ES2318020T3 - Composicion de vacuna contra la gripe. - Google Patents
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Abstract
Una preparación de virus de la gripe inactivado que comprende un antígeno de hemaglutinina (HA) estabilizado en ausencia de tiomersal, o a niveles de tiomersal de 5 µg/ml o menor, en la que la hemaglutinina puede detectarse mediante un ensayo de SRD, y en la que la preparación comprende succinato de alfa-tocoferol en una cantidad suficiente para estabilizar la HA.
Description
Composición de vacuna contra la gripe.
Esta invención se refiere a preparaciones de
antígenos de virus de la gripe novedosas, procedimientos para
prepararlas y su uso en profilaxis o terapia. En particular, la
invención se refiere a vacunas de la gripe inactivadas que son
vacunas con virus alterados en lugar de enteros y que son estables
en ausencia de conservantes de organomercurio. Además, las vacunas
contienen hemaglutinina que es estable de acuerdo con las pruebas
estándar. Las vacunas pueden administrarse por cualquier vía
adecuada para dichas vacunas, tal como por vía intramuscular,
subcutánea, intradérmica o por las mucosas por ejemplo por vía
intranasal.
El virus de la gripe es uno de los virus más
omnipresentes del mundo, afectando tanto a seres humanos como al
ganado. El impacto económico de la gripe es significativo.
El virus de la gripe es un virus de ARN con
cubierta y con un tamaño de partícula de aproximadamente 125 nm de
diámetro. Está constituido básicamente por una nucleocápside interna
o núcleo de ácido ribonucleico (ARN) asociado a nucleoproteína,
rodeado de una cubierta vírica con una estructura de bicapa lipídica
y glucoproteínas internas. La capa interna de la cubierta vírica
está compuesta predominantemente por proteínas de matriz y la capa
externa en su mayor parte por material lipídico derivado del
huésped. La glucoproteínas superficiales neuraminidasa (NA) y
hemaglutinina (HA) aparecen en forma de púas, de 10 a 12 nm de
largo, sobre la superficie de las partículas. Son estas proteínas
superficiales, en particular la hemaglutinina, las que determinan la
especificidad antigénica de los subtipos de la gripe.
Las vacunas de la gripe disponibles actualmente
son vacunas de gripe inactivada o viva atenuada. Las vacunas de la
gripe inactivadas están compuestas por tres formas posibles de
preparación de antígenos: virus entero inactivado,
sub-viriones en los que las partículas víricas
purificadas son alteradas con detergentes u otros reactivos para
solubilizar la cubierta lipídica (la denominada vacuna
"fraccionada") o HA y NA purificadas (vacuna con subunidades).
Estas vacunas inactivadas se administran por vía intramuscular
(i.m.) o por vía intranasal (i.n.). No existen vacunas atenuadas
vivas disponibles en el mercado.
Las vacunas de la gripe, de todo tipo, son
habitualmente vacunas trivalentes. Generalmente contienen antígenos
que se derivan de dos cepas de virus A de la gripe A y una cepa B de
la gripe. Una dosis inyectable de 0,5 ml estándar, en la mayoría de
los casos contiene 15 \mug de componente de antígeno de
hemaglutinina de cada cepa, medido mediante inmunodifusión radial
única (SRD) (J.M. Wood y cols.: An improved single radial
immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin
antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole
virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5 (1977)
237-247; J. M. Wood y cols., International
collaborative study of single radial diffusion and
immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin
antigen of influenza virus. J. Biol. Stand. 9 (1981)
317-330).
Las cepas del virus de la gripe a incorporar en
la vacuna de la gripe de cada estación son determinadas por la
Organización Mundial de la Salud en colaboración con las autoridades
sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas.
La epidemia de gripe habitual provoca aumentos
en la incidencia de neumonía y enfermedades de las vías
respiratorias bajas como se observa por mayores tasas de
hospitalización o mortalidad. Las personas mayores o los que padecen
enfermedades crónicas subyacentes son los que tienen mayor
probabilidad de sufrir dichas complicaciones, pero los niños
pequeños también pueden sufrir una enfermedad grave. Estos grupos en
particular por lo tanto necesitan protección.
Los esfuerzos actuales para controlar la
morbilidad y la mortalidad asociados a las epidemias anuales de
gripe se basan en el uso de vacunas de gripe inactivadas
administradas por vía intramuscular. La eficacia de dichas vacunas
en la prevención de enfermedades respiratorias y las complicaciones
de la gripe varía desde el 75% en los adultos sanos a menos del 50%
en las personas mayores.
Se aplican criterios internacionalmente para
medir la eficacia de las vacunas de la gripe. Los criterios
oficiales de la Unión Europea para una vacuna eficaz contra la
gripe se recogen en la tabla siguiente. En teoría, para cumplir los
requisitos de la Unión Europea, una vacuna de la gripe debe cumplir
únicamente uno de los criterios de la tabla, para todas las cepas
de gripe incluidas en la vacuna. Sin embargo, en la práctica deben
cumplirse al menos dos o los tres criterios para todas las cepas,
en particular para una vacuna nueva tal como una vacuna nueva para
administrar por una vía diferente. En algunas circunstancias, pueden
ser suficientes dos criterios. Por ejemplo, puede ser aceptable
cumplir dos de los tres criterios para todas las cepas mientras que
el tercer criterio se cumple sólo para algunas pero no para todas
las cepas (por ejemplo dos de tres cepas). Los requisitos son
diferentes para las poblaciones adultas (18-60 años)
y para las poblaciones de más edad (>60 años).
Para que una vacuna de la gripe novedosa sea
comercialmente útil será necesario no sólo cumplir esos criterios,
sino también en la práctica será necesario que sea al menos tan
eficaz como las vacunas inyectables actualmente disponibles.
También deberá ser comercialmente viable en lo que se refiere a la
cantidad de antígeno y el número de administraciones necesaria.
Las vacunas de la gripe actualmente disponibles
en el mercado son vacunas inyectables con virus fraccionados o con
subunidades. Estas vacunas se preparan alterando las partículas
víricas, generalmente con un disolvente orgánico o un detergente, y
separando o purificando las proteínas víricas en grados diversos.
Las vacunas con virus fraccionados se preparan fragmentando el
virus de la gripe entero, infeccioso o inactivado, con
concentraciones solubilizantes de disolventes orgánicos o
detergentes y posterior eliminación del agente solubilizante y
parte o la mayoría del material lipídico vírico. Las vacunas con
virus fraccionados generalmente contienen proteína de la matriz y
nucleoproteína y algunas veces lípidos contaminantes, así como las
proteínas de cubierta de la membrana. Las vacunas con virus
fraccionados habitualmente contendrán la mayoría o todas las
proteínas estructurales de los virus aunque no necesariamente en
las mismas proporciones que en los virus enteros. Las vacunas con
subunidades por otra parte, están constituidas esencialmente por
proteínas víricas superficiales muy purificadas, hemaglutinina y
neuraminidasa, que son las proteínas superficiales responsables de
provocar los anticuerpos neutralizantes del virus deseados tras la
vacunación.
Muchas vacunas que están disponibles actualmente
requieren un conservante para evitar el deterioro. Un conservante
usado frecuentemente es el tiomersal que es un compuesto que
contiene mercurio. Se han expresado alguna preocupación pública
sobre los efectos de los compuestos que contienen mercurio. No
existe ningún sistema de control en funcionamiento para detectar
los efectos de dosis de bajas a moderadas de compuestos de
organomercurio sobre el sistema nervioso en desarrollo, y los
estudios especiales de niños que han recibido altas dosis de
compuestos de organomercurio tardarán varios años en completarse.
Ciertos comentaristas han subrayado que los potenciales peligros de
las vacunas que contienen tiomersal no deberían exagerarse (Offit;
P.A. JAMA Vol. 283; n.º:16). Sin embargo, sería ventajoso encontrar
procedimientos alternativos para la preparación de vacunas para
sustituir el uso de tiomersal en el proceso de fabricación. Por lo
tanto existe la necesidad de desarrollar vacunas que estén libres
de tiomersal, en particular vacunas como las vacunas de la gripe que
se recomiendan, al menos para ciertos grupos de la población, todos
los años.
Ha sido práctica habitual hasta la fecha emplear
un conservante para las vacunas de gripe inactivadas comerciales,
durante el proceso de producción/purificación y/o en la vacuna
final. El conservante es necesario para evitar el crecimiento de
microorganismos durante las diversas etapas de la purificación. Para
las vacunas de la gripe derivadas del huevo, se añade habitualmente
tiomersal como líquido alantoico en bruto y también puede añadirse
una segunda vez durante el procesamiento del virus. De este modo,
habrá tiomersal residual presente al final del procedimiento, y
esto puede ajustarse además a una concentración de conservante
deseable en la vacuna final, por ejemplo a una concentración de
aproximadamente 100 \mug/ml.
Un efecto secundario del uso de tiomersal como
conservante en las vacunas de la gripe es un efecto estabilizador.
El tiomersal en las vacunas de la gripe comerciales actúa
estabilizando el componente HA de la vacuna, en particular pero no
exclusivamente la HA de la cepa B de la gripe. Ciertas
hemaglutininas de la cepa A, por ejemplo H3, también pueden
requerir estabilización. Por lo tanto, aunque puede ser deseable
considerar eliminar el tiomersal de las vacunas de la gripe, o al
menos reducir la concentración del tiomersal en la vacuna final,
hay que resolver el problema de que, sin tiomersal, la HA no será lo
suficientemente estable.
