NO335212B1 - Inaktivert influensavirus-preparat samt anvendelse derav, influensavaksine og metode for fremstilling av et stabilt hemagglutinin-antigen - Google Patents

Abstract

SAMMENDRAG Inaktivert influensavirus-preparat er beskrevet som omfatter et hemagglutinin- antigen stabilisert i fravær av tiomersal eller med lave nivåer av tiomersal, hvor hemagglutinin er detekterbar ved et SRD-forsøk. Influensavirus-preparatet kan omfatte et micelle-modifiserende tilsetningsmiddel, for eksempel a-tokoferol eller et derivat derav i en tilstrekkelig mengde til å stabilisere hemagglutininet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår inaktivert influensavirus-preparat samt anvendelse derav, influensavaksine og metode for fremstilling av et stabilt hemagglutinin-antigen. Spesielt angår oppfinnelsen inaktiverte influensavaksiner som er splittede heller enn hele virus vaksiner og som er stabile i fravær av organokvikksølv-konserveringsmidler. Videre inneholder vaksinene hemagglutinin som er stabil i henhold til standardtester. Vaksinene kan administreres ved hvilken som helst rute egnet for slike vaksiner, så som intramuskulært, subkutant, intradermalt eller mukosalt, f.eks. intranasalt.

Influensavirus er et av de mest utbredte virus til stede i verden og påvirker både mennesker og husdyr. Den økonomiske virkningen av influensa er betydelig.

Influensavirus er et RNA kappe-virus med en partikkelstørrelse på ca. 125 nm i diameter. Det består egentlig av et indre nukleokapsid eller kjerne av ribonukleinsyre (RNA) forbundet med nukleoprotein, omgitt av en viral kappe med en lipid bilag-struktur og ytre glykoproteiner. Det indre lag av den virale kappen er sammensatt overveiende av matriksproteiner og det ytre lag for det meste av vertsavledet lipid materiale. Overflate-glykoproteinene neuraminidase (NA) og hemagglutinin (HA) ser ut som nagler, 10 til 12 nm lange, ved overflaten av partiklene. Det er disse overflateproteiner, spesielt hemagglutinin, som bestemmer den antigene spesifisitet av influensa-undertypene.

For tiden tilgjengelige influensavaksiner er enten inaktivert eller levende svekket influensavaksine. Inaktiverte influensavaksiner er sammensatt av tre mulige former av antigen-preparat: inaktiverte hele virus, sub-virioner hvor rensede viruspartikler er splittet med detergenter eller andre reagenser for å solubilisere den lipide kappe (såkalt "splittet" vaksine) eller renset HA og NA (subenhet-vaksine). Disse inaktiverte vaksiner blir gitt intramuskulært (i.m.) eller intranasalt (i.n.). Det finnes ingen kommersielt tilgjengelig levende svekket vaksine.

Influensavaksiner, av alle typer, er vanligvis trivalente vaksiner. De inneholder generelt antigener avledet fra to influensa A virus stammer og én influensa B stamme. En standard 0,5 ml injiserbar dose inneholder i de fleste tilfeller 15 ug av hemagglutinin antigenkomponent fra hver stamme, som målt ved enkel radial immunodiffusjon (SRD) (J.M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).

WO 9842373 A1 beskriver en metode for å redusere eller forhindre bakteriell kontaminasjon av en influensavaksine.

US 5919480 A beskriver subenhet influensavaksiner inneholdende et influensa H/N-antigen og et immunostimulerende cytokin der fortrinnsvis begge er innkapslet i liposomer.

Influensavirus-stammer som skal innføres i influensavaksine hver sesong blir bestemt av WHO i samarbeid med nasjonale helsemyndigheter og vaksineprodusenter.

Typisk forårsaker influensaepidemier økninger i forekomst av lungebetennelse og nedre luftveis-sykdom som vises ved øket grad av sykehusinnleggelse eller dødelighet. Eldre eller de med underliggende kroniske sykdommer har størst sannsynlighet for å oppleve slike komplikasjoner, men unge barn kan også lide av alvorlig sykdom. Disse grupper trenger derfor spesielt å beskyttes.

Aktuelle anstrengelser for å kontrollere sykdommen og dødeligheten forbundet med årlige epidemier av influensa er basert på anvendelse av intramuskulært administrerte inaktiverte influensavaksiner. Effektiviteten av slike vaksiner for forhindring av respiratorisk sykdom og influensa-komplikasjoner er i området fra 75% hos friske voksne til mindre enn 50% hos de eldre.

Standarder blir anvendt internasjonalt for å måle effektiviteten av influensavaksiner. EU's offisielle kriterier for en effektiv vaksine mot influensa er angitt i tabellen nedenfor. Teoretisk, for å møte EU's krav, må en influensa-vaksine møte bare ett av kriteriene i tabellen, for alle stammer av influensa omfattet i vaksinen. Imidlertid vil i praksis minst to eller alle tre kriterier måtte møtes for alle stammer, spesielt for en ny vaksine, så som en ny vaksine for levering via en annen rute. Under noen omstendigheter kan to kriterier være tilstrekkelig. For eksempel kan det være akseptabelt at to av de tre kriterier blir oppfylt for alle stammer mens det tredje kriterium blir oppfylt for noen, men ikke alle stammer (f.eks. to av tre stammer). Kravet er forskjellig for voksne populasjoner (18-60 år) og eldre populasjoner (>60 år).

For at en ny influensavaksine skal bli kommersielt anvendelig vil den ikke bare trenge å møte de standarder, men i praksis vil den også måtte være minst like effektiv som de for tiden tilgjengelige injiserbare vaksiner. Den vil også måtte være kommersielt levedyktig når det gjelder mengden av antigen og antallet administreringer nødvendig.

De for tiden kommersielt tilgjengelige influensavaksiner er enten splittede eller subenhet injiserbare vaksiner. Disse vaksiner blir fremstilt ved splitting av viruspartikkelen, generelt med et organisk løsningsmiddel eller detergent og separering eller rensning av de virale proteiner i varierende utstrekning. Splitt-vaksiner blir fremstilt ved fragmentering av hele influensavirus, enten infeksiøse eller inaktiverte, med solubiliserings-konsentrasjoner av organiske løsningsmidler eller detergenter og påfølgende fjerning av solubiliseringsmiddel og noen eller mesteparten av det virale lipide materiale. Splitt-vaksiner inneholder generelt forurensende matriks-protein og nukleoprotein og noen ganger lipid, så vel som membran-kappeproteiner. Splitt-vaksiner vil vanligvis inneholde de fleste eller alle virus strukturelle proteiner selv om ikke nødvendigvis i samme forhold som de forekommer i hele virus. Subenhet-vaksiner består på den annen side i det vesentlige av meget rensede virale overflateproteiner, hemagglutinin og neuraminidase, som er overflateproteinene ansvarlige for å frembringe de ønskede virus-nøytraliserende antistoffer etter vaksinasjon.

Mange vaksiner som for tiden er tilgjengelige krever et konserveringsmiddel for å forhindre forringelse. Et ofte anvendt konserveringsmiddel er timerosal som er en kvikksølv-inneholdende forbindelse. Noe offentlig bekymring er uttrykt om virkningene av kvikksølv-holdige forbindelser. Det er intet overvåkningssystem på plass for å detektere virkningene av lave til moderate doser av organokvikksølvforbindelser på det utviklende nervesystem og spesielle undersøkelser av barn som har mottatt høye doser av organokvikksølvforbindelser vil ta mange år å fullføre. Visse kommentatorer har fremhevet at potensielle risikoer ved timerosal-holdige vaksiner ikke skal overdrives (Offit; P.A. JAMA Vol,283;Nr:16). Allikevel ville det være fordelaktig å finne alternative metoder for fremstilling av vaksiner ved å erstatte anvendelse av timerosal i framstillingsprosessen. Det er således et behov å utvikle vaksiner som er timerosal-frie, spesielt vaksiner så som influensavaksiner som anbefales, i det minste for visse populasjons-grupper, på en årlig basis.

Det har vært standard praksis hittil å anvende et konserveringsmiddel for kommersielle inaktiverte influensavaksiner, under produksjons/rensnings-prosessen og/eller i den endelige vaksine. Konserveringsmidlet er nødvendig for å forhindre mikroorganismer fra å vokse gjennom de forskjellige stadier av rensning. For egg-avledede influensavaksiner blir tiomersal typisk satt til rå allantoisk væske og kan også tilsettes en andre gang under prosesseringen av viruset. Således vil det være gjenværende tiomersal til stede ved slutten av prosessen og dette kan i tillegg reguleres til en ønskelig konserveringsmiddel-konsentrasjon i den endelige vaksine, for eksempel til en konsentrasjon på rundt 100 ug/ml.

En side-effekt ved anvendelse av tiomersal som et konserveringsmiddel i influensavaksiner er en stabiliserende effekt. Tiomersal i kommersielle influensavaksiner virker til å stabilisere HA-komponenten av vaksinen, spesielt, men ikke utelukkende HA av B stamme influensa. Visse A stamme hemagglutininer f.eks. H3 kan også kreve stabilisering. Derfor, selv om det kan være ønskelig å vurdere fjerning av tiomersal fra influensavaksiner eller i det minste redusere konsentrasjonen av tiomersal i den endelige vaksine, er det et problem å overvinne at uten tiomersal, vil HA ikke være tilstrekkelig stabil.

