ES2211961T3 - Procedimiento para la obtencion de eritropoyetina libre de proteinas animales. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion de eritropoyetina libre de proteinas animales.Info
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Abstract
UNA PREPARACION DE UNA PROTEINA CON ACTIVIDAD ERITROPOYETINA SE PUEDE OBTENER TRAS EL CULTIVO DE UNA CELULA HOSPEDADORA QUE PRODUCE ERITROPOYETINA, CARACTERIZADA POR A) UN CONTENIDO DE PROTEINAS PROCEDENTES DE LA CELULA HOSPEDADORA 100 PPM, B) UN CONTENIDO DE ADN DE LA CELULA HOSPEDADORA 10 PG/83 MI}G DE ERITROPOYETINA Y PORQUE C) LA PREPARACION QUE ESTA TOTALMENTE LIBRE DE PROTEINAS DE MAMIFERO QUE NO PROCEDAN DE LA CELULA HOSPEDADORA, SE OBTIENE TRAS EL CULTIVO SIN SUERO UTILIZANDO UN PROCEDIMIENTO DE PURIFICACION POR CROMATOGRAFIA CON COLORANTES, CROMATOGRAFIA HIDROFOBA SOBRE UN VEHICULO ALQUILADO O ARILADO, CROMATOGRAFIA EN HIDROXIAPATITO, CROMATOGRAFIA HIDROFOBA Y CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
Description
Procedimiento para la obtención de eritropoyetina
libre de proteínas animales.
Es objeto de la invención un procedimiento para
la obtención de eritropoyetina libre de proteínas animales ajenas,
excepto las proteínas de la célula hospedante.
La eritropoyetina (EPO) es un glicoproteína
humana que estimula la formación de eritrocitos. Su efecto y su
aplicación terapéutica se han descrito con detalle por ejemplo en
los documentos EP-B 0 148 605, Huang, S.L.; Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1984), 2708-2712;
EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 y
EP-B 0 411 678 así como en Lai, P.H. y col., J.
Biol. Chem. 261 (1986), 3116-3121 y Sasaki,
H. y col., J. Biol. Chem. 262 (1987),
12059-12076. La eritropoyetina empleada con fines
terapéuticos se obtiene por un método recombinante
(EP-B 0 148 605 y EP-B 0 209
539).
La obtención recombinante de eritropoyetina se
realiza por lo general en células CHO, añadiendo suero fetal bovino
y eventualmente insulina bovina al medio de cultivo. Por ello, los
preparados de EPO obtenidos de este modo contienen, incluso después
de la purificación, al menos trazas de sustancias que proceden de
estos aditivos. Estas trazas pueden ser por ejemplo virus bovinos y
agentes similares, cantidades residuales de proteínas bovinas y/o de
DNA bovino.
Ya es conocida por los métodos del estado de la
técnica la ejecución de una fermentación sin suero de células CHO
recombinantes que contienen un gen EPO. Tales procedimientos se
describen por ejemplo en los documentos EP-A 0 513
738; EP-A 0 267 678; y en general en Kawamoto, T. y
col., Analytical Biochem. 130 (1983),
445-453; EP-A 0 248 656; Kowar, J. y
Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986),
277-292; Bavister, B., Expcology 271 (1981),
45-51; EP-A 0 481 791;
EP-A 0 307 247; EP-A 0 343 635; WO
88/00967. Se ha constatado que, en caso de cultivar sin suero
células hospedantes eucarióticas productoras de EPO, la porción de
proteínas de las células hospedantes dentro de la cantidad total de
proteínas es más del doble que en el caso de cultivo en medios que
contienen suero. De igual modo, tal preparado proteínico contiene
ácidos nucleicos de las células hospedantes en una cantidad no
despreciable.
En el documento EP-A 0 267 678 se
describe que, para purificación la EPO obtenida en cultivo sin suero
después de la diálisis, se realiza una cromatografía de intercambio
iónico a través de S-Sepharose, una cromatografía
preparativa HPLC en fase inversa con una columna C_{8} y una
cromatografía de filtración a través de gel. La etapa de la
cromatografía de filtración a través de gel puede sustituirse por
una cromatografía de intercambio iónico a través de
S-Sepharose del tipo "fast flow" (flujo
rápido). Se ha propuesto también realizar una cromatografía de
colorantes en una columna de "Blue Trisacryl" antes de efectuar
la cromatografía de intercambio iónico.
