ES2268232T3 - Procedimiento para preparar eritropoyetina libre de proteinas animales. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de depleción de uno o más estabilizadores - elegidos del grupo formado por polivinilalcohol, metilcelu- losa, polidextrano, polietilenglicol, Pluronic F68, expansor de plasma poligelina (HAEMACCEL) o polivinilpirrolidona en un preparado proteico con actividad eritropoyética obtenido por producción recombinante en procesos de cultivo sin suero - mediante purificación cromatográfica del preparado proteico procedente del sobrenadante celular por cromatografía de afi- nidad a colorantes, cromatografía hidrofóbica, cromatografía sobre hidroxiapatito, cromatografía de fase inversa y croma- tografía de intercambio aniónico, caracterizado porque, tras la cromatografía de afinidad a colorantes, tiene lugar una cromatografía hidrófoba como segunda etapa.
Description
Procedimiento para preparar eritropoyetina libre
de proteínas animales.
Es objeto de la presente invención un
procedimiento para la depleción de estabilizadores en preparados de
eritropoyetina obtenidos por preparación recombinante en procesos de
cultivo sin suero.
La eritropoyetina (EPO) es una glicoproteína
humana que estimula la formación de eritrocitos. Su acción y su uso
terapéutico está descrito detalladamente, por ejemplo, en la patente
EP-B 0 148 605, en Huang, S.L., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA (1984) 2708-2712, en las patentes
EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 y
EP-B 0 411 678, así como en Lai, P.H., y otros, J.
Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121 y en Sasaki, H., y
otros, J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. La
eritropoyetina de uso terapéutico se produce por recombinación
(patentes EP-B 0 148 605 y EP-B 0
209 539).
La producción recombinante de eritropoyetina
suele efectuarse en células CHO, añadiendo suero de ternera fetal
y, dado el caso, insulina bovina al medio de cultivo. Por lo tanto,
la preparación de EPO obtenida de esta forma contiene, como mínimo,
trazas de las sustancias procedentes de dichas adiciones, incluso
después de la purificación. Puede tratarse por ejemplo de virus
bovinos y agentes comparables, de cantidades residuales de proteínas
bovinas y/o de ADN bovino.
Es sabido que con los métodos del estado técnico
se puede llevar a cabo una fermentación sin suero de células CHO
recombinantes que contienen un gen EPO. Tales procedimientos están
descritos por ejemplo en las patentes EP-A 0 513 738
y EP-A 0 267 678 y de forma general por Kawamoto,
T., y otros, Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453,
en la patente EP-A 0 248 656, en Kowar, J. und
Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986)
277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981)
45-51, y en las patentes EP-A 0 481
791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635,
WO 88/00967. Se ha demostrado que, al cultivar sin suero células
huésped eucariotas productoras de EPO, la proporción de proteínas de
la célula huésped sobre el contenido proteico total es más del
doble, comparada con el cultivo en medios con suero. Una
preparación proteica de este tipo también contiene ácidos nucleicos
de las células huésped en cantidad no despreciable.
En la patente EP-A 0 267 678 se
describe una cromatografía de intercambio iónico sobre
S-sefarosa, una cromatografía HPLC preparativa de
fase inversa sobre una columna C_{8} y una cromatografía de
filtración en gel, para purificar la EPO preparada en cultivo sin
suero tras la diálisis. En este caso, la etapa de cromatografía de
filtración en gel se puede sustituir por una cromatografía de
intercambio iónico sobre "S-Sepharose Fast
Flow". También se propone realizar una cromatografía de
colorantes sobre una columna "Blue Trisacryl", antes de la
cromatografía de intercambio iónico.
La EPO purificada de esta forma tiene una pureza
de un 99% y sin embargo contiene aún cantidades considerables de
proteína y ADN de la célula huésped.
En la patente EP-A 0 513 738 se
describe un método para producir EPO en células de mamíferos, sin
entrar en los detalles de la purificación.
Nobuo, I. y otros, J. Biochem. 107 (1990)
352-359, describen un método para purificar EPO
recombinante. En este procedimiento, sin embargo, la EPO se trata
con una solución de Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo,
etilmaleimida, pepstatin A, sulfato de cobre y ácido oxámixo antes
de las etapas de purificación. Aunque en el preparado farmacéutico
solo se hallan trazas de estos aditivos, su presencia es crítica
desde el punto de vista terapéutico.
