MXPA03010944A - Composicion de vacuna de la influenza. - Google Patents

Abstract

Se describe una preparacion de virus de la influenza inactivado que comprende un antigeno de hemaglutinina estabilizado en ausencia de tiomersal, o a bajos niveles de tiomersal, en la que la hemaglutinina es detectable por un ensayo de SRb. La preparacion del virus de la Influenza puede comprender un excipiente modificador de micelas, por ejemplo, a-tocoferol o un derivado del mismo, en una cantidad suficiente para estabilizar la hemaglutinina.

Description

COMPOSICION DE VACUNA DE LA INFLUENZA Esta invención se refiere a nuevas preparaciones de antígeno del virus de la influenza, a métodos para su preparación y a su uso en profilaxis o terapia. En particular, la invención se refiere a vacunas de la influenza inactivadas que son vacunas del virus fragmentado en lugar del virus entero y que son estables en ausencia de conservadores organomercuriales. Además, las vacunas contienen hemaglutinina, que es estable según ensayos convencionales, las vacunas pueden administrarse por cualquier vía adecuada para tales vacunas, tal como la vía intramuscular, subcutánea, intradérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal. El virus de la influenza es uno de los virus más ubicuos en el mundo, afectando tanto a los seres humanos como a las aves de corral. El impacto económico de la influenza es significativo. El virus de la influenza es un virus envuelto de ARN con un tamaño de partículas de aproximadamente 125 nm de diámetro. Consta básicamente de una nucleocápsida interna o núcleo de ácido ribonucleico (ARN) asociado con una nucleoproteína, rodeado por una envoltura viral con una estructura de bicapa lipídica y glicoproteínas externas. La capa interna de la envoltura viral se compone predominantemente de proteínas de matriz y la capa externa consta principalmente de un material lipídico procedente del hospedador. Las glicoproteínas superficiales neuraminidasa (NA) y hemaglutinina (HA) aparecen como espigas, de 10 a 12 nanómetros de longitud, en la superficie de las partículas. Son estas proteínas de superficie, particularmente la hemaglutinina, las que determinan la especificidad antigénica de los subtipos de influenza. Las vacunas de la influenza disponibles actualmente son vacunas de la influenza inactivadas o vivas atenuadas. Las vacunas de la gripe inactivadas se componen de tres formas posibles de preparación de antígeno: virus enteros inactivadas, subviriones en los que las partículas víricas purificadas se han fragmentado con detergentes u otros reactives para solubilizar la envoltura lipídica (denominada vacuna de "división") o HA y NA purificadas (vacuna de subunidad). Estas vacunas inactivadas se administran por vía intramuscular (i.m.) o intranasal (i.n.). En el mercado no están disponibles vacunas atenuadas vivas. Las vacunas de la influenza, de todos los tipos, normalmente son vacunas trivalentes. Generalmente contienen antígenos derivados de dos cepas de virus de influenza A y una cepa de virus de influenza B. En la mayoría de los casos, una dosis inyectable de 0,5 mi convencional contiene 15 µg del componente antigénico hemaglutinina de cada cepa, coma se mide por inmunodifusión radial individual (SRD) (J.M. Wood y col.: una técnica de inmunodifusión radial individual mejorada para el ensayo del antígeno hemaglutinina de influenza: adaptación para la determinación de la potencia de vacunas de virus enteros inactivados y de subunidad). J. Biol. Stand. 5(1997) 237-247; J. M. Wood y col., Estudio de colaboración internacional de técnicas de difusión radial individual e inmunoelectroforesis para el ensayo del antígeno hemaglutinina del virus de la influenza), J. Blof. Stand. 9 (1981) 317-330). La cepas del virus de la influenza a incorporar en la vacuna de la influenza cada estación se determinan por la Organización Mundial de le Salud en colaboración con las autoridades sanitarias nacionales y los fabricantes de vacunas. Las epidemias típicas de influenza aumentan la incidencia de neumonía y de enfermedades respiratorias inferiores como se demuestra por las mayores tasas de hospitalización o mortalidad. Las personas de edad avanzada o las que tienen una enfermedad crónica subyacente tienen una mayor probabilidad de experimentar tales complicaciones, pero en los niños pequeños la enfermedad también puede ser grave. Por lo tanto, es necesario proteger a estos grupos en particular. Los esfuerzos actuales para controlar la morbididad y la mortalidad asociadas con epidemias anuales de influenza se basan en el uso de vacunas de influenza inactivadas administradas por vía intramuscular. La eficacia de tales vacunas para prevenir enfermedades respiratorias y complicaciones de influenza varia del 75% en adultos sanos a menos del 50% en personas de edad avanzada. Se aplican patrones internacionalmente para medir la eficacia de las vacunas de la influenza. Los criterios oficiales de la Unión Europea para una vacuna eficaz contra la influenza se indican en la siguiente tabla. Teóricamente, para satisfacer los requisitos de la Unión Europea, una vacuna de la influenza tiene que cumplir sólo uno de los criterios de la tabla, para todas las cepas de influenza incluidas en la vacuna. Sin embargo, en la práctica, será necesario cumplir al menos dos o los tres criterios para todas las cepas, particularmente para una nueva vacuna tal como una nueva vacuna que se va a administrar por una vía diferente. En algunas circunstancias, pueden ser suficientes dos criterios. Por ejemplo, puede ser aceptable que todas las cepas cumplan das de los tres criterios, mientras que el tercer criterio se cumple por algunas pero no todas las cepas (por ejemplo dos de tres cepas). Los requisitos son diferentes para poblaciones de adultos 18-60 años poblaciones de edad avanzada (>60 años).

* El porcentaje de seroconversión se define como el porcentaje de individuos vacunados que tienen al menos un aumento de cuatro veces en las titulaciones de Inhibición de hemaglutinina (Hl) en suero después de la vacunación, para cada copa de vacuna. * El factor de conversión se define cómo el aumento en veces en las titulaciones medias geométricas (GMT) de Hl en suero después de la vacunación, para cada cepa de vacuna.