La EPO purificada de este modo tiene una pureza
en torno al 99%, pero sigue conteniendo cantidades considerables de
proteínas y de DNA de las células hospedantes.
En el documento EP-A 0 513 738 se
describe un procedimiento de obtención de EPO en células de
mamíferos, pero no se aborda con detalle el tema de la
purificación.
Von Nobuo, I. y col., J. Biochem. 107 (1990),
352-359, describen un procedimiento de purificación
de EPO recombinante. No obstante, en este procedimiento se trata la
EPO antes de las etapas de purificación con una solución de Tween®
20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, etilmaleimida, pepstatina A,
sulfato de cobre y ácido oxámico. Estos aditivos, a pesar de que
estén presentes en el preparado farmacéutico únicamente en trazas,
no dejan de ser problemáticos desde el punto de vista
terapéutico.
Para la aplicación terapéutica es preferido
además que el preparado terapéuticamente activo esté totalmente
exento de proteínas y de ácidos nucleicos de las células de
mamíferos y prácticamente exento de proteínas y de ácidos nucleicos
de células hospedantes.
Es objeto de la invención un procedimiento de
fabricación de un preparado proteínico que tenga actividad de
eritropoyetina, caracterizado por
a) un contenido de proteínas, procedentes de las
células hospedantes y que no poseen ninguna función biológica de
eritropoyetina, que es \leq 100 ppm
b) un contenido de DNA de la célula hospedante
que es \leq 10 pg/83 \mug de eritropoyetina
y porque
c) el preparado está completamente exento de
proteínas naturales de mamíferos, no procedentes de las células
hospedantes,
por expresión de un DNA que codifica a la
proteína en una célula hospedante eurocariótica, por cultivo de la
célula hospedante en un medio libre de proteínas naturales de
mamíferos y por purificación cromatográfica de la proteína tomada
del líquido sobrenadante de las células, caracterizado porque la
purificación cromatográfica se realiza en una primera etapa como
cromatografía de afinidad de colorante, en una segunda etapa como
cromatografía hidrófoba, en otra etapa como cromatografía a través
de hidroxiapatita, en otra etapa como cromatografía en fase inversa
a través de un soporte hidrófobo y como etapa siguiente como
cromatografía de intercambio
aniónico.
Hasta el momento no se conoce ningún preparado de
EPO que esté libre además de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, de
pepstatina A y/o de iones Cu ni puede fabricarse por los métodos del
estado de la técnica, en especial en cantidades terapéuticamente
eficaces. Para obtener y aislar un preparado homogéneo de EPO de
esta especificación, con preferencia en un rendimiento elevado, es
necesaria la combinación de etapas de proceso según la
invención.
Se entiende por proteína con actividad de
eritropoyetina aquella proteína que posee la función biológica de la
EPO. Esta función biológica consiste en estimular procesos de
diferenciación y de división en las células "precursoras"
eritroides y de este modo proporcionar eritrocitos. En sus
propiedades, esta proteína es con preferencia idéntica o
fundamentalmente idéntica a la eritropoyetina humana y consta de 166
aminoácidos, con un peso molecular comprendido entre 34 y 38 kD,
situándose la porción de restos glicosilo en un peso molecular del
40%. Los derivados y fragmentos de la EPO, que tienen una actividad
análoga y se obtienen por cultivo de una célula hospedante
productora de EPO, pueden fabricarse también por el procedimiento de
la invención en forma pura. La secuencia de DNA y de proteína de la
EPO humana se ha descrito por ejemplo en los documentos
EP-B 0 205 564 y EP-B 0 209 539.
Por la expresión "totalmente exenta de
proteínas naturales de mamíferos" se entiende que, por el hecho
de que al cultivo de la célula hospedante no se añaden proteínas
ajenas de fuentes naturales, por ejemplo albúmina de suero bovino o
suero fetal bovino, no existe tampoco en el preparado este tipo de
proteínas ajenas en una cantidad detectable. El preparado está,
pues, totalmente exento de tales proteínas de mamífero añadidas
según plan, que no proceden de la célula hospedante y que por lo
general se añaden en caso de cultivo sin suero al medio de cultivo
para mantener y mejorar el crecimiento celular así como para mejorar
el rendimiento. Se entiende por proteínas naturales de mamíferos las
proteínas de mamíferos procedentes de fuentes naturales, por ejemplo
las obtenidas en procariotas, tales como la E. coli.
