JPH08501695A - 組換え真核細胞による分泌タンパク質の増大された産生 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。特に、本発明は、ＳＳＯ遺伝子で形質転換された、新規な組換え真核細胞に関する。数コピーのＳＳＯ遺伝子で形質転換された真核細胞、またはそれ以外の手段によりＳｓｏタンパク質を過剰発現する真核細胞は、外来性または内在性の分泌タンパク質産生能が向上する。さらに、上記の新規な組換え細胞は、適当な加水分解酵素を発現する遺伝子で形質転換されると、適当なマクロモレキュラー化合物をより効率的に利用することができるようになる。したがって、適切な生物工学的用途において、該マクロモレキュラー化合物の、細胞による大量産生および／または多様な利用が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】 組換え真核細胞による分泌タンパク質の増大された産生 技術分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術に関する。特に、本発明は、ＳＳＯ遺伝子または その相同体で形質転換された、新規な組換え真核細胞に関する。数コピーのＳＳ Ｏ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子で形質転換された真核細胞は、外来 性または内在性の分泌タンパク質産生能が向上する。 さらに、上記の新規な組換え真核細胞、特に酵母類や糸状菌類は、適当な加水 分解酵素を発現する遺伝子で形質転換されると、適当なマクロモレキュラー／重 合化合物をより効率的に加水分解および／または利用することができるようにな る。したがって、適切な生物工学的用途において、該マクロモレキュラー／重合 化合物の、細胞による大量産生および／または多様な利用が可能になる。 背景技術 組換えＤＮＡ法の開発により、異種宿主系におけるタンパク質の産生が可能に なった。このことにより、例えば、通常、自然界には極めて少量しか存在しない 治療上重要なタンパク質、あるいは単離・精製の困難なタンパク質が、非常に容 易に得られるようになった。そのようなタンパク質の例としては、成長因子、ホ ルモン、および従来ヒトや動物の組織、あるいは血清や尿等の体液から単離され てきたその他の生物学 的に活性なタンパク質またはペプチドが挙げられる。ＨＢＶ、ＨＩＶおよび発ガ ン性ウイルスのようなヒト病原性ウイルスや、ヒトや動物の組織または体液中の その他の病原体の存在はますます危険なものになっているため、これらのウイル スは病原体が原因となる疾病の治療に用いるタンパク質の異種産生系の探索が非 常に急がれている。臨床上重要なその他のタンパク質としては、特にイン・ビト ロあるいは組織培養では生育しにくい微生物や、危険なヒト病原体である微生物 、により生じる疾病の診断ワクチンの製造に必要なウイルス、その他の微生物ま たはヒト寄生虫のタンパク質がある。これらの微生物の具体例としては、ＨＢＶ 、ＨＩＶ、黄熱ウイルス、風疹ウイルス、***ウイルスおよび狂犬病ウイルス などのウイルス、およびマラリアなどのヒト寄生虫などが挙げられる。 異種産生系が開発されている、あるいは開発されつつある他の１つのタンパク 質群として、分泌酵素、特に植物性物質を加水分解する分泌酵素が挙げられる。 これらは、食品および家畜用飼料の製造だけでなく、織物工業およびパルプ・紙 工業などの、その他の工業的プロセスにおいても必要なものである。異種系での タンパク質産生または遺伝的に操作された細胞における内在性タンパク質の産生 が可能になれば、その収率は向上し、純度も著しく高くなる。又この技術は、す でに今日までに、多くの重要な酵素およびその他のタンパク 質の構造や機能の研究に大きな影響を及ぼしている。例えば、酵母において外来 性加水分解酵素の産生・分泌が可能になったことにより、蒸留酵母、醸造酵母、 あるいはパン酵母などの工業的酵母株を用いるプロセスが改善されている。 様々な産生系が開発されており、例えば、細菌類、酵母類、糸状菌類、動・植 物細胞培養物、さらにはトランスジェニック動・植物などの多細胞生物が挙げら れる。これらの系は全て、欠点があるにしてもそれぞれの長所を有しており、し たがって必要なものである。 酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）は現在 のところ、遺伝子レベルで最も良く知られている真核生物である。この微生物は 、真核性微生物としては、真核細胞の有する長所、例えば真核生物の翻訳後に起 こる修飾の、全てではないにしてもそのほとんどを有しており、一方、微生物と しては、細菌の有する取り扱い易さおよび培養特性を有している。Ｓ．セレビシ エは、食品成分やビール、ワイン等の飲料の製造などのバイオテクノロジーにお いて、長い間有用とされてきた微生物であり、この微生物を用いる大規模な発酵 システムも十分に開発されている。 酵母の遺伝子操作方法は、古典的遺伝学により得られた膨大な知識に基づき、 真核生物の中でも最も進歩している。したがって、初めは大腸菌（Escherichia coli）についてしか論じられなかった遺伝子工学の手法が酵母においても容易に 適用でき、しかも更に開発できるようになった。また、別の方法に従って、外来 性タンパク質を産生する酵母菌株の構築法が広く開発されている（Romanos et． al.，1992）。 タンパク質を培養培地に分泌させるには、分泌経路を構成している様々な膜閉 鎖系区画を経由して該タンパク質を運搬する。まず最初に、タンパク質は小胞体 （ＥＲ）の内腔へと移動する。該タンパク質は、そこから、膜小胞に運搬されて ゴルジ複合体へと移動し、さらにゴルジ複合体から形質膜へと移動する。この分 泌プロセスはいくつかの工程からなり、分泌タンパク質を含有する小胞が、ドナ ーの膜から発芽して、受容体の膜を標的として融合する。これらの各工程におい ては、いくつかの異なるタンパク質の作用が必要となる。 酵母の分泌経路およびそれに関与する非常に多くの遺伝子は、その分泌プロセ スのある特定の工程に欠陥のある条件致死変異株を単離することにより明らかに されている（Novicket al.,1980; 1981）。ある特定の運搬工程に必要とされる タンパク質の突然変異により、分泌されたタンパク質がその工程前の膜区画に蓄 積する。このようにして、タンパク質はＥＲ、ゴルジ複合体、ＥＲとゴルジ複合 体との間の小胞、あるいはゴルジ複合体と形質膜との間の小胞に蓄積できる。 分泌プロセスに関与する遺伝子およびタンパク質は、該遺伝子のクローニング やそれに対応するタンパク質の機能の特徴づけにより、さらに詳細に解析できる ようになった。全て の工程において、相互作用するいくつかのタンパク質が機能していることが明ら かになった。近年、我々は、高温において生育やタンパク質の分泌を損なう sec 1-1 の多コピーサプレッサーとして、２つの新規な酵母遺伝子であるＳＳＯ１ およびＳＳＯ２をクローニングした（Aalto et al.，1993）。 Ｓ．セレビシエに関して同定・単離された遺伝子が多く発見され、酵母遺伝子 との配列相同性あるいは酵母突然変異の相補性に基いて他の生物からクローニン グされている。哺乳動物のＮＳＦ因子は酵母のＳＥＣ１８遺伝子産生物の相同体 であり、タンパク質分泌において同様の機能を示す（Wilson et al.，1989）。 また、ヤロビア・リポリティカ（Yarrowialipolytica）のＳＥＣ１４遺伝子（Lo pez et al.，1992）がクローニングされ、特徴づけられている。シグナルペプチ ダーゼの成分をコードする酵母ＳＥＣ１１遺伝子に対する哺乳動物の相同体がク ローニングされている（Greenberg etal.，1989）。小さなＧＴＰ結合タンパク 質をコードするシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）Ｙ ＰＴ１遺伝子は、酵母ＳＥＣ４遺伝子をプローブとして用いてクローニングされ （Fawell et al.，1989）、このＹＰＴ１遺伝子に対応する哺乳動物の遺伝子は 、酵母Ｙｐｔ１タンパク質に対する抗体を用いて、分泌機構の一部であることが 証明された（Segev et al., 1988）。Ｙｐｔ１タンパク質に相同であることが証 明された哺乳動物ｒａｂ１タンパク質 （Zaraoui et al.，1989）は、酵母Ｙｐｔ１タンパク質の機能と同じ役割を果た す（Haubruck et al.，1990）。 本発明による酵母ＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子とタンパク質レベルに おいて相同な遺伝子が、例えばマウス（Hirai et al.，1992）、ラット（Inoue et al.，1992；Bennett et al.，1992）および線虫（Ainscough et al.，1991； EMBL Data Bank 29，受託番号：Ｍ ７５８２５）などのいくつかの種で発見さ れており、したがって、これらの遺伝子が進化の過程において保持されているこ とが分かる。その他の種においても、そのような相同タンパク質は細胞表面い見 い出され、あるいは細胞表面へのシナプス小胞輸送に関与していると考えられて おり、ＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子と機能的に関連することが示唆され ている。しかしながら、分泌に直接関与することは、Ｓｓｏタンパク質について のみ証明されているだけであり、しかもそれは我々が報告したものである（Aalt o et al.，1993）。酵母が有する、シナプス小胞膜タンパク質、即ちシナプトブ レビン類（synaptobrevins）に対する相同体はＳｎｃ１およびＳｎｃ２タンパク 質である（Gerst et al.，1992；Protopopov etal.，1993）。 上記の例（更に多くの例も報告されている）は、分泌機構の普遍性を示してい る。従って、酵母について得られる結果は、その他の真菌類、さらにはその他の 真核細胞にもほとん どあてはまる。 ＳＳＯ遺伝子に類似する配列を有する遺伝子は、細胞内タンパク質の輸送／分 泌の上記以外の他の工程にも関与している。例えば、ＳＥＤ５遺伝子（Hardwick and Pelham，1992）はＥＲとゴルジ複合体の間、およびＰＥＰ１２遺伝子（Bec herer and Jones，1992）はゴルジ複合体と液胞（酵母のリソソーム区画）の間 のタンパク質の輸送／分泌に関与している。このことは、ＳＳＯ遺伝子が、タン パク質の分泌および細胞内輸送において中心的かつ保持された役割を有すること がさらに支持される。しかしながら、酵母または動物細胞においてＳＳＯ遺伝子 相同体が過剰発現された場合に、タンパク質の分泌に関して、本発明で我々がＳ ＳＯ遺伝子について示すような有利な効果を生じることについての報告は全くな い。 クライベロミセス（Kluyveromyces）、ピヒア（Pichia）、シゾサッカロミセ ス（Schizosaccharomyces）およびハンゼヌラ（Hansenula）などの、上記以外の 酵母類の分泌システムについてはあまり知られていない。しかし、これらの酵母 類は、外来性タンパク質産生の宿主として有用であることがわかっている（Buck holz and Gleeson，1991）。