*** El porcentaje de protección se define como el porcentaje de individuos vacunados con una titulación de Hl en suero igual o mayor de 1:40 después de la vacunación (para cada cepa de vacuna) y normalmente se acepta como una indicación de protección. Para que una nueva vacuna de la gripe sea comercialmente útil, no sólo necesitará . cumplir estas normas, sino que, en la práctica, necesitará ser al menos tan eficaz corno las vacunas inyectables disponibles actualmente. También necesitará ser comercialmente viable en términos de la cantidad de antígeno y del número de administraciones requeridas. Las vacunas de la influenza disponibles en el mercado actualmente son vacunas inyectables de división o de subunidad. Estas vacunas se preparan rompiendo la partícula vírica, generalmente con un disolvente orgánico o un detergente, y separando o purificando las proteínas virales en diferentes grados. Las vacunas de división se preparan por fragmentación del virus de la influenza entero, infeccioso o inactivado, con concentraciones solubilizantes de disolventes orgánicos o detergentes, y la posterior eliminación del agente de solubilización y algunos o la mayor parte del material lipídico viral. Las vacunas de división generalmente contienen como contaminantes proteína de matriz y nucleoproteína, y algunas veces lípidos, así como proteínas de membrana de la envoltura. Las vacunas de división normalmente contendrán la mayor parte o todas las proteínas estructurales del virus, aunque no necesariamente en las mismas proporciones en las que aparecen en el virus entero. Por otra parte, las vacunas de subunidad constan esencialmente de proteínas de la superficie viral muy purificadas, hemaglutinina y neuraminidasa, que son las proteínas de superficie responsables de la inducción de los anticuerpos neutralizadores de virus deseados tras la vacunación. Muchas vacunas que están disponibles actualmente requieren un conservador para impedir el deterioro. Un conservador usado con frecuencia es timerosai, que es un compuesto que contiene mercurio. Se han expresado algunas preocupaciones públicas acerca de los efectos de los compuestos que contienen mercurio. No se ha establecido ningún sistema de vigilancia para detectar los efectos de dosis bajas a moderadas de organomercuriales sobre el desarrollo del sistema nervioso, y los estudios especiales de niños que han recibido altas dosis de organomercuriales tardarán varios años en completarse. Ciertos comentaristas han subrayado que los riesgos potenciales de las vacunas que contienen timerosai no deben exagerarse (Offit; P.A. JAMA Voi. 283; No:16). Sin embargo, seria ventajoso encontrar procedimientos alternativos para la preparación de vacunas que reemplazasen el uso de tiomersal en el proceso de fabricación. De esta manera, existe la necesidad de desarrollar vacunas que carezcan de timerosai, en particular, vacunas tales como las vacunas de la influenza que se recomiendan, al menos para ciertos grupos de población, en una base anual. Hasta la fecha, ha sido una practica convencional emplear un conservador para vacunas de influenza inactivadas comerciales, durante el proceso de producción/purificación y/o en la vacuna final. El conservador se requiere para impedir el crecimiento de los microorganismos durante las diversas fases de purificación. Para vacunas de influenza derivadas de huevo, típicamente se añade tiomersal al fluido alantoico de partida y también puede añadirse por segunda vez durante el procesamiento del virus. De esta manera quedará tiomersal residual al final del proceso, que puede ajustarse adicionalmente a una concentración de conservador deseable en la vacuna final, por ejemplo, a une concentración de aproximadamente 100 µg/m\·. Un efecto secundario del uso de tiomersal como conservador en vacunas de la gripe es un efecto de estabilización. El tiomersal en las vacunas de la gripe comerciales actúa estabilizando el componente HA de la vacuna, en particular, pero exclusivamente la HA de influenza de la cepa B. Ciertas hemaglutininas de la cepa A, por ejemplo, H3, también pueden requerir estabilización. Por lo tanto, aunque puede ser deseable considerar la eliminación del tiomersal en vacunas de la influenza, o al menos reducir la concentración del tiomersal en la vacuna final, existe un problema que debe solucionarse ya que, sin tiomersal, la HA no será suficientemente estable. En la presente invención se ha descubierto que es posible estabilizar la HA en preparaciones de influenza inactivadas usando reactivos alternativos que no contienen organomercuriales. La HA permanece estabilizada, de tal forma que es detectable a lo largo del tiempo por procedimientos convencionales cuantitativos, en particular SRD, en una mayor medida que una preparación de antígeno no estabilizado producida por ei mismo procedimiento pero sin excipiente de estabilización. El procedimiento de SRD se realiza como se ha descrito anteriormente. De forma importante, la HA permanece estabilizada durante un periodo de hasta 12 meses, que es el tiempo convencional requerido para una vacuna de gripe final.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una preparación de virus de influenza inactivado que comprende un antígeno de hemaglutinina estabilizado en ausencia de tiomersal, o a bajos niveles de tiomersal, en la que la hemaglutinina es detectable por un ensayo de SRD. Son bajos niveles de tiomersal los niveles a los que la estabilidad de la HA derivada de la influenza de B es reducida, de tal forma que se requiere un excipiente de estabilización para estabilizar la HA. Los bajos niveles de tiomersal generalmente son de 5 µg/ml o menores. Generalmente, la HA estabilizada se refiere a la HA que es detectable a lo largo del tiempo por procedimientos cuantitativos convencionales, en particular SRD, en una mayor medida que una preparación de antígeno no estabilizado producida por el mismo procedimiento pero sin ningún excipiente de estabilización. La estabilización de HA preferiblemente mantiene la actividad de HA sustancialmente constante a lo largo de un período de un año. Preferiblemente, la estabilización permite que la vacuna que comprende HA proporcione una protección aceptable después de un período de almacenamiento de 6 meses, más preferiblemente durante un período de un año. Convenientemente, la estabilización se realiza por un excipiente de estabilización, preferiblemente un excipiente modificador de micelas. Un excipiente modificador de micelas generalmente es un excipiente que puede incorporarse en una micela formada por detergentes usados o adecuados para solubilizar la proteína de membrana HA, tales como los detergentes Tween 80, Tritón X100 y desoxicolato, individualmente o en combinación. Sin desear limitación por ninguna teoría, se cree que los excipientes actúan estabilizando la HA por interacción con los lípidos, detergentes y/o proteínas en la preparación final. Pueden formarse micelas mixtas de excipientes con proteína y lípido, tales como micelas de Tween y desoxicolato con lípidos residuales y/o Tritón X-100. Se cree que las proteínas de superficie se mantienen solubilizadas por estas micelas complejas. Preferiblemente, la agregación de las proteínas se limita por la repulsión de carga de micelas que contienen excipientes adecuados, tales como micelas que contienen detergentes cargados negativamente. Los excipientes modificadores de micelas adecuados incluyen moléculas anfífilas cargadas positiva, negativamente o bipolares, tales como alquil sulfatos o alquiíaril sulfatos; moléculas anfífilas no fónicas tales como alquil poliglucósidos o derivados de los mismos, tales como Plantacare® (disponible en Henkel KGaA), o poli(alquilenéteres) de alcohol alquílico o derivados de los mismos, tales como Laureth-9. Son excipientes preferidos el a-tocoferol o derivados de a-tocoferol, tales como succinato de a-tocoferol. Otros derivados de tocoferol preferidos para uso en la invención incluyen D-a-tocoferol, D-a-tocoferol, D-a-tocoferol y DL-a-tocoferol . Los derivados preferidos de tocoferoles que pueden usarse Incluyen acetatos, succinatos, ásteres de ácido fosfórico, formiatos, propionatos, butiratos, sulfatos y gluconatos. Se prefiere particularmente el succinato de alfa-tocoferol. El a-tocoferol o su derivado está presente en una cantidad suficiente para estabilizar la hemaglutinina. Pueden identificarse otros excipientes adecuados por procedimientos convencionales en la técnica y ensayarse, por ejemplo, usando e! procedimiento de SRD para el análisis de estabilidad como se ha descrito en este documento. En un aspecto preferido, la invención proporciona una preparación de antígeno del virus de la influenza que comprende al menos un antígeno de hemaglutinina de la cepa B de influenza estable. En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar un antígeno de hemaglutinina estable, comprendiendo el método purificar el antígeno en presencia de un excipiente de estabilización modificador de las micelas, preferiblemente a-tocoferol o un derivado del mismo tal como succinato de a-tocoferol.

Además, la invención proporciona vacunas que comprenden las preparaciones de antígeno descritas en este documento y su uso en un método para la profilaxis de la Infección o enfermedad producida por influenza en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una vacuna de acuerdo con la invención. La vacuna puede administrarse por cualquier vía de administración adecuada, tal como intradérmica, mucosa, por ejemplo, ¡ntranasal, oral, intramuscular o subcutánea. En la técnica se conocen otras vías de administración. Se prefiere la administración intradérmica. Para la administración intradérmica puede usarse cualquier dispositivo adecuado, par ejemplo, dispositivos de agujas cortas tales como los descritos en los documentos US 4.886.499, US 5.190.521, US 5.828.483, US 5.527.288, US 4.270.537, US 5.015.235, US 1.141.496 y US 5.417.662. Las vacunas ¡ntradérmicas también pueden administrarse por dispositivos que limitan la longitud de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en los documentos W099/34850 y EP1092444, incorporados en este documento como referencia, y equivalentes funcionales de los mismos. También son adecuados dispositivos de inyección de chorro que suministran vacunas liquidas en la dermis por medio de un inyector de chorro de líquido o por medio de una aguja que atraviesa el estrato córneo y produce un chorro que alcanza la dermis. Se describen dispositivos de inyección de chorro, por ejemplo, en los documentos US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.343.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520.639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4,941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. También son adecuados dispositivos de liberación de polvo/partículas balísticos que usan gas comprimido para acelerar el paso la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hasta la dermis. Además, en el procedimiento clásico de administración intradérmica de mantoux pueden usarse jeringas convencionales. Sin embargo, el uso de jeringas convencionales requiere operarios muy especializados y, por lo tanto, se prefieren dispositivos que sean capaces de producir el suministro de forma precisa sin necesidad de que el usuario tenga mucha experiencia. De esta forma, la invención proporciona un método para la profilaxis de la infección o enfermedad de influenza en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto por vía Intradérmica una vacuna de influenza de acuerdo con la invención. La invención también incluye dispositivos intradérmicos en combinación con una vacuna de acuerdo con la presente invención, en particular, con dispositivas descritos en los documentos W099134850 o EP1092444, por ejemplo. También se proporciona el uso de un excipiente modificador de micelas, preferiblemente a-tocoferol o un derivado del mismo, como estabilizante de hemaglutinina, en la fabricación de una vacuna de influenza.