Además, para su uso terapéutico, es preferible
que un preparado de acción terapéutica esté completamente exento de
proteínas y ácidos nucleicos de células de mamíferos y ampliamente
libre de proteínas y ácidos nucleicos de la célula huésped.
Es objeto de la presente invención un
procedimiento para la depleción de uno o más estabilizadores
escogidos del grupo constituido por polivinilalcohol, metilcelulosa,
polidextrano, polietilenglicol, Pluronic F68, expansor de plasma
poligelina (HAEMACCEL) o polivinilpirrolidona en un preparado
proteico con actividad eritropoyética obtenido por producción
recombinante en procesos de cultivo sin suero. Dicho procedimiento
consiste en purificar cromatográficamente el preparado proteico
procedente del sobrenadante celular mediante cromatografía de
afinidad a colorantes, cromatografía hidrofóbica, cromatografía
sobre hidroxiapatito, cromatografía de fase inversa y cromatografía
de intercambio aniónico, y se caracteriza porque, tras la
cromatografía de afinidad a colorantes, tiene lugar una
cromatografía hidrófoba como segunda etapa. Para obtener y aislar un
preparado de EPO homogéneo conforme a esta especificación,
preferentemente con gran rendimiento, es necesaria la combinación de
las etapas de proceso según la presente invención.
El preparado de EPO puede obtenerse
preferentemente cultivando una célula huésped productora de
eritropoyetina y se caracteriza por:
- a)
- un contenido de proteínas procedentes de la célula huésped de 100 ppm (p/p) como máximo, preferentemente de 40 ppm o menos y sobre todo de 20 ppm o menos,
- b)
- un contenido máximo de ADN procedente de la célula huésped de 10 pg por 83 \mug de EPO, preferentemente 1 pg por 83 \mug de EPO o menos,
- y porque
- c)
- el preparado está completamente exento de proteínas de mamífero naturales ajenas a la célula huésped.
Por proteína con actividad eritropoyética se
entiende una proteína que posee la función biológica de la EPO. Esta
función biológica consiste en estimular procesos de diferenciación y
división en células precursoras eritroides, y por lo tanto en
proporcionar eritrocitos. Esta proteína tiene preferentemente
propiedades idénticas o casi iguales a las de la eritropoyetina
humana y consta de 166 aminoácidos, con un peso molecular de
aproximadamente 34-38 kD, donde la proporción de
restos glicosilo en el peso molecular es de un 40%. Los derivados y
fragmentos de EPO que tienen una actividad análoga y que pueden
prepararse cultivando una célula huésped productora de EPO también
pueden obtenerse en forma pura con los métodos de la presente
invención. La secuencia proteica y de ADN de la EPO humana se
describe por ejemplo en las patentes EP-B 0 205 564
y EP-B 0 209 539.
Dado que durante el cultivo de la célula huésped
no se añade ninguna proteína ajena de origen natural, como albúmina
de suero bovino o suero de ternera fetal, "completamente exento de
proteínas de mamífero naturales" significa que el preparado
tampoco contiene tal tipo de proteínas extrañas en cantidades
detectables. Por lo tanto el preparado está totalmente libre de la
adición planificada de estas proteínas de mamífero no procedentes de
la célula huésped, que se suelen agregar al medio de un cultivo sin
suero, a fin de mantener y mejorar el crecimiento celular y
optimizar el rendimiento. Por proteínas de mamífero naturales debe
entenderse las que proceden de material humano o animal, pero no las
proteínas de mamífero recombinantes producidas, por ejemplo, en
organismos procariotas como E. coli.
Los tipos de proteínas de mamífero añadidas
durante el cultivo celular son por ejemplo albúmina de suero bovino,
suero de ternera fetal, transferrina (humana o bovina), insulina (de
cerdo o bovina) o gelatinas.
Como "célula huésped" se entiende una
célula animal o humana cuyo genoma contiene un gen EPO activo que se
transcribe y traduce en un medio libre de suero durante el cultivo
de la célula. El gen EPO se puede introducir en esta célula huésped
como gen exógeno, preferentemente con elementos reguladores (ver
p.ej. patentes EP-B 0 148 605, EP-B
0 209 539), puede encontrarse ya en la célula huésped como gen
endógeno activo o como gen endógeno no activo en estado activado.
