KR100900033B1 - 인간 에리스로포이에틴의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (1) 세포 배양액 또는 전처리한 형질전환 동물의 유즙을 헤파린 크로마토그래피로 정제하는 단계; (2) 단계 (1)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계 및 (3) 단계 (2)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 젤 여과 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한 인간 에리스로포이에틴의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명은 형질전환 동물의 유즙으로부터 인간 에리스로포이에틴을 정제할 경우에는 상기 단계 (1) 전에 (a) 형질전환 동물의 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계; (b) 상기 상등액에 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계; (c) 전이금속이온을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계 및 (d) 상기 단계로부터 회수한 상등액을 한외 여과하는 단계를 포함한 전처리 방법을 수행하는 것을 특징으로 한다.

인간 에리스로포이에틴, 1차 침전제, 전이금속이온, 헤파린 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피

Description

인간 에리스로포이에틴의 정제방법 {Purification Method of Human Erythropoietin}

인간 에리스로포이에틴의 정제방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 본 발명은 (1) 세포 배양액 또는 전처리한 형질전환 동물의 유즙을 헤파린 크로마토그래피로 정제하는 단계; (2) 단계 (1)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계 및 (3) 단계 (2)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 젤 여과 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한 인간 에리스로포이에틴의 정제방법에 관한 것이다. 본 발명은 형질전환 동물의 유즙으로부터 인간 에리스로포이에틴을 정제할 경우에는 상기 단계 (1) 전에 (a) 형질전환 동물의 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계; (b) 상기 상등액에 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계; (c) 전이금속이온을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계 및 (d) 상기 단계로부터 회수한 상등액을 한외 여과하는 단계를 포함한 전처리 방법을 수행하는 것을 특징으로 한다.

천연형 인간 에리스로포이에틴은 165개의 아미노산으로 구성된 단량체 당단백질로서, 전체 분자량이 약 34,000 달톤 (~34 kDa) 정도 되고, 단백질 부분의 분 자량은 약 18,000 달톤이다. 전체 분자량의 약 40%를 이루고 있는 당쇄 부분은 에리스로포이에틴의 생체내 활성에 필수적인 역할을 담당하며, 아미노산 24번째, 38번째 및 83번째에 위치한 Asn에 N-결합 당쇄와 126번째에 위치한 Ser에 하나의 뮤신형 O-결합 당쇄를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다.

천연형 인간 에리스로포이에틴은 1906년 조혈 조절인자의 존재 가능성에 대한 연구를 통해 처음 보고되었고, 1957년 에리스로포이에틴으로 명명되었다(Jacobson et al. Nature, 1957, vol.179, p.633). 이후 지속된 연구의 결과 인간 에리스로포이에틴은 1977년에 Miyake 등이 재생 불량성 환자의 뇨로부터 대량 분리 · 정제하는데 최초로 성공한 이후 (Miyake et al. J. Biol. Chem. 1977, vol.252, p.5558) 그 연구가 본격화되기 시작하여 Yanagawa 등에 의해 에리스로포이에틴의 N-말단 서열이 보고되었고 (Yanagawa et al. J. Biol. Chem. 1984, vol.295, p.2707), Lai 등이 인간 뇨 유래 에리스로포이에틴 시료에서 에리스로포이에틴 전체 아미노산 서열을 결정하여 보고하였다 (Lai et al. J. Biol. Chem. 1986, vol.261, p.3116).

현재 인간 유래 에리스로포이에틴은 동물세포 배양과 형질전환 동물을 이용한 기술에 의해 제조되고 있다. 형질전환 동물을 이용한 제조는 동물세포를 이용한 제조에 비해 여러 가지 측면에서 장점이 있다. 첫째로 천연형과 거의 동일하여 보다 안전한 고품질의 재조합 단백질을 얻을 수 있다는 점이며, 둘째로 형질전환 동물을 이용한 재조합 단백질의 제조는 1 리터당 수 그램의 수준으로 대량 생산이 가능하고, 셋째로 우리가 필요로 하는 재조합 단백질을 제조하는 형질전환 동물이 만들어지면 이들이 지니고 있는 외래 유전자가 자손에게 그대로 유전되어 영속적인 생산 시스템을 유지할 수 있다는 것이다.

