CN104436157A - 流感疫苗和治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明总体披露了M1多肽，所述M1多肽可用作疫苗和/或抗原，用于产生抗M1多肽抗体，用于预防性治疗易受流感病毒感染的个体。本发明的抗M1多肽抗体可用于治疗感染了流感病毒的个体，或可用于预防性治疗易受流感病毒感染的个体，或用于不能产生有效抗体反应的免疫受抑制的个体。
Description
技术领域
本发明涉及M1多肽类，包含M1多肽类的疫苗，结合至M1多肽类的抗体，以及使用所述抗体的流感治疗。本发明的抗体和多肽类还可用于诊断。
背景技术
流感是由通过呼吸道飞沫传播而扩散的流感病毒引起的一种急性、呼吸道传染性疾病。无并发症的流感表征为突然发生的全身和呼吸道症状，所述症状通常在一周内消除。在某些人中，流感可能加重现有的身体状况并可能导致危及生命的并发症。流感病毒是世界上最普遍存在的一种病毒，影响人类、犬类、鸟类和家畜。流感还对老年人和非常小的孩子有重大影响。流感导致经济上的负担、发病甚至死亡，是值得注意的。
流感病毒是包膜、负义/负链RNA病毒，具有节段基因组属于正粘病毒科。它们根据其核心蛋白被分类为三种不同的类型：A、B和C(甲型、乙型、丙型)[CoxNJ,FukudaK.Influenza.Infect.Dis.Clin.NorthAm.1998;12:27-38]。甲型流感病毒可以感染一定范围的哺乳动物和鸟类，而乙型(宿主范围人类和海豹)和丙型基本上限于人类。甲型和乙型流感病毒对人类患病负主要责任，其中甲型是最致病的。甲型和乙型流感病毒的主要抗原决定簇是两种表面糖蛋白：神经氨酸酶（NA）和血凝素（HA），两者均能够诱发人类的免疫应答。HA参与受体结合和膜融合。NA促进子代病毒从受感染细胞的***、阻止病毒聚集、并辅助运动通过粘膜呼吸道上皮细胞。
目前已知三种类型的流感病毒（甲型、乙型和丙型），甲型病毒对动物和人类状况负责，而乙型和丙型病毒尤其对人类是致病的。甲型病毒根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）(病毒包膜的主要糖蛋白)的抗原结构被细分成亚型。显示出16种亚型的HA（H1-H16）和9种亚型的NA（N1-N9）。甲型病毒的亚型因而由存在于病毒包膜中的HA亚型和NA亚型来限定。野鸟构成所有甲型流感病毒亚型的储存宿主。甲型流感病毒的某些亚型地方性地或流行性地（年度流行疾病）感染家禽（不同的亚型包括H5N1和H9N2），马（主要是H3N8），猪（主要是H1N1，H3N2和H1N2）以及还有人类（主要是H1N1和H3N2）。狗、猫和其它野生物种也可能偶尔被某些亚型（对于狗是H3N8和H5N1；对于猫是H5N1）感染。
流行病两次暴发之间的流感疫苗目前主要由在受精鸡蛋中生长的病毒制备或者是灭活流感疫苗或活流感疫苗。灭活流感疫苗由三种可能形式的抗原制剂组成：全灭活病毒，亚病毒粒子，其中纯化的病毒粒子用洗涤剂或其它试剂破坏以使脂质包膜（所谓的“裂解”疫苗）或纯化的HA和NA（亚单元疫苗）溶解。这些灭活疫苗目前可以进行肌内给药（i.m.），皮下给药（s.c），或者鼻内给药（i.n.）。根据世界卫生组织（WHO）的建议，季节性流感疫苗通常包含45ug的来自三种同时流行的人菌株的HA抗原（通过单向放射免疫扩散（SRD）测量）（J.M.Wood等人：An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenzahaemagglutinin antigen:adaptation for potency determination of inactivated whole virusand subunit vaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247；J.M.Wood等人：Internationalcollaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques forthe assay of haemagglutinin antigen of influenza virus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330））。它们一般包含源自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感菌株（例如H1N1，H3N2和B）的抗原。标准的0.5ml可注射剂量在大多数情况包含（至少）15μg的来自各菌株的血凝素抗原成分。疫苗接种在控制年度流感流行中起关键性作用。此外，在大流行期间，抗病毒药可能不足以或不能有效覆盖需求，并且处于流感风险的个人数量要大于流行病两次暴发之间期间的人数。开发可能大量生产并具有有效分配和管理潜能的长效、广泛保护性的疫苗是本发明的一个目的。
流感病毒每年影响数百万人，在美国导致超过20万人住院和2万人死亡。此外，流感的致命菌株间或出现（例如，1918年的西班牙流感），几乎没有有效的治疗方式。季节性流感疫苗提供了某些保护，前提是致病株自疫苗配方时起没有发生变化。血凝素和神经氨酸酶的表面表达的病毒蛋白的高变异性要求每年重新配方。种群/人类每年应进行再免疫以便有效保护。这种必要性意味着生产成本高，并且可用性取决于对疫苗的每种病毒成分的滴定度（可达到四种不同的病毒构成目前的疫苗）。
目前已采用重组细胞培养方法而非鸡蛋来生产抗原并且两种疫苗产品最近已被FDA批准。Flucelvax是通过哺乳动物细胞培养制成的重组病毒制剂（3种灭活病毒）。是通过昆虫细胞培养制成的重组HA疫苗（3种不同的HA蛋白）。这些产品寻求解决疫苗供应的问题，但是没有解决与基于HA的疫苗相关的抗原性漂移问题。
本发明的一个目的是通过提供会年年保持效力的一种新的流感疫苗来克服每年流感疫苗开发的需要和成本。本发明的另一目的是提供会不受新的流感(病毒)菌株感染的流感疫苗。本发明的另一目的是提供一种流感治疗方法，以便治疗已受流感感染的个体或对个体进行预防性治疗。
本发明的一个目的是利用包括结合至M1多肽的抗体或抗体片段的组合物减轻受感染患者的流感病毒感染的严重程度，和/或缩短受流感病毒感染的患者的流感症状的持续时间。
发明内容
本发明涉及对应一部分的流感M1蛋白的多肽。这些多肽对应来自蛋白的C-末端区的M1序列。在一个实施例中，至少一部分的M1多肽序列已被发现对流感病毒是表面暴露的，并因而是免疫防护的目标。在一个实施例中，多肽跨氨基酸残基215-252。在一个实施例中，多肽跨氨基酸残基215-241。在另一个实施例中，M1多肽跨氨基酸残基220-236。在一个实施例中，M1多肽跨在残基215-252找到的M1多肽的7-37连续的氨基酸。在一个实施例中，M1多肽包括至少15-50个氨基酸。在一个实施例中，M1多肽包括7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，和/或50个氨基酸。在一个实施例中，M1多肽用于在易患流感的生物体中产生保护性/治疗性免疫应答。在一个实施例中，生物体是人、犬、或商业上有价值的家畜。在一个实施例中，M1多肽组合物能够引起下述中的至少一个：对所述M1多肽的体液免疫反应、T-细胞免疫反应例如CD4T-细胞免疫反应和B细胞记忆反应。
本发明还涉及针对本发明的M1多肽序列的抗体。在一个实施例中，抗M1多肽抗体用于治疗受流感病毒感染的生物体。在一个实施例中，生物体是人、犬、或商业上有价值的家畜。在一个实施例中，用抗M1多肽抗体治疗生物体减轻了流感症状的严重性和/或缩短了流感症状的持续时间。
在一个实施例中，抗M1多肽抗体用于治疗生物体以预防感染流感，或者改善未来可能感染流感。在一个实施例中，生物体是人、犬、或商业上有价值的家畜。在一个实施例中，抗M1多肽抗体预防性地用于在生物体中产生被动免疫。在一个实施例中，生物体是人、犬、或商业上有价值的家畜。
在一个实施例中，抗M1多肽抗体在生物体中具有1-4周的半衰期。在一个实施例中，抗M1多肽抗体在生物体中具有2周的半衰期。在一个实施例中，在生物体中产生的被动免疫持续2-3个半衰期。
在一个实施例中，抗M1多肽抗体被工程设计为具有4-12周的半衰期。在一个实施例中，抗M1多肽抗体是嵌合的、人化的、或人工程化的、或是完全的人型抗体。在一个实施例中，抗M1多肽抗体与增大生物体中半衰期的分子结合。在一个实施例中，抗M1多肽抗体与聚乙二醇结合。
附图说明
图1示出了被2B-B10-G9抑制的PR/8的蚀斑抑制试验。
图2示出了被2B-B10-G9抑制的其它流感菌株的蚀斑抑制试验。
具体实施方式
本发明通过示例的方式而非限制的方式进行发明。
定义
如本文所用，“抗体”是指蛋白，所述蛋白在功能上定义为结合蛋白质，而在结构上定义为包括被识别为源自免疫球蛋白编码基因的框架区的氨基酸序列。抗体可以包括一个或多个多肽，所述多肽基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。识别的免疫球蛋白基因包括κ（kappa）、λ（lambda）、α（alpha）、γ（gamma）、δ（delta）、ε（epsilon）和μ(mu)恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ（kappa）或λ（lambda）。重链被分类为γ（gamma）、μ(mu)、α（alpha）、δ（delta）、或ε（epsilon），依次定义免疫球蛋白类别，分别为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。
已知的通常免疫球蛋白（抗体）结构单元包括四聚物。每个四聚物由两对相同对的多肽链组成，每对具有一个“轻”链（约25kD）和一个“重”链（约50-70kD）。每个链的N-端定义主要负责抗原识别的约100-110或更多的氨基酸的可变区。术语可变轻链（VL）和可变重链（VH）分别是指这些轻链和重链。