Se ha descubierto en la presente invención que
es posible estabilizar la HA en preparaciones de gripe inactivadas
usando reactivos alternativos que no contengan compuestos de
organomercurio. La HA permanece estabilizada de tal forma que es
detectable en el tiempo mediante procedimientos de cuantificación
estándar, en particular SRD, en mayor medida que una preparación de
antígeno no estabilizado producido por el mismo procedimiento pero
sin el excipiente estabilizante. El procedimiento de SRD se realiza
tal como se describe anteriormente en el presente documento. De
forma importante, la HA permanece estabilizada durante hasta 12
meses que es el estándar requerido en una vacuna de la gripe
final.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona una preparación de virus de la gripe inactivado que
comprende un antígeno de hemaglutinina estabilizado en ausencia de
tiomersal, o a niveles bajos de tiomersal, en el que la
hemaglutinina puede detectarse mediante un ensayo de SRD, y en el
que la preparación comprende succinato de
\alpha-tocoferol en una cantidad suficiente para
estabilizar la HA.
Los niveles bajos de tiomersal son los niveles a
los que se reduce la estabilidad de HA derivada de la gripe B, de
tal forma que es necesario un excipiente estabilizador para la HA.
Los niveles bajos de tiomersal son generalmente
5 \mug/ml o menos.
5 \mug/ml o menos.
Generalmente, la HA estabilizada se refiere a
una HA que es detectable en el tiempo mediante procedimientos de
cuantificación estándar, en particular SRD, en mayor medida que una
preparación de antígeno no estabilizado producido por el mismo
procedimiento pero sin el excipiente estabilizante. La
estabilización de HA preferiblemente mantiene la actividad de HA
sustancialmente constante durante un periodo de un año.
Preferiblemente, la estabilización permite a la vacuna que
comprende HA proporcionar una protección aceptable después de un
periodo de almacenamiento de 6 meses, más preferiblemente un
periodo de un año.
De forma adecuada, la estabilización se realiza
mediante un excipiente de estabilización, preferiblemente un
excipiente de modificación de las micelas. Un excipiente de
modificación de las micelas es generalmente un excipiente que puede
incorporarse en una micela formada por detergentes que se usan o
adecuados para solubilizar la proteína de la membrana HA, tales
como los detergentes Tween 80, Triton X100 y desoxicolato, de forma
individual o combinada.
Sin desear estar constreñidos por la teoría, se
cree que los excipientes estabilizan HA mediante la interacción con
los lípidos, detergentes y/o proteínas de la preparación final.
Pueden formarse micelas mixtas de excipiente con proteína y lípido,
tales como micelas de Tween y desoxicolato con lípidos residuales
y/o Triton X-100. Se cree que las proteínas
superficiales se mantienen solubilizadas mediante esas micelas
complejas. Preferiblemente, la agregación de proteínas se limita
mediante la repulsión entre las cargas de las micelas que contienen
excipientes adecuados, tales como micelas que contienen detergentes
con cargas negativas.
Los ejemplos de excipientes de modificación de
micelas adecuados incluyen: moléculas anfífilas con cargas
positivas, negativas o zwiteriónicas tales como sulfatos de alquilo,
sulfatos de alquilarilo; moléculas anfifílicas no iónicas tales
como poliglucósidos de alquilo o sus derivados, tales como
Plantacare® (disponibles en Henkel KGaA), o polialquilenéteres de
alcoholes alquílicos o sus derivados tales como
Laureth-9.
Los excipientes preferidos son
\alpha-tocoferol, o derivados de
\alpha-tocoferol tales como succinato de
\alpha-tocoferol. Otros ejemplos de derivados de
tocoferolinclude
D-\alpha-tocoferol,
D-\delta-tocoferol,
D-\gamma-tocoferol y
DL-\alpha-tocoferol. Los derivados
de tocoferoles adecuados que pueden usarse incluyen acetatos,
succinatos, ésteres de ácido fosfórico, formiatos, propionatos,
butiratos, sulfatos y gluconatos. En la presente invención se usa
succinato de alfa-tocoferol.
El \alpha-tocoferol o derivado está presente en
una cantidad suficiente para estabilizar la hemaglutinina.
Otros excipientes adecuados pueden identificarse
mediante procedimientos estándar en la técnica, y pueden analizarse
por ejemplo usando el procedimiento de SRD para el análisis de la
estabilidad tal como se describe en el presente documento.
En un aspecto preferido la invención proporciona
un preparación del antígeno de virus de la gripe que comprende al
menos un antígeno de hemaglutinina de la cepa B de la gripe
estable.
La invención proporciona en un aspecto adicional
un procedimiento para preparar un antígeno de hemaglutinina
estable, comprendiendo el procedimiento purificar el antígeno en
presencia de succinato de \alpha-tocoferol.
La invención proporciona además vacunas que
comprenden las preparaciones de antígeno que se describen en el
presente documento y su uso en un procedimiento para la profilaxis
de una infección o enfermedad de la gripe en un sujeto,
comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto una vacuna de
acuerdo con la invención.
La vacuna puede administrarse por cualquier vía
de administración adecuada, tal como intradérmica, mucosa por
ejemplo intranasal, oral, intramuscular o subcutánea. Otras vías de
administración son notorias en la técnica.
Se prefiere la administración intradérmica.
Puede usarse cualquier dispositivo adecuado para la administración
intradérmica, por ejemplo dispositivos de aguja corta tales como los
que se describen en los documentos US 4.886.499, US5.190.521, US
5.328.483, US 5.527.288, US 4.270.537, US 5.015.235, US 5.141.496,
US 5.417.662. Las vacunas intradérmicas también pueden
administrarse mediante los dispositivos que limitan la longitud de
penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los que se
describen en los documentos WO99/34850 y EP1092444, y equivalentes
funcionales de los mismos. También son adecuados los dispositivos de
inyección jet que administran vacunas líquidas a la dermis mediante
un inyector jet de líquido o mediante una aguja que atraviesa el
estrato corneo y que produce un chorro que alcanza la dermis. Los
dispositivos de inyección jet se describen por ejemplo en los
documentos US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412,
US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US
5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627,
US 5.064.413, US 5.520. 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US
4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. También so
adecuados los dispositivos de administración de polvo/partículas
balísticas que usan gas comprimido para acelerar una vacuna en
forma de polvo a través de las capas más externas de la piel hasta
la dermis. Además, pueden usarse jeringuillas convencionales en el
procedimiento clásico de administración intradérmica de mantoux.
Sin embargo, el uso de jeringuillas convencionales requiere
practicantes muy expertos y por lo tanto se prefieren dispositivos
que pueden administrar la vacuna de forma precisa sin necesidad de
una persona muy experta.
La invención por lo tanto proporciona un
procedimiento para la profilaxis de una infección o enfermedad de
la gripe en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar al
sujeto una vacuna contra la gripe por vía intradérmica de acuerdo
con la invención.
La invención también engloba dispositivos
intradérmicos combinados con una vacuna de acuerdo con la presente
invención, en particular con los dispositivos que se describen en
los documentos WO99/34850 o EP1092444, por ejemplo.
También se proporciona el uso de succinato de
\alpha-tocoferol como estabilizante de la
hemaglutinina en la fabricación de una vacuna de la gripe.
La invención se refiere en particular pero no de
forma exclusiva a la estabilización de la hemaglutinina de la cepa
B de la gripe.
Preferiblemente la HA estabilizada de la
presente invención es estable durante 6 meses, más preferiblemente
12 meses.
El \alpha-tocoferol está en
forma de succinato.
Las concentraciones preferidas para el
\alpha-tocoferol o derivado están entre 1
\mug/ml - 10 mg/ml, más preferiblemente entre 10 \mug/ml - 500
\mug/ml.
La vacuna de acuerdo con la invención
generalmente contiene antígenos de virus de las cepas A y B,
habitualmente en una composición trivalente de dos cepas A y una
cepa B. Sin embargo, no se excluyen las vacunas divalentes y
monovalentes. Las vacunas monovalentes pueden ser ventajosas en una
situación de pandemia, por ejemplo, donde es importante producir la
mayor cantidad de vacuna y administrarla lo más rápido posible.
La preparación de antígenos de la gripe no viva
para usar en la invención puede seleccionarse a partir del grupo
constituido por preparaciones de antígenos de virus fraccionados,
antígenos en subunidades (o bien expresados de forma recombinante o
preparados a partir de virus enteros), virus enteros inactivados que
pueden ser inactivados químicamente por ejemplo con formaldehído,
\beta-propiolactona o inactivarse de otro modo por
ejemplo inactivación por U.V. o calor. Preferiblemente, la
preparación de antígeno es o bien una preparación de virus
fraccionados, o un antígeno de subunidades preparado a partir de
virus enteros, en particular mediante un procesamiento del virus,
seguido de purificación del antígeno superficial. Lo más preferidos
son las preparaciones de virus fraccionados.
Preferiblemente, la concentración de antígeno de
hemaglutinina para la o cada cepa de la preparación del virus de la
gripe es 1-1000 \mug por ml, más preferiblemente
3-300 \mug por ml y lo más preferiblemente
aproximadamente 30 \mug por ml, medido mediante un ensayo de
SRD.
La vacuna de acuerdo con la invención puede
comprender además un adyuvante o inmunoestimulante tal como, pero
sin limitación, lípido A desintoxicado de cualquier fuente y
derivados no tóxicos de lípido A, saponinas y otros reactivos que
pueden estimular una respuesta de tipo TH1.
