이용하는 등록특허 제10-0344059호 및 등록특허 제10-0567448호가 있으며, 이온교환을 회분식 크로마토그래피로 사용하는 등록특허 제10-0297927호가 있다. 마지막으로, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피를 사용하는 등록특허 제10-0390325호, 등록특허 제10-0900013호 및 미국 특허 제7,619,073호가 있다. 상기 국내에 공개된 기술들은 EPO의 정제방법에 대해서 기술하지만 EPO보다 등전점이 낮은 NESP의 정제에 대해서는 기술하지 않고 있다.

한편, 미국 특허 제7,217,689호는 NESP의 물질특허로서, 실시예에서 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 방법을 제시하고 있다.

또한, 국제 특허 제WO2010/008823 A2에서는 NESP의 정제방법으로서 음이온 혹은 흡착 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 방법을 제시하고 있다. 특히 양이온 교환 비결합 크로마토그래피을 통하여 시알산이 많이 결합된 동형체를 분리하는 방법을 제시하고 있다.

이와 같이 기존의 EPO 관련 특허에서의 정제 방법은 대부분 산업적인 생산 규모에 맞지 않는 컬럼을 사용하거나 4 단계 이상의 정제 공정을 이용하여 복잡한 공정을 수행하고 있고 추가된 당쇄로 물리화학적 특성이 바뀐 등전점이 낮은 NESP에서는 그 방법을 적용할 수 없다. 그리고 최근 공시된 NESP의 정제공정에 대한 유일한 특허에서는 4단계 공정을 거치며, 시알산이 많이 결합된 동형체를 분리하는 주 공정은 양이온 비결합 크로마토그래피방법을 사용하고 있다. 본 발명에서는 시알산이 많이 결합된 동형체의 보다 정밀한 분리가 가능한 음이온 교환 결합 크로마토그래피를 사용하고 있으며, 상대적으로 간단한 3단계의 크로마토그래피 공정으로 저렴한 비용과 짧은 시간에 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 정제할 수 있는 방법을 제공한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연형인 에리스로포이에틴에 비해 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 동물세포 배양액으로부터 고순도의 에리스로포이에틴 유사체를 정제할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 동물세포에서 발현된 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체에 대한 신규한 정제 프로토콜을 개발하였고, 이 정제 프로토콜에 의해 등전점 4 미만의 에리스로포이에틴 유사체를 간편하고 신속하게 고효율 및 고순도로 정제할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 4 미만의 등전점 및 복잡한 당 구조를 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법을 제공한다:

(a) 상기 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포의 배양액으로부터 동물세포를 제거하여 전처리 용액을 수득하는 단계;

(b) 상기 전처리 용액을 1차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제1분획물을 수득하는 단계;

(c) 상기 제1분획물을 흡착 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제2분획물을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 제2분획물을 2차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제3분획물을 수득하는 단계.

본 발명의 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법을 각 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포의 배양액으로부터 전처리 용액 수득

본 발명에 따르면, 우선 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포의 배양액으로부터 동물세포를 제거하여 전처리 용액을 수득한다.

본 발명에서 이용되는 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포는 바람직하게는 포유류, 설치류, 조류 또는 곤충세포이며, 보다 바람직하게는 CHO(Chinese hamster ovary), VERO, HeLa 세포, WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포 또는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 CHO, VERO, HeLa 또는 MDCK이고, 가장 바람직하게는 CHO 세포이다.

본 발명의 정제 대상인 4 미만의 등전점을 갖는 에리스포포이에틴 유사체는 천연형 인 에리스로포이에틴의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상이 변이를 포함한다. 등전점이 낮은 에리스로포이에틴 유사체는 아미노산 잔기의 추가(addition), 삭제(deletion) 또는 치환(substitution)를 통해 변이를 생성(mutagenesis)함으로써 제작할 수 있으며, 이를 통해 당쇄화(glycosylation) 위치(site)를 증가시키거나 그 위치를 바꿀 수 있다. 등전점이 낮은 에리스로포이에틴 유사체는 천연형 인 에리스로포이에틴보다 많은 수의 탄수화물 사슬(carbohydrate chain)을 가지며, 적어도 하나 이상의 추가된 당쇄를 포함한다. 또한, 등전점이 낮은 에리스로포이에틴 유사체는 추가된 당쇄에 의해 천연형(natural occurring) 인 에리스로포이에틴보다 높은 시알산(sialic acid) 레벨을 나타내지만, 그로 인해 생물학적 활성에 중요한 단백질의 2차 구조 또는 3차 구조가 변하지는 않는다.

