KR20090027536A - 효모에서 재조합단백질을 고효율로 분비발현시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효모를 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서 목적 단백질 코돈 및/또는 분비 시그널 코돈을 최적화하여 목적 단백질의 발현분비율을 증가시키는 기술로서, 전문화된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 기존의 희귀 코돈(rare codon)을 개별적으로 바꾸는 방법에서 오는 시행착오를 미연에 방지할 수 있는 방법을 제공한다. 아울러 종래의 기술에서는 목적 단백질 코돈만을 최적화 하던 것을 분비 시그널 코돈의 최적화를 통하여 목적 단백질의 발현분비율을 향상시키는 방법을 제공한다.
효모, 코돈 최적화법, 재조합 단백질
Description
본 발명은 효모를 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어서, 효모 내 발현분비 시스템 분비시그널의 코돈을 최적화함으로써 재조합 단백질의 생산량을 증대시키는 방법에 관한 기술이다.
재조합 단백질 생산에 있어서 효모를 이용한 단백질 발현분비 시스템은 여러 가지 장점을 가진다(Romanos 등, 1992). 효모는 단세포 진핵생물(unicellular eukaryote)로서 저렴한 비용으로 손쉽게 대량 배양이 가능하고 대장균과 같은 원핵세포 발현 (prokaryotic expression) 시스템과는 달리 글리코실레이션(glycosylation) 등 번역후 변형(post-translational modification) 이 가능하여 특히 진핵세포 유래의 단백질 생산에 적합하다. 또한 대장균 등의 발현시스템과는 달리 거의 대부분의 경우 수용성 발현(soluble expression)이 가능하여 봉입체(inclusion body)를 형성하지 않으며 단백질 분비경로가 잘 발달하여 추 후 공정(down stream processing)이 복잡하지 않으므로 산업상 이용가치가 많다.
특히 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 안전성이 입증된 GRAS(Generally Regarded as Safe) 생물체로서 추가적인 장점을 제공하고 있다. 사카로마이세스 세레비지에는 오랜 연구의 역사로 인하여 전통적 유전학 기법이 매우 잘 발달되어 있어 유전적 조작이 용이하며 최근에는 지놈 염기서열 분석(genome sequencing)도 완료되어 마이크로어레이(microarray) 분석 등의 최신기법을 사용한 연구가 가능하므로 재조합 단백질 발현에 가장 많이 사용되는 생체 발현시스템 중 하나이다.
한편 최근 각광을 받고 있는 메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 특히 매우 강력하며 메탄올로 유도발현이 가능한 AOX 프로모터를 이용하여 리터 당 십수 그람의 재조합 단백질을 성공적으로 발현한 사례가 있을 정도로 생산성이 우수한 생체 발현시스템이다. 또한 피키아 파스토리스는 값싼 배지를 사용하여 손쉽게 고농도 세포배양이 가능하고 평상시 분비되는 단백질의 양이 매우 적으며 특히 하이퍼-글리코실레이션(hyper-glycosylation) 문제도 다른 효모와 비교하여 커다란 문제가 되지 않는 등의 다양한 장점이 있어 재조합 단백질 생산 분야에 있어서 그 이용 가능성이 상당히 높다.
최근에는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파 스토리스(Pichia pastoris) 뿐만 아니라 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 악셀라 아데니니보란스(Arxula adeninivorans) 등 다양한 효모 발현시스템도 개발되고 있다(Romanos 등, 1992). 이러한 여러 효모 발현 시스템들은 특히 전술한 바와 같이 대장균에 비해 목표 단백질의 분비 발현에 용이한 장점을 제공한다.
다양한 효모 발현 시스템에서 목표 단백질의 분비시그널로서는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 교배인자 알파 프리프로 리더(mating factor α prepro leader, MFα ppL)를 분비 시그널로서 가장 많이 사용하고 있다(Romanos 등, 1992; Hitzeman R. A. 등, 1990). 분비 시그널은 합성된 단백질이 합성된 장소에서 밖으로 분비되도록 자극을 주는 체계이며, 생물종 및 단백질의 종류에 따라 그 종류가 다양하다. 이러한 기능적 특성으로 인하여 단백질 분비 시그널은 재조합 단백질 생산에 있어서 최종적으로 수획되는 단백질 양을 증대시키는데 중요한 역할을 하지만, 지금까지는 재조합 단백질의 수율 증대를 위해서는 단백질 발현 부위 자체를 변형시키는 기술이 주를 이룬 반면, 단백질 분비를 향상시키는 방법에 관한 기술개발은 미미한 실정이었다. 다만, 최근 MFα ppL의 야생형 아미노산 서열에 아미노산 서열을 추가하거나 변경하고 이를 코돈 최적화한 몇몇 사례가 보고 되고 있다. 즉, 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 및 페니오포라 리시(Peniophora lycii) 유래 파이타제 유전자를 피키아 파스토리스에서 분비, 발현시키는 연구에서 목표유전자인 파이타제 유전자를 코돈 최적화하고 MFα ppL의 아미노산 서열이 변형된 분비 시그널(야생형 MFα ppL의 메티오닌 코돈 다음에 추가로 3개 코돈이 삽입됨)을 코돈 최적화한 경우 분비발현율이 증가됨을 보였다(Xiong A.-S. 등, 2005; Xiong A.-S. 등, 2006).
한편, 모든 생물체는 단백질을 코딩하는 코돈을 골고루 사용하지 않고 편중되게 사용하는 경향이 있다. 따라서 단백질 코딩에 주로 사용되는 코돈인 선호코돈(preferred codon)이 존재하는 코돈치우침(codon bias) 현상이 있고, 이로 인하여 만약 희귀코돈(rare codon)을 사용하게 되면 번역과정(translation)이 저해되어 단백질 생산이 감소하는 것으로 알려지고 있다. 즉, 대장균의 경우 단지 2개의 연속적인 희귀코돈의 사용도 번역을 심각하게 저해하는 것으로 보고 되었다 (She P. 등, 2006). 따라서 재조합 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 다양한 방법 중 하나로 코돈 최적화(codon optimization) 방법을 사용할 수 있다. 즉, 목표 유전자를 숙주세포의 코돈 사용법(codon usage)에 맞도록 코돈 최적화를 함으로써 번역의 효율을 높일 수 있는 것으로 알려져 있다(Yadava A. 등, 2003).