La invención se aplica particularmente, pero no exclusivamente, a la estabilización de la hemaglutinina de influenza de la cepa B. Preferiblemente, la HA estabilizada de la presente invención es estable durante 6 meses, más preferiblemente durante 12 meses. Preferiblemente, el oc-tocoferol está en forma de un, éster, más preferiblemente el succinato o acetato, siendo el más preferido el succinato. Las concentraciones preferidas para el a-tocoferol o su derivado están comprendidas entre 1 µ9/??? y 10 mg/ml, más preferiblemente entre 10 µ9/??? y 500 mg/ml. La vacuna de acuerdo con la invención generalmente contiene antígenos víricos tanto de la cepa A como de la cepa B, típicamente en una composición trivalente de dos cepas A y una cepa B. Sin embargo, no se excluyen las vacunas divalentes y monovalentes. Las vacunas monovalentes pueden ser ventajosas en situaciones pandémicas, por ejemplo, en las que es importante conseguir y administrar una gran cantidad de vacuna tan rápido como sea posible. La preparación de antígeno de la gripe no vivo para uso en la Invención puede seleccionarse entre el grupo compuesto por preparaciones de antfgenos de virus de división, antígenos de subunidad (expresados de forma recombinante o preparados a partir del virus entero), virus enteros inactivados que pueden haberse inactivado químicamente con, por ejemplo, formaldehído o ß- propiolactona, o inactivados de otra forma, por ejemplo, inactivados por U.V. o térmicamente. Preferiblemente, la preparación de antígeno es una preparación de virus de división, o un antígeno de subunidad preparado a partir del virus entero, particularmente por un proceso de división seguido de purificación del antígeno superficial. Las más preferidas son la preparaciones de virus de división. Preferiblemente, la concentración de antígeno de hemaglutínina para cada cepa de la preparación del virus de influenza es de 1 a 1000 µg por mi, más preferiblemente de 3 á 300 µg por mi y, aun más preferiblemente, de aproximadamente 30 µg por mi, como se mide por un ensayo de SRD. La vacuna de acuerdo con la invención puede comprender además un adyuvante o inmunoestimulante tal como, pero sin limitación, el lípido A destoxificado de cualquier fuente y derivados no tóxicos del lípido A, saponinas y otros reactivos capaces de estimular una respuesta de tipo TH1. Desde hace mucho tiempo, se sabe que el lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) es un potente estimulador del sistema inmune, aunque su uso en adyuvantes se ha restringido por sus efectos tóxicos. Ribi y col., (1968, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Pub[. Corp., NY, p407-419) han descrito un derivado no tóxico de LPS, el monofosforil lípido A (MPL), producido por la eliminación del grupo carbohidrato del núcleo y el fosfato de la glucosamina del extremo reductor, que tiene la siguiente estructura: Otra versión destoxificada de MPL se produce por la eliminación de la cadena acilo de la posición 3 del esqueleto de disacárido, y se denomina monofosforil lípido A 3-O-Desacilado (3D-MPL). Pueden purificarse y prepararse por los procedimientos enseñados en el documento GB 212220413, que también describe la preparación de difosforil lípido A y de variantes 3-0-desaciladas del mismo. Un forma preferida de 3D-MPL está en forma de una emulsión que tiene un tamaño de partículas pequeño menor de 0,2 µ?? de diámetro, y su procedimiento de fabricación se describe en el documento WO 94121292. En el documento W09843670A2 se describen formulaciones acuosas que comprenden monofosforil lípido A y un agente tensioactivo. Los adyuvantes derivados de lipopolisacáridos bacterianos a formular en las composiciones de la presente invención pueden purificarse y procesarse a partir de fuentes bacterianas o, como alternativa, pueden ser sintéticos. Por ejemplo, el monofosforil lípido A purificado se describe en Ribi y col., 1986 (supra), y el monofosforil o difosforil lípido A 3-0-Desacilado procedente de Salmonella sp. se describe en los documentos GB 2220211 y US 4912094. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos (Hilgers y col., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunot, 79(4);3926; Hilgers y col., 1987, Immunology, 60(1 ): 141 -6; y documento EP 0 549 074 B1). Un adyuvante de lipopolisacárido bacteriano particularmente preferido es 3D-MPL. Por consiguiente, los derivados de LPS que pueden usarse en la presente invención son los inmunoestimuladores que sean similares en estructura a LPS, MPL o 3D-MPL. En otro aspecto de la presente invención, el derivado de LPS puede ser un monosacárido acilado, que es una subporción de la estructura anterior de MPL. Las saponinas se enseñan en: Lacaille-Dubois, M y Wagner H. (1996, A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2, páginas 363-386). Las saponinas son esferoides o glicósidos de triterpenos ampliamente distribuidos en los reinos vegetal y de animales marinos. Las saponinas están indicadas para formar soluciones coloidales en agua, formando espuma tras la agitación, y para precipitar colesterol. Cuando las saponinas están cerca de las membranas celulares, crean estructuras semejantes a poros en la membrana que hacen que la membrana estalle. La hemolisis de los eritrocitos es un ejemplo de este fenómeno, que una propiedad de ciertas, pero no de todas las saponinas. La saponinas se conocen como adyuvantes en vacunas para administración sistémica. La actividad adyuvante y hemolítica de saponinas individuales se ha estudiado extensivamente en la técnica (Lacalile-Dubois y Wagner, supra). Por ejemplo, en el documento US 5.057.540 y "Saponins as vaccine adyuvants", Kensil, CR, Crit Rey Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1 -55; y en el documento EP 0 362 279 B1, se describen Quil A (derivado de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y fracciones del mismo. Ciertas estructuras particuladas, denominadas Complejos Estimulantes Inmunes (ISCOMS), que Comprenden fracciones de Quil A son hemolíticas y se han usado en la fabricación de vacunas (Morein, B., documentos EP 0 109 942 B1; WO 96/11711; WO 96/33739). Las saponinas hemolíticas QS21 y OS17 (fracciones de Quil 14 purificadas por HPLC) se han descrito como potentes adyuvantes sistémicos, y su procedimiento de producción se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5.057.540 y en el documento EP 0 362 279 B1. Otras saponinas que se han usado en estudios de vacunación sistémica incluyen las derivadas de otras especies vegetales tales como Gypsophila y Saponaria (Bomford y col., Vaccine, 10(9):572-577, 1992). Un sistema mejorado implica la combinación de un derivado de lípido A no tóxico y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que el QS21 se inactiva con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739. En el documento WO 95/17210 se describe una formulación adyuvante particularmente potente que incluye OS21 y 3D-MPL, que es una emulsión de aceite en agua y es una formulación preferida. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona un vacuna que comprende una preparación de antígeno de influenza de la presente invención con lípido A destoxificado o un derivado no tóxico del ![pido A como adyuvante, más preferiblemente con monofosforil lípido A o un derivado del mismo como adyuvante. Preferiblemente, la vacuna comprende además una saponina, más preferiblemente QS21. Preferiblemente, la formulación comprende además una emulsión de aceite en agua. La presente invención también proporciona un método para producir una formulación de vacuna que comprende mezclar una preparación de antígeno de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden comprender además al menos un agente tensioactivo que puede ser, en particular, un agente tensioactivo no tónico. Los agentes tensioactivos no iónicos adecuados se seleccionan entre el grupo compuesto por los octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (por ejemplo, la serio Tritón™ disponible en el mercado), ésteres de polioxietileno sorbitán (serie Tween ) y éteres de polioxietileno de fórmula general (I): (I) HO(CH2CH20)n-A-R en la que n es de 1 a 50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C1-50 o fenil alquilo C -50, y combinaciones de dos o más de éstos. Son tensioactivos preferidos incluidos dentro de la fórmula (I) moléculas en las que n es de 4 a 24, más preferiblemente de 6 a 12, y aún más preferiblemente 9; el componente R es alquilo Ci.50, preferiblemente alquilo C4-C2o y aún más preferiblemente alquilo C12- En "Surfactant systems" Eds: Attwood end Florence (1983, Chapmen & Hall) se describen octilfenoxi polioxietanoles y ésteres de polioxietileno sorbitán. En Merck Index Entry 6858 (Página 1162, 12a Edición, Merck & Co. Inc. Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3) también se describen octilfenoxi polioxietanoles (octoxinoles), incluyendo t-octilfenoxipolietoxietanoi (Tritón X-100™). En Merck Index Entry 7742 (Página 1308, 12a Edición, Merck & Co. Inc. Whitehouse Station, N.J., USA; ISSN 09 1910-12-3) se describen los ésteres de polioxietileno sorbitán, incluyendo monooleato de polioxietileno sorbitán (Tween 80™), Ambos pueden fabricarse usando procedimientos descritos en este documento o adquirirse a partir de fuentes comerciales tales como Sigma Inc. Los agentes tensioactivos no iónicos particularmente preferidos incluyen Tritón X-45, t-octilfenoxi polietoxietanol (Tritón X-100), Tritón X-102, Tritón X-114, Tritón X-165, Tritón X-205, Tritón X-305, Tritón N-57, Tritón N-101, Tritón N-128, Breij 35, polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9) y polioxietileno-9-estearil éter (esteareth 9). Se prefieren particularmente el Tritón X-100 y el laureth 9. También se prefiere particularmente el éster de polioxietileno sorbitán y el monooleato de polioxietileno sorbitán (Tween 80™). Otros éteres de polioxietileno adecuados de fórmula general (I) se seleccionan entre el siguiente grupo: polioxietifeno-8-estearil éter, polioxietifeno-4-lauril éter, polioxietifeno-35-lauril éter y polioxietileno-23-lauril éter. En el registro CAS se describen términos o nombres alternativos para el polioxietileno lauril éter. El número de registro CAS del polioxietileno-9-lauril éter es: 9002-92-0. En el Merck Index (12a ed: n° de acceso 7797, Merck ,& t:o. Inc., Whitehouse Station, N.J. USA; ISBN 0911910-12-3) se describen éteres de polioxietileno tales como polioxietileno lauril éter. El laureth 9 se forma por reacción de oxido de etiieno con alcohol dodecílico, y tiene un promedio de nueve unidades de óxido de etiieno. En la formulación de vacuna descrita en este documento pueden estar presentes dos o más tensioactivos no fónicos de los diferentes grupos de tensioactivos descritos. En particular, se prefiere una combinación de un éster de polioxietileno sorbitán tal como monooleato de polioxietileno sorbitán (tween 80™) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón) X-100™. Otra combinación particularmente preferida de tensioactivos no iónicos comprende laureth 9 más un éster de polioxietileno sorbitán, un octoxinol o ambos. Los agentes tensioactivos no iónicos tales como los descritos anteriormente tienen las siguientes concentraciones preferidas en la composición de vacuna final: ésteres de polioxietileno sorbitán tales como Tween 80™: del 0,01 al 1%, más preferiblemente aproximadamente un 0,1% (p/v); octil o nonilfenoxi polioxietanoles tales como Tritón X-100™ u otros detergentes de la serie Tritón: del 0,001 a 0,1 %, más preferiblemente del 0,005 al 0,02% (plv); éteres de polioxietileno de fórmula general (1) tal como laureth O: del 0,1 al 20%, preferiblemente del 0,1 al 10/0 y aún más preferiblemente del 0,1 al 1%, o aproximadamente un 0,5% (p/v). Para ciertas formulaciones de vacuna, en la formulación pueden Incluirse otros componentes de vacuna. Como tales, las formulaciones de la presente invención también pueden comprender un ácido biliar o un derivado del mismo, en particular, en forma de una sal. Éstos incluyen derivados de ácido cólico y sales de los mismos, en particular, sales de sodio de ácido cólico o de derivados de ácido cólico, los ejemplos de ácidos biliares y derivados de los mismos incluyen ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido quenodesoxicólico, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y derivados tales como glicoderivados, tauroderivados, o derivados de amidopropil-1 -propanosulfónico o amidopropil-2-hidroxi-1 -propanosulfónico de los ácidos biliares mencionados anteriormente, o N, N-bis(3Dgiuconoamidoropil) desoxicolamida. Un ejemplo particularmente preferido es el desoxicolato sódico (NaDOC), que puede estar presente en la dosis de vacuna final. También se proporcionan por la invención equipos farmacéuticos que comprenden un dispositivo de administración de vacuna rellenado con una vacuna de acuerdo con la invención. Tales dispositivos de administración incluyen, pero sin limitación, dispositivos de aguja, dispositivos de chorro de líquido, dispositivos de polvo y dispositivos de pulverización (para uso intranasal). Las preparaciones de antígeno de virus de influenza de acuerdo con la invención pueden obtenerse por el procedimiento de huevo embrionado convencional, o pueden obtenerse por cualquiera de los procedimientos de nueva generación usando cultivos de tejidos para desarrollar el virus o expresar los antígenos superficiales del virus de la influenza recombinante. Los sustratos celulares adecuadas para desarrollar el virus incluyen, por ejemplo, células de riñon de perro tales como MDCK o células de un clon de MDCK, células de tipo MDCK, células de riñon de mono tales como células AGMK incluyendo células Vero, líneas de células de cerdo adecuadas o cualquier otro tipo de células de mamífero adecuadas para la producción de virus de influenza para fabricar vacunas. Los sustratos celulares adecuados también incluyen células humanas, por ejemplo, células MRC-5. Los sustratos celulares adecuados no se limitan a las líneas celulares, por ejemplo, también se incluyen células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo. La preparación del antígeno del virus de la influenza puede producirse por cualquiera de varios procedimientos aplicables comercialmente, por ejemplo, el procedimiento de división para el virus de la gripe descrito en la patente no. DD 300 833 y DD 211 444, incorporada en este documento como referencia. Tradicionalmente, la vacuna de división de la gripe se producía usando un tratamiento de disolvente/detergente, tal como tri-n-butil fosfato, o dietiiéter en combinación con Tween™ (conocido como división con "Tween éter") y este procedimiento aún se usa en algunas instalaciones de producción. Otros agentes de división empleados actualmente incluyen detergentes o enzimas proteolíticas o sales biliares, por ejemplo, desoxicolato sódico, como se describe en la patente no. DD 155 875, incorporada en este documento como referencia. Los detergentes que pueden usarse como agentes de división incluyen detergentes catiónicos, por ejemplo, bromuro de cetil trimetil amonio, (CTAB), otros detergentes iónicos, por ejemplo, lauriisulfato o taurodesoxicolato, o detergentes no tónicos tales como los descritos anteriormente, incluyendo Tritón X-100 (por ejemplo, en un procedimiento descrito en Lina y col, 2000, Biologicals 28, 95-103) y Tritón N-10 , o combinaciones de dos cualesquiera o más detergentes. El procedimiento de preparación para una vacuna de división incluiré varias etapas diferentes de filtración y/u otras etapas de separación tales como ultracentrifugación, ultrafiltración, centrifugación zonal y cromatografía (por ejemplo, de intercambio fónico) en una diversidad de combinaciones, y opcionalmente una etapa de inactivación, por ejemplo, con calor, formaldeh ido o ß-propiolactona o U.V., que puede realizarse antes o después de la, división. El procedimiento de división puede realizarse como un procedimiento discontinuo, continuo o semicontinuo. Las preparaciones de antígeno de vacuna de la gripe de división preferidas de acuerdo con la invención comprenden una cantidad residual de Tween 80 y/o Tritón X-100 procedente del procedimiento de producción, aunque éstos pueden añadirse o sus concentraciones ajustarse después de la preparación del antígeno de división. Preferiblemente, están presentes tanto Tween 80 como Tritón X-100. Los intervalos preferidos para las concentraciones finales de estos tensioactivos no iónicos en la dosis de vacuna son: Tween 80: del 0,01 al 1%, más preferiblemente aproximadamente un 0,1 % (p/v) Tritón X-100: del 0,001 al 0,1 (% p/v), más preferiblemente del 0,005 al 0,02% (p/v). Como alternativa, las preparaciones de antígeno de virus de la influenza de acuerdo con la invención pueden proceder de una fuente distinta del virus de la influenza vivo, por ejemplo, el antígeno de hemaglutinina puede producirse de forma recombinante. La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 - Preparación de preparación de antígeno del virus de la influenza usando succinato de -tocoferol como estabilizante para una vacuna sin conservador (vacuna con una concentración reducida de tiomersal) Se preparó una vacuna de división monovalente de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Preparación del inoculo del virus En el día de la inoculación de huevos embrionados, se prepara un inoculo reciente mezclando el lote de siembra de trabajo con una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene sulfato de gentamicína a una concentración de 0,5 mg/ml e hidrocortisona a una concentración de 25 µ?/?t?? (dependiente de la cepa de virus). El inoculo del virus se mantiene a 2-8°C.