N-연결 당쇄가 3개인 천연형인 에리스로포이에틴은 최고 14개의 시알산을 포함하나, N-연결 당쇄가 최소 하나 이상 추가된 에리스로포이에틴 유사체는 더 많은 시알산을 함유할 수 있다. 시알산은 음성 전하는 띄는 산성당으로, N-연결 당쇄가 3개인 천연형인 에리스로포이에틴은 4 이상의 등전점을 가지는 반면, N-연결 당쇄가 최소 4개 이상인 에리스로포이에틴 유사체는 4 미만의 등전점을 갖게 되어 제조하기가 상대적으로 어렵다.

본 발명의 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 예는, EPO 서열(예컨대, GenBank M11319의 서열)에서 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 및 138번 위치에서 선택되는 최소 하나의 위치에 추가적인 당쇄화 위치가 도입된 것이다. 가장 바람직하게는, 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체는 A30N, H32T, P87V, W88N 및 P90T 변이를 포함하는 NESP이다.

에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포의 배양방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 CHO 세포 배양 방법 가운데 하나인 유가형 배양(fed-batch culture) 혹은 반복식 유가형 배양(Repeated fed-batch culture)을 실시하거나, 연속 배양(continuous culture)을 실시할 수 있다. 가장 바람직하게는 반복식 유가형 배양(Repeated fed-batch culture)이다.

동물세포의 배양액은 일반적으로 단백질, 당류, 지방 등 다양한 성분(불순물)으로 이루어져 있기 때문에 전처리가 필요하다.

본 명세서에서 용어 '전처리'는 본 발명에 따른 정제방법의 정제 효율을 높이기 위하여 상기 컬럼 크로마토그래피를 수행하기 전에 불순물들을 제거하는 공정을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 전처리 단계는 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 (i) 심층 여과 필터 및 멤브레인 여과 필터에 의한 여과 후 한외여과하여 실시하거나 또는 (ii) 원심분리 후 한외여과를 실시하여 동물세포의 배양액으로부터 동물세포를 제거한다.

상기 심층 여과 필터에 의한 전처리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 심층 여과 필터는 배양액으로부터 일정 크기의 입자들을 제거하는 데 이용된다. 심층 여과 필터는, 멤브레인 필터와 다르게, 매트릭스 내에 입자들을 캡처링 하여 배양액으로부터 입자들을 제거한다. 전형적으로, 심층 여과 필터는 셀룰로오스, 유리 섬유 또는 폴리프로필렌과 같은 파이버 매체로 이루어져 있다. 상기 멤브레인 여과 필터에 의한 전처리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 일정 크기의 공극 크기를 갖는 다양한 멤브레인을 이용하여 이러한 전처리를 실시할 수 있다.

심층 여과 필터 및 멤브레인 여과 필터에 의한 필터링을 하여 얻어진 여과액에 대하여 한외여과를 실시한다. 한외여과는 적합한 분획분자량(Molecular Weight Cut-off, MWCO)을 갖는 한외여과막을 이용하여 실시한다. 예를 들어, 분획분자량 5-30 kDa인 한외여과막을 사용하여 한외여과를 실시한다. 한외여과는 여과뿐만 아니라 농축의 효과도 발생시킬 수 있다.

택일적으로, 상기 전처리는 세포배양액을 원심분리한 후 한외여과하여 실시할 수 있다. 상기 원심분리는 2000 ~ 5000 rpm으로 실시할 수 있다.