抗体作为完整的免疫球蛋白或作为多个良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区内二硫键下面的抗体以产生F(ab)’2，Fab’的二聚物本身天然是通过二硫键链接至VH-CH1-铰链的轻链。F(ab)’2可以在温和的条件下被还原以断开铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’2二聚物转化成Fab’单体。Fab’单体基本上是具有铰链区的部分的Fab（见，Fundamental Immunology，W.E.Paul,ed.,RavenPress,N.Y.(1993）,更详细的描述其它抗体片段）。尽管不同的抗体片段根据完整抗体的消化来定义，本领域普通技术人员会理解可通过化学方法或者通过利用重组DNA方法从头合成片段。因此，术语抗体如本文所用还包括通过修饰整个抗体产生或利用重组DNA方法合成的抗体片段。优选的抗体包括VH-VL二聚物，包括单链抗体（作为单个多肽链存在的抗体），例如单链Fv抗体（sFv或scFv），其中可变重区和可变轻区连在一起（直接或通过肽链接）以形成连续的多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异源二聚体，可由包括直接连接或通过肽编码连接肽连接的VH-和VL-编码序列的核酸表达，（例如，Huston等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988）。尽管VH和VL被连接成各自为单个多肽链，VH和VL域非共价关联。可替换地，抗体可以是另一片段。还可以产生其它片段，包括使用重组技术。例如Fab分子可以展示在噬菌体上，如果链（重链或轻链）中的一个融合至g3衣壳蛋白，并且互补链输出至周质作为可溶分子。两个链可以在相同或不同的复制子上编码；每个Fab分子中的两个抗体链翻译后组装并且二聚物经由将链中的一个链接至g3p被结合入噬菌体颗粒（见，例如，美国专利号5,733,743）。scFv抗体和多个其它结构将自然聚集但化学上分开的轻多肽链和重多肽链从抗体V区转换成基本类似于抗原结合部位/位点的结构的折叠成三维结构的分子对于本领域技术人员来说是已知的（见，例如，美国专利号5,091,513，5,132,405，和4,956,778）。尤其优选的抗体包括所有那些在噬菌体上展示的或利用载体通过重组技术产生的抗体，其中链在载体上作为可溶性蛋白质分泌，例如scFv，Fv，Fab，(Fab’)2。抗体还可包括双链抗体和微型抗体。
本发明的抗体还包括重链二聚物，例如来自骆驼科动物的抗体。由于骆驼科动物中的重链二聚物IgG的VH区不必要与轻链发生疏水性相互作用，重链中通常接触轻链的区在骆驼科动物中被变成亲水性氨基酸残基。重链二聚物IgG的VH域被称为VHH域。
骆驼科动物中，抗体谱的多样性由VH或VHH区中的互补决定区（CDR）1，2和3确定。骆驼VHH区中的CDR3通过其平均16个氨基酸的相对较长长度表征（Muyldermans等人，1994，Protein Engineering7(9)：1129）。这与许多其它物种的抗体的CDR3区形成对照。例如，小鼠VH的CDR3平均为9个氨基酸。
骆驼科动物衍生的抗体可变区的库(保持骆驼科动物的可变区的体内多样性)可例如通过公开日为2005年2月17日的美国专利申请序列号20050037421所披露的方法制得。
如本文所用，术语“自然发生(naturallyoccurring)”表示组分被单个基因编码，所述基因没有被重组方式改变并且预先存在于生物体中，例如由初始细胞或暴露于抗原的细胞形成的抗体库中。
如本文所用，术语“抗原”是指在适当条件下能够引起特定免疫应答并与该应答的产物反应的物质，例如与特定抗体或特别致敏T-淋巴细胞或两者。抗原可以是可溶性物质，例如毒素和异种蛋白，或微粒，例如细菌和组织细胞；不过，只有已知为抗原决定簇（表位）的蛋白质或多糖分子的部分与抗体或淋巴细胞上的特定受体组合。更广泛来说，术语“抗原”可用于指抗体所结合的任何物质，或者抗体希望的任何物质，不管该物质是否产生免疫性。对于所述抗原，抗体可通过重组的方法识别，不依赖于任何免疫应答。
如本文所用，术语“表位”是指特定B细胞和/或T细胞应答的抗原或半抗原上的位点。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。表位包括能够形成与抗体的可变区结合口袋相互作用的结合作用的抗原或其它高分子的那部分。
如本文所用，术语抗体的“结合专一性”是指抗体所结合的抗原的身份，优选指抗体结合的表位的身份。
如本文所用，术语“嵌合多核苷酸”表示多核苷酸包括野生型区域和突变区域。它还可表示多核苷酸包括来自一个多核苷酸的野生型区域和来自另一相关多核苷酸的野生型区域。
如本文所用，术语“互补性决定区”或“CDR”是指本领域认可的术语，如由Kabat和Chothia示例。CDR还一般被称为高变区或高变环（Chothia和Lesk（1987）J Mol.Biol.196:901；Chothia等人（1989）Nature342:877；E.A.Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.)(1987)；和Tramontano等人（1990）JMol.Biol.215：175）。“框架区”或“FR”是指侧翼于CDR的V域的区。CDR和框架区的位置可利用本领域各种公知的定义来确定，例如Kabat,Chothia,international ImMunoGeneTics database(IMGT)，和AbM（见，例如，Johnson等人，supra；Chothia&Lesk，1987，Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917;Chothia C.等人，1989,Conformations of immunoglobulin hypervariable regions.Nature342,877-883;ChothiaC.等人，1992，structural repertoire of the human VH segmentsJ.Mol.Biol.227,799-817;Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol1997,273(4)）。抗原结合部位/位点的定义在下述文献也有描述：Ruiz等人，IMGT，the international ImMunoGeneTicsdatabase，Nucleic Acids Res.,28,219-221（2000）；和Lefranc，M.-P.IMGT，theinternational ImMunoGeneTics database，Nucleic Acids Res.,Jan1；29（1）：207-9（2001）；MacCallum等人，Antibody-antigen interactions：Contact analysis and bindingsite topography,J.Mol.Biol.,262(5),732-745(1996);和Martin等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272(1989);Martin等人，Methods Enzymol.,203,121-153，（1991）；Pedersen等人，Immunomethods，1,126，（1992）；和Rees等人，In SternbergM.J.E.（ed.），Protein Structure Prediction，Oxford University Press，Oxford，141-1721996）。
如本文所用，术语“半抗原”是小分子，当连接至较大载体例如蛋白质时，所述小分子可引起生物体内的免疫应答，例如产生特定与之结合的抗体（游离态或者结合态）。“半抗原”能够结合至预成抗体，但是可能自身不能刺激抗体生成。在本发明的上下文中，术语“半抗原”包括改性的氨基酸，自然发生或者非自然发生。因此，例如，术语“半抗原”包括自然发生的改性氨基酸，例如磷酸酪氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸丝氨酸，或硫酸化残基，例如硫酸化酪氨酸（硫化酪氨酸），硫酸化丝氨酸（硫化丝氨酸），或硫酸化苏氨酸（硫化苏氨酸）；并且还包括非自然发生的改性的氨基酸，例如p-硝基-苯丙氨酸。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其中可引入、表达和/或繁殖本发明的载体。微生物的宿主细胞是原核或真核微生物的细胞，包括细菌、酵母、微观真菌以及真菌和黏菌的生命周期中的微观相。通常的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。通常的真核宿主细胞是酵母或丝状真菌，或哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞，鼠科动物NIH3T3成纤维细胞，人胚胎肾193细胞，或啮齿动物骨髓瘤或杂交瘤细胞。
如本文所用，术语对组合物或疫苗的“免疫应答”是在宿主中形成对关注的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答/反应。通常，“免疫应答”包括但不限于一种或多种下述效应：产生抗体、B细胞、辅助性T细胞、和/或细胞毒性T(淋巴)细胞，特定指向包括在关注的组合物或疫苗中的抗原。优选地，宿主会展示治疗性或保护性免疫反应，使得对新感染的抵抗力会增强和/或疾病的临床严重程度会降低。所述保护将通过减少或缺少通常由受感染宿主展示的症状、更快的恢复时间和/或受感染宿主内降低的病毒滴度来展示。
如本文所用，术语“隔离的/分离的(isolated)”是指不仅从存在于核酸或多肽的自然源的其它核酸或多肽分离而且还从多肽并优选是指发现仅在溶剂、缓冲液、离子、或其它通常存在于上述的溶液中的组分中存在的（如果有的话）核酸或多肽分离的核酸或多肽。术语“隔离/分离的”和“纯化的”不包括以其自然来源存在的核酸或多肽。
如本文所用，术语“纯化的”表示所述核酸或多肽以基本上没有其它生物大分子例如多核苷酸、蛋白质等等而存在。在一个实施例中，多核苷酸或多肽被纯化，以便它构成至少按重量计95%，更优选至少按重量计99.8%的所述生物大分子存在（但可以存在水、缓冲液、和其它小分子尤其是分子量小于1000道尔顿的的分子）。