Det har vært oppdaget ved foreliggende oppfinnelse at det er mulig å stabilisere HA i inaktiverte influensa-preparater ved anvendelse av alternative reagenser som ikke inneholder organokvikksølvforbindelser. HA forblir stabilisert slik at det er detekterbart over tid ved kvantitative standard-metoder, spesielt SRD, i større grad enn et ikke-stabilisert antigen-preparat produsert ved samme metode men uten stabiliserende tilsetningsmiddel. SRD-metoden blir utført som beskrevet ovenfor. Det er viktig at HA forblir stabilisert i opptil 12 måneder som er standarden nødvendig for en endelig influensavaksine.

I et første aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse inaktivert influensavirus-preparat omfattende et hemagglutinin-antigen (HA) stabilisert i fravær av tiomersal eller med lave nivåer av tiomersal på 5 ug/ml eller mindre, hvor hemagglutinin er detekterbar ved et SRD-forsøk, og hvor preparatet omfatter a-tokoferol-succinat i en tilstrekkelig mengde til å stabilisere HA.

Lave nivåer av tiomersal er de nivåer ved hvilke stabiliteten til HA avledet fra influensa B blir redusert, slik at et stabiliserende tilsetningsmiddel er nødvendig for stabilisert HA. Lave nivåer av tiomersal er generelt 5 ug/ml eller mindre.

Generelt angir stabilisert HA, HA som er detekterbart over tid ved kvantitative standard-metoder, spesielt SRD, i en større grad enn et ikke-stabilisert antigen-preparat produsert ved samme metode, men uten noe stabiliserende tilsetningsmiddel. Stabilisering av HA opprettholder fortrinnsvis aktiviteten til HA hovedsakelig konstant over en ett års periode. Fortrinnsvis tillater stabilisering av vaksinen omfattende HA å gi akseptabel beskyttelse etter en 6 måneders lagringsperiode, mer foretrukket en ett års periode.

Hensiktsmessig blir stabilisering utført med et stabiliserende tilsetningsmiddel, fortrinnsvis et micelle-modifiserende tilsetningsmiddel. Et micelle-modifiserende tilsetningsmiddel er generelt et tilsetningsmiddel som kan innføres i en micelle dannet av detergenter anvendt i eller egnet for, solubilisering av membranprotein HA, så som rensemidlene Tween 80, Triton X100 og deoksycholat, individuelt eller i kombinasjon.

Uten å ønske å være bundet av teorien, er det antatt at tilsetningsmidlene virker til å stabilisere HA ved interaksjon med lipidene, rensemidlene og/eller proteinene i det endelige preparat. Blandede miceller av tilsetningsmiddel med protein og lipid kan dannes, så som miceller av Tween og deoksycholat med gjenværende lipider og/eller Triton X-100. Det er antatt at overflateproteiner blir holdt solubilisert av de komplekse miceller. Fortrinnsvis blir protein-aggregering begrenset ved ladningsfrastøtning av miceller inneholdende egnede tilsetningsmidler, så som miceller inneholdende negativt ladede detergenter.

Egnede micelle-modifiserende tilsetningsmidler omfatter: positivt, negativt eller zwitterionisk ladede amfifile molekyler så som alkylsulfater eller alkyl-aryl- sulfater; ikke-ioniske amfifile molekyler så som alkyl-polyglykosider eller derivater derav, så som Plantacare® (tilgjengelig fra Henkel KGaA) eller alkylalkohol-polyalkylenetere eller derivater derav så som Laureth-9.

Tilsetningsmidler kan være a-tokoferol eller derivater av a-tokoferol så som a-tokoferol-succinat. Andre tokoferol-derivater kan være D-a-tokoferol, D-5-tokoferol, D-y-tokoferol og DL-a-tokoferol. Derivater av tokoferoler kan være acetater, succinater, fosforsyreestere, formiater, propionater, butyrater, sulfater og glukonater. Alfa-tokoferol-succinat er spesielt foretrukket, a-tokoferol eller derivat er til stede i en mengde tilstrekkelig til å stabilisere hemagglutininet.

Andre egnede tilsetningsmidler kan identifiseres ved metoder standard på området og testes for eksempel ved anvendelse av SRD-metoden for stabilitetsanalyse som beskrevet her.

I et foretrukket aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et influensavirus preparat omfattende stabilisert B stamme influensa HA.

Oppfinnelsen tilveiebringer i et ytterligere aspekt en metode for fremstilling av et stabilt hemagglutinin-antigen hvilken metode omfatter rensning av antigenet i nærvær av a-tokoferol eller et derivat derav så som a-tokoferol-succinat.

Vaksinen kan administreres ved hvilken som helst egnet leveringsrute, så som intradermal, mukosal f.eks. intranasal, oral, intramuskulær eller subkutan. Andre leveringsruter er velkjent på området.

Intradermal levering er foretrukket. Hvilken som helst egnet anordning kan anvendes for intradermal levering, for eksempel korte nål-anordninger så som de beskrevet i US 4,886,499, US5,190,521, US 5,328,483, US 5,527,288, US 4,270,537, US 5,015,235, US 5,141,496, US 5,417,662. Intradermale vaksiner kan også administreres ved anordninger som begrenser den effektive penetreringslengde av en nål inn i huden, så som de beskrevet i WO99/34850 og EP1092444, og funksjonelle ekvivalenter derav. Også egnet er jet-injeksjonsanordninger som leverer flytende vaksiner til dermis via en væske-jetinjektor eller via en nål som trenger gjennom stratum corneum og produserer en jetstråle som når dermis. Jet-injeksjonsanordninger er beskrevet for eksempel i US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 og WO 97/13537. Også egnet er ballistiske pulver/partikkel-leverings-anordninger som anvender sammenpresset gass for å akselerere vaksine i pulverform gjennom det ytre lag av huden til dermis. I tillegg kan konvensjonelle sprøyter anvendes ved den klassiske mantoux-metode med intradermal administrering. Imidlertid krever anvendelse av konvensjonelle sprøyter meget dyktige operatører og således er anordninger som kan levere nøyaktig uten en meget dyktig bruker, foretrukket.

Intradermale anordninger i kombinasjon med en vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt for eksempel anordninger beskrevet i WO99/34850 eller EP1092444 er mulige.

Det tilveiebringes også anvendelse av et inaktivert influensavirus-preparat for fremstilling av en vaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 9- 14 for profylakse av influensainfeksjon eller sykdom i et individ. Idet vaksineleveringen er intradermal, intranasal, intramuskulær, oral eller subkutan.

Det tilveiebringes også anvendelse av a-tokoferol-succinat som en heamaglutininstabilisator for fremstilling av en influensavaksine.

Det tilveiebringes også influensavaksine som krevd i et hvilket som helst av kravene 9-14, for anvendelse i medisin.

Oppfinnelsen angår spesielt, men ikke utelukkende, stabilisering av B stamme influensa-hemagglutinin.

Fortrinnsvis er det stabiliserte HA ifølge foreliggende oppfinnelse stabilt i 6 måneder, mer foretrukket 12 måneder.

Fortrinnsvis er a-tokoferol i form av en ester, mer foretrukket succinat eller acetat, og mest foretrukket succinat.

Foretrukne konsentrasjoner for a-tokoferol eller derivat er mellom

1 ug/ml -10 mg/ml, mer foretrukket mellom 10 ug/ml - 500 ^g/rnl.

Vaksiner kan inneholde generelt både A- og B-stamme virus-antigener, typisk i et trivalent preparat av to A-stammer og én B-stamme. Imidlertid er divalente og monovalente vaksiner ikke utelukket. Monovalente vaksiner kan være fordelaktig i en pandemisk situasjon, for eksempel når det er viktig å få meget vaksine produsert og administrert så raskt som mulig.

Det ikke-levende influensa-antigenpreparat for anvendelse ved oppfinnelsen kan velges fra gruppen bestående av splittede virus-antigenpreparater, subenhet antigener (enten rekombinant uttrykt eller fremstilt fra hele virus), inaktiverte hele virus som kan være kjemisk inaktivert med f.eks. formaldehyd, p-propiolakton eller på annen måte inaktivert f.eks. U.V.- eller varme-inaktivert. Fortrinnsvis er antigenpreparatet enten et splittet virus-preparat eller et subenhet-antigen fremstilt fra hele virus, spesielt ved en splittingsprosess fulgt av rensning av overflateantigenet. Mest foretrukket er splitt-virus-preparater.

Fortrinnsvis er konsentrasjonen av hemagglutinin-antigen for en eller hver stamme av influensavirus-preparatet 1-1000^g pr. ml, mer foretrukket 3-300 ug pr. ml og mest foretrukket ca. 30 ug pr. ml, som målt ved et SRD-forsøk.

Vaksinen ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte et adjuvans eller en immunostimulant så som, men ikke begrenset til, detoksifisert lipid A fra hvilken som helst kilde og ikke-toksiske derivater av lipid A, saponiner og andre reagenser som er i stand til å stimulere en TH1-type respons.

Det har lenge vært kjent at enterobakterielt lipopolysakkarid (LPS) er en kraftig stimulator av immunsystemet, selv om dets anvendelse i adjuvantia har vært begrenset av dets toksiske effekter. Et ikke-toksisk derivat av LPS, monofosforyl lipid A (MPL), produsert ved fjerning av kjerne-karbohydratgruppen og fosfatet fra det reduserende-ende glukosamin, er beskrevet av Ribi et al (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, s.407-419) og har den følgende struktur:

En ytterligere detoksifisert versjon av MPL er resultat av fjerning av acyl-kjeden fra 3-stillingen av disakkarid-ryggraden og er betegnet 3-O-deacylert monofosforyl lipid A (3D-MPL). Det kan renses og fremstilles ved metodene beskrevet i GB 2122204B, hvilken referanse også beskriver fremstilling av difosforyl lipid A og 3-O-deacylerte varianter derav.