Esta activación de genes endógenos se puede efectuar, por ejemplo,
introduciendo elementos reguladores apropiados en el genoma, por
ejemplo, mediante recombinación homóloga. Estos procedimientos son
conocidos y están descritos, por ejemplo, en la patente WO
91/09955.
Como células huésped se usan habitualmente
células de mamíferos. En el caso de introducir un gen EPO exógeno
de origen humano, como células huésped pueden usarse por ejemplo
células CHO o BHK. Cuando se emplea un gen EPO endógeno para la
expresión, se usan por conveniencia células humanas procedentes por
ejemplo de los riñones, del hígado o de la linfa.
"Proteínas procedentes de la célula
huésped" hace referencia a las que se forman durante el cultivo
de células huésped que contienen el gen EPO activo y no poseen la
especificación de EPO arriba citada. El contenido de proteínas se
indica en ppm referido a peso (p/p). El contenido de estas proteínas
puede determinarse, por ejemplo, mediante un ELISA basado en
anticuerpos policlonales dirigidos contra las proteínas de la célula
huésped. Dichos anticuerpos policlonales se obtienen inmunizando
animales, preferiblemente ovejas, con un extracto de las proteínas
de la célula huésped (proteínas extracelulares e intracelulares). El
ensayo se efectúa preferentemente según el modelo sandwich, con un
anticuerpo policlonal inmovilizado y otro anticuerpo marcado con
peroxidasa. Como patrón se usa el extracto total de proteínas. El
límite inferior de detección para este tipo de ensayo es de
aproximadamente 15 ng de proteína por ml, lo cual, para una
concentración habitual de EPO de unos 3,0 mg/ml, corresponde a una
cantidad de 5 ppm de proteínas de la célula huésped como cantidad
mínima detectable. Por tanto el preparado según la presente
invención contiene preferentemente de 5 hasta 100 ppm de proteínas
de la célula huésped. Con especial preferencia se emplea un
preparado de EPO, en el que no pueden detectarse proteínas de la
célula huésped por este procedimiento.
Por "ADN de la célula huésped" se entiende
la cantidad global de ADN de dicha célula huésped (genómico,
ribosómico, mitocondrial, etc.). Este contenido también incluye el
ADN que codifica la EPO y que, por ejemplo, se ha obtenido por
transformación con un ADN exógeno. Se refiere convenientemente a una
dosis terapéutica de 83 \mug de EPO, normalmente empleada. El
contenido de ADN de la célula huésped se determina mediante un
ensayo de hibridación con detección de tipo radiactivo o
fluorescente. Como ADN sonda se usa todo el ADN de la célula
huésped. Este ADN global se usa como patrón para este ensayo. El
límite inferior de detección de tal ensayo de hibridación es de
aproximadamente 1 pg de ADN/83 \mug de EPO. Por tanto, el
preparado según la presente invención contiene preferentemente
1-10 pg de ADN de la célula huésped o, con especial
preferencia, menos de 5 pg por 83 \mug de EPO. De modo muy
preferente, en el preparado no hay ningún ADN detectable por este
procedimiento (\leq pg de ADN).
De modo sorprendente se ha demostrado que con
este procedimiento se puede obtener EPO, preferentemente a partir de
cultivos exentos de suero, con gran pureza y rendimiento. Si se
compara con el método descrito por Nobuo, I. y otros en J. Biochem.
107 (1990) 352-359, en un ensayo de ELISA
competitivo sobre EPO se alcanza un rendimiento multiplicado por un
factor aproximadamente igual a 2 (25% frente a un 13% en el caso de
Nobuo y otros).
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El ensayo ELISA competitivo empleado para
detectar la EPO se realizó en las siguientes etapas: aplicación de
un anticuerpo policlonal dirigido contra Fcy de ratón sobre una
placa de microvaloración; reacción con un anticuerpo monoclonal
contra EPO de ratón; competición entre la muestra de EPO y la EPO
marcada con peroxidasa; y reacción con el substrato ABTS® [ácido
2,2'-azino-di(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)].