如本文所用，术语“重组核酸”是指在自然界通常不能找到的形式的核酸。也就是说，重组核酸侧翼是非天然侧翼于核酸的核苷酸序列或者该重组核酸具有的序列通常不能在自然界中找到。重组核酸可以最初通过用限制性核酸内切酶处理核酸在体外形成，或者可替换地使用例如聚合酶链反应的技术。应当理解，一旦重组核酸被制成并被再次引入宿主细胞或生物体，它会非重组地复制，即，利用宿主细胞的体内细胞机制而非体外处理；不过，所述核酸一旦重组产生，尽管随后非重组地复制，仍然被认为是为本发明的目的的重组体。
如本文所用，术语“重组多肽”是指由重组核酸表达的多肽，或者在体外化学合成的多肽。
如本文所用，术语“重组变异”是指利用重组DNA技术产生的通过氨基酸***、删除和置换不同于自然发生的多肽的任何多肽。可以通过比较具体多肽的序列与同源肽的序列并且使高同源性区中所做的氨基酸序列变更的数量最小化找到确定哪些氨基酸残基可以被置换、添加或删除而不破坏关注的活性例如酶活性或结合活性的引导。
优选地，氨基酸“置换”是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸置换一氨基酸的结果，即，保守氨基酸置换。氨基酸置换可根据所涉及残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、和/或两亲性的相似性进行。例如，非极性（疏水的）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯(基)丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、和谷氨酰胺；正电荷（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；以及负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
如本文所用，术语“组库（repertoire）”或“库(library)”是指编码抗体或抗体片段例如Fab、scFv、Fd、LC、VH、或VL，或由自然系综获得的可变区的亚片段（例如交换盒）的基因库，或者存在的抗体基因(例如在人类供体)的“组库”，并主要从外周血和脾脏的细胞获得。在一些实施例中，人类供体是“非免疫性的”，即，不存在感染的症状。在当前的发明中，库或组库通常包括V区的给定部分的交换盒的成员。
如本文所用，术语“合成抗体库”是指编码一个或多个抗体或抗体片段（例如Fab，scFv，Fd，LC，VH，或VL，或可变区的亚片段例如交换盒）的基因库，其中一个或多个互补决定区（CDR）已部分或全部被例如寡核苷酸定点诱变而改变。“随机化”表示编码CDR的序列的部分或全部已被随机编码所有二十个氨基酸或一些氨基酸子集的序列置换。
如本文所用，术语“多价”表示疫苗包含来自具有不同氨基酸序列的至少两种流感病毒分离(物)的M1多肽，或者疫苗包含来自一种流感病毒分离(物)的M1多肽和来自不同于M1多肽分离物的另一流感病毒分离物的抗原制剂。
如本文所用，术语“哺乳动物”是指温血脊椎动物，所有这些动物具有毛发并且哺乳自己的幼子。
如本文所用，术语“蛋白(质)”、“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，表示任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性或分支的，它可包括改性的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可被不同于氨基酸的化学组成部分中断。所述术语还涵盖已经自然或通过干预而得以改性的氨基酸聚合物，例如，二硫键形成、糖化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其它的处理或修饰(改性)，如与标记或生物活性成分相共轭。
如本文所用，术语“异源性”当用于指多核苷酸的部分时表示核酸包括两个或更多个子序列，所述子序列通常在自然界不能找到彼此相同的关系。例如，核酸通常重组产生，具有两个或更多个序列，例如由不相关的基因排列以形成新的功能性核酸。相似地，“异源性”多肽或蛋白质是指两个或更多个在自然界不能找到彼此相同关系的子序列。
单数术语“一(a)”，“一(an)”，和“所述(the)”包括多数对象，除非上下文明确另外指出。相似地，单词“或(or)”旨在包括“和(and)”，除非上下文明确另外指出。关于物质例如抗原的浓度或程度的给定的数值限制旨在表示近似值。因此，当浓度表示为至少（例如）200μg时，它旨在表示浓度应被理解为至少近似“大约”或“约”200μg。
M1多肽
本发明涉及在人体或人群中引起免疫应答尤其是初次免疫应答来抵抗流感病毒的一种方法，所述方法包括管理M1多肽组合物，所述M1多肽组合物包括本发明的M1多肽或其抗原制剂。在一个实施例中，免疫应答在初始的免疫妥协的、或先前受感染的人体或人群中获得。
M-蛋白质或基质蛋白M1是流感病毒的主要结构成分。M基因编码两种蛋白质，M1和M2。M1蛋白在所有甲型流感病毒的亚型中是高度保守的，其很大程度上是更为临床相关的流感亚型。我们的数据显示一部分的M1蛋白质被暴露，并考虑到其高序列保守性，表示通用亚单位疫苗免疫原的极佳目标，前提是可以引起针对表面暴露区的适当的免疫应答。
在一个实施例中，目标M1多肽跨M1蛋白质的C-末端的氨基酸残基，尤其是M1蛋白质的氨基酸残基215-252，或215-240，或220-236。在一个实施例中，M1多肽是GTHPSSSAGLKNDLLEN,AMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK，或是由来自该序列的7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37和/或38个氨基酸的连续氨基酸构成的多肽。在一个实施例中，本发明的M1多肽包括自然发生的菌株变体，例如，A/Bangkok/163/2000(GTHPSSSTGLKNDLLEN)；A/PR/8/34(GTHPSSSAGLKNDLLEN)；A/AA/Huston/1945(GTHPSSSAGLKDDLLEN)；A/Berlin/6/2006(GTHPSSSTGLKNDLLDN)；A/Brandenburg/1/2006(GTHPNSSTGLKNDLLEN)；A/BrevigMission/1/1918(GTHPSSSAGLKDDLIEN)；A/Chile/8885/2001(GTHPSSSTGLKDDLLEN)；A/DaNang/DN311/2008(GTHPSSSTGLRDDLLEN)；A/FLW/1951(GTRPSSSAGLKDDLLEN)；A/FW/1/1950(GTHPRSSAGLKDDLLEN)；A/Fiji/15899/83(GTHPSSSAGLKNDLFEN)；A/FortMonmouth/1-MA/1947(GTHPSSSAGLKDNLLEN)；A/HaNoi/TX233/2008(GTHPSSSTGLKSDLLEN)；A/Iowa/CEID23/2005(GTHPNSSTGLKDDLLEN)；A/Malaysia/35164/2006(GTHPSSSTGLKKDLLDN)；A/Managua/4086.04/2008(GTHPSSSNGLKNDLLEN)；A/Texas/VR06-0502/2007(GTHPSSSTGLRNDLLEN)；A/WSN/1933(GTHPSSSAGLKSDLLEN)；A/Colorado/18/2011(GTHPSSSAGLRDDLLEN)；A/Kentucky/04/2010(GTHPNSSAGLKDDLLEN)；A/Maryland/28/2009(GTHPSSSAGLKDDLLGN)；A/New Mexico/05/2012(GTHPSSSSGLRNDLLEN)；A/Phillipines/TMC10-135/2010(GTHPSSSAGLRDDLLDN)；A/Singapore/GP4307/2010(GTHPSSSAGLKDDLLDN)；A/Singapore/GP489/2010(GTHPSSSAGLKDALLEN)；A/Boston/14/2007(GTHPSSSTGLRDDLLEK)；A/Brisbane/09/2006(GTHPSSSTGLRDNLLEN)；A/Hong Kong/CUH34175/2002(GTHPSSSNGLRDDLLEN)；A/Kyrgyzstan/WRAIR1256P/2008(GTHPSSSTGLRDDLLGN)；A/Malaysia/12550/1997(GTHPSSSTGLRDDLLDN)；A/Nanjing/1663/2010(GTHPSSSTGLRGDLLEN)；A/Wyoming/08/2010(GTHPSSSTGLRDDLLIN)；A/Berkeley/1/1968(GTPPSSSAGLKNDLLEN)；A/Korea/426/1968(GTPPSSSAGLKDDLLEN)。
在一个实施例中，本发明的M1多肽包括来自220-238,GTHPSSSAGLKNDLLENLQ的序列，或具有下述置换的一个或多个的变体：在222处的H变成R或N，在224处的S变成R或N，在227处的A变成T或N，在230处的K变成R，在231处的N变成D,S,或K，在232处的D变成N或G，在234处的L变成F或I，在235处的E变成D,H,或K，在236处的N变成H或K。
在一个实施例中，本发明的M1多肽涵盖下述序列变体：
220 238
GTXPXSSXGLXXXLXXXLQ
其中X=任何氨基酸。
本发明的M1多肽能够预防流感。也就是说，它们能够刺激动物中的免疫应答。抗原可包括单独或与载体共轭(结合)或存在于支架的M1多肽；包含具有免疫原性的***的重组载体；表位、半抗原、或者它们的任何组合。