En foretrukket form av 3D-MPL er i form av en emulsjon som har liten partikkelstørrelse mindre enn 0,2 \ im i diameter og dens fremstillingsmetode er beskrevet i WO 94/21292. Vandige preparater omfattende monofosforyl lipid A og et overflateaktivt middel er beskrevet i WO9843670A2.

Bakterielle lipopolysakkarid-avledede adjuvantia for formulering i preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse kan renses og prosesseres fra bakterielle kilder eller alternativt kan de være syntetiske. For eksempel er renset monofosforyl lipid A beskrevet i Ribi et al 1986 (supra) og 3-O-deacylert monofosforyl eller difosforyl lipid A avledet fra Salmonella sp. er beskrevet i GB 2220211 og US 4912094. Andre rensede og syntetiske lipopolysakkarider er beskrevet (Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. lmmunol., 79(4):392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1): 141-6; og EP 0 549 074 B1). Et spesielt foretrukket bakterielt lipopolysakkarid-adjuvans er 3D-MPL.

Følgelig er LPS-derivatene som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse de immunostimulanter som er lignende i struktur til de til LPS eller MPL eller 3D-MPL. I et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan LPS-derivatene være et acylert monosakkarid, som er en sub-gruppe av strukturen av MPL ovenfor.

Saponiner er beskrevet i: Lacaille-Dubois, M og Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol. 2 s. 363-386). Saponiner er steroid- eller triterpen-glykosider bredt distribuert i plante- og marine dyre-riker. Saponiner er kjent for å danne kolloidale løsninger i vann som skummer ved risting og for utfelling av kolesterol. Når saponiner er nær celle-membraner skaper de pore-lignende strukturer i membranen som forårsaker at membranen brister. Hemolyse av erytrocytter er et eksempel på dette fenomen, som er en egenskap til visse, men ikke alle, saponiner.

Saponiner er kjent som adjuvantia i vaksiner for systemisk administrering. Adjuvans og hemolytisk aktivitet til individuelle saponiner er i stor utstrekning studert på området (Lacaille-Dubois og Wagner, supra). For eksempel er Quil A (avledet fra barken av det syd-amerikanske tre Quillaja Saponaria Molina) og fraksjoner derav, beskrevet i US 5,057,540 og "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev TherDrug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; og EP 0 362 279 B1. Partikkelformede strukturer, betegnet immun- stimulerende komplekser (ISCOM), omfattende fraksjoner av Quil A er hemolytiske og har vært anvendt ved fremstilling av vaksiner (Morein, B.,

EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). De hemolytiske saponiner QS21 og QS17 (HPLC-rensede fraksjoner av Quil A) er beskrevet som kraftige systemiske adjuvantia og metoden for deres produksjon er beskrevet i US-patent nr. 5,057,540 og EP 0 362 279 B1. Andre saponiner som har vært anvendt ved systemiske vaksinasjonsundersøkelser omfatter de avledet fra andre plantearter så som Gypsophila og Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

Et forbedret system involverer kombinasjonen av et ikke-toksisk lipid A derivat og et saponin-derivat, spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153 eller et mindre reaktogent preparat hvor QS21 blir behandlet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739.

Et spesielt kraftig adjuvans-preparat som involverer QS21 og 3D-MPL i en olje-i-vann-emulsjon er beskrevet i WO 95/17210 og er et foretrukket preparat.

Følgelig tilveiebringes i én utførelsesform av oppfinnelsen, en vaksine omfattende et influensa-antigen-preparat ifølge foreliggende oppfinnelse adjuvantert med detoksifisert lipid A eller et ikke-toksisk derivat av lipid A, mer foretrukket adjuvantert med et monofosforyl lipid A eller derivat derav. Fortrinnsvis omfatter vaksinen i tillegg et saponin, mer foretrukket QS21. Fortrinnsvis omfatter preparatet i tillegg en olje-i-vann-emulsjon.

Vaksinene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte minst ett overflateaktivt middel som spesielt kan være et ikke-ionisk overflateaktivt middel. Egnet ikke-ionisk overflateaktivt middel er valgt fra gruppen bestående av oktyl- eller nonylfenoksy-polyoksyetanoler (for eksempel den kommersielt tilgjengelige Triton ™ serien), polyoksyetylen-sorbitanestere (Tween™ serien) og polyoksyetylen-etere eller -estere med den generelle formel (I):

(I) HO(CH2CH20)n-A-R

hvor n er 1 -50, A er en binding eller -C(O)-, R er C1-50alkyl eller fenyl-d-50 alkyl; og kombinasjoner av to eller flere av disse.

Foretrukne overflateaktive midler som faller innenfor formel (I) er molekyler hvor n er 4-24, mer foretrukket 6-12 og mest foretrukket 9; R-komponenten er C1-50, fortrinnsvis C4-C20alkyl og mest foretrukket C12alkyl.

Oktylfenoksy-polyoksyetanoler og polyoksyetylen-sorbitanestere er beskrevet i "Surfactant systems" Ed: Attwood and Florence (1983, Chapman and Hall). Oktylfenoksy-polyoksyetanoler (oktoksynoler), omfattende t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (Triton X-100 ™) er også beskrevet i Merck Index Entry 6858 (side 1162, 12. Ed., Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). Polyoksyetylen-sorbitanestere, omfattende polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80 ™) er beskrevet i Merck Index Entry 7742 (side 1308, 12. Ed., Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). Begge kan fremstilles ved anvendelse av metoder beskrevet der eller anskaffes fra kommersielle kilder så som Sigma Inc.

Spesielt foretrukne ikke-ioniske overflateaktive midler omfatter Triton X-45, t-oktylfenoksy-polyetoksyetanol (Triton X-100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, polyoksyetylen-9-lauryleter (laureth 9) og polyoksyetylen-9-stearyleter (steareth 9). Triton X-100 og laureth 9 er spesielt foretrukket. Også spesielt foretrukket er polyoksyetylen-sorbitanester, polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80™).

Ytterligere egnede polyoksyetylen-etere med den generelle formel (I) er valgt fra den følgende gruppe: polyoksyetylen-8-stearyleter, polyoksyetylen-4-lauryleter, polyoksyetylen-35-lauryleter og polyoksyetylen-23-lauryleter.

Alternative betegnelser eller navn for polyoksyetylen-lauryleter er beskrevet i CAS registry. CAS registry nummer for polyoksyetylen-9-lauryleter er: 9002-92-0. Polyoksyetylenetere så som polyoksyetylen-lauryleter er beskrevet i Merck Index (12. ed: entry 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). Laureth 9 blir dannet ved omsetning av etylenoksyd med dodecylalkohol og har et gjennomsnitt på ni etylenoksyd-enheter.

To eller flere ikke-ioniske overflateaktive midler fra de forskjellige grupper av overflateaktive midler beskrevet kan være til stede i vaksinepreparatet beskrevet her. Spesielt er en kombinasjon av en polyoksyetylen-sorbitanester så som polyoksyetylen-sorbitan-monooleat (Tween 80 ™) og en oktoksynol så som t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (Triton) X-100™ foretrukket. En annen spesielt foretrukket kombinasjon av ikke-ioniske overflateaktive midler omfatter laureth 9 pluss en polyoksyetylen-sorbitanester eller en oktoksynol eller begge.

Ikke-ioniske overflateaktive midler så som de beskrevet ovenfor har foretrukne konsentrasjoner i det endelige vaksinepreparat som følger: polyoksyetylen-sorbitanestere så som Tween 80™: 0,01 til 1%, mest foretrukket ca. 0,1% (vekt/volum); oktyl- eller nonylfenoksy-polyoksyetanoler så som Triton X-100™ eller andre rensemidler i Triton-serien: 0,001 til 0,1%, mest foretrukket 0,005 til 0,02 % (vekt/volum); polyoksyetylen-etere med den generelle formel (I) så som laureth 9: 0,1 til 20 %, fortrinnsvis 0,1 til 10 % og mest foretrukket 0,1 til 1 % eller ca. 0,5% (vekt/volum).

For visse vaksinepreparater kan andre vaksine-komponenter inkluderes i preparatet. Som sådanne kan preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse også omfatte en gallesyre eller et derivat derav, spesielt i form av et salt. Disse omfatter derivater av kolsyre og salter derav, spesielt natriumsalter av kolsyre eller kolsyrederivater. Eksempler på gallesyrer og derivater derav omfatter kolsyre, deoksykolsyre, chenodeoksykolsyre, lithokolsyre, ursodeoksykolsyre, hyodeoksykolsyre og derivater så som glyko-, tauro-, amidopropyl-1-propansulfonsyre-, amidopropyl-2-hydroksy-1 -propansulfonsyre-derivater av ovennevnte gallesyrer eller N,N-bis (3-D-glukonoamidopropyl)-deoksykolamid. Et spesielt foretrukket eksempel er natrium-deoksykolat (NaDOC) som kan være til stede i den endelige vaksinedose.

Det er mulig å danne farmasøytiske sett omfattende en vaksine-administreringsanordning fylt med en vaksine ifølge oppfinnelsen. Slike administreringsanordninger omfatter, men er ikke begrenset til nål-anordninger, væske-jet-anordninger, pulver-anordninger og spray-anordninger (for intranasal anvendelse).