これらの酵母類は遺伝学的および分子生物学的にサ ッカロミセスほどには解明されていないが、産生宿主としてはサッカロミセスと 同等に有用である。このことは、従来外来性分泌タンパク質の産生に用いられて きたニューロスポラ（Neurospora）属、 アスペルギルス（Aspergillus）属およびトリコデルマ（Trichoderma）属などの 糸状菌類についても言えることである（Jeenes et al.，1991）。非常に多くの 糸状菌類は、Ｓ．セレビシエのように、分類学上真菌類に属し、さらに子嚢菌類 に属するので、分泌機構がＳ．セレビシエと類似していることは明らかである。 糸状菌類は自己の加水分解酵素は非常に効率的に分泌する。しかし、糸状菌類に おける外来性タンパク質の産生はそれ程効率的ではない。これは、多くの場合、 分泌が不十分なためと考えられる。全ての菌類に共通する特徴は、例えば、分泌 経路に沿って起こる翻訳後修飾である。 これまでに、酵母や糸状菌類、さらにはその他の生物における外来性タンパク 質の産生を高めるために、いくつかの試みがなされ、発表されてきた。また、転 写レベルを高くするかあるいはプラスミドのコピー数を増加させるための、様々 なプロモーターおよびプラスミドの構築に多くの労力が費されてきた（例えば、 Baldari et al.，1987；Martegani etal.，1992；Irani and Kilgore，1988 を 参照）。分泌を増大させるための一般的なアプローチは、酵母のシグナル配列を 用いることである（Baldari，et al.，1987；Vanoni et al.，1989）。酵母およ び糸状菌類においては、外来性タンパク質をさらに効率的に分泌させるために、 分泌タンパク質のランダムな突然変異誘発および突然変異株のスクリーニング（ Smith et al.，1985；Sakai et al.，1988；Schuster et al.，1989；Suzuki et al.，1989；Sleep et al.，1991；Lamsa and Bloebaum， 1990；Dunn-Coleman et al.，1991）、あるいは外来性タンパク質の、効率的に 分泌された内在性タンパク質への融合（Ward et al.，1990；Harkki et al.， 願）が広く用いられている。しかし、これらの方法には限界がある。ランダムな 突然変異誘発を施し、スクリーニングすることにより単離される分泌タンパク質 過剰産生突然変異株は、専ら劣性形質であるため、倍数体である工業用酵母株と しては用いられない。この過剰産生は、しばしば、分泌の増大以外の変化により 引き起こされ、多くの場合、スクリーニングに用いられるタンパク質だけに影響 を及ぼす。一方、融合タンパク質によるアプローチでは、各外来性タンパク質の 融合構造をそれぞれ調整することが必要である。 我々のアプローチでは、分泌において機能する遺伝子のコピー数を増加させ、 分泌機構の構成成分の量がより普遍的なものになる。従って、特殊な融合構造を もたないタンパク質であれば応用でき、また、二倍体や倍数体の株にも応用可能 である。 分泌プロセスにおいて、どの工程がボトルネックとなるのかについては正確に は知られていないが、そのような工程は複数であることが予想できる。我々は、 分泌経路の最終段階において起こりうる障害の解明を始めた。そして、ゴルジ複 合体から出芽する分泌小胞が形質膜を標的とし、それと融合して分泌タンパク質 を細胞外に放出する段階である、分泌プロセスの最終段階に関与する遺伝子をク ローニングし、特徴づけを行なった。我々は、先に、この段階において機能する ＳＥＣ１遺伝子をクローニングし、特徴づけを行なった（Aalto et al.，1991； Aalto et al.，1992）。その後、このＳＥＣ１遺伝子が、必須の単コピー遺伝子 であることを示した（Aalto et al.，1993）。また、本発明によるＳＳＯ遺伝子 は、ｓｅｃ１−１突然変異の多コピーサプレッサーとしてクローニングされた（ Aalto et al.，1993）。発明の概要 本発明は、過剰発現させると分泌タンパク質の産生が増大する遺伝子の単離に ついて記載する。特に、本発明は、Ｓｓｏ１タンパク質およびＳｓｏ２タンパク 質をそれぞれコードするＳ．セレビシエのＳＳＯ１遺伝子及びＳＳＯ２遺伝子の 単離、該遺伝子の特徴づけ、該遺伝子のＳ．セレビシエへの導入並びにそこにお ける過剰発現について記載する。さらに、本発明は、トリコデルマ・レーセイ（ Trichoderma reesei）からのＳＳＯ相同遺伝子の単離、該遺伝子の特徴づけおよ びトリコデルマへの導入およびそこにおける過剰発現について記載する。 さらに、酵母のＳＳＯ遺伝子群と高等真核細胞の対応する遺伝子群との配列相 同性により、本発明は、高められた分泌 能を有する、より高等な真核生物の新規な細胞株の構築に用い得ることが示され る。 したがって、本発明は、新規な組換え真核細胞、好ましくは、Ｓｓｏタンパク 質を高レベルで発現する真菌宿主細胞、特にＳｓｏ１タンパク質および／または Ｓｓｏ２タンパク質を高レベルで発現する酵母株、およびトリコデルマＳｓｏタ ンパク質を高レベルで発現するトリコデルマ株を提供するものである。また、本 発明は、ＳＥＣ１遺伝子のようにＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子を過剰発現 することにより、分泌タンパク質の産生を増大する方法を提供する。 本発明による、ＳＳＯ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子により 形質転換される真核細胞は、分泌タンパク質産生能が向上する。また、本発明に よる新規な真核細胞、特に酵母および糸状菌類は、さらに効率的な加水分解酵素 の産生および重合性物質等の加水分解に用いられる。このような菌類を用いれば 、細胞量の増加による単一細胞またはビール酵母産生のような生物工学的なプロ セス、あるいは加水分解酵素の効率的な産生および／または植物性材料の効率的 な加水分解が有益とされるその他のプロセスが改善される。図面の簡単な説明 図１は、多コピープラスミドｐＭＡＣ５６１に、Ｓ．セレビシエＳＳＯ１遺伝 子およびＳＳＯ２遺伝子のｃＤＮＡをそれぞれ組み込んで得られるプラスミドＹ ＥｐＳＳＯ１および ＹＥｐＳＳＯ２を示す。 図２は、ＹＥｐＳＳＯ２により形質転換された酵母におけるＳｓｏ２タンパク 質の過剰発現を証明するウェスタンブロット解析を示す。 図３は、ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子を発現する多コピープラスミド 、およびバチルス（Bacillus）α−アミラーゼ遺伝子を発現する別のプラスミド により形質転換したＳ．セレビシエ（ｓｆ７５０−１４Ｄ株）により分泌された バチルスα−アミラーゼ産生量の増大を示すグラフである。 図４は、ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子を発現する多コピープラスミド を有する、あるいは有さないＳ．セレビシエにより分泌されたバチルスα−アミ ラーゼのウェスタン解析を示すものである。 図５は、ＳＳＯ２遺伝子を発現する多コピープラスミド、およびバチルスα− アミラーゼを発現する別のプラスミドにより形質転換したＳ．セレビシエ（ＤＢ Ｙ７４６株）により分泌されたバチルスα−アミラーゼ産生量の増大を示すグラ フである。 図６は、ＳＥＣ１遺伝子を発現する多コピープラスミド、およびバチルスα− アミラーゼを発現する別のプラスミドにより形質転換したＳ．セレビシエ（ＤＢ Ｙ７４６株）により分泌されたバチルスα−アミラーゼ産生量の増大を示すグラ フである。 図７は、リボゾーム配列により両側からはさまれたＳＳＯ２発現カセットをＢ Ｓ＋ベクターに組み込んで得られるプラスミドｐＲｂＳＳＯ２を示す。 図８は、６種類の異なる真菌種に由来するＤＮＡと、酵母ＳＳＯ１遺伝子との ハイブダイゼーションを示す。発明の詳細な説明 以下の本発明の詳細な説明がよりよく理解されるように、以下で用いる特定の 用語について定義する。 遺伝子の過剰発現： 前記遺伝子によりコードされるタンパク質の細胞内における産生量は増大する 。これは、多コピー数の該遺伝子をプラスミドにのせて細胞に導入するか、ある いはゲノムに組込んで、該遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる 。また、過剰発現は、該遺伝子を、それ自身のプロモーターよりも強力なプロモ ーターの制御下に配置することによっても達成できる。細胞中の該タンパク質の 量は、遺伝子のコピー数および／または発現に用いられるプロモーターの強度を 様々に変えることにより調節できる。 突然変異の抑圧： ある特定の遺伝子（第１の遺伝子）の突然変異の効果が他の遺伝子（第２の遺 伝子）の突然変異により低下または完全に損なわれた場合、この第２の遺伝子は 第１の遺伝子のサプレッサーと呼ばれる。抑圧（サプレッション）は、上記の方 法による第２の遺伝子の野生型対立遺伝子の過剰発現によっても起り得る。これ は、過剰発現抑圧と呼ばれる。過剰発現が多コピー数の抑圧遺伝子により引き起 こされる場合には、多コピー抑圧とも呼ばれる。抑圧現象の発生は、これら２つ の遺伝子が遺伝子レベルで相互作用していることを示す。この相互作用は、これ ら２つの遺伝子がコードする２つのタンパク質間の、直接的且つ物理的な接触と して、物理的レベルでも起こる。 相同遺伝子、相同体： ＤＮＡ配列において関連はあるが同一ではなく、及び／または同じ機能を有す る遺伝子は、互いに相同であり、又、互いに相同体であると呼ばれる。 分泌タンパク質： 分泌経路が細胞内部にあり、その経路を通じて細胞外（形質膜の外側）へと輸 送されるタンパク質を、分泌タンパク質と呼ぶ。酵母において、このタンパク質 は、例えばインベルターゼのように細胞壁と結合したままであるか、あるいは外 来性タンパク質バチルスα−アミラーゼのように細胞壁を通じて生育培地へ放出 さる。 本発明で用いられるＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子は、これらの遺伝子 を含有する生物、例えばサッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）やトリコデルマ（Trichoderma）属から単離される。また、それ以外の好適 な酵母およびその他の真菌類として、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacc haromyces pombe）、クライベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis） 、ピヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、アスペルギルス（Aspergi llus）属、ニューロスポラ（Neurospora）属、およびペニシリウム（Penicilliu m）属等が挙げられる。その他の生物から単離される相同遺伝子も用い得ること にも注目すべきである。 さらに、同工程において、ＳＥＣ１遺伝子のように、ＳＳＯ遺伝子と共同で機 能するその他の遺伝子を、正常レベルまたは増加されたレベルのＳｓｏタンパク 質の存在下で過剰発現することにより、分泌を高めることができる。