本发明的M1多肽涵盖M1多肽的免疫原性片段和变体。因此，术语“免疫原性或抗原性的多肽”还考虑到对序列的删除、添加和置换，只要多肽起到产生本文所定义的免疫应答的作用。术语“保守变化”表示用另一生物学上相似的残基置换氨基酸残基，或者置换核酸序列中的核苷酸以便编码的氨基酸残基不改变或者是另一结构上、化学上或其它方面功能上相似的残基。在这点上，尤其优选的置换一般会是性质上保守的，即，在氨基酸族内发生的那些置换。例如，氨基酸一般被分为四个族：（1）酸性-天冬氨酸和谷氨酸；（2）碱性-赖氨酸，精氨酸，组氨酸；（3）非极性-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和（4）不带电荷的极性-甘氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变体的示例包括用一个疏水残基，例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水残基，或者用一个极性残基置换另一个极性残基，例如用精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸，或者谷氨酰胺置换天冬酰胺，等等；或者用结构上相关的不会对生物活性具有大影响的氨基酸类似保守的置换氨基酸。因此，具有与参照分子基本上相同的氨基酸序列但具有基本不影响蛋白质的免疫原性的较小的氨基酸置换的蛋白质在参照多肽的定义之内。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在此。术语“保守变化”还包括使用置换的氨基酸代替未置换的母氨基酸，假如对置换的多肽引起的抗体同样与未置换的多肽进行免疫反应。
“变体”M1多肽旨在表示基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包括在天然多核苷酸内的一个或多个位点/部位删除和/或添加一个或多个核苷酸和/或在天然多核苷酸的一个或多个位点/部位置换一个或多个核苷酸。如本文所用，“天然/自然(native)”多核苷酸或多肽分别包括自然形成的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的具体多核苷酸的变体（即参照多核苷酸）还可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的序列一致性的百分比来进行评价。“变体”蛋白质旨在表示通过在天然蛋白质的一个或多个位点/部位删除或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点/部位置换一个或多个氨基酸而由天然蛋白质获得的蛋白质。本发明涵盖的变体蛋白质是生物活性的，也就是说，它们具有引起免疫应答的能力。
来自其它流感菌株和亚型的M1多肽的同系物旨在包含在本发明的范围内。如本文所用，术语“同系物”包括类似物和横向(旁系)同源物。术语“类似物”指的是具有相同或相似功能但在不相关的宿主生物体内单独演化的两种多核苷酸或多肽。术语“横向(旁系)同源物”指的是通过在基因组内复制而相关的两种多核苷酸或多肽。横向(旁系)同源物通常具有不同的功能，但是这些功能可能相关。野生型流感多肽的类似物和横向(旁系)同源物可通过转译后修饰、氨基酸序列差异或两者不同于野生型流感多肽。具体的说，本发明的同系物一般表现为与野生型流感多肽或多核苷酸序列至少80%-85%，85%-90%，90%-95%，或95%，96%，97%，98%，99%的序列一致性，并且会表现相似的功能。变体包括等位基因变异体。术语“等位基因变异体”指的是包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列中的变化并存在于天然群体内（例如病毒种类或变种）。所述天然等位基因变异可通常导致多核苷酸或多肽中的1%-5%的变化。等位基因变异体可通过排序多个不同种类中的关注的核酸序列来识别，这可通过利用杂交探针以识别在这些种类中的相同基因位点来容易地进行。任何和所有所述核酸变化和所得到的氨基酸多态性或变化旨在包含在本发明的范围内，所述多态性或变化为天然等位基因变异的结果并且不改变关注基因的功能活性。
如本文所用，术语“衍生物”或“变体”指的是M1多肽或编码M1多肽的核酸，其具有一个或多个保守氨基酸变化或其它微小修饰，使得（1）当与野生型多肽比较时相应的多肽具有基本上等同的功能，或者（2）针对多肽引起的抗体与野生型多肽进行免疫反应。这些变体或衍生物包括具有流感多肽一级氨基酸序列的微小修饰/改性的多肽，可导致与未修饰/改性的对应多肽相比具有基本上等同的活性的肽。所述修饰/改性可以是故意的，例如通过定点诱变，或者可以是自发的。术语“变体”还考虑到对该序列的删除、添加和置换，只要多肽起到产生如本文所定义的免疫应答的作用。术语“变体”还包括多肽的修饰/改性，其中天然信号肽被置换为异源信号肽，以促进自宿主种的多肽的表达或分泌。术语“变体”还可包括“模拟表位(mimitopes)”，其是完全不同的蛋白质序列但结构相似，也引起交叉免疫反应。
本发明的M1多肽还可包括氨基酸序列，用于引入糖基化位点或其它位点以便修饰/改性或衍生M1多肽。在一个实施例中，上述本发明的M1多肽可包括氨基酸序列N-X-S或N-X-T，可充当糖基化位点。在糖基化过程中，低聚糖链连接至在三肽序列N-X-S或N-X-T中出现的天冬酰胺酸（N），其中X可以是除Pro（脯氨酸）外的任何氨基酸。该序列被称为糖基化序列子。该糖基化位点可以位于N-端，C-端，或者在用于M1多肽的M1蛋白质序列的内部序列内。
本发明的任何M1多肽还可用于半抗原共轭物/结合物中。所述共轭物/结合物可以使用合适的载体多肽和/或支架多肽以便向生物体免疫***呈现M1多肽表位。例如，M1-多肽可被***单克隆抗体的CDR3或完全置换CDR3。在这种情况，最大的佐剂效应会通过使用与免疫主体不同物种/种类的单克隆抗体支架获得。这些M1-多肽半抗原可以增加或形成对M1多肽的免疫应答。合适的载体分子在本领域是公知的并且包括，例如，KLH，卵白蛋白，霍乱毒素，白喉毒素和破伤风毒素。
用于制备和纯化DNA构建体的分子生物学的标准技术能够制备用本发明的M1多肽的半抗原共轭物/结合物。这些分子生物学技术可用于制得编码半抗原共轭物/结合物的基因构建体，并且制得表达构建体以便在合适的宿主细胞中制造半抗原。可替换地，本发明的半抗原可利用标准多肽技术将本发明的M1多肽与载体或支架多肽共轭/结合来制得。尽管分子生物学的标准技术因而足以用于生产本发明的半抗原，但所披露的特定半抗原提供了新型的治疗。
在本发明的一个方面，提供了单价或多价例如二价、三价或四价组合物，所述组合物包括M1多肽并且还可包括灭活流感病毒或减毒流感病毒或其抗原制剂，用于降低由流感病毒株引起的流感感染的严重性或预防由流感病毒株引起的流感感染，所述流感病毒株是存在于所述一级(主要)免疫原组合物中的菌株的抗原变体。在本发明的一个实施例中，多价组合物的灭活或减毒流感病毒用于血清B型流感。
免疫应答和功效
在一个实施例中，本发明的M1多肽疫苗能够就中和抗流感的抗体引起体液反应，如通过中和抗体滴度和血清转换率（SCR）以便中和抗体应答的几何平均滴度（GMT）（定义为疫苗的百分比，在第0天没有可检测到的抗体，而疫苗接种后在中和抗体滴度增加至滴度1:28或者具有4-倍或更大的增加）来测量。
在另一具体实施例中，所述接种疫苗还或另外产生针对流感的CD4T细胞免疫应答和/或B细胞记忆应答。在一个特定的实施例中，病人是血清反应阴性的或对疫苗株是无免疫的（即，不具有预先存在的免疫性）。在一个实施例中，施行所述M1多肽组合物可替换地或额外地引起B-记忆细胞反应，如通过在遇到抗原后能够分化成分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞的频率来测量。
本发明的流感药剂/药物恰当地满足疫苗的某些国际标准。国际上适用标准来测量流感疫苗的功效。根据欧洲药物检验局(European Agency for theEvaluation of Medicinal Products)对人用药的标准来评价血清学变量（CHMP/BWP/214/96，Committee for Proprietary Medicinal Products（CPMP）。Notefor harmonization of requirements for influenza vaccines,1997.(注意对流感疫苗的要求的协调，1997。)CHMP/BWP/214/96circularN°96-0666:1-22），以便进行与流感疫苗的年度许可程序相关的临床试验（表1A）。对于成年人人群（18-60岁）和老年人群（>60岁）的要求是不同的（表1A）。对于流行病两次暴发之间的流感疫苗，针对包括在疫苗内的所有流感株，至少一个评价（血清转化因子，血清转化率，血清保护率）应满足欧洲要求。等于或大于1:40滴度的比例被认为最相关，因为这些滴度预期是最佳当前可得到的相关保护[Beyer W等人，1998.Clin DrugInvest，；15:1-12]。
由欧洲健康管理当局定义的70%血清保护率（CHMP--Committee forMedicinal Products for Human Use,人用药品委员会）是年度季节性流感疫苗通常要求满足的三个标准之一并且CHMP也希望大流行候选疫苗要满足。
不过，数学模型表明在群体水平，仅30%对抗原飘移的一种或多种异株有效的疫苗也可能在帮助降低大流行的程度上是有益的，并且使用对大流行株具有30%功效（30%的交叉保护）的（先前大流行的）疫苗的大流行疫苗接种活动可有效降低临床发病率达75%并因此在群体中降低发病率/死亡率。因此，本发明的加速的初次免疫是用于实现流感流行的早期缓解或在源头抑制出现流感株。
FDA已经发布了对支持流行性流感疫苗的许可证所需的临床数据的指南草案（CBER草案标准）（可从the Office of Communication,Training andManufacturers Assistance（HFM-40），1401Rockville Pike，Suite200N，Rockville，Md.20852-1448获得，或者通过拨打电话1-800-835-4709或301-827-1800获得，或者从网页http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm获得），并且所提议的标准也是基于CHMP标准。FDA使用了稍微不同的年龄分界点。适当的端点类似地包括：1）获得HI抗体滴度1:40的主体的百分比，和2）血清转化率，定义为接种疫苗后HI抗体滴度四倍的上升。几何平均滴度（GMT）应该被包括在结果中，但是数据应该不仅包括点估计，还要包括血清转化发生率的95%置信区间的下界，并且第42天1:40的HI滴度的发生率必须满足或超过目标值。因此应提供这些数据和这些评估的点估计的95%置信区间（CI）。FDA指南草案要求两个目标都要满足。
