CZ298697B6

CZ298697B6 - Prostredek deaktivovaného viru influenzy a vakcína s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ298697B6
Application number: CZ20033253A
Authority: CZ
Inventors: Eichhorn@Uwe
Original assignee: Saechsisches Serumwerk Dresden Branch Of Smithkline Beecham Pharma Gmbh & Co. Kg
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2007-12-27
Also published as: CN101069744A; AU2006200742C9; FR13C0072I1; IL188834A0; IL188834A; PL366990A1; CN1533434A; HUP0400445A2; US20080181914A1; SI1407008T1; NZ529755A; IL158931A; ZA200309250B; CY1108930T1; JP2004527264A; CN101069744B; ATE420159T1; ES2318020T3; CZ20033253A3; TWI228420B

Abstract

Podstatu rešení tvorí prostredek deaktivovaného viru influenzy pro použití jako vakcína proti chripce, který obsahuje antigen hemaglutinin stabilizovaný v neprítomnosti thiomersalu nebo v prítomnostinejvýš 0,5 .mi.g/ml thiomersalu, kde hemaglutininse detekuje SRD testem, pricemž prostredek obsahuje množství .alfa.-tokoferolsukcinátu, dostatecné pro stabilizaci HA. Rešení se rovnež týká vakcíny proti chripce, obsahující uvedený prostredek a také zpusobu prípravy stabilního antigenu hemaglutininu, zahrnujícího cištení antigenu v prítomnosti .alfa.-tokoferolu nebo jeho derivátu, jako je .alfa.-tokoferolsukcinát. Mimo to se rešení týká použití.alfa.-tokoferolu nebo jeho sukcinátu jako stabilizátoru hemaglutininu pri výrobe vakcíny proti chripce.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká prostředku deaktivovaného viru chřipky, zvláště prostředku s obsahem štěpeného viru, stabilního v nepřítomnosti organortuťových konzervačních látek. Vynález se rovněž týká vakcíny proti chřipce s obsahem tohoto prostředku, způsobu přípravy stabilního antigenu a použití α-tokoferolu nebo jeho sukcinátu k stabilizaci tohoto antigenu při výrobě vakcíny proti chřipce.

Dosavadní stav techniky

Virus chřipky je jeden z nejrozšířenějších virů, který se vyskytuje po celém světě a napadá jak člověka, tak domácí zvířata. Ekonomický dopad chřipky je podstatný.

Virus chřipky je RNA virus s obalem. Průměr částic je přibližně 125 nm. Částice viru obsahuje vnitřní nukleokapsid nebo jádro tvořené ribonukleovou kyselinou (RNA) spojené s nukleo20 proteinem, obklopené virovým obalem tvořeným lipidovou dvoj vrstvou strukturou a vnějšími glykoproteiny. Vnitřní vrstva virového obalu se skládá převážně z matricových proteinů a vnější vrstva je tvořena většinou z lipidového materiálu získaného z hostitele. Povrchová glykorpteinová neuraminidáza (NA) a hemaglutinin (HA) tvoří na povrchu virového obalu bodce 10 až 12 nm dlouhé. Povrchové proteiny, zvláště hemaglutinin, determinují antigenní specifitu sub25 typu viru chřipky.

V současné době dostupné vakcinační prostředky proti chřipce jsou buď deaktivované, nebo živé atenuované chřipkové vakcinační prostředky. Deaktivované chřipkové vakcinační prostředky obsahují tři možné formy antigenního prostředku: deaktivovaný celý virus, sub-viriony, kde izolované virové částice jsou porušeny detergenty nebo jinými činidly, aby došlo k rozpuštění lipidového obalu (tzv. „štěpené“ vakcinační prostředky), nebo poslední formou jsou izolovány HA a NA (dílčí vakcinační prostředky). Tyto deaktivované vakcinační prostředky se aplikují intramuskulámě (i.m.) nebo intranasálně (i.n.). V současné době neexistuje běžně dostupný živý atenuovaný vakcinační prostředek.

Všechny druhy vakcinačních prostředků jsou obvykle trivalentní vakcinační prostředky. Uvedené vakcinační prostředky běžně obsahují antigeny získané ze dvou kmenů viru influenzy A a jednoho kmene viru influnezy B. Standardní dávka pro zavedení injekcí o objemu 0,5 ml ve většině případů obsahuje 15 pg antigenní složky hemaglutininu z každého kmene, jak se stanovilo radiál40 ní imunodifúzí (SRD) (popisuje je v publikaci J.M. Wood et al., An Improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. biol. Stand. 5 (1977) 237-247, J. M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemugglutinin antigen of influenzae virus. J.

Biol. Stand. 9 (1981) 317-330).

Kmeny viru influenza, které se začleňují do vakcinačního prostředku, jsou každý rok stanoveny WHO ve spolupráci s řídicími orgány státního zdravotnictví a s výrobci vakcinačních prostředků.

Typická epidemie chřipky způsobuje zvýšení výskytu zápalu plic a onemocnění dolních cest dýchacích, o čemž svědčí zvýšený výskyt hospitalizací nebo úmrtí. U starých lidí a u těch, kteří trpí chronickým onemocněním, se často vyskytují uvedené komplikace, ale také mladí lidé mohou trpět vážným onemocněním. Proto je nutné zvláště tyto skupiny chránit.

-1 CZ 298697 B6

Současné úsilí řídit nemocnost a úmrtnost spojenou s částečnými epidemiemi chřipky je založeno na použití intramuskulámě aplikovaných deaktivovaných vakcinačních prostředků proti chřipce, účinnost takových vakcinačních prostředků při prevenci respiračního onemocnění a komplikací chřipky se pohybuje v rozmezí 75 % u zdravých dospělých a méně než 50 % v případě starých lidí.

Standardy se aplikují mezinárodně za účelem stanovení účinnosti vakcinačních prostředků proti viru influenzy. Oficiální kritéria evropské unie pro stanovení účinnosti vakcinačního prostředku proti chřipce jsou dány v tabulce dále v textu. Teoreticky, aby se splnily požadavky Evropské ío unie, vakcinaění prostředky proti chřipce musí splňovat pouze kriteria uvedená v tabulce v případě všech kmenů chřipky zahrnutých ve vakcinačním prostředku. Avšak v praxi je nutné, aby alespoň dvě nebo tři kritéria byly splněny pro všechny kmeny, zvláště v případě nových vakcín, které se aplikují odlišným způsobem. Za určitých okolností mohou být dvě kriteria dostatečná. Například může být přijatelné, aby všechny kmeny splňovaly dvě kritéria ze tří, zatímco třetí kritérium splňuje pouze několik kmenů, nikoliv však (například dva ze tří kmenů).

Požadavky jsou různé v případě populace dospělých lidí (18 až 60 let) a populace starých lidí (starší 60 let).

až 60 let starší 60 let

stupeň sérokonverze*	>40 %	>30 %
faktor konverze**	>2,5	>2
stupeň ochrany***	>70 %	>60 %

*Stupeň sérokonverze se definuje jako procento vakcinovaných jedinců, kteří vykazují alespoň čtyřnásobné zvýšení sérových hemiglutininových inhibičních (HI) titrů po vakcinaci v případě každého vakcinačního kmene.

** Faktor konverze se definuje jako násobek zvýšení geometrického průměru titrů HI v séru (GMT) po vakcinaci v případě každého vakcinačního kmene.

** Stupeň ochrany se definuje jako procento vakcinovaných jedinců, u kterých je titr HI v séru po vakcinaci stejný nebo vyšší než 1:40 (v případě každého kmene) a v normálním případě je tato hodnota přijatelná jako ukazatel ochrany.

V případě nového použitelného chřipkového vakcinačního prostředku není pouze potřeba splňovat uvedené standardy, ale je také nutné, aby nové vakcinaění prostředky byly alespoň tak účinné, jako jsou současné vakcinaění prostředky, které je možné zavést injekcí. Je také nutné, aby byly obecně realizovatelné, co se týká množství antigenů a počtu nutných aplikací.

V současné době běžně dostupné vakcinaění prostředky jsou buď štěpené, nebo dílčí vakcinaění prostředky, které se zavádějí injekcí. Tyto vakcinaění prostředky se připravily poškozením virových částic, v obecném případě organických rozpouštědel nebo detergentem a separací nebo izolací virových proteinů do různého stupně. Štěpené vakcinaění prostředky se připravily fragmentací celého viru influenzy a to buď infekčního, nebo deaktivovaného s rozpouštěcími koncentracemi organických rozpouštědel nebo detergenty a následným odstraněním rozpouštěcího činidla a části nebo většiny virového lipidového materiálu. Štěpené vakcinaění prostředky v obecném případě obsahují kontaminující matricové proteiny a nukleoprotein a v některých případech nukleoprotein a někdy lipid, stejně jako membránové obalové proteiny. Štěpené vakcinaění prostředky budou obvykle obsahovat většinu nebo všechny virové strukturní proteiny, ačkoliv nemusí být

-2CZ 298697 B6 zastoupeny ve stejném poměru jako se vyskytují v celém viru. Dílčí vakcinační prostředky na druhou stranu v podstatě obsahují vysoce čisté virové povrchové proteiny, hemaglutinin a neuraminidázu, které jsou povrchovými proteiny odpovídajícími ze vyvolání požadovaných protilátek neutralizujících virus po vakcinaci.

Řada v současné době dostupných vakcinačních prostředků vyžaduje ochranný prostředek, který brání degeneraci. Často používaným ochranným prostředkem je thiomersal, který je sloučenina obsahující rtuť. Účinky sloučenin obsahující rtuť se staly předmětem veřejného zájmu. Neexistuje testovací systém pro stanovení účinků nízkých a středních dávek organohydrargyriových sloučenin na vyvíjecí se nervový systém. U speciálních studií, které sledují děti, kterých se aplikovaly vysoké dávky organohydrargyriových sloučenin, zbývá ještě mnoho let do dokončení. Také je zřejmé, že nelze přecházet potenciální nebezpečí aplikace vakcinačních prostředků, které obsahují thiomersal (popisuje se v publikaci Offit, P.A. JAMA Vol., 283, No. 16). Nicméně bude výhodné najít alternativní metody přípravy vakcinačních prostředků, aby se mohl při ve výrob15 ním postupu thiomersal nahradit. Existuje potřeba vyvinout vakcinační prostředky, které neobsahují thiomersal, zvláště vakcinační prostředky, jako jsou vakcinační prostředky proti chřipce, které se doporučují, alespoň v případě jisté části populace a aplikují se jednou v roce.

Standardní praxí v současné době je použití ochranných prostředků v případě běžných deaktivo20 váných vakcinačních prostředků během postupu produkce/čištění a/nebo se přidávají do konečného vakcinačního prostředku. Aby se zabránilo růstu mikroorganizmů v různých fázích izolace, je nutné použít konzervační činidla. V případě vakcinačních prostředků získaných z vajec se thiomersal přidává do surové alantoické tekutiny a může se také přidat podruhé během zpracování viru. Na konci postupu je přítomen zbytkový thiomersal a jeho koncentrace se pak může upravit na požadovanou hodnotu, aby došlo k ochraně konečné vakcíny, například na koncentraci přibližně 100 pg/ml.

