NO319132B1 - Okt produksjon av utsondrede proteiner fra rekombinante eukaryote-celler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår isolert DNA-sekvens av secl suppressorgen SSO som er valgt fra S001- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3, og fungale homologer derav, hvilken DNA-sekvens, når den overuttrykkes i eukaryote celler, gjør nevnte celler i stand til å danne økede mengder av utskilte proteiner. Spesielt angår foreliggende oppfinnelse nye rekombinante eukaryotiske celler transformert med slike SSO-gener eller deres homologer. En eukaryotisk celle transformer flere kopier av et SSO gen, eller et gen som er homologt med SSO har en øket kapasitet til å danne utsondrede fremmede eller endogene proteiner.

Videre kan de nevnte rekombinante eukaryote celler, spesielt gjær og filamentøs sopp, når de er transformert med gener som uttrykker passende hydrolytiske enzymer, hydrolysere og/eller anvende passende makromolekylære(poly-mer) forbindelser mere effektivt, noe som resulterer i øket cellemasseproduksjon og/eller mer flektibel anvendelse av forbindelsene i relevante biotekniske anvendelser.

Bakgrunn for Oppfinnelsen

Utviklingen av rekombinante DNA-metoder har gjort det mulig å fremstille proteiner i heterologe vertssystemer. Denne mulighet letter i stor grad produksjon av f.eks. proteiner av terapeutisk viktighet som normalt opptrer i naturen i meget små mengder eller er ellers vanskelige å isolere eller rense. Slike proteiner innbefatte vekstfaktorer, hormoner og andre biologisk aktive proteiner eller peptider som tradisjonelt er blitt isolert fra humant eller animalt vev eller kroppsvæsker, f.eks. blodserum eller urin. Den økende fare for tilstedeværelse av humane patogene virus slik som HBV, HIV, og onkogene virus eller andre patogener i de humane eller animalske vev eller kroppsvæskene har i stor grad påskyndet forskningen på heterologe produksjonssystemer for disse terapeutika. Andre proteiner av klinisk viktighet er virale eller andre mikrobielle eller humane parasittproteiner som er nødvendige for diagnose og for vaksiner spesielt fra slike organismer som er vanskelig å dyrke in vitro eller i vevskultur eller er farlige humane patogener. Disse innbefatter virus lik BHV, HIV, gul feber, rubella, FMDV, rabies og humane parasitter, slik som mala-ria.

En ytterligere gruppe proteiner for hvilke heterologe produksjonssystemer er blitt eller blir utviklet, er utskilte enzymer, spesielt de som hydrolyserer plantemateriale, og som er nødvendige i mat- og forproduksjon såvel som i andre industrielle prosesser innbefattende tekstilindustri og masse- og papirindustri. Muligheten for å danne proteiner i heterologe systemer eller produksjon av endogene proteiner i genetisk manipulerte celler øker deres utbytte og letter i stor grad deres opprenskning og har allerede til nå hatt stor innvirkning på studier av struk-tur og funksjon av mange viktige enzymer og andre proteiner. Produksjonen og utskillingen av fremmede hydrolytiske enzymer i f.eks. gjær resulterer i forbedringer i prosesser basert på industrielle gjærstammer slik som destillasjons-, bryggeri- eller bakergjær.

Forskjellige produksjonssystemer er blitt og blir utviklet innbefattende bakterier, gjær, filamentær sopp, dyre-, og plantecellekulturer og til og med mulitcellulære organismer slik som transgene dyr og planter. Alle av disse forskjellige systemer har sine fordeler og sine ulemper, og det er bruk for alle.

Gjærtypen Saccharomyces cerevisiae er for tiden den best kjente eukaryot ved genetisk nivå. Som en eukaryot mikrobe har den fordelene til en eukaryot celle lik de fleste, om ikke alle, av de post-transjonelle modifikasjoner av eukaryoter, og som en mikrobe deler den de lette håndte-rings- og dyrkningsegenskaper til bakterier. Fermenterings-systemene av stor skala er godt utviklet for S. cerevisiae som har en lang historie som en arbeidshest innen biotekno-logi innbefattende produksjon av matvarebestanddeler og drikkevarer, slik som øl og vin.

De genetiske metoder angående gjær er aller best utviklet blant eukaryoter basert på den store kunnskap som er fremskaffet via klassisk genetikk. Dette gjorde det lett å tilpasse og videreutvikle for gjær de genteknologe prose-dyrer som først var beskrevet for Escherichia coli. Blant andre linjer har metodene for å konstruere gjærstammer som danner fremmede proteiner blitt utviklet i stor grad (Romanos et al., 1992).

Sekresjon av proteinene i kulturmediet innbefatter over-føring av proteinene gjennom de forskjellige membranlukkede rom som utgjør den sekretoriske vei. Først blir proteinene overført til lumen av det endoplasmiske reticulum ER. Herfra blir proteinene transportert i membranvesikler til Golgi-komplekset og fra Golgi til plasmamembranen. Den sekretoriske prosess innvolverer flere trinn, hvor vesikler inneholdende de utskilte proteiner blir spaltet fra donor-membranen, målrettet til og fusert med akseptormembranen. Ved hver av disse trinn er funksjonen av flere forskjellige proteiner nødvendig.

Den sekretoriske vei hos gjær samt et stort antall gener involvert i denne, er blitt funnet ved isolasjon av kondi-sjonene letale mutanter som er defisiente i visse trinn av den sekretoriske prosess (Novik et al., 1980; 1981). Mutasjon i et protein som er nødvendig for et spesielt overfø-ringstrinn, resulterer i akkumulering av de utskilte proteiner i det foregående membranrom. Således kan proteiner akkumuleres ved ER, Golgi eller i vesikler mellom ER og Golgi, eller i vesikler mellom Golgi og plasmamembran.

Mere deltajert analyse av genene og proteinene som er involvert i den sekretoriske prosess er blitt mulig ved kloning av genene og karakterisering av funksjonen til de tilsvarende proteiner. Et bilde begynner å danne seg som indikerer at i alle trinn fungerer flere samvirkende proteiner. Søker har nylig klonet to nye gjærgener, SS01 og SS02 som multikopi-suppressorer av secl-1 som er defekte i vekst og sekresjon ved høye temperaturer (Aalto et al., 1993).

Mange av genene identifisert i og isolert fra S cerivisiae er blitt funnet og klonet fra andre organismer basert enten på sekvenshomologien med gjær, gener eller komplementering av gjærmutasjoner. En NSF-faktor fra pattedyr er homologen til gjær-SEC18-genproduktet og oppviser en lignende funksjon i proteinsekresjon (Wilson et al., 1989). SE14-genet til Yarroqia lipolytica (Lopez et al., 1992) er blitt klonet og karakterisert. Pattedyrhomolog for gjær-SECll-genet som koder for en komponent av signalpeptidasen er blitt klonet (Greenberg et al., 1989). Schizosaccharomyces pombe YPTl-gen som koder for et lite GTP-bindende protein, ble klonet ved å bruke gjærgenet SEC4 som en probe (Fawell et al., 1989), og pattedyrmotstykket til YLPT1 ble vist å være en del av det sekretoriske maskineri ved å bruke antistoff mot gjær Yptl-protein (Segev et al., 1988). Pattedyr rabl-protein vist å være homolog til Yptlp (Zaraoui et al., 1989) kan erstatte gjær Yptl-funksjonen (Haubruck et al., 1990).

Gener som er homologe på proteinnivået til gjær SSOl- og SS02-genene i henhold til oppfinnelsen, er funnet i flere arter innbefattende mus (Hirai et al., 1992), rotte (Inoue et al., 1992, Bennett et al., 1992) og nematode (Ainscough et al., 1991; EMBL Data Bank 29, Tilgangsnummer M 75825) hvilket indikerer at genene er konservert under evolu-sjonen. De homologe proteiner i de andre arter opptrer også på celleoverflaten eller er implikert til å være involvert i en synaptisk vesikkeltransport til celleoverflaten, noe som antyder at de kan være funksjonelt relatert til SSOl og SS02. Imidlertid har direkte involvering i sekresjon bare blitt vist for Sso-proteinene angitt av Søker (Aalto et al., 1993). Gjærhomologer for de synaptiske vesikkelmem-branproteiner, synaptobreviner er Snei og Snc2 proteinene (Gerst et al, 1992; Protopopov et al. 1993).

De ovennevnte eksempler, hvorav mange flere kan eksistere, illustrerer den universale natur av det sekretoriske maskineri. Resultater fremskaffet med gjær kan i stor grad benyttes på andre sopp såvel som andre eukaryote celler.