Se ha sabido desde hace tiempo que el
lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) es un estimulador potente
del sistema inmunitario, aunque su uso en adyuvantes ha sido
restringido debido a sus efectos tóxicos. Un derivado no tóxico de
LPS, monofosforil lípido A (MPL), producido por la eliminación del
grupo carbohidrato nuclear y el fosfato de la glucosamina terminal
reductora, ha sido descrito por Ribi y cols (1986, Immunology and
Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY,
páginas 407-419) y tiene la siguiente
estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
Una versión desintoxicada adicional de MPL se
obtiene por la eliminación de la cadena acilo de la posición 3 del
esqueleto de disacárido y se denomina monofosforil lípido A
3-O-desacilado
(3D-MPL). Puede purificarse y prepararse por los
procedimientos que se enseñan en el documento GB 2122204B,
referencia que también describe la preparación de difosforil lípido
A, y de sus variantes
3-O-desaciladas.
Una forma preferida de 3D-MPL
está en forma de una emulsión que tiene un tamaño de partícula
pequeño de menos de 0,2 \mum de diámetro y su procedimiento de
fabricación se describe en el documento WO 94/21292. Las
formulaciones acuosas que comprenden monofosforil lípido A y un
tensioactivo se han descrito en el documento WO 98/43670A2.
Los adyuvantes derivados de lipopolisacárido
bacteriano a formular en las composiciones de la presente invención
pueden purificarse y procesarse a partir de fuentes bacterianas, o
de forma alternativa pueden ser sintéticas. Por ejemplo, el
monofosforil lípido A purificado se describe en Ribi y cols 1986
(referencia anterior), y monofosforil o difosforil lípido A
3-O-desacilado derivado de
Salmonella sp. se describe en los documentos GB 2220211 y US
4912094. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y
sintéticos (Hilgers y cols., 1986, Int.Arch.Allergy.Immunol.,
79(4):392-6; Hilgers y cols., 1987,
Immunology, 60(1):141-6; y EP 0 549 074 B1).
Un adyuvante de lipopolisacárido bacteriano particularmente
preferido es 3D-MPL.
Por consiguiente, los derivados de LPS que
pueden usarse en la presente invención son aquellos
inmunostimulantes que tienen una estructura similar a la de LPS o
MPL o 3D-MPL. En otro aspecto de la presente
invención, los derivados de LPS pueden ser un monosacárido acilado,
que es una subporción de la estructura de MPL anterior.
Las saponinas se describen en:
Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996. A review of
the biological and pharmacological activities of saponins.
Phytomedicine vol 2 páginas 363-386). Las saponinas
son glicósidos de esteroides o triterpenos de amplia distribución
en los reinos vegetales y animales marinos. Las saponinas son
conocidas por formar soluciones coloidales en agua que forman
espuma al agitar y por precipitar el colesterol. Cuando las
saponinas están cerca de las membranas celulares, crean estructuras
de tipo poro en la membrana que hacen que la membrana se rompa. La
hemólisis de los eritrocitos es un ejemplo de este fenómeno, que es
una propiedad de algunas, pero no todas, las saponinas.
Las saponinas son conocidas como adyuvantes de
vacunas para la administración sistémica. El adyuvante y la
actividad hemolítica de las saponinas individuales ha sido
ampliamente estudiada en la técnica (Lacaille-Dubois
y Wagner, referencia anterior). Por ejemplo, Quil A (derivado de la
corteza de el árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y sus
fracciones, se describen en el documento US 5.057.540 y Saponins as
vaccine adjuvants'', Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier
Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; y el
documento EP 0 362 279 B1. Las estructuras de partículas,
denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), que comprenden
fracciones de Quil A son hemolíticas y se han usado en la
fabricación de vacunas (Morein, B., documentos EP 0 109 942 B1; WO
96/11711; WO 96/33739). Las saponinas hemolíticas QS21 y QS17
(fracciones purificadas por HPLC de Quil A) se han descrito como
potentes adyuvantes sistémicos, y el procedimiento para su
producción se describe en la patente de Estados Unidos n.º
5.057.540 y el documento EP 0 362 279 B1 Otras saponinas que se han
usado en los estudios de vacunación sistémicos incluyen los
derivados de otras especies vegetales tales como Gypsophila y
Saponaria (Bomford y cols., Vaccine,
10(9):572-577, 1992).
Un sistema potenciado incluye la combinación de
un derivado de lípido A no tóxico y un derivado de saponina en
particular la combinación de QS21 y 3D-MPL tal como
se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos
reactógena en la que QS21 se inactiva con colesterol tal como se
describe en el documento WO 96/33739.
Una formulación adyuvante particularmente
potente que contiene QS21 y 3D-MPL en una emulsión
de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una
formulación preferida.
Por consiguiente en una realización de la
presente invención se proporciona una vacuna que comprende una
preparación de antígenos de la gripe de la presente invención con
adyuvante de lípido A desintoxicado o a derivado de lípido A no
tóxico, más preferiblemente con adyuvante de monofosforil lípido A o
su derivado.
Preferiblemente, la vacuna además comprende una
saponina, más preferiblemente QS21.
Preferiblemente, la formulación además comprende
una emulsión de aceite en agua. La presente invención también
proporciona un procedimiento para producir una formulación de vacuna
que comprende mezclar una preparación de antígeno de la presente
invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal
como 3D-MPL.
Las vacunas de acuerdo con la invención pueden
comprender además al menos un tensioactivo que puede ser, en
particular, un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos
se seleccionan a partir del grupo constituido por los octil- o
nonilfenoxi polioxietanoles (por ejemplo la serie Triton^{TM}
disponible en el mercado), ésteres de polioxietilensorbitana (serie
Tween^{TM}) y polioxietilenéteres o ésteres de la fórmula general
(I):
(I)
HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R
en la que n es
1-50, A es un enlace o-C(O)-,
R es alquilo C_{1-50} o fenilalquilo
C_{1-50}; y combinaciones de dos o más de
estos.
Los tensioactivos preferidos que entran dentro
de la fórmula (I) son las moléculas en las que n es
4-24, más preferiblemente 6-12, y
lo más preferiblemente 9; el componente R es alquilo
C_{1-50}, preferiblemente alquilo
C_{4}-C_{20} y lo más preferiblemente alquilo
C_{12}.
Los octilfenoxi polioxietanoles y los ésteres de
polioxietilen sorbitana se describen en "Surfactant systems"
Editores: Attwood and Florence (1983, Chapman y Hall). Los
octilfenoxi polioxietanoles (los octoxinoles), que incluyen
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton
X-100^{TM}) también se describen en el Merck
Index, Entrada 6858 (Página 1162, 12ª edición, Merck & Co.
Inc., Whitehouse Stación, N.J., EE. UU.; ISBN
0911910-12-3). Los ésteres de
polioxietilen sorbitana, que incluyen monooleato de polioxietilen
sorbitana (Tween 80^{TM}) se describen en el Merck Index Entrada
7742 (Página 1308, 12ª Edición, Merck & Co. Inc., Whitehouse
Stación, N.J., EE. UU.; ISBN
0911910-12-3). Ambos pueden
fabricarse usando los procedimientos que se describen en las
referencias, o comprarse de fuentes comerciales tales como Sigma
Inc.
Los tensioactivos no iónicos particularmente
preferidos incluyen Triton X-45,
t-octilfenoxi polietoxietanol (Triton X 100),
Triton X-102, Triton X-114, Triton
X-165, Triton X-205, Triton
X-305, Triton N-57, Triton
N-101, Triton N-128, Breij 35,
polioxietilen-9-lauril éter (laureth
9) y polioxietilen-9-estearil éter
(steareth 9). Se prefieren particularmente Triton
X-100 y laureth 9. También se prefiere
particularmente el éster de polioxietilen sorbitana y el monooleato
de polioxietilen sorbitana (Tween 80^{TM}).
Los polioxietilen éteres adecuados adicionales
de la fórmula general (I) se seleccionan a partir del siguiente
grupo: polioxietilen-8-estearil
éter, polioxietilen-4-lauriléter,
polioxietilen-35-lauriléter, y
polioxietilen-23-lauriléter.
Denominaciones o nombres alternativos para el
polioxietilen lauriléter se describen en el registro CAS. El número
de registro CAS de polioxietilen-9 lauril éter es:
9002-92-0. Los polioxietilen éteres
tales como polioxietilen lauriléter se describen en el Merck index
(12ª ed: Entrada 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Stación,
N.J., EE. UU.; ISBN 0911910-12-3).
El Laureth 9 se forma haciendo reaccionar óxido de etileno con
alcohol de dodecilo, y tiene una media de nueve unidades de óxido
de etileno.
Dos o más tensioactivos no iónicos de los
diferentes grupos de tensioactivos que se describen pueden estar
presentes en la formulación de vacuna que se describe en el presente
documento. En particular, se prefiere una combinación de un éster
de polioxietilen sorbitana tal como monooleato de polioxietilen
sorbitana (Tween 80^{TM}) y un octoxinol tal como
t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton)
X-100^{TM}. Otra combinación particularmente
preferida de tensioactivos no iónicos comprende laureth 9 más un
éster de polioxietilen sorbitana o un octoxinol o ambos.