Influensavirus-antigenpreparatene ifølge oppfinnelsen kan avledes ved den konvensjonelle embryonerte egg metode eller de kan avledes ved hvilken som helst av de nye dannelsesmetoder ved anvendelse av vevkultur for å dyrke viruset eller uttrykke rekombinante influensavirus-overflateantigener. Egnede celle-substrater for dyrking av viruset omfatter for eksempel hunde-nyreceller så som MDCK eller celler fra en klon av MDCK, MDCK-lignende celler, apenyre-celler så som AGMK-celler omfattende Vero-celler, egnede gris-cellelinjer eller hvilken som helst annen pattedyrcelletype egnet for fremstilling av influensavirus for vaksine-formål. Egnede cellesubstrater omfatter også humane celler f.eks. MRC-5 celler. Egnede celle-substrater er ikke begrenset til cellelinjer; for eksempel er primære celler så som kylling-embryo-fibroblaster også omfattet.

Influensavirus-antigenpreparatet kan produseres ved hvilken som helst av flere kommersielt anvendbare prosesser, for eksempel den split Flu prosessen beskrevet i patent nr. DD 300 833 og DD 211 444. Tradisjonelt ble split Flu produsert ved anvendelse av løsningsmiddel/detergent-behandling, så som tri-n-butylfosfat eller dietyleter i kombinasjon med Tween™ (kjent som "Tween-eter" splitting) og denne prosessen er fortsatt anvendt ved noen produksjonsanlegg. Andre splittings-midler nå anvendt omfatter rensemidler eller proteolytiske enzymer eller gallesyresalter, for eksempel natrium-deoksycholat som beskrevet i patent nr. DD 155 875. Detergenter som kan anvendes som splittingsmidler omfatter kationiske rensemidler f.eks. cetyl-trimetyl-ammoniumbromid (CTAB), andre ioniske detergenter f.eks. laurylsulfat, taurodeoksycholat eller ikke-ioniske detergenter så som de beskrevet ovenfor omfattende Triton X-100 (for eksempel ved en fremgangsmåte beskrevet i Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103) og Triton N-101 eller kombinasjoner av hvilke som helst to eller flere detergenter.

Fremstillingsprosessen for en splittet vaksine vil omfatte flere forskjellige filtrerings- og/eller andre separerings-trinn så som ultrasentrifugering-, ultrafiltrering-, zonal-sentrifugering- og kromatografi- (f.eks. ionebytter) trinn i en rekke kombinasjoner og eventuelt et inaktiveringstrinn, f.eks. med varme, formaldehyd eller p-propiolakton eller U.V. som kan utføres før eller etter splittingen. Splittingsprosessen kan utføres som batch, kontinuerlig eller semi-kontinuerlig prosess.

Foretrukne splittet influensavaksine-antigenpreparater ifølge oppfinnelsen omfatter en gjenværende mengde av Tween 80 og/eller Triton X-100 som er igjen fra produksjonsprosessen, selv om disse kan tilsettes eller deres konsentrasjoner reguleres etter fremstilling av det splittede antigen. Fortrinnsvis er både Tween 80 og Triton X-100 til stede. De foretrukne områder for de endelige konsentrasjoner av disse ikke-ioniske overflateaktive midler i vaksinedosen er:

Tween 80: 0,01 til 1%, mer foretrukket ca. 0,1% (volum/volum)

Triton X-100: 0,001 til 0,1 (% vekt/volum), mer foretrukket 0,005 til 0,02%

(vekt/volum).

Alternativt kan influensavirus-antigenpreparatene ifølge oppfinnelsen avledes fra en kilde forskjellig fra levende influensavirus, for eksempel kan hemagglutinin-antigen produseres rekombinant.

Oppfinnelsen vil nå bli ytterligere beskrevet i de følgende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - Fremstilling av influensavirus- antiqenpreparat ved anvendelse av g- tokoferol- succinat som en stabiliserer for en konserveringsmiddel- fri vaksine ( tiomersal- redusert vaksine)

Monovalent splitt-vaksine ble fremstilt i henhold til den følgende prosedyre.

Fremstilling av virus-inoculum

På dagen for inokulering av embryonerte egg blir friskt inoculum fremstilt ved blanding av det virksomme podestoff med fosfatbufret saltvann inneholdende gentamycinsulfat med 0,5 mg/ml og hydrokortison med 25 ug/ml.

(virus-stamme-avhengig). Virus-inoculum blir holdt ved 2-8°C.

Inokulering av embryonerte egg

Ni til elleve dager gamle embryonerte egg blir anvendt for virus-replikasjon. Skallene blir dekontaminert. Eggene blir inokulert med 0,2 ml virus-inoculum. De inokulerte egg blir inkubert ved passende temperatur (virus-stamme-avhengig) i 48 til 96 timer. Ved slutten av inkuberingsperioden blir embryoene drept ved avkjøling og eggene blir lagret i 12-60 timer ved 2-8°C.

Høsting

Den allantoiske væske fra de avkjølte embryonerte egg blir høstet. Vanligvis blir 8 til 10 ml rå allantoisk væske oppsamlet pr. egg.

Konsentrasjon og rensning av hele virus fra allantoisk væske

1. Klaring

Den høstede allantoiske væske blir klaret ved moderat hastighet sentrifugering (område: 4000 -14000 g).

2. Adsorpsjonstrinn

For å oppnå en CaHPCvgel i den klarede virus-samling blir 0,5 mol/l Na2HP04og 0,5 mol/l CaCfe-løsninger tilsatt for å nå en endelig konsentrasjon av CaHP04på 1,5 g til 3,5 g CaHPOVIiter avhengig av virusstammen.

Etter sedimentering i minst 8 timer blir supernatanten fjernet og sedimentet inneholdende influensavirus blir resolubilisert ved tilsetning av en 0,26 mol/l EDTA-Na2-løsning, avhengig av mengden av CaHPCvanvendt.

3. Filtrering

Det resuspenderte sediment blir filtrert på en 6 filtermembran.

4. Sukrose-gradient-sentrifugering

Influensavirus blir konsentrert ved isopyknisk sentrifugering i en lineær sukrose-gradient (0,55 % (vekt/volum)) inneholdende 100 ug/ml Tiomersal. Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet ved fire forskjellige fraksjoner (sukrosen blir målt i et refraktometer):

<*>virus stamme-avhengig: fraksjon 3 kan reduseres til 15% sukrose.

For videre vaksine-preparering blir bare fraksjoner 2 og 3 anvendt.

Fraksjon 3 blir vasket ved diafiltrering med fosfatbuffer for å redusere sukrose-innholdet til omtrent under 6%. Influensavirus til stede i denne fortynnede fraksjon blir pelletert for å fjerne oppløselige forurensninger.

Pelleten blir resuspendert og grundig blandet for å oppnå en homogen suspensjon. Fraksjon 2 og den resuspenderte pellet fra fraksjon 3 blir samlet og fosfatbuffer blir tilsatt for å oppnå et volum på omtrent 40 liter. Dette produktet er det monovalente hele virus-konsentrat.

5. Sukrose-gradient-sentrifugering med natrium-deoksycholat

Det monovalente hele influensavirus-konsentrat blir påført på en ENI-Mark II ultrasentrifuge. K3 rotor inneholder en lineær sukrosegradient (0,55 %

(vekt/volum)) hvor en natrium-deoksykolat-gradient i tillegg blir overlagt. Tween 80 er til stede under splitting i opptil 0,1% (vekt/volum) og Tokoferol-succinat blir tilsatt for B-stamme-virus opptil 0,5 mM. Den maksimale natrium-deoksycholat-konsentrasjon er 0,7-1,5% (vekt/volum) og er stamme-avhengig. Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet ved tre forskjellige fraksjoner (sukrosen blir målt i et refraktometer). Fraksjon 2 blir anvendt for videre prosessering. Sukrose-innhold for fraksjon-grenser (47-18%) varierer i henhold til stammer og blir fastsatt etter evaluering:

6. Sterilfiltrering

Den splittede virusfraksjon blir filtrert på filtermembraner som slutter med en 0,2 nm membran. Fosfatbuffer inneholdende 0,025 % (vekt/volum) Tween 80 og (for B-stamme virus) 0,5 mM Tokoferol-succinat blir anvendt for fortynning. Det endelige volum av den filtrerte fraksjon 2 er 5 ganger det opprinnelige fraksjonsvolum.

7. Inaktivering

Det filtrerte monovalente materiale blir inkubert ved 22 ± 2°C i maksimalt 84 timer (avhengig av virussstammene, denne inkubering kan forkortes). Fosfatbuffer inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 blir deretter tilsatt for å redusere det totale proteininnhold til maks. 250 \ ig/ m\. For B stamme virus blir fosfatbufret saltvann inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 og 0,25 mM Tokoferol-succinat anvendt for fortynning for å redusere det totale protein-innhold til 250 ug/ml. Formaldehyd blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på 50 ug/ml og inaktiveringen finner sted ved 20°C + 2°C i minst 72 timer.

8. Ultrafiltrering

Det inaktiverte splitt-virusmaterialet blir konsentrert minst 2 ganger i en ultrafiltreringsenhet, utstyrt med celluloseacetat-membraner med 20 kDa MWCO. Materialet blir deretter vasket med fosfatbuffer inneholdende 0,025 %

(vekt/volum) Tween 80 fulgt av fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01 %

(vekt/volum) Tween. For B-stamme virus blir fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01% (vekt/volum) Tween 80 og 0,1 mM Tokoferol-succinat anvendt for vasking.