分泌プロセ スの前の工程で機能する遺伝子もおそらく同様の効果を有すると考えられる。し たがって、ゴルジ区画からの分泌小胞の遊離は、この遊離工程で機能することが 知られているＳＥＣ７遺伝子および／またはＳＥＣ１４遺伝子のコピー数を増加 させること（Novick et al.，1980）、もしくはＳＥＣ７遺伝子および／または ＳＥＣ１４遺伝子と相互作用する遺伝子（例えばこれらの突然変異のサプレッサ ー）を探索し、そのコピー数を増加させることにより促進される。同様に、分泌 プロセスのいずれの前工程も、関与する遺伝子のコピー数を増加させることによ り改良することが可能である。我々がＳ．セレビシエから単離した新規な遺伝子 であるＳＳＯ１およびＳＳＯ２は、細胞内で重要な役割を果たすことが示唆され る 重複遺伝子の代表的なものである。上記したように、ＳＳＯ１遺伝子およびＳＳ Ｏ２遺伝子の性質やそれらの相同性が他の種の中において保持されることに基づ いて、我々は、あらゆる他の真核生物種においてＳＳＯ遺伝子を増加させれば、 その他の酵母類、糸状菌類および動植物細胞等におけるタンパク質分泌効率が高 まることを提案する。 多くの遺伝子がその他の生物における分泌に関与していた、という事実により 、本発明は、例えば、分泌を促進させるための、糸状菌類および高等真核生物内 における酵母遺伝子の発現、およびその逆（すなわち、酵母内での糸状菌および 高等真核生物の遺伝子の発現）あるいは、真核生物の遺伝子の別の真核生物内に おける発現をも包含することに注目されたい。 本発明の遺伝子により形質転換される宿主としては、外来性または内在性タン パク質の産生に好適な真核細胞であれば、いかなるものであってもよく、例えば 、Ｓ．セレビシエ酵母株（ＤＢＹ７４６、ＡＨ２２、Ｓ１５Ｏ−２Ｂ、ＧＰＹ５ ５−１５Ｂα、ＶＴＴ−Ａ−６３１０１５等）、トリコデルマ属［天然単離体で あるＱＭ６ａ（ＲＵＴＣ−３０、ＱＭ９４１６、ＶＴＴ−Ｄ−７９１２５等）に 由来するＴ．ハルジアナム（T. harzianum）およびＴ．レーセイ（T. ressei） 株］、クライベロミセス属、Ｓｃｈ．ポンベ、Ｈ．ポリモルファ（H. polymorph a）、ピヒア属、アスペルギルス属、ニューロスポラ属、ヤロビア属、ペニシリ ウム属、あるいはさらに高等な真核細胞が挙げられる。該遺伝子のこれらの宿主 への移入は、例えば、これらの生物について記載されている従来の方法を用いて 達成できる。 ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子を含有するＤＮＡ配列は、Ｓ．セレビシ エから従来の方法により単離される。１つの好ましい態様において、多コピープ ラスミド上の遺伝子またはｃＤＮＡライブラリーは、ｓｅｃ１−１突然変異株の 温度感受性の抑圧（Aalto et al.，1991; 1993）、あるいはＳ．セレビシエＳＳ Ｏ遺伝子の機能を欠失させる突然変異またはその他の種のアナログ突然変異の抑 圧に用いられる。もうひとつのアプローチとして、ＳＳＯ遺伝子およびＳＳＯ遺 伝子に類似する遺伝子の既知のＤＮＡ配列を、異種ハイブリ ダイゼーションに用いるプローブ、あるいはＳＳＯ遺伝子のクローニングに用い るＰＣＲプライマーの設計に用いる。さらにもうひとつのアプローチとして、既 知のＳＳＯ遺伝子およびＳＳＯ遺伝子に類似する遺伝子に対する抗体を、常法に よる該遺伝子のクローニングに用いる。 Ｓ．セレビシエのＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子に相当する遺伝子は、 以下に記載する方法の１つまたはいくつかを用いて、それ以外の真菌類や高等真 核生物からも単離される。その方法は、ここでは糸状菌であるトリコデルマ・レ ーセイからの単離について特に記載するものであるが、従来の知識および手段に 従って当該の真核細胞に合わせて改変することができる。 Ｔ．レーセイのｃＤＮＡバンクは、フィンランド国特許出願第９２−２３７３ 号（Buchert et al.）明細書に記載されているように、酵母ベクターｐＦＬ６０ に構築される。この遺伝子バンクＤＮＡはＳ．セレビシエＨ４５８株に挿入され て該株を形質転換し（Aalto et al.，1993）、例えば実施例６に記載されている ような分泌欠損の相補性によりスクリーニングする。このプラスミドを陽性コロ ニーから単離し、該遺伝子を常法により単離・特徴づける。そして、該相当染色 体遺伝子を単離する。十分な相補性は、酵母ＳＳＯ遺伝子と機能的に同じ遺伝子 が、他の真菌類、例えばＴ．レーセイにも存在することを示す。 あるいは、Ｓ．セレビシエのＳｓｏ１タンパク質および／またはＳｓｏ２タン パク質に対応するタンパク質をコードする遺伝子は、実施例７に記載されている ような比較的厳しくない条件下での異種ハイブリダイゼーションによりＴ．レー セイから調製されるｃＤＮＡまたは染色体遺伝子バンクから単離し、通常の方法 により特徴づけることができる。該遺伝子の機能も、上記したような方法により 調べることができる。酵母ＳＳＯ遺伝子に相同な染色体配列を有すること （例 えば、ＤＮＡ全体のサザンブロット・ハイブリダイゼーションにより解析される ）が証明されている全ての生物についても、同様のアプローチが好適に用いられ る。また、該遺伝子は、酵母Ｓｓｏタンパク質に対して調製した抗体を用いて、 発現ライブラリーから単離することもできる。 一方、オリゴヌクレオチドプライマーは、数種の生物から単離された各対応遺 伝子間において発見される相同性に基いて設計できる。明確な相同性は、例えば 、Ｓｓｏ１タンパク質（配列番号１）の第２６６番〜第２８７番のアミノ酸領域 およびＳｓｏ２タンパク質（配列番号３）の第２６９番〜第２９０番のアミノ酸 領域において認められる。これらのプライマーは、Ｔ．レーセイ遺伝子のＰＣＲ における増幅に用いられる。 酵母の形質転換に好適なプラスミドを構築するために、ＳＳＯ１遺伝子または ＳＳＯ２遺伝子を、適当な酵母発現ベク ター〔例えば、ｐＡＡＨ５（Ammerer，1983）など〕、または適当な酵母の調節 領域を含有する、酵母発現ベクターから誘導されるベクター（Ruohonen et al. ，1991; Ruohonen etal.，manuscript in preparation，a）にクローニングされ る。これらの調節領域は、例えば、ＡＤＨ１、ＧＡＬ１〜ＧＡＬ１０、ＰＧＫ１ 、ＣＵＰ１、ＧＡＰ、ＣＹＣ１、ＰＨＯ５等の酵母遺伝子、あるいはアスパラギ ンシンセターゼ遺伝子から得ることができる。また、ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳ ０２遺伝子の調節領域も、該遺伝子のＳ．セレビシエ内での発現に用いられる。 ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子を担持しているプラスミドによって、受容 菌である酵母株を軽質転換すると、自律複製が可能である（The plasmid carryー ing the SSO1 or SSO2 gene is capable of replicatingautonomously when tra nsformed into the recipient yeaststrain）。ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２ 遺伝子は、適当な酵母調節領域と共に、Hans Ronne のｐＨＲ７０、あるいはｐ ＲＳ３１３、ｐＲＳ３１４、ｐＲＳ３１５またはｐＲＳ３１６（Sikorski and H ieter，1989）などの単コピー酵母ベクターにクローニングされる。 また、多コピー数のＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子を酵母染色体、例え ばリボゾームＲＮＡ座に組込むことも可能である。この組込みを起こすためには 、好適なプラスミド［例えば、プラスミドｐＩＲＬ９（Hallborn et al.，特許 出願）など］のリボゾーム配列を分離し、図７に示すようにＢＳ＋ベクターに適 当にクローニングする。好適な酵母プロモーターおよびターミネーター領域の間 に連結されたＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子は、該遺伝子を含有するハイ ブリッド・ベクターから分離し、前の工程で得られたプラスミドにクローニング する。こうして得られたプラスミドから、リボゾーム配列で両側からはさまれた 発現カセットを分離する。この断片は、形質転換に好適なマーカーを担持してい る自律複製プラスミドと共に、酵母へ組み込まれ、該酵母を形質転換する。この プラスミドは、軽質転換後に、染色体に組込まれた多コピー数のＳＳＯ１遺伝子 またはＳＳＯ２遺伝子を含有する細胞から、該細胞を非選択的条件下で培養する ことにより除去することができる。このようにして、細菌ベクター配列などの余 分の外来性ＤＮＡを全く担持していない組換え菌株が得られる。倍数体酵母株（ 例えば、ＶＴＴ−Ａ−６３０１５など）が用いられる場合、該遺伝子を、ＡＤＨ １座またはｐＧＫ１座のように必須な遺伝子座にも組込むことができる。 ＳＳＯ遺伝子をトリコデルマ内で発現させるためには、トリコデルマｓｓｏ遺 伝子のコード領域を、例えばＴ．レーセイｃｂｈ１プロモーターおよびターミネ ーターの間に連結し、得られた発現カセットを、例えば哺乳動物抗体やその他の 外来性タンパク質を産生するトリコデルマ株、あるいはＥＧＩ コア、別のセルラーゼまたは加水分解酵素を産生する菌株に組み込んでこれを形 質転換する。分泌の促進は、その菌がグルコース含有培地上で生育される場合に 特に望まれることであり、このためには、ｓｓｏ遺伝子は構成プロモーターまた はグルコース培地上で機能するプロモーターから発現されなければならない。 糸状菌類において、ｓｓｏ遺伝子は、好ましくは当技術分野で公知の方法を用 いてゲノムに組込まれる。ｃｂｈ１プロモーターやｓｓｏ遺伝子自身のプロモー ター以外の好適なプロモーターとしては、例えば、その他のセルラーゼプロモー ター、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、またはｔｅｆ１、ｐｇｋ、ｇｐｄ、ｐｋ ｉ、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼなど のプロモーターが挙げられる。糸状菌類において、ｓｓｏ遺伝子による形質転換 を行なうと、通常は、ゲノムに組込まれた様々なコピー数の これらの菌株から、生育に最適なレベルのｓｓｏ発現能および高められた分泌能 を有する菌株をスクリーニングすることができる。 したがって、本発明の目的は、Ｓ．セレビシエのＳＳＯ遺伝子、特にＳＳＯ１ 遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子、さらにはそれらの遺伝子に対するトリコデルマ・ レーセイおよびその他の真核細胞の相同遺伝子を提供することである。これらの 遺伝子の配列は、それらを担持するプラスミドから、例えば二本鎖ジデオキシヌ クレオチド配列決定法（Zagursky et al.，1986）により決定することができる 。Ｓ．セレビシエのＳＳＯ１遺伝子の配列を配列番号１に示し、ＳＳＯ２遺伝子 の配列を配列番号３に示す。 本発明の他の１つの目的は、ＳＳＯ遺伝子を含有する特定のベクターを提供す ることである。