ES2211870T3 - Aumento de la produccion de proteinas secretadas por celulas eucarioticas recombinantes. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE. ESPECIFICAMENTE ESTA INVENCION SE REFIERE A NUEVAS CELULAS EUCARIOTICAS RECOMBINANTES TRANSFORMADAS CON GENES SSO. LAS CELULAS EUCARIOTICAS TRANSFORMADAS CON VARIAS COPIAS DE GENES SSO, O QUE SOBREEXPRESAN LA PROTEINA SSO POR ALGUN OTRO MEDIO, TIENEN UNA CAPACIDAD INCREMENTADA PARA PRODUCIR PROTEINAS SEGREGADAS EXTRAÑAS O ENDOGENAS. ADEMAS, LAS MENCIONADAS NUEVAS CELULAS RECOMBINANTES, CUANDO ESTAN TRANSFORMADAS POR GENES QUE EXPRESEN ENZIMAS HIDROLITICAS ADECUADAS PUEDEN UTILIZAR COMPUESTOS MACROMOLECULARES, ADECUADOS MAS EFICIENTEMENTE, LO QUE DA COMO RESULTADO UNA PRODUCCION INCREMENTADA DE MASA CELULAR Y/O UNA UTILIZACION MAS VERSATIL DE LOS COMPUESTOS EN APLICACIONES BIOTECNICAS.

Description

Aumento de la producción de proteínas secretadas por células eucarióticas recombinantes.

Campo de la invención

La invención se refiere a tecnología de DNA recombinante. Específicamente esta invención se refiere a nuevas células eucarióticas recombinantes transformadas con genes SSO o sus homólogos. Una célula eucariótica transformada con varias copias de un gen SSO o un gen homólogo a SSO tiene una capacidad incrementada para producir proteínas endógenas o extrañas secretadas.

Además,dichas células nuevas eucarióticas recombinantes, especialmente hongos filamentosos y levaduras, cuando se transforman con genes que expresan enzimas hidrolíticas convenientes pueden hidrolizar y/o utilizar compuestos macromoleculares/poliméricos más eficazmente, lo que da lugar a producción de masa celular incrementada y/o utilización más versátil de los compuestos en aplicaciones biotécnicas relevantes.

Fundamento de la invención

El desarrollo de métodos de DNA recombinante ha hecho posible producir proteínas en sistemas hospedantes heterólogos. Esta posibilidad facilita enormemente la producción de, por ejemplo, proteínas de importancia terapéutica que normalmente aparecen en la naturaleza en muy pequeñas cantidades o son difíciles de aislar o de purificar. Tales proteínas incluyen factores de crecimiento, hormonas y otras proteínas o péptidos biológicamente activos que tradicionalmente se han aislado de tejidos humanos o animales o fluidos corporales, por ejemplo, suero sanguíneo u orina. El peligro creciente de la presencia de virus patógenos humanos tales como HBV, HIV, y virus oncogénicos u otros patógenos en los tejidos animales o humanos o fluidos corporales ha acelerado enormemente la búsqueda de sistemas de producción heterólogos para estos terapéuticos. Otras proteínas de importancia clínica son proteínas virales u otras microbianas o parásitas humanas necesarias para diagnóstico y para vacunas especialmente de esos organismos que son difíciles de crecer in vitro o en cultivo de tejidos, o son patógenos humanos peligrosos. Estos incluyen virus como HBV, HIV, fiebre amarilla, rubeola, FMDV, rabia, y parásitos humanos como malaria.

Un grupo adicional de proteínas para el que se han desarrollado o se están desarrollando sistemas de producción heterólogos son enzimas secretadas, especialmente las que hidrolizan el material vegetal, y que son necesarias en producción de alimentos y de pienso así como en otros procedimientos industriales que incluyen la industria textil y la industria de la pasta y del papel. La posibilidad de producir proteínas en sistemas heterólogos o la producción de proteínas endógenas en células sometidas a ingeniería genética aumenta sus rendimientos y facilita grandemente su purificación y ha tenido ya ahora un gran impacto sobre los estudios de estructura y función de muchas enzimas y otras proteínas importantes. La producción y secreción de enzimas hidrolíticas extrañas en levadura, por ejemplo, da lugar a mejoras en los procedimientos basados en cepas de levadura industrial como las levaduras de destilería, cervecería o panadería.

Se han desarrollado y se están desarrollando varios sistemas de producción que incluyen bacterias, levaduras, hongos filamentosos, cultivos de células vegetales y animales e incluso organismos multicelulares como animales y plantas transgénicos. Todos estos sistemas diferentes tienen sus ventajas, incluso desventajas, y todos son necesarios.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es por el momento la eucariota mejor conocida a nivel genético. Como microbio eucariótico posee las ventajas de una célula eucariótica como la mayoría, si no todas las modificaciones post-translacionales de los eucariotas, y como microbio comparte las propiedades de fácil cultivo y manipulación de las bacterias. Los sistemas de fermentación a gran escala se han desarrollado bien para Saccharomyces cerevisiae que tiene una larga historia como caballo de tiro de la biotecnología, que incluye la producción de ingredientes y bebidas alimentarias como cerveza y vino.

Los métodos genéticos de levadura son hasta ahora los mejor desarrollados entre eucariotas basados en el vasto conocimiento obtenido por la genética clásica. Esto hace fácil adoptar y después desarrollar para genes y levadura los procedimientos tecnológicos descritos para Escherichia coli. Junto con otras líneas los métodos para construir cepas de levadura que producen proteínas extrañas se han desarrollado en gran extensión (Romanos et al., 1992).

La secreción de las proteínas en el medio de cultivo implica transferencia de las proteínas a través de compartimentos cerrados por varias membranas que constituyen la trayectoria secretoria. En primer lugar las proteínas se translocan al lumen del retículo endoplasmático ER. Desde allí las proteínas se transportan en vesículas de membrana al complejo Golgi y desde Golgi a la membrana plasmática. El procedimiento secretorio implica varias etapas en las que las vesículas que contienen las proteínas secretadas se pellizcan desde la membrana donadora, se toman como blanco y se fusionan con la membrana aceptora. En cada una de estas etapas es necesaria la función de varias proteínas diferentes.

La trayectoria secretoria de la levadura y un gran número de genes implicados en ella se han elucidado por aislamiento de mutantes letales condicionales deficientes en ciertas etapas del proceso secretorio (Novick et al., 1980; 1981). La mutación en una proteína, necesaria para una etapa de transferencia particular da lugar a acumulación de las proteínas secretadas en el compartimento de membrana precedente. Así, las proteínas pueden acumularse en
ER, Golgi o en vesículas entre ER y Golgi, o en vesículas entre Golgi y la membrana plasmática.

El análisis más detallado de los genes y proteínas implicados en el procedimiento secretorio se ha hecho posible por clonación de los genes y caracterización de la función de las proteínas correspondientes. Aparece un cuadro que indica que en todas las etapas están funcionando varias proteínas que interactúan. Hemos clonado recientemente dos nuevos genes de levadura, SSO1 y SSO2 como supresores de multicopia de defecto sec1-1 en crecimiento y secreción a temperaturas elevadas (Aalto et al., 1993).

Muchos de los genes identificados en, y aislados de, S. cerevisiae se han encontrado y clonado desde otros organismos basados bien en la homología de secuencia con genes de levadura o en la complementación de mutaciones de levadura. El factor NSF de mamíferos es el homólogo del producto de gen SEC18 de levadura y desempeña una función similar en la secreción de proteínas (Wilson et al., 1989). El gen SEC14 de Yarrowia lipolytica (López et al., 1992) se ha clonado y caracterizado. Se ha clonado el homólogo mamífero para el gen SEC11 de levadura que codifica un componente de la peptidasa señal (Greeenberg et al., 1989). El gen Schizosaccaromyces pombe YPTI que codifica una pequeña proteína de unión GTP se clonó utilizando el gen SEC4 de levadura como una sonda (Fawell et al., 1989) y el homólogo mamífero de YPTI mostró ser parte de la maquinaria secretoria utilizando anticuerpos contra la proteína Ypt1p de levadura (Segev et al., 1988). La proteína rab1 de mamífero que ha mostrado ser homóloga de Ypt1p (Zaraoui et al., 1989) puede sustituir la función Ypt1 de levadura (Haubruck et al, 1990).