因此，在本发明的一个方面，提供了本发明所要求保护的组合物、方法或用途，其中通过施行M1多肽组合物引起的免疫应答或保护满足流感疫苗功效的所有三个EU监管标准。下述标准的适当的至少一个、适当的两个或者三个满足于组合物的流感菌株：[0119]在血清阴性人群中血清转化率为>30%，>40%，>50%；[0120]在血清阴性人群中血清保护率为>60%，>70%，>80%；[0121]在血清阴性人群中血清转化因子为>2.0，>2.5，>3.0，>4.0。
流感病毒
甲型流感病毒连续地演化，结果发生抗原变异（Johnson NP,Mueller J.Updating the accounts：global mortality of the1918-1920“Spanish”influenza pandemic.Bull.Hist.Med.2006;76:105-115）。在流行病两次暴发之间的期间，传播的流感病毒与以前流行的那些病毒相关。病毒在人群中传播，与早期生活的感染具有不同程度的免疫性。所述传播在通常2-3年的时间段并缺乏病毒RNA聚合酶的有效校对，导致高转录错误率，可导致表面糖蛋白的氨基酸替换，并且促进选择新菌株，所述新菌株已经足够改变来引起普通人群中的再次流行；该过程被称为‘抗原(性)漂移’。
分段的病毒基因组允许第二种类型的抗原变异。在不可预知的间隔中，如果两种或更多种流感病毒同时感染宿主细胞，基因重配会导致新型流感病毒。这里，所得到的抗原可与先前在人群中传播的菌株的相应蛋白质有20%-50%的变化。该现象(称作“抗原转变(antigenic shift)”)可能产生具有新表面或内部蛋白质的新型病毒，其逃脱‘群体免疫’并形成流感大流行。
这些抗原变化(‘漂移’和‘转变’)是不可预知的并且从免疫学角度可具有巨大影响，因为它们最终导致出现新的流感菌株并且使得病毒能够逃脱免疫***引起公知的几乎每年的流行病。
除了每年的流行病，新出现的能够有效人对人传播的流感病毒在过去已经引起了疾病大流行，即，突然的全球性的流行疾病在所有年龄组具有较高的传染性和死亡率。上世纪已经见证了三次流感大暴发流行，1918-1919年的“西班牙流感(Spanish Flu)”，全球死亡2000万至5000万人，1957年的“亚洲流感(Asian Flu)”和1968年的“香港流感(Hong Kong Flu)”。
流感大流行的流感病毒株的特征是：与当前传播株中的血凝素相比它包含新的血凝素，可能伴随有或不伴随有神经氨酸酶亚型的变化；它能够在人群中横向传播；并且它对人类是致病的。新的血凝素可以是在较长的一段时间在人群中不明显的血凝素，可能至少十年，例如H2上一次传播是在1957年，或者它可以是之前从未在人群中传播的血凝素，例如H5，H9，H7或H6，它们通常在鸟类中发现。在这些情况下，大比例（例如H2的情况）或整个（H5，H7，H6或H9的情况）群体对流感大流行的流感病毒株是无免疫的。目前，被WHO认定为可能在人类引起流感流行的甲型流感病毒是高致病性H5N1禽流感病毒。因此，根据本发明所用的流感流行疫苗会适当地包括H5N1病毒。其它包括在所要求保护的组合物中的合适的菌株是H9N2，H7N1，H7N7或H2N2。
本发明的M1多肽不易受所述抗原变异的影响，因为（1）编码本发明M1多肽的选定的区域流感病毒基因组还编码M2蛋白质的一部分；和（2）流感的M1和M2蛋白质是主要嵌入在病毒颗粒中的结构蛋白。由于这两个理由，M1蛋白在流感株中具有较少的序列变异，并且有可能具有较小的能力来支持在表面暴露的抗原例如血凝素中看到的快速的抗原(性)漂移。
DNA疫苗
本发明的M1多肽还可作为DNA疫苗引入生物体。本发明的DNA疫苗会编码本发明的M1多肽。这些编码的M1多肽可能存在于具有载体多肽的编码的融合蛋白或融合入支架多肽。
用于制备和纯化DNA构建体的分子生物学的标准技术能够制备本发明的DNA治疗剂。尽管分子生物学的标准技术足以生产本发明的产品，本文所披露的特定构建体提供了新型治疗剂。
待被引向疫苗受体的可表达DNA的量取决于用于DNA构建体的转录和翻译启动子的强度，以及表达的基因产品的免疫原性。一般，约1μg-1mg的免疫或预防性有效剂量（并优选为大约10μg-300μg）被直接施加入肌肉组织。还可以考虑皮下注射，皮内引入，通过皮肤压印，以及其它施加(给药)模式，例如腹膜内，静脉，或吸入给药。还可以考虑提供加强疫苗接种。
DNA可以是裸露的，也就是说，不与任何蛋白质、佐剂或影响受体的免疫***的其它制剂相关联。在这种情况，希望DNA在生理学上可接受的溶液，例如但不限于无菌盐水或无菌缓冲盐水。可替代地，DNA可与脂质体类相关联，例如卵磷脂脂质体或其它本领域已知的脂质体，为DNA-脂质体混合物，（例如参见WO93/24640）或者DNA可与本领域已知的佐剂相关联以促进免疫应答，例如蛋白质或其它载体。还可使用帮助细胞摄取DNA的制剂，例如但不限于，钙离子、病毒蛋白质和其它转染促进剂，以使优点突出。这些制剂一般称为转染促进剂和药学上可接受的载体。如本文所用，术语基因指的是编码离散的多肽的核酸的片段。术语药物和疫苗可以互换使用，以表示可用于引起免疫应答的组合物。术语构建体和质粒/质体可以互换地使用。术语载体用于表示DNA，其中根据本发明的方法基因可被克隆入DNA以供使用。
DNA疫苗配方包括脱金属化的溶液，该溶液包含生理学上可接受的缓冲液(pH范围从至少大于约8.0至约至少9.5)，可达到约300mM的范围的盐（包括但不限于NaCl，KCl或LiCl），和金属离子螯合剂EDTA（可达到约5mM的范围）与自由基清除剂乙醇（可达到约3%的范围）组合，以及无菌玻璃瓶中最恰当的DNA浓度，包装以保护高度纯化的无核酸酶的DNA不受光照并在生理学上可接受的缓冲液中。在本发明的一个特定方面，DNA疫苗配方包括EDTA和乙醇的组合，NaCl的浓度在从约100mM至约200mM，EDTA的范围从约1μM至约1mM，乙醇存在的量可达到大约2%，所有都在无菌玻璃瓶中最恰当的DNA浓度，包装以保护高度纯化的无核酸酶的DNA不受光照并在生理学上可接受的缓冲液中。
本发明的DNA疫苗包括由于遗传密码而简并的序列，例如，用于特定宿主的优化密码子。如本文所用，“优化”指的是遗传工程以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码流感病毒多肽的优化的多核苷酸，流感蛋白基因的DNA序列可以被修饰/改性以1）包括被具体物种中高度表达的基因优选的密码子；2）包括在所述物种中实质发现的核苷酸碱基组合物中的A+T或G+C含量；3）形成所述物种的初始序列；或者4）消除引起RNA的脱稳定化、不适当的多聚腺苷酸化、降解和终止，或者形成二级发夹结构或者RNA剪接位点。流感病毒蛋白在所述物种的增加的表达可以通过利用在真核细胞和原核细胞中的密码子使用的分布频率或者在具体物种中获得。术语“优选的密码子使用的频率”指的是在使用核苷酸密码子中由特定宿主细胞表现的优选(偏好)以指定给定的氨基酸。有20种天然氨基酸，大部分被一种以上的密码子规定。因此，所有简并核苷酸序列被包括在本发明中，只要由核苷酸序列编码的流感多肽的氨基酸序列在功能上不改变。
杂交反应可以在不同的“严谨”条件下进行。增加杂交反应严谨性的条件是公知的。请见，例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版（Sambrook等人，1989）。
制成和实施本发明的DNA疫苗的其它细节可在美国专利号7,927,870中找到，该专利文献在此被援引入本文。
疫苗制备
制备M1多肽在本领域是公知的。希望纯度和足够浓度以诱导免疫应答的M1多肽与生理学上可接受的载体混合。生理学上可接受的载体在疫苗所用的剂量和浓度下对受体是无毒的。一般，疫苗被制成用于注射，通常为肌肉注射或皮下注射。用于注射的合适的载体包括无菌水，但优选是生理盐水溶液，例如生理盐水或缓冲盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水或者林格乳酸盐。疫苗一般包含佐剂。可用的佐剂包括QS21（皂皮树，商用可从Cambridge Biotech，Worcester，Mass.获得），其刺激细胞毒T-细胞，和明矾（氢氧化铝佐剂）。还可使用能增强细胞或局部免疫的不同佐剂的配方。尤其是，免疫增强剂例如细胞因子类可被包括在疫苗中。合适的免疫增强细胞因子的示例包括白细胞介素，例如白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-12（IL-12），以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。
可存在于疫苗的其它赋形剂包括低分子量多肽（小于约10个残基），蛋白质，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖或葡聚糖，螯合剂例如EDTA，以及稳定蛋白质或抑制微生物生长的其它赋形剂。
本发明的疫苗还可包含特定设计以表达诱导细胞毒T-细胞反应的蛋白质的一种或多种工程病毒。合适的工程病毒源自例如金丝雀痘病毒，牛痘病毒，腺病毒，减毒的人类疱疹病毒（例如，单纯疱疹病毒），和水痘带状疱疹。示例性工程病毒被修饰/改性以表达能够诱导细胞毒T-细胞反应的M1多肽。通过实施一个或多个剂量的M1多肽序列以促进免疫应答可跟随M1多肽疫苗的免疫。
在一个实施例中，根据本发明的以供使用的初级组合物被佐剂化。在一个特定实施例中，佐剂是水包油乳液佐剂或佐剂体系。在一个实施例中，水包油乳液包括可代谢油和乳化剂，以及可选的甾醇和/或母育酚例如α-生育酚。在另一个特定实施例中，所述水包油乳液佐剂包括至少一种可代谢油，量为总容量的0.5%-20%，并具有油滴，其中按强度至少70%具有小于1μm的直径。