酵母に対するそのようなベクターは、上記したように、自律的に 複製する多コピーまたは単コピープラスミド、或いは染色体に組込み可能なベク ターのいずれかである。一方、トリコデルマに対するそのようなベクターは、好 ましくは、制限酵素により発現カセット（プロモーター−遺伝子−ターミネータ ー）が分離出来、真菌ゲノムに組込まれるようなプラスミドである。 本発明のさらに他の１つの目的は、複製プスミド上に、あるいは染色体に組込 まれた形で多コピー数のＳＳＯ遺伝子を含有する酵母株、その他の真菌株および 真核細胞系を提供することである。そのように多コピー数のＳＳＯ遺伝子を含有 する酵母株、真菌株、真核細胞系は、例えば、酵母インベルターゼ、トリコデル マセルラーゼまたはその他の加水分解酵素等の分泌タンパク質の産生能が高めら れる。 したがって、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現可能な新規な真核細胞の構築 方法にして、 （ａ）適当なドナー生物から、Ｓｓｏタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、そし て （ｃ）得られたベクターの少なくとも１つにより適当な宿主細胞を形質転 換する、 ことを包含する方法が提供される。 本発明のさらに他の１つの目的は、多コピー数のＳＳＯ遺伝子に加えて、さら にα−アミラーゼ、セルラーゼまたは抗体等の外来性または内在性の分泌タンパ ク質をコードするＤＮＡ配列を含有し、該分泌タンパク質を発現可能な真核細胞 を提供することである。 したがって、ＳＳＯ遺伝子を過剰発現させることにより外来性または内在性の 分泌タンパク質産生量を増大させる方法が提供される。この方法は、 （ａ）適当なドナー生物から、外来性または内在性の分泌タンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現する 適当な宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより適当な宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳ Ｏ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺 伝子で再度形質転換し、上記の分泌タンパク質の産生能が高められた細胞をスク リーニングし、そして （ｄ）該組換え宿主細胞を、上記の分泌タンパク質の発現が可能な条件下 で培養する ことを包含する。 本発明のさらに他の１つの目的は、Ｓｓｏタンパク質レベルを、異なるプロモ ーターおよび異なるコピー数の遺伝子を用いて最適化すること、およびＳＳＯ遺 伝子を分泌に関与するその他の遺伝子（例えば、ＳＥＣ１など）と組み合せるこ とにより、分泌能を向上させることである。 したがって、本発明は、正常量または増加された量のＳｓｏタンパク質の存在 下でＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）を過剰発現するこ とにより、外来性または内在性の分泌タンパク質の産生量を増大させる方法にし て、 （ａ）適当なドナー生物から、外来性または内在性の分泌タンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を正常レベルまたは高 レベルで発現し、かつＳＳＯ遺伝子と相互作用するその他の遺伝子（例えば、Ｓ ＥＣ１）を過剰発現する適当な宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あ るいは、 該ベクターにより適当な宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳ Ｏ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子、およびＳＳＯ遺伝子と相互作用す る遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）により再度形質転換し、上記の分泌タンパク質の 産生能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の分泌タンパク質の発現が可能な 条件下で培養する、 ことを包含する方法を提供する。 本発明のさらに他の１つの目的は、内在性分泌タンパク質の産生を増大させる 方法にして、 （ａ）内在性分泌タンパク質を産生する細胞を、ＳＳＯ遺伝子またはＳＳ Ｏ遺伝子に相同な遺伝子単独で、あるいはＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子（ 例えば、ＳＥＣ１）と共同で、形質転換し、 （ｂ）該内在性分泌タンパク質を高レベルで産生する形質転換体をスクリ ーニングし、タンパク質産生能が高められた組換え細胞を得、そして （ｃ）該組換え細胞を、該内在性分泌タンパク質の発現が可能な条件下で 培養する、 ことを包含する方法を提供することである。 本発明のさらに他の１つの目的は、多コピー数のＳＳＯ遺伝子またはその相同 体に加えて、さらに加水分解酵素（例え ば、α−アミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼ）またはリグノセルロース 加水分解酵素（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはリグニナーゼ）をコ ードするＤＮＡ配列を含有する真菌株を提供することである。このような真菌株 は、デンプンやリグノセルロース等の重合化合物の加水分解能が向上、及び／ま たは該重合化合物上での生育が促進される。 したがって、原料を利用して効率的にバイオマスを産生するか、または原料を 効率的に加水分解する方法が提供される。 この方法は、 （ａ）適当なドナー生物から、内在性または外来性の加水分解酵素をコー ドするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持する真菌ベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現する 適当な真菌宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより適当な宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳ Ｏ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子で形質転換し、上記の加水分解酵素 の産生能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の加水分解酵素の発現が可能な条 件下で培養する、 ことを包含する。 又、更に、正常量または増加された量のＳｓｏタンパク質の存在下でＳＳＯ遺 伝子と相互作用する遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）を過剰発現することにより、原 料を利用して効率的にバイオマスを産生するか、または原料を効率的に加水分解 する方法にして、 （ａ）適当なドナー生物から、内在性または外来性の加水分解酵素をコー ドするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、正常量または増加された量のＳｓｏタン パク質の存在下で、Ｓｓｏタンパク質と相互作用するタンパク質を高レベルで発 現する適当な宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより適当な宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳ Ｏ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子、およびＳＳＯ遺伝子と相互作用す る遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）により再度形質転換し、上記の加水分解酵素の産 生能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の加水分解酵素の発現が可能な条 件下で培養する、 ことを包含する方法が提供される。 上記の組換え細胞は、単一細胞による産生、アルコール産 生の改良、あるいは原料の効率的な加水分解が望まれるプロセスに利用すること ができる。実施例 実施例１：サッカロミセス・セレビシエ由来のＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺 伝子の各コード領域のクローニング ＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子は、温度感受性欠損ｓｅｃ１−１突然変 異株（Novick and Scheckman; 1979；Novick et al.，1980）のサプレッサーと して単離した。Ｓ．セレビシエ ｓｆ７５０−１４Ｄα株（αｓｅｃ１−１ ｈ ｉｓ４ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８９ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ）（ランディ シェックマン（RandyScheckman），University of California， Berkeley，CA より入手）を、Ｘ２１８０−１Ｂ株由来のｃＤＮＡを２μ塩基プ ラスミド（ｐＭＡＣ５６１；選択マーカーとしてＴＲＰ１を含有）に導入して構 築された酵母ｃＤＮＡライブラリー〔マックナイト（McKnight）およびマッコノ ーイ（McConaughy）により構築（１９８３）〕で形質転換し、３７℃におけるＴ ｒｐ−栄養要求性の形質転換体を選抜した。この形質転換体の生育は３７℃で耐 性を示したので、ｓｅｃ１−１に対しては依然として非許容的条件である３６． ５℃または３５℃でさらに実験を行なった。３６．５℃でＴｒｐ⁺表現型を分離 し、生育を示す４種類の酵母突然変異株から単離 Hanahan，1983）に導入した。この大腸菌形質転換体から単 離されたプラスミドＤＮＡを用いて、Ｓ．セリビシエのｓｅｃ１−１株を再度形 質転換した。 このようにして、３６．５℃で生育させるための効率的な形質転換が達成され た。これらのプラスミドについて制限酵素解析を行なったところ、用いられたｃ ＤＮＡライブラリーから２種類の異なる配列が回収されたことがわかった。この ２種類の異なるクローン１および７に由来する挿入ＤＮＡの塩基配列を、二本鎖 ジデオキシ法（Zagursky et al.，1986）により決定し、標準的な組換えＤＮＡ 法（Maniatis et al.，1982）または特異的プライマーを用いて好適なサブクロ ーンを構築した。この２つのクローンは、それぞれ８７０ヌクレオチド（クロー ン１）および８８５ヌクレオチド（クローン７）のオープン・リーディング・フ レームを含有していた。上記ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列はＳ ｅｃ１タンパク質のアミノ酸配列（Aalto et al.