Genes homólogos en el nivel de proteína a los genes SSO1 y SSO2 de levadura conforme a la invención se encuentran en varias especies que incluyen el ratón (Hirai et al., 1992), la rata (Inoue et al., 1992, Bennete et al., 1992) y los nematodos (Ainscough et al., 1991; EMBL Data Bank 29, número de entrada M 75825) lo que indica que los genes se conservan durante la evolución. Las proteínas homólogas en las otras especies también aparecen sobre la superficie celular o están implicadas en el transporte de vesículas sinápticas a la superficie celular, sugiriendo que pueden estar funcionalmente relacionadas con SSO1 y SSO2. Sin embargo, la implicación directa en la secreción sólo se ha demostrado para las proteínas Sso, informado por nosotros (Aalto et al., 1993). Los homólogos de levadura para las proteínas de membrana de vesícula sináptica, sinaptobrevinas son las proteínas Snc1 y Snc2 (Gerst et al. 1992; Protopopov et al. 1993).

Los ejemplos citados más arriba, de los que existen muchos más, ilustran la naturaleza universal de la maquinaria secretora. Los resultados obtenidos con la levadura son ampliamente aplicables a otros hongos así como a otras células eucarióticas.

Los genes con similaridad de secuencia a los genes SSO están implicados para funcionar también en otras etapas de transporte/secreción de proteínas intracelulares: SED5 (Hardwick y Pelham, 1992) entre ER y Golgi y PEP12 (Becherer y Jones, 1992) entre Golgi y vacuola, el compartimento de lisosoma de la levadura. Esto además apoya el papel central y conservado de los genes SSO en la secreción de proteínas y en el transporte intracelular. Sin embargo, no existen informes hasta ahora relativos a cualquier efecto positivo de los homólogos SSO en células animales o de levadura sobre la secreción cuando se sobreexpresan, cuyo efecto estamos mostrando en esta invención para los genes SSO.

Menos se conoce acerca del sistema secretorio de otras levaduras como Kluyveromyces, Pichia, Schizosaccharomyces y Hansenula, que, sin embargo, tienen hospedantes útiles probados para la producción de proteínas extrañas (Buckholz y Gleeson, 1991). La biología genética y molecular de estas levaduras no son como la desarrollada para Saccharomyces pero las ventajas de estas levaduras como hospedantes de producción son las mismas que para Saccharomyces. Esto es también cierto para hongos filamentosos como Neurospora, Aspergillus y Trichoderma que han sido usados para producción de proteínas extrañas secretadas (Genes et al., 1991). Al pertenecer taxonómicamente a los hongos y perteneciendo muchos de los hongos filamentosos incluso a Ascomicetes, como el S. cerevisiae, es evidente que la maquinaria secretoria de los hongos filamentosos es similar a la de S. cerevisiae. Los hongos filamentosos son muy eficaces en secretar sus propias enzimas hidrolíticas. Sin embargo, la producción de proteínas extrañas en hongos filamentosos es mucho menos eficiente y en muchos casos esto parece ser debido a secreción ineficaz. Las características comunes de todos los hongos son, por ejemplo, modificaciones translacionales que tienen lugar a lo largo de la trayectoria secretoria.

Se han hecho varios intentos y se han publicado previamente para incrementar la producción de proteínas extrañas en los hongos filamentosos y en la levadura así como en otros organismos. Se ha dedicado mucho trabajo a varias construcciones de promotor y plásmido para aumentar el nivel de transcripción o número de copias de plásmido (véase por ejemplo, Baldari et al. 1987; Martegani et al 1992; Irani y Kilgore, 1988). Un enfoque común para intentar y aumentar la secreción es usar las secuencias de señal de levadura (Baldari et al. 1987, Vanoni et al. 1989). La mutagénesis y la selección al azar de una proteína secretada (Smith et al., 1985; Sakai et al., 1989; Suzuki et al., 1989; Sep et al., 1991); Lamsa y Bolebaum, 1990: Dunn-Coleman et al., 1991) o la fusión de la proteína extraña a una proteína endógena eficientemente secretada (Ward et al., Pat. Appl.) se han usado ampliamente en levadura y en hongos filamentosos con el fin de hacer más eficaz la secreción de proteínas extrañas. Ambos métodos son de uso limitado. Los mutantes de sobreproducción aislados por mutagénesis y selección al azar son casi exclusivamente recesivos y así no pueden ser transferidos a cepas de levadura industrial que son poliploides. A menudo la sobreproducción resulta de cambios distintos de la secreción incrementada y en muchos casos afecta solo a las proteínas usadas para la selección. El enfoque de proteína de fusión requiere adaptación de la construcción de fusión específica para cada proteína extraña separadamente.

Nuestro enfoque, que aumentar el número de copias de los genes que funcionan en la secreción y así la cantidad de componentes de la maquinaria secretoria es más universal: es aplicable a cualquier proteína sin construcciones de fusión específicas y es aplicable a cepas diploides y poliploides.

No se sabe exactamente qué etapas forman los cuellos de botella en el proceso secretorio, pero puede anticiparse que hay varias. Empezamos a desenmarañar los bloques potenciales en el extremo final de la trayectoria secretoria, y hemos clonado y caracterizado genes que participan en la etapa final del proceso secretorio en el que las vesículas secretorias que brotan del complejo Golgi se dirigen a y se fusionan con la membrana plasmática para liberar las proteínas secretadas al exterior de la célula. Previamente hemos clonado y caracterizado el SEC1 que funciona en esta etapa (Aalto et al., 1991; Aalto et al, 1992) y hemos demostrado más tarde que el SCE1 es un gen de copia única esencial (Aalto et al., 1993). Los genes SSO conforme a la invención se clonaron como supresores de multicopias de mutación de sec1-1 (Aalto et al., 1993).

Sumario de la invención

Esta invención describe el aislamiento de genes que, cuando se sobreexpresan aumentan la producción de proteínas secretadas. Específicamente, esta invención describe el aislamiento de genes SSO1 y SSO2 de S. cerevisiae que codifican Sso1p y Sso2p, respectivamente, la caracterización de los genes y su transferencia a, y sobreexpresión en, S. Cerevisiae. Además, esta invención describe el aislamiento de un homólogo SSO de Trichoderma reesei, caracterización del gen, y transferencia y sobreexpresión en Trichoderma.

Además, las homologías de secuencia entre los genes SSO de levadura y sus equivalentes eucarióticos superiores indica que esta invención puede usarse para construir nuevas líneas celulares para eucariotas superiores con capacidad de secreción aumentada.

Esta invención así proporciona nuevas células eucariotas recombinantes, preferiblemente células hospedantes fúngicas que expresan niveles aumentados de proteínas Sso y especialmente cepas de levadura que expresan niveles aumentados de proteínas Sso1 y Sso2 así como cepas de Trichoderma que expresan niveles aumentados de proteína Sso de Trichoderma. Esta invención también proporciona procedimientos para producción de cantidades aumentadas de proteínas secretadas por sobreexpresión de genes que interactúan con los genes SSO, como los SEC1.

Las células eucariotas conforme a la invención que se transforman con los genes SSO o los genes que interactúan con los genes SSO tienen una capacidad incrementada para producir proteínas secretadas. Las nuevas células eucarióticas conforme a la invención, especialmente levaduras y hongos filamentosos, pueden también usarse para una producción más eficiente de enzimas hidrolíticas e hidrólisis de, por ejemplo, sustratos poliméricos que dan lugar a mejoras en los procedimientos biotécnicos como producción de célula única o de levadura de panadero debido a masa celular incrementada o en otros procesos donde es beneficiosa la producción eficiente de enzimas hidrolíticas y/o la hidrólisis eficiente de material vegetal.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A y 1B muestran el cDNA con genes SSO1 Y SSO2 de S. cerevisiae integrado en un pMAC561 plásmido multicopia que da lugar a plásmidos YEpSSO1 y YEpSSO2, respectivamente.

La Fig. 2 muestra el análisis Western que demuestra sobreexpresión de proteína Sso2 en levadura transformada con YEpSSO2.

La Fig. 3 muestra producción incrementada de \alpha-amilasa de Bacillus secretada por S. cerevisiae (cepa sf750-14D) transformada con plásmido multicopia, que expresa genes SSO1 y SSO2 y con otro plásmido que expresa gen de \alpha-amilasa de Bacillus.