현재까지 알려진 많은 사례의 경우 분비, 발현시키고자 하는 목표유전자 자체는 코돈 최적화하는 반면 분비 시그널은 코돈 최적화하지 않는 경우가 대부분이다 (Demolder J. 등, 1992). 상품화되어 있는 효모 발현벡터들, 예를 들어 피키아 파스토리스 분비 발현 벡터인 pPIC6α, pGAPZα (Invitrogen, Carlsbad, 미국) 등의 경우에도 MFα ppL 서열은 코돈 최적화되지 않은 상태이며 대부분 연구에서 상품화된 발현 키트를 근간으로 사용하는 경우가 많다. 최근 보고된 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래의 리파제 lip1 유전자를 피키아 파스토리스 균주에서 MFαppL 서열을 이용하여 분비시키는 연구에서도 목표단백질인 lip1 단백질 아미노 말단 부분의 일부분만 코돈 최적화하여도 분비 효율이 증가한다는 보고를 하고 있지만 분비 시그널 MFα ppL 서열은 코돈 최적화하지 않은 상태로 사용하고 있다(Chang S.-W. 등, 2006).
이에 본 발명자들은 효모 분비 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 고효율 분비 발현을 연구하던 중, 코돈 최적화가 전반적인 발현효율을 증가시킴은 물론 온도에 따른 발현의 안정성에도 매우 중요함을 알게 되었다. 특히 효모에서 가장 많이 사용하는 MFα ppL 분비 시그널 및 본 발명자의 이전 연구(대한민국 등록특허 제626753호)에 따른 신규한 TEF 3 분비 시그널 코돈을 최적화하여 목표 단백질 발현 시스템을 실시한 결과, 발현 코돈 최적화만을 실시한 그룹에서보다 효율이 더 높음을 확인하였다.
이를 통해, 목표유전자의 코돈 최적화보다 분비 시그널의 코돈 최적화가 목표 단백질의 분비효율에 더욱 중요하며, 분비 시그널의 아미노산 서열의 추가 삽입 등의 변형보다 코돈 최적화가 더욱 중요함을 알 수 있었다. 이에 따라 효모에서 재 조합 단백질의 생산 효율을 높이는 방법을 확립하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 효모를 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어서 분비 시그널의 코돈을 최적화함으로써 재조합 단백질의 생산수율을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 효모 내의 코돈들을 최적화하여 재조합 단백질을 발현 분비하게 함으로써, 최적화하지 않은 코돈을 사용하였을 때에 비해 재조합 단백질 생산량이 현저히 증대됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 구체적인 양태로서 효모 균주 내 코돈 최적화를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 시스템을 제공한다. 바람직하게, 상기 "코돈 최적화"는 단백질 분비 시그널에 관여하는 유전자 염기서열의 코돈 최적화이며, 더욱 바람직하게는 분비 시그널 및 재조합 목적 단백질을 코딩하는 유전자 염기서열의 코돈 최적화를 포함한다.
본 발명에서 "효모"라 함은 단세포 진핵생물의 일종으로서, 원핵생물인 대장 균과 함께 재조합 단백질의 생산에 주로 사용되는 생물을 말한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 종래에 축적된 연구를 통해 안전성이 입증된 GRAS(Generally Regarded as Safe)생물체로서 일반적으로 가장 많이 사용되는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 최근 각광을 받고 있는 메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용하였으나, 본 발명에 따르는 효모는 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서, "코돈 최적화(Codon Optimization)"란 단백질을 코딩하는 부위의 아미노산 코돈 중에서 편중되어 사용되는 코돈(prefered codon)을 부각시키고 희귀코돈(rare codom)을 변형시켜 단백질의 생산을 증진시키는 방법을 말한다. 이러한 코돈 최적화는 희귀코돈을 개별적으로 바꾸는 방법도 있으나, 이경우 어떤 코돈이 발현에 어떠한 영향을 끼칠지를 가늠할 수 없으므로 많은 시행착오가 예상된다. 따라서 근래에는 전문화된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 효율적인 작업을 수행할 수 있으며, 본 연구자들도 실시예 4에서와 같이 '이볼빙코드(EvolvingCode)' 프로그램을 사용하여 코돈 최적화를 수행하였다. 구체적으로는, 컴퓨터 프로그램에 의해 전체 유전자의 범위에서 분비 시그널인 MF α ppL 및 TFP 3와 목표단백질인 CalB 및 이의 개량 변이체인 CalB14의 코돈들을 최적화하고, 최적화된 코돈에 따라 유전자를 합성하였다. 우선 Zhao X. 등의 문헌에 준하여 사카로마이세스 및 피키아 파스토리스 균주에서 가장 선호되는 코돈을 선택하고 전체 유전자의 구아닌-시토신 함량비(GC content)가 50% 내외가 되도록 정한후 컴퓨터 프로그램이 임의로 정한 코돈을 사용하였다(서열번호 3, 6, 9, 12). 확보된 염기서열을 토대로 중합효소반응(PCR)을 이용하여 유전자를 합성하고 이들을 상기에 언급한 발현 벡터에 삽입하여 각각의 코돈이 최적화된 벡터를 제조하였다.
분비 시그널은 리포좀에서 합성된 단백질이 소포체, 골지체 나아가 세포 밖으로 분비되도록 하는 작용을 하는 체계를 말하며 각 생물종들 및 발현하는 단백질에 따라 그 종류 또한 다양하다. 본 발명에서는 효모 사카로마이세스 세레비지에의 경우 가장 널리 사용되고 있는 교배인자 알파 프리프로 리더(mating factor α prepro leader, MFα ppL)를 분비 시그널로서 사용하였고, 피키아 파스토리스의 경우에는 상기 MFα ppL과 함께 전술한 바와 같이, 본 발명자들이 최근 개발한 번역 융합 파트너 3(Translational fusion partner 3, TFP 3)(대한민국 등록특허 제626753호)을 각각 사용하여 이들 분비 시그널에 대한 유전자의 염기서열을 코돈 최적화함으로써 효모에서의 재조합 단백질의 생산 및 분비 효율을 비교하였다.
한편, 사카로마이세스 세레비지에 및 피키아 파스토리스 균주를 사용하여 재조합 단백질을 생산함에 있어서, 분비발현의 리포터 유전자로는 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래의 리파제 B 단백질인 CalB 및 이의 변이체를 사용하였다.