Gener med sekvenslikhet med SSO-genene er implikert til å fungere også i andre trinn av intracellulær proteintrans-port/sekresjon: SED5 (Hardwick and Pelham, 1992) mellom ER og Golgi og PEP12 {Becherer and Jones, 1992) mellom Golgi og vakuole, det lysome rom hos gjær. Dette støtter ytterligere den sentrale og konserverte rolle til SSO-genene i proteinutskillelse og intracellulær transport. Imidlertid eksisterer til nå ingen rapporter angående noen positiv effekt av SSO-homologene i gjær eller animalske celler ved sekresjon når de blir overuttrykt, hvilken effekt søker påviser i foreliggende oppfinnelse for SSO-genene.

Mindre er kjent angående det sekretoriske system hos andre gjærtyper, slik som Kluyveromyces, Phichia, Schizusaccharo-myces og Hansenula, som imidlertid har vist seg å være nyttige vertsorganismer for produksjon av fremmede proteiner (Buckholz and Gleeson, 1991). Genetikken og den moleky-lære biologi hos disse gjærtyper er ikke like utviklet som for Saccharomyces, mens fordelene med disse gjærtyper som produksjonsvertsorganismer er de samme som for Saccharomyces. Dette er også tilfellet for filamentøs sopp, slik som Neuospora, Aspergillus og Trichoderma som er blitt brukt for produksjon av utskilte fremmede proteiner (Jeenes et al., 1991). Idet de tilhører taksonomisk sopp og svært mange av de filamentøse sopp også tilhører Ascomycetes, lik S. cerevisiae, er det innlysende at det sekretoriske maskineri av filamentøse sopp er lik det for S. cerevisiae. Filamentøse sopp er meget effektive i å utfylle sine egne hydrolytiske enzymer. Imidlertid er produksjon av fremmede proteiner i filamentøse sopp mye mindre effektiv og dette synes i mange tilfeller å være grunnet ineffektiv sekresjon. De felles trekk for alle sopp er f.eks. post-transla-sjonelle modifiseringer som skjer langs den sekretoriske vei.

Flere forsøk er blitt gjort og publisert tidligere angående å øke fremmed proteinproduksjon i gjær og filamentøs sopp såvel som i andre organismer. Mye arbeid er blitt avsatt til forskjellige promoter- og plasmidkonstruksjoner for å øke transkripsjonsnivået eller plasmidkopiantallet (se f.eks. Baldari et al., 1987; Martegani et al 1992; Irani and Kolgore, 1988). En felles tilnærming for å forsøke å øke sekresjon er å bruke gjærsignalsekvenser (Baldari, et al 1987, Vanoni et al, 1989). Tilfeldig mutagenese og utvelgelse for et utskilt protein (Smith et al., 1985; Sakai et al, 1988, Schuster et al, 1989; Suzuki et al, 1989; Sleep et al, 1991; Lamsa og Bloebaum, 1990; Dunn-Coleman et al, 1991) eller fusjon av det fremmede protein til et effektivt utskilt endogenprotein (Ward et al., 1990; Harkki et al., 1989; Nyyssonen et al. 1993; Nyyssonen et al., pat.søknad) har i stort grad blitt brukt både for gjær og filamentøs sopp for å gjøre sekresjonen av fremmede proteiner mere effektiv. Begge av disse metoder er av begrenset anvendelse. Overproduksjonsmutanter isolert ved tilfeldig mutagenese og utvelgelse er nesten utelukkende recessive og kan således ikke bli overført til industrielle gjærstammer som er polyploid. Ofte resulterer overproduk-sjonen fra endringer som er forskjellige fra øket sekresjon, og påvirker i mange tilfeller kun proteinet benyttet for utvelgelse. Tilnærming for fusjonsprotein krever å skreddersy fusjonskonstruksjonen for hvert fremmed protein separat.

En tilnærming som øker kopiantallet av gener som virker ved sekresjon og således mengden av komponenter av det sekretoriske maskineri, er mere universell. Den kan benyttes på ethvert protein uten spesifikke fusjonskonstruksjoner og er anvendelig på diploide og polypoide stammer.

Det er ikke nøyaktig kjent hvilke trinn som danner flaske-halsene i den sekretoriske prosess, men det kan ventes at det finnes flere av dem. Søker startet med å finne de potensielle blokker helt ved slutten av den sekretoriske vei, og har klonet og karakterisert gener som virker helt ved det endelige trinn av den sekretoriske prosess, hvorved de sekretoriske vesikler som skyter knopp fra Golgi-komplekset ble målrettet til og fusert med plasmamembranen for å utskille de sekreterte proteiner til celleeksteriøret. Søker har tidligere klonet og karakterisert SEC1 som virker ved dette trinn (Aalto et al., 1991; Aalto et al., 1992) og har senere vist at SEC1 er et essentielt enkelt kopigen (Aalto et al., 1993). SSO-genene i henhold til oppfinnelsen ble klonet som multikopi-suppressorer av secl-l-mutasjonen (Aalto et al., 1993).

Oppsummering av Oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse beskriver isolasjonen av gener som, når de blir overuttrykt, øker produksjonen av utskilte proteiner. Spesielt beskriver foreliggende oppfinnelse isoleringen av SSOl- og SS02-gener av S. cerevisiae som koder for Ssolp og Sso2p, karakteriseringen av genene og deres overføring til og overekspresjon i S. cerivisiae. I tillegg beskriver foreliggende oppfinnelse isolering av en SSO-homolog fra Trichoderma reesei, karakterisering av genet og overføring og overekspresjon i Trichoderma.

Videre indikerer sekvenshomologene mellom gjaer-SSO-genene og deres høyere eukaryotiske motparter at foreliggende oppfinnelse kan bli brukt til å konstruere nye cellelinjer for høyere eukaryoter med øket sekresjonskapasitet.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer således nye rekombinante eukaryote celler, fortrinnsvis soppvertsceller som uttrykker økede nivåer av Sso-protein(er) og spesielt gjærstammer som uttrykker økede nivåer av Ssol- og/eller Sso2-proteiner såvel som Trichoderma stammer som uttrykker økede nivå av Trichoderma Sso-protein. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også fremgangsmåte(r) for fremstilling av økede mengder utskilte proteiner ved å overuttrykke gener som samvirker med SSSO-genene, slik SEC1.

De eukaryote celler i henhold til foreliggende oppfinnelse som blir■transformert med SSO-genene eller genene som samvirker med SSO-genene, har en øket kapasitet til å danne utskilte proteiner. De nye eukaryote celler i henhold til oppfinnelsen, spesielt gjær og filamentøs sopp, kan også bli brukt for mere effektiv produksjon av hydrolytiske enzymer og hydrolyse av f.eks. polymere substrater, noe som resulterer i forbedringer i bioteknologiske prosesser, slik som enkeltcelle- eller bakergjærproduksjon grunnet øket cellemasse eller i andre prosesser, hvor effektiv produksjon av hydrolytiske enzymer og/eller effektiv hydrolyse av plantemateriale er gunstig.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser S. cerevisiae SSOl- og SS02-gen cDNA integrert i et multikopiplasmid pMAC561 som resulterer i henholdsvis plasmider YEpSSOl og YEpSS02. Figur 2 viser Western-analyse som viser overekspresjon av Sso2-protein i gjær transformert med YEpSS02. Figur 3 viser øket produksjon av utskilt Bacillus et-amylase hos S. cerevisiae (stamme sf750-14D) transformert med multikopiplasmid, som uttrykker SSOl- eller SS02-gener og med et annet plasmid som uttrykker Bacillus ct-amylasegen. Figur 4 viser Western-analyse av Bacillus ct-amylase utskilt av S. cerivisiae med eller uten mulitkopiplasmidet som uttrykker SSOl- eller SS02-gen. Figur 5 viser øket produksjon av utskilt Bacillus o-amylase av S. cerevisiae (stamme DBY74 6) transformert med multikopiplasmid, som uttrykker SS02-gen og med et annet plasmid som uttrykker Bacillus o-amylase. Figur 6 viser øket produksjon av utskilt Bacillus o-amylase av S. cerevisiae (stamme DBY74 6) transformert med et multikopi-plasmid som uttrykker SECl-gen og med et annet plasmid som uttrykker Bacillus a-amylase. Figur 7 viser SS02 ekspresjonskassetten flankert av ribosomale sekvenser integrert i BS+, noe som genererer vektoren pRbSS02. Figur 8 viser hybridisering av DNA avledet fra seks forskjellige sopparter med gjær SSOl-genet.

Detaljert Beskrivelse av Oppfinnelsen

For bedre forståelse av den følgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen kan det være nyttig å gi definisjoner av visse uttrykk som skal brukes nedenfor.