La Fig. 4 muestran el análisis Western de \alpha-amilasa de Bacillus secretada por S. cerevisiae con o sin el plásmido multicopia que expresa gen SSO1 o SSO2.

La Fig. 5 muestra producción aumentada de \alpha-amilasa de Bacillus secretada por S. cerevisiae (cepa DBY746) transformada con plásmido multicopia, que expresa gen SSO2 y con otro plásmido que expresa \alpha-amilasa de Bacillus.

La Fig. 6 muestra producción aumentada de \alpha-amilasa de Bacillus secretada por S. cerevisiae (cepa DBY746) transformada con plásmido multicopia que expresa gen SEC1 y con otro plásmido que expresa \alpha-amilasa de Bacillus.

La Fig. 7 muestra la casete de expresión SSO2 flanqueada por secuencias ribosómicas integradas en BS+, que generan el vector pRbSSO2.

La Fig. 8 muestra hibridación de DNA derivada de seis especies fúngicas diferentes con el gen de levadura
SSO1.

Descripción detallada de la invención

Para mejor comprensión de la siguiente descripción detallada de la invención puede ser útil dar definiciones de ciertos términos que se utilizan a continuación.

Sobreexpresión de un gen: La proteína codificada por dicho gen se produce en cantidades incrementadas en la célula. Esto puede conseguirse aumentando el número de copias del gen por introducción de copias extra del gen en la célula sobre un plásmido o integrado en el genoma. La sobreexpresión también se consigue situando el gen bajo un promotor más fuerte que su propio promotor. La cantidad de la proteína en la célula puede variarse variando el número de copias del gen y/o la fuerza del promotor utilizado en la expresión.

Supresión de una mutación: Cuando el efecto de una mutación en un gen dado se alivia o es abolida por una mutación en otro gen, este segundo gen se llama supresor del primer gen. La supresión puede ocurrir también por sobreexpresión del alelo silvestre del segundo gen por los medios descritos antes. Esto se llama supresión de sobreexpresión. Si la sobreexpresión está causada por múltiples copias del gen supresor la supresión también puede llamarse supresión de multicopias. El fenómeno de supresión indica que estos dos genes interactúan a nivel genético. La interacción también puede ocurrir a nivel físico como contacto directo, físico entre las dos proteínas codificadas por los genes que interactúan.

Genes homólogos, homólogos: Genes que están relacionados pero no son idénticos, en su secuencia de DNA y/o realizan la misma función son homólogos entre sí y se llaman cada uno homólogo del otro.

Proteínas secretadas: Las proteínas que en el interior de la célula se dirigen a la trayectoria secretoria y se transportan mediante ella al exterior de la célula, fuera de la membrana plasmática, se llaman proteínas secretadas. En la levadura las proteínas pueden permanecer asociadas con la pared celular como la invertasa o liberarse a través de la pared celular al medio de crecimiento como la proteína extraña \alpha-amilasa de Bacillus.

Los genes SSO1 y SSO2 que se utilizan en esta invención se aislan de un organismo que contiene estos genes por ejemplo, S. cerevisiae y Trichoderma spp. También pueden usarse otras levaduras y otros hongos convenientes, como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia spp., Hansenula spp., Aspergillus spp., Neurospora spp., y Penicillium spp. Debe observarse que también pueden usarse los genes homólogos de otros organismos.

Además, la sobreexpresión de otros genes que funcionan en la misma etapa con los genes SSO, como SEC1, en presencia de niveles normales o incrementados de proteínas Sso, da lugar a secreción incrementada. Los genes que funcionan en las etapas precedentes del proceso secretorio pueden tener también un efecto similar. Así, la liberación de las vesículas secretorias desde el compartimento Golgi puede facilitarse aumentando el número de copias de genes SEC7 y/o SEC14 que se sabe funcionan en esta etapa (Novick et al. 1980) o buscando y aumentando el número de copias de genes que interactúan con SEC7 y/o SEC14, por ejemplo, supresores de sus mutaciones. De igual modo cualquier etapa previa del proceso secretorio puede mejorarse aumentando el número de copias de los genes implicados. Los nuevos genes se han aislado de genes duplicados que representan S. cerevisiae, SSO1 y SSO2, lo que sugiere que desempeñan un importante papel en la célula. Basándose en la naturaleza conservada de SSO1 y SSO2 y sus homólogos en otras especies, como se ha mencionado antes, proponemos que el aumento de los genes SSO en cualquier otra especie eucariótica daría lugar a mayor eficacia de secreción de proteínas incluyendo otras levaduras, hongos filamentosos, y células animales y vegetales.

Debe observarse que debido al hecho de que muchos genes implicados en la secreción funcionan en otros organismos, esta invención abarca por ejemplo también la expresión de genes de levadura en hongos filamentosos y eucariotas superiores y viceversa, o cualquier gen eucariótico en otra eucariota para obtener secreción aumentada.

El hospedante a transformar con los genes de la invención puede ser cualquier célula eucariótica conveniente para producción de proteínas extrañas o endógenas, por ejemplo, cualquier cepa de levadura S. Cerevisiae, (por ejemplo, DBY746, AH22, S150-2B, GPY55-15B\alpha, VTT-A-63015) cualquier Trichoderma spp como T. Harzianum y las cepas T. reesei, derivadas del aislado natural QM6a como RUTC-30, QM9416 y VTT-D-79125, cualquier Kluyveromyces spp., Sch. Pombe, H. Polymorpha, Pichia, Aspergillus, Neurospora, Yarrowia, Penicillium spp. o células eucarióticas superiores. La transferencia de los genes a estas células puede conseguirse, por ejemplo, utilizando los métodos convencionales descritos para estos organismos.

La secuencia de DNA que contiene SSO1 y SSO2 se aisla de S. cerevisiae por métodos convencionales. En una realización preferida se usan genes o biblioteca de cDNA sobre un plásmido multicopia para suprimir la sensibilidad a la temperatura del mutante sec1-1 (Aalto et al., 1993) o mutaciones que conducen a deficiencia en la función SSO de S. cerevisiae o mutaciones análogas de otras especies . En otro enfoque la secuencia conocida de DNA de los genes SSO y genes similares a SSO se usa para diseñar sondas para hibridación heteróloga de prímeros PCR para clonar los genes SSO. En aún otro enfoque se usan anticuerpos de los genes SSO y similares a SSO conocidos para clonar los genes por métodos estándar.

Los genes que corresponden a los SSO1 y SSO2 de S. cerevisiae se aislan de los otros hongos o eucariotas superiores con uno o varios de los siguientes métodos, que aquí se describen específicamente para los hongos filamentosos Trichoderma reesei, y que pueden modificarse conforme al conocimiento y medios convencionales para adaptarse a la célula eucariótica en cuestión.

Un banco de cDNA de Trichoderma reesei se construye en el vector de levadura pFL60 como se describe en la solicitud de patente FI No.92 2373 (Buchert et al). Este DNA de banco de genes se transforma en la cepa S. cerevisiae H458 (Aalto et al., 1993) y se investiga la complementación del defecto de secreción, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 6. El plásmido se aísla de las colonias positivas y el gen se aísla y caracteriza utilizando metodología estándar, y se aísla el correspondiente gen cromosómico. La complementación con éxito demuestra que existen genes equivalentes funcionalmente a los genes SSO de levadura en otros hongos como Trichoderma reesei.

Alternativamente, los genes que codifican proteínas que corresponden a Sso1p y/o Sso2p pueden aislarse de un cDNA o un banco de genes cromosómicos preparado a partir de Trichoderma reesei por hibridación heteróloga en condiciones no estrictas como se describe en el Ejemplo 7 y caracterizarse por métodos convencionales y su función puede mostrarse como se ha descrito antes. Un enfoque similar es conveniente para todos los organismos que han mostrado poseer secuencias cromosómicas homólogas a los genes SSO de levadura como se ha analizado, por ejemplo, por hibridación Southern de DNA total. También es posible que los genes puedan aislarse a partir de una biblioteca de expresión con anticuerpos preparados contra las proteínas Sso de levaduras.

Alternativamente, pueden diseñarse prímeros oligonucleótidos basados en las homologías encontradas entre las secuencias de los genes correspondientes aislados de varios organismos. Se ven homologías claras, por ejemplo, en regiones que se extienden desde aa 266 a aa 287 en Sso1p y desde aa 269 a aa 290 en Sso2p, mostrados en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3, respectivamente. Estos prímeros se usan para amplificar los genes de Trichoderma reesei en una reacción PCR.