术语可代谢油的含义在本领域中是公知的。可代谢可被定义为‘能够通过代谢转化’（Dorland’s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，25thedition（1974））。油可以是任何植物油、鱼油，动物油或合成油，对受体无毒并且能够通过代谢转化。坚果、种子、和谷物是植物油的通常来源。合成油也是本发明的一部分，可包括市场上可得的油，例如NEOBEETM和其它油。尤其合适的代谢油是角鲨烯。角鲨烯（2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四己烯)是不饱和油，在鲨鱼肝油中大量发现，在橄榄油、麦胚芽油、米糠油、和酵母中量较低，并是一种尤其适合本发明使用的油。由于角鲨烯在胆固醇的生物合成的过程中被酶转化的事实，角鲨烯是可代谢油（Merck index，10th Edition，entry no.8619）。在一个实施例中，可代谢油存在的量为免疫原性组合物的总量的0.5%-20%（最终浓度），合适的量是总量的1.0%-10%，合适的量是总量的2.0%-6.0%。在一个特定实施例中，可代谢油存在的量是免疫原性组合物的总量的约0.25%-1.25%（v/v）。
合适的，本发明的水包油乳液体系具有在亚微米范围的小油滴粒径。合适的，油滴粒径在直径为120-750nm的范围内，合适的尺寸在直径为120-600nm。通常，水包油乳液包含的油滴按强度至少70%为直径小于500nm，尤其按强度至少80%直径小于300nm，合适地按强度至少90%直径在120-200nm的范围内。
本发明的水包油乳液还可包括甾醇和/或母生育酚例如生育酚，尤其是α-生育酚。甾醇在本领域是公知的，例如胆固醇是公知的并且例如披露于Merck Index,11th Edn.,page341，为在动物脂肪中找到的自然存在的甾醇。其它合适的甾醇包括β-谷甾醇，豆甾醇，麦角固醇和麦角钙化醇。所述甾醇合适存在的量为免疫原性组合物的总量的约0.01%-约20%（w/v），合适的量在约0.1%-约5%（w/v）。合适地，当甾醇是胆固醇时，其存在的量在免疫原性组合物的总量的约0.02%和约0.2%（w/v）之间，通常在0.5ml疫苗剂量容积中的量为约0.02%（w/v）。
母生育酚（例如维生素E）也经常用于油乳佐剂（EP0 382 271 B1；美国专利号5,667,784；WO95/17210）。用于本发明的油乳液中的母生育酚（可选的水包油乳液/乳剂）可按EP0 382 271B1所述配制，其中母生育酚可以是母生育酚液滴的分散液，可选地包括乳化剂，可选的直径小于1微米。可替换地，母生育酚可以与另一种油结合使用，以形成油相的油乳剂/乳液。本文披露了可与母生育酚结合使用的油乳剂/乳液的示例，例如上文所述的可代谢油。
水包油乳剂/乳液包括乳化剂。乳化剂可存在的量为免疫原性组合物的按重量计约0.01-约5.0%（w/w），合适地存在的量为按重量计约0.1-约2.0%（w/w）。合适的浓度为总组合物的按重量计约0.5-约1.5%（w/w）。
乳化剂可以合适地是聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯（聚山梨醇酯80或吐温80(Tween80)）。在一个特定实施例中，0.5ml疫苗剂量容积包含1%（w/w）吐温80，而0.7ml疫苗剂量容积包含大约0.7%（w/w）吐温80。在另一个特定实施例中，吐温80的浓度是大约0.1%或大约0.2%（w/w）。在一个方面，聚山梨醇酯80的量为每疫苗剂量大约4.9mg，合适地每疫苗剂量从约4.6mg至约5.2mg。在另一方面，聚山梨醇酯80的量为每疫苗剂量大约2.4mg，合适地每疫苗剂量从约2.0至约2.8mg。在另一方面，聚山梨醇酯80的量为每疫苗剂量大约1.2mg，合适地每疫苗剂量从约1.0至约1.5mg。在另一方面，聚山梨醇酯80的量为每疫苗剂量大约0.6mg，合适地每疫苗剂量约0.4-0.8mg。
水包油乳液佐剂可以与其它佐剂或免疫刺激剂一起使用，因此本发明的一个重要实施例是水包油配方，包括角鲨烯或另一可代谢油，生育酚，例如α-生育酚，和吐温80。水包油乳剂/乳液还可包含司盘85(Span85)（聚氧乙烯失水山梨醇油酸酯）和/或卵磷脂。通常，水包油(乳剂)会包括免疫原性组合物的总量的约2-约10%的角鲨烯，2%-10%的α-生育酚和约0.3-约3%的吐温80，并且可按照WO95/17210中所述的步骤生产。合适的角鲨烯:α-生育酚的比率等于或小于1，因为这提供了更为稳定的乳剂/乳液。司盘85也可以存在，例如约1%的水平。
流感疫苗制剂可以在存在防腐剂例如硫柳汞下制备。合适地，防腐剂尤其是硫柳汞存在的浓度为大约100μg/ml。可替换地，流感疫苗制剂在存在低水平的防腐剂例如硫柳汞下制备，例如浓度不超过20μg/ml或合适地小于5μg/ml。在另一合适的可替换实施例中，流感疫苗制剂在没有硫柳汞的情况下制备。合适地，所得到的流感疫苗制剂在没有有机汞防腐剂的存在下是稳定的；尤其是制剂不包含残余硫柳汞。尤其是，流感疫苗制剂包括在缺少硫柳汞下或在较低水平的硫柳汞（一般5μg/ml或更低）下稳定的M1多肽抗原。具体地说，乙型(B型)流感菌株的稳定由α-生育酚例如α-生育酚琥珀酸盐（也被称为维生素E琥珀酸盐，即VES）的衍生物完成。所述制剂和制备它们的方法披露于WO02/097072。
一个剂量的佐剂的M1多肽疫苗的容积可以在大约0.25-1ml之间，并通常对应于成人配方的大约0.5ml。合适地，0.5ml的成人剂量对应于大约0.25ml佐剂加上大约0.25ml抗原。每个疫苗剂量可包含大约15μgM1多肽。在可替换的实施例中，每个疫苗剂量包含较低量的M1多肽，例如小于大约15μg的量，合适地小于大约10μg。合适的量为大约2μg，大约4μg，大约5μg，大约7.5μg，或大约10μg的M1多肽或者M1多肽低于大约15μg的任何合适量，确定所述量使得疫苗组合物满足本文所定义的至少一个疗效标准。有利地，可使用大约1μg或者甚至更低例如约0.5μg的M1多肽剂量，使得满足上文所定义的监管标准。大约1ml的疫苗剂量（大约0.5ml佐剂加上大约0.5ml抗原制剂）也是合适的。大约0.25ml的疫苗剂量（例如，大约0.125ml佐剂加上大约0.125ml抗原制剂）也是合适的，特别是对于儿科人群。一个剂量的M1多肽疫苗的容积可以在大约0.25-1ml之间，并通常对应于成人配方的大约0.5ml。合适地，0.5ml的成人剂量对应于大约0.25ml佐剂加上大约0.25ml抗原。大约1ml的疫苗剂量（大约0.5ml佐剂加上大约0.5ml抗原制剂）也是合适的。大约0.25ml的疫苗剂量（例如，大约0.125ml佐剂加上大约0.125ml抗原制剂）也是合适的，尤其是儿科人群。
免疫刺激剂
在另一个实施例中，组合物可包括其它佐剂，尤其是TLR-4配体佐剂，合适地脂质A的无毒衍生物。合适的TLR-4配体是3-de-O-酰化的单磷酰类脂A（3D-MPL）。其它合适的TLR-4配体是脂多糖（LPS）和衍生物，MDP（胞壁酰二肽）和RSV的F蛋白质。
在一个实施例中，组合物可另外包括Toll样受体（TLR）4配体，例如脂质A的无毒衍生物，尤其是单磷酸类脂A或更具体地是3-脱酰基单磷酰脂A（3D-MPL）。
所述脂多糖(优选是3D-MPL)可使用的量在1和50μg之间(免疫原性组合物的每人剂量)。有利地，3D-MPL使用的水平为约25μg，例如在20-30μg之间，合适地在21-29μg之间或在22-28μg之间或者在23-27μg之间或在24-26μg之间，或25μg。在另一个实施例中，免疫原性组合物的人剂量包括在大约10μg水平的3D-MPL，例如在5-15μg之间，合适地在6-14μg之间，例如在7-13μg之间或者在8-12μg之间或者在9-11μg之间，或10μg。在另一个实施例中，免疫原性组合物的人剂量包括在大约5μg水平的3D-MPL，例如在1-9μg之间，或者在2-8μg之间或合适地在3-7μg之间或者4-6μg之间，或5μg。
MPL的剂量合适地能够增强人类中对抗原的免疫应答。尤其是，合适的MPL量是与无佐剂的组合物相比或者与用另一MPL量佐剂的组合物相比改善了组合物的免疫潜力，同时反应性谱可接受。
脂质A的合成衍生物是已知的，一些被描述为TLR-4激动剂，包括但不限于：[0181]OM174（2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧四-癸酰氨基]-4-o-磷-phono-.β.-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-.α.--D-吡喃葡萄糖基磷酸二氢盐），（WO95/14026）[0182]OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧四癸酰氨基]-4-氧-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-h-氢氧四癸酰氨基]decan-1,10-二醇,1,10-双(二氢磷酸酯)（WO99/64301和WO00/0462）[0183]OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧四癸酰氨基]-4-氧基-5-氮杂-9-[(R)-3-氢氧基四癸酰氨基]decan-1,10-二醇,1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)（WO01/46127）。
可用的其它TLR4配体是烷基氨基葡萄糖苷磷酸酯类（AGP），例如披露于WO9850399或美国专利号6,303,347（还披露了AGP的制备方法），或者药学上可接受的AGP类的盐，如美国专利号6,764,840中所披露的。一些AGP是TLR4激动剂，而一些是TLR4拮抗剂。二者都被认为可以用作佐剂。
其它合适的TLR-4配体（能够通过TLR-4引起信号应答（Sabroe等人，JI2003p1630-5）是例如来自革兰氏阴性细菌的脂多糖及其衍生物，或其片段，尤其是LPS的无毒衍生物（例如3D-MPL）。其它合适的TLR激动剂是：热激蛋白质（HSP）10,60,65,70,75或90；表面活性蛋白A，透明质酸寡糖类，硫酸肝素片段，纤维连接蛋白片段，纤维蛋白原肽类和b-防御素-2，胞壁酰二肽（MDP）或呼吸道合胞病毒的F蛋白质。在一个实施例中，TLR激动剂是HSP60,70或90。