Los tensioactivos no iónicos tales como los que
se describen anteriormente tienen las concentraciones preferidas en
la composición de la vacuna final siguientes: ésteres de
polioxietilen sorbitana tales como Tween 80^{TM}: 0,01 a 1%, lo
más preferiblemente aproximadamente 0,1% (p/v); octil- o nonilfenoxi
polioxietanoles tales como Triton X-100^{TM} u
otros detergentes de la serie Triton: 0,001 a 0,1%, lo más
preferiblemente 0,005 a 0,02% (p/v); polioxietilen éteres de
fórmula general (I) tal como laureth 9: 0,1 a 20%, preferiblemente
0,1 a 10% y lo más preferiblemente 0,1 a 1% o aproximadamente 0,5%
(p/v).
Para ciertas formulaciones de vacuna, pueden
incluirse otros componentes de vacunas en la formulación. Así, las
formulaciones de la presente invención también pueden comprender un
ácido biliar o un derivado de los mismos, en particular en forma de
una sal. Estos incluyen derivados de ácido cólico y sus sales, en
particular sales sódicas de ácido cólico o de derivados de ácido
cólico. Los ejemplos de ácidos biliares y sus derivados incluyen
ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido
litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y
derivados tales como derivados gluco, tauro,
amidopropil-1-propanosulfónico,
amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico
de los ácidos biliares mencionados anteriormente, o
N,N-bis
3D-gluconoamidopropil)desoxicolamida. Un
ejemplo particularmente preferido es desoxicolato sódico (NaDOC)
que puede estar presente en la dosis de la vacuna
final.
final.
También la invención proporciona kits
farmacéuticos que comprenden un dispositivo de administración de
vacuna cargado con una vacuna de acuerdo con la invención. Dichos
dispositivos de administración incluyen, pero sin limitación,
dispositivos con agujas, dispositivos jet para líquidos,
dispositivos para polvo, y dispositivos de spray (para uso
intranasal).
Las preparaciones de antígenos de virus de la
gripe de acuerdo con la invención pueden derivarse a partir del
procedimiento convencional de huevo embrionario, o pueden derivarse
mediante cualquiera de la nueva generación de procedimientos usando
cultivo tisular para cultivar el virus o expresar antígenos
superficiales del virus de la gripe recombinantes. Los sustratos de
células adecuados para cultivar los virus incluyen por ejemplo
células renales de perro tales como MDCK o células de un clon de
MDCK, células de tipo MDCK, células renales de mono tales como
células AGMK que incluyen células Vero, líneas celulares de cerdo
adecuadas, o cualquier otro tipo celular de mamífero adecuado para
la producción de virus de la gripe para vacunas. Los sustratos
celulares adecuados también incluyen células humanas por ejemplo
células MRC-5. Los sustratos celulares adecuados no
se limitan a líneas celulares; se incluyen también por ejemplo
células primarias tales como fibroblastos embrionarios de
pollo.
La preparación del antígeno de virus de la gripe
puede producirse mediante un número de procedimientos aplicables
comercialmente, por ejemplo el procesamiento de virus de la gripe
fraccionados que se describe en las patentes n.º DD 300 833 y DD
211 444. Tradicionalmente, los virus de la gripe fraccionados se
producían usando un tratamiento con disolvente/detergente, tal como
fosfato de tri-n-butilo, o
dietiléter combinados con Tween^{TM} (conocido como
fraccionamiento con "Tween-éter") y este procedimiento se usa
todavía en algunas plantas de producción. Otros agentes de
fraccionamiento de virus que se emplean actualmente incluyen
detergentes o enzimas proteolíticas o sales biliares, por ejemplo
desoxicolato sódico tal como se describe en la patente n.º DD 155
875. Los detergentes que pueden usarse como agentes de
fraccionamiento de virus incluyen detergentes catiónicos por ejemplo
bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB), otros detergentes iónicos
por ejemplo laurilsulfato, taurodesoxicolato, o detergentes no
iónicos tales como los que se describen anteriormente que incluyen
Triton X-100 (por ejemplo en un procedimiento que
se describe en Lina y cols, 2000, Biologicals 28,
95-103) y Triton N-101, o
combinaciones de cualesquiera dos o más
detergentes.
detergentes.
El procedimiento de preparación para una vacuna
con virus fraccionados incluirá un número de diferentes incluirá un
número de diferentes etapas de filtración y/o otras de separación
tales como ultracentrifugación, ultrafiltración, centrifugación
zonal y cromatografía (por ejemplo por intercambio iónico) en una
variedad de combinaciones, y opcionalmente una etapa de
inactivación por ejemplo con calor, formaldehído o
\beta-propiolactona o U.V. que puede realizarse
antes o después del fraccionamiento. El procedimiento de
fraccionamiento puede realizarse en un proceso discontinuo,
continuo o semicontinuo.
Las preparaciones preferidas de antígenos en
vacunas de la gripe con virus fraccionados de acuerdo con la
invención comprenden una cantidad residual de Tween 80 y/o Triton
X-100 que queda del proceso de producción, aunque
estos pueden añadirse o ajustar sus concentraciones después de
preparar el antígeno de virus fraccionados. Preferiblemente están
presentes tanto Tween 80 como Triton X-100. Los
intervalos preferidos para las concentraciones finales de estos
tensioactivos no iónicos en las dosis de vacuna son:
Tween 80: 0,01 a 1%, más preferiblemente
aproximadamente 0,1% (v/v)
Triton X-100: 0,001 a 0,1 (%
p/v), más preferiblemente 0,005 a 0,02% (p/v).
\global\parskip0.920000\baselineskip
De forma alternativa, las preparaciones de
antígenos de virus de la gripe de acuerdo con la invención pueden
derivarse a partir de una fuente distinta del virus de la gripe
vivo, por ejemplo el antígeno de hemaglutinina puede producirse de
forma recombinante.
La invención se describirá ahora adicionalmente
en los siguientes ejemplos no limitantes.
Se preparó una vacuna monovalente con virus
fraccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento.
El día de la inoculación de los huevos con
embriones se prepara un inóculo reciente mezclando el lote de
siembra de trabajo con una solución salina tamponada con fosfato
que contiene sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a
25 \mug/ml. (dependiendo de la cepa de virus). El inóculo vírico
se mantiene a 2-8ºC.
Se usan huevos con embriones de nueve a once
días para la replicación vírica. Se descontaminan las cáscaras. Los
huevos se inoculan con 0,2 ml del inóculo vírico. Los huevos
inoculados se incuban a la temperatura apropiada (dependiendo de la
cepa de virus) de 48 a 96 horas. Al final del periodo de incubación,
los embriones se sacrifican enfriando y los huevos se almacenan
durante 12-60 horas a 2-8ºC.
Se recolecta el líquido alantoico de los huevos
con embriones enfriados. Habitualmente, se recoge de 8 a 10 ml de
líquido alantoico en bruto por huevo.
El líquido alantoico recolectado se aclara
mediante centrifugado a velocidad moderada (intervalo:
4000-14000 g).
Para obtener un gel de CaHPO_{4} en la mezcla
de virus aclarada, se añaden soluciones de 0,5 mol/l de
Na_{2}HPO_{4} y 0,5 mol/l de CaCl_{2} para alcanzar una
concentración final de CaHPO_{4} de 1,5 g a 3,5 g de
CaHPO_{4}/litro dependiendo de la cepa de virus.
Después de sedimentar durante otras 8 horas, se
elimina el sobrenadante y el sedimento que contiene el virus de la
gripe se vuelve a solubilizar mediante la adición de una solución de
0,26 mol/l de EDTA-Na_{2}, dependiendo de la
cantidad de CaHPO_{4} utilizada.
El sedimento resuspendido se filtra en una
membrana de filtro de 6 \mum.
El virus de la gripe se concentra mediante
centrifugado isopínico en un gradiente lineal de sacarosa (0,55 %
(p/v)) que contiene 100 \mug/ml de tiomersal. El caudal es de
8-15 litros/hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro):
- fracción 1: 55-52% de
sacarosa
- fracción 2: aproximadamente
52-38% de sacarosa
- fracción 3: 38-20% de
sacarosa*
- fracción 4: 20-0% de
sacarosa
* dependiendo de la cepa de virus: la fracción 3
puede reducirse a 15% de sacarosa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para la posterior preparación de la vacuna, sólo
se usan las fracciones 2 y 3.
La fracción 3 se lava mediante diafiltración con
tampón fosfato para reducir el contenido en sacarosa a
aproximadamente menos del 6%. El virus de la gripe presente en esta
fracción diluida se sedimenta para eliminar los contaminantes
solubles.
El sedimento se vuelve a suspender y se mezcla
cuidadosamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2
y el sedimento resuspendido de la fracción 3 se juntan y se añade
tampón fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40
litros. Este producto es el concentrado de virus enteros
monovalente.
El concentrado de virus enteros monovalente se
aplica a una ultracentrifugadora ENI-Mark II. El
rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v))
sobre el que además se impone un gradiente de desoxicolato sódico.
El Tween 80 está presente durante el fraccionamiento de los virus
hasta 0,1% (p/v) y se añade succinato de tocoferol para los virus
de la cepa B hasta 0,5 mM. La concentración máxima de desoxicolato
sódico es de 0,7-1,5% (p/v) y depende de la cepa.
El caudal es 8-15 litros/ hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en tres fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para el
procesamiento posterior. El contenido en sacarosa para los límites
de las fracciones (47-18%) varía dependiendo de las
cepas y se fija después de la evaluación:
La fracción de virus fraccionados se filtra
sobre membranas de filtro terminando con una membrana de 0,2 \mum.