위에서 살펴본 바와 같이 인간 에리스로포이에틴을 생산하는 두 가지 방법에 따라 정제 방법은 상이하다. 일반적으로 동물세포 배양시 생산된 인간 에리스로포이에틴은 비단백질 배지 (protein-free media) 내에서 발현되고, 형질전환 동물의 유선에서 생산된 인간 에리스로포이에틴은 유즙 단백질 내에서 발현되기 때문에 정제 방법이 동물세포 배양을 이용한 방법보다 복잡하다.

동물세포를 배양하여 인간 에리스로포이에틴을 생산할 경우에 다양한 정제방법이 개시되었는데, 면역흡착 크로마토그래피를 사용하는 대한민국등록특허 10-0153808호와 대한민국등록특허 10-0297927호가 있고, 염료 친화성 크로마토그래피를 사용하는 것을 특징으로 하는 대한민국등록특허 10-162517호와 대한민국등록특허 10-0177300호가 있으며, 역상 크로마그래피를 사용하는 대한민국등록특허 10-100065197호와 미국특허 4,677,195호가 있다. 일반적으로 동물세포를 배양하여 생산된 인간 에리스로포이에틴은 낮은 pI를 갖게 되므로 대부분의 종래 기술들은 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 정제하고 있다.

곤충세포에 의해 생산된 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법으로서 양이온 교환 크로마토그래피와 렉틴 크로마토그래피, 젤 여과 크로마토그래피를 이용하는 대한민국 특허 제10-0321446호가 있다.

그러나, 상기와 같은 정제방법들은 형질전환 동물의 유즙으로부터 인간 에리스로포이에틴을 정제하는데 적용하기는 어렵다. 그 이유는 동물의 유즙내에 인간 에리스로포이에틴과 유사한 당단백질이 많고, 형질전환 동물의 유선에서 생산된 인간 에리스로포이에틴과 동물 및 곤충세포의 배양에 의해 생산된 인간 에리스로포이에틴은 당쇄화에서 상이하여 이온교환 크로마토그래피 또는 렉틴 크로마토그래피 등을 이용하게 되면 분리 효율이 낮아지기 때문이다.

본 발명자들은 인간 에리스로포이에틴을 간편하고 신속하게 고순도로 정제하기 위하여 형질전환 동물의 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하여 1차 침전제 및 전이금속이온를 첨가하여 불순물을 침전시키고 상기 단계로부터 회수한 상등액을 한외 여과하는 전처리 과정을 진행한 후에 상기 단계로부터 회수한 여과액을 헤파린 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피로 순차적으로 정제한 결과 형질전환 동물의 유즙으로부터 인간 에리스로포이에틴을 간편하고 신속하게 고순도 및 고효율로 정제할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 (1) 세포 배양액 또는 전처리한 형질전환 동물의 유즙을 헤파린 크로마토그래피로 정제하는 단계; (2) 단계 (1)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계 및 (3) 단계 (2)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 젤 여과 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한 인간 에리스로포이에틴의 정제방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 정제방법의 한 원료인 '세포 배양물'은 천연적으로 인간 에리스로포이에틴을 발현하는 인간세포의 배양물 또는 인간 에리스로포이에틴을 발현하도록 형질전환된 세포, 바람직하게는 동물세포의 배양물일 수 있다. 본 발명에 따라 세포 배양물로부터 인간 에리스로포이에틴을 정제할 경우에는 전처리 과정을 생략하여도 무방하나, 필요에 따라 0.1 ~ 0.45 ㎛ 크기의 여과막을 이용하여 정밀여과할 수 있다.

또 다른 원료인 '형질전환 동물의 유즙'은 인간 에리스로포이에틴을 유선에서 발현하도록 형질전환된 동물로부터 수득한 유즙을 의미한다. 형질전환 동물의 유즙은 일반적으로 단백질, 당류, 지방 등 다양한 성분 (불순물)으로 이루어져 있기 때문에 전처리가 필요하다. '전처리'는 본 발명에 따른 정제방법의한 정제 효율을 높이기 위하여 상기 정제방법을 수행하기 전에 불순물들을 제거하는 공정을 의미한다. 본 발명에 따라 형질전환 동물의 유즙으로부터 인간 에리스로포이에틴을 정제할 경우에는 상기 단계 (1) 전에 (a) 형질전환 동물의 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계; (b) 상기 상등액에 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계; (c) 전이금속이온을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계 및 (d) 상기 단계로부터 회수한 상등액을 한외 여과하는 단계를 포함한 전처리 방법을 수행하는 것을 특징으로 한다. 이하, 각 단계별로 구체적으로 설명한다.