Inoculación de huevos embrionados Para la replicación del virus se usan huevos embrionados de nueve a once días. Se descontaminan las cáscaras. Los huevos se inoculan con 0,2 mi del inoculo del virus. Los huevos inoculados se incuban a la temperatura apropiada (dependiente de la cepa de virus) durante 48 a 96 horas. Después del periodo de incubación, los embriones se destruyen por refrigeración y los huevos se almacenen durante 12-60 horas a 2-8°C.

Extracción Se extrae el fluido alantoico de los huevos embrionados enfriados. Normalmente, se recogen de 8 a 10 mi de fluido alantoico bruto por huevo.

Concentración y purificación del virus entero a partir del fluido alantoico 1. Clarificación El fluido alantoico recogido se clarifica por una centrifugación de velocidad moderada (intervalo: 4000-14000 g). 2. Etapa de adsorción Para obtener un gel de CaHP04 en el conjunto de virus clarificados, se añaden soluciones de Na2HP04 a una concentración de 0,5 mol/1 y de CaCI2 a una concentración de 0,5 mol/1 para alcanzar una concentración final de CaHP0 de 1,5 g a 3,5 g de CaHP04/litro dependiendo de la cepa del virus. Después de la sedimentación durante al menos 8 horas, se retira el sobrenadante y el sedimento que contiene el virus de la influenza se resolubiliza por adición de una solución de EDTA-Na2 de 0,26 mol/l dependiendo de la cantidad de CaHP04 usada. 3. Filtración El sedimento resuspendido se filtra en una membrana de filtro de 6 µ??. 4. Centrifugación en gradiente de sacarosa El virus de la influenza se concentra por centrifugación isopícnica en un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v) que contiene 100 g/mi de Tiomersal. El caudal es de 8-15 litros/hora. Al final de la centrifugación, se recupera el contenido del rotor en cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro): - fracción 1 55-52% de sacarosa fracción 2 aproximadamente 52-38% de sacarosa fracción 3 38-20% de sacarosa* fracción 4 20-0% de sacarosa * dependiente de la cepa del virus: la fracción 3 puede reducirse a un 15% de sacarosa. Para una preparación de vacuna adicional, sólo se usan la fracciones 2 y 3. La fracción 3 se lava por diafiltración con regulador de pH de fosfato para reducir el contenido de sacarosa a un valor aproximadamente inferior al 6%. El virus de la Influenza presente en esta fracción diluida se sedimenta para retirar loa contaminantes solubles. La pella se resuspende y se mezcla minuciosamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2 y el sedimento resuspendido de fracción 3 se reúnen y se añade un regulador de pH de fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros. Este producto es el concentrado de virus entero monovalente. 5. Centrifugación en gradiente de sacarosa con desoxicolato sódico El concentrado de virus de influenza entero monovalente se aplica a una centrífuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v)) en el que adicionalmente se aplica un gradiente de desoxicolato sódico como un recubrimiento. Durante la división está presente Tween 80 en una concentración de hasta un 0,1 % (p/v) y se añade succinato de Tocoferol para los virus de la cepa B hasta una concentración 0,5 mM. La concentración máxima de desoxicolato sódica es del 0,7 al 1,5% (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora. Al final de la centrifugación, el contenido del rotor se recupera en tres fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para un procesamiento adicional. El contenido de sacarosa límite para las fracciones (47-18%) varía de acuerdo con las cepas y se fija después de la evaluación. 6. Filtración estéril La fracción de virus de división se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ??. Para la dilución se usa regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y (para virus de la cepa B) succinato de Tocoferol 0,5 mM. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fracción original. 7. Inactivación El material monovalente filtrado se incuba a 22 + 2°C durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubación puede acortarse). Después se añade un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 para reducir el contenido de proteína total a un máximo de 250 µ9/???. Para virus de la cepa B, se aplica una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y succinato de Tocoferol 0,25 mM para la dilución, reduciéndose el contenido de proteína total a 250 µg ml. El formaldehído se añade a una concentración final de 50 µ?/?t?? y la inactivación se realiza a 20°C ± 2°C durante al menos 72 horas. 8. Ultrafiltración El material de virus de división inactivado se concentra al menos dos veces en una unidad de ultrafiltración, equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 KDa. Posteriormente, el material se lava con un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y después con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween. Para virus de la cepa B, so usa una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de Tocoferol 0,1 mM para el lavado. 9. Filtración estéril final Después de la ultrafiltración, el material se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ? . Las membranas de filtro se aclaran y el material se diluye si es necesario, de tal forma que la concentración de proteínas no exceda de 500 µ?/G??, con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween 80 y (para virus de la cepa B) succinato de Tocoferol 0,1 mM. 10. Almacenamiento El volumen final de monovalente se almacena a 2-8°C durante un máximo de 18 meses.

Estabilidad Cuadro 1. Comparación del contenido de HA (erg/ml) dependiente del tiempo, medido por SRD en volúmenes finales de monovalente * producido de acuerdo con FLUARIX autorizado, ** producido de acuerdo con el ejemplo 1 sin Succinato de tocoferilo, ON: en curso, ND no determinado.