9. Endelig sterilfiltrering

Materialet etter ultrafiltrering blir filtrert på filtermembraner som slutter med en 0,2^m membran. Filtermembraner blir skyllet og materialet blir fortynnet hvis nødvendig slik at protein-konsentrasjonen ikke overstiger 500 ug/ml med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01 % (vekt/volum) Tween 80 og (for B stamme virus) 0,1 mM Tokoferol-succinat.

10. Lagring

Den monovalente endelige bulk blir lagret ved 2 - 8°C i maksimalt 18 måneder.

Stabilitet

Eksempel 2 - Fremstilling av influensavaksine ved anvendelse av ct-tokoferol- succinat som en stabiliserer for en tiomersal- redusert vaksine

Monovalent endelig bulk av tre stammer, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 og B/Yamanashi/166/98 ble produsert i henhold til metoden beskrevet i Eksempel 1.

Samling

Den passende mengde av monovalent endelig bulk ble samlet til en endelig HA-konsentrasjon på 30 ug/ml for henholdsvis A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17, og på 39 ug/ml for B/Yamanashi/166/98. Tween 80 og Triton X-100 ble regulert til henholdsvis 580 ug/ml og 90 ug/ml. Det endelige volum ble regulert til 3 I med fosfatbufret saltvann. Den trivalente samling ble filtrert ved å slutte med 0,8 um celluloseacetat-membran for å oppnå den trivalente endelige bulk. Trivalent endelig bulk ble fylt i sprøyter med minst 0,5 ml i hver.

Eksempel 3 - SRD- metode anvendt for å måle hemagglutinin- innhold

Glassplater (12,4 -10,0 cm) blir belagt med en agarosegel inneholdende en konsentrasjon av anti-influensa HA-serum som er anbefalt av NIBSC. Etter at gelen har satt seg blir 72 prøvebrønner (3 mm 0) presset inn i agarosen. 10 mikroliter passende fortynninger av referanse og prøven blir fylt i brønnene. Platene blir inkubert i 24 timer ved romtemperatur (20 til 25°C) i et fuktig kammer. Deretter blir platene bløtet natten over med NaCI-løsning og vasket kort i destillert vann. Gelen blir deretter presset og tørket. Når fullstendig tørre blir platene merket med Coomassie Brillant Blue løsning i 10 min og avfarget to ganger i en blanding av metanol og eddiksyre inntil klart definerte merkede soner blir synlige. Etter tørking av platene blir diameteren av de merkede soner som omgir antigen-brønner målt i to retninger med rette vinkler. Alternativt kan utstyr for å måle overflaten anvendes. Dose-respons-kurver av antigen-fortynninger mot overflaten blir konstruert og resultatene blir beregnet i henhold til standard hellings-forhold forsøksmetoder (Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffin, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).

Eksempel 4 - Klinisk testing av g- tokoferol- stabilisert influensavaksine f redusert tiomersal)

Sprøyter oppnådd som beskrevet i Eksempel 2 blir anvendt for klinisk testing

H3N2: A/Panama/2007/99 RESVIR-17

H1N1: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116

B: B/Yamanashi/166/98

Resultater viser at vaksinen kan gi ekvivalent beskyttelse som vaksiner inneholdende tiomersal som konserveringsmiddel.

Eksempel 5a - Fremstilling av influensavirus- antigenpreparat ved anvendelse av g- tokoferol- succinat som stabilisator for en tiomersal- fri vaksine

Monovalent splittet vaksine ble fremstilt i henhold til den følgende prosedyre.

Fremstilling av virus-inoculum

På dagen for inokulering av embryonerte egg blir friskt inoculum fremstilt ved blanding av det virkende podestoff med fosfatbufret saltvann inneholdende gentamycinsulfat med 0,5 mg/ml og hydrokortison med 25 ug/ml. (virus-stamme-avhengig). Virusinoculum blir holdt ved 2-8°C.

Inokulering av embryonerte egg

Ni til elleve dager gamle embryonerte egg blir anvendt for virus-replikasjon. Skallene blir dekontaminert. Eggene blir inokulert med 0,2 ml av virus-inoculum. 60.000 inokulerte egg blir inkubert ved den passende temperatur (virus stamme-avhengig) i 48 til 96 timer. Ved slutten av inkuberingsperioden blir embryoene drept ved avkjøling og eggene blir lagret i 12-60 timer ved 2-8°C.

Høsting

Den allantoiske væske fra de avkjølte embryonerte egg blir høstet. Vanligvis blir 8 til 10 ml rå allantoisk væske oppsamlet pr. egg.

Konsentrasjon og rensning av hele virus fra allantoisk væske

Klaring

Den høstede allantoiske væske blir klaret ved sentrifugering med moderat hastighet (område: 4000 -14000 g).

Utfellingstrinn

Mettet ammoniumsulfat-løsning blir satt til den klarede virussamling for å nå en endelig ammoniumsulfat-konsentrasjon på 0,5 mol/l Etter sedimentering i minst 1 time blir fellingen fjernet ved filtrering på dybdefiltere (typisk 0,5 um)

Filtrering

Den klarede rå hele virus-bulk blir filtrert på filter-membraner som slutter med en validert steril membran (typisk 0,2 um).

Ultrafiltrering

Den sterilfiltrerte rå monovalente hele virus-bulk blir konsentrert på kassetter utstyrt med 1000 kDa MWCO BIOMAX™ membran minst 6 ganger. Det konsentrert retentat blir vasket med fosfatbufret saltvann minst 1,8 ganger.

Sukrose-gradient-sentrifugering

Influensavirus blir konsentrert ved isopyknisk sentrifugering i en lineær sukrose-gradient (0,55 % (vekt/volum)). Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet ved fire forskjellige fraksjoner (sukrose blir målt i et refraktometer):

<*>virus-stamme-avhengig: fraksjon 3 kan reduseres til 15% sukrose.

For videre vaksine-preparering blir enten bare fraksjoner 2 anvendt eller fraksjon 2 sammen med en ytterligere renset fraksjon 3 blir anvendt.

Fraksjon 3 blir vasket ved diafiltrering med fosfatbuffer for å redusere sukrose-innholdet til omtrent under 6%. Eventuelt kan dette trinnet utelates. Influensa-virus til stede i denne fortynnede fraksjon blir pelletert for å fjerne oppløselige forurensninger.

Pelleten blir resuspendert og grundig blandet for å oppnå en homogen suspensjon. Fraksjon 2 og den resuspenderte pellet fra fraksjon 3 blir samlet og fosfatbuffer blir tilsatt for å oppnå et volum på omtrent 40 liter. Dette produktet er det monovalente hele virus-konsentrat.

Sukrose-gradient-sentrifugering med natrium-deoksycholat

Det monovalente hele influensavirus-konsentrat blir påført på en ENI-Mark II ultrasentrifuge. K3-rotoren inneholder en lineær sukrose-gradient (0,55 % (vekt/volum)) hvor en natrium-deoksycholat-gradient i tillegg blir overlagt. Tween 80 er til stede under splitting i opptil 0,1 % (vekt/volum) og Tokoferylsuccinat blir tilsatt for B-stamme virus opptil 0,5 mM. Den maksimale natrium-deoksycholat-konsentrasjon er 0,7-1,5 % (vekt/volum) og er stamme-avhengig. Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet ved tre forskjellige fraksjoner (sukrosen blir målt i et refraktometer). Fraksjon 2 blir anvendt for videre prosessering. Sukrose-innhold for fraksjonsgrenser (47-18%) varierer i henhold til stammer og blir fastlagt etter evaluering:

Sterilfiltrering

Den splittede virusfraksjon blir filtrert på filtermembraner som slutter med en 0,2^im membran. Fosfatbuffer inneholdende 0,025 % (vekt/volum) Tween 80 og (for B-stammer) 0,5 mM Tokoferylsuccinat blir anvendt for fortynning. Det endelige volum av den filtrerte fraksjon 2 er 5 ganger det opprinnelige fraksjonsvolum.

Inaktivering

Det filtrerte monovalente materiale blir inkubert ved 22 ± 2°C i maksimalt 84 timer (avhengig av virus-stammene kan denne inkubering forkortes). Fosfatbuffer inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 blir deretter tilsatt for å redusere det totale proteininnhold til maks. 450 ug/ml. For B-stammer blir fosfatbufret saltvann inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 og 0,25 mM Tokoferylsuccinat anvendt for fortynning for å redusere det totale protein-innhold til 450Mg/m'- Formaldehyd blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på 100 ug/ml og inaktiveringen finner sted ved 20°C ± 2°C i minst 72 timer.

Ultrafiltrering

Det inaktiverte splittede virus-materiale blir konsentrert minst 2 ganger i en ultrafiltreringsenhet, utstyrt med celluloseacetat-membraner med 20 kDa MWCO. Materialet blir deretter vasket med fosfatbuffer inneholdende 0,025 %

(vekt/volum) Tween 80, fulgt av fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01 %

(vekt/volum) Tween. For B-stamme-virus blir fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01% (vekt/volum) Tween 80 og 0,1 mM Tokoferylsuccinat anvendt for vasking.

Endelig sterilfiltrering

Materialet etter ultrafiltreringen blir filtrert på filtermembraner som slutter med en 0,2 nm membran. Filtermembranene blir skyllet og materialet blir fortynnet hvis nødvendig for at proteinkonsentrasjonen ikke skal overstige 500 ug/ml med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01% (vekt/volum) Tween 80 og, spesifikt for B stammer, 0,1 mM Tokoferylsuccinat.

Lagring

Den monovalente endelige bulk blir lagret ved 2 - 8°C for maksimalt 18 måneder.