Vedlejším účinkem použití thiomersalu, jako ochranného prostředku ve vakcinačních prostředcích proti chřipce, je stabilizační účinek. Thiomersal v běžných chřipkových vakcinačních pro30 středcích působí jako stabilizátor složky HA vakcinačního prostředku, zvláště HA kmene influenzy B. Hemaglutininy jistého kmene a, například H3, mohou také vyžadovat stabilizaci. Ačkoliv může být nutné zvažovat odstranění thiomersalu z chřipkových vakcinačních prostředků nebo alespoň snížení jeho koncentrace v konečném vakcinačním prostředku, existuje problém, který se nedá bez thiomersalu obejít, HA nebude dostatečně stabilní.

Zjistilo se, že je možné stabilizovat HA v deaktivovaných chřipkových vakcinačních prostředcích za použití alternativních činidel, které neobsahují organohydrargyriové sloučeniny. HA zůstává stabilizován tak, že je detekovatelný kvantitativními standardními metodami, zvláště pomocí SRD ve větším rozsahu než nestabilizovaný antigenní prostředek produkovaný stejnou metodou, ale bez stabilizační pomocné látky. Test SRD se může provést způsobem popsaným shora v textu. Je důležité, že HA zůstává stabilizován až 12 měsíců, což je standardní požadavek v případě konečného chřipkové vakcinačního prostředku.

Vynález popisuje deaktivovaný virus influenzy obsahující hemaglutininový antigen stabilizovaný v nepřítomnosti thiomersalu nebo malým množství thiomersalu, kde hemaglutinin se detekoval testem SRD.

Malé množství thiomersalu je definuje jako množství, při kterém je stabilita HA získaného z viru influenzy kmene B snížena tak, že je pro stabilizaci HA nutné stabilizační činidlo. Nízké množ50 ství thiomersalu je v obecném případě 5 pg/ml nebo méně.

V obecném případě stabilizovaná HA znamená HA, který je detekovatelný kvantitativními standardními způsoby, zvláště SRD testem, ve větším rozsahu než nestabilizovaný antigenní přípravek produkovaný stejnou metodou, ale bez přítomnosti stabilizační pomocné látky. Stabilizace

HA s výhodou udržuje aktivitu HA v podstatě konstantní v období jednoho roku. Stabilizace

-3 CZ 298697 B6 s výhodou umožňuje vakcíny obsahující HA poskytnout ochranu po dobu 6 měsíců, což je doba uskladnění, výhodněji po dobu jednoho roku.

Je vhodné, aby se stabilizace provedla stabilizační pomocnou látkou, s výhodou s pomocnou látkou upravující micely. Pomocná látka upravující micely je v obecném případě pomocná látka, která může být začleněna do micel vytvořených detergenty používaných nebo vhodných pro rozpuštění membránového proteinu HA, jako jsou detergenty Tween 80, Triton XI00 a deoxycholát. Tyto látky je možné použít jednotlivě nebo v kombinaci.

ío Věří se, že pomocné látky stabilizují HA v konečném přípravku interakcí mezi lipidy, detergenty a/nebo proteiny. Mohou se tvořit smíchané micely pomocné látky s proteinem a lipidem, jako jsou micely přípravku Tween a deoxycholátu se zbytkovými lipidy a/nebo Tritonem X-100. Uvažuje se, že povrchové proteiny se udržují rozpuštěné pomocí uvedených komplexních micel. Agregace proteinu je výhodně limitována indukovaným driftem micel, které obsahují vhodné pomocné látky, j ako j sou micely obsahuj ící negativně nabité detergenty.

Vhodné pomocné látky upravující micely zahrnují pozitivně, negativně nebo obojetně nabití amfifilické molekuly, jako jsou alkylsulfáty nebo alkylarylsulfáty, neiontově amfifílické molekuly, jako je alkylpolyglykosidy nebo jejich deriváty, jako je přípravek Plantacare^(R) (dostupné u firmy Henkel KGaA) nebo polyalkenetery alkylalkoholu nebo jej ich deriváty, jako je Laureth-9.

Výhodné pomocné látky jsou deriváty α-tokoferolu, jako je α-tokoferolsulcinát. Jiné výhodné deriváty tokoferolu vhodné pro použití podle vynálezu zahrnují D-a-tokoferol, D-d-tokoferol, D-y-tokoferol a DL-a-tokoferol. Výhodné používané deriváty tokoferolu zahrnují acetáty, suk25 cináty, estery kyseliny fosforečné, formiáty, propionáty, butyráty, sulfáty a glukonáty. Zvláště výhodný je α-tokoferolsukcinát. Alfatokoferol nebo jeho derivát je přítomen v množství, které je dostatečné ke stabilizaci hemaglutininu.

Jiné vhodné pomocné látky se mohou identifikovat způsoby, které jsou standardní v oboru, a jejich stabilita se testuje například pomocí metody SRD.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří prostředek deaktivovaného viru influenzy pro použití jako vakcína proti chřipce, který obsahuje antigen hemaglutinin stabilizovaný v nepřítomnosti thiomersalu nebo v přítomnosti nejvýš 0,5 pg/ml thiomersalu kde hemaglutinin se detekuje SRD testem, přičemž prostředek obsahuje množství α-tokoferolsukcinátu, dostatečné pro stabilizaci HA.

Vynález se rovněž týká vakcíny proti chřipce, obsahující uvedený prostředek a také způsobu přípravy stabilního antigenu hemaglutininu, zahrnujícího čištění antigenu v přítomnosti a-tokoferolu nebo jeho derivátu, jako je α-tokoferolsukcinát. Mimo to se vynález týká použití a-tokoferolu nebo jeho sukcinátu jako stabilizátoru hemaglutininu při výrobě vakcíny proti chřipce.

Vakcinační prostředek se může aplikovat libovolným vhodným způsobem, jako je intradermálně, mukozálně, například intranasálně, orálně, intramuskulámě nebo subkutánně. V oboru jsou známy i jiné způsoby aplikace.

Preferuje se intradermální zavedení. Pro intradermální zavedení se používá libovolné vhodné zařízení, jak se popisuje v patentových dokumentech US 4 886 499, US 5 190 521, US 5 328 483, US 4 270 537, US 5 015 235, US 5 141 496, US 5 417 662. Intradermální vakcinační prostředky se mohou také aplikovat zařízeními, které omezuje účinné penetrační délka jehly při aplikaci do kůže. Tato zařízení se například popisují v patentových dokumentech WO 99/34 850 a EP 1092444 a dále se mohou použít jejich funkční ekvivalenty. Vhodné jsou

-4CZ 298697 B6 také vstřikovací zařízení které zavádějí kapalné vakcinační prostředky do dermisu prostřednictvím vstřikovací trysky nebo prostřednictvím jehly, která proniká stratům comeum a produkuje paprsek, který proniká do oblasti dermisu. Trysková vstřikovací zařízení se popisují například v patentových dokumentech US 5480 381, US 5 599 302, US 5 34 144, US 5 993 412,

US 5 649 912, US 5 569 189, US 5 704 911, US 5 383 851, US 5 893 397, US 5 466 220, US 5 339 163, US 5 312 335, US 5 503 627, US 5 064 413, US 5 520 639, US 4 596 556, US 4 790 824, US 4 941 880, US 4 940 460, WO 97/37 705 a WO 97/13537. Vhodné jsou také balistická zaváděcí zařízení pro prášek/částice, kde se používá stlačený plyn, aby se zrychlil průchod vakcinačního prostředku ve formě prášku přes vnější vrstvy kůže do dermisu. Navíc při io klasické metodě intradermální aplikace se mohou použít běžné injekční stříkačky. Avšak použití běžných injekčních stříkaček vyžaduje odborníka a tak jsou výhodnější zařízení, které umožňují přesné zavedení i nezkušenému uživateli.

Vynález dále popisuje způsob profylaxe infekce influenzy nebo onemocnění u subjektu, který zahrnuje intradermální aplikaci subjektu vakcinačního prostředku chřipky podle vynálezu.

Vynález dále popisuje intradermální zařízení v kombinaci s vakcinačním prostředkem podle vynálezu zvláště zařízení popsaná například v patentových dokumentech WO 99/34 850 nebo EP 1092444.

Také se popisuje použití pomocné látku upravující micely při výrobě chřipkového vakcinačního prostředku, s výhodu α-tokoferol nebo jeho derivát, jako hemaglutininového stabilizátoru.

Vynález se zvláště aplikuje, ale nikoli pouze, za účelem stabilizace hemaglutininu viru influenzy kmene B.

Stabilizovaný HA je s výhodou stabilní po dobu 6 měsíců, s výhodou po dobu 12 měsíců.

α-tokoferol se vyskytuje s výhodou ve formě esteru, s výhodou ve formě sukcinátu nebo acetátu a nejvýhodnější je sukcinát.

Výhodné koncentrace α-tokoferolu nebo jeho derivátu jsou v rozmezí 1 pg/ml až 10 mg/ml, výhodněji v rozmezí 10 až 500 pg/ml.

Vakcinační prostředek podle vynálezu v obecném případě obsahuje antigeny viru kmene A a B, v typickém případě trivalentní prostředek dvou kmenů A a jednoho kmene B. Vyloučeny nejsou ani divalentní a monovalentní vakcinační prostředky. Monovalentní vakcinační prostředky mohou být výhodné v případě pandemie, například kde je důležité získat velké množství vakcinačního prostředku a aplikovat ho, tak rychle, jak jen je to možné.

Přípravek antigenu neživého viru chřipky vhodného pro použití podle vynálezu se může vybrat ze skupiny obsahující štěpené virové antigenní přípravky, dílčí antigeny (buď exprimované rekombinantně, nebo připravené z celého viru), deaktivovaný celý virus, který se může deaktivovat chemicky například pomocí formaldehydu, β-propiolaktonu nebo se může deaktivovat jiným způsobem, například UV zářením nebo teplem. Antigenní přípravek je s výhodou buď štěpený virový přípravek, nebo dílčí antigen připravený z celého viru zvláště postupem štěpení, který následuje po izolaci povrchového antigenu. nejvýhodnější jsou přípravky štěpeného viru.

Koncentrace antigenu hemaglutinin je v případě každého kmene přípravku viru influenzy 1 až

1 000 pg/ml, s výhodou 3 až 300 pg/ml a nejvýhodnější je koncentrace přibližně 30 pg/ml, jak se stanovilo testem SRD.

-5CZ 298697 B6

Vakcinační prostředek podle vynálezu může dále obsahovat adjuvans nebo imunostimulant, který se neomezuje na detoxifikovaný lipid A z libovolného zdroje a netoxické deriváty lipidu A, saponiny a jiná činidla schopná stimulovat odezvu typu TH1.