Overekspresjon av et gen: Proteinet kodet for av det nevnte gen fremstilles i økede mengder i cellen. Dette kan bli oppnådd ved å øke kopiantallet av genet ved å innføre eksta kopier av genet i cellen på et plasmid eller integrert i genomet. Overekspresjon kan også bli oppnådd ved å plassere genet under en promotor som er sterkere enn dens egen promotor. Mengden av proteinet i cellen kan varies ved å variere kopiantallet av genet og/eller styrken av promotoren som brukes for ekspresjonen.

Suppresjon av en mutasjon: Når effekten av en mutasjon i et gitt gen blir lettet eller fjernet i en mutasjon i et annet gen, blir dette andre gen kalt en suppressor for det første gen. Suppresjon kan inntreffe også ved overekspresjon av villtypeallelet av det andre gen ved metodene beskrevet ovenfor. Dette blit kalt overekspresjonssuppresjon. Hvis overekspresjonen er forårsaket av multiple kopier av det undertrykkende gen, kan suppresjonen også bli kalt multiko-pisuppresjon. Suppresjonsfenomenet indikerer at disse to gener samvirker ved genetisk nivå. Interaksjonen kan også inntreffe ved fysiske nivå som direkte fysisk kontakt mellom de to proteiner kodet for av de samvirkende gener.

Homologe gener, homologer: Gener som er relatert, men ikke identiske, i sin DNA-sekvens og/eller utfører den samme funksjon, er homologe med hverandre og blir hverandres homologer.

Utskilte proteiner: Proteiner som inne i cellen er rettet mot den sekretoriske vei og transportert gjennom denne til det utvendige av cellen utenfor plasmamembranen er kalt utskilte proteiner. I gjær kan proteinene forbli assosiert med celleveggen såsom invertase eller frigjort gjennom celleveggen til vekstmediet, slik som det fremmede protein Bacilus a-amylase.

SS01-og SS02-gener som skal bli brukt i foreliggende oppfinnelse blir isolert fra en organisme som inneholder disse gener f.eks. Saccharomyces cerevisiae og Trichoderma spp. Ogås andre egnede gjærorganismer og andre sopp, slik som Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia spp.,. Hansenula spp., Aspergillus spp, Neuropsora spp og Penicillium spp bli brukt. Det vil bemerkes at homologe gener fra andre organismer også kan bli brukt.

Videre resulterer overekspresjon av andre gener som fungerer ved det samme trinn som SSO genene, slik som SEC1, i nærvær av normale eller økede nivå av Sso-proteiner i øket sekresjon. Gener som virker ved de foregående trinn av den sekretoriske prosess, kan godt ha en lignende effekt. Således kan frigjøringen av de sekretoriske vesikler fra Golgi-apparaturen bli lettet ved å øke kopiantallet av SEC 1-og/eller SEC 14-genene kjent for å virke ved dette trinn (Novick et al., 1980) eller ved å lete etter og øke kopiantallet av gener som virker med SEC7 og/eller SEC14, f.eks. suppressorer av deres mutasjoner. Likeledes kan ethvert tidligere trinn av den sekretoriske prosess bli forbedret ved å øke kopiantallet av gener som er involvert. De nye gener søker har isolert fra S cerevisiae, SSOl og SS02 representerer duplikerte gener, noe som antyder at de spiller en viktig rolle i cellen. Basert på den konserverte natur av SSOl og SS02 og deres homologer i andre arter, som nevnt ovenfor, foreslår Søker at økning av SSO-genene i alle andre eukaryote arter ville resultere i øket protein-sekresjonseffektiviet innbefattende andre gjær, filamentære sopp og plante- og animalske celler.

Det skal bemerket at på grunn av det faktum at mange gener er involvert i sekresjonsfunksjonen i andre organismer, dekker foreliggende oppfinnelse f.eks. også ekspresjon av gjærgener i filamentøs sopp og høyere eukaryoter og vice versa, eller ethvert eukaryotisk gen i en annen eukaryot for å fremskaffe øket sekresjon.

Vertsorganismen som skal transformeres med genene ifølge oppfinnelsen, kan være enhver eukaryot celle som er egnet for fremmed eller endogen proteinproduksjon, f.eks. enhver S. cerivisiae gjærstamme (f.eks. DBY74 6, AH22, S150-2B, GPY55-15Ba, VTT-A-63015), enhver Trichoderma spp. slik som T. harzianum og T. reesei stammer avledet fra det naturlige isolat QM6a, slik som RUTC-30, QM9416 og VTT-D-79215, enhvert Kluyveromyces spp., Sch. pombe, H. polymorpha, Pichia, Aspergillus, Neurospora, Yarrowia, Penicillium spp eller høyere eukaryote celler. Overføring av genene til disse celler kan oppnås f.eks. ved å anvende de konvensjonelle metoder beskrevet for disse organismer.

DNA-sekvensen som inneholder SSOl eller SS02, isoleres fra S. cerevisiae ved konvensjonelle metoder. I en foretrukket utførelsesform blir gen- eller cDNA-bibliotek på et multikopiplasmid benyttet til å undertrykke temperatursen-sitiviten av secl-l-mutant (Aalto et al, 1991; 1993) eller mutasjoner som fører til defisiens i SSO-funksjonen av S. cerevisiae eller analoge mutasjoner av andre arter. I en annen tilnærming ble den kjente DNA-sekvens av SSO-genene og SSO-lignende gener benyttet til å utforme prober for heterolog hybridisering eller PCR-primere for å klone SSO-genene. I enda en annen tilnærmelse blir antistoffer mot de kjente SSO- og SSO-lignende gener benyttet for kloning av genet ved standardmetoder.

Genene som tilsvarer S. cerevisiae SSOl og SS02 blir isolert fra de andre sopp eller høyere eukaryoter med én eller flere av de følgende metoder, som her er beskrevet spesielt for den filamentøse sopp Trichoderma reesei og som kan bli modifisert i henhold til konvensjonell kunnskap og metoder til å passe den aktuelle eukaryote celle.

En cDNA-bank av T. reesei konstrueres i gjærvektoren pFL60 som beskrevet i Fl patentsøknad nr. 92.2373 (Buchert et al). Denne genbank DNA-transformeres i S. cerevisiae stamme H458 (Aalto et al., 1993) og utvelges for komplementering av sekresjonsdefekten f.eks. som beskrevet i eksempel 6. Plasmidet isoleres fra de positive kolonier og genet isoleres og karakteriseres ved å bruke standardmetoder og det tilsvarende kromosomale gen isoleres. Suksessrik komplementering viser at funksjonelt ekvivalente gener til gjær SSO-genene eksisterer i andre sopp, slik som T. reesei.

Alternativt kan genene som koder for proteinene tilsvarende S cerevisiae Ssolp og/eller Sso2p bli isolert fra et CDNA eller en komosomal genbank fremstilt fra T. reesei ved heterolog hybridisering i ikke-stringente betingelser som beskrevet i eksempel 7 og bli karakterisert ved konvensjonelle metoder og deres funkjson kan bli vist som beskrevet ovenfor. Lignende tilnærmninger er egnet for alle organismer som har vist seg å ha kromosomale sekvenser som er homologe med gjær SSO genene som analysert f.eks. ved Southern Hybridisering av total DNA. Det er også mulig at genet kan bli isolert fra et ekspresjonsbibliotek med antistoffer fremskaffet mot Sso gjærproteinene.

Alternativt kan oligonukleotidprimere ble utarbeidet basert på homologiene funnet mellom sekvensene av de tilsvarende gener isolert fra flere organismer. Klare homologier kan observeres f.eks. i områder som strekker seg fra aa266 til aa 287 i Ssolp o fra aa 269 til aa 290 Sso2p, vist i hen-holsvis SEQ ID NO.l og SEQ ID NO. 3. Disse primere blir brukt til å amplifisere T. reesei-genet i en PCR-reaksjon.

For å konstruere et plasmid som er egnet for transformasjon i en gjærorganisme, blir SSOl- eller SS02-genet klonet i en passende gjærekspresjonsvektor, slik som pAAH5 (Ammerer, 1983) eller vektorer avledet fra den {Ruohonen et al., 1991; Ruohonen et al., manuskript under utarbeidelse a) omfattende de passende gjærregulatoriske områder. Disse regulatoriske områder kan bli fremskaffet fra gjærgener, slik som ADH1, GALI-GALI0, PGKl, CUP1, GAP, CYC1, PH05, eller asparaginsyntetasegenet. Alternativt kan også de regulatoriske områder av SSOl eller SS02 bli brukt til å uttrykke genene i S. cerevisiae. Plasmidet som bærer SSOl-eller SS02-genet er i stand til å replikere autonomt når transformert i det mottagende gjærstamme. Genet SSOl eller SS02 sammen med de passende gjærregulatoriske områder kan også bli klonet i en enkelt kopi gjærvektor slik som pHR70 til Hans Ronne eller pRS313, pRS314, pRS315 eller pRS316 (Sikorski and Hieter, 1989).