El preparado proteico se produce preferentemente
en cargas de 0,1-10 g. Sorprendentemente se ha
demostrado que la EPO resultante del cultivo en un medio exento de
proteínas de mamífero naturales solo puede purificarse de manera
suficiente para usos terapéuticos, cuando a la cromatografía de
afinidad a un colorante le sigue una cromatografía hidrófoba como
segunda etapa. Sorprendentemente no es necesario añadir inhibidores
de proteasa (p.ej. CuSO_{4}) antes de la purificación
cromatográfica, tal como describen Nobuo, I. y otros en J. Biochem.
107 (1990) 352-359 o la patente WO 86/07494. La
cromatografía hidrófoba se realiza preferentemente sobre un soporte
dotado de grupos alquilo (C_{4}-C_{18}) o arilo
(preferiblemente fenilo o bencilo). Se utiliza especialmente un
soporte butilado. En este caso, el rendimiento del proceso de
purificación y el nivel de pureza de la proteína son muy
elevados.
La expresión de un ADN codificador para EPO en
una célula huésped eucariota puede efectuarse por transfección de
una célula huésped adecuada, preferentemente células CHO, con un ADN
exógeno codificador de EPO. También es posible activar un gen EPO
endógeno inactivo en la célula (por ejemplo células renales
humanas), utilizando, por ejemplo, un proceso de recombinación
homóloga (patentes WO 91/09955 y WO 93/09222). De la forma conocida
por el especialista, las células huésped que llevan un gen EPO
activo se cultivan sin agregar ninguna proteína de mamífero de
procedencia natural. En cambio suelen añadirse a este cultivo
insulinas, albúminas y transferrinas preparadas por recombinación
(preferentemente en procariotas, como E. coli).
Un medio sin suero, apropiado para el marco de
la presente invención, contiene por ejemplo DMEM/F12 (p.ej. GRH
Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, nº de referencia
57-736) propiamente como medio y además bicarbonato
sódico, L+glutamina, D+glucosa, insulina recombinante, selenito
sódico, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro(II),
aspargina, ácido aspártico, serina y un estabilizador de células de
mamífero, como p.ej. polivinilalcohol, metilcelulosa, polidextrano,
polietilenglicol, Pluronic F68, el expansor de plasma poligelina
(HAEMACCEL) o polivinilpirolitiona.
Una ventaja esencial del método de purificación
de EPO según la presente invención es que permite purificar con gran
rendimiento una EPO que contenga uno de los estabilizadores arriba
citados, tras un proceso de cultivo sin suero, y disminuir la
cantidad del o de los estabilizadores hasta que ya no sean
detectables.
Para producir EPO, la célula huésped que
contiene el gen EPO se adapta al medio libre de proteínas de
mamífero de origen natural, pasando por cultivos de pequeño volumen.
Si es preciso, las células adaptadas se mantienen por
crioconservación y en caso necesario se sacan del banco celular y se
expanden en un medio libre de suero.
Preferentemente, para purificarla, el
sobrenadante libre de células se extrae del cultivo de la célula
huésped y después de filtrarlo se somete al proceso de purificación
de la presente invención.
Si es necesario, antes del proceso de
purificación se puede efectuar una filtración, para eliminar
turbideces, y/o una concentración.
En la primera etapa, mediante la cromatografía
de colorantes se eliminan básicamente las contaminaciones por
proteasas. Se emplea preferentemente un colorante de triazina azul,
como el Cibachron® azul. También son apropiados otros colorantes de
triazina. El material soporte para la cromatografía de colorantes no
es de por sí crítico, pero preferiblemente se usa uno a base de
polisacárido, como p.ej. sefarosa, con preferencia "Sepharose 6
Fast Flow". La columna se equilibra con tampón de pH
4,5-5,5, preferentemente 4,8-5,2, de
acetato o de ácido acético. Preferiblemente se trabaja a
temperaturas de 1-10ºC, sobre todo a unos 5ºC.
La elución se puede llevar a cabo incrementando
la concentración salina a pH ácido o neutro (preferentemente a pH
5-7). A pH básico, preferentemente a pH
8,5-9,5 y con especial preferencia a pH
8,8-9,2, la elución también es factible sin alterar
en gran medida la concentración salina.