Las proteínas de mamíferos que se añaden al
cultivo celular son por ejemplo la albúmina de suero bovino, el
suero fetal bovino, la transferrina (humana o bovina), la insulina
(porcina o bovina) o la gelatina.
Se entiende por "células hospedante" una
célula animal o humana, cuyo genoma contiene un gen EPO activo, este
gen de EPO se transcribe y se traduce en caso de cultivo de la
célula en un medio exento de suero. El gen EPO puede incorporarse a
la célula hospedante en calidad de gen exógeno, con preferencia con
elementos de regulación (véase p.ej. los documentos
(EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539);
puede estar ya presente en la célula hospedante en calidad de gen
endógeno o puede activarse en calidad de gen endógeno no activo. Tal
activación de genes endógenos puede realizarse por ejemplo por
incorporación de elementos reguladores al genoma, por ejemplo
mediante una recombinación homóloga. Estos procedimientos ya son
conocidos y se describen por ejemplo en el documento WO
91/09955.
En calidad de células hospedantes se emplean por
lo general células de mamíferos. Cuando se quiere incorporar un gen
EPO humano exógeno, pueden utilizarse por ejemplo como células
hospedantes las células CHO o BHK. Si se emplea para la expresión un
gen EPO endógeno, entonces se emplean de modo conveniente células
humanas, por ejemplo células renales, hepáticas o linfáticas
humanas.
Se entiende por "proteínas que proceden de la
células hospedante" aquellas proteínas que se forman durante el
cultivo de las células hospedantes que contienen el gen EPO activo y
no poseen la especificación definida anteriormente de EPO. El dato
del contenido en proteína se indica en ppm, referidos al peso (p/p).
El contenido de estas proteínas puede determinarse por ejemplo
mediante un ensayo ELISA basado en anticuerpos policlonales,
dirigidos contra las proteínas de la célula hospedante. Estos
anticuerpos policlonales se obtienen inmunizando animales, sobre
todo ovejas, con un extracto de las proteínas de la célula
hospedante (proteínas extracelulares e intracelulares). El ensayo se
realiza con preferencia en forma de ensayo sandwich con un
anticuerpo policlonal inmovilizado y un segundo anticuerpo marcado
con peroxidasa. En calidad de patrón se emplea el extracto
proteínico total. El límite inferior de detección de este ensayo se
sitúa en 15 ng de proteína por ml. En el caso de una concentración
normal de EPO de 3,0 mg/ml, esto equivale a una cantidad de 5 ppm de
proteína de la célula hospedante como cantidad detectable mínima. El
preparado de la invención contiene, pues, con preferencia proteínas
de la célula hospedante en una concentración de 5 ppm a 100 ppm. Se
emplea con preferencia especial un preparado de EPO, en el que de
este modo ya no son detectables las proteínas de la célula
hospedante.
Se entiende por "DNA de la célula
hospedante" la cantidad total de DNA de esta célula hospedante
(DNA genómico, ribosómico, mitocondrial, etc.). Este contenido
incluye también el DNA que codifica la EPO y se obtiene por ejemplo
por transformación con un DNA exógeno. Este contenido se refiere de
modo conveniente a una dosis terapéutica empleada habitualmente de
83 \mug de EPO. La determinación del contenido de DNA en la célula
hospedante se realiza mediante un ensayo de hibridación con
detección radiactiva o fluorescente. En calidad de DNA de sonda se
emplea el DNA total de la célula hospedante. Este DNA total se toma
en este ensayo como patrón. El límite inferior de detección de dicho
ensayo de hibridación se sitúa en 1 pg de DNA/83 \mug de EPO. Por
consiguiente, el preparado de la invención contiene con preferencia
DNA de la célula hospedante en una cantidad comprendida entre 1 y 10
pg o, con preferencia especial, en una cantidad inferior a 5 pg por
cada 83 \mug de EPO. De modo muy especialmente preferido ya no se
detecta en el preparado por este método DNA alguno (\leq 1 pg de
DNA).