"CalB"는 20℃ 이하의 저온조건에서만 단백질의 접힘(folding)이나 퇴화(degradation) 현상이 없이 정상적인 단백질이 생성되는 특성을 가지고 있어 대량 생산에 어려움을 가지고 있는 단백질의 일종이다. CalB 단백질을 재조합 생산시 효모의 생육 적정온도인 30℃에서 배양하게 되면 단백질의 접힘(folding)이나 퇴화(degradation) 현상 등으로 인해 전체적인 생산성이 감소하게 된다. 따라서 20℃ 이하의 저온에서 배양하기 위해서는, 저온유지를 위한 에너지원 유지비용 및 저온배양으로 인한 효모 생장 속도의 감소로 전체적인 생산성의 저해를 초래할 수 있었다. 이러한 문제점을 코돈 최적화를 통해 해결함으로써, 통상의 발효배양 온도인 30℃에서도 Cal B를 안정적으로 발현할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 피키아 파스토리스에서 CalB 발현을 위해 분비 시그널로서 사카로마이세스 세레비지에 균주 유래이지만 피키아 파스토리스 균주에서도 가장 많이 사용되는 MF α ppL 및 본 발명자들의 선행 등록특허(대한민국등록특허 제10-626753호)에 개시된 단백질 융합인자 TFP 3(Translation fusion partner 3)를 각각 사용하여 이들을 코돈 최적화한 후, 상용화된 발현벡터 pPIC9(Invitrogen사)를 변형한 벡터에 상기 코돈 최적화된 분비 시그널 및 재조합 단백질의 유전자 서열을 삽입하여 (도 2) CalB 단백질의 생산 및 분비를 확인하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 또한 CalB의 변이 개량체로서 본원 발명자의 선행 등록특허 제10-0529254호에 개시된 CalB14 단백질을 코딩하는 염기서열을 코돈 최적화하여 이를 발현 분비 벡터인 YEGα-HIR525 벡터에 (Choi E.S. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 587-594)에 삽입하여 도 1과 같은 pYGMFα-CalB14 벡터를 제작하였다. 상기 YEGα-HIR525 벡터는 발현성 프로모터로서 유도성 프로모터(inducible promoter)인 GAL10 promoter (Mylin ML 등, 1990)를 포함하고 분비 시그널로는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 교배인자 알파 프리프로 리더(mating factor α prepro leader, MFα ppL)를 포함하는 발현분비 벡터이다. 상기 pYGMFα-CalB14 벡터를 사카로마이세스 세레비지에에 형질전환하여 배양한 후, 상기 벡터가 유입된 콜로니를 선별하여 선별된 콜로니를 배양 및 단백질 발현을 유도한 후, CalB14 단백질의 존재 및 활성을 웨스턴 블롯 및 p-NPP(p-nitrophenyl palmitate)라는 발색시약을 통해 확인하였다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 최적화된 발현 코돈과 최적화된 분비시그널 코돈을 동시에 포함한 벡터, 발현 코돈만을 최적화한 벡터, 분비 코돈만을 최적화한 코돈 등 세가지 경우에서 각각의 단백질 발현분비율을 야생형(wild type) 분비 시그널 및 발현 코돈을 포함하는 벡터의 발현율과 비교하였다. 그결과, 사카로마이세스 세레비지에 및 피키아 파스토리스 두 균주 모두에서 발현 및 분비 시그널 코돈을 함께 최적화한 벡터 그룹에서 발현분비율이 월등히 높았으며(표 2 및 3), 발현 코돈과 분비 시그널 코돈 중 어느 코돈의 최적화가 발현분비율 증가에 더많은 영향을 주는지 비교한 결과, 분비 시그널 코돈만 최적화된 그룹이 발현 코돈만 최적화된 그룹보다 약 5배 정도 높은 발현분비율 증가를 나타내었다(표 4). 또한 상 기 발현분비율의 증가가 특정 분비 시그널 즉, MF α ppL 분비시그널에만 국한되는지를 확인하기 위하여 본 발명자들이 개발한 TFP 3 코돈을 최적화하여 상기의 실시예 등과 같이 분비발현율을 비교하였다. 그결과, 표 5에서 보는바와 같이, TFP 3 시그널을 사용한 경우에도 MFα ppL의 경우와 마찬가지로 TFP 3를 코돈 최적화한 경우가 야생형 그룹에 비해 높은 발현분비율을 보임으로써, 코돈의 최적화로 인한 발현분비율의 증가는 특정 분비 시그널에 한정되지 않음을 확인하였다.
한편, 본 발명의 바람직한 실시예에서는, TEF 프로모터와 연결된 MF α ppL 분비 시그널 유전자의 염기서열을 돌연변이시켜 아미노산 서열이 변경되도록 한 발현 벡터를 구축하여 이들을 형질전환한 효모에서의 재조합 단백질의 생산, 분비 효과를 상기 분비 시그널을 코돈 최적화한 벡터에 의한 단백질 발현분비 효과와 비교하였다. 그결과, 아미노산 서열을 변경한 그룹들이 야생형 코돈을 가진 그룹보다 발현분비율이 높았으며, 아미노산 서열을 변경한 그룹 중에서도 코돈 최적화를 수행한 그룹이 그렇지 않은 그룹보다 발현분비율이 월등히 높음을 확인하였다(표 7).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 효모를 이용한 재조합 단백질의 생산에 있어, 분비 시그널의 코돈을 최적화함으로써 재조합 단백질의 발현 효율을 증가시키고 생산량을 증가시키는 우수한 재조합 효모 발현 시스템을 제공할 수 있다.
본 발명의 내용은 이하의 실시예를 통하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것에 불과하며 이로써 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예
1. 목표 단백질의 발현 및 활성 확인
재조합단백질 발현의 리포터 유전자로서 칸디다 안타티카(Candida antarctica) 유래 리파제 B(CalB) 야생형과 본 발명자들이 최근 특허 등록받은 CalB 개량체 CalB14를 사용하였다(한국등록특허 제10-0475133호).
발현된 리파제의 활성 측정은 발색시약인 p-nitrophenyl palmitate (pNPP)를 사용하였다. 10 μl의 10 mM pNPP, 40 μl의 에틸 알콜, 950 μl의 50mM pH 7.5 트리스 완충액이 조합된 반응액 1 ml에 적절히 희석된 20 μl의 효소용액을 넣고 10분간 반응 시킨후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 리파제 활성 1 unit는 1분당 1 μmole의 pNPP기를 유리시키는 효소의 활성으로 정의하였다.
실시예
2. 사카로마이세스
세레비지에
균주 발현 시스템 구축
리파제 CalB14을 효모를 이용하여 대량생산하기 위하여, 유전자 조작이 용이하고 대량 발효배양의 지식이 많이 축적되어 있으며 인체에 안전한 GRAS (Generally Regarded as Safe) 생물체로 알려져 있는 효모 사카로마이세스 세레비지에 발현시스템을 이용하여 최적의 효소 분비생산시스템을 구축하고자 하였다. 효모 사카로마이세스 세레비지에 균주에서의 CalB14 생산 연구를 위해서 도 1과 같은 발현 및 분비 벡터 pYGMFa-CalB14를 제작하였다. 발현 프로모터로는 유도성 프로모터(inducible promoter)인 GAL10 promoter (Mylin ML 등, 1990)를 이용하였고 분비 시그널로는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 교배인자 알파 프리프로 리더(mating factor α prepro leader, MFα ppL)을 이용하였다. 이들 구성요소를 가지고 있는 YEGα-HIR525 벡터에 (Choi E.S. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 587-594) Hitzeman 등의 방법 (Hitzeman RA 등, 1990)에 따라 5'-말단에 XbaI 부위를 부가한 서열번호 4 또는 6의 CalB14 성숙 구조유전자를 3‘-말단에 XbaI 부위가 부가되어 있는 MF α ppL 분비 시그널에 XbaI 절단 후 서로 연결하였다.