단계 (a)에서는 형질전환 동물로부터 수득한 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수한다. 본 발명에서 형질전환 동물의 유즙은 4,000 내지 12,000 rpm으로, 4 내지 37℃에서, 10 내지 40분 동안 원심분리한다. 일반적으로 동물의 유즙을 원심분리하면 3개의 상으로 분리되어 최상층에는 지방이, 중간층에는 콜로이드상이, 최하층에는 불용성 복합체가 각각 형성된다. 이렇게 형성된 지방과 불용성 복합체를 제거하고, 콜로이드상을 회수하여 다음 단계에서 처리한다. 따라서, 본 발명의 단계 (a)에서 "상등액"이란 지방층을 제거한 후 중간층에 형성된 콜로이드상을 의미 하는 것이다.

단계 (b)에서는 단계 (a)에 따라 수득한 상등액에 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시킨다. 여기서, 1차 침전제로는 황산암모늄, 황산나트륨 또는 인산칼륨을 이용할 수 있으며, 이들의 이용 농도는 10 내지 60%, 바람직하게는 20 내지 50%이다. 당해 농도의 1차 침전제를 첨가한 후에 4 내지 37℃에서, 1 내지 12 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨다.

단계 (b)에 이어서, 단계 (c)에서는 전이금속이온을 첨가하여 불순물을 2차 침전시킨다. 여기서, 전이금속이온은 Mn, Fe, Co, Ni, Cu 및 Zn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속이온을 의미하며, 이들의 농도는 5 내지 500mM, 바람직하게는 20 내지 200mM이다. 당해 농도의 전이금속이온을 첨가한 후에 4 내지 37℃에서, 1 내지 24 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨다.

한편, 본 발명에서는 단계 (b)와 (c)를 동시에 실시할 수 있는데, 이러한 양태에서는 1차 침전제를 지정된 농도 중 일부만 첨가하고 4 내지 37℃에서 1 내지 6 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨 후에 남은 1차 침전제를 첨가하고 지정된 농도의 전이금속이온을 첨가한 후 4 내지 37℃에서 1 내지 24 시간 반응시켜 불순물을 침전시킨다.

본 발명은 이와 같이 총 2 차례의 침전 반응을 진행하는 것을 특징으로 한다. 1차 침전에서는 염 농도를 높임으로써 소수성 단백질을 침전시킬 수 있으며, 2차 침전에서는 1차 침전으로 형성된 미립자를 응집시키고 기타 불순물과의 결합을 유도하여 침전물의 형성을 촉진시키기 때문에 효과적으로 불순물을 제거할 수 있 다.

단계 (d)에서는 후속되는 단계 (1)이 염 농도를 조절하여 인간 에리스로포이에틴을 용출시키는 단계이므로 단계 (b)와 (c)에서 사용된 각종 염류들을 제거하고 부피를 줄이기 위하여 한외 여과를 수행한다. 본 발명에서는 한외 여과 전에 단계 (3)으로부터 얻은 상등액을 정밀 여과하여 미세한 침전물을 제거하는 과정을 추가로 수행하는 것이 바람직하다.