Para la calidad de la purificación es
fundamental que en la segunda etapa se realice una cromatografía
sobre un soporte hidrofobado. En Protein Purification Methods, A
practical approach, Ed. Harris, E.L.V. y Angal S., IRL Press,
Oxford, Inglaterra (1989), p. 224 y Protein Purification, Ed.
Janson, J.C., Ryden L, VCH-Verlag, Weinheim,
Alemania (1989), p. 207-226, por ejemplo, se
describen materiales adsorbentes apropiados para la cromatografía
hidrofóbica. El material del soporte no es crítico en sí; por
ejemplo, puede ser sefarosa, un copolímero de ácido acrílico y ácido
metacrílico, o gel de sílice. Lo fundamental es que haya grupos
hidrófobos unidos por enlace covalente a estos soportes,
preferiblemente grupos butilo. En el comercio se pueden adquirir
soportes adecuados (p.ej. Butyl-Toyopearl, de la
firma Toso Haas, Alemania, o Butylsepharose, de la firma Pharmacia,
Alemania).
Con especial preferencia se emplea un soporte
butilado. Otros soportes con grupos alquilo o grupos arilo fijan la
EPO de manera parcialmente irreversible o dan lugar a una peor
separación.
En la cromatografía hidrofóbica, la elución
tiene lugar, preferentemente, disminuyendo la concentración salina
(p.ej. con un gradiente de 4 mol/l hasta 0 mol/l o añadiendo agentes
caotrópicos como yoduro, perclorato o rodanida o bien alcoholes como
glicerina, etilenglicol o isopropanol).
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La cromatografía hidrófoba se realiza con
especial preferencia a pH neutro y en presencia de sal,
preferiblemente NaCl, unos 0,75 mol/l. También se prefiere
especialmente realizarla en presencia de un alcohol de bajo peso
molecular, en concreto isopropanol. De modo preferente y aproximado,
la concentración del alcohol en el tampón eluyente es del doble al
triple que en el tampón de equilibración; en el tampón de lavado
casi el doble que en el tampón de equilibración. Para equilibrar
(carga del material cromatográfico) se añade preferentemente un
10-15%, sobre todo 10% de isopropanol; para la
elución de 25% hasta 35%, sobre todo un 27% de isopropanol y en el
tampón de lavado 19% de isopropanol (datos de concentración
adecuados también para otros alcoholes, expresados en % en volumen,
v/v).
La cromatografía hidrófoba puede llevarse a cabo
en un amplio margen de temperaturas, en el intervalo aproximado de
10-40ºC. Preferentemente se trabaja a una
temperatura controlada de 27 \pm 2ºC. Las temperaturas inferiores
a 10ºC son poco adecuadas.
La siguiente etapa de purificación en el proceso
de la presente invención consiste en efectuar una separación con
hidroxiapatito. El material de la columna está adecuadamente formado
por hidroxiapatito incluido en un armazón de agarosa. La EPO se fija
sobre esta matriz y se eluye preferentemente a bajas concentraciones
de fosfato. Materiales de columna apropiados son, por ejemplo, el
Hydroxyapatit-Ultrogel (Biosepra, Alemania) o el
HA-Biogel (Biorad, Alemania).
La cromatografía se realiza por conveniencia a
un pH casi neutro. El tampón de elución contiene fosfato,
preferentemente fosfato potásico, a una concentración de 1 mmol/l
hasta 100 mmoles/l, con preferencia de unos 10 mmoles/l.
La subsiguiente etapa de purificación consiste
en una cromatografía de fase inversa sobre un soporte hidrófobo,
preferentemente el mismo que se emplea para la cromatografía
hidrofóbica. Como materiales cromatográficos para la cromatografía
de fase inversa son apropiados, por ejemplo: Phenylsepharose y
Octylsepharose (Pharmacia, Suecia),
Butyl-Toyo-pearl (Toso Haas,
Alemania) o Propyl-TSK (Merck, Alemania). No
obstante, en esta etapa del proceso también se prefiere usar
soportes que contengan grupos alquilo de mayor longitud (p.ej.