이렇게 구축한 pYGMFα-CalB14 벡터를 사카로마이세스 세레비지에 Y2805 wild-type (Ura-) 균주에 litium/acetate 방법을 이용하여 형질전환하였고, UD(Ura-, glucose 2%) plate에서 얻은 transformants를 YPDG(glucose 1%, galactose 1%)-tributyrin plate에 이쑤시개를 사용하여 옮기고 30℃에서 24시간 배양시킨 후, 활성환(halo)을 보인 콜로니를 선별하였다. CalB 유전자를 발현시키기 위하여 YPD 배지 3㎖에 상기 콜로니를 접종하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후, 250㎖ 배플드 플라스크(baffled flask)에 YPDG(glucose 1%, galactose 1%) 배지 25㎖에 O.D.600 값이 1이 되도록 접종하였다. 30℃와 22℃에서 각각 48시간 동안 배양하여 CalB 유전자의 발현을 유도하였다. 각각의 배양액으로부터 얻은 상등액을 SDS-PAGE (12% Tris-glycine gel) 분석과 CalB에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 (3% BSA 반응중지액, 1차 항체 : 5000배 희석된 CalB, 2차 항체 : 5000배 희석된 토끼 IgG) 분석을 하여 세포외로 분비된 약 45kDa의 분자량의 크기를 가진 CalB 단백질의 밴드를 확인한 후 리파제 활성을 측정하였다.
실시예
3.
피키아
파스토리스
균주 발현 시스템 구축
피키아 파스토리스 균주에서 리파제 CalB를 발현시키기 위해 본 발명자들이 최근 개발한 피키아 균주의 신규한 구성적 발현 프로모터(constitutive expression promoter)인 TEF 프로모터(한국등록특허 제10-0752107호)를 사용하였고, 발현된 단백질의 분비를 위해서는, 사카로마이세스 세레비지에 균주 유래이지만 피키아 파스토리스 균주에서도 가장 많이 사용되는 분비 유도 서열 MFα ppL 분비 서열(도 2 A) 또는 본 발명자들이 개발한 신규 분비 서열인 분비융합인자 TFP 3(translational fusion partner 3) (대한민국 등록특허 제10-626753호)(도 2B)를 사용하였다. 피키아 발현 벡터로 상용화되어있는 pPIC9 벡터 (Invitrogen 사)의 AOX promoter부분을 BglⅡ와 EcoRⅠ으로 절단하여 제거한 후 TEF 프로모터를 삽입 하여 치환하였고, EcoRⅠ과 NotⅠsite에 목표유전자 단편을 삽입할 수 있도록 피키아 TEF 프로모터 벡터를 구축하였으며, 이를 도 2에 도시하였다.
이렇게 구축한 2종의 발현 벡터인 pTEF-MFα-CalB14 및 pTEF-TFP3-CalB14의 His4 부분을 SalⅠ 효소로 절단한 후, 피키아 파스토리스 GS115(His-, Mut-) 균주에 리튬/아세테이트 방법을 이용하여 각각 형질전환하였다. HG(His-, glycerol) plate에서 얻은 상기 형질전환체(transformants)를 YPD(glucose 2%)-tributyrin plate에 이쑤시개를 사용하여 옮기고 30℃에서 24시간 배양시킨 후, 활성환(halo)을 보인 콜로니를 각각 선별하였다. CalB 유전자를 발현하기 위하여 YPD 배지 3㎖에 상기 콜로니를 접종하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후, 250㎖ 베플드 플라스크(baffled flask)에 YP 글리세롤 (glycerol 2%) 배지 25㎖에 O.D.600 값이 1이 되도록 접종하고 30℃와 22℃에서 각각 48시간 동안 배양하여 CalB 유전자의 발현을 유도하였다.
각각의 배양액으로부터 얻은 상등액을 SDS-PAGE (12% Tris-glycine gel) 분석과 CalB에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 (3% BSA 반응중지액, 1차 항체 : 5000배 희석된 CalB, 2차 항체 : 5000배 희석된 토끼 IgG) 분석을 하여 세포외로 분비된 약 45kDa의 분자량의 크기를 가진 CalB 단백질의 밴드를 확인한 후 리파제 활성을 측정하였다.
실시예
4. 코돈 최적화
코돈 최적화함에 있어서 희귀 코돈(rare codon)을 하나하나 바꾸는 방법도 있지만 어느 부위가 발현율에 영향을 미치는지는 수많은 시행착오를 거쳐야 하므로 좀 더 효율적인 방법으로서 컴퓨터 프로그램에 의하여 전체 유전자의 코돈을 최적화하고 최적화된 코돈에 따라 유전자를 합성하는 방법을 선택하였다. 효모 사카로마이세스 세레비지에 및 피키아 파스토리스에서 가장 선호되는 코돈은 Zhao X. 등의 문헌(Chinese J. Biotechnol. 16: 308-311 (2000)에 준하였고 전체 유전자의 구아닌-시토신 함량비(GC content)가 50% 내외가 되도록 조건을 정한 후 컴퓨터 프로그램이 임의대로 정한 코돈을 사용하였다. 따라서 가장 선호되는 코돈뿐만 아니라 두 번째로 선호되는 코돈도 부분적으로 사용되었다. MFα ppL 및 TFP 3 분비 시그널과 목표단백질 CalB 및 CalB14를 코딩하는 구조 유전자인 CalB 및 CalB14의 코돈을 최적화하였으며, ‘이볼빙코드(EvolvingCode)’ 프로그램을 사용한 결과 약 48.2%의 구아닌-시토신 함량비(GC content)를 갖는 최적화된 염기서열을 확보하였고, 코돈 최적화된 각각의 염기서열은 서열번호 3, 6, 9, 12와 같다(G. Wu 등, 2005). 이때 MFα ppL 분비시그널과 목표단백질을 연결하는 부위인 Xba I 인지부위의 4개 아미노산 서열 Leu_Asp-Lys-Arg은 코돈 최적화하지 않은 상태로 사용하였다. 확보된 염기서열을 토대로 ‘DNA works 2.4’ 프로그램을 사용하여 유전자를 합성하기 위한 프라이머를 각각 디자인하였으며, 총 반응액을 50㎕로 하여 PCR을 수행하였고, 반응조건은 표 1과 같다(C. Prodromou 등, 1992).