Ahora se ha constatado de modo sorprendente que
con el procedimiento de la invención puede obtenerse EPO con
preferencia de un cultivo exento de suero en una pureza elevada y
con un alto rendimiento. De este modo, en un ensayo competitivo
ELISA se consigue un rendimiento de EPO mayor en un factor 2 que el
obtenido en el procedimiento descrito por Nobuo, I. y col., J.
Biochem. 107, 352-359 (1990) (es decir, 25%
frente al 13% del procedimiento de Nobuo y col.).
El ensayo competitivo ELISA, aplicado para la
detección de la EPO, se realiza en dos etapas: el recubrimiento de
una placa de microvaloración con un anticuerpo policlonal dirigido
contra el Fcy de ratón; la reacción con un anticuerpo monoclonal
dirigido contra la EPO de ratón; la competencia entre la muestra de
EPO y la EPO marcada con peroxidasa; la reacción de sustrato con
ABTS® [tiazolinasulfato(6) de
2,2'-acino-di-e(3-)etilo].
El preparado de proteína puede fabricarse con
preferencia en partidas de 0,1 a 10 g. Se ha constatado de modo
sorprendente que, después del cultivo en un medio exento de
proteínas naturales de mamíferos, solamente puede conseguirse una
purificación de la EPO, suficiente con fines terapéuticos, si
después de una cromatografía de afinidad a través de un colorante se
realiza como segunda etapa una cromatografía hidrófoba. Se ha
constatado de modo sorprendente que no es necesaria la adición de
inhibidores de proteasa (p.ej. CuSO_{4}) antes de la purificación
cromatográfica, según se describe en Nobuo, I. y col., J. Biochem.
107, 352-359 (1990) o en WO 86/07494. La
cromatografía hidrófoba se realiza con preferencia a través de un
sustrato alquilado (C_{4}-C_{18}) o arilado (con
preferencia fenilado o bencilado). Se emplea con preferencia
especial un sustrato butilado. En este caso, el rendimiento del
proceso de purificación y la pureza de la proteína son especialmente
altos.
La expresión de un DNA que codifique a la EPO en
una célula hospedante eurocariótica puede realizarse por ejemplo por
transfección de una célula hospedante idónea, con preferencia
células CHO, con un DNA exógeno, que codifique a la EPO. También es
posible activar un gen EPO endógeno inactivo en la célula (por
ejemplo células renales humanas), por ejemplo por un procedimiento
de recombinación homóloga (WO 91/09955 y WO 93/09222). El cultivo de
las células hospedantes que contienen el gen EPO activo se realiza
por un método que el experto ya conoce, en un cultivo al que no se
añaden proteínas de mamífero procedentes de fuentes naturales. No
obstante, a este cultivo se añaden normalmente insulinas, albúminas
y transferrinas obtenidas por métodos recombinantes (con preferencia
en procariotas, tales como la E. coli).
Un medio exento de suero, que es idóneo en el
marco de la invención, contiene por ejemplo como medio
DMEM/F-12 (p.ej. de la empresa GRH
Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, EE.UU., artículo nº
57-736) y además hidrogenocarbonato sódico,
L+glutamina, D+glucosa, insulina recombinante, selenito sódico,
diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro (II), asparagina,
ácido aspártico, serina y un estabilizador de las células de
mamífero, p.ej. el alcohol polivinílico, metilcelulosa,
polidextrano, polietilenglicol, Pluronic F68, expansor de plasma
poligelina (HEMACCEL) o polivinilpirolitiona.
Una ventaja esencial del procedimiento de la
invención para la purificación de la EPO consiste en que logra
purificar la EPO, que después de realizar el cultivo sin suero
contiene uno de los estabilizadores recién citados, en un alto
rendimiento y disminuir la concentración del o de los
estabilizadores hasta el punto de que ya no son detectables.
Para la obtención de la EPO se adapta la célula
hospedante que contiene el gen EPO, mediante pasaje por cultivos de
pequeño volumen, al medio que no contiene proteínas de mamíferos de
fuentes naturales. Las células adaptadas se crioconservan
eventualmente, se sacan del banco de células si fuera necesario y se
expanden en medio exento de suero.
Para la purificación se obtiene con preferencia
el líquido sobrenadante exento de células del cultivo de células
hospedantes y, después de la filtración, se somete al procedimiento
de purificación de la presente invención.