Dlouho je známo, že enterobakteriální lipopolysacharid (LPS) je silný stimulátor imunitního systému, ačkoli jeho použití v adjuvans je omezeno jeho toxickými účinky. Netoxický derivát LPS, monofosforyllipid A (MPL) produkovaný odstraněním jaderné sacharidové skupiny a fosforečnanu s redukujícího koncového glukozaminu, jak se popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ. Corp., NY, p407io 419) má následuj ící strukturu.

Další detoxifikovaná verze MPL vznikla odstraněním acylovaného řetězce z polohy 3 disachari15 dové základní struktury a nazývá se 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL). Může se izolovat a připravuje se metodami popsanými v patentovém dokumentu GB 2122204B, která také popisuje přípravu difosforyllipidu A a jeho 3-O-deacylovaných variant.

Výhodná forma 3D-MPL je emulze, která vykazuje malou velikost částic. Průměr částic je menší než 0,2 pm a způsob výroby se popisuje v patentovém dokumentu WO 94/21292. Vodné přípravky obsahujícím onofosforyllipid A a povrchově aktivní činidlo se popisuje v patentovém dokumentu WO 98/43670A.

Adjuvans odvozené do bakteriálního lipopolysacharidu se zavedlo do prostředku podle vynálezu a může se izolovat a zpracovávat z bakteriálních zdrojů nebo v jiném případě může být syntetické. Izolovaný monofosforyllipid A se například popisuje v publikaci Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenům Publ. Corp., NY, p407-419) a 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A nebo difosforyllipid A získaný z mikroorganismu Salmonella sp., jak se popisuje v patentovém dokumentu GB 2220211 a US 4 912 094. Jiné izolované a syntetické lipopolysacharidy se popisují v publikaci Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79 (4):392-6, Hilgers et al, 1987, Immunology, 60(1):141-6 a EP 0 549 074 Bl). Zvláště výhodné bakteriální polysacharidové adjuvans je 3D-MPL.

-6CZ 298697 B6

Používané deriváty LPS podle vynálezu jsou ty imunostimulanty, které jsou podobné strukturou struktuře LPS nebo MPL nebo 3D-MPL. Ve výhodném provedení vynálezu derivátu LPS mohou být acylované monosacharidy, kterou jsou dílčí částí shora uvedené struktury MPL.

Saponiny se popisují v publikaci Lacaille-Dubois, M. and Wagner H. (1996), A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, vol. 2, pp. 363-386. Saponiny jsou steroidní glykosidy nebo triterpenglykosidy, které se vyskytují v rostlinách a v mořských živočiších. Saponiny se zmiňují v souvislosti s tvorbou koloidních roztoků ve vodě, které při míchání pění, a v souvislosti se srážením cholesterolu. Když se saponiny dostanou do ío blízkosti membrány tvoří v membráně struktury podobné pórům, které způsobují praskání membrány. Vlastností jistých, ne všech, saponinů je například jev hemolýza erytrocytů.

Saponiny jsou známy jako adjuvans v případě vakcinačních prostředků vhodných pro systémovou aplikaci. Adjuvantní a hemolytická aktivita jednotlivých saponinů se studuje v oboru (popi15 suje se v publikaci Lacaille-Dubois, M. and Wagner H. (1996), A review of the biological and pharmacological acitivities of saponins. Phytomedicine, vol. 2, pp. 363-386). Například přípravek Wuil A (získaný z kůry jihoamerického stromu Quillaja Saponaria Molina) ajeho frakce se popisují v patentovém dokumentu US 5 057 540 a v publikaci „Saponins as vaccine adjuvants.“ Kensil, C. R„ Crit. rev. Ther. Drug Carrier Syst., 1996, 12 (1-2):1-55 a v patentovém dokumentu

EP 0 362 279 Bl. Jisté struktury nazývané imunostimulační komplexy (ISCOMS) obsahující frakce přípravku Quil A jsou hemolytické a používají se při výrobě vakcinačních prostředků (popisuje se v patentovém dokumentu Morein, B., EP 0 109 942 Bl, WO 96/11711, WO 96/33739). hemolytické saponiny QS21 a QS17 (frakce Quil A čištěné pomocí HPLC) se popisují jako silná systémová adjuvans a způsob jejich produkce se popisuje v patentovém doku25 mentu US 5 057 540 a EP 0 362 279. Jiné saponiny, které se používají ve studiích systémové vakcinace, se získaly z jiných druhů rostlin, jako je Gypsophila a Saponaria (popisuje se v publikaci Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992).

Zesílený systém zahrnuje kombinaci netoxického derivátu lipidu A a derivátu saponinů zvláště v kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 94/0053 nebo méně reaktogenní prostředek, kde QS21 je zhášený cholesterolem, jak se popisuje v patentovém dokumentu WO 96/33739.

Zvláště vhodné adjuvans zahrnující QS21 a 3D-MPL voleji ve vodní emulzi se popisuje v patentovém dokumentu WO 95/17210.

V jednom provedení vynálezu se popisuje vakcinační prostředek obsahující antigenní přípravek influenzy podle vynálezu upravený s detoxifikováným lipidem A nebo netoxickým derivátem lipidu A, s výhodou upravený monofosforyllipidem A nebo jeho derivátem.

Vakcinační prostředek s výhodou obsahuje saponin, výhodněji QS21.

Prostředek s výhodou obsahuje olej ve vodní emulzi. Vynález dále popisuje způsob produkce vakcinačního prostředku obsahujícího směs antigenního přípravku podle vynálezu spolu s farma45 ceuticky přijatelnou pomocnou látkou, jako je 3D-MPL.

Vakcinační prostředky podle vynálezu mohou dále obsahovat alespoň jednu povrchově aktivní látku. Vhodné neionogenní povrchově aktivní látky se vybraly ze skupiny zahrnující oktylfenoxypolyoxyetanoly nebo nonylfenoxypolyoxyetanoly (například běžně dostupné jako

Triton^(tm), estery polyoxyetylensorbitanu (Tween^(tm) a polyoxyetylenestery nebo estery obecného vzorce I:

HO(CH₂CH₂O)_n-A-R (I),

-7CZ 298697 B6 kde symbol n je 1 až 50, symbol Aje vazba nebo skupina -C(O)-, symbol Rje alkyl obsahující 1 až 50 atomů uhlíku nebo fenylalkyl, kde alkyl obsahuje 1 až 50 atomů uhlíku, a kombinace dvou nebo více radikálů.

Výhodné povrchově aktivní činidla obecného vzorce I jsou molekuly, kde symbol n je 4 až 24, výhodněji 6 až 12 a nejvýhodněji 9. Symbol Rje Ci._5O, s výhodou alkyl obsahující 4 až 20 atomů uhlíku a nejvýhodněji alkyl obsahující 12 atomů uhlíku.

Oktylfenoxypolyoxyetanoly a polyoxyetylensorbitanestery se popisují v publikaci „Surfactant ío systems“ Eds: Attwood and Florence (1983, Chapman and Halí), octylfenoxypolyetanoly (okroxynoly) zahrnující t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton X-100^(tm| se také popisují v publikaci měrek Index Entry 6858 (page 1162), 12* edition Merck & Co. lne., Whitehouse Station, N.J., USA, ISBN 0911910-12-3). Estery polyexyetylensorbitanu zahrnující polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^<tm>) se popisují v publikaci Merck Index Entry 7742 (page

1308, 12^th Edition, Merck & Co. lne., Whitehouse Station, N. J., USA, ISBN 0911910-2-3). Oba prostředky se mohou vyrobit za použití zde popsaných způsobů nebo je možné je získat z běžných zdrojů, například od firmy Sigma lne..

Zvláště výhodné neionogenní povrchově aktivní činidla zahrnují Triton X-45, t-oktylfenoxy20 polyetoxyetanol (Triton X-100), Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305, Triton N-57, Triton N-101, Triton N-128, Breij 35, polyoxyetylen-9-leuryleter (leureth 9) a polyoxyetylen-9-stearyleter (steareth 9). Zvláště se používají triton X-100 a laureth 9. Zvláště výhodný je také polyoxyetylensorbitanester, polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^(tm)).

Další výhodné polyoxyetylenetery obecného vzorce I se vybraly ze skupiny obsahující polyoxyetylen-8-stearyleter, polyoxyetylen-4-lauryleter, polyoxyetylen-35-lauryleter a polyoxyetylen23-lauryleter.

Alternativní termíny a názvy polyoxyetylenlauryleteru se popisují v CAS registru. Číslo polyoxyetylen-9-lauryleteru v CAS registru je 9002-92-0. Polyoxyetylenetery, jako je polyoxyetylenlauryleter se popisuje v publikaci Merck index (12^th ed: entry 7717, Merck & Co., Inc., Whitehouse, Station, N.J. USA, ISBN. 0911910-12-3). Eaureth 9 se vytvořil reakcí etylenoxidu s dodecylalkoholem a obsahuje v průměru devět etylenoxidových jednotek.

Dva nebo více neionogenních povrchově aktivních činidel z popsaných odlišných skupin povrchově aktivních činidel může být přítomno ve zde popsaných vakcinačních prostředcích. Zvláště výhodná je kombinace poyoxyetylensorbitanesteru, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^(tm)), a oktoxynolu, zvláště výhodná kombinace neionogenních povrchově aktivních látek zahrnuje laureth 9 a polyoxyetylensorbitanester nebo oktytoxynol nebo obě látky.

Neionogenní povrchově aktivní látky, jako jsou ty popsané shora v textu, vykazují následující výhodnou koncentraci v konečném vakcinačním prostředku: polyoxyetylensorbitanestery, jako je Tween 80^(tm) 0,01 až 1 %, nej výhodněji přibližně 0,1 % (hmotnost/objem), oktylfenoxypoly45 oxyetanoly nebo nonylfenoxypolyoxyetanoly, jako je triton X-l OO¹ ¹ nebo jiné detergenty v sérii tritonů: 0,01 až 0,1 %, nejvýhodněji 0,05 až 0,02 % (hmotnost/objem), polyoxyetylenetery obecného vzorce I, jako je laureth 9: 0,1 až 20 %, s výhodou 0,1 až 10 % a nejvýhodněji 0,1 až 1 % nebo přibližně 0,5 % (hmotnost/objem).

V případě jistých vakcinačních prostředků mohou být zahrnuty ve vakcinačních prostředcích i jiné vakcinační složky. Jako takové může vakcinační prostředek obsahovat kyselinu žlučovou nebo její derivát, zvláště ve formě sole. Zahrnují například deriváty kyseliny cholové a její sole, zvláště sodné sole kyseliny cholové nebo deriváty kyseliny cholové. Příklady žlučových kyselin a jejich deriváty zahrnují kyselinu cholovou, kyselinu deoxycholovou, chenodeoxycholovou kyse55 linu, kyselinu lithocholovou, kyselinu ursodeoxycholovou, hyodeoxycholovou a jejich deriváty,

-8CZ 298697 B6 jako je glykoderiváty, tauroderiváty, nebo amidopropyl-l-propansulfonové a amidopropyl-2hydroxy-l-propansulfonové kyseliny žlučových kyselin nebo N,N-bis(3D-glukonoamidopropyl)deoxycholamid. Zvláště výhodným příkladem je deoxycholát sodný (NaDOC), který může být přítomný v dávce vakcinačního prostředku.