Ejemplo 2 - Preparación de vacuna de la influenza usando succinato de -tocoferol como estabilizante para una vacuna con una concentración reducida de tiomersal Se produjeron volúmenes finales monovalentes de tres cepas, A/New Caledonia/20199 (H1N1) 1VR-116, A/Panamaf2007199 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166/98, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

Reunión Se reunieron las cantidades apropiadas ate volúmenes finales monovalentes testa una concentración final de HA de 30 µg/m/ para A/New Caledonia/20199 (H1N1) 1VR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17, respectivamente, y de 39 µ9/p??,9 para B/Yamanashi/166/ 98. El Tween 80 y el Tritón X-100 se ajustaron a 580 µ9/?t?? y 90 µg/p\\, respectivamente. El volumen final se ajustó a 3 litros con solución salina regulada en su pH con fosfato. El conjunto trivalente se filtró, terminando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 µ??, obteniéndose el volumen final trivalente. El volumen final trivalente se introdujo en jeringas en una cantidad de al menos 0,5 mi en cada una.

Cuadro 2. Comparación del contenido de HA dependiente del tiempo medido por RSD en volúmenes finales trivalentes que se recuperaron de las jeringas.

Ejemplo 3 - Procedimiento de SRD usado para medir el contenido de hemaglutinina Se recubren placas de vidrio (12,4-10,0 cm) con un gel de agarosa que contiene la concentración de suero de anti-HA de influenza recomendada por NIBSC. Después de haberse solidificado el gel, se perforan 72 pocilios de muestra (de 3 mi de diámetro) en la agarosa. En los pocilios se introducen 10 microlitos dé diluciones apropiadas de la referencia y de la muestra. Las placas se Incuban durante 24 horas a temperatura ambiente (de 20 a 25°C) en una cámara de humedad. Después de esto, las placas se sumergen durante una noche con solución de NaCI y se lavan brevemente en agua destilada. El gel después se prensa y se seca. Cuando está completamente seco, las placas se tiñen en solución de Azul Brillante de Coomassie durante 10 minutos y se destiñen dos veces en una mezcla de metanol y ácido acético hasta que son visibles unas zonas teñidas claramente definidas. Después de secar las placas, se mide el diámetro de las zonas teñidas que rodean a los pocilios de antígeno en dos direcciones en ángulo recto. Como alternativa, puede usarse un equipo para medir la superficie. Se construyen curvas de dosis-respuesta de diluciones de antígeno frente a la superficie y los resultados se calculan de acuerda con procedimientos de ensayo de relación de pendientes convencionales (Pinney, D.J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. Londres; Griffin, Citado en: Wood, J.M., y col. (1977). J. Biol. Standard. 5, 237-247).

Ejemplo 4 - Ensayo clínico de vacuna de influenza estabilizada con oc-tocqferol (concentración reducida de tiomersal) Las jeringas obtenidas como se describe en el Ejemplo 2 se usan para ensayos clínicos H3N2: AIPanama/2007/99 RESVIR-17 H1N1: A/New Caledonia/20199 (H1N1) IVR-116 B: B/Yamanashi/166/98 Cuadro 3 n.d. = no se define la C.l. para la proporción p = n/N, porque p*(1-p)*N<9 n/N = respondedores (n) como parte del número de sujetos de la (sub)población (N), es decir, seroconversiones o aumentos significativos, véase también: CPMAP/BWP/214/96 12 de marzo de 1997, p.17ff. GMT = titulación media geométrica, recíproca C. I. 95% = intervalo de confianza del 95%, SPR = Porcentaje de seroprotección: proporción de sujetos con una titulación protectora antes o después de la vacunación _40. titulación = titulación de anticuerpo Hl Porcentaje de serocon versión = proporción de sujetos con un aumento de anticuerpos de <10 antes de la vacunación a >_ 40 después de la vacunación. GMT en veces = aumento en veces de GMT Aumento significativo = proporción de sujetos con una titulación de anticuerpos >.10 antes de la vacunación y un aumento de anticuerpos de cuatro veces después de la vacunación (2 etapas de titulación) req. = requisitos de la UE Seroconversiones = de negativa o positiva o g.e. 4 veces (negativa: titulación <10; positiva: titulación >40) = proporción de sujetos con seroconversión (<10 a >40) o aumento significativo. los resultados demuestran que la vacuna puede ofrecer una protección equivalente a vacunas que contienen tiomersal como conservador.

Ejemplo 5a - Preparación de la preparación de antígeno del virus de la influenza usando succinato de oc-tocoferol como estabilizante para una vacuna sin tiomersal Se preparó una vacuna de división monovalente de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Preparación del inoculo de virus En el día de la inoculación de huevos embrionados, se prepara un inoculo reciente mezclando el lote de siembra de trabajo con una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene sulfato de gentamicina a una concentración de 0,5 mg/ml e hidrocortisona a una concentración de 25 µ9/?t?? (dependiente de la cepa de virus). El inoculo del virus se mantiene a 2-8°C.

Inoculación de huevos embrionados Para la replicación del virus se usan huevos embrionados de nueve a once días. Se descontaminan las cáscaras. Los huevos se inoculan con 0,2 mi del inoculo del virus. Se incuban 60.000 huevos inoculados a la temperatura apropiada (dependiente de la cepa de virus) durante 48 a 96 horas. Después del periodo de incubación, los embriones se destruyen por refrigeración y los huevos se almacenan durante 12-60 horas a 2-8°C.

Extracción Se extrae el fluido alantoico de los huevos embrionados enfriados. Normalmente, se recogen de 8 a 10 mi de fluido alantoico bruto por huevo.

Concentración y purificación del virus entero a partir del fluido alantoico Clarificación El fluido alantoico recogido se clarífica por una centrifugación de velocidad moderada (intervalo: 4000-14000 g).

Etapa de precipitación Al conjunto de virus clarificados se le añade solución de sulfato amónico saturada para alcanzar una concentración final de sulfato amónico de 0,5 mol/litro. Después de la sedimentación durante al menas 1h, el precipitado se retira por filtración en filtros profundos (típicamente de 0,5 Mm).

Filtración El volumen de virus entero bruto clarificada se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana estéril validada (típicamente de 0,2 µ??).

Ultrafiltración El volumen de virus entero monovalente bruto filtrado estéril se concentra en un cásete equipado con una membrana BIOMAX™ MWCO de 1000 kDa el menos 6 veces. El retenido concentrado se lava con solución salina regulada en su pH con fosfato al menos 1,8 veces.

Centrifugación en gradiente de sacarosa El virus de la influenza se concentra por centrifugación isopícnica en un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v)). El caudal es de 8-15 litros/hora.

Al final de la centrifugación, se recupera el contenido del rotor en cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro): fracción 1 55-52% de sacarosa - fracción 2 aproximadamente 52-38% de sacarosa fracción 3 38-20% de sacarosa* fracción 4 20-0% de sacarosa * dependiente de la cepa del virus: la fracción 3 puede reducirse a un 15% de sacarosa. Para una preparación de vacuna adicional, sólo se usa la fracción 2 o la fracción 2 junto con una fracción 3 purificada adicionalmente. La fracción 3 se lava por diafiltración con un regulador de pH de fosfato para reducir él contenido de sacarosa a un valor aproximadamente inferior al 6%. Opcionalmente, esta etapa puede omitirse. El virus de la influenza presente en esta fracción diluida se sedimenta para retirar los contaminantes solubles. El sedimento se resuspende y se mezcla minuciosamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2 y el sedimento resuspendido de fracción 3 se reúnen y se añade un regulador de pH de fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros.

Este producto es el concentrado de virus entero monovalente.

Centrifugación en gradiente de sacarosa con desoxicolato sódico El concentrado de virus de influenza entero monovalente se aplica a una ultracentríf uga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v)) en el que adicionalmente se aplica un gradiente de desoxicolato sódico como un recubrimiento. Durante la división está presente Tween 80 en una concentración de hasta un 0,1% (p/v) y se añade succinato de tocoferilo para los virus de la cepa B hasta una concentración 0,5 mM, la concentración máxima de desoxicolato sódico es del 0,7 al 1;5% (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 5-15 litros/hora. Al final de la centrifugación, el contenido del rotor se recupera en tres fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para un procesamiento adicional. El contenido de sacarosa limite para las fracciones (47-98%) varia de acuerdo con las cepas y se fija después de la evaluación.

Filtración estéril La fracción de virus de división se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ? . Para la dilución se usa un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y (para virus de la cepa B) succinato de Tocoferilo 0,5 mM. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fracción original.

Inactivación El material monovalente filtrado se incuba a 22 ± 2°C durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubación puede acortarse). Después se añade un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 para reducir el contenido de proteína total a un máximo de 450 µ9/???. Para virus de la cepa B, se aplica una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y succinato de Tocoferlio 0,25 mlvl para la dilución, reduciéndose el contenido de proteína total a 450 µ9/?t??. Se añade formaldehído a una concentración final de 100 µg/ \ y la inactivación se realiza a 20°C ± 2°C durante al menos 72 horas.

Ultraf iltración El material de virus de división inactivado se concentra al menos dos veces en una unidad de ultrafiltración, equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 KDa. Posteriormente, el material se lava con un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y después con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween. Para virus de la cepa B, se usa una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de Tocoferilo 0,1 mM para el lavado.

Filtración estéril final Después de la ultrafiltración, el material se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ??. Las membranas do filtro se aclaran y el material se diluye si es necesario, de tal forma que la concentración de proteínas no exceda de 500 µ?/???, con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween 80 y, específico para virus de la cepa B, succinato de Tocoferilo 0,1 mM.

Almacenamiento El volumen final de monovalente se almacena a 2-8°C durante un máximo de 18 meses.