Para la dilución se usa tampón fosfato que contiene 0,025% (p/v) de
Tween 80 y (para los virus de la cepa B) succinato de tocoferol 0,5
mM. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen
original de la fracción.
El material monovalente filtrado se incuba a 22
\pm 2ºC durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas
de virus, esta incubación puede ser menor). Después se añade tampón
fosfato que contiene 0,025% (p/v) de Tween 80 para reducir el
contenido total en proteína hasta un max. de 250 \mug/ml. Para los
virus de la cepa B, se aplica una solución salina tamponada con
fosfato que contiene 0,025% (p/v) Tween 80 y succinato de tocoferol
0,25 mM para diluir y reducir el contenido en proteína total hasta
250 \mug/ml. Se añade formaldehído a una concentración final
de
50 \mug/ml y la inactivación se produce a 20ºC \pm 2ºC durante al menos 72 horas.
50 \mug/ml y la inactivación se produce a 20ºC \pm 2ºC durante al menos 72 horas.
El material de virus fraccionado inactivado se
concentra al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltración,
provista con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 kDa. El
material posteriormente se lava con tampón fosfato que contiene
0,025% (p/v) de Tween 80 y después con solución salina tamponada con
fosfato que contiene
0,01% (p/v) de Tween. Para los virus de la cepa B, se usa una solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de tocoferol 0,1 mM para lavar.
0,01% (p/v) de Tween. Para los virus de la cepa B, se usa una solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de tocoferol 0,1 mM para lavar.
El material después de la ultrafiltración se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana
de
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y (para los virus de la cepa B) succinato de tocoferol 0,1 mM.
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y (para los virus de la cepa B) succinato de tocoferol 0,1 mM.
La vacuna monovalente final se almacena a
2-8ºC durante un máximo de 18 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se produjeron vacunas monovalentes finales de
tres cepas, A/New Caldonia/20/99 (H1N1) NR-116,
A/Panama/
2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166/98 de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 1.
2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166/98 de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 1.
Se agrupó la cantidad apropiada de vacunas
monovalentes finales a una concentración final de HA de 30 \mug/ml
para A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116,
A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17, respectivamente y
de 39 \mug/ml para B/ Yamanashi/166/98. Se ajustaron Tween 80 y
Triton X-100 a 580 \mug/ml y 90 \mug/ml,
respectivamente. El volumen final se ajustó a 3 1 con solución
salina tamponada con fosfato. La agrupación trivalente se filtró
terminando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 \mum
obteniendo la agrupación trivalente final. La agrupación trivalente
final se introdujo en jeringuillas con al menos 0,5 ml en cada
una.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubren placas de vidrio
(12,4-10,0 cm) con un gel de agarosa que contiene
una concentración de suero contra HA de la gripe que recomienda
NIBSC. Después de que el gel se haya gelificado, se troquelan 72
pocillos de muestras (3 mm \diameter) en la agarosa. Se cargan 10
microlitros de las diluciones de referencia apropiadas y la muestra
en los pocillos. Las placas se incuban durante 24 horas a
temperatura ambiente (20 a 25ºC) en una cámara húmeda. Después de
eso, las placas se ponen a remojo toda la noche con solución de NaCl
y se lavan brevemente en agua destilada. El gel después se prensa y
se seca. Cuando se ha secado completamente, las placas se tiñen con
solución azul brillante de Coomassie durante 10 minutos y se
destiñen dos veces en una mezcla de metanol y ácido acético hasta
que se vuelven visibles zonas teñidas claramente definidas. Después
de secar las placas, se mide el diámetro de las zonas teñidas que
rodean los pocillos de antígeno en dos direcciones en ángulos
rectos. De forma alternativa, puede usarse un equipo alternativo
para medir la superficie. Se construyen curvas de diluciones de
antígenos y superficie en función de la dosis y los resultados se
calculan de acuerdo con procedimientos de ensayo de pendiente y
relación estándar (Finney, D.J. (1952). Statistical Methods in
Biological Assay. Londres: Griffin, Citado en: Wood, JM, y cols
(1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).
Se usan jeringuillas obtenidas tal como se
describe en el Ejemplo 2 para las pruebas clínicas
H3N2: A/Panama/2007/99
RESVIR-17
H1N1: A/New Caledonia/20/99 (H1N1)
IVR-116
B: B/Yamanashi/166/98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que la vacuna puede
ofrecer una protección equivalente a las vacunas que contienen
tiomersal como conservante.
Ejemplo
5a
Se preparó una vacuna monovalente con virus
fraccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento.
El día de la inoculación de los huevos con
embriones se prepara un inóculo reciente mezclando el lote de
siembra de trabajo con una solución salina tamponada con fosfato
que contiene sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a
25 \mug/ml. (dependiendo de la cepa de virus). El inóculo vírico
se mantiene a 2-8ºC.
Se usan huevos con embriones de nueve a once
días para la replicación vírica. Se descontaminan las cáscaras. Los
huevos se inoculan con 0,2 ml del inóculo vírico. Los 60.000 huevos
inoculados se incuban a la temperatura apropiada (dependiendo de la
cepa de virus) de 48 a 96 horas. Al final del periodo de incubación,
los embriones se sacrifican enfriando y los huevos se almacenan
durante 12-60 horas a 2-8ºC.
Se recolecta el líquido alantoico de los huevos
con embriones enfriados. Habitualmente, se recoge de 8 a 10 ml de
líquido alantoico en bruto por huevo.
El líquido alantoico recolectado se aclara
mediante centrifugado a velocidad moderada (intervalo:
4000-14000 g).
Se añade solución saturada de sulfato de amonio
a la agrupación de virus aclarada para alcanzar una concentración
final de sulfato de amonio de 0,5 mol/l. Después de sedimentar
durante al menos 1 hora, el precipitado se elimina por filtración
con filtros de profundidad (habitualmente 0,5 \mum).
La vacuna de virus enteros en bruto aclarada se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana de
esterilización validada (habitualmente 0,2 \mum).
La vacuna de virus enteros en bruto monovalente
esterilizada por filtración se concentra en un casete equipado con
una membrana MWCO BIOMAX^{TM} de 1000 kDa al menos 6 veces. La
producción concentrada se lava con solución salina tamponada con
fosfato al menos 1,8 veces.
El virus de la gripe se concentra mediante
centrifugado isopínico en un gradiente lineal de sacarosa (0,55%
(p/v)). El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro):
- fracción 1: 55-52% de
sacarosa
- fracción 2: aproximadamente
52-38% de sacarosa
- fracción 3: 38-20% de
sacarosa*
- fracción 4: 20-0% de
sacarosa
* dependiendo de la cepa de virus: la fracción 3
puede reducirse a 15% de sacarosa.
Para la preparación posterior de la vacuna, o
bien se usan solamente las fracciones 2 o se usa la fracción 2
junto con una fracción 3 más purificada.
La fracción 3 se lava mediante diafiltración con
tampón fosfato para reducir el contenido en sacarosa a
aproximadamente menos del 6%. Opcionalmente puede omitirse esta
etapa. El virus de la gripe presente en esta fracción diluida se
sedimenta para eliminar los contaminantes solubles.
El sedimento se vuelve a suspender y se mezcla
cuidadosamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2
y el sedimento resuspendido de la fracción 3 se juntan y se añade
tampón fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40
litros. Este producto es el concentrado de virus enteros
monovalente.
El concentrado de virus de la gripe enteros
monovalente se aplica a una ultracentrifugadora
ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente
lineal de sacarosa (0,55% (p/v)) sobre el que además se impone un
gradiente de desoxicolato sódico. El Tween 80 está presente durante
el fraccionamiento de los virus hasta 0,1% (p/v) y se añade
succinato de tocoferilo para los virus de la cepa B hasta 0,5 mM. La
concentración máxima de desoxicolato sódico es de
0,7-1,5% (p/v) y depende de la cepa. El caudal es de
8-15 litros/hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en tres fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para el
procesamiento posterior. El contenido en sacarosa para los límites
de las fracciones (47-18%) varía dependiendo de las
cepas y se fija después de la evaluación:
La fracción de virus fraccionados se filtra
sobre membranas de filtro terminando con una membrana de 0,2 \mum.
Para la dilución se usa tampón fosfato que contiene 0,025% (p/v) de
Tween 80 y (para las cepas B) succinato de tocoferilo 0,5 mM. El
volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen
original de la fracción.
El material monovalente se incuba a 22 \pm 2ºC
durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas de virus,
esta incubación puede ser menor). Después se añade tampón fosfato
que contiene 0,025% (p/v) de Tween 80 para reducir el contenido
total en proteína hasta un max. de 450 \mug/ml. Para las cepas B,
se aplica una solución salina tamponada con fosfato que contiene
0,025% (p/v) Tween 80 y succinato de tocoferilo 0,25 mM para diluir
y reducir el contenido en proteína total hasta 450 \mug/ml. Se
añade formaldehído a una concentración final de 100 \mug/ml y la
inactivación se produce a 20ºC \pm 2ºC durante al menos 72
horas.
El material de virus fraccionado inactivado se
concentra al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltración,
provista con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 kDa. El
material posteriormente se lava con tampón fosfato que contiene
0,025% (p/v) de Tween 80 y después con solución salina tamponada con
fosfato que contiene 0,01% (p/v) de Tween. Para las cepas B, se usa
una solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v)
de Tween 80 y succinato de tocoferilo 0,1 mM para lavar.