Stabilitet

Eksempel 5b - Fremstilling av influensavirus- antigenpreparat ved anvendelse av g- tokoferol- succinat som en stabiliserer for en tiomersal- fri vaksine

En foretrukket variasjon av metoden beskrevet i Eksempel 5a er som følger: Høstingen av de hele virus blir fulgt av utfellingstrinnet (ammoniumsulfat-utfelling). Dette blir fulgt av klaringstrinnet hvor væsken blir klaret ved sentrifugering med moderat hastighet (område 4000 -14000 g). Således er rekkefølgen av utfellings- og klarings-trinnet reversert sammenlignet med Eksempel 5a.

Sterilfiltrerings-, ultrafiltrerings- og ultrasentrifugerings- (sukrose-gradient-sentrifugering) trinn følger som for Eksempel 5a. Imidlertid er det ikke behov for reprosesseringstrinnet av fraksjonene som er et resultat av ultrasentrifugeringstrinnet.

Det resterende trinn ved fremgangsmåten er som beskrevet i Eksempel 5a.

Således er den oppsummerte prosess i dette eksemplet som følger:

Høsting

Utfelling (ammoniumsulfat)

Klaring

Sterilfiltrering

Ultrafiltrering

Ultrasentrifugering

Splitting (fortrinnsvis natrium-deoksycholat)

Sterilfiltrering

Inaktivering

Ultrafiltrering

Endelig sterilfiltrering

En annen foretrukket variasjon av Eksempel 5a involverer et prefiltreringstrinn før den første sterilfiltrering. Denne anvender en membran som ikke sterilfiltrerer, men som tillater fjerning av forurensninger, f.eks. albumin før sterilfiltrering. Dette kan resultere i et bedre utbytte. En egnet membran for prefiltrering er ca. 0,8 (im til ca. 1,8 (im, for eksempel 1,2 (im. Prefiltreringstrinnet kan anvendes i skjemaet i Eksempel 5a eller Eksempel 5b.

Eksempel 6 - Fremstilling av influensavaksine ved anvendelse av ct-tokoferol- succinat som en stabiliserer for en tiomersal- fri vaksine

Monovalent endelig bulk av tre stammer, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 og B/Yamanashi/166/98 ble produsert i henhold til metoden beskrevet i Eksempel 5.

Samling

Den passende mengde av monovalent endelig bulks ble samlet til en endelig HA-konsentrasjon på henholdsvis 30 ug/ml for A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17, og 36 ug/ml for B/Johannesburg/5/97. Tween 80 og Triton X-100 ble regulert til henholdsvis 580 ug/ml og 90 ug/ml. Det endelige volum ble regulert til 3 I med fosfatbufret saltvann. Den trivalente samling ble filtrert ved å slutte med 0,8 um celluloseacetat-membran for å oppnå den trivalente endelige bulk. Trivalent endelig bulk ble fylt i sprøyter med minst 0,5 ml i hver.

Eksempel 7 - Fremstilling av influensavirus- antigenpreparat ved anvendelse av natriumlaurvlsulfat som en stabilisator for en konserveringsmiddel- fri vaksine ( tiomersal- redusert vaksine)

Monovalent hele virus konsentrat av B/ Johannesburg/ 5/ 99 ble oppnådd som beskrevet i Eksempel 1.

Sukrose-gradient-sentrifugering med natrium-deoksycholat

Det monovalente hele influensa virus-konsentrat blir påført på en ENI-Mark II ultrasentrifuge. K3-rotoren inneholder en lineær sukrose-gradient (0,55 % (vekt/volum)) hvor en natrium-deoksycholat-gradient i tillegg er overlagt. Tween 80 er til stede under splitting i opptil 0,1 % (vekt/volum). Den maksimale natrium-deoksycholat-konsentrasjon er 0,7-1,5 % (vekt/volum) og er stamme-avhengig. Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet av tre forskjellige fraksjoner (sukrosen blir målt i et refraktometer). Fraksjon 2 blir anvendt for videre prosessering. Sukrose-innhold for fraksjon-grenser (47-18%) varierer i henhold til stammer og blir fastlagt etter evaluering:

Sterilfiltrering

En prøve av fraksjon 2 på 10 ml ble tatt for videre prosessering. Splitt-virusfraksjonen blir filtrert på filtermembraner som slutter med en 0,2 (im membran. Fosfatbuffer inneholdende 0,025 % (vekt/volum) Tween 80 og 0,5 mM natriumlaurylsulfat blir anvendt for fortynning. Det endelige volum av den filtrerte fraksjon 2 er 5 ganger det opprinnelige fraksjonsvolum.

Inaktivering

Det filtrerte monovalente materiale blir inkubert ved 22 ± 2°C i maksimalt 84 timer (avhengig av virus-stammene kan denne inkubering forkortes). Fosfatbufret saltvann inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 og 0,5 mM natriumlaurylsulfat blir deretter tilsatt for å redusere det totale protein-innhold til maks. 250 ug/ml. Formaldehyd blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på 50 (ig/ml og inaktiveringen finner sted ved 20°C ± 2°C i minst 72 timer.

Ultrafiltrering

Det inaktiverte splitt-virusmaterialet blir konsentrert minst 2 ganger i en ultrafiltreringsenhet, utstyrt med celluloseacetat-membraner med 20 kDa MWCO. Materialet blir deretter vasket med 4 volumer fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01 % (vekt/volum) Tween og 0,5 mM natriumlaurylsulfat.

Endelig sterilfiltrering

Materialet etter ultrafiltreringen blir filtrert på filtermembraner som slutter med en 0,2^m membran. Filtermembraner blir skyllet og materialet blir fortynnet hvis nødvendig for at proteinkonsentrasjonen ikke skal overstige 500 ug/ml med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01 % (vekt/volum) Tween 80 og 0,5 mM natriumlaurylsulfat.

Lagring

Den monovalente endelige bulk blir lagret ved 2 - 8°C.

Eksempel 8 - Fremstilling av influensavirus-antigenpreparat ved anvendelse av Plantacare eller Laureth-9 som stabilisator for en konserveringsmiddel-fri vaksine (tiomersal-redusert vaksine)

Monovalent hele virus- konsentrat av B/ Yamanashi/ 166/ 98 ble oppnådd som beskrevet i Eksempel 1.

Fragmentering

Det monovalente hele influensavirus-konsentrat blir fortynnet til en protein-konsentrasjon på 1000 ug/ml med fosfatbufret saltvann, pH 7,4. Enten Plantacare® 2000 UP eller Laureth-9 blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1 % (vekt/volum). Materialet blir forsiktig blandet i 30 min. Deretter blir materialet overlagt på en sukrose-pute 15% (vekt/vekt) i en bøtte. Ultrasentrifugering i en Beckman swingout-rotor SW 28 blir utført i 2 timer ved 25.000 rpm og 20°C.

Sterilfiltrering

En supernatant ble tatt for videre prosessering. Splitt-virus-fraksjonen blir filtrert på filtermembraner som ender med en 0,2 (im membran.

Inaktivering

Fosfatbufret saltvann blir tilsatt hvis nødvendig for å redusere det totale protein-innhold til maks. 500 ug/ml. Formaldehyd blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på 100 (ig/ml og inaktiveringen finner sted ved 20°C ± 2°C i minst 6 dager.

Ultrafiltrering

Tween 80 og Triton X 100 blir regulert i det inaktivert materiale til henholdsvis 0,15% og 0,02%. Det inaktiverte splittede virusmateriale blir konsentrert minst 2 ganger i en ultrafiltreringsenhet, utstyrt med celluloseacetat-membraner med 30 kDa MWCO. Materialet blir deretter vasket med 4 volumer fosfatbufret saltvann.

Endelig sterilfiltrering

Materialet etter ultrafiltreringen blir filtrert på filtermembraner som ender med en 0,2 (im membran. Filtermembranene blir skyllet og materialet blir fortynnet slik at proteinkonsentrasjonen ikke overstiger 500 ug/ml med fosfatbufret saltvann

Lagring

Den monovalente endelige bulk blir lagret ved 2 - 8°C.

Eksempel 9 - Klinisk testing av g- tokoferol- stabilisert influensavaksine ( redusert tiomersal) hos eldre via ID- og IM- administrering A Fremstilling av influensavirus- antigenpreparat

Monovalent splitt-vaksine ble fremstilt i henhold til den følgende prosedyre.

Fremstilling av virus-inoculum

På dagen for inokulering av embryonerte egg blir friskt inoculum fremstilt ved blanding av det virksomme podestoff med fosfatbufret saltvann inneholdende gentamycin-sulfat med 0,5 mg/ml og hydrokortison med 25 ug/ml (virus-stamme-avhengig). Virus-inoculum blir holdt ved 2-8°C.

Inokulering av embryonerte egg

Ni til elleve dager gamle embryonerte egg blir anvendt for virus-replikasjon. Skall blir dekontaminert. Eggene blir inokulert med 0,2 ml av virus inoculum. De inokulerte egg blir inkubert ved den passende temperatur (virus-stamme-avhengig) i 48 til 96 timer. Ved slutten av inkuberingsperioden blir embryoene drept ved avkjøling og eggene blir lagret i 12-60 timer ved 2-8°C.

Høsting

Allantoisk væske fra de avkjølte embryonerte egg blir høstet. Vanligvis blir 8 til 10 ml rå allantoisk væske oppsamlet pr. egg.

Konsentrasjon og rensning av hele virus fra allantoisk væske

1. Klaring

Den høstede allantoiske væske blir klaret ved sentrifugering med moderat hastighet (område: 4000 -14000 g).