이러한 전처리 단계에 의해, 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체가 포함된 동물세포 배양액의 부피를 줄일 수 있고, 배양액 내에 존재하는 다양한 불순물들을 제거하여 크로마그래피의 컬럼에 걸리는 부하를 줄일 수 있다.

단계 (b): 1차 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 제1분획물 수득

상기 전처리 단계에 의해 얻어진 전처리 용액을 1차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제1분획물을 얻는다.

1차 음이온 교환 크로마토그래피는 당업계에 공지된 다양한 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다. 보다 바람직하게는 강염기성 음이온 교환 크로마토그래피이다.

본 발명에서 이용되는 음이온 교환수지에는 양으로 대전된(charged) 기능기가 공유결합되어 있다. 바람직하게는, 음이온 교환수지에 대전된 기능기는 아민 또는 아미노기, 보다 바람직하게는 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민 또는 사차 아민, 가장 바람직하게는, 사차 아민이다. 음이온 교환수지에 대전된 기능기의 예는 사차 아민(예컨대, 트리메틸아미노메틸 및 트리에틸아미노에틸), 아미노에틸, 디에틸아미노에틸 및 파라-아미노벤질을 포함한다.

본 발명에서 이용되는 음이온 교환수지의 지지체는 폴리스티렌(polystrene), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 셀룰로오스(cellulose), 세파셀(Sephacel), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose) 및 토요펄(Toyopearl)이며, 바람직하게는 셀룰로오스, 덱스트란 및 아가로오스이고, 가장 바람직하게는 아가로오스이다. 본 발명에서 이용되는 음이온교환제는 Q 세파로스, DEAE 세파로스이며, 바람직하게는 Q 세파로스이다.

본 발명의 1차 음이온 교환 크로마토그래피 과정에서 이용되는 완충액은 완충력(buffering power)을 가지는 어떠한 완충액도 사용 가능하며 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 글리신-HCl 및 Tris를 포함한다.

평형(equilibrium) 용액으로는 다양한 완충액, 특히 Tris를 이용할 수 있고, 이용되는 pH는 6-8, 바람직하게는 7.0-7.6이다. 세척 용액으로 바람직하게는 pH 4.0 미만의 완충액(바람직하게는, 초산 완충액)이 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 3.0-6.0, 보다 더 바람직하게는 4.0-4.5의 완충액이 사용될 수 있다.

용출 용액으로는 적합한 염(바람직하게는, 염화나트륨)을 포함하는 다양한 완충액, 특히 Tris를 이용할 수 있고, pH는 6-8, 바람직하게는 7.0-7.6이다.

4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 강염기성 음이온교환제로부터 용출시키는 데 바람직한 pH 및/또는 이온세기는 경험적으로 결정하는 것이 바람직하며, 이는 다양한 요인(예컨대, 강염기성 음이온교환제의 종류, 온도 등)에 의해 다양한 값을 나타낸다. 용출 용액에 이용되는 이온세기는 다양한 염에 의해 주어질 수 있으며, 예컨대 염화나트륨에 의해 이온세기가 주어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예를 참조하여, 상기 단계 (b)를 설명하면 다음과 같다: 강염기성 음이온 교환수지의 일종인 Q 세파로스 FF 레진(GE healthcare)을 800 mL 충진한 컬럼(GE healthcare, BPG 100/500)에 평형완충액(예를 들어, 10 mM 트리스 완충용액, pH 7.4)으로 수지를 평형화시킨다. 이어, 상기 단계 (a)에서 수득한 전처리 용액을 상기 Q 세파로스 컬럼에 적용시킨 후 상기 레진에 결합된 물질의 대부분이 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체 성분이도록 오염물을 제거하는 세척 단계를 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 세척 용액으로 바람직하게는 100 mM의 초산 완충액(pH 4.0)을 이용한다. 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체는 크로마토그램 상에서 염화나트륨을 포함한 트리스 완충 용액을 이용하여 용출할 수 있다. 용출에 사용되는 염화나트륨의 농도는 바람직하게는 50-500 mM이고, 보다 바람직하게는 100-400 mM이며, 가장 바람직하게는 200-300 mM이다.