Para construir un plásmido conveniente para transformación en una levadura, el gen SSO1 o SSO2 se clona en un vector de expresión de una levadura conveniente, como pAAH5 (Ammerer, 1983) o vectores derivados de eso (Ruohonen et al., 1991); Ruohonen et al., manuscrito en preparación, a) comprendiendo las regiones reguladoras de levadura apropiadas. Estas regiones reguladoras pueden obtenerse de genes de levadura como ADH1, GAL1-GAL10, PGK1, CUP1, GAP, CYc1, PHO5, o gen de sintetasa asparagina, por ejemplo. Alternativamente, también pueden usarse las regiones reguladoras SSO1 o SSO2 para expresar los genes en S. cerevisiae. El plásmido que soporta el gen SSO1 o SSO2 es capaz de replicarse autónomamente cuando se transforma en la cepa de levadura recipiente. El gen SSO1 o SSO2 junto con las regiones reguladoras de levadura apropiadas puede también clonarse en un vector de levadura de única copia como pHR70 de Hans Ronne o pRS313, pRS314, pRS315 o pRS316 (Sikorski y Hieter, 1989).

Alternativamente, copias extra de genes SSO1 o SSO2 pueden también integrarse en el cromosoma de levadura, en el locus de RNA ribosómico, por ejemplo. Para este fin las secuencias ribosómicas de un plásmido conveniente, por ejemplo plásmido pIRL9 (Hallborn et al., Pat Appl.) se liberan y se clonan apropiadamente en vector BS+, como se muestra en la Fig. 7. El gen SSO1 o SSO2 acoplado entre las regiones de promotor y terminador de levadura convenientes, se libera del vector híbrido que comprende los genes y se clona en el plásmido obtenido en la etapa previa. De este plásmido resultante puede liberarse la casete de expresión flanqueada por secuencias ribosómicas. Este fragmento se cotransforma en una levadura con un plásmido que se replica autónomamente que soporte un marcador conveniente para la transformación. El plásmido puede ser más tarde separado de las células que contienen las copias extra de genes SSO1 o SSO2 integrados en el cromosoma cultivando las células en condiciones no selectivas. De este modo, pueden obtenerse cepas recombinantes que no llevan DNA extraño extra como las secuencias de vector bacteriano. Si se usa una cepa de levadura poliploide, como VIT-A-63015, el gen puede integrarse también en un locus esencial como el locus ADH1 o el PGK1.

Para expresar los genes SSO en Trichoderma la región codificante del gen sso de Trichoderma se acopla, por ejemplo, entre el promotor y el terminador de cbh1 de Trichoderma reesei y la casete de expresión se transforma en una cepa Trichoderma que produce, por ejemplo, anticuerpos de mamíferos u otra proteína extraña en una cepa que produce EGIcore, otra celulasa o una enzima hidrolítica. El aumento de la secreción sería especialmente deseado cuando el hongo crece en medios que contienen glucosa y para este fin los genes sso necesitan expresarse a partir de promotores constitutivos o promotores que funcionan sobre medio de glucosa.

Para hongos filamentosos el gen sso se integra preferentemente en el genoma utilizando métodos conocidos en la técnica. Promotores conveniente además del promotor cbh1 o el promotor del propio gen sso son, por ejemplo, los otros promotores de células, cbh2, egl1, egl2, o tef1, pgk, gpd, pki, la glucoamilasa, la \alpha-amilasa o el promotor de alcoholdeshidrogenasa. En hongos filamentosos la transformación usualmente da lugar a cepas con copias variables del gen sso integrado en el genoma (Pentilä et al., 1987) y de estas puede separarse la cepa con nivel óptimo de expresión sso para crecimiento y secreción aumentada.

Un objeto de esta invención es así proporcionar genes SSO, especialmente los genes SSO1 y SSO2 de S. cerevisiae, así como genes homólogos de Trichoderma reesei y otras células eucarióticas. La secuencia de los genes puede determinarse a partir de los plásmidos que los soportan utilizando, por ejemplo, el método de secuenciación de didesoxinucleótidos de doble hebra (Zagursky et al., 1986). La secuencia del gen SSO1 de S. cerevisiae se da como la SEQ ID NO.1 y la secuencia del gen SSO2 de S. cerevisiae se da como la SEQ ID NO 3.

Otro objeto de esta invención es proporcionar vectores específicos que comprenden los genes SSO. Para la levadura un vector así es, o bien una multicopia que se replica autónomamente o un plásmido de copia única o un vector capaz de integrarse en el cromosoma, como se ha descrito antes. Para Trichoderma un vector así es preferiblemente un plásmido del que puede liberarse la casete de expresión (promotor-gen-terminador) por enzimas de restricción para integrarse en el genoma fúngico.

Aún otro objeto de esta invención es proporcionar levadura u otras cepas fúngicas así como líneas de células eucarióticas que contienen copias extra de genes SSO bien replicando plásmidos o integrados en los cromosomas, lo que da lugar a producción incrementada de proteínas secretadas, como invertasas de levadura o celulasas de Trichoderma u otras hidrolasas.

Así, un método para construir nuevas células eucarióticas capaz de expresar niveles aumentados de proteínas Sso comprende:

(a)

aislar secuencias de DNA que codifican proteínas Sso a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir vector(es) que llevan al menos una de dichas secuencias de DNA; y

(c)

transformar al menos uno de los vectores obtenidos en células hospedantes convenientes.

Aún otro objeto de esta invención es proporcionar células eucarióticas que además de copias extra de genes SSO comprenden una secuencia de DNA que codifica una proteína endógena o extraña secretada, como \alpha-amilasa, celulasa, o un anticuerpo y son capaces de expresar esta proteína.

Se proporciona así, un procedimiento para producir cantidades incrementadas de proteína endógena o extraña secretada por sobreexpresión de los genes SSO. Este procedimiento comprende:

(a)

aislar secuencias de DNA que codifican dicha proteína a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que soporta al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante conveniente que expresa niveles aumentados de proteínas Sso para obtener células hospedantes recombinantes; o alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con SSO o un gen homólogo de SSO y selección de células con producción aumentada de dicha(s) proteína(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) proteína(s).

Un objeto adicional de esta invención es aumentar la secreción por optimización del nivel de proteína Sso utilizando diferentes promotores y diferentes números de copias del gen y combinar los genes SSO con otros genes implicados en la secreción, como SEC1.

Así la invención proporciona un procedimiento para producir cantidades incrementadas de proteínas endógenas o extrañas secretadas, por sobreexpresión de genes que interactúan con el gen SSO, por ejemplo, SEC1, en la presencia de cantidades normales o incrementadas de las proteínas Sso, cuyo procedimiento comprende:

(a)

aislar secuencias de DNA que codifican dicha proteína a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que soporta al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante conveniente que expresa niveles normales o aumentados de proteínas Sso y sobreexpresión de otros genes que interactúan con el gen SSO, por ejemplo, SEC1, para obtener células hospedantes recombinantes; o alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con SSO o un gen homólogo de SSO y por el gen que interactúa con gen SSO y selección de células con producción aumentada de dicha(s) proteína(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) proteína(s).

Aún otro objeto de esta invención es proporcionar un procedimiento para aumentar la producción de una proteína endógena secretada, cuyo procedimiento comprende:

(a)

transformar las células que producen dicha proteína con un gen SSO o un gen homólogo de SSO, solo o junto con genes que interactúan con el gen SSO, como SEC1,

(b)

selección de transformantes que producen nivel aumentado de dicha proteína obteniendo así células recombinantes para producción aumentada de proteínas, y

(c)

cultivar dichas células recombinantes en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína.

Aún otro objeto de esta invención es proporcionar cepas fúngicas que además de copias extra de genes SSO o sus homólogos comprenden secuencias de DNA que codifican una enzima hidrolítica como \alpha-amilasa y/o glucoamilasa o enzimas que hidrolizan lignocelulosa como celulasas, hemicelulasas, o ligninasas, que hacen el hongo capaz de hidrólisis incrementada y/o crecimiento mejorado sobre compuestos poliméricos como almidón o lignocelulosa.