C_{8} o C_{18}). La columna se equilibra preferentemente en un
intervalo de pH entre 2 y 7, sobre todo a pH 2,5, con una solución
acuosa de ácido trifluoroacético. Para eluir se usa un gradiente de
tampón de equilibración hasta una solución de un disolvente orgánico
polar, como por ejemplo acetonitrilo. Tras la cromatografía se
neutraliza adecuadamente el producto eluido.
La siguiente etapa en el proceso de purificación
de la presente invención consiste en una cromatografía de
intercambio aniónico. Como material de columna se usa en este caso
"DEAE-Sepharose Fast Flow". Se equilibra a pH
6-9, preferentemente a pH 7,5. Después de lavar, si
es preciso, preferentemente con una solución ácida (pH aproximado de
4,5), se eluye a pH neutro o ligeramente básico (pH
6-9, preferentemente a pH 7,5, aumentando la fuerza
iónica, preferentemente con NaCl). Se emplean preferentemente
tampones de fosfato.
El procedimiento según la presente invención se
ilustra con mayor detalle mediante los siguientes ejemplos:
Ejemplo
Se fermenta EPO en células CHO según el proceso
por lotes. El fermentador se inocula con un precultivo y al cabo de
unos 5 días se recolecta el contenido del fermentador. Tras la
recolección, las células CHO se separan del caldo de fermentación
por centrifugado. El sobrenadante libre de células se ajusta a pH
5,0-5,2 con 1 mol/l de ácido acético y se filtra a
1-9ºC.
Se emplea un medio de cultivo exento de suero,
que consta del medio básico DME(HG)HAM's F12
modificado (R5) (GRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, USA, nº
de referencia 57-736), bicarbonato sódico,
L-(+)glutamina, D-(+)glucosa, insulina recombinante, selenito
sódico, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro(II),
aspargina, ácido aspártico, serina y polivinilalcohol.
La Sefarosa Azul (Pharmacia) está formada por
bolitas de sefarosa, sobre cuya superficie está unido por enlace
covalente el colorante azul Cibacron®. A una fuerza iónica baja y a
valores de pH neutros hasta ácidos, la EPO se fija a este soporte.
La EPO se eluye aumentando la fuerza iónica y el valor del pH.
La columna cromatográfica (Amicon P 440 x 500,
Amicon, GB) se rellena con 60-80 l de Sefarosa Azul
y se regenera con NaOH 0,5 N. A continuación, la columna se
equilibra con unos 3 volúmenes de columna (VC) de tampón de acetato.
El sobrenadante del cultivo, libre de células y ajustado a pH 5, se
aplica sobre la columna a una temperatura de 10 \pm 5ºC y a un
caudal de 800-1.400 ml/min. La columna se lava al
mismo caudal y a 5 \pm 4ºC con 1 VC de tampón de lavado 1. Después
siguen unos 2 VC del tampón de lavado 2. A continuación se eluye la
columna con unos 3 VC de tampón eluyente. El pico global de proteína
(unos 30-60 l) se reúne, se ajusta con HCl a pH 6,9
y se conserva a 5 \pm 4ºC hasta su reelaboración. En esta etapa
cromatográfica se concentra la solución de producto y se alcanza una
pureza de un 40-50%.
- Tampón de equilibración:
- acetato Na 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,1 M, pH 5,0 \pm 0,2
- Tampón de lavado 1:
- acetato Na 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,25 M, pH 5,0 \pm 0,2
- Tampón de lavado 2:
- Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,5 \pm 0,3
- Tampón de elución:
- Tris-HCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 1M, pH 9,0 \pm 0,2
El Butyl-Toyopearl (Toso Haas)
es un soporte sobre cuya superficie hay radicales butilo unidos por
enlace covalente. La EPO se fija a esta matriz y se eluye con un
tampón que contiene isopropanol.
Tras fijar la proteína a la matriz de butilo en
un tampón de equilibración que contenía 10% de isopropanol, la EPO
se eluyó con un gradiente formado por disolución tampón acuosa e
isopropanol al 50%. Esta elución empieza a partir de aproximadamente
un 20% de isopropanol.
Se esperaba que la adición del eluyente
isopropanol al tampón de equilibración rebajara la fijación de
"proteína ajena" y debilitara la fijación de EPO (menor
capacidad). De manera sorprendente se halló que la adición de
isopropanol al tampón de equilibración en concentraciones definidas
(10-15%) incrementaba la fijación de EPO, mejorando
asimismo el rendimiento (véase tabla 1).