2. Adsorpsjonstrinn

For å oppnå en CaHPCvgel i den klarede virussamling, blir 0,5 mol/l Na2HP04og 0,5 mol/l CaCI2-løsninger tilsatt for å nå en endelig konsentrasjon av CaHP04på 1,5 g til 3,5 g CaHPOVIiter avhengig av virus-stammen.

Etter sedimentering i minst 8 timer blir supernatanten fjernet og sedimentet inneholdende influensavirus blir resolubilisert ved tilsetning av 0,26 mol/l EDTA-Na2-løsning, avhengig av mengden av CaHPCvanvendt.

3. Filtrering

Det resuspenderte sediment blir filtrert på en 6 (im filtermembran.

4. Sukrose-gradient-sentrifugering

Influensavirus blir konsentrert ved isopyknisk sentrifugering i en lineær sukrose-gradient (0,55 % (vekt/volum)) inneholdende 100 ug/ml Tiomersal. Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet ved fire forskjellige fraksjoner (sukrosen blir målt i et refraktometer):

fraksjon 1 55-52% sukrose

fraksjon 2 omtrent 52-38% sukrose fraksjon 3 38-20% sukrose<*>

fraksjon 4 20- 0% sukrose

<*>virus-stamme-avhengig: fraksjon 3 kan reduseres til 15% sukrose.

For videre vaksine-preparering blir bare fraksjoner 2 og 3 anvendt.

Fraksjon 3 blir vasket ved diafiltrering med fosfatbuffer for å redusere sukrose-innholdet til omtrent under 6%. Influensavirus til stede i denne fortynnede fraksjon blir pelletert for å fjerne oppløselige forurensninger.

Pelleten blir resuspendert og grundig blandet for å oppnå en homogen suspensjon. Fraksjon 2 og den resuspenderte pellet fra fraksjon 3 blir samlet og fosfatbuffer blir tilsatt for å oppnå et volum på omtrent 40 liter, et volum som passer for 120.000 egg/batch. Dette produktet er det monovalente hele virus-konsentrat.

5. Sukrose-gradient-sentrifugering med natrium-deoksycholat

Det monovalente hele influensavirus-konsentrat blir påført på en ENI-Mark II ultrasentrifuge. K3-rotoren inneholder en lineær sukrose-gradient (0,55 % (vekt/volum)) hvor en natrium-deoksycholat-gradient i tillegg blir overlagt. Tween 80 er til stede under splitting i opptil 0,1% (vekt/volum) og Tokoferol-succinat blir tilsatt for B-stamme-virus i opptil 0,5 mM. Den maksimale natrium-deoksycholat-konsentrasjon er 0,7-1,5% (vekt/volum) og er stamme-avhengig. Strømningshastigheten er 8 -15 liter/time.

Ved slutten av sentrifugeringen blir innholdet av rotoren gjenvunnet ved tre forskjellige fraksjoner (sukrosen blir målt i et refraktometer). Fraksjon 2 blir anvendt for videre prosessering. Sukrose-innhold for fraksjongrenser (47-18%) varierer i henhold til stammer og blir fastlagt etter evaluering:

6. Sterilfiltrering

Den splittede virus-fraksjon blir filtrert på filtermembraner som ender med en 0,2 (im membran. Fosfatbuffer inneholdende 0,025 % (vekt/volum) Tween 80 og (for B-stamme virus) 0,5 mM Tokoferol-succinat blir anvendt for fortynning. Det endelige volum av den filtrerte fraksjon 2 er 5 ganger det opprinnelige fraksjonsvolum.

7. Inaktivering

Det filtrerte monovalente materiale blir inkubert ved 22 ± 2°C i maksimalt 84 timer (avhengig av virus-stammene kan denne inkubering forkortes). Fosfatbuffer inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 blir deretter tilsatt for å redusere det totale proteininnhold til maks. 250 (ig/ml. For B-stamme virus blir fosfatbufret saltvann inneholdende 0,025% (vekt/volum) Tween 80 og 0,25 mM Tokoferol-succinat anvendt for fortynning for å redusere det totale protein-innhold til 250 ug/ml. Formaldehyd blir tilsatt til en endelig konsentrasjon på 50 ug/ml og inaktiveringen finner sted ved 20°C ± 2°C i minst 72 timer.

8. Ultrafiltrering

Det inaktiverte splittede virusmateriale blir konsentrert minst 2 ganger i en ultrafiltreringsenhet, utstyrt med celluloseacetat-membraner med 20 kDa MWCO. Materialet blir deretter vasket med fosfatbuffer inneholdende 0,025 %

(vekt/volum) Tween 80 fulgt av fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01%

(vekt/volum) Tween. For B-stamme-virus blir fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01% (vekt/volum) Tween 80 og 0,1 mM Tokoferol-succinat anvendt for vasking.

9. Endelig sterilfiltrering

Materialet etter ultrafiltreringen blir filtrert på filtermembraner som ender med en 0,2 nm membran. Filtermembranene blir skyllet og materialet blir fortynnet hvis nødvendig slik at proteinkonsentrasjonen ikke overstiger 1000 ug/ml, men hemagglutinin-konsentrasjonen overstiger 180 ug/ml med fosfatbufret saltvann inneholdende 0,01% (vekt/volum) Tween 80 og (for B-stamme-virus) 0,1 mM Tokoferol-succinat.

10. Lagring

Den monovalente endelige bulk blir lagret ved 2 - 8°C i maksimalt 18 måneder.

B Fremstilling av influensavaksine

Monovalent endelig bulk av tre stammer, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 og B/Johannesburg/5/99 ble produsert i henhold til metoden beskrevet i del A ovenfor.

Samling

Den passende mengde av monovalent endelig bulk ble samlet til en endelig HA-konsentrasjon på 60 ug/ml for henholdsvis A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 og 68 ug/ml for B/Johannesburg/5/99. Tween 80, Triton X -100 og Tokoferol-succinat ble regulert til henholdsvis 1000 ug/ml, 110 ug/ml og 160 ug/ml. Det endelige volum ble regulert til 3 I med fosfatbufret saltvann. Den trivalente samling ble filtrert ved å slutte med 0,8 um celluloseacetat-membran for å oppnå trivalent endelig bulk. Trivalent endelig bulk ble fylt i sprøyter med minst 0,165 ml i hver.

Vaksine-administrering

Vaksinen ble levert i forhåndsfylte sprøyter og ble administrert intradermalt i deltoid-regionen. Den intradermale (ID) nål var som beskrevet i EP1092444, som har en hudpenetrerings-begrenser for å sikre riktig intradermal injeksjon. Siden dannelse av en blemme (papel) på injeksjonsstedet demonstrerer god kvalitet på ID-administrering, målte forskeren den nøyaktige størrelse av blemmen 30 minutter etter vaksinasjonen.

Én dose (100 ul) inneholdt de følgende komponenter:

B Vaksinen ovenfor ble sammenlignet med en standard trivalent splittet influensavaksine: Fluarix™. Fluarix-vaksinen ble levert i forhåndsfylte sprøyter og ble administrert intramuskulært i deltoid-muskelen. En nål med minst 2,5 cm /1 tomme i lengde (23 gauge) ble anvendt for å sikre riktig intramuskulær injeksjon.

Én dose (0,5 ml) inneholdt de følgende komponenter:

Resultater

Gjennomsnittlig alder for den totale gruppen på tidspunktet for vaksine-administrering var 70,4 + 6,2 år standard avvik (S.D.), kvinne /mann-forhold var 1,7:1.

Injeksjonssted-smerte, angitt av 10/65 (15,4%) vaksinerte, var det vanligste symptom etter IM-administrering av Fluarix™. I ID-gruppen ble smerte angitt av 3/65 (4,6%) vaksinerte. Denne forskjell var statistisk signifikant (p=0,038; Fisher nøyaktighetstest). Følgelig er ID-levering av et tiomersal-redusert produkt foretrukket.

Konklusjoner

Både ID- og IM-administrering av en tio-redusert influensa-vaksine i en eldre populasjon kan gi 100% serobeskyttelse.

En sammenlignbar respons på vaksinasjon når det gjelder geometriske gjennomsnittstitere, serobeskyttelsesgrader, serokonversjonsgrader og konversjonsfaktorer ble funnet hos IM- og ID-vaksinerte individer hvor ID-gruppen mottok 2,5 ganger mindre antigen.

Det var ingen tydelig forskjell i den totale forekomst av vaksine-relaterte solisiterte/usolisiterte systemiske symptomer i de to behandlingsgrupper.

Eksempel 10 - Intradermal levering av en tiomersal- redusert influensa-vaksine

Immunogenisitet av den tiomersal-reduserte splitt-influensavaksinen fremstilt som beskrevet i Eksempel 9 (bortsett fra at samlingen ble utført uavhengig og vaksinen ble ikke fylt i sprøyter) ble bedømt ved ID-levering til marsvin ved anvendelse av en standard nål.