단계 (b)에서, 단계 (a)의 상기 전처리 용액을 1차 이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제1분획물을 수득한다.

단계 (c): 흡착 크로마토그래피에 의한 제2분획물 수득

상기 1차 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 얻어진 제1분획물을 흡착 크로마토그래피에 적용하여 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제2분획물을 얻는다.

흡착 크로마토그래피는 이동상인 액체와 고정상인 고체(흡착 레진) 사이에서 시료가 고정상에 흡착되는 정도에 따라 분리가 일어난다.

본 발명에서 이용되는 흡착 크로마토그래피의 고정상은 바람직하게는 실리카, 알루미나, 마그네슘 옥사이드 및 인산칼슘(바람직하게는, 하이드록시아파타이트)을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 고정상은 인산칼슘이며, 가장 바람직하게는 하이드록시아파타이트이다. 하이드록시아파타이트는 탁월한 분리능 및 해상도를 갖는다. 하이드록시아파타이트를 이용하는 경우, 바람직한 이동상은 인산 완충용액이다.

하이드록시아파타이트를 이용하는 경우, 평형 용액으로 특히 인산 완충용액을 이용할 수 있고, 이용되는 pH는 6-8, 바람직하게는 6.0-7.0이다. 용출 용액으로는 적합한 염(바람직하게는, 염화나트륨)을 포함하는 인산 완충용액을 이용할 수 있고, pH는 6-8, 바람직하게는 6.0-7.0이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예를 참조하여, 상기 단계 (c)를 설명하면 다음과 같다: 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite Type I 또는 Type II, 20-40 ㎛) 레진을 충진한 컬럼에 평형완충액(예를 들어, 20 mM 인산 완충용액, pH 6.0-7.0)으로 수지를 평형화시킨다. 이어, 상기 단계 (b)에서 수득한 상기 제1분획물을 상기 하이드록시아파타이트 컬럼에 적용시킨 후 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 레진에 흡착되지 않은 비흡착 분획물로 분획한다. 상기 하이드록시아파타이트 레진에 흡착된 불순 단백질은 용출 용액(예를 들어, 500 mM 인산 완충액, pH 6.0-7.0)을 이용하여 용출할 수 있다.

단계 (d): 2차 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 제3분획물 수득

상기 흡착 크로마토그래피 단계에 의해 얻어진 제2분획물을 2차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제3분획물을 얻는다.

2차 음이온 교환 크로마토그래피는 당업계에 공지된 다양한 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 강염기성 음이온 교환 크로마토그래피이다.

본 발명에서 이용되는 음이온 교환수지에 대전된 기능기는 아민 또는 아미노기, 보다 바람직하게는 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민 또는 사차 아민, 가장 바람직하게는, 사차 아민이다.

본 발명에서 이용되는 음이온 교환수지의 지지체는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리스티렌/디비닐벤젠(polystyrene/divinyl benzene), 셀룰로오스(cellulose), 세파셀(Sephacel), 덱스트란(dextran), 아가로오스(agarose) 및 토요펄(Toyopearl)이며, 바람직하게는 아가로오스 혹은 폴리스티렌/디비닐벤젠이다.

본 발명에서 이용되는 음이온교환제는 Q 세파로스, DEAE 세파로스, SOURCE 15Q, SOURCE 30Q, Capto DEAE, Capto Q 등 이며, 바람직하게는 SOURCE 15 Q 혹은 SOURCE 30 Q 이다.

본 발명의 2차 음이온 교환 크로마토그래피 과정에서 이용되는 완충액은 완충력(buffering power)을 가지는 어떠한 완충액도 사용 가능하며 예를 들어, 소듐 아세테이트, 소듐 포스페이트, 글리신-HCl 및 Tris를 포함한다.