El material después de la ultrafiltración se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana de 0,2
\mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye
si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no
supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato
que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y específicamente para las cepas
B, succinato de tocoferilo 0,1 mM.
La vacuna monovalente final se almacena a
2-8ºC durante un máximo de 18 meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Una variación preferida del procedimiento que se
describe en el Ejemplo 5a es el siguiente:
Después de recolectar los virus enteros se
continúa con la etapa de precipitación (precipitación con sulfato
de amonio). Después se continua con la etapa de aclarado en la que
el líquido se aclara mediante centrifugado a velocidad moderada
(intervalo: 4000-14000 g). De ese modo se invierte
el orden de las etapas de precipitación y aclarado con respecto al
Ejemplo 5a.
Las etapas de esterilización por filtración,
ultrafiltración y ultracentrifugado (centrifugado con gradiente de
sacarosa) se realizan después como en el ejemplo 5a. Sin embargo, no
hay necesidad de la etapa de reprocesamiento de las fracciones
obtenidas en la etapa de ultracentrifugado.
El resto de las etapas del proceso son tal como
se describen en el Ejemplo 5a.
Así, el proceso resumido de este ejemplo es el
siguiente:
Recolección
Precipitación (sulfato de amonio)
Aclarado
Esterilización por filtración
Ultrafiltración
Ultracentrifugado
Fraccionamiento de los virus (preferiblemente
con desoxicolato sódico)
Esterilización por filtración
Inactivación
Ultrafiltración
Esterilización final por filtración
\vskip1.000000\baselineskip
Otra variación preferida del Ejemplo 5a supone
una etapa de prefiltración antes de la primera esterilización por
filtración. Esto usa una membrana que no esteriliza al filtrar pero
que permite eliminar contaminantes como la albumina antes de la
esterilización por filtración. Esto puede conseguir un mejor
rendimiento. Una membrana adecuada para la prefiltración es de
aproximadamente 0,8 \mum a aproximadamente 1,8 \mum, por
ejemplo 1,2 \mum. La etapa de prefiltración puede usarse en el
esquema de Ejemplo 5a o del Ejemplo 5b.
Se produjeron vacunas monovalentes finales de
tres cepas, A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116,
A/Panama/
2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166198 de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 5.
2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166198 de acuerdo con el procedimiento que se describe en el Ejemplo 5.
Se agrupó la cantidad apropiada de vacunas
monovalentes finales a una concentración final de HA de 30 \mug/ml
para A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116,
A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17, respectivamente y
de 36 \mug/ml para B/ Johannesburg/5/97. Se ajustaron Tween 80 y
Triton X-100 a 580 \mug/ml y 90 \mug/ml,
respectivamente. El volumen final se ajustó a 31 con solución
salina tamponada con fosfato. La agrupación trivalente se filtró
terminando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 \mum
obteniendo la agrupación trivalente final. La agrupación trivalente
final se introdujo en jeringuillas con al menos 0,5 ml en cada
una.
\vskip1.000000\baselineskip
El concentrado monovalente de virus enteros de
B/Johannesburg/5/99 se obtuvo tal como se describe en el Ejemplo
1.
El concentrado de virus de la gripe enteros
monovalente se aplica a una ultracentrifugadora
ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente
lineal de sacarosa (0,55% (p/v)) sobre el que además se impone un
gradiente de desoxicolato sódico. El Tween 80 está presente durante
el fraccionamiento de los virus hasta en un 0,1% (p/v). La
concentración máxima de desoxicolato sódico es de
0,7-1,5% (p/v) y depende de la cepa. El caudal es
de 8-15 litros/hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en tres fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para el
procesamiento posterior. El contenido en sacarosa para los límites
de las fracciones (47-18%) varía dependiendo de las
cepas y se fija después de la evaluación:
Se tomó una muestra de la fracción 2 de 10 ml
para procesamiento ulterior. La fracción de virus fraccionados se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana de 0,2
\mum. Para la dilución se usa tampón fosfato que contiene 0,025%
(p/v) de Tween 80 y (para las cepas B) lauril sulfato sódico 0,5 mM.
El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen
original de la fracción.
El material monovalente se incuba a 22 \pm 2ºC
durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas de virus,
esta incubación puede ser menor). Después se añade solución salina
tamponada con fosfato que contiene 0,025% (p/v) Tween 80 y lauril
sulfato sódico 0,5 mM para reducir el contenido en proteína total
hasta un max. de 250 \mug/ml. Se añade formaldehído a una
concentración final de 50 \mug/ml y la inactivación se produce a
20ºC \pm 2ºC durante al menos 72 horas.
El material de virus fraccionado inactivado se
concentra al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltración,
provista con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 kDa. El
material posteriormente se lava con 4 volúmenes de solución salina
tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) de Tween y lauril
sulfato sódico 0,5 mM.
El material después de la ultrafiltración se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana
de
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y lauril sulfato sódico 0,5 mM.
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y lauril sulfato sódico 0,5 mM.
La vacuna monovalente final se almacena a
2-8ºC.
El concentrado monovalente de virus enteros de
B/Yamanashi/166/98 se obtuvo tal como se describe en el Ejemplo
1.
El concentrado de virus enteros monovalente se
diluye a una concentración de proteína de 1.000 \mug/ml con
solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. Se añade Plantacare®
2000 UP o Laureth-9 a una concentración final
de
1% (p/v). El material se mezcla ligeramente durante 30 min. Después el material se cubre con un amortiguador de sacarosa del 15% (p/p) en un cubo. Se realiza un ultracentrifugado en un rotor oscilante Beckman SW 28 durante 2 horas a 25.000 rpm y 20ºC.
1% (p/v). El material se mezcla ligeramente durante 30 min. Después el material se cubre con un amortiguador de sacarosa del 15% (p/p) en un cubo. Se realiza un ultracentrifugado en un rotor oscilante Beckman SW 28 durante 2 horas a 25.000 rpm y 20ºC.
El sobrenadante se tomó para el procesamiento
posterior. La fracción de virus fraccionados se filtra sobre
membranas de filtro terminando con una membrana de 0,2 \mum.
Se añade solución salina tamponada con fosfato
si fuera necesario para reducir el contenido en proteína total
hasta un max. de 500 \mug/ml. Se añade formaldehído a una
concentración final de 100 \mug/ml y la inactivación se produce a
20ºC \pm 2ºC durante al menos 6 días.
Se ajustan Tween 80 y Triton X 100 en el
material inactivado a 0,15% y 0,02% respectivamente. El material de
virus fraccionado inactivado se concentra al menos 2 veces en una
unidad de ultrafiltración, provista con membranas de acetato de
celulosa con MWCO de 30 kDa. El material posteriormente se lava con
4 volúmenes de solución salina tamponada con fosfato.
El material después de la ultrafiltración se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana
de
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye de forma que la concentración de proteína no supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato.
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye de forma que la concentración de proteína no supere los 500 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato.
La vacuna monovalente final se almacena a
2-8ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una vacuna monovalente con virus
fraccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento.
El día de la inoculación de los huevos con
embriones se prepara un inóculo reciente mezclando el lote de
siembra de trabajo con una solución salina tamponada con fosfato
que contiene sulfato de gentamicina a 0,5 mg/ml e hidrocortisona a
25 \mug/ml. (dependiendo de la cepa de virus). El inóculo vírico
se mantiene a 2-8ºC.
Se usan huevos con embriones de nueve a once
días para la replicación vírica. Se descontaminan las cáscaras. Los
huevos se inoculan con 0,2 ml del inóculo vírico. Los huevos
inoculados se incuban a la temperatura apropiada (dependiendo de la
cepa de virus) de 48 a 96 horas. Al final del periodo de incubación,
los embriones se sacrifican enfriando y los huevos se almacenan
durante 12-60 horas a 2-8ºC.
Se recolecta el líquido alantoico de los huevos
con embriones enfriados. Habitualmente, se recoge de 8 a 10 ml de
líquido alantoico en bruto por huevo.
El líquido alantoico recolectado se aclara
mediante centrifugado a velocidad moderada (intervalo:
4000-14000 g).
Para obtener un gel de CaHPO_{4} en la mezcla
de virus aclarada, se añaden soluciones de 0,5 mol/l de
Na_{2}HPO_{4} y 0,5 mol/l de CaCl_{2} para alcanzar una
concentración final de CaHPO_{4} de 1,5 g a 3,5 g de
CaHPO_{4}/litro dependiendo de la cepa de virus.
Después de sedimentar durante otras 8 horas, se
elimina el sobrenadante y el sedimento que contiene el virus de la
gripe se vuelve a solubilizar mediante la adición de una solución de
0,26 mol/l de EDTA-Na_{2}, dependiendo de la
cantidad de CaHPO_{4} utilizada.
El sedimento resuspendido se filtra en una
membrana de filtro de 6 \mum.
El virus de la gripe se concentra mediante
centrifugado isopínico en un gradiente lineal de sacarosa (0,55%
(p/v)) que contiene 100 \mug/ml de tiomersal. El caudal es de
8-15 litros/hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro):
- fracción 1: 55-52% de
sacarosa
- fracción 2: aproximadamente
52-38% de sacarosa
- fracción 3: 38-20% de
sacarosa*
- fracción 4: 20-0% de
sacarosa
* dependiendo de la cepa de virus: la fracción 3
puede reducirse a 15% de sacarosa.
Para la posterior preparación de la vacuna, sólo
se usan las fracciones 2 y 3.