，1991）とは異なるので、これ らの新しい遺伝子をＳＳＯ１およびＳＳＯ２（ＳＳＯ：Suppressor of Secl One ）と命名した。ＳＳＯ１およびＳＳＯ２の、それぞれのコード配列およびそれら の推定アミノ酸配列を、配列番号１および３に示す。ＳＳＯ１およびＳＳＯ２遺 伝子を担持するプラスミドは、それぞれＹＥｐＳＳＯ１およびＹＥｐＳＳＯ２と 命名し、図１に示す。 実施例２：ＹＥｐＳＳＯ２で形質転換された酵母におけるＳｓｏ２タンパク質の 過剰発現 コントロールのプラスミドｐＭＡ５６（Ａ）（Ammerer，1983）あるいはＹＥ ｐＳＳＯ２（Ｂ）のいずれかにより形質転換した酵母 ｓｆ７５０−１４Ｄ株を 、Ｔｒｐを含有しない合成完全培地（Sherman et al.，1983）上で生育させた。 存在下で、該酵母細胞の溶解物を得た。この溶解物に存在する全酵母タンパク質 １０μｐｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウサギにおけるＳｓｏ２タンパク 質に対するポリクロナール抗体およびアルカリホスファーターゼ共役ヤギ抗ウサ ギＩｇＧを検出の際に用いたウェスタン・ブロッティングにより解析した。図２ に示すように、ＹＥｐＳＳＯ２形質転換体では、Ｓｓｏ２タンパク質の分泌量が 非常に増大した。 実施例３：ＳＳＯ１遺伝子またはＳＳＯ２遺伝子を過剰発現する酵母ｓｆ７５０ −１４Ｄ株における異種分泌タンパク質（バチルスα−アミラーゼ）産生の増大 ＳＳＯ１遺伝子及びＳＳＯ２遺伝子をそれぞれ含有する多コピープラスミドＹ ＥｐＳＳＯ１及びＹＥｐＳＳＯ２のいずれかを担持する酵母ｓｆ７５０−１４Ｄ α株を、ＡＤＨ１プロモーター（Ruohonen et al.,1987）およびターミネーター の間に連結したバチルスα−アミラーゼ遺伝子を含有するプラスミドＹＥｐαａ ６〔遺伝子をより効率的に発現するために、プロモーター要素に対し予想される ５’端の抑制配列を 切除することにより修飾されている（modified for moreefficient expression by deleting predicted inhibitorysequences 5' to the promoter element）(R uohonen et al.，1991;Ruohonen et al.,manuscript in preparation，a)〕によ り形質転換した。上記のバチルスα−アミラーゼ遺伝子には、その発現をより効 率的に行うために、予想される抑制性配列の５’端からプロモーター要素まで切 除することにより修飾を加えている（Ruohonen et al.，1991；Ruohonen etal. ，manuscript in preparation，a）。こうして得られた、ＹＥｐＳＳＯ１および ＹＥｐａａ５を含有する酵母株（ＶＴＴ−Ｃ−９２０７２）、またはＹＥｐＳＳ Ｏ２およびＹＥｐαａ５を含有する酵母株（ＶＴＴ−Ｃ−９２０７３）を選択培 地上で２４℃で生育させた。α−アミラーゼの培地への分泌は、ファデバス（Ph adebas）アミラーゼ検定キット〔スウェーデン国、フェルマシア・ダイアグノス テクス ＡＢ社（Pharmacia Diagnostics AB）製〕を用いてα−アミラーゼの活 性を測定することによりモニターした。これらの菌株ＶＴＴ−Ｃ−９２０７２お よびＶＴＴ−Ｃ−９２０７３は、それぞれ寄託番号ＤＳＭ７２５３および７２５ ４として、１９９２年９月３０日付でドイチェ ザムルング フォン ミクロオ ーガニズメン ウントツェルクルツーレン ゲーエムベー ハー〔Deutsche Sam mlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH (DSM)〕に寄託した。図３に 示すように、 多コピープラスミドに導入されているＳＳＯ１遺伝子を担持する菌株（▲）また は多コピープラスミドに導入されているＳＳＯ２遺伝子を担持する菌株（■）で は、形質転換されていないコントロール株（●）よりもα−アミラーゼ活性は向 上していた。該形質転換体からＹＥｐＳＳＯ１を除去した菌株（△）またはＹＥ ｐＳＳＯ２を除去した菌株（□）では、α−アミラーゼの分泌はコントロール株 の示すレベルにまで低下した。このことにより、分泌はＳＳＯ遺伝子含有プラス ミドの存在により向上することがわかる。培養培地におけるα−アミラーゼタン パク質量の増加は、ウェスタン・ブロッティングにより検出した（図４）。図３ における記号、Ｓは標準（バチルスα−アミラーゼ）を表わす。 実施例４：ＳＳＯ２遺伝子を過剰発現する酵母ＤＢＹ７４６株における外来性分 泌タンパク質（バチルスα−アミラーゼ）および内在性タンパク質（インベルタ ーゼ）産生の増大 ＡＤＨ１プロモーター(Ruohonen et al.,1987)およびターミネーターの間に連 結したバチルスα−アミラーゼ遺伝子を含有するプラスミドＹＥｐαａ６〔遺伝 子をより効率的に発現するために、プロモーター要素に対し予想される５’端の 抑制配列を切除することにより修飾されている(Ruohonen etal.,1991; Ruohonen et al.,manuscript in preparation，a)〕を担持するＳ．セレビシエ ＤＢＹ ７４６株（α ｈｉ ｓ３△１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２ ｔｒｐ１−２８ ９ ｃｇｈ^R）〔デビット・ボッテイン（David Botstein; Department of Biolo gy，Massachusetts Institute of Technology，Cambridge，MA）より入手〕を、 ＹＥｐＳＳＯ２およびコントロールのプラスミドｐＭＡ５６（Ammerer，1983） のいずれかにより形質転換する。この形質転換体を選択培地で３０℃で生育し、 培養培地へのα−アミラーゼの分泌を、ファデバスアミラーゼ検定キット（スェ ーデン国、ファルマシア・ダイアグノステクス ＡＢ社製）を用いてα−アミラ ーゼ活性を測定することによりモニターした。図５に示すように、多コピープラ スミドに導入されたＳＳＯ２遺伝子を担持する菌株（△）は、ＳＳＯ遺伝子を含 有しないコントロールのプラスミドで形質転換されたコントロール株（〇）と比 較して、α−アミラーゼ活性が向上した。コントロールの形質転換体（●）とＳ ＳＯ２形質転換体（▲）には、酵母の生育に差異は全く認められなかった。同様 にして、ＳＳＯ１遺伝子を過剰発現させると、α−アミラーゼの分泌量が増加し た。内在性タンパク質であるインベルターゼの分泌についても、対数増殖期後期 から定常期初期にかけて測定を行なったところ、これらの条件下における分泌は 増加した。ＹＥＰＳＳＯ２形質転換体における分泌インベルターゼ活性は、ｐＭ Ａ５６を含有するコントロールの形質転換体の１．４倍であった。ＳＳＯ遺伝子 の過剰 発現による、α−アミラーゼ分泌増大効果は、増殖後期においてより著しくなる ので、インベルターゼ分泌も増殖後期にはより増大すると考えられる。 ＹＥｐＳＳＯ２におけるＳＳＯ２遺伝子の発現に用いられるＡＤＨ１プロモー ター（上記参照）上にあると予想される抑制性配列を切除することにより、ＳＳ Ｏ２遺伝子の発現時間は延長し、分泌量の増大したＳｓｏタンパク質は長時間存 在可能になる。従って、バチルスα−アミラーゼの培地への最終的分泌レベルも 高まる。この修飾ＡＤＨ１プロモーターによる、単コピープラスミドに組込まれ たＳＳＯ２遺伝子の発現も、Ｓｓｏタンパク質の分泌レベルを向上させ、α−ア ミラーゼの分泌を促進する。 実施例５：正常レベルまたは増加されたレベルの機能性Ｓｓｏタンパク質の存在 下におけるＳＥＣ１遺伝子過剰発現酵母における外来性分泌タンパク質（バチル スα−アミラーゼ）産生の増大 ＡＤＨ１プロモーター〔Ruohonen et al.,1987；遺伝子をより効率的に発現す るために、プロモーター要素に対し予想される５’端の抑制配列を切除すること により修飾されているもの（Ruohonen et al.,1991; Ruohonen et al.，manuscr ipt in preparation，a）〕およびターミネーターの間に連結したバチルスα− アミラーゼ遺伝子を含有するプラスミドＹＥｐαａ６を担持するＳ．セレビシエ ＤＢＹ７４ ６株を、ＳＥＣ１遺伝子を発現する多コピープラスミドＹＥｐＳＥＣ１およびコ ントロールのプラスミドＹＥｐ２４Ｈ（Aalto et al.，1991; Ruohonen et al., manuscript in preparation，b）のいずれかにより形質転換した。この形質転換 体を選択培地で３０℃で生育させ、培養培地へのα−アミラーゼの分泌を、ファ デバスアミラーゼ検定キット（スウェーデン国、ファルマシア・ダイアグノステ ィクス ＡＢ社製）を用いてα−アミラーゼ活性を測定することによりモニター した。図６に示すように、多コピープラスミドに導入されたＳＥＣ１遺伝子を担 持する菌株（□）は、ＳＥＣ１遺伝子を含有しないプラスミドで形質転換された 菌株（〇）と比較して、α−アミラーゼ活性が向上した。この２種類の形質転換 体において、その生育に差異は全く認められなかった。 ＳＥＣ１タンパク質とＳＥＣ２タンパク質を同時に過剰発現させると、α−ア ミラーゼの分泌はさらに促進された。ＳＳＯ遺伝子を発現するプラスミドは、Ｖ ＴＴ〔バイオテクニカル ラボラトリー（Biotechnical Laboratory; Espoo，Fi nland）〕より入手できる。 実施例６：酵母における発現によるトリコデルマｓｓｏ遺伝子の単離および該遺 伝子のトリコデルマにおける発現 Ｔ．レーセイＱＭ９４１４株（Buchert et al.，フィンランド特許出願第９２ ２３７３号に記載）から調製した酵母発 現遺伝子バンクを、サッカロミセス・セレビシエＨ４５８株〔Aalto et al.,199 3；α ＳＵＣ２ ａｄｅ２−１ ｃａｎ１−１００ ｈｉｓ３−１１，１５ ｌｅｕ２−３，１１２ ｔｒｐ１−１ ｕｒａ３−１ ｓｓｏ１−δ１：：ＵＲ Ａ３ ｓｓｏ２−δ２：：ｌｅｕ２：：（ＧＡＬ１：ｓｓｏ１，ＨＩＳ３）〕に 導入して形質転換させ、ガラクトース培地におけるＵｒａ要求性変異株を選抜す ることにより形質転換体を得た。この形質転換体をグルコース培地へ移し、その 成長コロニーから該プラスミドを取り出し、上記菌株に導入し形質転換させて相 補性を確認した。このようにして、グルコース培地におけるてＳｓｏタンパク質 消費に対する救済能を示すクローンが得られた。このクローンに対応するプラス ミドをＰＭＳ５１と命名した。得られたプラスミドＰＭＳ５１を担持するＳ．セ レビシエ株は、１９９３年１０月５日ドイチェ ザムルングフォン ミクロオー ガニズメンウントツェルクルツーレン ゲー エム ベー ハー（ＤＳＭ）に寄 託した（寄託番号：ＤＳＭ８６０４）。この遺伝子の染色体コピーは、ＰＣＲに より調製されるｃＤＮＡクローンの５’端を用いることにより、染色体コスミド ライブラリー ドは、シグナルを与えるクローンから単離され、上記ｃＤＮＡに対応するコスミ ドは、ＣＢＨＩ−Ｆａｂ分子を産生するＴ．レーセイ（Penttila et al.,1987） 株、すなわち、ＶＴ Ｔ−Ｄ−９１４１８（CBS 287.91）に導入されて形質転換する（Nyyssonen et a l.,（特許出願）に記載）。ＣＢＨＩ−Ｆａｂの産生は、Ｓｏｌｃａ−ｆｌｏｃ 培地における細胞外マトリックスから調べられる（Nyyssonen et al.,特許出願 ）。 