Vynález dále popisuje farmaceutické sady obsahující zařízení pro aplikaci vakcinačního prostředku naplněného vakcinačním prostředkem podle vynálezu. Takové aplikační prostředky zahrnují, ale nejsou omezeny na zařízení opatřená jehlou, vstřikovací zařízení vhodná pro kapalinu, zařízení pro aplikaci práškových prostředků a spreje (vhodná pro intranasální použití).

Antigenní prostředky viru influenzy podle vynálezu se mohou získat způsobem oplodnění vajíček nebo libovolnou metodou nové generace za použití tkáňové kultury pro růst viru nebo expresi povrchových antigenů rekombinantního viru influenzy. Vhodné buněčné substráty pro růst viru zahrnují například buňky ledvin psů, jako je MDCK nebo buňky z klonů MDCK, buňky podobné

MDCK, buňky opičích ledvin, jako jsou buňky AGMK zahrnující buňky Věro, vhodné prasečí buněčné linie nebo libovolný jiný typ savčích buněk vhodný pro produkci viru influenzy pro účely vakcinace. Vhodné buněčné substráty také zahrnují lidské buňky, například buňky MRC-5. Vhodné buněčné substráty se neomezují na buněčné linie, například primární buňky, jako jsou kuřecí embryonální fibroblasty.

Antigenní prostředek viru influenzy se může připravit libovolným počtem běžně dostupných aplikačních postupů, například postupem štěpení viru influenzy popsaném v patentovém dokumentu DD 300 833 a DD 211 444. Tradičně štěpený virus influenzy se připravuje použitím rozpouštědla/detergentu, jako je tri-n-butylfosfát nebo dietyleter v kombinaci s Tween⁰’’ (známo jako metoda štěpení „Tween-eter“). Tento postup se stále používá v některých výrobních zařízení. Jiná používaná štěpící činidla zahrnují detergenty nebo proteolytické enzymy nebo sole žlučových kyselin, například deoxycholát sodný, jako se popisuje v patentovém dokumentu DD 155 875. Detergenty, které se mohou použít jako štěpící činidla zahrnují kationogenní detergenty, například cetyltrimetylamoniumbromid (CTAB), jiné ionogenní detergenty, jako je například laurysulfát, taurodeoxycholát nebo neionogenní detergenty, jako jsou ty popsané shora v textu zahrnující Triton X-100 (například způsobem popsaným v publikaci Lina et al., 2000, Biologicals 28, 95-103) a Triton B-101 nebo v kombinaci libovolných dvou detergentů.

Způsob přípravy štěpených vakcinačních prostředků bude zahrnovat řadu různých filtrací a/nebo jiných separačních kroků, jako je ultracentrifugace, ultrafiltrace, zonální centrifugace a chromatografie (například chromatografie s výměnou iontů), v různých kombinacích, a může také zahrnovat krok deaktivace, například teplem, formaldehydem nebo β-propiolaktonem nebo UV zářením. Tento krok deaktivace se může provést před nebo po štěpení. Proces štěpení se může provést jako vsádkový, kontinuální nebo semikontinuální proces.

Výhodné štěpené vakcinační antigenní prostředky viru influenzy podle vynálezu obsahují zbytkové množství přípravku Tween X-100 z postupu přípravy, ačkoliv se také mohou přidat nebo jejich koncentrace se může také upravit po přípravě štěpeného antigenu. Je výhodné, aby byl přítomen jak Tween 80 tak Triton X-100. Výhodné rozmezí konečných koncentrací těchto neio45 nogenních povrchově aktivních látek v dávce vakcinačního prostředku jev případě Tween 80 0,01 až 1 % (objem/objem), v případě přípravku Triton X-100 0,01 až 0,1 % (hmotnost/objem), výhodněji 0,05 až 0,02 % (hmotnost/objem).

V jiném případě antigenní přípravy viru influenzy podle vynálezu se mohou získat ze zdroje jiného než je živý virus influenzy, například antigen hemaglutinin se může připravit rekombinantně.

-9CZ 298697 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava antigenního prostředku viru influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru vakcinačního prostředku, který neobsahuje konzervační činidla (vakcinační prostředek se sníženým obsahem thiomersalu).

Monovalentní štěpený vakcinační prostředek se připravil následujícím postupem.

Příprava virového inokula

V den inokulace vajíček obsahujících embryo se připravilo čerstvé inokulum smícháním pracovní očkovací dávky s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím sulfát gen15 tamycinu v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortizonu v koncentraci 25 pg/ml (v závislosti na kmenu viru). Virové inokulum se udržovalo při teplotě 2 až 8 °C.

Inokulace vajíček obsahujících embrya

V případě replikace viru se použily dvě až jedenáct dnů staré vajíčka s embryem. Skořápky jsou dekontaminovány. Vajíčka se inokulovala inokulem viru o objemu 0,2 ml. Inokulovaná vajíčka se inkubovala při vhodné teplotě (závislé na virovém kmenu) po dobu 48 až 96 hodin. Nakonec inkubační doby se embrya usmrtila ochlazením a vajíčka se uchovávala po dobu 12 až 60 hodin při teplotě 2 až 8 °C.

Sklizeň

Z ochlazených vajíček s embryi se shromáždila alantoická tekutina. Z jednoho vejce se shromáždí 8 až 10 ml surové alantoické tekutiny.

Koncentrace a čištění celého viru z alantoické tekutiny

1. Čištění

Shromážděná alantoická tekutina se čistila centrifugací při mírné rychlosti (rozmezí 4000 až 14 000 g).

2. Adsorpce

Aby se vytvořil gel CaHPO₄ v čištěném shromážděném viru, přidal se 0,5 mol/1 Na₂HPO₄ a 0,5 mol/1 CaCl₂ tak,a by se dosáhlo konečné koncentrace CaHPO₄ 1,5 g až 3,5 g CaHPO₄ najeden litr v závislosti na kmenu viru.

Po sedimentaci trvající alespoň 8 hodin se odstranil supematant a sediment obsahující virus influenzy se rozpustil přidáním roztoku EDTA-Na₂ v koncentraci 0,26 mol/1 v závislosti na používaném množství CaHPO₄.

3. Filtrace

Resuspendovaný sediment se filtroval před filtrační membránu 6 pm.

-10CZ 298697 B6

4. Centrifugace v sacharidovém gradientu

Koncentrace viru influenzy se zvýšila izopyknickou centrifugací v lineárním sacharózovém gra5 dientu (0,55 % (hmotnost/objem)) obsahujícím 100 pg/ml thiomersalu. Průtoková rychlost je 8 až litrů/hodinu.

Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do čtyř různých frakcí (sacharóza se měří refrak-

tometrem): - frakce 1	55 až 52 % sacharóza
- frakce 2	přibližně 52 až 38 % sacharóza
- frakce 3	38 až 20 % sacharóza*
- frakce 4	20 až 0 % sacharóza

* závisí na virovém kmenu: frakce 3 se může redukovat na 15 % sacharózu.

V případě další přípravy vakcinačního prostředku se použily frakce 2 a 3.

Frakce 3 se promyla diafiltrací s fosforečnanovým pufrem za účelem redukovat obsah sacharózy na přibližně 6 %. Virus influenzy přítomný v této ředěné frakci se shromáždil do peletu, aby se odstranily rozpouštěné nečistoty.

Pelet se resuspendoval a dobře se promíchal za účelem získání homogenní suspenze. Frakce 2 se resuspendovaný pelet frakce 3 se shromáždily a přidal se fosforečnanový pufr, aby se dosáhlo konečného objemu 40 litrů. Tento produkt je koncentrát monovalentního celého viru.

5. Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným

Monovalentní koncentrát celého viru influenzy se aplikoval do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem) a v případě virů kmene B se přidá tokoferolsukcinát až do koncentrace 0,5 mM. Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5% (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.

Na konec centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem). Frakce 2 se požije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.

6. Sterilní filtrace

Oddělená virová frakce se filtrovala před filtrační membrány končící membránou s velikostí pórů 0,2 μηι. V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 20 a (v případě virů kmene B) a (v případě virů kmene B) 0,5 mM tokoferolsukcinát. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek počátečního objemu frakce.

8. Deaktivace

Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22 ± 2 °C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné ztratit). Pak se přidá fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 250 pg/ml. V případě virů kmenů B se aplikoval za účelem ředění fyziologický roztok upravený fosforečnanovým pufrem obsahujícím 0,25% (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 až 0,25 mM tokoferolusukcinát, přičemž se obsah celko-11 CZ 298697 B6 vého proteinu sníží na 250 pg/ml. Přidá se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 50 pg/ml a deaktivace probíhá při teplotě 20 ± 2 °C po dobu alespoň 72 hodin.

Koncentrace deaktivovaného materiálu štěpeného viru se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační 5 jednotce vybavené membránami acetátu celulózy s hodnotou MWCO 20 000. Materiál se následně promyl fosforečnanovým pufrem, který obsahuje 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku

Tween 80 a pak fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween. V případě viru kmene B se při promývání používá fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween ío 80 a 0,01 mM tokoferolsukcinát.

9. Konečná sterilní filtrace

Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 15 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje

0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a (v případě viru kmene B) 0,1 mM tokoferolsukcinát.

10. Uchovávání

Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8 °C po maximální dobu 18 měsíců.

Stabilita

Tabulka č.l: Porovnání obsahu HA v závislosti na čase (pg/ml) stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách.

Kmen	Stabilizát or	Po produkci	4 týdny při teplotě 30 °C	6 měsíců při teplotě 2 až 8 °C	12 měsíců při teplotě 2 až 8 °C
B/Yamanas	tokoferols	169	139	172	ND
hi/166/98	ukcinát (zbytková rtuť 3pg/ml)		(82%)	(>100%)
B/Yamanas	thiomersal	192	160	186	178
hi/166/98	(108pg/ml)		(83%)	(97%)	(93%)

-12CZ 298697 B6

B/Yamanas hi/166/98	žádná zbytková rtuť 3pg/ml)	191	122 (60%)	175 (92%)	154 (81%)
B/Johanne	tokoferols	166	183	158	179
sburg/5/9 9	ukcinát (zbytková rtuť 4pg/ml)		(>100%)	(95%)	(>100%)
B/Johanne	tokoferols	167	179	158	178
sburg/5/9 9	ukcinát (zbytková rtuť 4pg/ml)		(>100%)	(95%)	(>100%)
B/Johanne	tokoferols	144	151	130	145
sburg/5/9 9	ukcinát (zbytková rtuť 3pg/ml)		(>100%)	(90%)	(>100%)
B/Johanne	thiomersal	159	ND	172	154
sburg/5/9 9*				(>100%)	(97%)
B/Johanne	žádný	169	107	153	ON
sburg/5/9 9**			(63%)	(90%)

*připravovaný podle přípravku FLUARIX^(tm) z licencí, **připravovaný podle příkladu 1 bez tokoferylsukcinátu

ON probíhající ND nestanoveno

Příklad 2: Příprava vakcinačního prostředku influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako io stabilizátoru pro vakcinaění prostředek se sníženým obsahem thiomersalu

-13 CZ 298697 B6

Monovalentní konečné dávky třech kmenů A/New Caldonia/20/99 (HlNl)IVR-l 16, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvirl7 a B/Yamanashi/166/98 se připravovaly způsobem popsaným v příkladu 1.