증폭단계 | 온도 | 시간 | 횟수 |
Denaturation | 94 ℃ | 5 min | 1 cycle |
Denaturation | 94 ℃ | 20 sec | 15 cycles |
Annealing | 55 ℃ | 20 sec | |
Denaturation | 94 ℃ | 20 sec | 25 cycles |
Annealing | 65 ℃ | 20 sec | |
Extension | 72 ℃ | 2 min | |
Extension | 72 ℃ | 10 min | 1 cycle |
이렇게 얻은 코돈 최적화된 유전자들을 실시예 2 및 3에서와 같은 코돈 최적화되지 않은 해당유전자의 발현 벡터에 삽입, 치환하여 각각 코돈 최적화된 유전자 발현 벡터를 제조하였다.
실시예
5 : 코돈 최적화에 의한
재조합단백질
분비발현 효율 및 안정성의 증진
코돈 최적화가 목표 단백질의 분비발현율에 어떠한 영향을 미치는지 알아 보기 위하여 먼저 야생형 (wild type) CalB 유전자를 실시예 3에서 제조된 형질전환체 및 실시예 4에서 제조된 피키아 파스토리스 균주에서 분비 발현시켰다. 표 2에 표시한 바와 같이 MFαppL 분비 시그널과 CalB 성숙 구조유전자 (mature structural gene)를 모두 코돈 최적화함으로써 이들을 코돈 최적화하지 않은 대조군에 비하여 22℃ 배양의 경우 약 15배, 30℃ 배양의 경우 약 80배의 높은 발현량의 증가를 보였다. 또한, 코돈 최적화하지 않은 경우는 22℃ 배양이 30℃ 배양보다 5배 정도 안정적인 발현율을 보였음과 달리 코돈 최적화한 경우에는 22℃와 30℃ 배양간의 발현율 차이를 보이지 않았다. 이로써, 코돈 최적화는 분비발현량의 증가뿐만 아니라 온도에 따른 발현 안정성에도 중요한 영향을 미친다는 매우 유용한 결과를 얻을 수 있었다. 이후의 실험에서는 30℃ 배양을 주로 하여 코돈 최적화의 영향을 조사하였다.
MFα(비최적화t)- CalB(비최적화t) | MFα(최적화)- CalB(최적화) | 비율 (최적화/비최적화) | |
22℃ 배양 시 | 55.1 | 821 | 14.9 |
30℃ 배양 시 | 10.3 | 815 | 79.2 |
비율(30℃/22℃) | 0.2 | 1.0 | - |
실시예
6 : 사카로마이세스
세레비지에
균주에서의 코돈 최적화 효과
코돈 최적화의 영향을 좀 더 자세히 알아 보기 위하여, 실시예 2에 기술한 바와 같이 숙주세포를 사카로마이세스 세레비지에로 바꾸어 사용하고 목표 유전자도 CalB 야생형의 개량체인 CalB14를 사용하여 코돈 최적화의 영향을 조사하였다. 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 CalB 야생형의 개량체 CalB14를 분비발현 시켰을 때 코돈 최적화의 영향을 표 3에 표시하였다.
MFα(비최적화)- CalB(비최적화) | MFα(최적화)- CalB(최적화) | 비율 (최적화/비최적화) | |
30℃ 배양 시 | 1,512 | 6,696 | 4.4 |
야생형 CalB에 비하여 단백질 생산성과 비활성이 모두 증가한 개량체 CalB14는 표 2의 야생형에 비하여 전반적으로 높은 활성을 보임을 알 수 있다. 그리고 MFα ppL 분비 시그널과 CalB14 성숙 구조유전자 (mature structural gene)를 모두 코돈 최적화한 경우 코돈 최적화 하지 않은 대조군에 비하여 약 4.4배의 발현량의 증가를 보였다. 따라서, 코돈 최적화는 재조합단백질 생산에 가장 많이 사용되는 숙주인 피키아 파스토리스 균주와 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 공히 유용함을 확인하였다.
실시예
7 : 분비 시그널 및 구조유전자 각각의 코돈 최적화 조합의 효과
목표단백질의 분비발현 시에 사용하는 분비 시그널과 목표단백질을 코딩하는 구조 유전자를 각각 코돈 최적화하고 조합발현함으로써, 어느 부분의 코돈 최적화가 중요한지 알아보는 실험을 수행하였다. 피키아 파스토리스 균주에서 개량체 CalB14를 분비발현시켰을 때 MFα ppL 분비 시그널의 코돈 최적화 유무와 구조 유전자 CalB14의 코돈 최적화 유무를 조합한 4가지 경우의 수에 대하여 발현율을 조사한 결과를 표 4에 나타내었다.
MFα(비최적화)- CalB14(비최적화) | MFα(최적화)- CalB14(비최적화) | MFα(비최적화)- CalB14(최적화) | MFα(최적화)- CalB14( 최적화) | |
30℃ 배양 시 | 1,429 | 7,560 | 1,706 | 11,443 |
비율 | 1.0 | 5.3 | 1.2 | 8.0 |
MFα ppL 분비 시그널과 CalB14 구조유전자 모두를 코돈 최적화한 경우가 MFα ppL 분비 시그널과 CalB14 구조유전자 모두를 코돈 최적화하지 않은 대조군보다 가장 높은 약 8배의 증가율을 보였다. 한편 MFα ppL 분비 시그널은 코돈 최적화하고 CalB14 구조유전자는 코돈 최적화하지 않은 경우에도 대조구 대비 약 5.3배의 상당히 높은 증가율을 보인 반면, MFα ppL 분비 시그널은 코돈 최적화하지 않고 CalB14 구조유전자는 코돈 최적화한 경우에는 대조구와 유사한 낮은 값을 보이는데 그쳤다. 따라서 효모에서 가장 많이 사용하는 분비 시그널 중 하나인 MFαppL 분비 시그널만 코돈 최적화하여도 그렇지 않은 경우보다 높은 분비발현율의 증가를 기대할 수 있는 분비발현 벡터로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예
8 : 다른 분비 시그널의 코돈 최적화의 효과
코돈 최적화의 영향이 MFα ppL 분비 시그널에 국한되는지 알아보기 위하여, 다른 분비 시그널로서 본 발명자들이 최근 개발한 TFP 3를 사용하여 CalB14를 피키아 파스토리스 균주에서 분비발현하여 코돈 최적화의 영향을 조사하였다.