평형(equilibrium) 용액으로는 다양한 완충액, 특히 초산 완충액을 이용할 수 있고, 이용되는 pH는 3-6, 바람직하게는 4-5이다. 세척 용액으로 바람직하게는 pH 2.0-4.0의 완충액(바람직하게는, 글라이신 완충액), 보다 바람직하게는 pH 3.0-4.0의 완충액이 이용될 수 있다. 용출 용액으로는 적합한 염(바람직하게는, 염화나트륨)을 포함하는 다양한 완충액, 특히 인산 완충액을 이용할 수 있고, pH는 6-8, 바람직하게는 7.0-7.6이다. 용출 용액에 포함되는 염, 특히 염화나트륨의 농도는 바람직하게는 100-500 mM이다.

본 발명의 구체적인 일 실시예를 참조하여, 상기 단계 (d)를 설명하면 다음과 같다: 강염기성 음이온 교환수지의 일종인 Q 세파로스 SOURCE 15Q 또는 30Q 레진(GE healthcare)을 200 mL 충진한 컬럼(GE healthcare, XK 50/30)에 평형완충액(예를 들어, 20 mM 인산 완충용액, pH 6.0-7.0)으로 수지를 평형화시킨다. 이어, 상기 흡착 크로마토그래피에 적용하여 수득한 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제2분획물을 상기 SOURCE 15Q 또는 30Q 컬럼에 적용시킨 후 제1차 세척 완충액(예를 들어, 20 mM 아세트산염 완충액, pH 4.0-5.0) 및 제2차 세척 완충액(20 mM 글라이신 완충액, pH 2.2~2.4 을 이용하여 레진을 세척한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)와 단계 (d)를 하나의 공정으로 처리한다. 상기 단계 (d)를 수행하기 전에 상기 제2분획물에 어떠한 처리도 할 필요가 없기 때문에 상기 단계 (c) 및 단계 (d)의 컬럼을 연결하여 운행함으로써 상기 단계 (c) 및 단계 (d)를 각각 수행하는데 걸리는 시간을 줄일 수 있어 빠른 시간 안에 상기 제2분획물 및 제3분획물을 수득할 수 있다.

본 발명에 따르면, 단계 (d)에서 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 제외한 단백질 동형체(isoform)을 효과적으로 제거할 수 있으며, 단계 (c)에서 흡착하지 못한 소량의 불순 단백질은 단계 (d)에서 효과적으로 제거되어 고순도의 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 분획물로서 수득할 수 있다.

본 발명의 방법은 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체, 특히 N-연결 당쇄가 4개 이상인 적혈구 자극인자, 가장 바람직하게는 NESP의 정제에 매우 유효하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 신규한 정제방법을 제공한다.

(b) N-연결 당쇄가 3개인 EPO는 최고 14개의 시알산을 포함하나, N-연결 당쇄가 최소 하나 이상 추가된 에리스로포이에틴 유사체는 더 많은 시알산을 함유할 수 있다. 이에 따라서, EPO는 4 이상의 등전점을 가지는 반면 N-연결 당쇄가 최소 4개 이상인 에리스로포이에틴 유사체는 4 미만의 등전점을 갖게 되어 제조하기가 상대적으로 어렵다. 본 발명에서는 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 물리화학적 성질에 따른 제조상의 어려움을 극복하고 산업적 규모로 대량 생산할 수 있는 제조방법을 제공한다.

(c) 본 발명은 3 차례의 크로마토그래피를 통해 불순 단백질이 효과적으로 제거되어 고순도의 에리스로포이에틴 유사체를 수득할 수 있는 정제방법을 제공한다.