Hromadění

Shromáždilo se vhodné množství monovalentních konečných dávek tak, aby konečná koncentrace HA byla 30 pg/ml v případě A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116 respektive A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-l7 a 39 pg/ml v případě B/Yamanashi/166/98. Přípravky Tween 80 a ío Tween X-100 se upravily tak, aby jejich koncentrace byl 580 pg/ml respektive 90 pg/ml.

Konečný objem se upravil na 3 1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, trivalentní produkt se filtroval nakonec přes membránu tvořenou acetátem celulózy s velikostí pórů 0,8 pm za účelem získání trivalentní konečné dávky. Do každé stříkačky se naplnilo alespoň 0,5 ml trivalentní konečné dávky.

Tabulka č. 2: Porovnání obsahu HA závislém na čase, jak se stanovilo pomocí SRD v trivalentních konečných dávkách, které se získaly z injekčních stříkaček.

Vakcinační prostředek	kmen	0 měsíců	2 měsíce	4 měsíce	6 měsíců
chřipkový vakcinační prostředek bez stabilizátoru	A/NCal/20/99	33(32- 34)	32(31- 33)	36(34- 38)	31(30- 32)

	A/Pan/2007/99	29(27- 31)	31(28- 34}	34(32- 36)	32(31- 33)
	B/Yam/166/98	36(34- 38)	33(32- 34)	I o (\)	31 (29- 33)
chřipkový vakcinační prostředek obsahuj ící stabilizátoru	A/NCal/20/99	31 (30- 32)	32(31- 33)	36(34- 38)	32(31- 35)
ot— tokoferolsukci nát	A/Pan/2007/99	33(30- 36}	33(30- 36}	36(35- 37)	33(31- 35)
	B/Yam/166/98	37(35- 39)	36(34- 38)	38 (35- 41)	36(33- 39)

- 14CZ 298697 B6

Příklad 3: Způsob SRD používaný k měření obsahu hemaglutininu

Skleněné plotny (12,4 až 10,0 cm) jsou potažené agarózovým gelem obsahujícím koncentraci séra proti HA influenzy, která je doporučena NIBSC. Po vytvoření gelu se vytvoří do agarózy 72 prohlubní určených pro vzorky (průměr prohlubně je 3 mm). Do každé prohlubně se nanese 10 mikrolitrů vhodného ředění referenčního vzorku a ostatních vzorků. Plotny se pak nechají inkubovat po dobu 24 hodin při teplotě místnosti (20 až 25 °C) ve vlhké buňce. Pak se plotny nechají přes noc nasáknout roztokem chloridu sodného a krátce se promyjí destilovanou vodou, ío gel se pak stlačí a vysuší. Když se gel úplně vysuší, destičky se barví v roztoku briliantové modře podle Commassie po dobu 10 minut a dvakrát se odbarvují ve směsi metanolu a kyseliny octové až jasně definované obarvené zóny se stanou viditelné. Po vysušení ploten se měří průměr obarvených zón obklopujících prohlubeň santigenem ve dvou směrech, které svírají pravý úhel.

V jiném případě je možné použít zařízení, které měří povrch. Zkonstruovaly se křivky závislé na dávce, kdy se vyneslo ředění antigenu proti povrchu zón a výsledky se počítaly podle standardních metod popsaných v publikaci Finney, D. J. (1952). Statistical Methods in Biological Assay. London: Griffín, Quoted in: Wood, JM, et al (1977). J. Biol. Standard. 5: 237-247).

Příklad 4: Klinické testy chřipkového vakcinačního prostředku stabilizovaného a-tokoferolem (omezený obsah thiomersalu)

V případě klinického testování se používají injekční stříkačky získané způsobem popsaným v příkladu 2.

H3N2: A/Panama/2007/99 RESVIR-17

H1N1: A/New Caledonia/20/99 (HlNl)IVR-l 16)

B: B/Yamanashi/166/98

Tabulka č. 3

	dospělí 18 až 60 let
		thio- red.			thio- plus
		H3N2	H1N1	B	H3N2	H1N1	B
pre- vakc.	GMT	47	41	111	55	37	102
	titrdO( %)	10,3%	13,8 %	1,7 %	5,3 %	12,3 %	8,8 %

-15CZ 298697 B6

	titr Ž40,SPR (%)	60,3%	55,2 %	75,9 %	70,2 %	52,6 %	75,4 %
post- vakc.	stupeň sérokon verze	10,3%	13,8 %	1,7 %	5,3 %	12,3 %	8,8 %
	podst. zvýšení titru protilát ky	58, 6%	74,1 %	58,6 %	63,2 %	73,7 %	52,6 %
	sérokonv erze (%}	58,6%	74,1 %	58,6 %	63,2 %	73,7 %	52,6 %
	GMT	328	525	766	324	359	588
	násobek GMT	7,3	13,0	6,9	5,9	9,8	5,9
	titr^40, SPR (%)	100 %	100 %	100 %	100 %	100 %	100 %

n.d. = C.I. pro poměr p=n/N není definován, protože p*(l-p)*N<9 n/N = respondéři (n) jako část počtu subjektů (sub)populace (N) to je sérokonverze nebo podstatné zvýšení, také se popisuje v CPMAP/BWP/214/96 12.3.1997, p. 17ff.

GMT = geometrický průměr hodnoty titru, převrácená hodnota 95 % C.I. = 95 % interval spolehlivosti

SPR = stupeň ochrany sérem: podíl subjektů s ochranným titrem před vakcinací nebo po vakciío naci >40 titr = titr Hl-protilátek stupeň sérokonverze = podíl subjektů se zvýšením množství protilátek z hodnoty <10 před vakcinací na hodnotu >40 po vakcinací násobek GMT = násobek zvýšení GMT podstatné zvýšení = podíl subjektů s titrem protilátky >10 před vakcinací a 4 násobné zvýšení množství protilátek po vakcinací req. = požadavky EU

Sérokonverze = negativní nebo pozitivní nebo příklad 4 násobné (negativní: titr <10, pozitivní:

titr >40) — podíl subjektů, kteří vykazují sérokonverzi (<10 až >40) nebo podstatné zvýšení.

-16CZ 298697 B6

Výsledky ukazují, že použitím vakcinačního prostředku je možné dosáhnout ekvivalentní ochrany jako v případě vakcinačního prostředku, který obsahuje thiomersal, jako konzervační činidlo.

Příklad 5a: Příprava antigenního přípravku viru influenzy za použití cc-tokoferolsukcinátu, jako stabilizačního činidla v případě vakcinačního prostředku, který neobsahuje thiomersal

Monovalentní štěpený vakcinační prostředek se připravil podle následujícího prostupu.

Příprava virového inokula

V den inokulace vajíček obsahujících embryo se připravilo čerstvé inokulum smícháním pracovní očkovací dávky s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím gentamycin15 sulfát v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortizon v koncentraci 25 pg/ml (v závislosti na kmenu viru). Vírové inokulum se udržovalo při teplotě 2 až 8 °C.

Inokulace vajíček obsahujících embrya

V případě replikace viru se použily devět až jedenáct dnů stará vajíčka s embryem. Skořápky jsou dekontaminovány. Vajíčka se inokulovala inokulem viru o objemu 0,2 ml. 60 000 inokulovaných vajíček se inkubovalo při vhodné teplotě (závislé na virovém kmenu) po dobu 48 až 96 hodin. Nakonec inkubační doby se embrya usmrtila ochlazením a vajíčka se uchovávala po dobu 12 až 60 hodin při teplotě 2 až 8 °C.

Inokulace vajíček obsahujících embrya

Hromadění

Z ochlazených vajíček s embryi se shromáždila alantaoická tekutina. Z jednoho vejce se získá 8 až 10 ml surové alantoické tekutiny.

Zvýšení koncentrace a čištění celého viru z alantoické tekutiny

Čiření

Srážení

Saturovaný roztok síranu amonného se přidal do vyčiřeného produktu, aby se dosáhl konečné koncentrace síranu amonného 0,5 mol/1. Po sedimentaci po dobu alespoň jedné hodiny se odstra50 nila sraženina filtrací na filtrech, jejich velikost pórů je v typickém případě 0,5 pm.

Filtrace

Vyčiřený surový celý virus se filtroval přes filtrační membrány končící osvědčenou sterilní mem55 bránou s velikostí pórů 0,2 pm.

- 17CZ 298697 B6

Ultrafiltrace

Sterilní filtrovaný surový monovalentní celý virus se koncentroval na kazetě vybavené membránou BIOMAX^(tm) s hodnotou MWCO 1 000 000 alespoň šestkrát. Koncentrovaný roztok se pro5 myl fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem alespoň 1,8 krát.

Centrifugace v sacharidovém gradientu

Koncentrace viru influenzy se zvýšila izopyknickou centrifugací v lineárním sacharózovém graío dientu (0,55 % hmotnost/objem)). Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů/hodinu.

*závisí na virovém kmenu: frakce 3 může být redukována na 15 % sacharózu.

V případě další přípravy vakcinačního prostředku se použila bud’ pouze frakce 2, nebo frakce 2 spolu s další čištěnou frakcí 3.

Frakce 3 se promyla diafiltrací fosforečnanovým pufrem za účelem redukovat obsah sacharózy pod 6 %. Tento krok se může vypustit. Virus influenzy přítomný v této ředěné frakci se shromáž25 díl do peletu, aby se odstranily rozpuštěné nečistoty.

Pelet se resuspendoval a dobře se promíchal za účelem získání homogenní suspenze. Shromáždily se frakce 2 a resuspendovaný pelet frakce 3 a přidal se fosforečnanový pufr, aby se dosáhlo konečného objemu 40 litrů. Tento produkt je monovalentní koncentrát celého viru.

Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným

Koncentrace monovalentního celého viru influenzy se vnesl do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem) a v případě virů kmene B se přidá tokoferolsukcinát až do koncentrace 0,5 mM. Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.

Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharóza se měří reflektometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.

Sterilní fdtrace

Frakce štěpeného viru se filtrovala na filtračních membránách končících membránou s velikostí pórů 0,2 pm. V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a (v případě virů kmene B) se používá 0,5 mM tokoferylsukcinát. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek původního objemu frakce.

Deaktivace

Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22±2 °C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit). Pak se přidá fosforečnanový

-18CZ 298697 B6 pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 450 pg/ml. V případě virů kmenů B se aplikoval za účelem ředění fyziologický roztok upravený fosforečnanovým pufrem obsahujícím 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,25 mM tokoferolusukcinát, přičemž se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 100 pg/ml, a deaktivace probíhá při teplotě 20±2 °C po dobu alespoň 72 hodin.