Toll-样受体（TLR）是I型跨膜受体，在昆虫类和人类之间进化上保守。十个TLR至此已经建立（TLR1-10）（Sabroe等人，JI2003p1630-5）。TLR族的成员具有相似的胞外和胞内域；它们的胞外域已经显示具有富含亮氨酸重复序列，而它们的胞内域类似于白细胞介素-1受体（IL-1R）的胞内区域。TLR细胞在免疫细胞和其它细胞（包括血管上皮细胞，脂肪细胞，心肌细胞和肠上皮细胞）间差异表达。TLR的胞内域可以与衔接蛋白Myd88相互作用，Myd88在其胞质区内也具有IL-1R域，导致细胞因子类的NF-KB活化；该Myd88路径是细胞因子释放受TLR活化影响的一个路径。TLR的主要表达是在细胞类型例如抗原呈递细胞（例如树突细胞，巨噬细胞等等）。
在另一个实施例中，佐剂和免疫原性组合物还包括皂苷佐剂。用于本发明的尤其合适的皂苷是QuilA及其衍生物。QuilA是从南美树皂树莫丽娜（QuillajaSaponaria Molina）分离出来的皂苷制剂，被Dalsgaard等人于1974年首次披露（“Saponin adjuvants”，Archiv.fur die gesamte Virusforschung，Vol.44，SpringerVerlag，Berlin，p243-254），具有佐剂活性。QuilA的纯化片段已经被HPLC分离，其保留佐剂活性而没有与QuilA相关的毒性（EP0 362 278），例如QS7和QS21（也被称为QA7和QA21）。QS-21是源自皂树莫丽娜（Quillaja Saponaria Molina）的树皮的天然皂苷，其诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTL），Th1细胞和主要的IgG2a抗体应答并且是本发明上下文中的优选的皂苷。在本发明的一个合适的形式中，免疫原性组合物内的皂苷佐剂是saponaria molina quil A的衍生物，优选Quil A的免疫活性部分，例如QS-17或QS-21，合适地QS-21。在一个实施例中，本发明的组合物包含基本纯化形式的免疫活性皂苷部分。优选地，本发明的组合物包含基本纯化形式的QS21，也就是说，QS21为至少90%纯化，例如至少95%纯化，或者至少98%纯化。
其它可用的皂苷类源自植物马栗树(Aesculus hippocastanum)或Gyophillastruthium。文献中已披露过的其它皂苷类包括七叶树(Escin)，已披露于Merck index（12.sup.thed:entry3737）为出现在七叶树，Aesculus hippocastanum种子中的皂苷的混合物。其分离通过色谱法和纯化进行描述（Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953)），以及通过离子交换树脂（Erbring等人，美国专利号3,238,190）。接穗的部分已被纯化并且显示出生物活性（Yoshikawa M等人（Chem Pharm Bull(Tokyo)1996年8月；44(8)：1454-1464））。来自Gypsophilla struthium的Sapoalbin（R.Vochten等人，1968，J.Pharm.Belg.,42,213-226）也是一个选择。
3D-MPL和/或QS21的剂量合适地能够提高人类中对抗原的免疫应答。尤其是，合适的3D-MPL和/或QS21的量是与无佐剂的组合物相比或与用另一3D-MPL或QS21量佐剂的组合物相比改善了组合物的免疫潜力，同时反应性谱可接受。通常，对于人实施，皂苷（例如QS21）和/或LPS衍生物（例如3D-MPL）在人剂量的免疫原性组合物中存在的量的范围是每剂量1μg-200μg，例如10-50μg，或者1μg-25μg。
其中可选地包括其它免疫刺激剂的佐剂特别适于婴儿和/或老年疫苗配方。
接种疫苗
本发明的组合物可以通过任何合适的给药途径实施，例如皮内、粘膜例如鼻内、口服、肌肉或皮下给药。其他给药途径在本领域是公知的。
肌肉给药途径特别适合本发明的M1多肽组合物。本发明的组合物能够以单一剂量容器或可替换地多剂量容器存在，特别适合大流行性疫苗。在这种情况，通常存在抗菌性防腐剂例如硫柳汞以防止在使用过程中受污染。硫柳汞浓度可以在25μg/0.5ml剂量（即50μg/mL）。5μg/0.5ml剂量的硫柳汞浓度（即10μg/ml）或10μg/0.5ml剂量（即20μg/ml）合适地存在。可以使用合适的IM输送设备，例如无针喷液注射装置，例如Biojector2000（Bioject，Portland，Oregon）。可替换地，可以使用笔式注射器装置。使用所述输送装置可以尤其顺应大规模免疫接种活动，例如在大流行中会需要。
皮内输送是另一合适的途径。任何合适的设备可用于皮内输送，例如无针或短针装置，例如限制针进入皮肤内的有效穿透长度的装置，例如披露于WO99/34850和EP1092444，所述文献在此被援引入本文，以及其功能等值。另外合适的是喷射注射装置，其通过液体喷射注射器或者通过针刺穿角质层并产生到达真皮的喷射向真皮输送液体疫苗。另外合适的是弹道式粉末/颗粒输送装置，其使用压缩气体使粉末形式的疫苗加速通过皮肤外层到真皮。另外，传统的注射器可用于皮内实施的经典曼托方法（mantoux method）。
另一合适的给药途径是皮下途径。任何合适的装置可用于皮下输送，例如经典的针或无针喷射注射器装置。合适的，所述装置预装有液体疫苗制剂。
可替换地，疫苗鼻内给药。通常，疫苗局部给药至鼻咽区，合适地不会被吸入肺。希望使用鼻内输送装置，所述装置将疫苗制剂输送至鼻咽区，而不会或基本不会进入肺部。用于本发明疫苗的鼻内给药的合适装置是喷雾装置，其在本领域是公知的。
可替换地，表皮或经皮接种途径也是本发明所考虑的。
抗体
本发明的抗体对一种或多种本发明的M1多肽会具有结合专一性。本发明的抗体涵盖上文所述的所有形式。在一个实施例中，抗体会针对具体的生物体进行工程设计。生物体可以是人，犬，或商业上有价值的家畜，例如，猪、马、狗、猫、鸡、或其它鸟类。抗体的所述工程设计包括例如人化、人源化改造(humaneering)，制成嵌合抗体，或者利用本领域已知的任何组库技术或单克隆技术分离全人（或者其它生物体）抗体。
分离抗原特异性人抗体的已有方法包括筛选小鼠的杂交瘤，所述小鼠对于人免疫球蛋白位点是转基因的（例如Jakobacits,1998,Adv Drug Deliv Rev.31:33-42），和体外方法，其中展示并编码在丝状噬菌体（例如McCafferty等人，1990，Nature348:552-554)，酵母细胞（例如Boder和Wittrup，1997，Nat Biotechnol15:553-557），和核糖体（例如Hanes和Pluckthun，1997，Proc Natl Acad Sci USA94:4937-4942）的人抗体片段的重组库对固定化抗原进行淘选。这些方法产生了许多有用的人抗体。但是，对于具有希望的治疗特性的很多非人类抗体，具有等价生物活性的人抗体还未使用这些方法分离。
针对人免疫球蛋白位点转基因的小鼠一般不表达人多样性的完全补体，并且亲和力成熟效率较低。因此，希望的亲和力和特异性的成功率倾向低于传统的小鼠。展示技术的主要限制源于抗体组库的倾向性表达，和天然组库的特异性和亲和力限制。来自天然库的抗原结合抗体通常要求额外的亲和力成熟。
最小化非人类抗体的免疫原性同时保留尽可能多的初始特异性和亲和力的最广泛应用的方法涉及将非人类抗体的CDR移植到人框架上，通常选择与非人类框架结构同源的那些（Jones等人，1986，Nature321:522-5；美国专利号5,225,539）。最初这些方法导致亲和力急剧损失。不过，然后显示一些亲和力可以通过在框架的关键位置恢复非人类残基来恢复，这要求保持非人类CDR1和2的正则结构（Bajorath等人，1995，J Biol Chem270:22081-4；Martin等人，1991，Methods Enzymol.203:121-53；Al-Lazikani，1997，J Mol Biol273:927-48）。恢复CDR3的天然构象是非常不确定的事情，因为它们的结构更加多变。因此确定恢复哪些非人类残基来恢复功能性CDR3构象很大程度上是模型，其中可能结合有试验和错误。结果，在很多情况，初始非人类抗体的完全亲和力没有被恢复。通过CDR移植人化抗体的示例性方法披露于例如美国专利号6,180,370。
为了减轻传统CDR-移植方法的缺点，已尝试了不同的杂交选择方法，其中非人类抗体的部分已经在连续轮的抗原结合选择中与互补人抗体序列的库相结合，在这个过程中大部分非人类序列逐渐被人序列置换。不过，这些方法一般不表现地比CDR-移植好。例如，在链替换技术中（Marks等人，1992，Biotechnology10:779-83），非人类抗体的一个链与另一个链的天然人组库结合，根据是非人类链的亲和力会足以将人伙伴的选择限制在抗原上的相同表位。选定的人伙伴随后用于指导对余下非人类链的人对应物的选择。
其它方法包括链置换技术，其中非人类CDR3被保留，而仅仅V-区的剩余部分包括框架和CDR1和2按序列进行的步骤分别置换（例如美国专利申请号20030166871；Rader等人，Proc Natl Acad Sci USA95:8910-15,1998；Steinberger等人，J.Biol.Chem.275:36073-37078,2000；Rader等人，J.Biol.Chem.275:13668-13676,2000）。不过，该策略仍具有缺陷，可选择的人V-区必须不仅与非人类CDR3而且与非人类伴随V-区相容。该种间相容性对所选定的人V-区的结构同源性提出了高要求，使得那些与非人类V-区最同源的一般被选择。在这点上，结果与CDR移植方法非常相似，除了CDR1和2在所选的V-区最初是人的。
在一个实施例中，本发明的抗M1多肽抗体用增强生物体中抗体的半衰期的分子来修饰/改性。所述修饰/改性包括，例如，聚乙二醇化(PEGylation)，或者通过其它亲水聚合物例如葡聚糖衍生，或者其它聚碳水化合物，PVP（聚维酮），PVA（聚乙烯醇）等等。用于所述衍生的聚合物在本领域是公知的。
在一个实施例中，本发明的抗体包括单克隆抗体2B-B10-G9，其结合至跨氨基酸220-236的流感病毒基质（M1）蛋白的C-端区。针对PR/8M蛋白质引起杂交瘤并且其结合被定位到序列GHTPSSSAGLKNDLLEN。
制造多肽