표 5에 표시한 바와 같이, MFα ppL 분비 시그널 대신 TFP3 분비 시그널을 사용하였을 경우도 코돈 최적화한 경우가 대조구에 비하여 약 4.7배의 높은 발현량을 보임을 알 수 있었다. 따라서 코돈 최적화는 분비 시그널의 종류에 큰 상관없이 목표 단백질의 분비 발현율을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
TFP3(비최적화)- CalB(비최적화) | TFP3(최적화)- CalB(최적화) | |
30℃ 배양 | 3,726 | 17,496 |
비율 | 1.0 | 4.7 |
실시예
9 :
MF
α 아미노산 서열 변형과 코돈 최적화의 분비발현율 비교
전술한 바와 같이, 최근 보고된 문헌에 의하면 피키아 파스토리스 균주의 AOX (alcohol oxidase) 프로모터에 연결하여 MFα ppL 분비 시그널을 사용함에 있어서 AOX 구조유전자의 메티오닌 코돈 직후의 3개의 아미노산 코돈을 MFα ppL 분비 시그널 ORF의 아미노산 말단 메티오닌 코돈 다음에 추가로 삽입하면 분비효율이 증가한다고 알려졌다. 본 발명자들은 TEF 프로모터에 연결된 MFα ppL 분비 시그널을 사용하는 경우에도 같은 효과가 있는지 알아보기 위하여, TEF 구조유전자의 메티오닌 코돈 다음의 글라이신(Gly) (ggt), 및 글라이신-라이신(Gly-Lys) (ggtaag) 아미노산 서열을 각각 MFα ppL의 야생형 아미노산 서열의 메티오닌(Met) 코돈 뒤에 추가로 삽입하여 야생형과 비교하여 분비효율이 증가하는지 조사하였다.
먼저 글라이신(Gly) 코돈을 추가로 삽입하기 위하여 하기 표 6에 표시한 MFa(G)-F 및 MFa-R2 프라이머의 조합으로 증폭시킨 후, 실시예 3에서 제조한 pTEF-MFα-CalB14 벡터의 EcoRⅠ과 XbaⅠsite에 단편을 삽입하여 pTEF-MFα(G)-CalB14 벡터를 구축하였다. 또한, 글라이신-라이신(Gly-Lys) 코돈을 추가로 삽입하기 위해서는 MFa(GK)-F 및 MFa-R2 프라이머를 사용하여 동일한 요령으로 pTEF-MFα(GK)-CalB14 벡터를 제조하였다. 코돈 최적화는 글라이신(Gly) 코돈을 삽입한 경우만 실험하였다. 이를 위해 TEF-1F와 TEF-MGR 및 MFa(G)opt-F와 MFa-8 프라이머의 조합으로 중합효소 반응(PCR)을 이용하여 증폭시킨 후, 두 개의 단편을 연결하는 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 실시예 4에서 제조한 코돈 최적화된 (opt) 염기서열을 포함하는 벡터 pTEF-MFα (opt)-CalB14 (opt) 의 SmaⅠ과 XbaⅠsite에 단편을 삽입하여 pTEF-MFα opt(G)-CalB14 opt 벡터를 구축하였다.
서열이름 | 염기서열 |
MFa(G)-F | GAATTCATGGGTAGATTTCCTTCAATTTTTACT |
MFa(GK)-F | GAATTCATGGGTAAGAGATTTCCTTCAATTTTTACT |
MFa-R2 | TCTCTTATCTAGAGATACCCCTTCTTCTTTA |
TEF-1F | CCCGGGATTTAAATATAACTGTCGCCTCTTTTATC |
TEF-MGR | GATGGATGGGAATCTACCCATGTTGGCGAATAACTAAAATGT |
MFa(G)(opt)-F | ATGGGTAGATTCCCATCCATCTTC |
MFa-8 | TCTCTTGTCTAGAGGAACACCTTC |
이렇게 구축한 5종의 발현 벡터인 pTEF-MFα-CalB14, pTEF-MFα(G)-CalB14, pTEF-MFα(GK)-CalB14, pTEF-MFα (opt)-CalB14 (opt) 및 pTEF-MFα (opt)(G)-CalB14 (opt)의 His4 부분을 SalⅠ 효소로 절단한 후 피키아 파스토리스 GS115(His-, Mut-) 균주에 litium/acetate 방법을 이용하여 각각 형질전환하였다. 그 후 HG(His-, glycerol) plate에서 얻은 형질전환체(transformants)를 YPD(glucose 2%)-tributyrin plate에 이쑤시개로 옮기고 0℃에서 24시간 배양시킨 후, 활성환 (halo)를 보인 콜로니를 각각 선별하였다. CalB 유전자를 발현하기 위하여 YPD 배지 3㎖에 접종하여 30℃에서 24시간 배양시킨 후, 250㎖ 배플드 플라스크에 YP glycerol (glycerol 2%) 배지 25㎖에 O.D.600 값이 1이 되도록 접종하였다. 30℃에서 각각 48시간 동안 배양하여 CalB 유전자의 발현을 유도하였다. 각각의 배양액으로부터 얻은 상등액을 SDS-PAGE (12% Tris-glycine gel) 분석과 CalB에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 (3% BSA 반응중지액, 1차 항체 : 5000배 희석된 CalB, 2차 항체 : 5000배 희석 토끼 IgG) 분석을 하여 세포외로 분비된 약 45kDa 크기의 분자량을 가진 CalB 단백질의 밴드를 확인한 후 리파제 효소 활성을 측정하였다.
하기 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 효모에서 가장 많이 사용하는 MFα ppL 분비 시그널을 사용하는 경우 목표유전자 코돈의 최적화보다 분비 시그널 코돈 최적화가 목표 단백질의 분비효율에 더욱 중요하며, 또한 분비 시그널의 아미노산 서열의 추가 삽입 등의 변형보다 코돈 최적화가 더욱 중요함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따라 효모에서 분비 시그널을 최적화하는 것이 재조합 단백질을 생산하는데 매우 유용함을 확인하였다.
아미노산 서열 (염기서열) | 코돈 비최적화 | 코돈 최적화 | |
MFα (야생형) | MRFPS... | pTEF-MFα-CalB14 | pTEF-MFα opt-CalB14 opt |
518 | 11,421 | ||
MFα (G) | MG(ggt)RFPS... | pTEF-MFα(G)-CalB14 | pTEF-MFα opt(G)-CalB14 opt |
1,522 | 5,875 | ||
MFα (GK) | MGK(ggtaag)RFPS... | pTEF-MFα(GK)-CalB14 | - |
253 | - |
도 1은 효모 사카로마이세스 세레비지에의 CalB14 발현 및 분비벡터 pYGMFα-CalB14의 모식도이다.