Estabilidad Cuadro 4. Comparación del contenida de HA (µ?/?t??) dependiente del tiempo, medido ** producido de acuerdo con el ejemplo 1 sin succinato de tocoferilo.

Ejemplo 5b - Preparación de la preparación del antígeno del virus de la influenza usando succinato de g-tocoferol como estabilizante ara una vacuna sin tiomersal Una variación preferida del procedimiento descrito en el Ejemplo 5a es la siguiente: La extracción del virus entero va seguida de la etapa de precipitación (precipitación con sulfato amónico). Esto se continúa por la etapa de clarificación en la que el fluido se clarifica por centrifugación a velocidad moderada (intervalo 4000-14000 g). De esta forma, el orden de las etapas de precipitación y clarificación se invierte en comparación con el Ejemplo 5a. A continuación se realizan la filtración estéril, la ultrafiltración y la ultracentrifugación (centrifugación con gradiente de sacarosa) coleo en el Ejemplo 5a. Sin embargo, no hay necesidad de una etapa de reprocesamiento de las fracciones resultantes de la etapa de ultracentrifugación. Las demás etapas del procedimiento son como se han descrito en el Ejemplo 5a. De esta forma, el proceso resumido en este ejemplo es el siguiente: Extracción Precipitación (sulfato amónico) Clarificación Filtración estéril Ultrafiltración Ultracentrifugación División (preferiblemente con desoxicolato sódico) Filtración estéril Inactivación Ultrafiltración Filtración estéril final Otra variación preferida dei Ejemplo 5a implica una etapa de prefiltracion antes de la primera filtración estéril. Esta etapa usa una membrana que no filtra de forma estéril, pero que permite la eliminación de contaminantes, por ejemplo, albúmina, antes de la filtración estéril. De esta forma se puede mejorar el rendimiento. Una membrana adecuada para la prefiltracion es de aproximadamente 0,8 µ(t? a aproximadamente 1,8 µ?t?, por ejemplo, 1,2 µ??. La etapa de prefiltracion puede usarse en el esquema del Ejemplo 5a o del Ejemplo 5b.

Ejemplo 6 - Preparación de vacuna de la influenza usando succinato de a-tocoferol como estabilizante para una vacuna sin tiomersal Se produjeron volúmenes finales monovalentes de tres cepas, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Yamanashi/166/98, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 5.

Reunión Se reunieron las cantidades apropiadas de volúmenes finales monovalentes hasta una concentración final de HA de 30 µg/rG\\ para A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-16, A/Panama/2007199 (H3N2) Resvir-17, respectivamente, y de 36 µ?/?t?? para B/Johannesburg/5/ 97. El Tween 80 y el Tritón X-100 se ajustaron a 580 µ?/p?? y 90 µ9/?t?? respectivamente. El volumen final se ajustó a 3 I con solución salina regulada en su pH con fosfato. El conjunto trivalente se filtró, terminando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 µ?t? para obtener el volumen final trivalente. El volumen final trivalente se introdujo en jeringas al menos en 0,05 mi en cada una. Cuadro 5. Comparación del contenido de HA ^g/ml) dependiente del tiempo, medido por SRD en volúmenes finales de trivalente * La formulación se basó en una concentración diana de 39 µg/ml. ** La formulación se basó en una concentración diana de 34 µgltr\.

Ejemplo 7 - Preparación de preparación de antíqeno del virus de la influenza usando lauril sulfato sódico como estabilizante para una vacuna sin conservador (vacuna con concentración reducida de tiomersal) El concentrado del virus entro monovalente de B/Johannesburq/ 5/99 se obtuvo como se describe en el Ejemplo 1 Centrifugación en gradiente de sacarosa con desoxicolato sódico El concentrado de virus de influenza entero monovalente se aplica a una centrifuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v)) en ei que adicionalmente se aplica un gradiente de desoxicolato sódico como un recubrimiento. Durante la división está presente Tween 80 en una concentración de hasta un 0,1 % (p/v). La concentración máxima de desoxicolato sódico es del 0,7 al 1,5% (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora. Al final de la centrifugación, el contenido del rotor se recupera en tres fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro). La fracción 2 se usa para un procesamiento adicional. El contenido de sacarosa limite para las fracciones (47-18%) varia de acuerdo con las cepas y se fija después de la evaluación: Filtración estéril Se toma una muestra de 10 mi de la fracción 2 para ten procesamiento adicional. La fracción de virus de división se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ??. Para la dilución se usa un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y lauril sulfato sódico 0,5 mM. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fracción original.

Inactivación El material monovalente filtrado se incuba a 22 ± 2°C durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubación puede acortarse). Después se añade un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y lauril sulfato sódico 0,5 mM para reducir el contenido de proteína total a un máximo de 250 µg ml. Se añade formaldehído a una concentración final de 50 µg/ml y la inactivación se realiza a 20°C ± 2°C durante al menos 72 horas.

Ultrafiltración El material de virus de división ¡nactivado se concentra al menos dos veces en una unidad de ultrafiltración, equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 KDa. Posteriormente, el material se lava con 4 volúmenes de solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01 % (p/v) de Tween y lauril sulfato sódico 0,5 mM.

Filtración estéril final Después de la ultrafiltración, el material se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ? . Las membranas de filtro, se aclaran y el material se diluye si es necesario, de tal forma que la concentración de proteínas no exceda de 500 9/?t??, con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01 % (p/v) de Tween 80 y lauril sulfato sódico 0,5 mM.

Almacenamiento El volumen final de monovalente se almacena a 2-8°C. Cuadro 7. Comparación del contenido de HA (hg/ml) dependiente del tiempo, medido por SRD en volúmenes finales de monovalente * Producido de acuerdo con el Ejemplo 7 sin adición dé lauril sulfato sódico Ejemplo 8 - Preparación de preparación de antígeno del virus de la influenza usando Plantacare o Laureth-9 como estabilizante para una vacuna sin conservador (vacuna con concentración Taducida de tiomersal) El concentrado de virus entro monovalente de B/Yamanash¡H66198 se obtuvo corno se describe en el Ejemplo 1 Fragmentación El concentrado de virus de la influenza entero monovalente se diluye hasta una concentración de proteínas de 1.000 µ9/??1 con solución salina regulada en su pH con fosfato, pH 7,4. Se añade Plantacare® o Laureth-9 a una concentración final del 1% (p/v). El material se mezcla ligeramente durante 30 minutos. Después, el material se aplica sobre una capa de sacarosa al 15% (p/p) en una cubeta. Se realiza una ultracentrifugación en un rotor SW de oscilación Beckman durante 2 h a 25,000 rpm y a 20°C.

Filtración estéril Se recoge el sobrenadante para un procesamiento adicional. La fracción de virus de división se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ??.

Inactivación Se añade solución salina regulada en su pH con fosfato si es necesario para reducir el contenido de proteína total a un máximo de 500 µg/ml. Se añade formaldehído a una concentración final de 100 µQlm\ y la Inactivación se realiza a 20°C ± 2°C durante al menos 6 días.

Ultrafiltración En el material inactivado se ajustan el Tween 80 y el Tritón X 100 al 0,15% y 0,02% respectivamente. El material de virus de división inactivado se concentra al menos dos veces en una unidad de ultrafiltración, equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 80 KDa. Posteriormente, el material se lava con 4 volúmenes de solución salina regulada en su pH con fosfato.

Filtración estéril final Después de la ultrafiltración, el material se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ?t?. Las membranas de filtro se aclaran y el material se diluye, de tal forma que la concentración de proteínas no exceda de 500 µ?/???, con solución salina regulada en su pH con fosfato.

Almacenamiento El volumen final de monovalente se almacena a 2-8°C. Cuadro 8. Comparación del contenido de HA dependiente del tiempo, medido por SRD en volúmenes finales de monovalente Estabilizante Después de 4 semanas a la producción 30°C B/Yamanashi/166/98 Ninguno* 143 98 (68%) B/Yamanash¡/166/98 Planracare w 2000 UP 476 477 (100%) B/Yamanashi/166/98 Laureth-9 468 494 (>100%) Ejemplo 9 - Ensayo clínico de vacuna de influenza estabilizada con a-tocoferol (concentración reducida de tiomersal) en pacientes de edad avanzada por administración ID o IM A Preparación de la preparación de antí eno del virus de la influenza Se preparó una vacuna de división monovalente de acuerdo con el siguiente procedimiento Preparación del inoculo del virus En el día de la inoculación de huevos embrionados, se prepara un inoculo reciente mezclando el lote de siembra de trabaje con orna solución salina regulada en su pH can fosfato que contiene sulfato de gentamicina a una concentración de 0,5 µg ml e hidrocortisona a una concentración de 25 µ9/p?? (dependiente de la cepa de virus). El inoculo del virus se mantiene a 2-8°C.

Inoculación do huevos embrionados Para la replicación del virus se usan huevos embrionarios de nueve a once días. Se descontaminan las cáscaras. Los huevos se inoculan con 0,2 mi del inoculo del virus. Les huevos inoculadas se incuban a la temperatura apropiada (dependiente de la cepa de virus) durante 48 a 96 horas. Después del período de incubación, los embriones se destruyen por refrigeración y los huevos se almacenan durante 12-60 horas a 2-8°C.