Ultrafiltrace io Koncentrace deaktivovaného štěpeného virového materiálu se zvýšila dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami z acetátu celulózy s hodnotu MWCO 20 000. Materiál se následně promyje fosforečnanovým pufrem obsahujícím 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween. V případě virů kmene B se za účelem promývání použil fyziologický roztok pufrovaný za účelem promývání použil fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahujícím 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,1 mM tokoferylsukcinát.

Konečná sterilní filtrace

Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 μιη. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a specificky v případě viru kmene B 0,1 mM tokoferylsukcinát.

Uchovávání

Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8 °C po dobu maximálně 18 měsíců.

Stabilita

Tabulka č. 4: Porovnání obsahu HA (pg/ml) v závislosti na čase stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách

Kmen	Stabilizátor	Po produkci	4 týdny při teplotě 30 °C	6 týdnů při teplotě 2 až 8°C
B/Johannes	tokcferolsuk	214	196	206
burg/5/99 ---------.	cinát		(92%)	(96%)
B/Johannes	žádný	169	107	153
burg/5/99* *			(63%)	(90%)

**připravovaný podle příkladu 1 bez tokofeiyl sukcinátu

-19CZ 298697 B6

Příklad 5b: Příprava antigenního prostředku viru influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru v případě vakcinačního prostředku, který neobsahuje thiomersal

Výhodná odchylka způsobu popsaného v příkladu 5a je následující:

Po shromáždění celého viru následuje srážení (srážení síranem amonným). Pak následuje krok čiření, kde tekutina se čiří centrifugací pří mírné rychlosti (v rozmezí 4000 až 14 000 g). Pořadí kroku srážení a čiření je opačné ve srovnání s příkladem 5a.

Následující kroky sterilní filtrace, ultrafiltrace a ultracentrifugace (centrifugace v sacharózovém gradientu) jako v příkladu 5a. Není nutné opět zpracovávat frakce, které jsou výsledkem kroku ultracentrifugace.

Zbývající kroky postupu se popisují v příkladu 5a.

Pak postup shrnutý v tomto příkladu je následující: hromadění srážení (síranem amonným) čiření sterilní filtrace ultrafiltrace ultracentrifugace štěpení (s výhodou deoxycholátem sodným) sterilní filtrace deaktivace ultrafiltrace konečná sterilní filtrace

Jiná výhodný verze příkladu 5a zahrnuje krok pre-filtrace před první sterilní filtrací. V tomto případě se použije membrána, která není sterilní filtrem, ale která umožňuje odstranění nečistot, například albuminu, před sterilní filtrací. Tento krok umožňuje dosažení lepšího výtěžku. Vhodná membrána pro pre-filtraci je přibližně ta s velikostí pórů 0,8 pm až přibližně 1,8 μιη, například 1,2 μιη. Pre-filtrace se může použít ve schématu příkladu 5a nebo příkladu 5b.

Příklad 6: Příprava vakcinačního prostředku influenzy za použití α-tokoferolsukcinátu jako stabilizátoru v případě vakcinačního prostředku, který neobsahuje thiomersal.

Monovalentní konečné dávky tří kmenů A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116, A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17 a B/Yamanashi/166/98 se připravovaly způsobem popsaným v příkladu 5.

Hromadění

Vhodné množství monovalentních konečných dávek se shromáždilo tak, aby konečná koncentrace HA byla 30 pg/ml v případě A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116, A/Panama/2007/99/(H3N2)Resvir-17 a respektive 36 pg/ml v případě B/Johannesburg/5/97. Koncentrace přípravku Tween 80 a Triton X-100 se upravila na hodnotu 580 pg/ml respektive 90 pg/ml. Konečný objem se upravil na 3 1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem. Trivalentní produkt se filtroval přes membrány končící membránou z acetátu celulózy s velikostí pórů 0,8 μιη za účelem získání trivalentní celulózy s velikostí pórů 0,8 μιη za účelem získání trivalentní konečné

-20CZ 298697 B6 dávky. Trivalentní konečná dávka se naplnila do injekčních stříkaček, kdy každá obsahuje alespoň objem 0,5 ml.

Tabulka č. 5: Porovnání obsahu HA (pg/ml) v závislosti na čase stanoveném SRD vtrivalentních konečných dávkách.

vakcinační prostředek	kmen	0 měsiců	4 týdny při teplotě 30 °C	6 raěsiců při teplotě 2 až 8°C
vakcinační prostředek influenzy bez stabilizátoru	A/NCal/20/99	31	32	30
	A/Pan/2007/99	31	34	33
....	B/Joh/5/99*	35	25	31
vakcinační prostředek	A/NCal/20/99	34	35	34

influenzy obsahující a-tokoferolsukcinát
	A/Pan/2007/99	33	33	34
	B/Joh/5/99**	29	25	28

ío * Prostředek je založen na cílové koncentraci 39 pg/ml.

**Prostředek je založen na cílové koncentraci 34 pg/ml.

Příklad 7: Příprava antigenního přípravku viru influenzy za použití laurylsulfátu sodného jako stabilizátoru pro vakcinační prostředek bez konzervačních činidel (vakcinační prostředek s omezeným množstvím thiomersalu)

Monovalentní koncentrát celého viru kmene B/Johannesburg/5/99 se získal způsobem popsaným v příkladu 1

Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným

Koncentrát monovalentního celého viru influenzy se aplikoval do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gra25 dientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do koncentrace 0,1 % (hmotnost/objem). Maximální koncentrace deoxycholátu sodného (hmotnost/objem). Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) aje závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.

-21 CZ 298697 B6

Na konec centrifugace se obsah rotoru rozdělí do třech různých frakcí (sacharóza se měří refraktometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.

Sterilní filtrace

Vzorky frakce 2 o objemu 10 ml se použily pro další zpracování. Oddělená virová frakce se filtrovala na filtračních membránách končících membránou s velikostí pórů 0,2 pm. V případě ředění se použil fosforečnanový pufř obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 až 0,5 mM laurylsulfát sodný. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek počátečního objemu frakce.

Deaktivace

Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22±2 °C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit). Pak se přidá fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak 0,5 mM laurylsulfát sodný za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 250 pg/ml. Přidá se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 50 pg/ml a deakti20 vace probíhá při teplotě 20±2 °C po dobu 72 hodin.

Ultracentrifugace

Koncentrace deaktivovaného štěpeného virového materiálu se zvýšila alespoň dvakrát v ultra25 filtrační jednotce vybavené membránami acetát celulózy s hodnotu MWCO 20 000. Materiál se následně promyl 4 objemy fyziologického roztoku upraveného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravku Tween a 0,5 mM laurylsulfát sodný.

Konečná sterilní filtrace

Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se řídil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a 0,5 mM laurylsulfát sodný.

Uchovávání

Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8 °C.

Tabulka č. 7: Porovnání obsahu HA v závislosti na čase (pg(/ml) stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách.

	stabilizátor	po produkci	4 týdny při teplotě 30 °C
B/Johannesburg/5/99	žádný*	182	139 (77%)
B/Johannesburg/5/99	laurylsulfát sodný	288	264(92%)

*připravovaný podle příkladu 7 bez přidání laurylsulfátu sodného

-22CZ 298697 B6

Příklad 8: Příprava antigenního prostředku viru influenzy za použití přípravku Plantacare nebo Laureth-9 jako stabilizátoru v případě vakcinačního prostředku bez konzervačních činidel (vakcinační prostředek s omezeným obsahem thiomersalu)

Monovalentní koncentrát celého viru kmene B/Yamanashi/166/98 se získal jak se popisuje v příkladu 1.

Fragmentace

Monovalentní koncentrát celého viru influze se ředil tak, aby koncentrace proteinu byla 1000 pg/ml pomocí íyziologického roztoku upraveného fosforečnanem s hodnotou pH 7,4. Přidal se přípravek Plantacare^(R) 2000 UP nebo Laureth-9 v konečné koncentraci 1 % (hmotnost/objem). Materiál se lehce míchal po dobu 30 minut. Pak se materiál nalil na 15 % (hmotnostní) sacharózový polštář. Ultracentrifugace v Beckmanově rotoru SW 28 se provedla po dobu 2 hodin při 25 000 ot./min. a při teplotě 20 °C.

Sterilní filtrace

Supematant se odebral pro další zpracování. Frakce štěpeného viru se filtrovala na filtračních membránách končících membránou o velikosti pórů 0,2 μηι.

Deaktivace

Za účelem snížit celkový obsah proteinu na maximální hodnotu 500 pg/ml se přidal fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem. Formaldehyd se přidal v konečné koncentraci 100pg/mI a deaktivace probíhala při teplotě 20±2 °C alespoň po dobu 6 dní.

Ultrafiltrace

Koncentrace přípravku Tween 80 a Triton X 100 se upravila v deaktivovaném materiálu na hodnotu 0,15% respektive 0,02%. Koncentrace deaktivovaného štěpeného virového materiálu se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené acetát celulózovou membránou s hodnotou MWCO 30 000. Materiál se následně promyl 4 objemy fyziologického roztoku puf35 rovaného fosforečnanem.

Konečná sterilní filtrace

Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry o velikosti 0,2 μηι. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 500 pg/ml, fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem.

Uchovávání

Monovalentní konečná dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8 °C.

-23 CZ 298697 B6

Tabulka č. 8: Porovnání obsahu HA v závislosti na čase (pg/ml) stanoveném SRD v monovalentních konečných dávkách.

	stabilizátor	po produkci	4 týdny při teplotě 30 °C
B/Yamanashi/166 /98	žádný	143	98 (68%)
B/Yamanashi/166 /98	Plantacare® 2000 UP	476	477 (100 %)
B/Yamanashi/166 /98	Laureth-9	468	494 (>100%)

Příklad 9: Klinické testování vakcinačního prostředku influenzy stabilizovaného a-tokoferolem (snížený obsah thiomersalu) u starých lidí prostřednictvím ID a IM aplikace

A. Příprava antigenního přípravku viru influenzy

Příprava virového inokula

V den inokulace vajíček obsahujícím embryo se připravilo čerstvé inokulum smícháním pracovní očkovací dávky s fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem obsahujícím sulfát gentamycinu v koncentraci 0,5 mg/ml a hydrokortizon v koncentraci 25 pg/ml v závislosti na kmenu viru). Virové inokulum se udržovalo při teplotě 2 až 8 °C.

Inokulace vajíček obsahujícím embrya

V případě replikace viru se použily devět až jedenáct dnů staré vajíčka s embryem. Skořápky jsou dekontaminovány. Vajíčka se inokulovala inokulem viru o objemu 0,2 ml. Inokulovaná vajíčka se inkubovala při vhodné teplotě (závislé na virovém kmenu) po dobu 48 až 96 hodin. Nakonec inkubační doby se embrya usmrtila ochlazením a vajíčka se uchovávala po dobu 12 až 60 hodin při teplotě 2 až 8 °C.

Hromadění

Z ochlazených vajíček embryi se shromáždila alantaoická tekutina. Z jednoho vejce se shromáždí obvykle 8 až 10 ml surové alantoické tekutiny.