도 2(a)는 피키아 파스토리스 균주의 TEF 프로모터 및 MFα ppL 분비 시그널이용한 CalB 발현 벡터(pTEF-MFα-CalB14)의 모식도이며, 도 2(b)는 피키아 파스토리스 균주의 TEF 프로모터 및 TFP 3 분비 시그널이용한 CalB 발현 벡터(pTEF-TFP 3-CalB14)의 모식도이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
<120> AN EFFECTIVE METHOD FOR EXPRESSING AND SECRETING RECOMBINANT
PROTEINS IN YEAST
<160> 13
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 954
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctaccttccg gttcggaccc tgccttttcg cagcccaagt cggtgctcga tgcgggtctg 60
acctgccagg gtgcttcgcc atcctcggtc tccaaaccca tccttctcgt ccccggaacc 120
ggcaccacag gtccacagtc gttcgactcg aactggatcc ccctctctgc gcagctgggt 180
tacacaccct gctggatctc acccccgccg ttcatgctca acgacaccca ggtcaacacg 240
gagtacatgg tcaacgccat caccacgctc tacgctggtt cgggcaacaa taagcttccc 300
gtgctcacct ggtcccaggg tggtctggtt gcacagtggg gtctgacctt cttccccagt 360
atcaggtcca aggtcgatcg acttatggcc tttgcgcccg actacaaggg caccgtcctc 420
gccggccctc tcgatgcact cgcggttagt gcaccctccg tatggcagca aaccaccggt 480
tcggcactca ctaccgcact ccgaaacgca ggtggtctga cccagatcgt gcccaccacc 540
aacctctact cggcgaccga cgagatcgtt cagcctcagg tgtccaactc gccactcgac 600
tcatcctacc tcttcaacgg aaagaacgtc caggcacagg ctgtgtgtgg gccgctgttc 660
gtcatcgacc atgcaggctc gctcacctcg cagttctcct acgtcgtcgg tcgatccgcc 720
ctgcgctcca ccacgggcca ggctcgtagt gcagactatg gcattacgga ctgcaaccct 780
cttcccgcca atgatctgac tcccgagcaa aaggtcgccg cggctgcgct cctggcgccg 840
gcggctgcag ccatcgtggc gggtccaaag cagaactgcg agcccgacct catgccctac 900
gcccgcccct ttgcagtagg caaaaggacc tgctccggca tcgtcacccc ctga 954
<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)
<223> AMINO ACID SEQUENCE OF CALB
<400> 2
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 3
<211> 954
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF CODON OPTIMIZED CALB
<400> 3
ttgccatccg gttccgaccc agctttctcc caacctaagt ccgttttgga cgctggtttg 60
acttgtcaag gtgcctctcc atcctccgtt tccaagccaa tcttgttggt tccaggtact 120
ggtactactg gtcctcaatc cttcgactct aactggatcc cattgtccgc tcaattgggt 180
tacactccat gttggatctc tccaccacca ttcatgttga acgacactca agttaacact 240
gaatacatgg ttaacgctat cactactttg tacgctggtt ctggtaacaa caagttgcct 300
gttttgactt ggtcccaagg tggtttggtt gctcaatggg gtttgacttt cttcccatcc 360
atcagatcca aggttgacag attgatggct ttcgctcctg actacaaagg tactgttttg 420
gctggtccat tggacgcttt ggccgtttcc gctccatctg tttggcaaca aactactggt 480
tccgccttga ctactgcttt gagaaacgct ggtggtttga ctcaaatcgt tccaactact 540
aacttgtact ccgctactga cgaaatcgtt caaccacaag tttccaactc cccattggac 600
tcctcctact tgttcaacgg taagaacgtt caagcccaag ctgtttgtgg tcctttgttc 660
gttatcgacc acgctggttc tttgacttcc caattctcct acgttgttgg tagatccgcc 720
ttgagatcca ctactggtca agctagatcc gctgactacg gtatcactga ctgtaaccca 780
ttgccagcta acgacttgac tccagaacaa aaggttgctg ctgctgcttt gttggctcca 840
gctgctgctg ctatcgttgc tggtccaaag caaaactgtg aaccagactt gatgccttac 900
gctagaccat tcgctgttgg taagagaact tgttccggta tcgttactcc ataa 954
<210> 4
<211> 954
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF CALB14
<400> 4
ctgccttccg gttcggaccc tgccttttcg cagcccaagt cggtgctcga tgcgggtctg 60
acctgccaag gtgcttcgcc atcctcggtc tccaaaccca tccttctcgt ccccggaacc 120
ggcaccacag gtccacagtc gttcgactcg aactggatcc ccctctctgc gcagctgggt 180
tacacaccct gctggatctc acccccgccg ttcatgctca acgacaccca ggtcaacacg 240
gagtacatgg tcaacgccat caccacgctc tacgctggtt cgggcaacaa caagcttccc 300
gtgctcacct ggtcccaggg tggtctggtt gcacagtggg gtctgacctt cttccccagt 360
atcaggtcca aggtcgatcg acttatggcc tttgcgcccg actacaaggg caccgtcctc 420
gccggccctc tcgatgcact cgcggttagt gcaccctccg tatggcagca aaccaccggt 480
tcggcactca ctaccgcact ccgaaacgca ggtggtctga cccagatcgt gcccaccacc 540
aacctctact cggcgaccga cgagatcgtt cagcctcagg tgtccaactc gccactcgac 600
tcatcctacc ttttcaacgg aaagaacgtc caggcacagg ctgtgtgtgg gccgcagttc 660
gtcatcgacc atgcaggctc gctcacctcg cagttctcct acgtcgtcgg tcgatccgcc 720
ctgcgctcca ccacgggcca ggctcgtagt gcggactatg gcattacgga ctgcaaccct 780
cttcccgcca atgatctgac tcccgagcaa aaggtcgccg cggctgcgct cccggcgccg 840
gcggctgcag ccatcgtggc gggtccaaag cagaactgcg agcccgacct catgccctac 900
gcccgcccct ttgcagtagg caaaaggacc tgctccggca tcgtcacccc ctga 954
<210> 5
<211> 317
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)
<223> AMINO ACID SEQUENCE OF CALB14
<400> 5
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Gln Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 6
<211> 954
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DAN SEQUENCE OF CODON OPTIMIZED CALB14
<400> 6
ttgccatccg gttccgaccc agctttctcc caacctaagt ccgttttgga cgctggtttg 60
acttgtcaag gtgcctctcc atcctccgtt tccaagccaa tcttgttggt tccaggtact 120
ggtactactg gtcctcaatc cttcgactct aactggatcc cattgtccgc tcaattgggt 180
tacactccat gttggatctc tccaccacca ttcatgttga acgacactca agttaacact 240
gaatacatgg ttaacgctat cactactttg tacgctggtt ctggtaacaa caagttgcct 300
gttttgactt ggtcccaagg tggtttggtt gctcaatggg gtttgacttt cttcccatcc 360