\newpage
La fracción 3 se lava mediante diafiltración con
tampón fosfato para reducir el contenido en sacarosa a
aproximadamente menos del 6%. El virus de la gripe presente en esta
fracción diluida se sedimenta para eliminar los contaminantes
solubles.
El sedimento se vuelve a suspender y se mezcla
cuidadosamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2
y el sedimento resuspendido de la fracción 3 se juntan y se añade
tampón fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40
litros, un volumen apropiado para 120.000 huevos/lote. Este producto
es el concentrado de virus enteros monovalente.
El concentrado de virus enteros monovalente se
aplica a una ultracentrifugadora ENI-Mark II. El
rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v))
sobre el que además se impone un gradiente de desoxicolato sódico.
El Tween 80 está presente durante el fraccionamiento de los virus
hasta 0,1% (p/v) y se añade succinato de tocoferol para los virus
de la cepa B hasta 0,5 mM. La concentración máxima de desoxicolato
sódico es de 0,7-1,5% (p/v) y depende de la cepa.
El caudal es de 8-15 litros/hora.
Al final del centrifugado, se recupera el
contenido del rotor en tres fracciones diferentes (la sacarosa se
mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para el
procesamiento posterior. El contenido en sacarosa para los límites
de las fracciones (47-18%) varía dependiendo de las
cepas y se fija después de la evaluación:
La fracción de virus fraccionados se filtra
sobre membranas de filtro terminando con una membrana de 0,2 \mum.
Para la dilución se usa tampón fosfato que contiene 0,025% (p/v) de
Tween 80 y (para los virus de la cepa B) succinato de tocoferol 0,5
mM. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen
original de la fracción.
El material monovalente se incuba a 22 \pm 2ºC
durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas de virus,
esta incubación puede ser menor). Después se añade tampón fosfato
que contiene 0,025% (p/v) de Tween 80 para reducir el contenido
total en proteína hasta un max. de 250 \mug/ml. Para los virus de
la cepa B, se aplica una solución salina tamponada con fosfato que
contiene 0,025% (p/v) Tween 80 y succinato de tocoferol 0,25 mM
para diluir y reducir el contenido en proteína total hasta 250
\mug/ml. Se añade formaldehído a una concentración final de 50
\mug/ml y la inactivación se produce a 20ºC \pm 2ºC durante al
menos 72 horas.
El material de virus fraccionado inactivado se
concentra al menos 2 veces en una unidad de ultrafiltración,
provista con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 kDa. El
material posteriormente se lava con tampón fosfato que contiene
0,025% (p/v) de Tween 80 y después con solución salina tamponada con
fosfato que contiene
0,01% (p/v) de Tween. Para los virus de la cepa B, se usa una solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de tocoferol 0,1 mM para lavar.
0,01% (p/v) de Tween. Para los virus de la cepa B, se usa una solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de tocoferol 0,1 mM para lavar.
El material después de la ultrafiltración se
filtra sobre membranas de filtro terminando con una membrana
de
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no supere los 1.000 \mug/ml pero la concentración de hemaglutinina supera los 180 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y (para los virus de la cepa B) succinato de tocoferol
0,1 mM.
0,2 \mum. Las membranas de filtro se enjuagan y el material se diluye si fuera necesario de tal forma que la concentración de proteína no supere los 1.000 \mug/ml pero la concentración de hemaglutinina supera los 180 \mug/ml con solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,01% (p/v) Tween 80 y (para los virus de la cepa B) succinato de tocoferol
0,1 mM.
La vacuna monovalente final se almacena a
2-8ºC durante un máximo de 18 meses.
Se produjeron vacunas monovalentes finales de
tres cepas, A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116,
A/Panama/
2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Johannesburg/5/99 de acuerdo con el procedimiento que se describe en la parte A anterior.
2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Johannesburg/5/99 de acuerdo con el procedimiento que se describe en la parte A anterior.
Se agrupó la cantidad apropiada de vacunas
monovalentes finales a una concentración final de HA de 60 \mug/ml
para A/New Caldonia/20/99 (H1N1) IVR-116,
A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17, respectivamente y
de 68 \mug/ml para B/ Johannesburg/5/99. Se ajustaron Tween 80,
Triton X-100 y succinato de tocoferol a 1.000
\mug/ml, 110 \mug/ml y 160 \mug/ml, respectivamente. El
volumen final se ajustó a 31 con solución salina tamponada con
fosfato. La agrupación trivalente se filtró terminando con una
membrana de acetato de celulosa de 0,8 \mum obteniendo la
agrupación trivalente final. La agrupación trivalente final se
introdujo en jeringuillas con al menos 0,165 ml en cada una.
La vacuna se proporcionó en jeringuillas
previamente cargadas y se administró por vía intradérmica en la
región del deltoides. La aguja intradérmica (ID) era tal como se
describe en el documento EP 1092444, con un limitador de la
penetración en la piel para asegurar una inyección intradérmica
adecuada. Dado que la formación de una pápula en el sitio de la
inyección demuestra la buena calidad de la administración ID, el
investigador con el sujeto midió el tamaño exacto de la pápula 30
minutos después de vacunación.
Una dosis (100 \mul) contenía los siguientes
componentes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
B La vacuna anterior se comparó con una vacuna
trivalente estándar con virus de la gripe fraccionados:
Fluarix^{TM}. La vacuna Fluarix se proporcionó en jeringuillas
previamente cargadas y se administró por vía intramuscular en el
músculo deltoides. Se usó una aguja de al menos 2,5 cm/1 pulgada de
longitud (calibre 23) para asegurar una inyección intramuscular
adecuada.
Una dosis (0,5 ml) contenía los siguientes
componentes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La edad media de la cohorte total en el momento
de la administración de la vacuna era de 70,4 \pm 6,2 años de
Desviación típica (D.T.), la proporción entre mujeres y hombres era
de 1,7:1.
\vskip1.000000\baselineskip
El dolor en la zona de inyección, referido por
10/65 (15,4%) de personas vacunadas, fue el síntoma más común tras
la administración IM de Fluarix^{TM}. En el grupo de ID, se
refirió dolor en 3/65 (4,6%) de los vacunados. Esta diferencia era
estadísticamente significativa (p=0,038; prueba exacta de Fisher).
Por consiguiente, se prefiere la administración ID de un producto
con tiomersal reducido.
Tanto la administración ID como IM de una vacuna
de la gripe con menos tio en una población de personas mayores
puede proporcionar una seroprotección del 100%.
Se encontró una respuesta comparable a la
vacunación en términos de medias geométricas de las valoraciones,
tasas de seroprotección, tasas de seroconversión y factores
conversión en los individuos vacunados IM e ID donde el grupo de ID
recibió 2,5 veces menos antígeno. No se encontraron diferencias
discernibles en la incidencia global de los síntomas sistémicos
cuestionados/no cuestionados relacionados con la vacuna en los dos
grupos de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la capacidad inmunógena de la vacuna
con virus fraccionados de la gripe con tiomersal reducido preparada
tal como se describe en el Ejemplo 9 (excepto que la agrupación se
realizó de forma independiente y la vacuna no se introdujo en
jeringuillas) mediante administración ID en cobayas usando una aguja
estándar.
Se expuso a grupos de 5 animales por vía
intranasal a virus de la gripe inactivado trivalente que contenía 5
\mug de cada HA en un volumen total de 200 \mul. Veintiocho días
después de la exposición, se vacunó a los animales o por vía
intradérmica o intramuscular. Las dosis intradérmicas que contenían
0,1, 0,3, o 1,0 \mug de vacuna de virus de la gripe fraccionados
trivalente con tiomersal reducido en 0,1 ml se administraron en la
espalda de la cobaya usando una aguja estándar. Se administró una
dosis intramuscular de 1,0 \mug de vacuna de virus de la gripe
fraccionados trivalente con tiomersal reducido en la pata trasera de
las cobayas en un volumen de 0,1 ml. Los grupos experimentales eran
los siguientes:
\bullet Grupo 1-0,1 \mug
virus de la gripe fraccionados trivalente con tiomersal reducido
ID;
\bullet Grupo 2-0,3 \mug
virus de la gripe fraccionados trivalente con tiomersal reducido
ID;
\bullet Grupo 3-1,0 \mug
virus de la gripe fraccionados trivalente con tiomersal reducido
ID
\bullet Grupo 4-1,0 \mug
virus de la gripe fraccionados trivalente con tiomersal reducido
IM
\vskip1.000000\baselineskip
Catorce días después de la vacunación, se
extrajo la sangre de los animals y se analizaron las valoraciones
de anticuerpos inducidas por la vacunación usando un ensayo estándar
de inhibición de hemaglutinina (HI). Los resultados se muestran en
la Figura 1. La vacunación indujo respuestas potentes de HI contra
las tres cepas. No se observó una respuesta clara lo que sugiere
que las dosis muy bajas de antígeno con tiomersal reducido todavía
pueden inducir respuestas de anticuerpos HI muy potentes cuando se
administran por vía ID. No había diferencias significativas entre
las valoraciones de HI inducidas por la vacunación ID o IM. Así,
los resultados obtenidos en cobayas confirmaron que los antígenos de
la gripe virus fraccionados con tiomersal reducido trivalente
induce niveles similares de anticuerpos HI en los animales cuando se
administran por vía ID comparada con la vía IM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunó a cobayas el día 0 con 5 \mug de
virus de la gripe inactivado entero trivalente en 200 \mul, por
vía intranasal.