Alternativt kan ekstra kopier av SSOl- eller SS02-genet også integreres i gjærkromosomet, f.eks. i ribosomalt RNA-lokus. For dette formål blir ribosomalsekvensen av et egnet plasmid, f.eks. plasmid pIRL9 (Hallborn et al., patentsøknad) frigitt og klonet egnet til BS+ vektor, som vist i fig. 7. Genet SSOl eller SS02 koblet inn mellom den egnede gjærpromotor og terminatorområdene, blir frigitt fra hybridvektoren omfattende genet og klonet i plasmidet erholdt ved tidligere trinn. Fra dette resulterende plasmid kan ekspresjonskassetten flankert av ribosomale sekvenser bli frigjort. Dette fragment blir kotransformert i en gjærorganisme med et autonomt replikerende plasmid som bærer en egnet markør for transformasjon. Plasmidet kan senere bli fjernet fra cellene inneholdende de ekstra kopier av SSOl- eller SS02-genet integrert i kromosomet ved å dyrke cellene under ikke-selektive betingelser. På denne måte kan rekombinante stammer bli fremskaffet som ikke bærer noe ekstra fremmed DNA, slik som bakterielle vektorsekvenser. Hvis en polyploidgjærstamme, slik som VTT-A-63015, anvendes, kan genet bli integrert også til et essensielt lokus, slik som ADH1- eller PGKl-lokus.

For å uttrykke SSO-genene i Trichoderma, blir det kodende område for Trichoderma sso-genet koblet f.eks. mellom T. reesei cbhl-promotoren og -terminatoren og ekspresjonskassetten blir transformert i en Trichoderma-stamme som danner f.eks. pattedyr-antistoff eller et annet fremmed protein som gir en stamme som danner EGI-kjerne, et annet cellulase eller et hydrolytisk enzym. Økning av sekresjonen ville være spesielt ønsket når soppen dyrkes på glukose-innehold-nede media, og for dette formål behøver sso-genet(ene) å bli uttrykt fra konstitutive promotorer eller promotorer som virker på glukosemedium.

For filamentøse sopp blir sso-genet fortrinnsvis integrert i genomet ved å bruke metoder kjent i faget. Egnete promotorer ved addisjon til cbhl-promotoren eller promotoren av sso-genet i seg selv er f.eks. de andre cellulosepro-motorer, cbh2, egil, egl2, eller tefl, pgk, gpd, pki, glukoamylase, ot-amylase eller alkoholdehydrogenpromotoren. Filamentøs sopptransformasjon resulterer vanligvis i stammer med varierende kopier av sso-genet integrert i genomet (Penttilå et al., 1987) og fra disse vil stammen med opti-malt nivå av sso-ekspresjon for vekst og øket sekresjon bli valgt ut.

Et mål for oppfinnelsen er således å fremskaffe SSO-gener, spesielt SSOl- og SS02-gener av S. cerivisiae, såvel som homologe gen(er) av Trichoderma reesei og andre eukaryotiske celler. Sekvensen av genene kan bestemmes fra plasmidene som bærer dem ved å bruke f.eks. den dobbeltkjedete dideoksydnukleotidsekvenseringsmetode {Zagursky et al., 1986). Sekvensen av SSOl-genet av S cerevisiae er gitt som SEQ ID NO. 1 og sekvensen av SS02 genet av S.cerevisiae er gitt som SEQ ID NO. 3.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe spesifikke vektorer omfattende SSO-genene. For gjær er en slik vektor enten et autonomt replikerende multikopi eller et enkelkopiplasmid eller en vektor som er i stand til å integrere i kromosomet, som beskrevet ovenfor. For Trichoderma er en slik vektor fortrinnsvis et plasmid hvor-fra ekspresjonskassetten (promotor-gen-terminator) kan frigis fra restriksjonsenzymer til å bli integrert i sopp-genomet.

En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe gjær eller andre soppstammer såvel som eukaryotiske cellelinjer som inneholder ekstra kopier av SSO-gener enten på replikerende plasmid(er) eller integrert i kromo-somene, som resulterer i øket produksjon av utskilte proteiner, slik som gjærinvertase eller Trichoderma cellulase eller andre hydrolaser.

Således omfatter en fremgangsmåte for å konstruere nye eukaryote celler som er i stand til å uttrykke økede nivå av Sso-protien(er): a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for Sso-protein(er) fra en egnet donororganisme; b) konstruere vektor(er) som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; og c) transformere minst én av vektorene som er fremskaffet til passende vertsceller.

Et ytterligere formål med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe eukaryote celler som i tillegg til ekstra kopier av SSO-gener, omfatter en DNA-sekvens som koder for et utskilt fremmed eller endogent protein, slik som a-amylase, cellulose, eller et antistoff og som er i stand til å uttrykke dette protein.

Således er det frembragt en fremgangsmåte for å danne økede mengder av utskilte fremmede eller endogene protein(er) ved å overuttrykke SSO-gen(ene). Denne fremgangsmåte omfatter: a) å isolerer DNA-sekvens(er) som koder for nevnte protein(er) fra en egnet donororganisme; b) konstruere en vektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; c) å transformere vektoren således fremstilt i en egnet vertsorganisme som uttrykker økede nivå av Sso-protein(er) for å fremskaffe rekombinante vertsceller; eller alternativt, å transformere vektoren til en egnet vertsorganisme og retransformere denne transformant med SSO eller et gen som er homologt med SSO og utvelge for celler med øket produkt av nevnte prtoein(er), og d) dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte protein (er) .

Et ytterligere mål med foreliggende oppfinnelse er å forbe-dre sekresjon ved å optimalisere Sso-proteinnivået under anvendelse av forskjellige promotorer og forskjellige kopiantall av genet og kombinere SSO-genene med andre gener involvert i sekresjon, slik som SEC1.

Således fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å danne økede mengder av utskilte fremmede eller endogene protein(er) ved å overuttrykke gen(er) som samvirker med SSO-genet, f.eks. SEC 1, i nærvær av normale eller økede mengder av Sso-protein(er), hvilken fremgangsmåte omfatter: a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for nevnte protein(er) fra en egnet donororganisme, b) å konstruere en vektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; c) å transformere vektoren som er fremskaffet i en passende vertsorganisme som uttrykker normale eller

økede nivåer av Sso-protein(er) og overuttrykker andre gen(er) som samvirker med SSO-genet, f.eks. SEC1, for å fremskafe rekombinante vertsceller, eller, alternativt, å transformere vektoren til en egnet vertsorganisme og retransformere denne transformant med SSO eller et gen som er homologt med SSO og genet som samvirker med SSO-gen og utvelge for celler med øket produksjon av nevnte protein(er); og

d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte

protein (er).

Enda et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en fremgangsmåte for øket produksjon av et endogent utskilt protein, hvor fremgangsmåten omfatter: a) å transformere celler som produserer nevnte protein med et SSO-gen eller et gen homologt til SSO, alene eller sammen med gen(er) som samvirker med SSO-genet såsom SEC1, b) å utvelge for transformanter som danner økede nivå av nevnte protein for således å fremskaffe rekombinante celler for øket proteinproduksjon, og c) å dyrke nevnte rekombinante celler under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte protein.

Enda et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe soppstammer som i tillegg til ekstra kopier av SSO-gener eller deres homologer omfatter DNA-sekvens(er) som koder for hydrolytiske enzym(er) slik som a-amylase og/eller glukoamylase eller lignocellulose-hydrolyserende enzymer slik som cellulase(er), hemicellulaser eller ligni-naser, som gjør soppen i stand til å øke hyrdolyse, og/eller øket vekst på polymere forbindelser slik som stivelse eller lignocellulose.

Således er det fremskaffet et effektiv biomasseprodukt på nevnte råmateriale eller effektiv hydrolyse av nevnte råmateriale. Denne fremgangsmåte omfatter: a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for endogene eller fremmede hydrolytiske enzym(er) fra en egnet

donororganisme:

b) å konstruere en soppvektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; c) å transformere vektoren fremskaffet i en egnet soppvertsorganisme som uttrykker økede nivåer av Sso-protein (er) for å oppnå rekombinante vertsceller;

eller, alternativt, å-transformere vektoren til en egnet vert og retransformere denne transformant med SSO eller et gen homologt til SSO og utvelge for celler med øket produksjon av nevnte enzym(er)

d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte

hydrolytiske enzym(er).