atcagatcca aggttgacag attgatggct ttcgctcctg actacaaggg tactgttttg 420
gctggtccat tggacgcttt ggccgtttcc gctccatctg tttggcaaca aactactggt 480
tccgccttga ctactgcttt gagaaacgct ggtggtttga ctcaaatcgt tccaactact 540
aacttgtact ccgctactga cgaaatcgtt caaccacaag tttccaactc cccattggac 600
tcctcctact tgttcaacgg taagaacgtt caagcccaag ctgtttgtgg tcctcaattc 660
gttatcgacc acgctggttc tttgacttcc caattctcct acgttgttgg tagatccgcc 720
ttgagatcca ctactggtca agctagatcc gctgactacg gtatcactga ctgtaaccca 780
ttgccagcta acgacttgac tccagaacaa aaggttgctg ctgctgcttt gccagctcca 840
gctgctgctg ctatcgttgc tggtccaaag caaaactgtg aaccagactt gatgccttac 900
gctagaccat tcgctgttgg taagagaact tgttccggta tcgttactcc ataa 954
<210> 7
<211> 255
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF MF ALPHA PPL
<400> 7
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctagata agcgt 255
<210> 8
<211> 85
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)
<223> AMINO ACID SEQUENCE OF MF ALPHA PPL
<400> 8
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Asp Lys Arg
85
<210> 9
<211> 255
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF CODON OPTIMIZED MF ALPHA PPL
<400> 9
atgagattcc catccatctt cactgctgtt ttgttcgctg cttcctccgc cttggctgct 60
ccagttaaca ccactaccga agacgaaact gcccaaatcc cagctgaagc tgttatcggt 120
tactccgact tggaaggtga cttcgacgtt gctgttttgc cattctccaa ctccactaac 180
aacggtttgt tgttcatcaa cactaccatc gcttccatcg ctgctaagga agaaggtgtt 240
cctctagata agaga 255
<210> 10
<211> 327
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF TFP3
<400> 10
atgcaattca aaaacgtcgc cctagctgcc tccgttgctg ctctatccgc cactgcttct 60
gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccaccttaa ccccaaccgg ctccatctct 120
tgtggtgctg ccgaatacac taccaccttt ggtattgctg ttcaagctat tacctcttca 180
aaagctaaga gagacgttat ctctcaaatt ggtgacggtc aagtccaagc cacttctgct 240
gctactgctc aagccaccga tagtcaagcc caagctacta ctaccgctac cccaaccagc 300
tccgaaaaga tccttctaga taagcgt 327
<210> 11
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)
<223> AMINO ACID SEQUENCE OF TFP3
<400> 11
Met Gln Phe Lys Asn Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ser Ala Glu Gly Tyr Thr Pro Gly Glu Pro Trp Ser Thr
20 25 30
Leu Thr Pro Thr Gly Ser Ile Ser Cys Gly Ala Ala Glu Tyr Thr Thr
35 40 45
Thr Phe Gly Ile Ala Val Gln Ala Ile Thr Ser Ser Lys Ala Lys Arg
50 55 60
Asp Val Ile Ser Gln Ile Gly Asp Gly Gln Val Gln Ala Thr Ser Ala
65 70 75 80
Ala Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ser Gln Ala Gln Ala Thr Thr Thr Ala
85 90 95
Thr Pro Thr Ser Ser Glu Lys Ile Leu Leu Asp Lys Arg
100 105
<210> 12
<211> 327
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF CODON OPTIMIZED TFP3
<400> 12
atgcaattca agaacgttgc tttggctgct tccgttgctg ccttgtccgc tactgcttcc 60
gctgaaggtt acactccagg tgaaccatgg tccactttga ctccaactgg ttccatctcc 120
tgtggtgctg ccgaatacac taccactttc ggtatcgccg ttcaagctat cacttcctcc 180
aaggctaaga gagacgttat ctcccaaatc ggtgacggtc aagttcaagc tacttccgct 240
gctactgctc aagctactga ctcccaagct caagctacta ctactgctac tccaacttcc 300
tccgaaaaga tccttctaga taagaga 327
<210> 13
<211> 430
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> promoter
<222> (1)
<223> DNA SEQUENCE OF TEF PROMOTER
<400> 13
ataactgtcg cctcttttat ctgccgcact gcatgaggtg tccccttagt gggaaagagt 60
actgagccaa ccctggagga cagcaaggga aaaataccta caacttgctt cataatggtc 120
gtaaaaacaa tccttgtcgg atataagtgt tgtagactgt cccttatcct ctgcgatgtt 180
cttcctctca aagtttgcga tttctctcta tcagaattgc catcaagaga ctcaggacta 240
atttcgcagt cccacacgca ctcgtacatg attggctgaa atttccctaa agaatttctt 300
tttcacgaaa attttttttt tacacaagat tttcagcaga tataaaatgg agagcaggac 360
ctccgctgtg actcttcttt tttttctttt attctcacta catacatttt agttattcgc 420
caacgaattc 430
Claims (8)
- 효모에서 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서, 재조합 단백질을 분비시키는 분비 시그널 유전자를 코돈 최적화함으로써 재조합 단백질을 고효율로 생산하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 재조합 단백질을 코딩하는 염기서열이 코돈 최적화된 것인 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 분비 시그널이 MFα ppL(Mating Factor α prepro Leader) 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 TFP 3(Translational Fusion Partnet 3)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 재조합 단백질이 칸디다 앤타티카 (Candia antarctica) 유래의 리파제 B (CalB) 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 변이 리파제 CalB14인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 MF αppL의 코돈 최적화된 염기서열이 서열번호 9의 염기서열인 것인 방법.
- 제 3항에 있어서, TFP 3의 코돈 최적화된 염기서열이 서열번호 12인 것인 방법.
- 제 4항에 있어서, CalB의 코돈 최적화된 염기서열이 서열번호 3인 것인 방법.
- 제 4항에 있어서, CalB14의 코돈 최적화된 염기서열이 서열번호 6인 것인 방법.
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KR102466926B1 (ko) * | 2020-05-20 | 2022-11-14 | 전남대학교산학협력단 | 하이드로포빈의 가용성 발현 방법 및 정제 방법 |
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-
2007
- 2007-09-12 KR KR1020070092823A patent/KR100919704B1/ko active IP Right Grant
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