実施例７：異種ハイブリダイゼーションによる真菌ｓｓｏ遺伝子の単離 真菌種であるサッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ク ライベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ピヒア・ステイピティ ス（Pichia stipitis）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulan s)およびトリコデルマ・レーセイから、それぞれ染色体ＤＮＡを単離した。該Ｄ ＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動により 分画し、ナイロンフィルター上にブロットした。該フィルターのサザン・ブロッ トハイブリダイゼーションは、酵母ＳＳＯ１遺伝子コード領域をプローブとして 用いて、異なる厳密な条件下で行なった。ハイブリダイゼーションを、３０％ホ ルムアルデヒド、６×ＳＳＣ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５％ＳＤＳ、１０ ０μｇ／ｍｌのニシン***ＤＮＡおよび１０μｇ／ｍｌのポリＡを含有する混合 物中で３５℃で行ない、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで３０分間、２回洗浄 したところ、Ｓ．セレビシエ、Ｋ．ラクティス、Ｐ．スティピティスおよびＴ． レーセイ由来のＤＮＡに対して、ハイ ブリッドしたバンドがいくつか現れた（図８）。また、ハイブリダイゼーション をあまり厳密ではない条件下で行なったところ、Ｓ．ポンベについてもハイブリ ダイゼイションは観察された。λＥＭＢＬ３（Frischauf et al.,1983）ベクタ ーにおいて構築されたＴ．レーセイ遺伝子ライブラリーを、上記した操作により ハイブリッドさせた。ハイブリダイゼーション・シグナルを与えるクローンを精 製し、それらのハイブリッドしている領域を、それらのＤＮＡの消化およびサザ ン・ブロット・ハイブリダイゼーションによりマップした。３種類のハイブリッ ドしたλクローンを、それぞれＴＳＳＯａ、ＴＳＳＯｂおよびＴＳＳＯｃと命名 した。これらのクローンは、１９９３年１０月５日付でドイチェ ザムルング フォン ミキロオーガニズメン ウント ツェルクルツーレン ゲー エム ベ ー ハー（ＤＳＭ）に寄託した（寄託番号：ＤＳＭ ８６０１、ＤＳＭ ８６０ ２およびＤＳＭ ８６０３）。 寄託微生物 ブタペスト条約に基き、以下の微生物をドイチェ・ザムルング・フォン・ミク ロオーガニズメン・ウント・ツェルクルツーレン・ゲー・エム・ベー・ハー（Ｄ ＳＭ；ドイツ国、ブラウンシュヴァイク Ｄ−３３００ マシュローダー ヴェ ーク１Ｂ）に寄託した。 菌株 寄託番号 寄託日 サッカロミセス・セレビシエ DSM 7253 1992年9月30日 VTT-C-92072 （プラスミド YEpSSO1を担持） サッカロミセス・セレビシエ DSM 7254 1992年9月30日 VTT-C-92073 （プラスミド YEpSSO2を担持） サッカロミセス・セレビシエ DSM 8604 1993年10月5日 H458（VTT-C-93002） （プラスミド pMS51を担持） バクテリオファージλ株 DSM 8601 1993年10月5日 TSSOa（VTT-H-93001） バクテリオファージλ株 DMS 8602 1993年10月5日 TSSOb（VTT-H-93002） バクテリオファージλ株 DMS 8603 1993年10月5日 TSSOc（VTT-H-93003） 参考文献 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人： （Ａ）名称：バルティオン テクニリーネン トゥキムスケスクス （Ｂ）街路：ブオリミエヘンティエ ５ （Ｃ）市 ：エスポー （Ｅ）国 ：フィンランド （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：ＦＩＮ−０２１５０ （ii）発明の名称：組換え真核細胞による分泌タンパク 質の増大された産生 （iii）配列の数：４ （iv）コンピューター読取り形態： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ共に使用可 （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン・リリース ＃１．０，バージョン＃１．２５（ＥＰＯ） （vi）先行出願データ： （Ａ）出願番号：ＦＩ ９２ ４４９４ （Ｂ）出願日 ：１９９２年１０月６日 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８７０塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ （Ｂ）株：Ｘ２１８０−１Ｂ （ix）特徴： （Ａ）名称／特徴を表わす記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置 ：１．．８７０ （xi）配列：配列番号１ （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９０アミノ酸 （Ｂ）配列の型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号２ （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：８８５塩基対 （Ｂ）配列の型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数 ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：ｃＤＮＡからｍＲＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物名：サッカロミセス・セレビシエ （Ｂ）株：Ｘ２１８０−１Ｂ （ix）特徴： （Ａ）名称／特徴を表わす記号：ＣＤＳ （Ｂ）存在位置 ：１．．８８５ （xi）配列：配列番号３ （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２９５アミノ酸 （Ｂ）配列の型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号４

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年１２月２１日 【補正内容】 能を有する、より高等な真核生物の新規な細胞株の構築に用い得ることが示され る。 したがって、本発明は、新規な組換え真核細胞、好ましくは、Ｓｓｏタンパク 質を高レベルで発現する真菌宿主細胞、特にＳｓｏ１タンパク質および／または Ｓｓｏ２タンパク質を高レベルで発現する酵母株、およびトリコデルマＳｓｏタ ンパク質を高レベルで発現するトリコデルマ株を提供するものである。また、本 発明は、ＳＥＣ１遺伝子のようにＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子を過剰発現 することにより、分泌タンパク質の産生を増大する方法を提供する。 本発明による、ＳＳＯ遺伝子またはＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子により 形質転換される真核細胞は、分泌タンパク質産生能が向上する。また、本発明に よる新規な真核細胞、特に酵母および糸状菌類は、さらに効率的な加水分解酵素 の産生および重合性物質等の加水分解に用いられる。このような菌類を用いれば 、細胞量の増加による単一細胞またはビール酵母産生のような生物工学的なプロ セス、あるいは加水分解酵素の効率的な産生および／または植物性材料の効率的 な加水分解が有益とされるその他のプロセスが改善される。図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、多コピープラスミドｐＭＡＣ５６１に、Ｓ．セレビシエ ＳＳＯ１遺伝子およびＳＳＯ２遺伝子のｃＤＮＡをそれぞれ組み込んで得られる プラスミドＹＥｐＳ ＳＯ１および 離されたプラスミドＤＮＡを用いて、Ｓ．セリビシエのｓｅｃ１−１株を再度形 質転換した。 このようにして、３６．５℃で生育させるための効率的な形質転換が達成され た。これらのプラスミドについて制限酵素解析を行なったところ、用いられたｃ ＤＮＡライブラリーから２種類の異なる配列が回収されたことがわかった。この ２種類の異なるクローン１および７に由来する挿入ＤＮＡの塩基配列を、二本鎖 ジデオキシ法（Zagursky et al.，1986）により決定し、標準的な組換えＤＮＡ 法（Maniatis et al.，1982）または特異的プライマーを用いて好適なサブクロ ーンを構築した。この２つのクローンは、それぞれ８７０ヌクレオチド（クロー ン１）および８８５ヌクレオチド（クローン７）のオープン・リーディング・フ レームを含有していた。上記ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列はＳ ｅｃ１タンパク質のアミノ酸配列（Aalto et al.，1991）とは異なるので、これ らの新しい遺伝子をＳＳＯ１およびＳＳＯ２（ＳＳＯ：Suppressor of Sec1 One ）と命名した。ＳＳＯ１およびＳＳＯ２の、それぞれのコード配列およびそれら の推定アミノ酸配列を、配列番号１および３に示す。ＳＳＯ１およびＳＳＯ２遺 伝子を担持するプラスミドは、それぞれＹＥｐＳＳＯ１およびＹＥｐＳＳＯ２と 命名し、図１Ａおよび１Ｂに示す。 実施例２：ＹＥｐＳＳＯ２で形質転換された酵母における Ｓｓｏ２タンパク質の過剰発現 請求の範囲 １．配列番号１および３にそれぞれ示されるＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、 並びにそれらの相同配列から選択され、且つ真核細胞中で過剰発現させると、該 細胞の分泌タンパク質産生量の増大を可能にする、ｓｅｃ１サプレッサー遺伝子 ＳＳＯの単離されたＤＮＡ配列。 ２．該ＤＮＡ配列が真菌由来であり、真菌宿主中で過剰発現させると、該宿主の 分泌タンパク質産生量の増大を可能にする請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ３．本質的に配列番号２および４で表わされるアミノ酸配列からなる各ポリペプ チドをそれぞれコードするＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの機 能的断片から選ばれる請求項２に記載のＤＮＡ配列。 ４．請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むベクター。 ５．それによって真核細胞を形質転換すると、その自律複製が可能である請求項 ４に記載のベクター。 ６．それによって真核細胞を形質転換すると、その該細胞染色体への組込みが可 能である請求項４に記載のベクター。 ７．該ベクターが酵母発現ベクターであり、該ＤＮＡ配列が酵母遺伝子調節領域 の制御下で発現されることを特徴とする請求項４に記載のベクター。 ８．