이와 같이 전처리한 형질전환 동물의 유즙은 불순물이 충분히 제거되어 후술된 크로마토그래피를 효율적으로 실시하기에 적합한 상태가 된다. 또한, 통상 세포 배양물은 배지의 조성에 따라 달라지지만, 일반적으로 유즙에 비하여 불순물을 적게 함유하고 있기 때문에 크로마토그래피를 실시하기에 적절한 상태이다. 따라서, 세포 배양물과 전처리한 형질전환된 동물의 유즙은 모두 본 발명에 따른 정제방법에 의하여 정제 가능하다. 특히, 본 발명에 따른 형질전환된 동물의 유즙으로부터 정제하는 방법은 시알리산이나 다른 당쇄 부분을 활용하는 동물세포배양으로부터 정제하는 방법과는 차별화되며 불완전한 당쇄 (분자량에 있어서 약 10 kDa이 작음)를 가진 에리스로포이에틴의 정제에도 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 정제방법의 단계 (1)에서는 세포 배양액 또는 전처리한 형질전환 동물의 유즙을 헤파린 크로마토그래피를 이용하여 정제한다. 헤파린 크로마토그래피는 특히 당단백질에 대한 친화성이 우수한 것으로 알려져 있다. 본 발명의 한 양태에서 평형용액으로는 인산완충용액을, 용출용액으로는 염화나트륨을 함 유한 인산완충용액을 이용할 수 있으며, 인간 에리스로포이에틴은 크로마토그램 상에 50 내지 600mM의 염화나트륨 농도에서 용출된다. 본 발명에 따라 헤파린 크로마토그래피를 이용하여 인간 에리스로포이에틴을 정제함으로써 다른 크로마토그래피에 비하여 정제 속도가 빠르고 단위 젤 당 흡착능이 우수하여 고농도로 농축할 수 있다.

단계 (2)에서는 상기 헤파린 크로마토그래피로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유한 분획물을 수집하여 역상 크로마토그래피로 정제한다. 단계 (2)를 진행하기 전에 상기 분획물에 어떠한 처리도 할 필요가 없기 때문에 단계 (1)과 단계 (2)는 연속적으로 진행할 수 있고, 전체 정제방법을 간편하게 한다. 본 발명의 한 양태에서 평형용액으로는 증류수를, 용출용액으로는 아세토니트릴을 이용할 수 있으며, 인간 에리스로포이에틴은 크로마토그램 상에 약 30~70%의 아세토니트릴 용액에서 용출된다. 여기서, 불순 단백질과 실리카 레진의 비특이적 흡착을 줄이기 위하여 트리플로로아세트산 (trifluoroacetic acid)을 평형용액과 용출용액에 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 따른 역상 크로마토그래피에서는 C1, C4, C6, C8, C18을 리간드로 하는 젤을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 역상 크로마토그래피를 이용하여 인간 에리스로포이에틴을 정제함으로써 인간 에리스로포이에틴과 이를 제외한 불순 단백질을 정확하게 분리할 수 있다.

단계 (3)에서는 상기 역상 크로마토그래피로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유한 분획물을 수집하여 젤 여과 크로마토그래피로 정제한다. 젤 여과 크로마토그래피에 의한 정제 효율을 높이기 위하여 단계 (3)을 진행하기 전에 상기 분획물부터 아세토니트릴 용액을 제거하는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 양태에서 평형 및 용출용액으로는 트리스 완충용액을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 젤 여과 크로마토그래피에서는 분자량 5~100kDa에 해당하는 단백질을 분획하는데 사용할 수 있는 크기 배제 젤을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면 수퍼로즈 12, 수퍼덱스 75, 수퍼덱스 200, 세파덱스 200, 세파덱스 75, 세파크릴 S-100, 세파크릴 S-200 으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 젤을 이용한다. 본 발명에 따라 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 인간 에리스로포이에틴을 정제함으로써 분획물에 함유된 미량의 불순물 및 전술된 정제 단계 중에 단백질 엉김으로 인하여 생성된 비활성 인간 에리스로포이에틴을 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 에리스로포이에틴의 정제 방법 중 먼저 전처리 과정에 의하여 형질전환 동물의 유즙으로부터 여러 불순물을 충분히 제거할 수 있어 후속되는 크로마토그래피에 의하여 정제되어야 할 시료의 양을 줄이고 정제 시간 등을 단축시킬 수 있다. 그리고, 세포 배양물 또는 전처리한 형질전환 동물의 유즙을 대상으로 하여 당업계에 공지된 다양한 크로마토그래피 방법 중에서 헤파린, 역상 및 젤 여과 크로마토그래피를 선택하여 순차적으로 진행함으로써 인간 에리스로포이에틴을 간편하고 신속하게 고순도 및 고효율로 정제할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 원심분리

인간 에리스로포이에틴으로 형질전환된 돼지로부터 수득한 유즙 40㎖을 12,000 rpm, 4℃에서 30분간 원심분리를 실시하였다. 3개의 상으로 층이 분리되는데, 최상층의 지방과 최하층의 불용성 복합체를 제거하고 중간층의 콜로이드상을 회수하였다. 이 때 손실된 에리스로포이에틴의 양은 약 1~2%이었다.