(d) 본 발명은 흡착 크로마토그래피 및 2차 이온 교환 크로마토그래피를 하나의 공정으로 처리할 수 있어 각각 수행하는데 필요한 시간을 단축하여 전체 정제공정에 걸리는 시간을 줄일 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 동물세포 배양액으로부터 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 정제하는 방법을 간략하게 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 정제 방법 중 1차 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체을 포함하는 제1분획물을 수득한 크로마토그램이다. 화살표는 목적 단백질의 크로마토그램 피크를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 정제 방법 중 흡착 크로마토그래피를 이용하여 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체을 포함하는 제2분획물을 수득한 크로마토그램이다. 화살표는 목적 단백질의 크로마토그램 피크를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 정제 방법의 단계별로 수득한 분획물에 대하여 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 하고 쿠마시 염색한 결과를 나타낸 도이다. 화살표는 목적 단백질 및 NESP 표준품의 밴드를 나타낸다.
레인 1: 분자량 표준품(BIO-RAD)
레인 2: 동물세포 배양액(한외여과 여과액)
레인 3: 1차 이온 교환 크로마토그래피 제1분획물
레인 4: 흡착 크로마토그래피 제2분획물
레인 5: 2차 이온 교환 크로마토그래피 제3분획물
레인 6: NESP 표준품
도 5는 본 발명에 따른 최종 정제 단계로 수득한 제3분획물에 대한 등전점 검사 겔 쿠마시 염색 결과를 나타낸 도이다.
레인 1: 2차 이온 교환 크로마토그래피 주입 분획
레인 2: 2차 이온 교환 크로마토그래피 pH 세척 정제 분획
레인 3: 2차 이온 교환 크로마토그래피 정제 분획
레인 4: NESP 표준품
도 6은 본 발명에 따른 정제 방법 중 2차 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체을 포함하는 제3분획물을 수득한 크로마토그램이다. 화살표는 목적 단백질의 크로마토그램 피크를 나타낸다.
도 7은 본 발명에 따른 분석 방법 중 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 NESP의 순도를 분석한 크로마토그램이다. 화살표는 목적 단백질의 크로마토그램 피크를 나타낸다.
도 8은 본 발명에 따른 흡착 크로마토그래피와 2차 이온교환 크로마토그래피를 결합한 정제 방법으로 수득한 분획물에 대한 등전점 검사 겔 쿠마시 염색 결과를 나타낸 도이다.
레인 1: NESP 표준품
레인 2: 2차 이온 교환 크로마토그라피 정제 분획
도 9는 본 발명에 따른 공정 단계별 수득물을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 순도를 분석한 크로마토그래피이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 에리스로포이에틴 유사체 생산 세포주의 배양

EPO에서 5개의 아미노산(A30N, H32T, P87V, W88N 및 P90T)이 치환된 당단백질을 생산하는 CHO 세포를 50 L 규모로 부유 배양하였다. 당업계에 공지된 CHO 세포 배양 방법 가운데 하나인 반복식 유가형 배양(repeated fed-batch culture)을 실시하였으며, 화학적 규명 배지 또는 Hyclone사에서 구할 수 있는 SFM4CHO 배지와 같은 무혈청 배지를 사용하였다. 5일 내외의 생산기(production phase) 이후에 배양액을 회수하였고, 이때 세포 농도는 8x10⁶ cells/mL 이상이었으며, 세포 생존율은 95% 이상이었다.

실시예 2: 정밀 여과 및 한외 여과

상기 실시예 1에서 얻은 동물세포 배양액을 각각 심층 여과 필터(Millipore사, depth filter) 및 멤브레인 필터(Sartorius사, 0.2 ㎛)를 이용하여 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 이어서, 상기 정밀 여과액을 한외 여과(Millipore사, MWCO 5-30 kDa)를 이용하여 5-30 kDa보다 작은 염과 당류는 한외 여과막을 통과하여 제거하였다. 여기서, 초기 농축된 부피보다 10배 많은 양의 트리스 완충 용액으로 희석하면서 희석여과(diafiltration) 및 농축을 수행하였다.