該酵母遺伝子調節領域が、ＳＳＯ１遺伝子、ＳＳＯ２遺伝子、ＳＥＣ１遺伝 子、ＧＡＬ１〜ＧＡＬ１０遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１ 、及びアスパラギンシンセターゼ遺伝子の各プロモーター領域、並びにそれらの プロモーター領域の機能的部分からなる群から選ばれることを特徴とする請求項 ７に記載のベクター。 ９．該ベクターが糸状菌発現ベクターであり、該ＤＮＡ配列が、糸状菌類内で機 能する調節領域の制御下で発現されることを特徴とする請求項４に記載のベクタ ー。 １０．上記の糸状菌類内で機能する調節領域が、ｓｓｏ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、 ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｔｅｆ１、ｐｇｋ、ｐｋｉ、グルコアミラーゼ、α−アミ ラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子の各プロモーター領域からな る群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載のベクター。 １１．構造がそれぞれ図１Ａおよび図１Ｂに示されるＹＥｐＳＳＯ１およびＹＥ ｐＳＳＯ２からなる群から選ばれる真菌ベクターである請求項４に記載のベクタ ー。 １２．請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列を担持し、そしてＳｓｏタン パク質を高レベルで発現する組換え真核細胞。 １３．サッカロミセス(Saccharomyces)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、クラ イベロミセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharo myces pombe)、ピヒア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ヤロビア(Yarrow ia)属、アスペルギルス(Aspergillus)属およびニューロスポラ(Neurospora)属か らなる群から選ばれる種に属する真菌細胞である請求項１２に記載の組換え真核 細胞。 １４．サッカロミセス(Saccharomyces)属およびトリコデルマ(Trichoderma)属か ら選ばれる種に属する真菌細胞である請求項１３に記載の組換え真核細胞。 １５．サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)ＶＴＴ−Ｃ−９ ２０７２株（受託番号：ＤＳＭ７２５３）である請求項１４に記載の組換え真核 細胞。 １６．サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)ＶＴＴ−Ｃ−９ ２０７３株（受託番号：ＤＳＭ７２５４）である請求項１４に記載の組換え真核 細胞。 １７．Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現可能な真核細胞の構築方法にして、 （ａ）ドナー生物から、Ｓｓｏタンパク質をコードする、配列番号１およ び３にそれぞれ示されるＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの相同 配列から選択されるＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、そし て （ｃ）得られたベクターの少なくとも１つにより、宿主細胞を形質転換す る、 ことを包含する方法。 １８．該宿主が、サッカロミセス(Saccharomyces)属、トリコデルマ(Trichoderm a)属、クライベロミセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schi zosaccharomyces pombe)、ピヒア(Pichia)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ヤロ ビア(Yarrowia)属、アスペルギルス(Aspergillus)属およびニューロスポラ(Neur ospora)属からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法 。 １９．該宿主が、サッカロミセス(Saccharomyces)属およびトリコデルマ(Tricho derma)属から選ばれる種に属することを特徴とする請求項１８に記載の方法。 ２０．ＳＳＯ遺伝子を過剰発現することにより外来性または内在性の分泌タンパ ク質産生量を増大させる方法にして、 （ａ）ドナー生物から、外来性または内在性の分泌タンパク質をコードす るＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、配列番号１および３にそれぞれ示される ＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの相同配列から選択されるＤＮ Ａ配列を含み、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現する宿主を形質転換して組換 え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体を配列番号１ および３にそれぞれ示されるＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの 相同配列から選択されるＤＮＡ配列で再度形質転換し、上記の分泌タンパク質の 産生能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）該組換え宿主細胞を、上記の外来性または内在性の分泌タンパク質 の発現が可能な条件下で培養する、 ことを包含する方法。 ２１．正常量または増加された量のＳｓｏタンパク質の存在下でＳＳＯ遺伝子と 相互作用する遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）を過剰発現することにより、外来性ま たは内在性の分泌タンパク質の産生量を増大させる方法にして、 （ａ）ドナー生物から、外来性または内在性の分泌タ ンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を正常レベルまたは高 レベルで発現し、かつＳＳＯ遺伝子と相互作用するその他の遺伝子（例えば、Ｓ ＥＣ１）を過剰発現する宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは 、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳＯ遺伝 子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子、およびＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝 子（例えば、ＳＥＣ１）により再度形質転換し、上記の分泌タンパク質の産生能 が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の分泌タンパク質の発現が可能な 条件下で培養する、 ことを包含する方法。 ２２．内在性分泌タンパク質の産生を増大させる方法にして、 （ａ）内在性分泌タンパク質を産生する細胞を、配列番号１および３にそ れぞれ示されるＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの相同配列から 選択されるＤＮＡ配列単独で、あるいはＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子（例 えば、ＳＥＣ１）と共同で、形質転換し、 （ｂ）該内在性分泌タンパク質を高レベルで産生する 形質転換体をスクリーニングし、タンパク質産生能が高められた組換え細胞を得 、そして （ｃ）該組換え細胞を、該内在性分泌タンパク質の発現が可能な条件下で 培養する、 ことを包含する方法。 ２３．原料を利用して効率的にバイオマスを産生するか、または原料を効率的に 加水分解する方法にして、 （ａ）ドナー生物から、内在性または外来性の加水分解酵素をコードする ＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持する真菌ベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、配列番号１および３にそれぞれ示される ＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの相同配列から選択されるＤＮ Ａ配列を包み、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現する真菌宿主を形質転換して 組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体を配列番号１ および３にそれぞれ示されるＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの 相同配列から選択されるＤＮＡ配列で再度形質転換し、上記の加水分解酵素の産 生能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の加水分解酵 素の発現が可能な条件下で培養する、 ことを包含する方法。 ２４．正常量または増加された量のＳｓｏタンパク質の存在下でＳＳＯ遺伝子と 相互作用する遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）を過剰発現することにより、原料を利 用して効率的にバイオマスを産生するか、または原料を効率的に加水分解する方 法にして、 （ａ）ドナー生物から、内在性または外来性の加水分解酵素をコードする ＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、正常量または増加された量のＳｓｏタン パク質の存在下で、Ｓｓｏタンパク質と相互作用するタンパク質を高レベルで発 現する宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳＯ遺伝 子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子、およびＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝 子（例えば、ＳＥＣ１）により再度形質転換し、上記の加水分解酵素の産生能が 高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の加水分解酵素の発現が可能な条 件下で培養する、 ことを包含する方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１月１１日 【補正内容】 【図１Ａ】 【図１Ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 オトウラ，ミカ フィンランド国、エフアイエヌ―00750 ヘルシンキ、ハトゥンテキヤンクヤ ３― ５ ビー 55 (72)発明者 ローネ，ハンス スエーデン国、エス―756 45 ウップサ ラ，ディリゲントゥバーゲン 169 (72)発明者 ペンッティラ，メルヤ フィンランド国、エフアイエヌ―00390 ヘルシンキ、バハントゥバンティエ ９ エー ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．