Así se proporciona una producción eficaz de biomasa sobre dicho material crudo o una eficaz hidrólisis de dicho material crudo. Este procedimiento comprende:

(a)

aislar secuencias de DNA que codifican enzimas hidrolíticas extrañas o endógenas a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector fúngico que soporta al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante fúngico conveniente que expresa niveles mejorados de proteínas Sso para obtener células hospedantes recombinantes; o alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con SSO o un gen homólogo de SSO y seleccionar las células con producción aumentada de dicha(s) enzima(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) enzima(s) hidrolítica(s).

También se proporciona un procedimiento para producción eficaz de biomasa sobre un material crudo o hidrólisis eficaz de un material crudo, por sobreexpresión de genes que interactúan con el gen SSO, por ejemplo, SEC1, en la presencia de cantidades normales o incrementadas de las proteínas Sso. Este procedimiento comprende:

(a)

aislar las secuencia de DNA que codifican enzimas hidrolíticas extrañas o endógenas a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que soporta al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante conveniente que expresa niveles mejorados de proteínas que interactúan con las proteínas Sso en la presencia de cantidades normales o aumentadas de las proteínas Sso para obtener células hospedantes recombinantes, o alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con gen SSO o un gen homólogo de SSO y con los genes que interactúan con los genes SSO como SEC1, y seleccionar las células con producción aumentada de dicha(s) enzima(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) enzima(s) hidrolítica(s).

Aplicaciones posibles de dichas células recombinantes son por ejemplo, la producción de células únicas, la producción mejorada de alcohol o en procedimientos donde se desea una hidrólisis eficaz del material bruto.

Experimental Ejemplo 1 Clonación de la región codificante de genes SSO1 y SSO2 a partir de Saccharomyces cerevisiae

Los genes SSO1 y SSO2 se aislaron como supresores del defecto de sensibilidad a la temperatura de mutante sec1-1 (Novick y Scheckman, 1979; Novick et al., 1980). La cepa S. cerevisiae sf750-14D\alpha (\alpha sec1-1 his4 ura3-52trpl-289 leu2-3 leu2-112) (obtenida de Randy Scheckman, Universidad de California, Berkeley, CA) se transformó (Ito et al., 1993) por la biblioteca de cDNA de levadura construida por McKnight y McConaughy (1983) a partir de la cepa X2180-1B sobre un plásmido base de 2\mu, pMAC561, que contenía TRP1 como un marcador de selección, y se seleccionó para prototrofia-Trp a 37ºC. Como el crecimiento de los transformantes fue refractario a 37ºC, se realizó trabajo adicional a temperaturas de 36,5 ó 35ºC, que no son permisivas para sec1-1. El DNA aislado (Kerännen, 1986) de cuatro transformantes de levadura que mostraron co-segregación del fenotipo Trp+ y crecimiento a 36,5ºC se transfirió a E. coli (Hanahan, 1983). El DNA plásmido aislado de transformantes de E. coli se usó para retansformar la cepa sec1-1 de S. cerevisiae.

Se obtuvo transformación eficaz del crecimiento a 36,5ºC. El análisis de enzimas de restricción de los plásmidos indicó que se recuperaron dos diferentes secuencias de la biblioteca de cDNA usada. El DNA inserto de los dos diferentes clones, 1 y 7, se secuenció utilizando el método didesoxi de doble hebra (Zagursky et al., 1986) y subclones convenientes construidos con métodos de DNA recombinante estándar (Maniatis et al., 1982) o prímeros específicos. Los dos clones contenían un marco de lectura abierta de 870 nucleótidos (clon 1) y 885 nucleótidos (clon 7), respectivamente. Como las secuencias de aminoácidos deducidas no representaban la de la proteína Sec1 (Aalto et al., 1991) los nuevos genes se denominaron SSO1 y SSO2 (Supresor de Sec1 One). Las secuencias que codifican SSO1 y SSO2 y las secuencias de aminoácidos deducidas se dan en SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente. Los plásmidos que soportan los genes SSO1 y SSO2 se denominaron YEpSSO1 y YEpSSO2, respectivamente y se muestran en las Fig., 1A y 1B.

Ejemplo 2 Sobreexpresión de la proteína Sso2 en levadura transformada con YepSSO2

La cepa de levadura sf750-14D transformada con el plásmido control pMA56 (A) (Ammerer, 1983) o con YEpSSO2 (B) se desarrollaron en un medio completo sintético (Sherman etal. 1983) carente de Trp. Los lisatos de células de levadura se prepararon en presencia de SDS como describió Keränen (1986). Diez \mug de proteína de levadura total presente en los lisatos se separaron por SDS-PAGE y se analizaron por Western blotting utilizando anticuerpos policlonales hechos en conejo contra la proteína Sso2 e IgG anticonejo de cabra conjugada con fosfatasa alcalina para la detección. Como se muestra en la Fig. 2, se ve cantidad grandemente incrementada de proteína Sso2 en el transformante YEpSSO2.

Ejemplo 3 Producción mejorada de proteína heteróloga secretada, \alpha-amilasa de Bacillus en cepa de levadura sf750-14D que sobreexpresa SSO1 o SSO2

La cepa sf750-14D\alpha que alberga gen SSO1 o SSO2 en los plásmidos multicopia YEpSSO1 o YEpSSO2, respectivamente, se transformó con un plásmido multicopia YEp\alphaa5 que contiene gen de \alpha-amilasa de Bacillus ligado entre el promotor y el terminador ADH1 (Ruohonen et al., 1987), modificado para expresión más eficaz borrando las secuencias inhibitorias predichas 5' al elemento promotor (Ruohonen et al., 1991; Ruohonen et al., manuscrito en preparación, a). Las cepas de levadura obtenidas que contienen YEpSSO1 y YEp\alphaa5 (VTT-C-92072) o YEpSSO2 e YEp\alphaa5 (VTT-C-92073) se desarrollaron en medio selectivo a 24ºC y la secreción de \alpha-amilasa al medio de cultivo se controló midiendo la actividad de \alpha-amilasa utilizando el ensayo de amilasa Phadebas (Pharmacia Diagnostics AB, Suecia). Estas cepas (VTT-C-92072) y (VTT-C-92073) se depositaron en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM) el 30 de septiembre de 1992 con los números de entrada DSM 7253 y 7254, respectivamente. Como se ve en la Fig. 3, se obtuvo actividad de \alpha-amilasa aumentada en cepas que llevaban SSO1
( ) o SSO2 ( ) sobre el plásmido multicopia en comparación con la cepa control no transformada ( ). La segregación de YEpSSO1 (\Delta) o YEpSSO2 ( ) de los transformantes redujo la secreción de amilasa al nivel de control demostrando que la secreción aumentada es debida a la presencia de plásmidos que contienen gen SSO en los transformantes. La cantidad aumentada de proteína de \alpha-amilasa en el medio de cultivo se detectó por Western blotting (Fig. 4). Los símbolos son como para la Fig. 3, S = estándar (\alpha-amilasa de Bacillus).

Ejemplo 4 Producción mejorada de proteína extraña secretada, \alpha-amilasa de Bacillus y una proteína endógena, invertasa en cepa de levadura DBY746 que sobreexpresa SSO2

La cepa DBY746 de S. cerevisiae. (\alpha his3 1 leu2-3 leu2-112 ura3-52 trp1-289 cgh^{R}) obtenida de David Botstein, Departamento de Biología, Massachussets Institute of Tecnology, Cambridge, MA) que alberga el plásmido YEp\alphaa6 que contiene gen de \alpha-amilasa de Bacillus ligado entre el promotor y el terminador ADH1 (Ruohonen et al.,1987) modificado para expresión más eficiente borrando las secuencias 5' inhibidoras predichas al elemento promotor (Ruohonen et al., 1991; Ruohonen et al.,manuscrito en preparación, a) se transformó con YEpSSO2 o con el plásmido control pMA56 (Ammerer, 1983). Los transformantes se desarrollaron en medio selectivo a 30ºC y la secrección de \alpha-amilasa al medio de cultivo se controló midiendo la actividad de \alpha-amilasa utilizando el ensayo de amilasa de Phadebas (Pharmacia Diagnostics AB, Suecia). Como se muestra en la Fig. 5, la actividad de \alpha-amilasa aumentada se obtuvo en la cepa que soportaba SSO2 (\Delta) sobre el plásmido multicopia en comparación con la cepa control transformada con el plásmido control sin gen SSO (O).