制造本发明的M1多肽和/或抗体的重组技术在本领域是公知的。本发明的M1多肽或抗体可制造在任何宿主细胞中，例如在哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞等等。制造重组表达构建体或载体用于某些宿主细胞例如酵母或丝状真菌，或者哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞，鼠科NIH3T3成纤维细胞，人胚胎肾193细胞，或者啮齿类骨髓瘤或杂交瘤细胞，大肠杆菌，某些昆虫细胞，和其它市场上可得的宿主细胞体系的技术在本领域是公知的。在这些宿主细胞中表达重组多肽并从这些宿主细胞获得重组多肽在本领域也是公知的。在一个实施例中，本发明的全长抗体将在能够糖基化抗体的宿主细胞体系中制得。在一个实施例中，糖基化将是用抗体治疗的靶标生物体的糖基化。在一个实施例中，糖基化将类似于待用抗体治疗的生物体的糖基化。在一个可替换的实施例中，糖基化不同于待被治疗的生物体，以便糖基化提供佐剂效应，但并不实质损害抗体的效应子作用。
本发明的M1多肽还可利用多肽合成装置（例如在试管中）通过化学合成制得。
在本说明书中所援引的所有公开出版物和专利在此被援引入本申请，如同每篇单独的公开出版物或专利专门和单独地表示被援引并且在此被援引以披露和描述所引用公开出版物的方法和/或材料。
示例
示例1.通过抗M1多肽抗体抑制流感病毒感染
研究了单克隆抗体2B-B10-G9，用于结合至流感菌株库和用于在蚀斑抑制试验中和活性。单克隆抗体2B-B10-G9结合至跨氨基酸220-236的流感病毒基质（M1）蛋白的C-端区域。2B-B10-G9还可结合至跨220-237，220-238，220-239，220-240，或220-241的氨基酸处的M1蛋白质。
2B-B10-G9以琼脂覆层被添加至部分感染的MDCK细胞的菌苔并且在37℃用CO2孵化3天（图1）。结果显示15ug的抗体完全抑制了蚀斑形成。由于2B-B10-G9仅接触(进入)病毒或感染的细胞上M蛋白质的暴露部分，阻止蚀斑表示来自PR/8的基质蛋白质的C-端区必须是表面可接触的。抑制MDCK细胞的菌苔上的病毒蚀斑通过两种单独的方法进一步分析。在添加含有2B-B10-G9抗体的琼脂覆层之前细胞被病毒感染并且孵化30分钟。可替换地，在感染细胞之前病毒和抗体混合并孵化30分钟。在感染和另外的30分钟孵化之后，添加没有抗体的琼脂覆层。结果表明在被抑制的总蚀斑中两个实验之间没有差异。这些结果暗示病毒感染的抑制是由2B-B10-G9结合至病毒引起的并且不阻止病毒从感染的细胞芽殖。其它测试显示菌斑试验中2B-B10-G9抑制了A/South Dakota(南达科他)（H1N1）的菌斑形成并且部分抑制了A/Uruguay(乌拉圭)（H3N2）（图2）。位置231处的氨基酸变化可能对降低的抗体功效负责。不过，即使部分抑制表明M蛋白的扩展的C-末端（在氨基酸残基215-252）是表面暴露的并且是针对免疫的可行靶标。进行了在位置231处的用天门冬素或天冬氨酸的病毒的其它测试。来自PR/8和A/South Dakota的M蛋白在位置231处包含天门冬素，而A/Uruguay在该位置包含天冬氨酸。另外，PR/8和South Dakota具有H1N1表面糖蛋白，而Uruguay具有H3N2表面糖蛋白。为了确定2B-B10-G9是否具有广泛的中和活性，进行了一系列的中和实验，来针对在H1N1设置的位置231处的天门冬素和天冬氨酸变化以及针对H3N2设置的天冬氨酸设置测试有效性。在H3N2病毒中不能测试在位置231含有天门冬素的M蛋白，因为该变化在野生型病毒中没有出现。两种病毒(A/WSN/33和A/Port Chalmers/1/73)在菌斑抑制试验中进行测试。A/WSN/33是H1N1病毒但不同于PR/8，在M1蛋白的位置231包含天冬氨酸。A/Port Chalmers/1/73是H3N2病毒，在位置231包含天冬氨酸。同时，还测试了两种对照病毒：A/PR/8和A/USSR/90/77。PR/8和USSR/90具有相同的氨基酸序列从AA220至AA236，但具有不同的H1N1蛋白质。结果显示所有的病毒被2B-B10-G9以剂量依赖的方式抑制(图2)。通过2B-B10-G9抑制菌斑形成不受位置231处的氨基酸变化的影响，并且不受H3N2或H1N1糖蛋白的影响。结合上面的数据和包含在NCBI数据库中的野生型M蛋白质的序列分析，可以合理地得出结论：2B-B10-G9结合所有已知的M1变体。在疫苗设置中呈现C-端肽215-252会产生多克隆(抗体)反应，利用了希望的抗体应答赋予的良好记录的效力，导致与单克隆抗体相对的由疫苗赋予的保护的非线性增长。该多克隆抗体应答能够提供针对具有A型基质蛋白的任何流感的接种疫苗生物体通用保护。
示例2.新的抗M1多肽抗体
包括来自A/PR/8/38流感病毒的M1蛋白质的氨基酸序列从220-236的M1多肽被结合至免疫原性载体蛋白（KLH，卵白蛋白，和BSA）并且注射入10-12周大的雌性BALB/c小鼠。该M1多肽具有氨基酸序列GHTPSSSAGLKNDLLEN。在最初注射之后又给予了两次随后的追加，一次在第14天，一次在第28天。正好在接种之前和在三次注射的每一次之后7天采集血清血液。分析所采集的血清表明在第二次追加之后对M1多肽和对整个M1蛋白质本身有强反应/应答。
肽GHTPSSSAGLKNDLLEN包括A/PR/8基质蛋白的氨基酸序列从220-236。肽化学共轭(结合)至KLH、卵白蛋白和BSA。
10-12周大的雌性BALB/c小鼠被随机分成三组进行接种：A组-对照（小鼠77-81），B组-肽共轭物（小鼠82-86），C组-仅肽（小鼠87-91）。所有的小鼠在第1天、第15天和第29天被注射。第1天注射包括Freund完整佐剂，并且随后的追加包含Freund不完整佐剂。A组小鼠（对照）最初被注射50ugKLH，并用50ug卵白蛋白追加两次（第15和29天）。B组小鼠用50ugKLH-肽共轭物接种（第1天）并用50ug卵白蛋白-肽共轭物追加两次（第15和29天）。C组小鼠用肽（没有共轭物）注射和追加，使用的量与B组摩尔当量。
三组小鼠通过仅用BSA（A组，小鼠77-81）、M1多肽-BSA共轭物（B组，小鼠82-86）、或者仅用M1多肽（C组，小鼠87-91）接种。小鼠通过仅BSA（A组）、M1多肽共轭物（B组）或仅M1多肽（C组）追加两次。从A组采集的血清显示与BSA、M1多肽-BSA共轭物、和M1蛋白质没有结合（图1）。从B组采集的血清（M1多肽-BSA共轭物）显示与M1多肽-BSA共轭物结合以及与M蛋白质结合。观察到没有与BSA结合表明结合至M1多肽是特异性的。从仅M1多肽（C组）采集的血清显示没有与BSA、M1多肽-BSA共轭物、或M蛋白质结合。
示例3.具有糖基化的M1多肽
在小鼠模型中评估了利用M1多肽的糖基化和a-糖基化形式的免疫应答和保护的比较。在位置231的主要变异可能影响抗体结合至该抗原位点，还会测试对在位置231具有突变的M1多肽的血清学反应。
纯化的a-糖基化的M1多肽和突变的231M1多肽以等比例组合，50ug(带Freunds佐剂)给药入一组小鼠（10只小鼠/组）。同时，糖基化的M1多肽(带Freunds佐剂)被给药至另一组小鼠。每组在两周后用10ug的各自的M1多肽进行追加。在最初注射之前一天、追加前一天以及追加后七天从每个小鼠采集大致100μl的血液。针对结合至M1多肽（加上和减去糖基化）、M1蛋白质、和针对对照非特异性肽来分析每只小鼠的血清。两周之后，进行另一次追加并且在追加后七天采集血清。血清对M1多肽变体的反应使得能够量化对糖基化和a-糖基化形式的反应，并且还可确定对病毒攻击实验的免疫接种程序。
六组小鼠（10只小鼠/组）进行免疫，并用M1多肽和突变的231M1多肽追加。三组会接收到组合的糖基化M1多肽（组1-3），并且3组会接收到具有佐剂的a-糖基化形式（组4-6）。在最终追加后三天用致命剂量的流感病毒攻击小鼠。各组用代表三种识别的M蛋白的变体的病毒进行攻击：A/PR/8（组1，4），A/WSN或等同物（组2，5），和A/South Dakota或等同物（组3，6）。另三组用每种病毒作为非免疫对照进行攻击。7天后测量体温和存活率。
本说明书中引用的所有公开出版物和专利在此被援引入本发明，如同每篇单独的公开出版物或专利专门和单独地表明被援引入本发明并且在此被援引入本文以披露和描述结合所引用公开出版物的方法和/或材料。
本领域的普通技术人员会认识到或使用不超出常规实验能够确定本文所述的特定实施例的许多等同物。所述等同物旨在涵盖于所附权利要求书。
Claims (16)
1.一种甲型流感疫苗，所述甲型流感疫苗包括M1多肽。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中M1多肽包括M1蛋白的氨基酸残基220-236。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其中M1多肽包括M1蛋白的氨基酸残基215-241之间的至少7个连续的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其中M1多肽由M1蛋白的氨基酸残基220-252组成。
5.根据权利要求3所述的疫苗，其中M1多肽结合至载体。
6.根据权利要求3所述的疫苗，其中M1多肽存在于支架。
7.根据权利要求1所述的疫苗，还包括佐剂。
8.根据权利要求1所述的疫苗，其中M1多肽还包括糖基化的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的疫苗，其中疫苗引起人中的B-细胞应答。
10.根据权利要求1所述的疫苗，其中疫苗引起哺乳动物中的B-细胞应答。
11.一种治疗哺乳动物的方法，包含以下步骤：将M1多肽组合物给药入哺乳动物，其中M1多肽组合物诱导哺乳动物中的免疫应答。
12.根据权利要求11所述的方法，其中免疫应答保护哺乳动物抵抗流感病毒。
13.根据权利要求12所述的方法，其中哺乳动物是人。
14.根据权利要求11所述的方法，其中免疫应答是B-细胞应答。
15.根据权利要求14所述的方法，其中免疫应答还在哺乳动物中产生记忆免疫应答。
16.一种组合物，包括针对来自多种不同的甲型流感病毒的多个M1多肽的抗体，其中被所述抗体结合的表位在M1多肽的氨基酸序列215-241中找到。
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