真核細胞中で過剰発現させると、該細胞の分泌タンパク質産生量の増大を可 能にする、ｓｅｃ１サプレッサー遺伝子ＳＳＯの単離されたＤＮＡ配列、または その相同配列。 ２．該ＤＮＡ配列が真菌由来であり、真菌宿主中で過剰発現させると、該宿主の 分泌タンパク質産生量の増大を可能にする請求項１に記載のＤＮＡ配列。 ３．本質的に配列番号２および４で表わされるアミノ酸配列からなるポリペプチ ドをそれぞれコードするＳＳＯ１配列およびＳＳＯ２配列、並びにそれらの機能 的断片から選ばれる請求項２に記載のＤＮＡ配列。 ４．請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含むベクター。 ５．それによって真核細胞を形質転換すると、その自律複製が可能である請求項 ４に記載のベクター。 ６．それによって真核細胞を形質転換すると、その該細胞染色体への組込みが可 能である請求項４に記載のベクター。 ７．該ベクターが酵母発現ベクターであり、該ＤＮＡ配列が酵母遺伝子調節領域 の制御下で発現されることを特徴とする 請求項４に記載のベクター。 ８．該酵母遺伝子調節領域が、ＳＳＯ１遺伝子、ＳＳＯ２遺伝子、ＳＥＣ１遺伝 子、ＧＡＬ１〜ＧＡＬ１０遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＡＤＨ１ 、アスパラギンシンセターゼ遺伝子の各プロモーター領域、並びにそれらのプロ モーター領域の機能的部分からなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に 記載のベクター。 ９．該ベクターが糸状菌発現ベクターであり、該ＤＮＡ配列が、糸状菌類内で機 能する調節領域の制御下で発現されることを特徴とする請求項４に記載のベクタ ー。 １０．上記の糸状菌類内で機能する調節領域が、ｓｓｏ、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、 ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｔｅｆ１、ｐｇｋ、ｐｋｉ、グルコアミラーゼ、α−アミ ラーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子の各プロモーター領域からな る群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載のベクター。 １１．該ベクターがＹＥｐＳＳＯ１およびＹＥｐＳＳＯ２からなる群から選ばれ る真菌ベクターであり、その構造が図１に示される請求項４に記載のベクター。 １２．請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ配列を担持し、 そしてＳｓｏタンパク質を高レベルで発現する組換え真核細胞。 １３．サッカロミセス（Saccharomyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、 クライベロミセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizos accharomyces pombe）、ピヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenula）属、ヤ ロビア（Yarrowia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属およびニューロスポ ラ（Neurospora）属からなる群から選ばれる種に属する真菌細胞である請求項１ ２に記載の組換え真核細胞。 １４．サッカロミセス（Saccharomyces）属およびトリコデルマ（Trichoderma） 属から選ばれる種に属する真菌細胞である請求項１３に記載の組換え真核細胞。 １５．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）ＶＴＴ−Ｃ− ９２０７２株（受託番号：ＤＳＭ７２５３）である請求項１４に記載の組換え真 核細胞。 １６．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomycescerevisiae）ＶＴＴ−Ｃ− ９２０７３株（受託番号：ＤＳＭ７２５４）である請求項１４に記載の組換え真 核細胞。 １７．Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現可能な真核細胞の 構築方法にして、 （ａ）ドナー生物から、Ｓｓｏタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離 し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、そし て （ｃ）得られたベクターの少なくとも１つにより宿主細胞を形質転換する 、 ことを包含する方法。 １８．該宿主が、サッカロミセス（Saccharomyces）属、トリコデルマ（Trichod erma）属、クライベロミセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロミセス・ポン ベ（Schizosaccharomyces pombe）、ビヒア（Pichia）属、ハンゼヌラ（Hansenu la）属、ヤロビア（Yarrowia）属、アスペルギルス（Aspergillus）属およびニ ューロスポラ（Neurospora）属からなる群から選択されることを特徴とする請求 項１７に記載の方法。 １９．該宿主が、サッカロミセス（Saccharomyces）属およびトリコデルマ（Tri choderma）属から選ばれる種に属することを特徴とする請求項１８に記載の方法 。 ２０．ＳＳＯ遺伝子を過剰発現することにより外来性または内在性の分泌タンパ ク質産生量を増大させる方法にして、 （ａ）ドナー生物から、外来性または内在性の分泌タンパク質をコードす るＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現する 宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳＯ遺伝 子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子で再度形質転換し、上記の分泌タンパク質 の産生能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）該組換え宿主細胞を、上記の分泌タンパク質の発現が可能な条件下 で培養する ことを包含する方法。 ２１．正常量または増加された量のＳｓｏタンパク質の存在下でＳＳＯ遺伝子と 相互作用する遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）を過剰発現することにより、外来性ま たは内在性の分泌タンパク質の産生量を増大させる方法にして、 （ａ）ドナー生物から、外来性または内在性の分泌タンパク質をコードす るＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を正常レベルまたは高 レベルで発現し、かつＳＳＯ遺伝子と相互作用するその他の遺伝子（例えば、Ｓ ＥＣ１）を過剰発現する宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは 、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳＯ遺伝 子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子、およびＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝 子（例えば、ＳＥＣ１）により再度形質転換し、上記の分泌タンパク質の産生能 が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の分泌タンパク質の発現が可能な 条件下で培養する、 ことを包含する方法。 ２２．内在性分泌タンパク質の産生を増大させる方法にして、 （ａ）内在性分泌タンパク質を産生する細胞を、ＳＳＯ遺伝子またはＳＳ Ｏ遺伝子に相同な遺伝子単独で、あるいはＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝子（ 例えば、ＳＥＣ１）と共同で、形質転換し、 （ｂ）該内在性分泌タンパク質を高レベルで産生する形質転換体をスクリ ーニングし、タンパク質産生能が高められた組換え細胞を得、そして （ｃ）該組換え細胞を、該内在性分泌タンパク質の発現が可能な条件下で 培養する、 ことを包含する方法。 ２３．原料を利用して効率的にバイオマスを産生するか、または原料を効率的に 加水分解する方法にして、 （ａ）ドナー生物から、内在性または外来性の加水分解酵素をコードする ＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持する真菌ベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、Ｓｓｏタンパク質を高レベルで発現する 真菌宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳＯ遺伝 子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子で形質転換し、上記の加水分解酵素の産生 能が高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の加水分解酵素の発現が可能な条 件下で培養する、 ことを包含する方法。 ２４．正常量または増加された量のＳｓｏタンパク質の存在下でＳＳＯ遺伝子と 相互作用する遺伝子（例えば、ＳＥＣ１）を過剰発現することにより、原料を利 用して効率的にバイオマスを産生するか、または原料を効率的に加水分解する方 法にして、 （ａ）ドナー生物から、内在性または外来性の加水分解酵素をコードする ＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列の少なくとも１つを担持するベクターを構築し、 （ｃ）得られたベクターにより、正常量または増加された量のＳｓｏタン パク質の存在下で、Ｓｓｏタンパク質と相互作用するタンパク質を高レベルで発 現する宿主を形質転換して組換え宿主細胞を得るか、あるいは、 該ベクターにより宿主を形質転換し、この形質転換体をＳＳＯ遺伝 子またはＳＳＯ遺伝子に相同な遺伝子、およびＳＳＯ遺伝子と相互作用する遺伝 子（例えば、ＳＥＣ１）により再度形質転換し、上記の加水分解酵素の産生能が 高められた細胞をスクリーニングし、そして （ｄ）得られる組換え宿主細胞を、上記の加水分解酵素の発現が可能な条 件下で培養する、 ことを包含する方法。