Antes de poner en marcha el procedimiento de la
invención se puede efectuar, si fuera necesaria, una filtración para
separar las turbideces y/o una concentración.
Con la cromatografía a través de un colorante se
pueden eliminar en una primera etapa ante todo las contaminaciones
de proteasas. Como colorante se emplea con preferencia un colorante
azul de triazina, por ejemplo el Azul Cibacron®. Son también idóneos
otros colorantes de triazina. El material sustrato de la
cromatografía de colorante no es de por sí determinante, pero se
emplea con preferencia un material de sustrato basado en
polisacáridos, p.ej. la Sepharose, con preferencia la Sepharose 6
fast flow. Para equilibrar la columna se emplea un tampón de pH
4,5-5,5, con preferencia 4,8-5,2, en
especial un tampón acetato o ácido acético. Se trabaja con
preferencia a una temperatura comprendida entre 1 y 10ºC, con
preferencia especial a 5ºC.
La elución puede realizarse elevando la
concentración de sal a un pH ácido o neutro (con preferencia pH
5-7). A un pH básico, con preferencia pH
8,5-9,5, con preferencia especial pH
8,8-9,2, puede realizarse también la elución sin
modificar de modo importante la concentración de sal.
Para la calidad de la purificación es esencial
que en la segunda etapa se realice una cromatografía a través de un
sustrato hidrófobo. Son materiales adsorbentes idóneos para la
cromatografía hidrófoba por ejemplo los descritos en "Protein
Purification Methods, A practical approach", coord. Harris,
E.L.V. y Angal S., editorial IRL Press, Oxford, Inglaterra, p. 224
(1989) y "Protein Purification", coord. Janson, J.C., Ryden,
L., editorial VCH-Verlag, Weinheim, Alemania, pp.
207-226 (1989). El material de sustrato no es de
por sí fundamental, pudiendo emplearse por ejemplo la Sepharose, un
copolímero de ácido acrílico y ácido metacrílico o gel de sílice. Lo
determinante es que los grupos hidrófobos, con preferencia grupos
butilo, estén unidos a este sustrato mediante enlaces covalentes.
Los sustratos idóneos son productos comerciales (p.ej.
Butyl-Toyopearl de la empresa Toso Haas, Alemania, o
la Butylsepharose de la empresa Pharmacia, Alemania).
Se emplea con preferencia un sustrato o soporte
butilado. Otros sustratos alquilados o arilados fijan la EPO de modo
parcialmente irreversible, o bien se traducen en una separación de
peor eficacia.
La elución en la cromatografía hidrófoba se
realiza con preferencia por disminución de la concentración de sal
(p.ej. con un gradiente de 4 moles/de 1 a 0 moles/l) o por adición
de agentes caotrópicos como son yoduro, perclorato o rodanida o por
adición de alcoholes, tales como la glicerina, el etilenglicol o el
isopropanol.
La ejecución de la cromatografía hidrófoba se
realiza con preferencia especial a un pH neutro y en presencia de
sal, con preferencia NaCl, aprox. 0,75 moles/l. Es especialmente
preferida además la realización de la cromatografía hidrófoba en
presencia de un alcohol de bajo peso molecular, sobre todo en
presencia de isopropanol. La concentración del alcohol en el tampón
de elución es con preferencia dos o tres veces mayor que en el
tampón de equilibrado, en el tampón de lavado es dos veces mayor que
en el tampón de equilibrado. Para el equilibrado (carga del material
de la cromatografía) se añade con preferencia del 10 al 15%, en
especial el 10% de isopropanol, en la elución del 25 al 35%, con
preferencia el 27% de isopropanol y en el tampón de lavado el 19% de
isopropanol (los datos indicados de concentración son también
idóneos para otros alcoholes, los datos se expresan en % v/v).
La cromatografía hidrófoba puede realizarse en un
amplio intervalo de temperaturas, de 10 a 40ºC. Pero se trabaja con
preferencia a una temperatura controlada de 27\pm2ºC. Las
temperaturas inferiores a 10ºC son menos idóneas.