Vacunación - día 28 - Vacuna que contenía 0,1
\mug de HA por cepa de virus de la gripe fraccionados trivalente
preparada tal como se describe en el Ejemplo 9 (a excepción de que
la etapa de agrupamiento produjo una concentración final de cada
antígeno de 1,0 \mug/ml proporcionando una dosis de 0,1 \mug en
100 \mul comparada con 60 \mug/ml en el Ejemplo 9). La
formulación trivalente final se administró por vía intradérmica
usando jeringuillas de tuberculina, o bien con adyuvante o sin
adyuvante, en 100 \mul.
Sangrado - día 42.
El efecto del adyuvante se evaluó midiendo las
respuestas por ensayo de HI (día 0, 28, 42).
Todos los experimentos ID se realizaron usando
una aguja estándar.
G1-G5 se refieren a 5 grupos de
cobayas, 5 por grupo.
G1 virus fraccionados trivalente con tiomersal
reducido 0,1 \mug
G2 virus fraccionados trivalente tio red 0,1
\mug + 3D-MPL 50 \mug
G3 virus fraccionados trivalente tio red 0,1
\mug + 3D-MPL 10 \mug
G4 virus fraccionados trivalente tio red 0,1
\mug + 3D-MPLin 50 \mug + QS21 50 \mug
G5 virus fraccionados trivalente tio red 0,1
\mug + 3D-MPLin 10 \mug + QS21 10 \mug
\vskip1.000000\baselineskip
Obsérvese que 3D-MPLin + QS21 se
refiere a una formulación de adyuvante que comprende una vesícula
unilaminar que comprende colesterol, que tiene una bicapa lipídica
que comprende dioleoil fosfatidilcolina, en la que el QS21 y el
3D-MPL están asociados o embebidos en la bicapa
lipídica. Dichas formulaciones de adyuvante se describen en el
documento EP 0 822 831 B.
\vskip1.000000\baselineskip
Valoraciones de HI contra A/New
Caledonia/20/99
\vskip1.000000\baselineskip
Valoraciones de HI contra
A/Panama/2007/99
\vskip1.000000\baselineskip
Valoraciones de HI contra
B/Johannesburg/5/99
Así, ya sea con adyuvante o sin adyuvante el
antígeno de virus de la gripe fraccionado con tiomersal reducido
trivalente es un inmunógeno potente y es capaz de inducir fuertes
respuestas de HI cuando se administra por vía ID o IM. Estas
respuestas parecen ser al menos tan potentes como las respuestas
inducidas por la preparación de Fluarix estándar.
Para evaluar la capacidad inmunógena de la
vacuna con virus de la gripe fraccionados (con y sin tiomersal)
administrada por vía ID, se usó el modelo de cerdo expuesto. Dado
que la gran mayoría de la población ha experimentado al menos una
infección de gripe, una vacuna de la gripe debe ser capaz de
reforzar una respuesta inmunitaria preexistente. Por lo tanto se
expone a los animales en un esfuerzo por simular lo mejor posible la
situación en seres humanos.
En este experimento, se expuso a cerdos de 4
semanas de edad por vía intranasal. Se expuso a seis grupos de
cinco animales cada uno de la forma siguiente:
Grupo 1 - dos exposiciones de virus entero
inactivado trivalente (50 \mug de cada HA) los días 0 y 14;
Grupo
2 - dos exposiciones de virus entero inactivado trivalente (50 \mug de cada HA) los días 0 y 14; Grupo 3 - una única exposición con virus entero inactivado trivalente (50 \mug de cada HA) el día 0; Grupo 4 - dos exposiciones de virus entero inactivado trivalente (25 \mug de cada HA) los días 0 y 14; Grupo 5 - una única exposición de virus entero inactivado trivalente (25 \mug de cada HA) el día 0; Grupo 6 - dos exposiciones de virus entero inactivado trivalente (12,5 \mug de cada HA) los días 0 y 14.
2 - dos exposiciones de virus entero inactivado trivalente (50 \mug de cada HA) los días 0 y 14; Grupo 3 - una única exposición con virus entero inactivado trivalente (50 \mug de cada HA) el día 0; Grupo 4 - dos exposiciones de virus entero inactivado trivalente (25 \mug de cada HA) los días 0 y 14; Grupo 5 - una única exposición de virus entero inactivado trivalente (25 \mug de cada HA) el día 0; Grupo 6 - dos exposiciones de virus entero inactivado trivalente (12,5 \mug de cada HA) los días 0 y 14.
El día 28 después de la exposición final, se
vacuno a los animales con 3 \mug de cada antígeno de HA de virus
fraccionados trivalente (cepas A/New Caledonia H1N1, A/Panama H3N2,
y B/Johannesburg) en 100 por vía ID. El Grupo 1 recibió
Fluarix^{TM} estándar que contiene el conservante tiomersal como
antígeno de vacuna. Todos los otros grupos recibieron el antígeno
sin conservantes.
Los resultados de HI obtenidos en este
experimento se muestran en la Figura 2 (Valoraciones de la
inhibición contra la hemagulinina de la gripe inducidas en cerdos
expuestos a una variedad de dosis de antígenos y vacunados con 3
microgramos de antígeno de la gripe trivalente con o sin tiomersal
por vía intradérmica).
Se inducen valoraciones relativamente bajas de
HI contra la cepa B en este experimento y el ruido de fondo contra
la cepa A/H3N2 es alto. Se observa un efecto beneficioso en términos
de respuesta a la vacunación cuando se reduce la dosis de
exposición. En casi todos los casos, la reducción en la
concentración de antígeno o en el número de dosis de exposición (de
las dos exposiciones con 50 \mug) provocó una mayor respuesta a
la vacunación. Aunque la respuesta de los animales de los Grupos 1 y
2, que se cebaron dos veces con 50 \mug, a la vacunación no es
tan evidente, parece que el antígeno sin conservantes (Grupo 2)
funciona al menos igual de bien que Fluarix^{TM} (Grupo 1) en
estas condiciones. Queda clara una fuerte respuesta a la vacunación
con antígeno de la gripe trivalente sin conservantes administrada
por vía ID en los animales cebados de forma alternativa (Grupos
3-6) y esta respuesta se observa incluso en la cepa
B, aunque las valoraciones de HI permanecen bajas.
Claims (20)
1. Una preparación de virus de la gripe
inactivado que comprende un antígeno de hemaglutinina (HA)
estabilizado en ausencia de tiomersal, o a niveles de tiomersal de
5 \mug/ml o menor, en la que la hemaglutinina puede detectarse
mediante un ensayo de SRD, y en la que la preparación comprende
succinato de \alpha-tocoferol en una cantidad
suficiente para estabilizar la HA.
2. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el
succinato de \alpha-tocoferol está presente a una
concentración de entre 1 \mug/ml y 10 mg/ml.
3. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el
succinato de \alpha-tocoferol está presente a una
concentración entre 10 y 500 \mug/ml.
4. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, en la que la preparación del antígeno de virus de la gripe se
selecciona a partir del grupo constituido por preparaciones de
antígeno de virus fraccionados, antígenos en subunidades, virus
enteros inactivados químicamente o de otro modo.
5. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la
preparación de antígenos de la gripe es una preparación de
antígenos de virus fraccionados.
6. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 5 que comprende hemaglutinina de cepa A y B.
7. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con la reivindicación 6 que es una preparación
de virus de la gripe trivalente.
8. La preparación de virus de la gripe
inactivado de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que
comprende HA de la cepa B de la gripe estabilizada.
9. Una vacuna de la gripe que comprende la
preparación de virus de la gripe de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8.
10. La vacuna de la gripe de acuerdo con la
reivindicación 9, en la que la concentración de antígeno de
hemaglutinina para la o para cada cepa de gripe es
1-1000 \mug por ml, medida mediante un ensayo de
SRD.
11. Una vacuna de la gripe de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, que además comprende una emulsión de aceite
en agua.
12. Una vacuna de la gripe de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, que además comprende un adyuvante.
13. Una vacuna de la gripe de acuerdo con la
reivindicación 12, en la que dicho adyuvante se selecciona a partir
del grupo constituido por un derivado no tóxico de lípido A, una
saponina o su derivado, una combinación de un derivado de lípido A
no tóxico y una saponina o su derivado en una emulsión de aceite en
agua.
14. Una vacuna de la gripe de acuerdo con la
reivindicación 13, en la que dicho derivado no tóxico de lípido A
es 3D-MPL.
15. Una vacuna de la gripe de acuerdo con la
reivindicación 14, en la que 3D-MPL está en forma de
una emulsión que tiene un tamaño de partícula pequeño inferior a
0,2 \mum de diámetro.
16. Un procedimiento para preparar un antígeno
de hemaglutinina estable, comprendiendo el procedimiento purificar
el antígeno en presencia de \alpha-tocoferol o un
derivado del mismo tal como succinato de
\alpha-tocoferol.
17. El uso de una preparación de virus de la
gripe inactivado en la fabricación de una vacuna tal como se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15 para la
profilaxis de infección o enfermedad de la gripe en un sujeto.
18. El uso de acuerdo con la reivindicación 17,
en el que la administración de la vacuna es intradérmica,
intranasal, intramuscular, oral o subcutánea.
19. Uso de succinato de
\alpha-tocoferol como estabilizante de la
hemaglutinina en la fabricación de una vacuna de la gripe.
20. Una vacuna de la gripe tal como se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, para
usar en medicina.
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