실시예 2: 황산암모늄 및 전이금속 침전

실시예 1을 통하여 회수한 산물에 황산암모늄을 20% 첨가하고 4℃의 온도에서 1시간 동안 반응시켜 불순물을 침전시켰다. 이어서, 황산암모늄을 35% 까지 첨가한 후 염화아연을 60 mM 농도로 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 불순물을 침전시켰다. 이렇게 얻은 산물을 6,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취하였다.

실시예 3: 정밀여과 및 한외여과

상기 실시예 3에서 나온 상등액을 0.45㎛의 필터를 이용하여 정밀여과를 실시하였다. 이어서, 상기 정밀 여과액을 한외여과 (Millipore사, MWCO 3K)를 이용하여 3 kDa보다 작은 염과 당류는 한외여과막을 통과시켜 제거하였다. 여기서, 초 기 부피보다 10배의 양으로 인산완충용액으로 희석하면서 희석여과(diafiltration) 및 농축(concentration)을 수행하였다.

실시예 4: 헤파린 크로마토그래피

헤파린 크로마토그래피는 AKTAFPLC시스템 (GE사, 미국)을 사용하였고, 컬럼으로는 헤파린 레진이 5 ml 충진되어 있는 GE사의 HiTrap Heparin HP를 사용하였다. 상기 컬럼을 pH 7.0의 10 mM 인산나트륨 완충용액 (평형용액)으로 3 ml/분의 유속으로 평형화시켰다. 용출용액으로 2 M 염화나트륨을 함유한 평형용액을 이용하여 헤파린 젤에 흡착된 단백질을 용출하였다. 각각의 분획물에 대하여 효소면역측정법으로 인간 에리스로포이에틴 활성 유무를 확인하였다.

효소면역측정키트의 항체흡착 플레이트의 각 웰에 분석을 위한 분획물의 희석액을 100㎕씩 가하여 잘 섞은 후 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰의 잔여 반응액을 제거하고 세척용액 400㎕로 4회 세척한 후 효소항체 접합체액 200㎕를 가한 후 다시 상온에서 2시간 반응시켰다. 반응 여액을 위의 방법으로 제거, 세척한 후 키트에 포함되어 있는 기질-발색 용액 200㎕를 웰에 첨가하고 상온에서 25분간 발색시켰다. 발색이 완료된 후 반응정지액 100㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 로그 좌표계를 이용하여 표준액의 활성도를 횡축, 흡광도를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고 작성된 표준곡선으로부터 국제표준액과 분획물내 에리스로포이에틴 활성도를 구하고 희석배수를 곱하여 분획물의 최종 활성도를 측정하였다.

헤파린 크로마토그래피에 의하여 인간 에리스로포이에틴은 염화나트륨의 농도가 50 ~ 600 mM에서 용출되는 것을 확인하였다 (도 2). 활성이 확인된 분획물을 회수하여 후술된 역상 크로마토그래피를 진행하였다.

실시예 5: 역상 크로마토그래피

역상 크로마토그래피는 HPLC 시스템 (Varian사, 미국)을 사용하였으며, 컬럼으로는 Vydac사 (미국)의 C8 컬럼을 이용하였다. 평형용액으로는 증류수를, 용출용액으로는 아세토니트릴을 사용하였다. 불순 단백질과 실리카 레진의 비특이적 흡착을 줄이기 위하여 0.1% 트리플로로아세트산 (trifluoroactic acid)을 평형용액과 용출용액에 동일하게 첨가하였다. 각각의 분획물에 대하여 실시예 4와 동일한 절차에 따라 효소면역측정법을 실시하여 인간 에리스로포이에틴 활성 유무를 확인하였다.

역상 크로마토그래피에 의하여 인간 에리스로포이에틴은 아세토니트릴의 농도가 30% ~ 70% 사이에서 용출되는 것을 확인하였다 (도 3). 활성이 확인된 분획물을 회수하여 후술된 젤 여과 크로마토그래피를 진행하였는데, 이를 위하여 진공 증발기를 사용하여 아세토니트릴을 완전히 제거하였다.