En fremgangsmåte er også fremskaffet for effektiv biomasseproduksjon på et råmateriale eller effektiv hydrolyse av et råmateriale ved å overuttrykke gener som samvirker med SSO-genet, f.eks. SEC1, i nærvær av normale eller økede mengder av Sso-protein(er). Denne fremgangsmåte omfatter: a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for endogene eller fremmede hydrolytiske enzym(er) fra en egnet donororganisme; b) å konstruere en vektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; c) å transformere vektoren som er fremskaffet til en egnet vertsorganisme som uttrykker økede nivåer proteiner som samvirker med Sso-protein(er) i nærvær av normale eller økede mengder av Sso-protein(er) for å fremskaffe rekombinante vertsceller, eller alternativt, å transformere vektoren til en egnet vertsorganisme og retransformere denne transformant med SSO-gen eller et gen som er homologt med SSO og med genet(ene) som samvirker med SSO-gen, slik som SEC1, og utvelge for celler med øket produksjon av nevnte enzym(er); og d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte

hydrolytiske enzym(er).

Mulige anvendelser av nevnte rekombinante celler er f.eks. i enkelcelleproduksjon, forbedret alkoholproduksjon eller i prosesser hvor effektiv hydrolyse av råmaterialet er ønsket.

Ekperimentielt

Eksempel 1: Kloning av det kodende område av SSOl- og SS02-gener fra Saccharomyces cerevisiae. SSOl- og SS02-genene ble isolert som suppressorer av den temperatursensitive secl-1 defekte mutant (Novick and Scheckman, 1979; Novick et al, 1980), S. cerevisiae stammen sf750-14Da(aaecl-1 his4 ura3-51 trpl-289 leu2-3 leu2-112)

(erholdt fra Randy Scheckman, University of California, Berkeley, CA) ble transformert (Ito et al., 1983) med gjær cDNA-bibliotek konstruert av McKnight and McConaughy (1983) fra stamme X2180-1B på et 2u-basert plasmid, pMAC561, som inneholder TRP1 som en seleksjonsmarkør og utvalgt for Trp-prototropi ved 37°C. Da vekten av transformantene var refraktorisk ved 37°C, ble ytterligere arbeid foretatt ved 36,5 eller 35°C som er temperaturer som likevel er ikke-permissive for secl-1. DNA isolert (Keranen, 1986) fra fire gjærtransformanter som viste ko-segregasjon av Trp<+->fenoty-pen og vekst ved 36,5 °C ble overført til E. coli (Hanahan, 1983). Plasmid-DNA isolert fra E. coli transformanter, ble brukt for å retransformere secl-l-stammen av S. cerevisiae.

Effektiv transformasjon for vekst ved 36,5°C ble erholdt. Restriksjonsenzymanalyse av plasmidene indikerte at to forskjellige sekvenser ble gjenvunnet fra det anvendte cDNA-bibliotek. Det insatte DNA fra de to forskjellige kloner 1 og 7 ble sekvensert under anvendelse av den dobbeltkjedede dideoksymetode (Zagursky et al., 1986), og passende subklo-ner ble konstruert med standard rekombinante DNA-metoder (Maniatis et al., 1982) eller spesifikke primere. De to kloner inneholdt en åpen leseramme på 870 nukleotider (klon 1) og 885 nukleotider (klon 7). Ettersom de utledete aminosyresekvenser aldri representerer den til Secl-protein (Aalto et al., 1991), ble de nye gener kalt SSOl og SS02 (Suppressor of Secl One). De SSOl- og SS02-kodende sekvensene og de avledete aminosyresekvenser er gitt i henholdsvis SEQ ID N0.1 og SEQ ID NO: 3. Plasmidene som bærer SSOl- og SS02-genene ble betegnet YEpSSOl og YEpSS02 og er vist i fig, 1.

Eksempel 2: Overekspresjon av Sso2-proteinet i gjær transformert med YEpSS02.

Gjærstammen sf750-14D stransformert med kontrollplasmidet pMA56 (A) (Ammerer, 1983) eller med YTpSS02 (B), ble dyrket i syntetisk fullstendig medium {Sherman et al. 1983) som manglet Trp. Gjærcellelysater ble fremstilt i nærvær av SDS som beskrevet av Kerånen (11986). Ti ug totalt gjærprotein som var tilstede i lysatene ble separert med SDS-PAGE og analysert ved Western blotting ved å bruke polyklonale antistoff dannet i kanin mot Sso2-proteinet og alkalifosfa-tase-konjugert geite-anti-kanin-IgG for utvelgelse. Som vist i fig. 2, ble en sterkt øket mengde av Sso2-protein observert i YEpSS02-transformanten.

Eksempel 3: Øket produksjon av utskilt heterologt protein, Bacillus o-amylase i gjærstamme sf750-14D som overuttrykker enten SSOl eller SS02.

Gjærstammen sf750-14Dot som inneholder enten SSOl- eller SS02-genet på henholdsvis multikopi-plasmidene YEpSSOl eller YEpSS02, ble transformert med et multikopiplasmid YEpaa5 som inneholder Bacillus a-amylasegenet ligert mellom ADHl promotoren og terminator (Ruohonen et al., 1987) modifisert for mer effektiv ekspresjon ved å fjerne forutsagte inhibitoriske sekvenser 5' til promotorelementet (Ruohonen et al., 1991; Ruohonen et al, manuskript under utarbeidelse, a). Gjærstammene fremskaffet inneholdende YEpSSOl og YEpaaS (VTT-C-92072) eller YEpSS02 og YEpotaS (VTT-C-92073) ble dyrket i selektivt medium ved 24°C og sekresjon av a-amylase i kulturmediet ble overvåket av a-amylaseaktiviteten ved å bruke Phadebas amylasetesten (Pharmacia Diagnostics AB, Sverige). Disse stammer VTT-C-92072 og VTT-C-92073 ble deponert hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen og Zellkulturen GmbH (DSM) 30.september 1992 med henholdsvis tilgangsnumrene DSM 7253 og 7254. Som vist i fig. 3, ble øket a-amylaseaktivitet erholdt i stammen som bærer enten SSOl (A) eller SS02 (■) på multikopiplasmidet sammenlignet med den utransformerte kontrollstamme (•) . Segregering av YEpSSOl (0) eller YEpSS02 (□) bort fra transformantene reduserte a-amylasesekresjonen til kontrollnivået, noe som beviser at den økede sekresjon er grunnet tilstedeværelsen av de SSO-geninneholdende plasmider i transformantene. Økete mengder a-amylaseprotein i kulturmediet ble påvist ved Western blotting (fig. 4). Symboler med hensyn til fig. 3, S = standard (Bacillus o-amylase).

Eksempel 4:0ket produksjon av utskilt fremmed protein, Bacillus a-amylase og et endogent protein, invertase i gjærstamme DBY746 som overuttrykker SS02.

S cerevisiae-stammen DBY74 6 (a his _1 leu2-3 leu2-112 ura3-52 trpl-289 cgh®) (erholdt fra David Botstein, Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambrid-ge, MA) som inneholder plasmidet YEpaa6 som inneholder Bacillus o-amylasegenet ligert mellom ADHl promotoren og terminatoren (Ruohonen et al., 1987), modifisert for mere effektiv ekspresjon ved å fjerne forutsatte inhibitoriske sekvenser 5' til promotorelementet (Ruohonen et al, 1991; Ruohonen et al., manuskript under utarbeidelse, a) ble transformert enten med YEpSS02 eller med kontrollplasmidet pMA56 (Ammerer, 1983). Transformantene ble dyrket i selektivt medium ved 30°C og sekresjon av a-amylase i kulturmediet ble overvåket ved å måle a-amylaseaktiviteten ved å bruke Phadebas amylasetesten (Pharmacia Diagnostics AB, Sverige). Som vist i fig. 5, ble øket a-amylaseaktivitet erholdt i stammen som inneholdt SS02 (A) på multikopiplasmidet sammenlignet med kontrollstammen transformert med kontrollplasmidet uten SSO-gen (O) .

Ingen forskjell ble observert i gjærvekst mellom kontroll-transformanten (•) og SS02-transformant (A). Overekspresjon av SSOl øket sekresjonen av a-amylase på lignende måte. Sekresjon av det endogene protein invertase, ble også øket under disse betingelser målt ved sen logaritmisk til tidlig stasjonær vekstfase. Den utskilte invertaseaktivitet i YEpSS02-transformant var 1,4 ganger den i kontrolltrans-formanten inneholdende pMA56. Ettersom den økende effekt av SSO overekspres jon på ot-amylasesekres jon er mere uttalt senere under veksten, bør også invertasesekresjonen være mere økende ved senere tidspunkter.