A +4ºC no se fija EPO al
Butyl-Toyopearl. A +25ºC se fijan 800 \mug de
EPO/ml de adsorbente (aumentados mediante el isopropanol hasta 1.000
\mug/ml) y a +35ºC sorprendentemente hasta 1.700 \mug de EPO/ml
de Butyl-Toyopearl.
| % de isopropanol en el tampón de | 0 | 10 | 15 | 17 | 19 |
| equilibración | |||||
| % de EPO en el tampón de lavado | 24 | <1 | <1 | <1 | 10 |
| % de EPO en el producto eluido | 76 | 96 | 93 | 83 | 69 |
La columna cromatográfica (Pharmacia BPG
300/500) se rellena con 30-40 l de
Butyl-Toyopearl y se regenera con
guanidina-HCl 4 M y NaOH 0,5 N. A continuación, la
columna se equilibra con al menos 3 VC de tampón de
equilibración.
El producto eluido de la columna de sefarosa
azul se ajusta a 10% de isopropanol y se aplica a la columna a una
temperatura de 27 \pm 2ºC y a un caudal de
800-1.200 ml/min. La columna se lava a la misma
temperatura y al mismo caudal con aproximadamente 1 VC de tampón de
equilibración y luego con aproximadamente 2 VC de tampón de lavado.
A continuación se eluye con unos 3 VC de tampón eluyente. Se reúne
el pico global de proteína (unos 10-18 l), se diluye
enseguida por el factor 3 y se conserva a 15ºC hasta su
reelaboración. Con esta cromatografía se alcanza una pureza de un
90%.
- Tampón de equilibración:
- Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,75 M, 10% de isopropanol, pH 6,9 \pm 0,2
- Tampón de lavado:
- Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,75 M, 19% de isopropanol, pH 6,9 \pm 0,2
- Tampón de elución:
- Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,75 M, 27% de isopropanol, pH 6,9 \pm 0,2
- Tampón de dilución:
- Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,9 \pm 0,2
\global\parskip0.950000\baselineskip
El hidroxiapatito Ultrogel consta de
hidroxiapatito (fosfato cálcico cristalino) incrustado en una
estructura de agarosa, para mejorar sus propiedades mecánicas e
hidrodinámicas. La EPO se fija a esta matriz y se eluye a una
concentración de fosfato menor que la mayoría de impurezas de tipo
proteico.
La columna cromatográfica (Amicon P 440 x 500 o
una equivalente) se carga con 30-40 l de
hidroxiapatito Ultrogel y se regenera con NaOH 0,5 N. A
continuación, la columna se equilibra con al menos 4 VC de tampón de
equilibración.
El producto eluido de la columna de
Butyl-Toyopearl se aplica sobre la columna a una
temperatura de unos 15ºC y a un caudal de 500-1.200
ml/min. La columna se lava después a la misma temperatura y a
idéntico caudal con aproximadamente 1 VC de tampón de equilibración
y luego con unos 2 VC de tampón de lavado. Seguidamente se eluye con
unos 3 VC de tampón eluyente. Se reúne el pico total de proteína
(unos 10-18 l) y se conserva a 15ºC hasta su
reelaboración. Con esta cromatografía se alcanza una pureza superior
al 95%.
- Tampón de equilibración:
- Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 5 mM, NaCl 0,25 M, 9% de isopropanol, pH 6,9 \pm 0,2
- Tampón de lavado:
- Tris-HCl 10 mM, CaCl_{2} 5 mM, pH 6,8 \pm 0,2
- Tampón de elución:
- Tris-HCl 10 mM, fosfato K 10 mM, CaCl_{2} 0,5 mM, pH 6,8 \pm 0,2
El material de la RP-HPLC, p.ej.
Vydac C4 (Vydac, USA), consta de partículas de gel de sílice, cuya
superficie lleva cadenas alquilo C4. Debido a interacciones
hidrófobas, la EPO se fija a esta matriz y se eluye selectivamente
con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético
diluido.