Zvýšení koncentrace a čištění celého viru z alantoické tekutiny

1. Čiření

-24CZ 298697 B6

2. Adsorpce

Aby se vytvořil gen CaHPO₄ v čištěném shromážděném viru, přidal se 0,5 mol/1 Na₂HPO₄ a 0,5 mol/1 roztok CaCl₂ tak, aby se dosáhlo konečné koncentrace CAHPO₄ 1,5 g až 3,5 g CaHPO₄ najeden litr v závislosti na kmenu viru.

3. Filtrace

Resuspendovaný sediment se filtroval přes filtrační membránu s velikostí pórů 6 μιη.

4. Centrifugace v sacharidovém gradientu

Koncentrace viru influenzy se zvýšila izopyknickou centrifugací v lineárním sacharózovém gradientu (0,55 % (hmotnost/objem)) obsahujícím 100 pg/ml thiomersalu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů/hodinu.

V případě další přípravy vakcinačního prostředku se použily pouze frakce 2 a 3.

Frakce 3 se promyla diafíltrací s fosforečnanovým pufrem za účelem redukovat obsah sacharózy pod hodnotou přibližně 6 %. Virus influenzy přítomný v této ředěné frakci se shromáždil do peletu, aby se odstranily rozpuštěné nečistoty.

Pelet se resuspendoval a dobře se promíchal za účelem získání homogenní suspenze. Shromáždily se frakce 2 a resuspendovaný pelet frakce 3 a přidal se fosforečnanový pufr, aby se dosáhlo konečného objemu 40 litrů. Objem odpovídá 120 000 vajec v sádce. Tento produkt je monovalentní koncentrát celého viru.

5. Centrifugace v sacharidovém gradientu s deoxycholátem sodným

Monovalentního koncentrát celého viru influenzy se aplikoval do ultracentrifugy ENI-MARK II. Rotor K3 obsahuje lineární sacharidový gradient (0,55 % (hmotnost/objem)), který se přelije gradientem deoxycholátu sodného. Během štěpení je přítomen přípravek Tween 80 až do kon45 centrace 0,1 % (hmotnost/objem) a v případě virů kmene B se přidá tokoferolsukcinát až do koncentrace 0,5 mM. Maximální koncentrace deoxycholátu sodného je 0,7 až 1,5 % (hmotnost/objem) a je závislá na kmenu. Průtoková rychlost je 8 až 15 litrů za hodinu.

Na konci centrifugace se obsah rotoru rozdělil do třech různých frakcí (sacharózu se měří refrak50 tometrem). Frakce 2 se použije pro další zpracování. Obsah sacharózy v případě limitu u jednotlivých frakcí kolísá v rozmezí 47 až 18 % podle kmenů a po zhodnocení je konstantní.

-25CZ 298697 B6

6. Sterilní filtrace

Frakce štěpeného viru se filtrovala na filtračních membránách končících membránou s velikostí pórů 0,2 pm. V případě ředění se použil fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/5 objem) přípravku Tween 80 a (v případě virů kmene B) a 0,5 mM tokoferolsukcinát. Konečný objem filtrované frakce 2 je 5-ti násobek počátečního objemu frakce.

7. Deaktivace ío Filtrovaný monovalentní materiál se inkuboval při teplotě 22±2 °C po maximální dobu 84 hodin (v závislosti na virových kmenech, tuto inkubaci je možné zkrátit). Pak se přidá fosforečnanový pufr obsahující 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 za účelem redukovat celkový obsah proteinu na maximální koncentraci 250 pg/ml. V případě virů kmene B se aplikoval za účelem ředění fyziologický roztok upravený fosforečnanem obsahující 0,025 % (hmot15 nost/objem) přípravku Tween 80 a 0,25 mM tokoferolsukcinát, přičemž se obsah celkového proteinu sníží na 250 pg/ml. Přidá se formaldehyd tak, aby konečná koncentrace byla 50 pg/ml a deaktivace probíhá při teplotě 20±2 °C po dobu alespoň 72 hodin.

8. Ultrafiltrace

Koncentrace deaktivovaného materiálu štěpeného viru se zvýšila alespoň dvakrát v ultrafiltrační jednotce vybavené membránami acetátu celulózy s hodnotu MWCO 20 000. Materiál se následně promyl fosforečnanovým pufrem, který obsahuje 0,025 % (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a pak fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem, který obsahuje 0,01 (hmotnost/25 objem) přípravku Tween. V případě viru kmene B se při promývání používá fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem obsahujícím 0,01% (hmotnost/objem) přípravku Tween 80 a 0,1 mM tokoferolsukcinát.

9. Konečná sterilní filtrace

Materiál po ultrafiltraci se filtroval přes filtrační membrány, které končí membránou s póry 0,2 pm. Filtrační membrány se promyly a materiál se ředil tak, aby koncentrace proteinu nepřekročila 1000 pg/ml, za použití fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem, který obsahuje 0,01 % (hmotnost/objem) přípravek Tween 80 a (v případě viru kmene B) 0,1 mM toko35 ferolsukcinát.

10. Uchovávání

Monovalentní koncová dávka se uchovávala při teplotě 2 až 8 °C po dobu maximální 18 měsíců.

B. Příprava vakcinačního prostředku viru influenzy

Monovalentní konečná dávka třech kmenů A/New Caldonia/20/00(H1N1)IVR-116, A/Panama/2007/99 (H3N2) Resvir-17 a B/Johannesburg/5/99 se připravily způsobem popsaným v části A shora v textu.

Hromadění

Shromáždilo se vhodné množství monovalentních konečných dávek tak, aby konečná koncent50 race HA byla 60 pg/ml v případě kmenů A/New Caldonia/20/99(H1N1)IVR-116 respektive A/Panama/2007/99(H3N2)Resvir-17 a 68 pgf(ml v případě B/Johannesburg/5/99. Přípravky Tween 80, Tween X-100 tokoferolsukcinát se upravily tak, aby jejich koncentrace byla 1000 pg/ml, 110 pg/ml respektive 160 pg(ml. Konečný objem se upravil na 3 1 fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem. Trivalentní produkt se filtroval nakonec přes membránu

-26CZ 298697 B6 tvořenou acetátem celulózy s velikostí pórů 0,8 pm za účelem získání trivalentní konečná dávka. Do každé injekční stříkačky se naplnilo alespoň 0,5 ml trivalentním konečné dávky.

Aplikace vakcinačního prostředku

Vakcinační prostředek je dostupný v předem naplněné injekční stříkačce a aplikoval se intradermálně do deltové oblasti. Používá se intradermální jehla (ID) popsaná v patentovém dokumentu EP 1092444 s penetračním omezovačem, který zaručuje správnou intradermální aplikaci. Protože tvorba boule v místě aplikace injekce demonstruje správnou aplikaci ID, pak je možné 30 minut ío po aplikaci měřit skutečnou velikost uvedené boule.

Jedna dávka o objemu 100 μΐ obsahovala následující složky:

hemaglutinin ze tří kmenů influenzy
	A/New Caledonia/20/99		6,0 pg

	A/Panama/2007/99		6,0 pg
	B/Johannesburg 5/99		6,0 pg
konzervační činidlo thiomersal		0,4 pg-0,8 pg

Shora uvedený vakcinační prostředek se porovnával se standardním trivalentním štěpeným vakcinačním prostředkem influenzy Fluarix^(tm). Vakcinační prostředek Fluarix se dodává v předem naplněných injekčních stříkačkách a aplikoval se intramuskulámě do deltového svalu. Použila se jehla o délce alespoň 2,5 cm (23 gauge), aby se zaručila správná intramuskulámí aplikace.

Jedna dávka (0,5 ml) obsahovala následující složky:

hemaglutinin ze tří kmenů influenzy
	A/New Caledonia/20/99		15,0 pg
	A/Panama/2007/99		15,0 pg
	B/Johannesburg 5/99		15,0 pg
konzervační činidlo thiomersal		50,0 pg

Výsledky

Průměrný věk celkové kohorty v době aplikace vakcinačního prostředku byl 70,4+6,2 let. Poměr žen k mužům byl 1,7:1.

-27CZ 298697 B6

Výsledky imunogennosti: Analýza proměnných imunogennosti byla následující:
proměnné		Flu-red ID (N=65)	Fluarix^(tm\| IM (N=65)
GMT		GMT	LL	UL	GMT	LL	UL
A/New Caledonia	před	99,5	76,9	128,7	90,0	70,1	115,7

-28CZ 298697 B6

	po	165,1	129,2	211,0	174,3	133,3	227,9
A/Panama	před	75,5	54,7	104,2	69,2	51, 9	92,4
	po	128,6	99,1	166,8	164,3	126,0	214,1
B/Johannesburg	před	236,0	187,7	296,8	222,6	176,9	280,2
	P°	341,2	276,0	421,7	402,4	312,1	518,9
stupeň sérokonverze		%	LL	UL	%	LL	UL
A/New Caledonia		15, 4	7,6	26,5	18,5	9,9	30,0
A/Panama		20,0	11,1	31,8	29,2	18,6	41,8
B/Johannesburg		9,2	3,5	19,0	16, 9	8,8	28,3
Faktor konverze		GMR	LL	UL	GMR	LL	UL
A/New Caledonia		1,7	1,4	2,0	1,9	t—1	2,3
A/Panama		1,7	1,4	2,1	2,4	1,9	3,0
B/Johannesburg		1,4	1,2	1,7	1,8	1,5	2,1
stupeň ochrany sérem	%	LL	UL	%	LL	UL
A/New Caledonia	před	87,7	77,2	94,5	90,8	81,0	96,5
	po	92,3	83,0	97,5	96, 9	89,3	99,6
A/Panama	před	75,4	63,1	85,2	81, 5	70,0	90,1
	PO	90,8	81,0	96,5	93,8	85, 0	98,3
B/Johannesburg	před	98,5	91,7	100,0	96,9	89,3	99, 6
	po	100,0	94,5	100,0	98,5	91,7	100,0

-29CZ 298697 B6

N: počet subjektů s dostupnými výsledky, %: procento subjektů s daným parametrem, LL/UL: nižší a vyšší limit 95% CI, Před: v čase aplikace vakcinačního prostředku, po: 21 dní po vakcinační dávce

Bolest v místě aplikace, zaznamenalo 10 ze 65 (15,4 %) subjektů, byl nejběžnější symptom po 5 IM aplikaci prostředku Fluarix^(tm). V ID skupině bolest zaznamenaly 3 z 65 (4,6 %) subjektů.

Tento rozdíl byl statisticky podstatný (p=0,038, Fišerům exaktní test). Výhodné je ID zavedení produktu s omezeným obsahem thiomersalu.

Závěry

100 % ochrany sérem u starých lidí se může dosáhnout jak ID tak IM aplikací vakcinačního prostředku influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu.

U jedinců vakcinovaných IM a ID, kde skupině ID se aplikovalo 2,5 krát méně antigenu, se 15 dosáhlo porovnatelné odezvy na vakcinaci, co se týče hodnot geometrického průměru titrů, stupně ochrany sérem, stupně sérokonverze a konverzních faktorů. Neexistuje rozlišitelný rozdíl ve všech výskytech symptomů spojených s vakcinací v obou skupinách.