Fjerning av de forutsagte inhibitoriske sekvenser på ADH1-promotoren (se ovenfor) brukt for ekspresjon av SS02 i EYpSS02, resulterte i forlenget ekspresjon av SS02 og forlenget eksistens av øket nivå av Sso2-protein og følgelig enda høyere endelige nivåer av Bacillus a-amylase utskilt i mediet. Ekspresjon av SS02 på et enkelt kopiplasmid fra denne modifiserte ADHl-promotor resulterte også i økete nivå av Sso2-protein og øket sekresjon av a-amylase.

Eksempel 5: øket produksjon av utskilt fremmedprotein Bacillus a-amylase i gjær som overuttrykker SECl i kombinasjon med normale eller økede nivåer av funksjonelle Sso-proteiner.

S. cerevisiae-stammen DBY74 6 som inneholder plasmidet YEpaa6 inneholdende Bacillus a-amylase gener ligert mellom ADHl promoteren og terminatoren (Ruohonen et al., 1987), modifisert for mer effektiv ekspresjon ved å fjerne forutsatte inhibitoriske sekvenser 5' til promotorelementet (Ruohonen et al., 1991, Ruohonen et al., manuskript under utarbeidelse, a) ble transformert enten med et multikopiplasmid UEpSECl som overuttrykker SECl-genet eller med kontrollplasmidet YEp24H (Aalto et al., 1991; Ruohonen et al., manuskript under utarbeidelse, b). Transformantene ble dyrket i selektivt medium ved 30°C og sekresjon av a-amylase i kulturmediet ble overvåket ved å måle a-amylaseaktiviteten ved å bruke Phadebas amylasetesten (Pharmacia Diagnostics AB, Sverige). Som vist i figur 6, ble øket a-amylaseaktivitet fremskaffet i stammene som inneholdt SECl på et multikopiplasmid (□), sammenlignet med stammene transformert med vektoren uten SECl-genet (O). Ingen forskjell ble observert i veksten mellom transformantene.

Overekspresjonen av både Seclp og Sso2p på samme tid økte a-amylasesekresjonen ytterligere. Plasmidene som uttrykker Sso-genene er tilgjengelige ved VVT, Biotechnical Laboratory, Espoo, Finland.

Eksempel 6: Isolering av Trichoderma sso-genene ved ekspresjon i gjer og deres ekspresjon i Trichoderma.

En gjærekspresjonsgenbank fremstilt fra T. reesei-stammen QM9414 som beskrevet (Buchert et al., Fl Pat.Ans. 922373), ble transformert i Saccharomyces cerevisiae-stammen H458 (Aalto et al.# 1993)(a-SUC2 ade2-l canl-100 his3-ll,15 leu2-3,112 trpl-1 ura 3-1 ssol-52::leu2:: (GALI:ssol,HIS3)) ved å velge ut for Ura-prototropi på et galactosemedium. Transformantene ble overført på cellulosemedium og plasmidet ble innfanget fra de voksende kolonier og retransformert i den ovennevnte stamme for å verifisere komplementeringen. En klon ble fremskaffet som viste egenskapen å redde senkningen av Sso-proteinene på glukosemedium og det tilsvarende plasmid ble betegnet pMS51. Den erholdte S. cerevisiae-stamme som bærer plasmidet pMS51, ble deponert hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) den 5. oktober 1993 med tilgangsnummer DSM 8 604. Den kromosomale kopi av genet blir isolert fra et genomisk kosmidbibliotek (Måntylå et al., 1992) ved å bruke den 5" ende av cDNA-klonene som en probe fremstilt ved PCR. Kosmidet blir isolert fra klonen som gir et signal, og de som tilsvarer det ovennevnte cDNA blir transformert i en T. reesei (Penttilå et al., 1987)-stamme som danner CBHI-Fab-molekyler. VTT-D-91418 (CBS 287.91) beskrevet i Nyyssonen et al., (Pat.ans.). Produksjonen av CBHI-Fab blir studert fra det ekstracellulære medium på Solca-floc-medium (i henhold til Nyyssonen et al., pat.ans.).

Eksempel 7: Isolering av sso soppgener ved heterolog

hybridisering.

Genomisk DNA fra soppartene Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharamyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia stipitis, Aspergillus nidulans og Trichoderma reesei ble isolert, spaltet med Hindlll restriksjonsenzym, separert elektroforetisk i en 0,8% agarosegel og blottet på et nylonfilter. Sothern hybridisering av filteret ble utført ved forskjellige stringenser ved å bruke det gjær SSOl genkodende område som en probe. Hybridisering i en blanding inneholdende 30% formamid, 6xSSC, 10 x Denhardfs, 0,5% SDS, 100 ug/ml sildemelke DNA og 10 ug/ml polyA ved 35°C og vask 2 x 30 minutter i 2xSSC, 0,1% SDS ved 42°C viste flere hybridiseringsbånd i DNA avledet fra S. cerevisiae, K. lactis, P. stipitis og T. reesei (fig. 8). Når hybridisering ble utført under mindre stringente betingelser, ble hybridisering observert også med S. pombe-DNA. Et genomisk T. reesei genbibliotek konstruert i AEMBL3 (Frischauf et al., 1983) vektoren, ble hybridisert ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor. Kloner som ga hybridiseringssignaler, ble renset og deres hybridiserende områder ble kartlagt ved spaltninger og Southern hybridiseringer av deres DNA. De tre hybridiserende X-kloner ble betegnet TSSOa, TSSOb og TSSOc. Disse kloner ble deponert hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) den 5. oktober 1993 med tilgangsnummer h.h.v. DSM 8601, DSM 8602 og DSM 8603.

Deponerte mikroorganismer

De følgende mikroorganismer ble deponert i henhold til Budapest-konvensjonen ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig, Tyskland.

REF3RANS3R

Aalto, M.K-, Keiåncn, S. and Ronnc, II. 1992. A family of pioicins involvec in intmccllular transport. Ccli 68, 181-182.

Aalto, M.K., Ronne, H. and Kcråncn, S, 1993. Ycast syniaxins Ssolp ai:d SsoZp belong to a family of mcmbrane proteins that function in vcsicular transport. EMBO J. 12, (in press).

Aalto, M.K., Ruohonen, L-, Hosono, K. and Kcråncn, S. 1991. Goning and sequencing of the ycast Saccharomyces cerevisiae SECl gene localizcri on chromosomc IV. Yeast 7, 643-650.

Ammerer, G. 3983. Exprcssion of genes in yeast using the ADC1 promotct. Mcthods Enzymnl. 101, 192-201.

Baldari, C, Murray, J.A.H., Ghiara, P.f Cesarcni, G. and Galeotli, CL 1987. A novel peptidc leadcr which allows effkieitt secrction of a fragment of human intcrjcukin \ fl ia Saccharomyces cerevisiae, EMBO L, 6, 229-234.

Bcchcrcr, KA. and Jones, E.W., 1992. Rolc of the PEP12 gene produel in vacuola: targetting in ycast. EMBL Data Bank 31, accessiou number M90395.

Bennett, M.K., Calakos, N. and Schellei, R.H. 1992. Syntaxin: A synaptic protein implicatcd in docking of synaptic vesiclcs at pre synaptic activc zoncs. Science 257, 255-259.

Buchcrt, J., PenttilS, M., Siika-abo, M., Salohcimo, A., Kanua, M. and Viikari, L. 1992. Mannanaasicntsyymit, niitå koodittnvat gecnil ja menclclmii nåiden eristamiscksi scka mcnctclmå lignoseUuloasapiwuRcti massan valk&iscmiscksi (Mannanase enzym es, the encoding genes and mclhod for their isolation, and a method for bleccbing iignocelluiose containing materials). Fl Fat. Appl. 92 2373.

BuckhoLz, R.G. and Gleeson, M.A. 1991. Ycast systems for the commercial productton of hetcroiogous proteins. Bio/Technology 9, 1067-1072.

Dunn-Colcmaii, N., Bloebaum, P., Berka, K., Bodie, £., Robinson, Nn Arnistrong, G, Ward, M., Praetak, M., Carter, C, LaCost, R., Wilson, L., Kodama, K., Baliu, E., Bower, B., fjamsa, M. and Heinsohn, II. 1991. Commercial le vels of chymosin production by Aspcrgillus. Bio/Icchnology 9: 976-981.

Fawell, E., Hook, S. and Armstrong, J., 1989. Nudcoltde scqucncc of a gene encoding a YPTl-rclatcd protein from Sckixosaccharomyces pombe. Kue!. Acid Res. 11, 4373.

Frischauf, A.-M.. Lcrach, H., Poutstka. A. and Murray, N., 1983. Lambda rcplacemcnt vectors carrying polylinkci sequences. J. Mol. Biol. 170, 827-842.

Gerst, F.E.. Rodgcrs, L, Riggs, M. and Wiglei, M. 1992, SWC1, a ycast homolog of the synaptic vesicle-associated mcmbrane protcin/synaptobrevin gene family: Genette intcractions with the RAS and CAP genes. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89. 4338-4342.