No se observa diferencia en el crecimiento de levadura entre el transformante control ( ) y el transformante SSO2 ( ). La sobreexpresión de SSO1 incrementó la secreción de \alpha-amilasa de manera similar. La secreción de la proteína endógena, invertasa, aumentó también bajo estas condiciones medida en la fase de crecimiento última logarítmica a la primera fase de crecimiento estacionaria. La actividad de invertasa secretada en el transformante YEpSSO2 fue 1,4 veces la del transformante control que contenía pMA56. Como el efecto mejorador de la sobreexpresión SSO sobre la secreción de \alpha-amilasa es más pronunciado más tarde durante el crecimiento,también la secreción de invertasa debería mejorar en momentos de tiempo posteriores.

La separación de las secuencias inhibidoras predichas sobre el promotor ADH1 (véase más arriba) utilizado para expresión de SSO2 en YEpSSO2 da lugar a expresión prolongada de SSO2 y existencia prolongada de nivel incrementado de la proteína SSO2 y consecuentemente niveles finales aún más altos de la \alpha-amilasa de Bacillus secretada al medio. La expresión de SSO2 sobre un plásmido de copia única a partir de este promotor ADH1 modificado también da lugar a niveles incrementados de la proteína Sso2 y secreción mejorada de \alpha-amilasa.

Ejemplo 5 Producción aumentada de proteína extraña secretada, \alpha-amilasa de Bacillus en levadura que sobreexpresa SEC1 en combinación con niveles normales o incrementados de proteínas Sso funcionales

La cepa DBY746 de S. Cerevisiae que soporta el plásmido YEp\alphaa6 que contiene genes de \alpha-amilasa de Bacillus ligados entre el promotor y el terminador ADH1 (Ruohonen et al., 1987), modificado para expresión más eficaz borrando las secuencias inhibidoras predichas 5' al elemento promotor (Ruohonen et al., 1991; Ruohonen et al., manuscrito en preparación, a) se transformó con un plásmido multicopia YEpSEC1 que expresa el gen SEC1 o con el plásmido control YEp24H (Aalto et al., 1991; Ruohonen et al., manuscrito en preparación, b). Los transformantes se desarrollaron en un medio selectivo a 30ºC y la secreción de \alpha-amilasa al medio de cultivo se controló midiendo la actividad de \alpha-amilasa utilizando el ensayo de amilasa de Phadebas (Pharmacia Diagnostics AB, Suecia). Como se muestra en la Fig. 6, la actividad de \alpha-amilasa aumentada se obtuvo en las cepas que soportaban SEC1 sobre un plásmido multicopia ( ) en comparación con las cepas transformadas con el vector sin gen SEC1 (O). No se observa diferencia en el crecimiento entre los transformantes.

La sobreexpresión tanto de Sec1p como de Sso2p al mismo tiempo aumentó la secreción de \alpha-amilasa incluso más. Los plásmidos que expresan los genes SSO están disponibles en VTT, Biotechnical Laboratory, Espoo, Finlandia.

Ejemplo 6 Aislamiento de genes sso de Trichoderma por expresión en levadura y su expresión en Trichoderma

Un banco de genes de expresión en levadura preparado a partir de la cepa T. reesei QM9414 como se ha descrito (Buchert et al., FI Pat Appl. 922373) se transformó en la cepa S. Cerevisiae H458 (Aalto et al., 1993) (\alpha SUC2 ade2-1 can1-100 his3-11,5 leu2-3,112 trp1-1ura 3-1 sso1-\delta1::URA3 sso2-\delta2::leu2::GAL1:sso1,HIS3)) seleccionando Ura-prototrofia sobre un medio de galactosa. Los transformantes se transfirieron a un medio de glucosa y el plásmido se rescató de las colonias de crecimiento y se retransformó en la cepa mencionada más arriba para verificar la complementación. Se obtuvo un clon que muestra capacidad para rescatar el agotamiento de las proteínas Sso en el medio de glucosa y el correspondiente plásmido se denominó pMS51. La cepa S. Cerevisiae obtenida, que soporta el plásmido pMS51 se depositó en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM) el 5 de octubre de 1993 con el número de entrada DSM 8604. La copia cromosómica del gen se aísla de una biblioteca de cósmidos genómica (Mäntylä et al., 1992) utilizando el extremo 5' de los clones de cDNA como una sonda, preparada por PCR. El cósmido se aísla de los clones dando una señal, y los que corresponden al cDNA mencionado antes se transforman en una cepa T.reesei (Penttilä., et al., 1987) que produce moléculas de CBHI-Fab VTT-D-91418 (CBS 287,91) descritas en Nyyssönen et al., (Pat. Sol.). La producción de CBHI-Fab se estudia a partir del medio extracelular sobre medio Solca-floc (según Nyyssönen et al., Pat. Sol.)

Ejemplo 7 Aislamiento de genes sso fúngicos por hibridación heteróloga

El DNA genómico de las especie fúngicas Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Pichia stripitis, Aspergillus nidulans y Trichoderma reesei se aislaron, se sometieron a digestión con la enzima de restricción HindIII, se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se mancharon sobre un filtro de nylon. La hibridación de Southern del filtro se llevó a cabo a diferentes astringencias utilizando la región de codificación de genes SSO1 de levadura como una sonda. La hibridación en una mezcla que contenía 30% de formamida, 6xSSC, 10xDenhardt's, 0,5% de SDS, 100 \mug/ml de DNA de esperma de arenque y 10 \mug/ml de polyA a 35ºC y el lavado 2x30 minutos en 2xSSC, 0,1% de SDS a 42ºC reveló varias bandas de hibridación en DNA derivadas de Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Pichia stripitis, y Trichoderma reesei (Fig. 8). Cuando la hibridación se realizó en condiciones menos astringentes, se observó hibridación también con DNA de S. Pombe. Una biblioteca genómica de genes de T. reesei construida en el vector \lambdaEMBL3 (Frischauf et al., 1983) se hibridó por el procedimiento descrito antes. Los clones que daban señales de hibridación se purificaron y sus regiones de hibridación se representaron en mapas por digestiones e hibridaciones Southern de su DNA. Los tres clones \lambda de hibridación se designaron TSSOa, TSSOb y TSSPc. Estos clones se depositaron en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM) el 5 de octubre de 1993 con los números de entrada DSM 8601, DSM 8602 y DSM 8603, respectivamente.

Microorganismos depositados

Los microorganismos se depositaron conforme al Tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-3300, Braunschweig, Alemania.

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Cepa	Número de depósito	Fecha de depósito
Saccaharomyces cerevisiae VTT-C-92072	DSM 7253	30 septiembre 1992
que lleva el plásmido YEpSSO1
Saccaharomyces cerevisiae VTT-C-92072	DSM 7254	30 septiembre 1992
que lleva el plásmido YEpSSO2
Saccaharomyces cerevisiae H458 (VTT-C-93002)	DSM 8604	5 octubre 1993
que lleva el plásmido pMS51
Cepa de bacteriofago \lambda TSSOa (VTT-H-93001)	DSM 8601	5 octubre 1993
Cepa de bacteriofago \lambda TSSOb (VTT-H-93002)	DSM 8602	5 octubre 1993
Cepa de bacteriofago \lambda TSSOc (VTT-H-93003)	DSM 8603	5 octubre 1993

Referencias

Aalto, M.K., Keränen, S. and Ronne, H. 1992. A family of proteins involved in intracellular transport. Cell 68, 181-182.

Aalto, M.K., Ronne, H. and Keränen, S. 1993. Yeast syntaxins Ssolp and Sso2p belong to a family of membrane proteins that function in vesicular transport. EMBO J. 12, (in press).

Aalto, M.K., Ruohonen, L, Hosono, K. And Keränen, S. 1991. Cloning and sequencing of the yeast Saccharomyces cerevisiae SEC1 gene localized on chromosome VI. Yeast 7, 643-650.

Ammerer, G. 1983. Expression of genes in yeast using the ADC1 promotor. Methods Enzymol. 101, 192-201.

Baldari, C., Murray, J.A.H., Ghiara, P., Cesareni, G. and Galeotti, C.L. 1987. A novel peptide leader which allows efficient secretion of a fragment of human interleukin 1\beta in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J., 6, 229-234.

Becherer, K.A. and Jones, E.W., 1992. Role of the PEP12 gene product in vacuolar targetting in yeast. EMBL Data Bank 31, accession number M90395.

Bennett, M.K., Calakos, N. and Scheller, R.H. 1992. Syntaxin: A synaptic protein implicated in docking of synaptic vesieles at pre synaptic active zones. Science 257, 255-259.