실시예 6: 젤 여과 크로마토그래피

젤 여과 크로마토그래피는 AKTAexplorer시스템 (GE사, 미국)을 이용하여 수행하였다. 이 때, Superdex 200 컬럼 (GE사)을 사용하여 단백질을 크기별로 분획 하였으며, pH 7.0의 50mM 트리스 완충용액을 사용하였다. 이 공정을 통하여 99% 이상의 순도를 나타내는 고순도의 사람 에리스로포이에틴을 분리할 수 있었다 (도 4).

실시예 7: 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동을 이용한 순도 분석

본 발명에 따른 정제방법에 의해 불순 단백질이 제거되고 원하는 인간 에리스로포이에틴이 정제되는지 여부를 확인하기 위하여 각 단계별 산물 (시료)을 대상으로 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동을 실시하였다. 전기영동용 젤(12%)을 전기영동장치에 설치하고 이동 완충용액으로 채웠다. 각 시료 5㎕를 샘플 완충용액 25㎕와 혼합한 후 95℃에서 5분간 가열한 후 12,000rpm에서 3~4 분간 원심분리하고 분자량 표준품 (BIO-RAD 사)과 함께 각 웰에 30㎕ 씩 주입하였다. 시료 주입 후 150V의 정전압으로 전기영동하였고 전개가 완료되면 젤을 꺼내어 쿠마시 염색을 실시하였다.

상기 전기영동 결과는 도 5에 나타내었으며, 불순 단백질이 제거되고 인간 에리스로포이에틴만이 정제됨을 확인할 수 있었다. 도 5에서 레인 M은 단백질 크기 마커 (Bio-Rad, Precision), 레인 1은 유즙 원액, 레인 2는 원심분리 후 상등액, 레인 3은 황산암모늄과 염화아연 동시 침전 후 상등액, 레인 4는 정밀여과 및 한외여과 후 상등액, 레인 5는 헤파린 크로마토그래피 정제 분획, 레인 6은 역상 크로마토그래피 정제 분획, 레인 7은 젤 여과 크로마토그래피 정제 분획을 각각 나타낸다.

도 1은 본 발명에 따른 형질전환 동물의 유즙으로부터 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법을 간략하게 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 정제방법 중 헤파린 크로마토그래피를 이용하여 인간 에리스로포이에틴을 정제하면서 수득한 크로마토그램이다.

도 3은 본 발명에 따른 정제방법 중 역상 크로마토그래피를 이용하여 인간 에리스로포이에틴을 정제하면서 수득한 크로마토그램이다.

도 4는 본 발명에 따른 정제방법 중 젤 여과 크로마토그래피를 이용하여 인간 에리스로포이에틴을 정제하면서 수득한 크로마토그램이다.

도 5는 본 발명에 따른 정제 방법의 단계별로 수득한 분획물에 대한 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

Claims (6)

1. (1) 세포 배양물 또는 전처리한 형질전환 동물의 유즙을 헤파린 크로마토그래피로 정제하는 단계; (2) 단계 (1)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 역상 크로마토그래피로 정제하는 단계 및 (3) 단계 (2)로부터 얻은 인간 에리스로포이에틴을 함유하는 분획물을 젤 여과 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한 인간 에리스로포이에틴의 정제방법.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 전처리는 (a) 형질전환 동물의 유즙을 원심분리하여 상등액을 회수하는 단계; (b) 상기 상등액에 1차 침전제를 첨가하여 불순물을 1차 침전시키는 단계; (c) 전이금속이온을 첨가하여 불순물을 2차 침전시키는 단계 및 (d) 상기 단계로부터 회수한 상등액을 한외 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 정제방법.
3. 제 2항에 있어서,

   단계 (b)에서 1차 침전제는 황산암모늄, 황산나트륨 및 인산칼륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 정제방법.
4. 제 2항에 있어서,

   단계 (c)의 전이금속이온은 Mn, Fe, Co, Ni, Cu 및 Zn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속이온인 것을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 정제방법.
5. 제 1항에 있어서,

   단계 (2)의 역상 크로마토그래피는 C1, C4, C6, C8, C18을 리간드로 하는 젤을 사용하는 것을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 정제방법.
6. 제 1항에 있어서,

   단계 (3)의 젤 여과 크로마토그래피는 분자량 5 ~ 100 kDa에 해당하는 단백질을 분획하는데 사용할 수 있는 크기 배제 젤을 사용하는 것을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 정제방법.

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