실시예 3: 1차 음이온교환 크로마토그래피

음이온교환 크로마토그래피는 AKTApilot 시스템(GE사, 미국)을 사용하였고, 컬럼으로는 Q 세파로스 FF(GE사) 레진을 800 mL 충진한 GE사의 BPG 100/500을 사용하였다. 상기 컬럼을 pH 7.4의 10 mM 트리스 완충 용액(평형 용액)으로 300 mL/분의 유속으로 평형화시켰다. 세척 용액으로 pH 4.0의 100 mM 초산 완충액을 이용하여 컬럼을 세척하였고, 300 mM 염화나트륨을 함유한 평형 용액을 이용하여 Q 세파로스 FF 겔에 흡착된 단백질을 용출하였다. 상기 1차 음이온 교환 크로마토그램을 도 2에 나타내었다.

실시예 4: 흡착 크로마토그래피

흡착 크로마토그래피는 AKTApurifier 시스템을 사용하였고, 컬럼으로는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite Type I 또는 Type II, 20-40 ㎛, BIO-RAD사) 레진을 430 mL 충진한 GE사의 XK 50/30을 사용하였다. 상기 컬럼을 pH 6.0-7.0의 20 mM 인산 완충 용액으로 20 mL/분의 유속으로 평형화시키고 1차 음이온 교환에서 얻어진 분획물을 컬럼에 통과시켜서 에리스로포이에틴 유사체는 컬럼에 흡착시키지 않고 비흡착 분획물로 회수하였다. 세척용액으로 pH 6.0-7.0의 500 mM 인산 완충액을 이용하여 컬럼에 남아있는 불순 단백질을 제거하였다. 이때 흡착 크로마토그래피에 이어서 시행되는 2차 이온 교환 크로마토그래피를 원활히 수행하기 위해, 흡착 크로마토그래피를 시행하기 전에 한외 여과(MWCO 5-30 kDa)를 실시하였다. 상기 흡착 크로마토그램은 도 3에 나타내었다.

실시예 5: 2차 음이온교환 크로마토그래피

2차 음이온교환 크로마토그래피는 AKTApurifier 시스템을 사용하였고, 컬럼으로는 SOURCE 15Q 또는 30Q(GE사) 레진을 200 mL 충진한 GE사의 XK 50/30을 사용하였다. 상기 컬럼을 pH 4.0-5.0의 20 mM 아세트산 완충 용액으로 25 mL/분의 유속으로 평형화시켰다. 세척용액으로 pH 2.2~2.4 의 20 mM 글라이신 완충액을 사용하여 컬럼을 세척하였고, 100-500 mM 염화나트륨을 함유한 인산 완충액을 이용하여 SOURCE 15Q 또는 30Q 겔에 흡착된 단백질을 용출하였다. 그리고 각 분획물은 단백질 정량을 통해 적정량을 계산하여 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 쿠마시 염색과 등전점 검사 겔 쿠마시 염색을 통해 불순물의 함유 여부(도 4)와 에리스로포이에틴 유사체의 동형체(도 5)을 분석하였다. 동형체 분석에서는 최종 분획물과 NESP 표준품의 단백질 밴드 양상이 유사함을 확인하였다. 상기 2차 음이온교환 크로마토그램을 도 6에 나타내었다. 또한, 2차 음이온교환 크로마토그램에서 수득한 정제된 단백질을 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 분석하여 순도가 98% 이상임을 도 7에 나타내었다.