La HPLC preparativa se lleva a cabo con un
equipo separador Prepbar 100 de Merck (o equivalente) a una
temperatura de 22 \pm 4ºC. La columna de separación (1000 mm x 400
mm, 3,2 l) está empaquetada con material Vydac C4. Antes del uso, la
columna se regenera empleando varias veces un gradiente de tampón A
hasta 100% de disolvente y seguidamente se equilibra con tampón
A.
El producto eluido de la columna de
hidroxiapatito se acidifica a un pH de 2,5 con ácido
trifluoroacético y se esteriliza por filtración. Luego se aplica a
la columna a una temperatura de 22 \pm 4ºC y a un caudal de
250-310 ml/min. La columna se eluye la misma
temperatura y a idéntico caudal con un gradiente lineal de tampón A
hasta tampón B. El pico de la elución se recoge en fracciones. Con
la introducción previa de 4 volúmenes de tampón de dilución HPLC el
producto eluido se neutraliza inmediatamente.
Las fracciones que dan una pureza mínima del 99%
en la HPLC analítica se purifican (volumen existente
aproxima-
damente igual a 4-6 l). Con esta cromatografía se separan trazas de impurezas y se alcanza una pureza superior al 99%.
damente igual a 4-6 l). Con esta cromatografía se separan trazas de impurezas y se alcanza una pureza superior al 99%.
- Tampón A:
- 0,1% de ácido trifluoroacético en agua
- Tampón B:
- 80% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroacético en agua
- Tampón de dilución HPLC:
- {}\hskip0.5cm fosfato Na/K 10 mM, pH 7,5 \pm 0,2
La DEAE-Sepharose Fast Flow
(Pharmacia) consta de grupos DEAE unidos mediante enlace covalente a
la superficie de bolitas de sefarosa. Debido a interacciones
iónicas la EPO se fija a esta matriz y se eluye aumentando la fuerza
iónica.
La columna cromatográfica (Amicon P 90 x 250 o
una equivalente) se carga por encargo con 100-200 ml
de gel por g de EPO y se regenera con NaOH 0,5 N. Luego se equilibra
la columna, primero con tampón de fosfato Na/K 100 mM de pH 7,5 y
después con al menos 12 VC de tampón de equilibración.
\global\parskip0.990000\baselineskip
El producto eluido de la columna de HPLC se
aplica a la columna a una temperatura de 5 \pm 4ºC y a un caudal
de unos 150 ml/min. La columna se lava luego a la misma temperatura
y al mismo caudal con al menos 5 VC de tampón de equilibración y
después con unos 10 VC de tampón de lavado. Luego se lava otra vez
con unos 10 VC de tampón de equilibración y después se eluye con
unos 7 VC de tampón de elución. Se reúne el pico global de proteína
(unos 2-5 l), se esteriliza por filtración y se
envasa.
En esta cromatografía se separa el disolvente de
la HPLC y se eliminan trazas de impurezas. La pureza es superior al
99%.
- Tampón de equilibración:
- fosfato Na/K 10 mM, pH 7,5 \pm 0,2
- Tampón de lavado:
- acetato Na 30 mM, pH 4,5 \pm 0,1
- Tampón de elución:
- fosfato Na/K 10 mM, NaCl 80 mM, pH 7,5 \pm 0,2
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Patente WO 88/00967
Patente WO 91/09955
Patente WO 93/09222
Claims (3)
1. Procedimiento de depleción de uno o más
estabilizadores -elegidos del grupo formado por polivinilalcohol,
metilcelulosa, polidextrano, polietilenglicol, Pluronic F68,
expansor de plasma poligelina (HAEMACCEL) o polivinilpirrolidona en
un preparado proteico con actividad eritropoyética obtenido por
producción recombinante en procesos de cultivo sin suero- mediante
purificación cromatográfica del preparado proteico procedente del
sobrenadante celular por cromatografía de afinidad a colorantes,
cromatografía hidrofóbica, cromatografía sobre hidroxiapatito,
cromatografía de fase inversa y cromatografía de intercambio
aniónico, caracterizado porque, tras la cromatografía de
afinidad a colorantes, tiene lugar una cromatografía hidrófoba como
segunda etapa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cromatografía hidrófoba se efectúa
sobre un soporte que lleva grupos alquilo (C_{4} hasta C_{18}),
fenilo o bencilo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o
2, caracterizado porque la cromatografía hidrófoba se efectúa
sobre un soporte butilado.
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