En el procedimiento de la invención se realiza en
calidad de etapa adicional de purificación una separación a través
de hidroxiapatita. El material de la columna se compone de modo
conveniente de hidroxiapatita, que se aloja en el interior del
esqueleto de la agarosa. La EPO se fija a este esqueleto y se eluye
con preferencia en concentraciones bajas de fosfato. El material
idóneo de la columna es por ejemplo la
hidroxiapatita-Ultrogel (empresa Biosepra,
Alemania) o HA-Biogel HT (empresa Biorad,
Alemania).
La ejecución de la cromatografía se lleva a cabo
de modo conveniente a un pH neutro. El tampón de elución contiene
fosfato, con preferencia fosfato potásico, en una concentración de 1
a 100 mmoles/l, con preferencia de 10 mmoles/l.
Otra etapa de la purificación incluye una
cromatografía en fase inversa a través de un sustrato hidrofugado.
Este es con preferencia un sustrato que se emplea también en la
cromatografía hidrófoba. Son materiales idóneos para la
cromatografía en fase inversa por ejemplo: la Phenylsepharose y la
Octylsepharose (Pharmacia, Suecia), el
Butyl-Toyopearl (Toso Haas, Alemania) o el
Propyl-TSK (Merck, Alemania). Sin embargo, es
preferido emplear en esta etapa del proceso sustratos que poseen
grupos alquilo de una longitud considerable (p.ej. C_{8} o
C_{18}). El equilibrado de la columna se realiza con preferencia
en un intervalo de pH comprendido entre 2 y 7, sobre todo a pH 2,5,
empleándose para ello con preferencia el ácido trifluoracético
acuoso. Para la elución se emplea un gradiente del tampón de
equilibrado con respecto a una solución acuosa de un disolvente
orgánico polar, por ejemplo el acetonitrilo. Después de la
cromatografía es conveniente neutralizar el líquido eluido.
La siguiente etapa del proceso de purificación de
la invención consiste en una cromatografía de intercambio aniónico.
Como material de columna se emplea para ello con preferencia la
DEAE-Sepharose. El equilibrado se realiza a pH
6-9, con preferencia a pH 7,5. Después del lavado
con preferencia con una solución ácida (pH 4,5) se eluye
eventualmente a un pH neutro o ligeramente básico (pH
6-9, con preferencia pH 7,5, aumentando la densidad
iónica, con preferencia con NaCl). En calidad de tampón se emplean
con preferencia tampones fosfato.
El procedimiento de la invención se ilustra con
mayor detalle mediante los ejemplos siguientes.
Se fermenta la EPO en células CHO por un proceso
discontinuo (por lotes o "batch"). Se inocula el fermentador
con un cultivo previo y pasados 5 días se recolecta el contenido de
dicho fermentador. Después de la recolección se separan las células
CHO del caldo de fermentación por centrifugación. Se ajusta el pH
del líquido sobrenadante sin células con 1 mol/l de ácido acético a
pH 5,0-5,2 y se filtra a una temperatura de
1-9ºC.
Como medio de cultivo se emplea un medio sin
suero que consta del medio base DME (HG) HAM's F-12
modificado (R5) (empresa GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver,
EE.UU., art. nº 57-736), hidrogenocarbonato sódico,
L-(+)-glutamina, D-(+)-glucosa,
insulina recombinante, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de
hierro (II), asparagina, ácido aspártico, serina y
polivinilalcohol.
La Sepharose azul (empresa Pharmacia) se compone
de esferillas de Sepharose, sobre cuya superficie se halla fijado
mediante enlaces covalentes el colorante Azul Cibacron®. Cuando la
fuerza iónica es baja y el pH es neutro o ácido, la EPO se fija
sobre este sustrato. Aumentando la concentración iónica y elevando
el pH, la EPO se eluye.
Se llena la columna cromatográfica (Amicon P440 x
500, Amicon, GB) con 60-80 l de Sepharose azul y se
regenera con NaOH 0,5 N. A continuación se equilibra la columna con
3 volúmenes de columna (VC) de tampón acetato. El líquido
sobrenadante del cultivo, exento de células, se ajusta a pH 5 a una
temperatura de 10\pm5ºC y se transporta a través de la columna con
un caudal de 800-1400 ml/min. Se lava la columna con
el mismo caudal a 5\pm4ºC con 3 VC de tampón de lavado 1. A
continuación con 2 VC de tampón de lavado 2. Finalmente se eluye la
columna con 3 VC de tampón de elución. Se recoge el pico total de
proteínas (aprox. 30-60 l), se ajusta el pH a 6,9
por adición de HCl y se almacena a 5\pm4ºC hasta el momento de su
procesado posterior. En esta etapa de la cromatografía se concentra
la solución de producto y se consigue una pureza de
40-50%.