Grccnbcrg, G., Shelne&s, G.S. and Blobcl, G„ 1989. A subunit of mammalian signal peptidase is homologous to ycast SEC11 protein. S. Biol. Gicm. 264. 15762-15765.

Hallbom, L, Penttila, M., Ojamo, H.. Kcråncn, S. & Hahn-Hagerdal, B. 1990. Xylose utilization by rccombinan: yeasts. International Pal. Appl. WO 91/15588.

Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escheridua coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580.

Hardwick, K.G. and Pelhani, H.R.B. 1992. SED5 encodes a 39 KD integral mcmbrane protein required for vesiccular transport bctwecn the ER and the Golgi complcx. EMBL Data Bank 32, accession number X66980.

Harkki, A., Uusitalo, J., Bailey, M., Penttila, M. & Knowlcs, J.K.C. 1989. A novel fungal exprcssion system: secrction of activc ca!f chymosin from the Olamentous fungus Trichoderma recscL Bio/lcctmology 7: 596-603.

Haubruck, H., Prange, R., Vorgias, C. and Gallwitz, D. 1989. The ras-rclatcd mousc yptl protein can functiocally replace the YTP1 gene product in yeasi. EMBO J, 8, 1427-1432.

Hiiaj, Y. Takebe, K., Takashina, M., Kobayaslii. S. und Takeichi, M. 1992. Epimorphin: a mescnchyinal protein essential for cpithelial morphogenesis. Cell 69, 471-481.

Inuiie, A., Obata, K. and Agakawa, K. 1992. Qoning and sequence analysis of cDNA for a ncuronal celi mcmbrane antigen, HPC-1. J. Biol. Chcm. 267, 10613-10619.

Irani, M.H. and Kilgore, T.JL 1988. High Icvcl exprcssion in yeast. European patent application EP 0 284 044 Al.

[to, H., Fukuda, Y., Murala, K. and Kimura, A. 1983. Transformation of intact yeast cclls with alkali cations. J. Bacteriol. 153, 163-168.

Jccncs, D., Macttenzie, D., Roberts, I. and Archer, D. 1991. Hcterologous protein pioduction by fiiamentous fungi. Biotechnology and Genctic Engineering Reviews, vol. 9. Pp. 327-367.

Keranen, S. 1986. Syiithesis and proccssing of Scmliki forest virus polyprotcin in Saccharomyces cerevisiae: a ycast type giycosylation of El cnvclopc protein. Gene 48, 267-275.

Lamsa, M. and Blocbaum, P. 1990. Mutation and screening to increase chymosin yield in a genetically-enginccrcd strain of Aspergillus avamori. J. lad. Microbiol. 5, 229-238.

Lopez, M.C., Nicand, J.M. and Gaillardin, C, 1992. SEC14 deleted mutant of Yarrawia lipofytica is ahcred in tbe secretion and diffcrentation processes. 16th International Conference on Ycast Genettes and Molecular Biology. Vienna, Austria, Aug. 15-21.1992, Ycast 8 (Spee. Issue) p. 473.

Maniatis, T., Fritscli, E.F. and Sambrook, J. 1982. Molecular Qoning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Martcgani, E., Forlani, ti., Mauii, I-, Porro, D., Schleuning. W.D. and Albcxghioa, L. 1992. Expression of high levels of human tissuc plasminogcn activator in ycast under the control of an mducibie GAL promoter. Appl. Microbiol. Biotcchnol, 37,604-608.

McKnight, G.L. and McConnaughy, B.L.. 1983. Sckction of functional cDNAs by complcmcniation in ycast. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80, 4412-4416.

Måntylå, A., Rossi, IL Vanhancn, S., Penttila, M., Suonrinen, P. and Nevalaincn, H. 1992. Electrophorctic karyotyping of wild type and mutant Trichoderma reesei strains. Current Gcnetics 21:471-477.

Novick, P. and Scheckman, IL, 1979. Secrction and ccll-suifacc growth are blocked in a temperarurc-sensitive mutant of Saccharomyces cerevisiae. Proe Nati. Acad. Sei. USA 76, 1858-1862.

Novick, P-, Ferro, S. and Scheckman, R. 1981. Order of events in the yeast scerctory paihway. Ccll 25, 461-469.

Novick. P., Fields, C. and Scheckman, K. 1980. Identification of 23 complemcntation groups required for post-translational events in the yeast secretory pathway. Cell 21, 205-215.

Nyyssonen, E., Kcianen, S.. Penttila. M.. Takkincn. K- and Knowlcs, J. K. C. 1990. Imniunoglobulin production by Trichoderma. US Pat. Appl. 552757.

NyyssSnen, E., Penttila, M., Harkki, A., SalohdniO, A, Knowlcs, J.K.C. and Keranen, S. 1993. Efficicnt production of antibodies by the filarnentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Tcchnology 11, 591-595.

Pcnttilå, M.E., Ncvalaincn, H., Ratto, M., Salmiiien, E. and Knowlcs. J.K.C. 1987. A versatilt; transformation system lor the filamcntous fungus Trichoderma reesei. Gene 61, 155-164.

Pmtopopov, V., Govindan, B.( Novick, P. and Gcrsi, J.E. 1993. Homologs of the s>naptobrevin/VAMP family of synaptic vesicle proteins function on the late secretory pathway in S. cerevviiae. Cell 74, (in press).

Romanos, M. A., Scorer, GA. and Ctare, J.J. 1992. Foreign gcce expression in ycast: a Kevicw. Ycast 8., 423-488.

Ruohonen, L., Hackman, P., Lchtovaara, P., Knowles, J.C.K, and Keranen, S. 1987. Hfficicnt secrction of Bacillus amyloliqucfacicns a-amylasc by its own signal peptide in Saccharomyces cerevisiae host cells. Gene 59, 161-170.

Ruohonen, L., Penttila, M- and Keranen, S. 1991. Optimization of Bacillus <x-amyiasc production by Saccharomyces cerevisiae. Ycast 7, 337-346.

Sakai, A. Shimizu, Y. and Hishinuma, F. 1988. Isolation and characterizAlion of mutants which show an oversccrction phenotypc in Sacdiaramyces cerevisiae. Genetics 119, 499-506.

Schuster, J.R., Mover, D.L., Lcc, II., Dennis, A, Smith, B. and Mcrrywcather, J.P. 1989. Gene 83, 47-55.

Segcv, N., MulhoUnnd, J. and Beiste in, D., 1988. The ycast GTP-binding YTP1-protcin and a mammalian counterparl are associated with the secrction machincry. Cell 52, 915-924.

Sikorski, R.S. and Hieter, P. 1989. A system of shutllc veetors and ycast host strains designcd for cf Scient manipularion of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genettes 122, 19-27.

Slccp, D-, Bclficld, G.P., Ballancc, DJ., Steven, J., Jones, S. Evans, L.R-, Moir, P.D. aud Goodcy, A.R. 1991. Saccharomyces cerevisiae. strains tha; overexpress hetcrologous protciDS. Bio/fechuology 9. 183-187.

Smith, RA.. Duncan, M.J. and Moir, D.T. 1985. Hetcrologous protein secretion from ycast. Science 229, 1219-1224.

Suzuki, K., Ichikawa, K. and Jigami, Y. 1989. Ycast mutants with enhanced ability to sccrctc human lysozymc: Isolation and identtficatioti of a proiease-deficienl mutant. Mol. Gen. Genet. 219, 58-64.

Vanoni, M., Potto, D., Martcgani, E. and Albcrgbiita, L. 1989. Sccrclion of Escherichin coli B—galactosidasc in Saccharomyces cerevisiae ustng the signal scqucnee fron the glucnamylase-encoding STA2 gene. Biochem. Biophys. Res. Coiijmun. 164, 1331-1338.

Ward, M., Wilson, L.I., Kodama, K.H., Rev, M.W. and Berka, R.M. 1990. bnprovcd production of cal f chymosin in Axpcrgillus by exprcssion as a glucoamylasu-chymosin fusion.

Wilson. D.W., Wilcox, OA-, Flynii, G. C., Clien, E, Unang, W-J„ Henzel, WJ., Block, M.R., Ultrich. A. and Rothman, J.E., 1989. A fusion protein requircd for vchide-mediated tninspon in both mammalian cclls and ycasts. Nature 339, 355-359.

Zagursky, RJ., Boman, M.L., Baumeistcr, FC aiid Lomax, N. 1986. Rapid and easy sequencingof large linear double stranded DNA and supercoilcd plasmid DNA. Gene Anal. Techn. 2, 89-94.