Buchert, J., Penttilä, M., Siika-aho, M., Saloheimo, A., Ranua, M. and Viikari, L. 1992. Mannanaasientsyymit, niitä koodittavat geenit ja menetelmä näiden ëristämiseksi sekä menetelmä lignoselluloosapitoisen massan valkaisemiseksi (Mannanase enzymes, the encoding genes and method for their isolation, and a method for bleeching lignocellulose containing materials). FI Pat. Appl. 92 2373.

Buckholz, R.G. and Gleeson, M.A. 1991. Yeast systems for the commercial production of heterologous proteins. Bio/Technology 9, 1067-1072.

Dunn-Coleman, N., Bloebaum, P., Berka, R., Bodie, E., Robinson, N., Armstrong, G., Ward, M., Przetak, M., Carter, G., LaCost, R., Wilson, L., Kodama, K., Baliu, E., Bower, B., Lamsa, M. and Heinsohn, H. 1991. Commercial levels of chymosin production by Aspergillus. Bio/Technology 9: 976-981.

Fawell, E., Hook, S. and Armstrong, J., 1989. Nucleotide sequence of a gene encoding a YPT1-related protein from Schizosaccharomyces pombe. Nucl. Acid Res. 11, 4373.

Frischauf, A.-M., Lerach, H., Poutstka, A. and Murray, N., 1983. Lambda replacement vectors carrying polylinker sequences. J. Mol. Biol. 170, 827-842.

Gerst, F.E., Rodgers, L., Riggs, M. and Wigler, M. 1992. SNC1, a yeast homolog of the synaptic vesicle-associated membrane protein/synaptobrevin gene family: Genetic interactions with the RAS and CAP genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4338- 4342.

Greenberg, G., Shelness, G.S. and Blobel, G., 1989. A subunit of mammalian signal peptidase is homologous to yeast SEC11 protein. J. Biol. Chem. 264, 15762-15765.

Hallborn, J., Penttilä, M., Ojamo, H., Keränen, S. & Hahn-Hägerdal, B. 1990. Xylose utilization by recombinant yeasts. International Pat. Appl. WO 91/15588.

Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580.

Hardwick, K.G. and Pelham, H.R.B. 1992. SED5 encodes a 39 KD integral membrane protein required for vesiccular transpot between the ER and the Golgi complex. EMBL Data Bank 32, accession number X66980.

Harkki, A., Uusitalo, J., Bailey, M., Penttilä, M. & Knowles, J.K.C. 1989. A novel fungal expression system: secretion of active calf chymosin from the filamentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Technology 7: 596-603.

Haubruck, H., Prange, R., Vorgias, C. and Gallwitz, D. 1989. The ras-relatad mouse ypt1 protein can functionally replace the YTPI gene product in yeast. EMBO J. 8, 1427-1432.

Hirai, Y. Takebe, K., Takashina, M., Kobayashi, S. and Takeichi, M. 1992. Epimorphin: a mesenchymal protein essential for epithelial morphogenesis. Cell 69, 471-481.

Inoue, A., Obata, K. and Agakawa, K. 1992. Cloning and sequence analysis of cDNA for a neuronal cell membrane antigen, HPC-1. J. Biol. Chau. 267, 10613-10619.

Irani, M.H. and Kilgore, T.L 1988. High level expression in yeast. European patent application EP 0 284 044 A1.

Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K. and Kimura, A. 1983. Transformation of intact yeast cells with alkali cations. J. Bacteriol. 153, 163-168.

Jeenes, D., MacKenzie, D., Roberts, I. and Archer, D. 1991. Heterologous protein production by filamentous fungi. Bioteehnology and Genetic Engineering Reviews, vol. 9. Pp. 527-367.

Penttilä, M.E., Nevalainen, H., Rättö, M., Salminen, E. and Knowles, J.K.C. 1987. A versatile transformation system for the filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61, 155-164.

Protopopov, V., Govindan, B., Novick, P. and Gerst, J.E. 1993. Homologs of the synaptobrevin/VAMP family of synaptic vesicle proteins function on the late secretory pathway in S. cerevisiae. Cell 74, (in press).

Romanos, M.A., Scorer, CA. and Clare, J.J. 1992. Foreign gene expression in yeast: a Review. Yeast 8, 423-488.

Ruohonen, L., Hackman, P., Lehtovaara, P., Knowles, J.C.K. and Keränen, S. 1987. Efficient secretion of Bacillus amyloliquefaciens\alpha-amylase by its own signal peptide in Saccharomyces cerevisiae host cells. Gene 59, 161-170.

Ruohonen, L., Penttilä, M. and Keränen, S. 1991. Optimization of Bacillus\alpha-amylase production by Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7, 337-346.

Sakai, A. Shimizu, Y. and Hishinuma, F. 1988. Isolation and characterization of mutants which show an oversecretion phenotype in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 119, 499-506.

Schuster, J.R., Moyer, D.L., Lee, H., Dennis, A., Smith, B. and Merryweather, J.P. 1989. Yeast mutants conferring resistance to toxic effects of cloned human insulin-like growth factor I. Gene 83, 47-55.

Segev, N., Mulholland, J. and Botstein, D., 1988. The ycast GTP-binding YTP1-protein and a mammalian counterpart are associated with the secretion machinery. Cell 52, 915-924.

Sikorski, R.S. and Hieter, P. 1989. A system of shuttle vectors and yeast post strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 122, 19-27.

Sleep, D., Belfield, G.P., Ballance, D.J., Steven, J., Jones, S. Evans, L.R., Moir, P.D. and Goodey, A.R. 1991. Saccharomyces cerevisiae strains that overexpress heterologous proteins. Bio/Technology 9, 183-187.

Smith, R.A., Duncan, M.J. and Moir, D.T. 1985. Heterologous protein secretion from yeast. Science 229, 1219-1224.

Suzuki, K., Ichikawa, K. and Jigami, Y. 1989. Yeast mutants with enhanced ability to, secrete human lysozyme: Isolation and identification of a protease-deficient mutant. Mol. Gen. Genet. 219, 58-64.

Vanoni, M., Porro, D., Martegani, E. and Alberghina, L. 1989. Secretion of Escherichia coli\beta-galactosidase in Saccharomyces cerevisiae using the signal sequence from the glucoamylase-encoding STA2 gene. Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 1331-1338.

Ward, M., Wilson, L.J., Kodama, K.H., Rey, M.W. and Berka, R.M. 1990. Improved production of calf chymosin in Aspergillus by expression 'as a glucoamylase-chymosin fusion. Bio/Technology 8, 435-440.

Wilson, D.W., Wilcox, C.A., Flynn, G.C., Chen, E., Unang, W-J., Henzel, W.J., Block, M.R., Ullrich, A. and Rothman, J.E., 1989. A fusion protein required for vehicle-mediated transport in both mammalian celas and yeasts. Nature 339, 355-359.

Zagursky, R.J., Berman, M.L., Baumeister, K. and Lomax, N. 1986. Rapid and easy sequencing of large linear double stranded DNA and supercoiled plasmid DNA. Gene Anal. Techn. 2, 89-94.

Zaraoui, A., Touchot, N., Chardin, P. and Tavitian, A. 1989.The human Rab genes encode family or GTP-binding proteins related to yeast YTP1 and SEC4 products involved in secretion. J. Biol. Chem. 264, 12394-12401.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Valtion

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: Vuori

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(C)

CIUDAD: Espoo

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: Finland

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): FIN-02150

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Producción incrementada de proteínas secretadas por células eucariotas recombinantes.

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible PC

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: FI 92 4494

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DEL ARCHIVO: 06-oct-1992

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 870 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a Mrna

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: X

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..870

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 290 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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3

4

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\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 885 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucléico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CEPA: X2180-1B

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..885

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

LONGITUD: 295 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

Claims (24)

1. Una secuencia de DNA aislada de un gen SSO supresor de sec1, seleccionado de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y sus homólogos fúngicos, cuya secuencia de DNA, cuando se sobreexpresa en células eucarióticas, hace a dichas células capaces de producir cantidades aumentadas de proteínas secretadas.

2. Una secuencia de DNA conforme a la reivindicación 1, en que la secuencia se deriva de un hongo, y cuando se sobreexpresa en un hospedante fúngico, hace a dicho hospedante capaz de producir cantidades incrementadas de proteínas secretadas.