Extracción Se extrae el fluido alantoico de los huevos embrionados enfriados. Normalmente, se recogen de 8 a 10 mi de fluido alantoico crudo por huevo. Concentración y purificación del virus entero a partir del fluido alantoico 1. Clarificación El fluido alantoico recogido se clarifica por una centrifugación de velocidad moderada (intervalo: 4000-14000 g). 2. Etapa de adsorción Para obtener un gel de CaHP04 en el conjunto de virus clarificados, se añaden soluciones de Na2HP0 a una concentración de 0,5 mol/1 y de CaCI2 a una concentración de 0,5 mol/1 para alcanzar una concentración final de CaHP04 de 1,5 g a 3,5 g de CaHP04/litro dependiendo de la cepa del virus. Después de la sedimentación durante al menos 8 horas, se retira el sobrenadante y el sedimento que contiene el virus de la influenza se resolubiliza par adición de una solución de EDTA-Na2 de 0,26 mol/l dependiendo de la cantidad de CaHP04 usada. 3. Filtración El sedimento resuspendido se filtra en una membrana de filtro de 6 µ?t?. 4. Centrifugación en gradiente de sacarosa El virus de la influenza se concentra por centrifugación isopícnica en un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v» que contiene 10q µ9/??? de Tiomersal. El caudal es de 8-15 litros/hora. Al final de la centrifugación, se recupera el contenido del rotor en cuatro fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro): fracción 1 55-52% de sacarosa fracción 2 aproximadamente 52-38% de sacarosa - fracción 3 38-20% de sacarosa* fracción 4 20-0% de sacarosa * dependiente de la cepa del virus: la fracción 3 puede reducirse a un 15% de sacarosa. Para una preparación de vacuna adicional, sólo se usan la fracciones 2 y 3. La fracción 3 se lava por diafiltración con un regulador de pH de fosfato para reducir el contenido de sacarosa a un valor aproximadamente inferior al 6%. El virus de la influenza presente en esta fracción diluida se sedimenta para retirar los contaminantes solubles. El sedimento se resuspende y se mezcla minuciosamente para obtener una suspensión homogénea. La fracción 2 y el sedimento resuspendido de fracción 3 se reúnen y se añade un regulador de pH de fosfato para obtener un volumen de aproximadamente 40 litros, un volumen apropiado para 120.000 huevos/lote. Este producto es el concentrado de virus entero monovalente. 5. Centrifugación en gradiente de sacarosa con desoxicolato sódico El concentrado de virus de influenza entero monovalente se aplica a una centrífuga ENI-Mark II. El rotor K3 contiene un gradiente lineal de sacarosa (0,55% (p/v)) en ei que adicionalmente se aplica un gradiente de desoxicolato sódico como un recubrimiento. Durante la división está presente Tween 80 en una concentración de hasta un 0,1 % (p/v) y se añade succlnato de Tocoferol para los virus de la cepa 8 hasta una concentración 0,5 mM. La concentración máxima de desoxicolato sódico es del 0,7 al 1,5% (p/v) y es dependiente de la cepa. El caudal es de 8-15 litros/hora. Al final de la centrifugación, el contenido del rotor se recupera en tres fracciones diferentes (la sacarosa se mide en un refractómetro). La facción 2 se usa para un procesamiento adicional. El contenido de sacarosa limite para las fracciones (47-18%) varía de acuerdo con las cepas y se fija después de la evaluación. 6. Filtración estéril La fracción de virus de división se filtra en membranas de filtro, terminando con una, membrana de 0,2 µ??. Para la dilución se usa un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y (para virus de la cepa 8) succinato de Tocoferol 0,5 mM. El volumen final de la fracción 2 filtrada es 5 veces el volumen de la fracción original. 7. Inactivación El material monovalente filtrado se incuba a 22 ± 2°C durante un máximo de 84 horas (dependiendo de las cepas del virus, esta incubación puede acortarse). Después se añade un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 para reducir el contenido de proteína total a un máximo de 250 µ9/?p?. Para virus de la cepa B, se aplica una solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y succinato de Tocoferol 0,25 mM para la dilución, reduciéndose el contenido de proteína total a 250 µ9/?~??. Se añade formaldehído a una concentración final de 50 µg ml y la inactivación se realiza a 20°C ± 2°C durante al menos 72 horas. 8. Ultraf iltración El material de virus de división inactivado se concentra al menos dos veces en una unidad de ultrafiltración, equipada con membranas de acetato de celulosa con MWCO de 20 KDa. Posteriormente, el material se lava con un regulador de pH de fosfato que contiene un 0,025% (p/v) de Tween 80 y después con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01 % (p/v) de Tween. Para virus do la cepa B, se usa una solución salina regulada en su pH con fosfató que contiene un 0,01% (p/v) de Tween 80 y succinato de Tocoferol 0,1 mM para el lavado. 9. Filtración estéril final Después de la ultrafiltración, el material se filtra en membranas de filtro, terminando con una membrana de 0,2 µ??. Las membranas de filtro se aclaran y el material se diluye si es necesario, de tal forma que la concentración de proteínas no exceda de 1.000 µ9/?t?? pero la concentración de hemaglutinina exceda de 180 µ?/???, con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene un 0,01% (p/v) de Tween 80 y (para virus de la cepa B) succinato de tocoferol 0,1 m . 10. Almacenamiento El volumen final de monovalente se almacena a 2-8°C durante un máximo de 18 meses.

B Preparación de vacuna de la influenza Se produjeron volúmenes finales monovalentes de tres cepas, A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 y B/Johannesburg/5/99 de acuerdo con el procedimiento descrito en la parte A anterior.

Reunión Se reunieron las cantidades apropiadas de volúmenes finales monovalentes hasta una concentración final de HA de 60 µ?/??? para A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR- 16, A/Panama/2007199 (H3N2) Resvir-17, respectivamente, y de 68 µg/ml para B/Johannesburg/ 5/99, El Tween 80, el Tritón X-100 y el succinato de tocoferol se ajustaron a 1.000 µg/m\, 110 µg/m y 160 µg/m\, respectivamente. El volumen final se ajustó a 3 I con solución salina regulada en su pH con fosfato. El conjunto trivalente se filtró, terminando con una membrana de acetato de celulosa de 0,8 µ?? para obtener el volumen final trivalente. El volumen final trivalente se Introdujo en jeringas al menos en 0,165 mi en cada una.

Administración de la vacuna La vacuna se suministró en jeringas rellenadas previamente y se administró por vía intradérmica en la región del deltoides. La aguja intradérmica (ID) fue como se describe en el documento EP1092444, con un limitador de la penetración en la piel para asegurar una inyección intradérmica apropiada. Como la formación de una roncha (pápula) en el sitio de inyección demuestra la buena calidad de la administración ID, el investigador midió el tamaño exacto de la roncha 30 minutos después de la vacunación. Una dosis (100 µ?) contenía los siguientes componentes: HEMAGLUTININA DE TRES CEPAS DE INFLUENZA A/NEW CALEDONIA/2007/99 ?,? µ9 A/PANA A/2007/99 8,0 µ9 B/JOHANNESBURG 5/99 ?,? µ CONSERVADOR TIO ERSAL 0,4 µ9 - 0,8 µ9 ? La vacuna anterior se comparó con una vacuna de influenza de división trivalente convencional: Fluarix™. La vacuna Fluarix se suministró en jeringas rellenadas previamente y se administró por vía intramuscular en el músculo deltoides. Se usó una aguja de al menos 2,5 cm/1 pulgada de longitud (calibre 23) para asegurar una inyección intramuscular apropiada. Una dosis (0,5 mi) contenía los siguientes componentes: Resultados La edad media del grupo total en el momento de la administración de la vacuna fue de 70,4 ± 6,2 años ± Desviación Típica (S.D.), la relación entre el sexo femenino/masculino fue de 1,7:1 Resultados de inmunogenicidad: El análisis de las variables de inmunogenicidad obtenidas fue el si uiente: N: número de sujetos con resultados disponibles; %: porcentaje de sujetos dentro del parámetro dado; LL/UL: limite neror y superior de Ci del 95%; Pre: en el momento de la administración de la vacuna; Post: 21 días después de la dosis de la vacuna El dolor en el sitio de inyección, notificado por 10/65 (1,4%) de los individuos vacunados, fue el síntoma más común después de la administración IM de Fluarix™. En el grupo de ID, se notificó dolor por 3/65 (4,6%) de los individuos vacunados. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p = 0,038; ensayo exacto de Fisher). Por consiguiente, se prefiere el producto con una concentración reducida de tiomersal.

Conclusiones Tanto la administración ID como la administración IM de una vacuna de la gripe con una concentración de tiomersal reducida en una población de edad avanzada puede proporcionar una seroprotección del 100%. Se encontró una respuesta comparable a la vacunación en términos de titulaciones medias geométricas, porcentajes de seroprotección, porcentajes de seroconversión y factores de conversión, en los individuos vacunados IM e ID, recibiendo el grupo ID 2,5 veces menos antígeno. No se observó una diferencia discernible en la incidencia global de síntomas sistémicos solicitados/no solicitados relacionados con la vacuna entre los dos grupos de tratamiento.

Ejemplo 10 - Administración Intradérmica de una vacuna de influenza con concentración reducida de tiomersal La inmunogenicidad de la vacuna de la influenza de división con la concentración reducida de tiomersal preparada como se ha descrito en el Ejemplo 9 (con la excepción de que la reunión se hizo independientemente y la vacuna no se introdujo en jeringas) se evaluó por suministro ID en cobayos usando una aguja convencional.