El Butyl-Toyopearl (empresa Toso
Haas) es un sustrato, sobre cuya superficie se fijan restos butilo
mediante enlaces covalentes. La EPO se fija sobre esta estructura y
se eluye con un tampón que contenga isopropanol.
Después de fijarse la proteína sobre la
estructura butilo en un tampón de equilibrado, que contiene un 10%
de isopropanol, se eluye la EPO con un gradiente, que consta de
solución tampón acuosa y un 50% de isopropanol. Se inicia la elución
a partir del 20% de isopropanol.
Cabe esperar que la adición de eluyente
isopropanol al tampón de equilibrado reduzca al mínimo la fijación
de "proteínas ajenas" y debilite la unión de la EPO (menor
capacidad). Se ha encontrado de modo sorprendente que la adición de
isopropanol al tampón de equilibrado en concentraciones definidas
(10-15%) incrementa la fijación de la EPO y de este
modo mejora el rendimiento (ver tabla 1).
A +4ºC, la EPO no se fija sobre el
Butyl-Toyopearl. A +25ºC se fijan 800 \mug de
EPO/ml de adsorbente (incrementados gracias al isopropanol hasta
1.000 \mug/ml) y a +35ºC de modo sorprendente 1.700 \mug de
EPO/ml de Butyl-Toyopearl.
Se llena la columna cromatográfica (Pharmacia BPG
300/500) con 30-40 l de
Butyl-Toyopearl y se regenera con solución 4 M de
clorhidrato de guanidina y NaOH 0,5 N. Después se equilibra la
columna por lo menos con 3 VC de tampón de equilibrado.
Se ajusta al 10% la concentración de isopropanol
en el líquido eluido de la columna de Sepharose azul y se pasa a
través de la columna a una temperatura de 27\pm2ºC y un caudal de
800-1200 ml/min. Con la misma temperatura e igual
caudal se lava la columna seguidamente con 1 VC de tampón de
equilibrado y después con 2 VC de tampón de lavado. A continuación
se eluye con 3 VC de tampón de elución. Se recoge el pico proteínico
total (10-18 l), se diluye de inmediato con tampón
de dilución hasta un factor 3 y se almacena a 15ºC hasta el momento
del procesado posterior. Con esta cromatografía se logra una pureza
del 90%.
El Hidroxiapatita-Ultrogel
(empresa Biosepra) está compuesto de hidroxiapatita (fosfato
cálcico cristalizado) que está alojado dentro de una estructura de
agarosa, con el fin de mejorar sus propiedades mecánicas e
hidrodinámicas. La EPO se fija sobre esta estructura y se eluye a
concentraciones más bajas de fosfato que la mayoría de impurezas
proteicas.
Se llena la columna cromatográfica (Amicon P440 x
500 u otra equivalente) con 30-40 l de
Hidroxiapatita-Ultrogel y se regenera con NaOH 0,5
N. A continuación se equilibra la columna por lo menos con 4 VC de
tampón de equilibrado.
Se pasa a través de la columna el líquido eluido
de la columna de Butyl-Toyopearl a una temperatura
de 15ºC y con un caudal de 500-1200 ml/min. Con la
misma temperatura e igual caudal se lava después la columna con 1 VC
de tampón de equilibrado y seguidamente con 2 VC de tampón de
lavado. A continuación se eluye con 3 VC de tampón de elución. Se
recoge la totalidad del pico de proteína (10-18 l) y
se almacena a 15ºC hasta el momento de su procesado posterior. En
esta cromatografía se logra una pureza superior al 95%.
El material de la RP-HPLC, p.ej.
el Vydac C4 (de la empresa Vydac, EE.UU.), está formado por
partículas de gel de sílice, cuya superficie está provista de
cadenas alquilo C4. Por sus interacciones hidrófobas, la EPO se fija
sobre esta estructura y se eluye selectivamente con un gradiente de
acetonitrilo en ácido trifluoracético diluido.