Zaraoui, A., Touchot, N., Chardin, P. and Tavjiian, A. 1989. Tlie human Rab genes encode family or GTP-binding proteins relatcd to ycast VITI and SEC4 products involvcd in secretion. J. Biol. Chem. 264, 12394-12401.

Claims (24)

1. Isolert DNA-sekvens av secl suppressorgen SSO som er valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3, og homologer derav, hvilken DNA-sekvens, når den overuttrykkes i eukaryote celler, gjør nevnte celler i stand til å danne økede mengder av utskilte proteiner.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor sekvensen er avledet fra sopp, og når den overuttrykkes i en soppvertsorganisme, gjør nevnte vertsorganisme i stand til å danne økede mengder av utskilte proteiner.

3. DNA-sekvens ifølge krav 2, som er valgt fra SSOl- og SS02-sekvensene som koder for et polypeptid omfattende i hovedsak aminosyresekvensene gitt i henholdsvis SEQ ID NO:2 og SEQ ID NO:4, eller et funksjonelt fragment derav som og som, når den overuttrykkes i eukaryote eller fungale celler, gjør nevnte celler i stand til å danne økede mengder av utskilte proteiner.

4. Vektor omfattende en DNA-sekvens ifølge ethvert av kravene 1-3.

5. Vektor ifølge krav 4, hvilken vektor er i stand til å replikere autonomt når den transformeres i eukaryote celler.

6. Vektor ifølge krav 4, hvilken vektor er i stand til å integrere i kromosomet når den transformeres i eukaryote celler.

7. Vektor ifølge krav 4, som er en gjærekspresjonsvektor, hvor nevnte DNA-sekvens blir uttrykt under gjærgenregu-latoriske områder.

8. Vektor ifølge krav 7, hvor nevnte gjærregulatoriske områder er valgt fra gruppen omfattende promoterområdene av SSOl-genet, SS02-genet, SECl-genet, GAL1-GALI0-genene, alkoholdehydrogenasegenet ADH1, asparaginsyntetasegenet samt funksjonelle deler derav.

9. Vektor ifølge krav 4, som er en filamentøs soppekspresjonsvektor hvor nevnte DNA-sekvens blir uttrykt under regulatoriske områder som er funksjonelle i filamentøse sopp.

10. Vektor ifølge krav 9, hvor nevnte regulatoriske områder som er funksjonelle i filamentøse sopp er valgt fra gruppen omfattende promoterområdene av sso, cbhl, cbh2, egil, egl2, tefl, pgk, pki, glukoamylase, a-amylase og alkoholdehydrogenasegenene.

11. Vektor ifølge krav 4, som er en soppvektor valgt fra gruppen omfattende YEpSSOl og YEpSS02 som deponert i henholdsvis DSM 7253 og DSM 7254.

12. Rekombinante eukaryote celler som bærer en DNA-sekvens i henhold til ethvert av kravene 1-3, og som uttrykker økede nivåer av Sso protein(er).

13. Rekombinante eukaryote celler ifølge krav 12, som er soppceller tilhørende en art valgt fra gruppen omfattende Saccharomyces spp., Trichoderma spp., Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe, Pichia spp., Hansenula spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp. og Neurospora spp.

14. Rekombinante eukaryote celler ifølge krav 13 som er soppceller som tilhører en art valgt fra Saccharomyces og Trichoderma.

15. Rekombinante eukaryote celler ifølge krav 14, som er soppceller av Saccharomyces cerevisiae stamme VTT-C-92072 som har deponeringstilgangsnummer DSM 7253.

16. Rekombinante eukaryote celler ifølge krav 14, som er soppceller av Saccharomyces cerevisiae stamme VTT-C-92073 som har deponeringstilgangsnummer DSM 7254.

17. Fremgangsmåte for konstruksjon av nye eukaryote celler som er istand til å uttrykke økte nivåer av Sso-protein(er), hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å isolere DNA-sekvens(er) valgt fra SS01-og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3, og homologer derav, som koder for Sso-protein (er) fra en passende donororganisme; (b) å konstruere en vektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; og (c) å transformere minst én av de erholdte vektorer til egnede vertsceller.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, hvor vertscellen som skal bli transformert er valgt fra gruppen omfattende Saccharomyces spp., Trichoderma spp., Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe, Pichia spp., Hansenula spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp. og Neurospora spp.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, hvor nevnte vertsorgansime tilhører en art valgt fra Saccharomyces og Trichoderma.

20. Fremgangsmåte ved fremstilling av økte mengder utskilte fremmede eller endogene protein(er) ved å overuttrykke SSO-gen(er), hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for nevnte protein(er) fra en passende donororganisme; (b) å konstruere en vektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; (c) å transformere den erholdte vektor i en passende vertsorganisme omfattende DNA-sekvens(er) valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3, og homologer derav, og som uttrykker økede nivåer av Sso-protein(er) for å fremskaffe rekombinante vertsceller, eller alternativt å transformere vektoren i en passende vertsorganisme og retransformere denne transformant med DNA-sekvens(er) valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQQ ID NO: 3, og homologer derav og utvelge for celler med øket produksjon av nevnte protein(er), og (d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte protein (er).

21. Fremgangsmåte ved fremstilling av økede mengder utskilte fremmede eller endogene protein(er) ved å overuttrykke gen(er) og som har DNA-sekvenser valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvi SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3 samt homologer derav, f.eks. SECl, i nærvær av normale eller økede mengder av Sso protein(er), hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for nevnte protein(er) fra en passende donororganisme; (b) å konstruere en vektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; (c) å transformere den erholdte vektor i en passende vertsorganisme som uttrykker normale eller økede nivåer av Sso-protein(er) og overuttrykker andre gen(er) som samvirker med SSO-genet, f.eks. SECl, for å fremskaffe rekombinante vertsceller, eller alternativt å transformere vektoren i en passende vertsorganisme og retransformere denne transformant med SSO eller et gen som er homologt med SSO og hvor gen(ene) samvirker med SSO-genet, f.eks. SECl, og å utvelge for celler med øket produksjon av nevnte protein(er); og (d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte protein (er) .

22. Fremgangsmåte for øket produksjon av et endogent utskilt protein, hvor fremgangsmåten omfatter: (a) å transformere celler som danner nevnte protein med DNA-sekvens(er) valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3, og homologer derav, alene eller sammen med gen(er) som samvirker med SSO-genet, slik som SECl, (b) å utvelge for transformanter som danner økede nivåer av nevnte protein for således å fremskaffe rekombinante celler for øket proteinproduksjon, og (c) å dyrke nevnte rekombinante celler under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte protein.

23. Fremgangsmåte for effektiv biomasseproduksjon på et råmateriale eller effektiv hydrolyse av et råmateriale, hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for endogene eller fremmede hydrolytiske enzym(er) fra en passende donororganisme; (b) å konstruere en soppvektor som bærer minst én av nevnte DNA-sekvenser; (c) å transformere den fremskaffede vektor i en passende soppvertsorganisme som omfatter DNA-sekvens (er) valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3, og homologer derav og som uttrykker økede nivåer av Sso-protein (er), for å fremskaffe rekombinante vertsceller, eller alternativt å transformere vektoren til en egnet vertsorganisme og retransformere denne transformant med DNA-sekvens(er) valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO: 1 og SEQ ID NO: 3 og homologer derav, og å utvelge for celler med øket produksjon av nevnte enzym(er); og (d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte hydrolytiske enzym(er).

24. Fremgangsmåte for effektiv biomasseproduksjon på et råmateriale eller effektiv hydrolyse av et råmateriale, ved å overuttrykke gener som samvirker med SSO-genet og som har DNA-sekvens(er) valgt fra SSOl- og SS02-sekvenser vist i henholdsvis SEQ ID N0:1 og SEQ ID NO:3 samt homologer derav, f.eks. SECl, i nærvær av normale eller økede mengder av Sso-protein(er), hvilken fremgangsmåte omfatter: (a) å isolere DNA-sekvens(er) som koder for endogene eller fremmede hydrolytiske enzym(er) fra en egnet donororganisme; (b) å konstruere en vektor som bærer minst én av de nevnte DNA-sekvenser; (c) å transformere den fremskaffede vektor i en passende vertsorganisme som uttrykker økede nivåer av protein(er) som samvirker med Sso-protein(er) i nærvær av normale eller økede mengder av Sso-protein(er), for å fremskaffe rekombinante vertsceller, eller alternativt å transformere vektoren til en passende vertsorganisme og retransformere denne transformant med SSO-genet eller et gen som er homologt med SSO og hvor gen(ene) samvirker med SSO-genet, så som SECl, og å utvelge for celler med øket produksjon av nevnte enzym(er); og (d) å dyrke nevnte rekombinante vertsceller under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte hydrolytiske enzym(er).