A grupos de 5 animales cada uno se les administró por vía intranasal una primera dosis de virus de influenza trivalente entero inactivado que contenía 5 µg de cada HA en un volumen total de 200 µ?. Veintiocho días después de esta primera dosificación, los animales se vacunaron por las vías intradérmica o intramuscular. Se administraron dosis intradérmicas que contenían 0,1, 0,3 ó 1,0 µg de virus de la gripe de división con una concentración reducida de tiomersal en 0,1 mi en el lomo del cobaya usando una aguja convencional. En la pata trasera del cobaya se administró una dosis intramuscular de 1,0 µ9 de virus de la gripe de división con concentración reducida de tiomersal en un volumen de 0,1 mi. Los grupos fueron los siguientes: * Grupo 1 - 0,1 µg de vacuna de la gripe de división trivalente con concentración de tiomersal reducida ID; * Grupo 2 - 0,3 µg de vacuna de la gripe de división trivalente can concentración de tiomersal reducida ID; * Grupo 3 - 1,0 µg de vacuna de ¡a gripe de división trivalente con concentración de tiomersal reducida ID; * Grupo 4 - 1,0 ? de vacuna de la gripe de división trivalente con concentración de tiomersal reducida IM. Catorce días después de la vacunación, se extrajo sangre de los animales y se evaluaron las titulaciones de anticuerpo inducidas por la vacunación usando un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (Hl) convencional. Los resultados se muestran en la Figura 1. La vacunación indujo fuertes respuestas de Hl ante las tres cepas. No se detectó ninguna respuesta clara a la dosis, lo que sugiere que dosis muy bajas de antígeno con concentración reducida de tiomersal pueden inducir respuestas de anticuerpos Hl muy potentes cuando se administrara por vía ID. No se observó una diferencia significativa entre las titulaciones de Hl inducidas por la vacunación ID o IM. De esta manera; los resultados obtenidos en cobayos confirmaron que los antígenos de influenza de división trivalentes con concentración reducida de tiomersal inducen niveles similares de anticuerpos Hl en animales cuando se administran por vía ID en comparación con la vía IM.

Ejemplo 11 - Administración intradérmica de una vacuna de influenza con adyuvante, con una concentración reducida de tiomersal Protocolo A cobayos se les administró en el día 0 5 µ9 de virus de la gripe entero inactivado trivalente en 200 µ?, por vía intranasal. Vacunación - Día 28 - Vacuna que contenía 0,1 µg de HA por cepa de virus de la gripe de división trivalente preparado como se describe en el Ejemplo 9 (con la excepción de que la etapa de reunión produjo una concentración final para cada antígeno de 1,0 µg/mlI dando una dosis de 0,1 µg en 100 µ? en comparación con 60 µg/ml en el Ejemplo 9). La formulación trivalente final se administró por vía intradérmica usando jeringas de tuberculina, con adyuvante o sin adyuvante, en 100 µ?.

Extracción de sangre - Día 42. El efecto de la adición del adyuvante se evaluó midiendo las respuestas de anticuerpos por el ensayo Hl (día 0, 28, 42). Todos los experimentos ID se realizaron usando una aguja convencional.

Resultados G1 -G5 se refiere a 5 grupos de cobayos, 5 por grupo. G1 de división trivalente con concentración reducida de tiomersal, 0,1 µ9 G2 de división trivalente con concentración reducida de tiomersal, 0,1 µg + 3D-MPL 50 G3 de división trivalente con concentración reducida de tiomersal, 0,1 + 3D-MPL 10 9 G4 de división trivalente con concentración reducida de tiomersal, 0,1 µ9 + 3D-MPLin 50 µg + QS21 50 µg G4 de división trivalente con concentración reducida de tiomersal, 0,1 g + 3D-MPL¡n 10 µ9 + QS21 10 µ9 Nota: 3D-MPLin + QS21 se refiere a una formulación adyuvante que comprende una vesícula unilamelar que comprende colesterol, que tiene una bicapa lipídica que comprende dioleoil fosfatid i I colina, estando el QS21 y el 3D-MPL asociados o incluidos dentro de la bicapa lipídica. Tales formulaciones adyuvantes se describen en el documento EP 0 822 831 B, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia.

Titulaciones Hl de anti-A/New Caledonia/20/99 Titulaciones Hí de anti-A/Panama/2007/99 Titulaciones Hl de anti-B/Johannesburg/5/99 ta manera, tenga o no adyuvante, el antígeno de la gripe de división trivalente con concentración reducida de tiomersal es un potente inmunogeno capaz de inducir fuertes respuestas Hl cuando se administra por vía ID o IM. Estas respuestas parecen ser al menos tan potentes corno las respuestas inducidas por la preparación Fluarix convencional.

Ejemplo 12 - Comparación de vacunas que contienen tiomersal y sin tiomersal administradas por vía intradérmica en cerdos. Para evaluar la inmunogenicidad de la vacuna de la gripe de división (más y menos tiomersal) administrada por vía ID, se usó el modelo de cerdo expuesto previamente al antígeno. Como la inmensa mayoría de la población ha experimentado al menos una infección con influenza, la vacuna de la influenza tiene que poder reforzar una respuesta inmune preexistente, Por lo tanto, los animales se exponen previamente para simular mejor la situación humana. En este experimento, cerdos de 4 semanas de edad se expusieron previamente por vía intranasal. Se expusieron seis grupos de cinco animales cada uno como se indica a continuación: Grupo 1 - dos administraciones de virus entero inactivado trivalente (50 µg de cada HA) en el día 0 y 14; Grupo 2 - dos administraciones de virus entero inactivado trivalente' (50 µg de cada HA) en el día 0 y 14; Grupo 3 - una sola administración de virus entero inactivado trivalente (50 µg de cada HA) en el día 0; Grupo 4 - dos administraciones de virus entero inactivado trivalente (25 µg de cada HA) en el día 0 y 14; Grupo 5 - una sola administración de virus entero inactivado trivalente (25 µ9 de cada HA) en el día D; Grupo 6 - dos administraciones de virus entero inactivado trivalente (12,5 µg de cada HA) en el día 0 y 14. En el día 28 después de la exposición final, los animales se vacunaron con 3 µg de cada antígeno de división trivalente HA (cepas A/New Caledonia H1N1, A/Panama H3N2 y B/Johannesburg) en 100 µ? por vía ID. El grupo 1 recibió Fluarix™ convencional que contenía conservador de tiomersal como antígeno de vacuna. Todos los demás grupos recibieron el antígeno sin conservador. Los resultados de Hl obtenidos en este experimento se muestran en la Figura 2 (Titulaciones de Inhibición de Hemaglutinación Anti-influenza Inducidas en Cerdos con una Diversidad de Dosis de Antígenos y Vacunados con 3 Microgramos de Antígeno de la Influenza Trivalente Más o Menos Tiomersal por Vía Intradérmica). En este experimento se inducen titulaciones de Hl relativamente bajas frente a la cepa B y el nivel de fondo frente a la cepa A/H3N2 es alto. Se observa un efecto beneficioso en términos de la respuesta a la vacunación cuando se reduce la dosis de exposición. En casi todos los casos, la reducción de la concentración de antígeno o del número de dosis de exposición (desde las dos exposiciones con 54 µg) produjo una respuesta intensificada a la vacunación,, Aunque la respuesta de los animales en los Grupos 1 y 2, que se expusieron dos veces con 50 µ9, a la vacunación no es tan evidente, parece ser que el antígeno sin conservador (Grupo 2) funciona al menos tan bien como Fluarix™ (Grupo 1) en estas condiciones. Es evidente una fuerte respuesta a la vacunación con antígeno de la influenza trivalente sin conservador administrado por vía ID en los animales expuestos alternativamente (Grupos 3-6) y esta respuesta se ve incluso en la cepa B, aunque las titulaciones de Hl siguen siendo bajas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una preparación del virus de la influenza inactivado que comprende un antígeno de hemaglutinina estabilizado en ausencia de tiomersal, o a bajos niveles de tiomersal, en la que la hemaglutinina es detectable por un ensayo de SRD, y en donde la preparación comprende succinato de a-tocoferol en una cantidad suficiente para estabilizar la HA.

2. La preparación del virus de la influenza inactivado de acuerdo con ia reivindicación 1, en donde el succinato de a-tocoferol está presente a una concentración comprendida entra 1 µg/ml y 10 mg/ml.

3. La preparación del virus de la influenza inactivado de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el succinato de a-tocoferol está presente a una concentración comprendida entre 10 y 500 Mg/ml.

4. La preparación del virus de la influenza inactivado de acuerdo pon una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la preparación del virus de la influenza se selecciona entre el grupo compuesto por preparaciones de antígenos de virus de división, antígenos de subunidad o virus entero inactivado químicamente o de otra manera.

5. La preparación del virus de la influenza inactivado de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la preparación del antígeno de la influenza es una preparación de antígeno de virus de división.

6. La preparación del virus de la influenza inactivado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende hemaglutinina tanto de la cepa A como de la cepa B.

7. La preparación del virus de la Influenza inactivado de acuerdo con la reivindicación 6, que es una preparación de virus de la influenza trivalente.

8. La preparación del virus de la influenza inactivado de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende HA de Influenza de la cepa B estabilizada.

9. Una vacuna de la influenza que comprende la preparación del virus de la influenza de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. La vacuna de la influenza de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la concentración de antígeno de hemaglutinina para la cepa o para cada cepa de influenza es de 1 a 1000 pg por mi, según se mide por un ensayo de SRD.

11. Una vacuna de la influenza de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, que comprende además un adyuvante.

12. Un método para preparar un antígeno de hemaglutinina estable, comprendiendo el método purificar el antígeno en presencia de a-tocoferol o un derivado del mismo tal como succinato de oc-tocoferol.

13. Un método para la profilaxis de la infección o la enfermedad producida por influenza en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una vacuna de acuerdo con ias reivindicaciones 29-31.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la administración de la vacuna es intradérmica, intranasal, intramuscular, oral o subcutánea.

15. Uso de a-tocoferol o un derivado del mismo como estabilizante de hemaglutinina en la fabricación de una vacuna de la influenza.