실시예 6: 흡착 크로마토그래피 및 2차 이온 교환 크로마토그래피의 동시 시행

AKTApurifier 시스템을 사용하여 흡착 크로마토그래피와 2차 음이온 교환 크로마토그래피를 동시에 시행하는 방법을 수행하였다. 하이드록시아파타이트 레진을 430 mL 충진한 GE사의 XK 50/30 컬럼과 SOURCE 15Q 또는 30Q 레진을 200 mL 충진한 GE사의 XK 50/30 컬럼을 컨넥터로 연결하고 pH 6.0-7.0의 20 mM 인산 완충 용액(평형 용액)으로 20 mL/분의 유속으로 평형화시켰다. 그리고 1차 음이온 교환 크로마토그래피에서 얻은 분획물을 한외여과(MWCO 5-30 kDa)한 여과액을 연결되어 있는 컬럼에 주입 후 평형 용액을 20 mL/분의 유속으로 주입하여 컬럼에 흡착되지 않은 불순 단백질을 세척하였다. 세척이 완료되면 하이드록시아파타이트 컬럼은 제거하고 SOURCE 컬럼만을 AKTApurifier 시스템에 장착하여 실시예 5에서 기술했던 실험 방법을 사용하여 목적 단백질을 용출하였다. 그리고 최종 정제물은 단백질 정량을 통해 적정량을 계산하여 등전점 검사 겔 쿠마시 염색을 통해 동형체을 분석하였다(도 8). 동형체 분석 결과, 흡착 크로마토그래피 및 2차 이온 교환 크로마토그래피를 각각 수행하는 방법과 흡착 크로마토그래피 및 2차 이온 교환 크로마토그래피를 하나의 공정으로 연결하여 수행하는 방법에서 최종 분획물의 순도에 차이가 없는 것이 확인되었으며, 최종 분획물과 NESP 표준품의 단백질 밴드 양상이 유사함을 확인하였다.

실시예 7: 공정 단계별 분획물 분석

4-12% 농도 구배 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔에 분석을 위한 각각의 분획물을 분자량 표준품과 함께 각 웰에 주입하여 150 V의 정전압에서 1시간 동안 전기영동시켰다. 전기영동이 끝난 겔은 쿠마시 염색액에서 30분 동안 염색하였다.

2-5% 등전점 검사 겔에 분석을 위한 각각의 분획물을 단백질 정량을 통해 10 ㎍씩 가하여 100 V 정전압에서 1시간, 200 V에서 1시간, 400 V에서 1시간, 550 V에서 1시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔은 쿠마시 염색액에서 30분 동안 염색하였다.

실시예 8: 파일럿( pilot ) 정제공정 확립

본 발명의 정제공정을 이용하여 파일럿 수준으로 생산공정을 확립하였다. 그 결과 각 정제단계별 수율 및 최종 수율 그리고 각 단계별 순도를 표 1에 나타내었다. 의약품으로서 높은 순도와 품질을 위해서 등전점이 높은 이성질체를 제거하면서도 높은 수율을 얻을 수 있었다.

정제단계	부피 (mL)	농도 (mg/mL)	단백량 (mg)	순도 (%)	함량 (mg)	전체수율 (%)
배양농축액	6780	0.5	3390.0	22.4	759.4	-
1차 음이온	2466	0.3	813.8	60.1	489.1	60.1
흡착	4695	0.1	469.5	94.0	441.3	54.2
2차 음이온	424	0.4	148.4	99.0	146.9	18.1

Claims

다음의 단계를 포함하는 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴(Erythropoietin: EPO) 유사체로서 N-연결 당쇄가 4개 이상인 적혈구 자극인자의 정제방법:
(a) 상기 4 미만의 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포의 배양액으로부터 동물세포를 제거하여 전처리 용액을 수득하는 단계;
(b) 상기 전처리 용액을 1차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제1분획물을 수득하는 단계;
(c) 상기 제1분획물을 흡착 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제2분획물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 제2분획물을 2차 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하여 상기 에리스로포이에틴 유사체를 포함하는 제3분획물을 수득하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 에리스로포이에틴 유사체를 발현하는 동물세포는 CHO(Chinese hamster ovary), VERO, HeLa 세포, WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포 또는 MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포를 포함하는 정제방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 (i) 심층 여과 필터 및 멤브레인 여과 필터에 의한 여과 후 한외여과하여 실시하거나 또는 (ii) 원심분리 후 한외여과하여 실시하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 흡착 크로마토그래피는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 이용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 1차 음이온 교환 크로마토그래피는 세척용액으로 pH 4.0 미만의 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 세척용액으로 pH 2.0-4.0의 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)와 단계 (d)를 하나의 공정으로 처리하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 N-연결 당쇄가 4개 이상인 적혈구 자극인자는 N-연결 당쇄가 5개인 NESP(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein)인 것을 특징으로 하는 정제방법.