La cromatografía HPLC preparativa se realiza en
una instalación separativa Prepbar 100 de Merck (u otra equivalente)
a una temperatura de 22\pm4ºC. La columna separativa (100 mm x
400 mm, 3,2 l) tiene un relleno de material Vydac C4. Antes de su
utilización se regenera la columna mediante el paso reiterado de un
gradiente de tampón A después de pasar el disolvente 100% y
finalmente se equilibra con tampón A.
El líquido eluido de la columna de hidroxiapatita
se acidifica a pH 2,5 con ácido trifluoracético y se filtra en
condiciones estériles. Después se pasa por la columna a una
temperatura de 22\pm4ºC y un caudal de 250-310
ml/min. Con la misma temperatura e igual caudal se eluye la columna
con un gradiente lineal de tampón A después del tampón B. Se recogen
las fracciones del pico de elución. Se neutraliza inmediatamente el
líquido eluido mediante el depósito previo de 4 volúmenes de tampón
de dilución HPLC.
Se reúnen las fracciones que presentan una pureza
analítica (HPLC) por lo menos del 99% (volumen recogido:
4-6 l). Con esta cromatografía se separan
contaminaciones existentes en trazas y se logra una pureza superior
al 99%.
La DEAE-Sepharose fast flow
(empresa Pharmacia) consta de grupos DEAE que están unidos mediante
enlaces covalentes a la superficie de las esferillas de Sepharose.
Gracias a las interacciones iónicas, la EPO se fija sobre esta
estructura y se eluye cuando aumenta la concentración iónica.
Se llena la columna cromatográfica (Amicon P90 x
250 u otra equivalente) con 100 - 200 ml de gel por g de EPO a
cromatografiar y se regenera con NaOH 0,5 N. A continuación se
equilibra la columna en primer lugar con tampón fosfato Na/K 100 mM,
pH 7,5, y después se equilibra por lo menos con 12 VC de tampón de
equilibrado.
Se pasa por esta columna el líquido eluido de la
columna HPLC a una temperatura de 5\pm4ºC con un caudal de 150
ml/min. A la misma temperatura e igual caudal se lava la columna por
lo menos con 5 VC de tampón de equilibrado y después con 10 VC de
tampón de lavado. A continuación se lava de nuevo con 10 VC de
tampón de equilibrado y se eluye con 7 VC de tampón de elución. Se
recoge la totalidad del pico de proteína (2-5 l), se
filtra en condiciones estériles y se envasa.
En esta cromatografía se separa el disolvente de
la etapa HPLC y se eliminan las impurezas existentes en cantidades
de trazas. La pureza es superior al 99%.
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Claims (6)
1. Procedimiento para la fabricación de un
preparado de proteína con actividad de eritropoyetina,
caracterizado por
a) un contenido de proteínas, procedentes de las
células hospedantes y que no poseen ninguna función biológica de
eritropoyetina, que es \leq 100 ppm
b) un contenido de DNA de la célula hospedante
que es \leq 10 pg/83 \mug de eritropoyetina y porque
c) el preparado está completamente exento de
proteínas naturales de mamíferos, no procedentes de las células
hospedantes,
por expresión de un DNA que codifica a la
proteína en una célula hospedante eurocariótica, por cultivo de la
célula hospedante en un medio libre de proteínas naturales de
mamíferos y por purificación cromatográfica de la proteína tomada
del líquido sobrenadante de las células, caracterizado porque
la purificación cromatográfica se realiza en una primera etapa como
cromatografía de afinidad de colorante, en una segunda etapa como
cromatografía hidrófoba, en otra etapa como cromatografía a través
de hidroxiapatita, en otra etapa como cromatografía en fase inversa
a través de un soporte hidrófobo y como etapa siguiente como
cromatografía de intercambio
aniónico.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cromatografía hidrófoba se realiza a
través de un sustrato butilado.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizado porque la cromatografía en fase inversa se
realiza a pH neutro a través de un sustrato butilado.
4. Procedimiento según las reivindicaciones de 1
a 3, caracterizado porque la carga y/o elución de la
cromatografía hidrófoba se realiza en presencia de un alcohol.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque para la elución se emplea isopropanol en
una cantidad comprendida entre el 25 y el 35% (v/v).
6. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque para la carga se emplea isopropanol en
una cantidad comprendida entre el 10 y el 15% (v/v).
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