Příklad 10: Intradermální zavedení vakcinačního prostředku influenzy s omezeným obsahem 20 thiomersalu

Imunogennost vakcinačního prostředku štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu připraveného způsobem popsaným v příkladu 9 (s tou výjimkou , že hromadění se provedlo nezávisle na vakcinační prostředek se naplnil do injekčních stříkaček) se hodnotila ID zavedením do morčat za použití standardní jehly.

Každá skupina obsahující 5 zvířat se primárně imunizovala celým deaktivovaným trivalentním virem influenzy obsahující 5 pg každého HA v celkovém objemu 200 pl. Dvacet osm dní po nebo intramuskulámě. Intradermální dávky obsahující 0,1, 0,3 nebo 1,0 pg trivalentního štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu v 0,1 ml se aplikovaly do zad morčat za použití standardní jehly. Intramuskulámí dávka obsahující 1,0 pg trivalentního štěpeného viru influenzy s omezeným obsahem thiomersalu se aplikovala do zadní nohy morčete v objemu 0,1 ml. Skupiny byly následující:

• Skupina 1: 0,1 pg trivalentního ID štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu • Skupina 2: 0,3 pg trivalentního ID štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu • Skupina 3: 1,0 pg trivalentního ID štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu • Skupina 4: 1,0 pg trivalentního IM štěpeného viru influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu

Čtrnáct dní po vakcinaci se zvířata nechala vykrvácet a titry protilátek vyvolaných vakcinací se hodnotily za použití standardního hemaglutinačního inhibičního testu (Hl). Výsledky jsou zobra45 zeny na obrázku č. 1. Vakcinací se vyvolaly silné Hl odezvy na všechny tři kmeny. Není jasná odezva na dávku, což naznačuje, že velmi nízké dávky antigenu s redukovaným množstvím thiomersalu mohou stále vyvolat velmi silnou Hl protilátkovou odezvu, když se aplikují ID způso-30CZ 298697 B6 bem. Neexistuje podstatný rozdíl mezi H1 titry vyvolanými ID nebo IM vakcinací. Pak výsledky získané v případě morčat potvrzují, že antigeny trivalentních štěpených virů influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu vyvolávají podobný stupeň HI protilátek u zvířat, když se zavádějí ID způsobem ve srovnání s IM způsobem.

Příklad 11: Intradermální zavedení vakcinačního prostředku influenzy upraveného pomocnou látkou obsahujícího redukované množství thiomersalu ío Protokol

Morčata se primárně intranasálně imunizovala v den 0 pěti mikrogramy trivalentního celého deaktivovaného viru influenzy v objemu 200 pl.

Vakcinace proběhla v den 28 vakcinačním prostředkem obsahujícím 0,1 pg HA jednoho kmene privalentního štěpeného viru influenzy připraveného způsobem popsaným v příkladu 9 (konečná koncentrace každého antigenů v dané dávce 0,1 pg ve 100 pije 1,0 pg/ml ve srovnání s 60 pg/ml uvedenými v příkladu 9). Konečný trivalentní prostředek se aplikoval intradermálně za použití tuberkulinových injekčních stříkaček v objemu 100 pl. Vakcinační prostředek je buď upraven adjuvans, nebo není upraven adjuvans.

Vykrvácení zvířat - den 42.

Účinek úpravy adjuvans se hodnotil měřením proti látkových odezev HI testem (den 0, 28, 42).

Všechny ID experimenty se provedly za použití standardní jehly.

Výsledky

G1 až G5 odpovídá 5-ti skupinám morčat, kdy každá skupina obsahuje 5 zvířat.

G1 štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg.

G2 štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPL 50 pg.

G3 štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množství thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPL 10 pg.

G4 štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg + 3D-MPLÍ 50 pg + QS21 50 pg.

G5 štěpený trivalentní vakcinační prostředek s redukovaným množstvím thiomersalu 0,1 pg +

3D-MPLin 10 pg + QS21 10 pg.

Poznámka 3D-MPLin+QS21 znamená adjuvantní prostředek, který obsahuje unilamelámí vehikuly obsahující cholesterol, které mají lipidovou dvojvrstvou obsahující dioleylfosfatidylcholin, kde QS21 a 3D-MPL je spojen s lipidovou dvojvrstvou nebo jsou v ní uloženy. Takové adjuvantní prostředky se popisují v patentovém dokumentu EP 0 822 831 B.

HI titry proti kmenu A/New Caledonia/20/99

-31 CZ 298697 B6

NC	Pre-imunizace	pre-vakcinace	post-vakcinace
Gl	5	10	92
G2	5	10	70
G3	5	11	121
G4	7	9	368
G5	5	10	243

HI titry proti kmenu A/Panama/2007/99

P	pre-imunizace	pre-vakcinace	pre-vakcinace
Gl	5	4 85	7760
G2	5	279	7760
G3	5	485	8914
G4	7	485	47051
G5	5	320	17829

Hi titry proti kmenu B/Johannesburg/5/99

J	pre-imunizace	post-vakcinace	post-vakcinace
Gl	5	23	184
G2	5	11	121
G3	5	11	70
G4	6	15	557
G5	5	13	320

Pak uvedený i neupravený trivalentní štěpený vakcinační prostředek influenzy s redukovaným obsahem thiomersalu je silný imunogen a je schopný vyvolat silné HI odezvy, když se aplikuje

-32CZ 298697 B6

ID nebo IM způsobem. Tyto odezvy se jeví být alespoň tak silné, jako jsou odezvy vyvolané standardním vakcinačním prostředkem Fluarix.

Příklad 12: Porovnání vakcinačních prostředků, které obsahují a neobsahují thiomersal, zavedených intradermálně prasatům

Za účelem hodnocení imunogennosti štěpeného vakcinačního prostředku influenzy (obsahující a neobsahující thiomersal) aplikovaného ID způsobem se použil model primárně imunizovaných ío prasat. Velká většina populace už měla zkušenosti alespoň s infekcí viru influenzy, proto vakcinační prostředek musí být schopný zesílit už existující imunitní odezvu. Zvířata jsou proto primárně imunizována, aby se co nejlépe simulovala situace u člověka.

V tomto experimentu se 4 týdny stará selata primárně imunizovala intranasální cestou. Šest sku15 pin, kdy každá obsahuje 5 zvířat, se primárně imunizovalo následujícím způsobem.

Skupina 1 se primárně imunizovala dvakrát v den 0 a 14 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA). Skupina 2 se primárně imunizovala dvakrát v den 0 a 14 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA). Skupina 3 se primárně imunizovala jednou v den 0 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA). Skupina 4 se primárně imunizovala dvakrát v den 0 a 14 trivalentním celým deaktivovaným virem (50 pg každého HA).

dní po konečné primární imunizaci se zvířatům intradermálně aplikoval vakcinační prostředek obsahující 3 pg každého HA trivalentního štěpeného antigenního prostředku (kmeny A/New

Caledonia H1N1, A/Panama H3N2 a B/Johannesburt) ve 100 pl. Skupině 1 se aplikoval standardní vakcinační prostředek Fluarix^(tm) obsahující konzervační činidlo hiomersal. Všem ostatním skupinám se aplikoval antigenní prostředek, který neobsahuje konzervační činidlo.

HI výsledky získané v tomto experimentu jsou zobrazeny na Obr. 2 (inhibiční titry proti hema30 glutininu viru influenzy vyvolané u prasat primárně imunizovaných různými dávkami antigenu a vakcinované 3 pg trivalentním antigenním prostředkem influenzy obsahujícím nebo neobsahujícím thiomersal intradermálním způsobem).

HI titry vyvolané v tomto experimentu proti kmenu B jsou relativně nízké a pozadí proti kmenu

A/H3N2 je vysoké. Výhodný účinek, co se týká odezvy na vakcinaci, se pozoroval po snížení dávky primární imunizace. Skoro ve všech případech snížení koncentrace antigenu nebo počtu dávek primární imunizace (ze dvou primárních imunizací 50 pg) vede k zesílení odezvy na vakcinaci. Zatímco odezva zvířat ve skupinách 1 a 2, která se primárně imunizovaly dvakrát dávkou 50 pg, na vakcinaci není tak evidentní, zdá se, že antigenní prostředek neobsahující konzervační činidlo (skupina 2) funguje za uvedených podmínek alespoň stejně dobře jako standardní vakcinační prostředek Fluarix^(tm) (skupina 1). Silná odezva na vakcinaci trivalentním antigenním prostředkem influenzy, který neobsahuje konzervační činidlo, aplikovaný ID způsobem u zvířat, která jsou alternativně primárně imunizovány (skupina 3 až 6), je zřejmý a tuto odezvu je možné pozorovat dokonce v případě kmene B, ačkoliv HI titry zůstávají nízké.

Claims

1. Prostředek deaktivovaného viru influenzy pro použití jako vakcína proti chřipce, vyznačující se tím, že obsahuje antigen hemaglutinin stabilizovaný v nepřítomnosti thiomersalu nebo v přítomnosti nejvýš 0,5 pg/ml thiomersalu, kde hemaglutinin se detekuje SRD testem, přičemž prostředek obsahuje množství α-tokoferolsukcinátu, dostatečné pro stabilizaci HA.

2. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 1,vyznačující se tím, že α-tokoferolsukcinát je přítomen v koncentraci 1 pg/ml až 10 mg/ml.

3. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se tím, že 15 α-tokoferolsukcinát je přítomen v koncentraci 10 až 500 pg/ml.

4. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že antigenní materiál viru influenzy je vybrán ze skupiny zahrnující štěpené virové antigeny, dílčí antigeny, chemicky nebo jinak deaktivovaný celý virus.

5. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 4, vyznačující se tím, že antigenní materiál influenzy je štěpený virový antigen.

6. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznaču25 jící se tím, že obsahuje hemaglutinin kmene A a B viru influenzy.

7. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle nároku 6, vyznačující se tím, že jde o trivalentní prostředek viru chřipky.

30

8. Prostředek deaktivovaného viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje stabilizovaný HA viru influenzy kmene B.

9. Vakcína proti chřipce, vy z n a č uj í c í se tím, že obsahuje prostředek viru influenzy podle libovolného z nároků 1 až 8.

10. Vakcína proti chřipce podle nároku 9, vyznačující se tím, že koncentrace antigenu hemaglutinin v případě jednoho kmene influenzy nebo každého kmene influenzy je 1 až 1000 pg/ml, jak se stanovilo SRD testem.

40

11. Vakcína proti chřipce podle nároku 9 nebo 10, v y z n a č u j í c í se tím, že navíc obsahuje adjuvans.

12. Způsob přípravy stabilního antigenu hemaglutinin, vyznačující se tím, že zahrnuje čištění antigenu v přítomnosti α-tokoferolu nebo jeho derivátu, jako je a-tokoferolsukcinát.

13. Použití α-tokoferolu nebo jeho sukcinátu jako stabilizátoru hemaglutininu při výrobě vakcíny proti chřipce.