3. Una secuencia de DNA conforme a la reivindicación 1 ó 2, seleccionada de secuencias SSO1 y SSO2 que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos dada en SEQ. ID Nº. 2 y SEQ. ID Nº. 4, respectivamente, o un fragmento funcional suyo que cuando se sobreexpresa en células eucarióticas o fúngicas hace a esas células capaces de producir cantidades incrementadas de proteínas secretadas.

4. Un vector que comprende una secuencia de DNA conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un vector conforme a la reivindicación 4, en que dicho vector es capaz de replicarse autónomamente en células eucarióticas cuando está transformado.

6. Un vector conforme a la reivindicación 4, cuyo vector es capaz de integrarse en el cromosoma en células eucarióticas cuando está transformado.

7. Un vector conforme a la reivindicación 4, que es un vector de expresión de levadura en que esa secuencia de DNA se expresa bajo regiones reguladoras de los genes de levadura.

8. Un vector conforme a la reivindicación 7, en que dichas regiones reguladoras de genes de levadura se seleccionan del grupo que comprende las regiones promotoras del gen SSO1, gen SSO2, gen SEC1, genes GAL1-GAL10, gen ADH1 de alcohol-deshidrogenasa, gen de asparagina-sintetasa, y sus partes funcionales.

9. Un vector conforme a la reivindicación 4, que es un vector de expresión de hongo filamentoso en que dicha secuencia de DNA se expresa bajo regiones reguladoras funcionales en hongos filamentosos.

10. Un vector conforme a la reivindicación 9, en que dichas regiones reguladoras funcionales en hongos filamentosos se seleccionan del grupo que comprende las regiones promotoras de los genes sso, cbhl, cbh2, egl1, egl2, tef1, pgk, pki, de glucoamilasa, \alpha-amilasa y alcohol-deshidrogenasa.

11. Un vector conforme a la reivindicación 4, que es un vector fúngico seleccionado del grupo que comprende YEpSSO1 y YEpSSO2 depositados en DSM 7253 y DSM 7254, respectivamente.

12. Células eucarióticas recombinantes que contienen una secuencia de DNA conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y que expresan niveles aumentados de proteína(s) Sso.

13. Células eucarióticas recombinantes conforme a la reivindicación 12, que son células fúngicas que pertenecen a una especie seleccionada del grupo que comprende Saccharomyces spp., Trichoderma spp., Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe, Pichia spp., Hansenula spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp. y Neurospora spp.

14. Células eucarióticas recombinantes conforme a la reivindicación 13, que son células fúngicas que pertenecen a una especie seleccionada de Saccharomyces y Trichoderma.

15. Células eucarióticas recombinantes conforme a la reivindicación 14, que son células fúngicas de la cepa VTT-C-92072 de Saccharomyces cerevisiae que tiene el número de entrada de depósito DSM 7253.

16. Células eucarióticas recombinantes conforme a la reivindicación 14, que son células fúngicas de la cepa VTT-C-92073 de Saccharomyces cerevisiae que tiene el número de entrada de depósito DSM 7254.

17. Un método para construir nuevas células eucarióticas capaces de expresar niveles aumentados de proteínas Sso, cuyo método comprende:

(a)

aislar secuencia(s) de DNA seleccionadas de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y sus homólogos, que codifican proteína(s) Sso, a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que contiene al menos una de dichas secuencias; y

(c)

transformar al menos uno de los vectores obtenidos en células hospedantes convenientes.

18. Un método conforme a la reivindicación 17, en que el hospedante a transformar se selecciona del grupo que comprende Saccharomyces spp., Trichoderma spp., Kluyveromyces spp., Schizosaccharomyces pombe, Pichia spp., Hansenula spp., Yarrowia spp., Aspergillus spp. y Neurospora spp.

19. Un método conforme a la reivindicación 18, en que dicho hospedante pertenece a una especie seleccionada de Saccharomyces y Trichoderma.

20. Un procedimiento para producir cantidades incrementadas de proteínas endógenas o extrañas secretadas, por sobreexpresión de los genes SSO, cuyo procedimiento comprende:

(a)

aislar secuencia(s) de DNA que codifican dicha proteína(s) a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que lleva al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante conveniente que comprende secuencias de DNA seleccionadas de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y sus homólogos y expresar niveles aumentados de proteína(s) Sso, para obtener células hospedantes recombinantes; o, alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con secuencias de DNA seleccionadas de SSO1 y SSO2 representadas en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y sus homólogos, y seleccionar células con producción aumentada de dicha(s) proteína(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) proteína(s).

21. Un procedimiento para producir cantidades incrementadas de proteína(s) endógena(s) o extraña(s) secretada(s), por sobreexpresión de gen(es) que interactúan con el gen SSO que tiene secuencias de DNA seleccionadas de SSO1 y SSO2 representadas en SEQ. ID. No: 1 y SEQ.ID NO: 3, respectivamente, y sus homólogos, por ejemplo, SEC1, en presencia de cantidades normales o incrementadas de la(s) proteína(s) Sso, cuyo procedimiento comprende:

(a)

aislar la(s) secuencia(s) de DNA que codifican dicha(s) proteína(s) a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que lleva al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante conveniente que expresa niveles normales o aumentados de proteína(s) Sso y sobreexpresar otro(s) gen(es) que interactúan con el gen SSO, por ejemplo SEC1, para obtener células hospedantes recombinantes; o, alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con SSO o un gen homólogo de SSO y por los genes que interactúan con el gen SSO, por ejemplo SEC1 y seleccionar las células con producción aumentada de dicha(s) proteína(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) proteína(s).

22. Un procedimiento para aumentar la producción de una proteína secretada endógena, que comprende:

(a)

transformar células que producen dicha proteína con secuencia(s) de DNA seleccionada(s) de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ. ID. No: 1 y SEQ.ID NO: 3 , respectivamente, y sus homólogos, solos o junto con genes que interactúan con dicho gen SSO, como SEC1,

(b)

seleccionar transformantes que producen un nivel aumentado de dicha proteína obteniendo así células recombinantes para producción aumentada de proteína, y

(c)

cultivar dichas células recombinantes en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína.

23. Un procedimiento para producción eficaz de biomasa sobre un material crudo o hidrólisis eficaz de un material crudo, cuyo procedimiento comprende:

(a)

aislar secuencia(s) de DNA que codifican enzima(s) hidrolítica(s) a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector fúngico que contiene al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante fúngico conveniente que comprende secuencia(s) de DNA seleccionada(s) de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ. ID. No: 1 y SEQ.ID NO: 3 , respectivamente, y sus homólogos, y que expresa niveles aumentados de proteína(s) Sso, para obtener células hospedantes recombinantes, o, alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con secuencia(s) de DNA seleccionada(s) de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ. ID. No: 1 y SEQ.ID NO: 3 , respectivamente, y sus homólogos, y seleccionar células con producción aumentada de dicha enzima(s); y

(d)

cultivar dichas células recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) enzima(s) hidrolítica(s).

24. Un procedimiento para la producción eficaz de biomasa sobre un material crudo o eficaz hidrólisis de un material crudo, por sobreexpresión de genes que interactúan con el gen SSO que tiene secuencias de DNA seleccionadas de secuencias SSO1 y SSO2 representadas en SEQ. ID. No: 1 y SEQ.ID NO: 3 , respectivamente, y sus homólogos, por ejemplo SEC1, en presencia de cantidades normales o incrementadas de la(s) proteína(s) Sso cuyo procedimiento comprende:

(a)

aislar la(s) secuencia(s) de DNA que codifican enzima(s) hidrolítica(s) extraña(s) o endógena(s), a partir de un organismo donador conveniente;

(b)

construir un vector que contiene al menos una de dichas secuencias de DNA;

(c)

transformar el vector obtenido en un hospedante conveniente que expresa niveles aumentados de proteínas que interaccionan con la(s) proteína(s) Sso en la presencia de cantidades normales o incrementadas de la(s) proteína(s) Sso para obtener células hospedantes recombinantes, o, alternativamente, transformar el vector en un hospedante conveniente y retransformar este transformante con gen SSO o un gen homólogo de SSO y con los genes que interactúan con gen SSO, como SEC1, y seleccionar células con producción aumentada de dicha(s) enzima(s); y

(d)

cultivar dichas células hospedantes recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha(s) enzima(s) hidrolítica(s).