Grupper på 5 dyr hver ble primet intranasalt med hele inaktiverte trivalente influensa-virus inneholdende 5 ug av hver HA i et totalt volum på 200 (il. 28 dager etter priming ble dyrene vaksinert enten via intradermal eller intramuskulær rute. Intradermale doser inneholdende 0,1, 0,3 eller 1,0 ug trivalent tiomersal-redusert split Flu i 0,1 ml ble administrert i ryggen til marsvinene ved anvendelse av en standard nål. En intramuskulær dose på 1,0 ug trivalent tiomersal-redusert splittet Flu ble administrert i bakleggen til marsvin i et volum på 0,1 ml. Gruppene var som følger: Gruppe 1 - 0,1 jxg trivalent tiomersal-redusert split Flu ID;

Gruppe 2 - 0,3 (ig trivalent tiomersal-redusert split Flu ID;

Gruppe 3 -1,0 (ig trivalent tiomersal-redusert split Flu ID

Gruppe 4 -1,0 fxg trivalent tiomersal-redusert split Flu IM

Fjorten dager etter vaksinasjonen ble blod tappet fra dyrene og antistoff-titerene fremkalt ved vaksinasjonen ble bedømt ved anvendelse av et standard hemagglutinasjons-hemningsforsøk (Hl). Resultatene er vist i Figur 1. Sterke Hl-responser på alle tre stammer ble fremkalt ved vaksinasjon. Ingen klar dose-respons ble registrert, hvilket indikerer at meget lave doser av tiomersal-redusert antigen fortsatt kan fremkalle meget kraftige Hl-antistoff-responser når administrert via ID-rute. Det var ingen betydelig forskjell mellom Hl-titere fremkalt ved ID- eller IM-vaksinasjon. Således bekreftet resultatene oppnådd i marsvin at de tiomersal-reduserte trivalente splitt-influensa-antigener fremkaller lignende nivåer av Hl-antistoffer i dyr når levert via ID-rute sammenlignet med IM-rute.

Eksempel 11 - Intradermal levering av en tiomersal- redusert, adjuvantert influensavaksine

Protokoll

Marsvin ble primet på dag 0 med 5 ug trivalente hele inaktiverte Flu-virus i 200 ul, intranasalt.

Vaksinasjon - dag 28 - Vaksine inneholdende 0,1 jxg HA pr. stamme trivalent split Flu fremstilt som beskrevet i Eksempel 9 (bortsett fra at samlingstrinnet resulterte i en endelig konsentrasjon av hvert antigen på 1,0 ug/ml, hvilket ga en dose av 0,1 (ig i 100 (il sammenlignet med 60 ug/ml i Eksempel 9). Det endelige trivalente preparat ble administrert intradermalt ved anvendelse av tuberkulin-sprøyter, enten adjuvantert eller ikke-adjuvantert, i 100 jd.

Blodtapping - dag 42.

Effekten av adjuvantering ble bedømt ved å måle antistoff-responser ved Hl-forsøk (dag 0, 28, 42).

Alle ID forsøk ble utført ved anvendelse av en standard nål.

Resultater

G1-G5 refererer til 5 grupper av marsvin, 5 pr. gruppe.

Bemerk at 3D-MPLin + QS21 angir et adjuvans-preparat som omfatter en unilamellær vesikkel omfattende kolesterol, som har et lipid bilag omfattende dioleoylfosfatidyl-cholin, hvor QS21 og 3D-MPL er forbundet med eller innleiret i, lipid-bilaget. Slike adjuvans-preparater er beskrevet i EP 0 822 831 B, idet beskrivelsen i denne er inntatt her ved referanse.

Hl-titere anti-A/New Caledonia/20/99

Hl-titere anti-A/Panama/2007/99 H l-titere anti-B/Johannesburg/5/99

Således er tiomerosal-redusert trivalent split Flu-antigen, hvorvidt adjuvantert eller ikke-adjuvantert, et kraftig immunogen og er i stand til å fremkalle sterke Hl-responser når administrert ved ID- eller IM-rute. Disse responser synes å være minst så kraftige som responsene fremkalt av standard Fluarix-preparatet.

Eksempel 12 - Sammenligning av tiomersal- inneholdende og tiomersal- fri vaksine levert intradermalt til griser.

For å bedømme immunogenisiteten av split Flu-vaksine (pluss og minus tiomerosal) administrert ved ID-ruten ble en primet grisemodell anvendt. Ettersom den store majoriteten av populasjonen har opplevet minst én infeksjon med influensa, må en influensavaksine være i stand til å booste en pre-eksisterende immunrespons. Derfor blir dyrene primet i en anstrengelse for best mulig å simulere den humane situasjon.

I dette forsøket ble 4 uker gamle griser primet intranasalt. Seks grupper på fem dyr hver ble primet som følger: Gruppe 1 - to priminger av trivalente hele inaktiverte virus (50 ug hver HA) på dag 0 og 14; Gruppe 2 - to priminger av trivalente hele inaktiverte virus (50 ug hver HA) på dag 0 og 14; Gruppe 3 - enkel priming med trivalente hele inaktiverte virus (50 ug hver HA) på dag 0; Gruppe 4 - to priminger av trivalente hele inaktiverte virus (25 ug hver HA) på dag 0 og 14; Gruppe 5 - enkel priming av trivalente hele inaktiverte virus (25 |xg hver HA) på dag 0; Gruppe 6 - to priminger av trivalente hele inaktiverte virus (12,5 jxg hver HA) på dag 0 og 14.

På dag 28 etter endelig priming ble dyrene vaksinert med 3 ug hver av HA trivalent splitt-antigen (stammer A/New Caledonia H1N1, A/Panama H3N2 og B/Johannesburg ) med 100 |xl via ID-rute. Gruppe 1 mottok standard Fluarix™ inneholdende tiomersal-konserveringsmiddel som vaksine-antigen. Alle andre grupper mottok det konserveringsmiddel-frie antigen.

Hl-resultater oppnådd i dette forsøket er vist i Figur 2 (Anti-influensa hemagglutinasjon hemningstitere fremkalt i griser primet med en rekke antigen-doser og vaksinert med 3 mikrogram trivalent influensa-antigen pluss eller minus Tiomersal via intradermal rute).

Relativt lave Hl-titere er fremkalt for B-stammen i dette forsøket og bakgrunnen mot A/H3N2-stammen er høy. En fordelaktig effekt når det gjelder respons på vaksinasjon er observert når primingsdosen blir redusert. I nesten alle tilfeller resulterte reduksjon i antigenkonsentrasjonen eller antall av primings-doser (fra de to priminger med 50^g) i en forhøyet respons på vaksinasjon. Mens responsen til dyrene i Grupper 1 og 2, som var primet to ganger med 50 ug, på vaksinasjonen ikke var så åpenbar, synes det som om konserveringsmiddel-fritt antigen (Gruppe 2) fungerer minst like godt som Fluarix™ (Gruppe 1) under disse betingelsene. En sterk respons på vaksinasjon med konserveringsmiddel-fritt trivalent influensa-antigen administrert ved ID-rute i de alternativt primede dyr (Grupper 3-6) er klar og denne responsen blir sett selv i B-stammen, selv om Hl-titere forblir lave.

Claims (19)

1. Inaktivert influensavirus-preparat omfattende et hemagglutinin-antigen (HA) stabilisert i fravær av tiomersal eller med lave nivåer av tiomersal på 5 ug/ml eller mindre, hvor hemagglutinin er detekterbar ved et SRD-forsøk, og hvor preparatet omfatter a-tokoferol-succinat i en tilstrekkelig mengde til å stabilisere HA.

2. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge krav 1 hvor a-tokoferol-succinat er til stede i en konsentrasjon mellom 1 ug/ml og 10 mg/ml.

3. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge krav 2 hvor a-tokoferol-succinat er til stede i en konsentrasjon mellom 10 og 500 ug/ml.

4. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 3 hvor influensavirus-antigenpreparatet er valgt fra gruppen bestående av splitt-virus-antigenpreparater, subenhet-antigener, kjemisk eller på annen måte inaktiverte hele virus.

5. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge krav 4 hvor influensa-antigenpreparatet er et splittvirus-antigenpreparat.

6. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5 omfattende både A- og B-stamme hemagglutinin.

7. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge krav 6 som er et trivalent influensavirus-preparat.

8. Inaktivert influensavirus-preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav, omfattende stabilisert B-stamme influensa HA.

9. Influensavaksine omfattende influensavirus-preparatet ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8.

10. Influensa vaksine ifølge krav 9 hvor konsentrasjonen av hemagglutinin-antigen for én eller hver stamme av influensa er 1-1000 |xg pr. ml, som målt ved et SRD-forsøk.

11. Influensavaksine ifølge krav 9 eller 10, som i tillegg omfatter et adjuvans.

12. Influensavaksine ifølge krav 11, hvor nevnte adjuvans er valgt fra gruppen bestående av: et ikke-toksisk derivat av lipid A, et saponin eller derivat derav, en kombinasjon av et ikke-toksisk derivat av lipid A og et saponin eller derivat derav, og en olje i vann emulsjon.

13. Influensavirus ifølge krav 12, hvor nevnte ikke-toksiske derivat av lipid A er 3D-MPL.

14. Influensavaksine ifølge krav 13, hvor 3D-MPL er i form av en emulsjon som har en liten partikkelstørrelse som er mindre enn 0,2 um i diameter.

15. Metode for fremstilling av et stabilt hemagglutinin-antigen hvilken metode omfatter rensning av antigenet i nærvær av a-tokoferol eller et derivat derav så som a-tokoferol-succinat.

16. Anvendelse av et inaktivert influensavirus-preparat for fremstilling av en vaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 9-14 for profylakse av influensainfeksjon eller sykdom i et individ.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvor vaksineleveringen er intradermal, intranasal, intramuskulær, oral eller subkutan.

18. Anvendelse av a-tokoferol-succinat som en heamaglutininstabilisator for fremstilling av en influensavaksine.

19. Influensavaksine som krevd i et hvilket som helst av kravene 9-14, for anvendelse i medisin.